JPH07196700A - 抗カルシトニン抗体及びその作製方法、並びに該抗体を用いたカルシトニンの測定方法 - Google Patents
抗カルシトニン抗体及びその作製方法、並びに該抗体を用いたカルシトニンの測定方法Info
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- JPH07196700A JPH07196700A JP30894A JP30894A JPH07196700A JP H07196700 A JPH07196700 A JP H07196700A JP 30894 A JP30894 A JP 30894A JP 30894 A JP30894 A JP 30894A JP H07196700 A JPH07196700 A JP H07196700A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 カルシトニンをより高感度で種特異的に測定
する方法を提供する。 【構成】 カルシトニン分子中のジスルフィド結合を還
元してＳＨ基を遊離させたカルシトニン誘導体で動物を
免疫することを特徴とする抗カルシトニン抗体の作製方
法及び該方法から作製され得る抗カルシトニン抗体、並
びに該抗体を用いたカルシトニンの測定方法。 【効果】 カルシトニンをより高感度で種特異的に測定
でき、更に、測定に要する時間を２日間に短縮できた。
する方法を提供する。 【構成】 カルシトニン分子中のジスルフィド結合を還
元してＳＨ基を遊離させたカルシトニン誘導体で動物を
免疫することを特徴とする抗カルシトニン抗体の作製方
法及び該方法から作製され得る抗カルシトニン抗体、並
びに該抗体を用いたカルシトニンの測定方法。 【効果】 カルシトニンをより高感度で種特異的に測定
でき、更に、測定に要する時間を２日間に短縮できた。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は抗カルシトニン抗体及び
その作製方法並びに該カルシトニン抗体を用いたカルシ
トニンの高感度測定法に関する。
その作製方法並びに該カルシトニン抗体を用いたカルシ
トニンの高感度測定法に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】カルシ
トニンは魚類、鳥類及び哺乳類の甲状腺Ｃ細胞に存在す
る分子量約３４００の甲状腺ホルモンの一種であり、生
体内に於いては破骨細胞に作用し、骨吸収を抑制する結
果、骨形成を促進する作用を有すると考えられている。
トニンは魚類、鳥類及び哺乳類の甲状腺Ｃ細胞に存在す
る分子量約３４００の甲状腺ホルモンの一種であり、生
体内に於いては破骨細胞に作用し、骨吸収を抑制する結
果、骨形成を促進する作用を有すると考えられている。
【０００３】日本国内においては、カルシトニン製剤は
高カルシウム血症治療薬として、又は骨粗鬆症患者など
の疼痛緩和を目的として筋注により投与されている。通
常、患者は一週間に数回の投与を必要とするが、注射に
よる投与であるため通院を必要とする。従って、臥床を
強いられる重度の骨粗鬆症患者の場合は入院での加療を
要している。
高カルシウム血症治療薬として、又は骨粗鬆症患者など
の疼痛緩和を目的として筋注により投与されている。通
常、患者は一週間に数回の投与を必要とするが、注射に
よる投与であるため通院を必要とする。従って、臥床を
強いられる重度の骨粗鬆症患者の場合は入院での加療を
要している。
【０００４】新しい投与経路での投与計画の確立や治療
効果の判定を行うには、先ず、患者に投与されたカルシ
トニンの血中濃度をより迅速で且つ高感度に測定するこ
とが好ましい。
効果の判定を行うには、先ず、患者に投与されたカルシ
トニンの血中濃度をより迅速で且つ高感度に測定するこ
とが好ましい。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者はかかる問題点
を顧みて、より迅速で且つ高感度なカルシトニン測定方
法を開発することを目的とし、研究した結果、種特異性
の高い抗カルシトニン抗体を使用することによってかか
る目的を達成し、本発明を完成させた。
を顧みて、より迅速で且つ高感度なカルシトニン測定方
法を開発することを目的とし、研究した結果、種特異性
の高い抗カルシトニン抗体を使用することによってかか
る目的を達成し、本発明を完成させた。
【０００６】即ち、本発明は抗カルシトニン抗体の作製
方法であって、カルシトニン分子中のジスルフィド結合
を還元してＳＨ基を遊離させたカルシトニン誘導体で動
物を免疫することを特徴とする抗カルシトニン抗体の作
製方法に係わる。
方法であって、カルシトニン分子中のジスルフィド結合
を還元してＳＨ基を遊離させたカルシトニン誘導体で動
物を免疫することを特徴とする抗カルシトニン抗体の作
製方法に係わる。
【０００７】このカルシトニン誘導体分子中の遊離ＳＨ
基にはキャリアー物質が結合していることが好ましく、
カルシトニンとしてはサケ等の各種動物由来の天然のも
のの他、組換え技術によって得られたものも含まれる。
基にはキャリアー物質が結合していることが好ましく、
カルシトニンとしてはサケ等の各種動物由来の天然のも
のの他、組換え技術によって得られたものも含まれる。
【０００８】前記キャリアー物質としては、カルシトニ
ンの遊離ＳＨ基に結合して複合体を形成し、化学的に安
定化する物質であれば使用可能であるが、本発明の目的
を充分に達成するためにはペプチド又はタンパク質等を
使用することが好ましい。
ンの遊離ＳＨ基に結合して複合体を形成し、化学的に安
定化する物質であれば使用可能であるが、本発明の目的
を充分に達成するためにはペプチド又はタンパク質等を
使用することが好ましい。
【０００９】また、本発明に於いて『抗体』とは完全な
抗体成分の他に、Ｆ（ａｂ′）2 、及びＦａｂ′等の抗
体分子のフラグメントも包含される。
抗体成分の他に、Ｆ（ａｂ′）2 、及びＦａｂ′等の抗
体分子のフラグメントも包含される。
【００１０】前記動物は、例えば、鳥類又は哺乳類等、
抗体を産生する能力があればいかなる種のものも使用可
能であるが、ニワトリ、ブタ、ヤギ、ウシ、ウサギ、ラ
ット、及びマウスからなる群から選択されることが好ま
しい。
抗体を産生する能力があればいかなる種のものも使用可
能であるが、ニワトリ、ブタ、ヤギ、ウシ、ウサギ、ラ
ット、及びマウスからなる群から選択されることが好ま
しい。
【００１１】また、本発明は前記方法から作製され得る
抗カルシトニン抗体、及び該抗体を用いたカルシトニン
の測定方法にも係わる。カルシトニンの測定方法として
は酵素免疫測定法を用いることが好ましいが、高感度な
測定をするためにはヘテロ２点結合酵素免疫測定法を用
いることがより好ましい。
抗カルシトニン抗体、及び該抗体を用いたカルシトニン
の測定方法にも係わる。カルシトニンの測定方法として
は酵素免疫測定法を用いることが好ましいが、高感度な
測定をするためにはヘテロ２点結合酵素免疫測定法を用
いることがより好ましい。
【００１２】以下、本発明を詳細に説明する。
【００１３】本発明の抗カルシトニン抗体の作製方法
は、カルシトニン分子中のジスルフィド結合を還元して
ＳＨ基を遊離させて得られるカルシトニン誘導体を免疫
原として用いる。カルシトニン分子中のジスルフィド結
合の還元は、例えばＳＨ還元試薬を用いる従来公知の方
法で行うことができる。
は、カルシトニン分子中のジスルフィド結合を還元して
ＳＨ基を遊離させて得られるカルシトニン誘導体を免疫
原として用いる。カルシトニン分子中のジスルフィド結
合の還元は、例えばＳＨ還元試薬を用いる従来公知の方
法で行うことができる。
【００１４】ここでＳＨ還元試薬としては、ジチオスレ
イトール、２−メルカプトエタノール、２−メルカプト
エチルアミンなどが例示できるが、カルシトニン分子中
のジスルフィド結合を還元してＳＨ基を遊離させ得る試
薬であれば他の試薬でも使用可能である。
イトール、２−メルカプトエタノール、２−メルカプト
エチルアミンなどが例示できるが、カルシトニン分子中
のジスルフィド結合を還元してＳＨ基を遊離させ得る試
薬であれば他の試薬でも使用可能である。
【００１５】更に、前記遊離ＳＨ基にキャリアー物質を
結合させることによってカルシトニン誘導体を免疫原と
して安定な複合体とすることができる。この結合も当業
者にとって公知の方法で行うことができるが、例えば、
マレイミド基を導入したキャリアータンパク質を結合さ
せ、複合体を形成させる操作が例示できる。前記キャリ
アータンパク質としては卵白アルブミン、ウシ・チログ
ロブリンなどが例示できるがこの限りではない。また、
前記遊離ＳＨ基と結合する官能基であれば、マレイミド
基に限らずどのようなものでもキャリアー物質に導入し
て使用でき、複合体を形成させることができる。
結合させることによってカルシトニン誘導体を免疫原と
して安定な複合体とすることができる。この結合も当業
者にとって公知の方法で行うことができるが、例えば、
マレイミド基を導入したキャリアータンパク質を結合さ
せ、複合体を形成させる操作が例示できる。前記キャリ
アータンパク質としては卵白アルブミン、ウシ・チログ
ロブリンなどが例示できるがこの限りではない。また、
前記遊離ＳＨ基と結合する官能基であれば、マレイミド
基に限らずどのようなものでもキャリアー物質に導入し
て使用でき、複合体を形成させることができる。
【００１６】これら還元によって得られるカルシトニン
誘導体又は複合体を用いて動物を免疫することにより、
主としてカルシトニンのＣ末端近傍のエピトープを認識
する抗体を得ることができる。ただし、得られる抗体は
ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれであ
っても良く、これらの抗体の作製にあたっては当該技術
分野に於いて周知の方法を用いることができる。
誘導体又は複合体を用いて動物を免疫することにより、
主としてカルシトニンのＣ末端近傍のエピトープを認識
する抗体を得ることができる。ただし、得られる抗体は
ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれであ
っても良く、これらの抗体の作製にあたっては当該技術
分野に於いて周知の方法を用いることができる。
【００１７】こうして得られた本発明の抗カルシトニン
抗体は、従来のカルシトニン分子で動物を免疫すること
により得た抗体とは異なり、カルシトニンのＣ末端近傍
を認識することによって種特異性が極めて高いことを特
徴とする。
抗体は、従来のカルシトニン分子で動物を免疫すること
により得た抗体とは異なり、カルシトニンのＣ末端近傍
を認識することによって種特異性が極めて高いことを特
徴とする。
【００１８】本来、カルシトニンのＣ末端近傍のエピト
ープは、動物種間において相同性が低いため、Ｃ末端近
傍を免疫システムに認識させることにより種特異性の高
い抗体が得られるものと考えられるが、カルシトニンの
Ｃ末端近傍のエピトープはジスルフィド結合によりカル
シトニン分子の内側へ入り込んだ構造を有しているため
免疫システムに認識されにくい性質を有している。
ープは、動物種間において相同性が低いため、Ｃ末端近
傍を免疫システムに認識させることにより種特異性の高
い抗体が得られるものと考えられるが、カルシトニンの
Ｃ末端近傍のエピトープはジスルフィド結合によりカル
シトニン分子の内側へ入り込んだ構造を有しているため
免疫システムに認識されにくい性質を有している。
【００１９】本発明者らは、少なくともカルシトニン分
子中のジスルフィド結合を切断（還元）し、分子の内側
へ入り込んでいたＣ末端部分を免疫システムに認識され
やすい構造とすることによって、種特異性の高い抗カル
シトニン抗体を得ることに成功したのである。
子中のジスルフィド結合を切断（還元）し、分子の内側
へ入り込んでいたＣ末端部分を免疫システムに認識され
やすい構造とすることによって、種特異性の高い抗カル
シトニン抗体を得ることに成功したのである。
【００２０】次に本発明のカルシトニンの測定方法の一
好適態様を説明する。先ず、カルシトニンを含有する試
料中から大分子物質（例えばタンパク質など）を塩析
法、ゲル濾過法又は限外濾過法などにより除去する。こ
こで言う試料とは、例えば血液、血清、血漿、リンパ
液、骨髄液、組織のホモジネート抽出液、及び組織灌流
液などが挙げられるがこの限りではない。
好適態様を説明する。先ず、カルシトニンを含有する試
料中から大分子物質（例えばタンパク質など）を塩析
法、ゲル濾過法又は限外濾過法などにより除去する。こ
こで言う試料とは、例えば血液、血清、血漿、リンパ
液、骨髄液、組織のホモジネート抽出液、及び組織灌流
液などが挙げられるがこの限りではない。
【００２１】次に、こうして処理された試料中のカルシ
トニンをビオチンで標識し、本発明の抗カルシトニン抗
体不溶化固相に捕捉する。固相を洗浄した後、酸処理に
よりビオチン化カルシトニンを固相から溶出し、溶出し
たビオチン化カルシトニンに酵素標識された本発明の抗
カルシトニン抗体を結合させる。さらにこの免疫複合体
をストレプトアビジン又はアビジン不溶化固相に捕捉す
る。最後に固相に結合した酵素活性から測定すべきカル
シトニン量を知ることができる。この方法がヘテロ２点
結合酵素免疫測定法であり、サンドウイッチ酵素免疫法
が適用できないハプテン（一価の小分子抗原）を測定す
るために開発されたものであり、競合結合法を用いたラ
ジオイムノアッセイや酵素免疫測定法よりも高感度測定
が可能な方法である。この本発明の方法によれば、適切
な条件下での測定では１×１０-17 ｍｏｌレベルの測定
が可能である。
トニンをビオチンで標識し、本発明の抗カルシトニン抗
体不溶化固相に捕捉する。固相を洗浄した後、酸処理に
よりビオチン化カルシトニンを固相から溶出し、溶出し
たビオチン化カルシトニンに酵素標識された本発明の抗
カルシトニン抗体を結合させる。さらにこの免疫複合体
をストレプトアビジン又はアビジン不溶化固相に捕捉す
る。最後に固相に結合した酵素活性から測定すべきカル
シトニン量を知ることができる。この方法がヘテロ２点
結合酵素免疫測定法であり、サンドウイッチ酵素免疫法
が適用できないハプテン（一価の小分子抗原）を測定す
るために開発されたものであり、競合結合法を用いたラ
ジオイムノアッセイや酵素免疫測定法よりも高感度測定
が可能な方法である。この本発明の方法によれば、適切
な条件下での測定では１×１０-17 ｍｏｌレベルの測定
が可能である。
【００２２】本発明の方法では、固相に不溶化する抗カ
ルシトニン抗体及び酵素標識抗カルシトニン抗体に前述
のように作製した抗体又は抗体フラグメントを用いる。
ルシトニン抗体及び酵素標識抗カルシトニン抗体に前述
のように作製した抗体又は抗体フラグメントを用いる。
【００２３】モノクローナル抗体を用いる場合はこれら
は互いに別種のものを用いるのが好ましい。
は互いに別種のものを用いるのが好ましい。
【００２４】本発明の測定方法に於いて、操作工程中で
使用する分注器、試験管壁等へのカルシトニン分子の吸
着を防止する目的で、全ての工程でブロッキング剤を用
いる。ブロッキング剤としては酵素免疫測定法等の生化
学分野で通常使用されるものを使用し得るが、より優れ
た効果を得るためにはバシトラシンを用いることが好ま
しい。
使用する分注器、試験管壁等へのカルシトニン分子の吸
着を防止する目的で、全ての工程でブロッキング剤を用
いる。ブロッキング剤としては酵素免疫測定法等の生化
学分野で通常使用されるものを使用し得るが、より優れ
た効果を得るためにはバシトラシンを用いることが好ま
しい。
【００２５】以下、実施例により本発明をさらに詳しく
説明するが本発明はこれに限定されるものではない。
説明するが本発明はこれに限定されるものではない。
【００２６】
【実施例】本実施例でいう緩衝液Ａ及びＢは以下の通り
である。
である。
【００２７】緩衝液Ａ：５ｍＭ ＥＤＴＡを含む０．１
Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．０ 緩衝液Ｂ：０．１Ｍ 塩化ナトリウムを含む１０ｍＭリ
ン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０ （実施例１）抗カルシトニン抗体の作製 （１）マレイミド−卵白アルブミンの調製 ４．５ｍｇの卵白アルブミン（ナカライテクス社）を
０．２２５ｍｌの０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐ
Ｈ７．０）に溶解した。０．１６５Ｍ Ｎ−サクシイミ
ジル−６−マレイミドヘキサノエート（同人化学社）Ｄ
ＭＦ溶液２２．５μｌを加え３０℃にて３０分間反応さ
せた。緩衝液Ａにより平衡化したデキストランゲル（セ
ファデックスＧ−２５、ファルマシアＬＫＢ バイオテ
クノロジー社、スエーデン）カラム（１．０×３０ｃ
ｍ）により前記反応液をゲル濾過しマレイミド−卵白ア
ルブミンを得た。
Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．０ 緩衝液Ｂ：０．１Ｍ 塩化ナトリウムを含む１０ｍＭリ
ン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０ （実施例１）抗カルシトニン抗体の作製 （１）マレイミド−卵白アルブミンの調製 ４．５ｍｇの卵白アルブミン（ナカライテクス社）を
０．２２５ｍｌの０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐ
Ｈ７．０）に溶解した。０．１６５Ｍ Ｎ−サクシイミ
ジル−６−マレイミドヘキサノエート（同人化学社）Ｄ
ＭＦ溶液２２．５μｌを加え３０℃にて３０分間反応さ
せた。緩衝液Ａにより平衡化したデキストランゲル（セ
ファデックスＧ−２５、ファルマシアＬＫＢ バイオテ
クノロジー社、スエーデン）カラム（１．０×３０ｃ
ｍ）により前記反応液をゲル濾過しマレイミド−卵白ア
ルブミンを得た。
【００２８】導入されたマレイミド基数は卵白アルブミ
ン一分子あたり８．０であった。卵白アルブミン量は２
８０ｎｍの吸光度より算出した。マレイミド基濃度は石
川らの方法（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、４、ｐ２０
９、１９８３）により測定した。
ン一分子あたり８．０であった。卵白アルブミン量は２
８０ｎｍの吸光度より算出した。マレイミド基濃度は石
川らの方法（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、４、ｐ２０
９、１９８３）により測定した。
【００２９】（２）還元型サケ・カルシトニンの調製 １．６５ｍｇのサケ・カルシトニン（サンド社、スイス
より入手）を０．８ｍｌの緩衝液Ａに溶解した。緩衝液
Ａに溶解した０．１Ｍのジチオスレイトール（ナカライ
テクス社）溶液０．８ｍｌを前記カルシトニン溶液に加
え、３７℃にて９０分間インキュベートした。インキュ
ベート後、緩衝液Ａにて平衡化したデキストランゲル
（セファデックスＧ−１０、ファルマシア ＬＫＢ バ
イオテクノロジー社）カラム（１．０×３０ｃｍ）を用
いたゲル濾過を行い、還元型サケ・カルシトニンを得
た。還元型サケ・カルシトニン１分子中のＳＨ基数は前
述の石川らの方法により測定し１．９個であることを確
認した。
より入手）を０．８ｍｌの緩衝液Ａに溶解した。緩衝液
Ａに溶解した０．１Ｍのジチオスレイトール（ナカライ
テクス社）溶液０．８ｍｌを前記カルシトニン溶液に加
え、３７℃にて９０分間インキュベートした。インキュ
ベート後、緩衝液Ａにて平衡化したデキストランゲル
（セファデックスＧ−１０、ファルマシア ＬＫＢ バ
イオテクノロジー社）カラム（１．０×３０ｃｍ）を用
いたゲル濾過を行い、還元型サケ・カルシトニンを得
た。還元型サケ・カルシトニン１分子中のＳＨ基数は前
述の石川らの方法により測定し１．９個であることを確
認した。
【００３０】（３）サケ・カルシトニン結合卵白アルブ
ミンの調製 マレイミド−卵白アルブミン１．４９ｍｇを緩衝液Ａ
０．８ｍｌに溶解し、還元型サケ・カルシトニン１．１
４ｍｇを緩衝液Ａ ２．２ｍｌに溶解した溶液を加え、
４℃にて２０時間インキュベートした。インキュベート
後、０．１Ｍ２−メルカプトエチルアミン・塩酸塩の緩
衝液Ａの溶液３０μｌを加え、３０℃にて３０分間イン
キュベートした。続いて、０．１Ｍ Ｎ−エチルマレイ
ミドの緩衝液Ａの溶液６０μｌを加え、３０℃にて３０
分間インキュベートした。最終的に緩衝液Ｂにて平衡化
したアクリルアミド−アガロースゲル（ウルトロゲルＡ
ｃＡ４４、ＩＢＦ バイオテクニックス社、フランス）
カラム（１．５×４５ｃｍ）を用いたゲル濾過を行い、
サケ・カルシトニン結合卵白アルブミンを得た。結合し
たサケ・カルシトニン分子数は、マレイミド基の減少量
から算出したところ、卵白アルブミン１分子あたり８．
０であった。
ミンの調製 マレイミド−卵白アルブミン１．４９ｍｇを緩衝液Ａ
０．８ｍｌに溶解し、還元型サケ・カルシトニン１．１
４ｍｇを緩衝液Ａ ２．２ｍｌに溶解した溶液を加え、
４℃にて２０時間インキュベートした。インキュベート
後、０．１Ｍ２−メルカプトエチルアミン・塩酸塩の緩
衝液Ａの溶液３０μｌを加え、３０℃にて３０分間イン
キュベートした。続いて、０．１Ｍ Ｎ−エチルマレイ
ミドの緩衝液Ａの溶液６０μｌを加え、３０℃にて３０
分間インキュベートした。最終的に緩衝液Ｂにて平衡化
したアクリルアミド−アガロースゲル（ウルトロゲルＡ
ｃＡ４４、ＩＢＦ バイオテクニックス社、フランス）
カラム（１．５×４５ｃｍ）を用いたゲル濾過を行い、
サケ・カルシトニン結合卵白アルブミンを得た。結合し
たサケ・カルシトニン分子数は、マレイミド基の減少量
から算出したところ、卵白アルブミン１分子あたり８．
０であった。
【００３１】（４）サケ・カルシトニン結合ウシ・チロ
グロブリンの調製 マレイミド−卵白アルブミンを調製した方法に準じ、マ
レイミド−ウシ・チログロブリンを調製した。導入され
たマレイミド基数はウシ・チログロブリン１分子あたり
１５であった。ウシ・チログロブリン量は２８０ｎｍの
吸光度より算出した。
グロブリンの調製 マレイミド−卵白アルブミンを調製した方法に準じ、マ
レイミド−ウシ・チログロブリンを調製した。導入され
たマレイミド基数はウシ・チログロブリン１分子あたり
１５であった。ウシ・チログロブリン量は２８０ｎｍの
吸光度より算出した。
【００３２】マレイミド−ウシ・チログロブリン４．４
ｍｇを０．４ｍｌの緩衝液Ａに溶解し、これに前述のよ
うに調製した還元型サケ・カルシトニン０．４６ｍｇの
緩衝液３．０ｍｌへの溶液を加え、４℃で２０時間イン
キュベートした。インキュベート後、緩衝液Ａに溶解し
た０．１Ｍ ２−メルカプトエチルアミン・塩酸塩を３
０μｌ加え、３０℃にて３０分間インキュベートした。
続いて、緩衝液Ａに溶解した０．１Ｍ Ｎ−エチルマレ
イミド溶液６０μｌを加え、３０℃にて３０分間インキ
ュベートした。最終的に緩衝液Ｂにて平衡化したアクリ
ルアミド−アガロースゲル（ウルトロゲルＡｃＡ２２、
ＩＢＦ バイオテクニックス社）カラム（１．５×４５
ｃｍ）を用いたゲル濾過を行い、サケ・カルシトニン結
合ウシ・チログロブリンを得た。結合したサケ・カルシ
トニン分子数は、マレイミド基の減少量から算出したと
ころ、ウシ・チログロブリン１分子あたり１５であっ
た。
ｍｇを０．４ｍｌの緩衝液Ａに溶解し、これに前述のよ
うに調製した還元型サケ・カルシトニン０．４６ｍｇの
緩衝液３．０ｍｌへの溶液を加え、４℃で２０時間イン
キュベートした。インキュベート後、緩衝液Ａに溶解し
た０．１Ｍ ２−メルカプトエチルアミン・塩酸塩を３
０μｌ加え、３０℃にて３０分間インキュベートした。
続いて、緩衝液Ａに溶解した０．１Ｍ Ｎ−エチルマレ
イミド溶液６０μｌを加え、３０℃にて３０分間インキ
ュベートした。最終的に緩衝液Ｂにて平衡化したアクリ
ルアミド−アガロースゲル（ウルトロゲルＡｃＡ２２、
ＩＢＦ バイオテクニックス社）カラム（１．５×４５
ｃｍ）を用いたゲル濾過を行い、サケ・カルシトニン結
合ウシ・チログロブリンを得た。結合したサケ・カルシ
トニン分子数は、マレイミド基の減少量から算出したと
ころ、ウシ・チログロブリン１分子あたり１５であっ
た。
【００３３】（５）家兎抗血清の調製（サケ・カルシト
ニン結合卵白アルブミン抗体の作製） ０．１ｍｇのサケ・カルシトニン結合卵白アルブミンを
１．５ｍｌのフロイント完全アジュバンド（ナカライテ
クス社）に懸濁し、家兎に皮内投与した。２週間後、
０．１ｍｇのサケ・カルシトニン結合卵白アルブミンを
１．５ｍｌのフロイント不完全アジュバンド（ナカライ
テクス社）に懸濁し、３週間間隔で２回皮下投与した。
最終投与２週間後に血液を採取し、遠心分離により血清
を得た。抗血清は、−２０℃で保存した。
ニン結合卵白アルブミン抗体の作製） ０．１ｍｇのサケ・カルシトニン結合卵白アルブミンを
１．５ｍｌのフロイント完全アジュバンド（ナカライテ
クス社）に懸濁し、家兎に皮内投与した。２週間後、
０．１ｍｇのサケ・カルシトニン結合卵白アルブミンを
１．５ｍｌのフロイント不完全アジュバンド（ナカライ
テクス社）に懸濁し、３週間間隔で２回皮下投与した。
最終投与２週間後に血液を採取し、遠心分離により血清
を得た。抗血清は、−２０℃で保存した。
【００３４】（６）ＩｇＧ及びそのフラグメントの調製
及び定量 ＩｇＧ及びそのフラグメント｛Ｆ（ａｂ′）2 、Ｆａ
ｂ′｝は前記、石川らの方法を用いて調製し、定量し
た。
及び定量 ＩｇＧ及びそのフラグメント｛Ｆ（ａｂ′）2 、Ｆａ
ｂ′｝は前記、石川らの方法を用いて調製し、定量し
た。
【００３５】（実施例２）サケ・カルシトニンの測定 （１） 家兎（抗サケ・カルシトニン）ＩｇＧ及びＦ
（ａｂ′）2 のアフィニティー精製 実施例１のようにして得たサケ・カルシトニン結合ウシ
・チログロブリン２．４ｍｇをブロムシアン活性化アガ
ロースゲル（セファロース４Ｂ、ファルマシアＬＫＢ
バイオテクノロジー社）０．２４ｇに同社の取扱い説明
書に従って不溶化した。
（ａｂ′）2 のアフィニティー精製 実施例１のようにして得たサケ・カルシトニン結合ウシ
・チログロブリン２．４ｍｇをブロムシアン活性化アガ
ロースゲル（セファロース４Ｂ、ファルマシアＬＫＢ
バイオテクノロジー社）０．２４ｇに同社の取扱い説明
書に従って不溶化した。
【００３６】このサケ・カルシトニン結合ウシ・チログ
ロブリン不溶化アガロースゲル（セファロース４Ｂ、フ
ァルマシア ＬＫＢ バイオテクノロジー社）カラムに
家兎（抗サケ・カルシトニン結合卵白アルブミン）Ｉｇ
Ｇ及びＦ（ａｂ′）2 を結合させ、河野らの方法（Ｊ．
Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１００、ｐ１２４７、１９８６）で
アフィニティー精製し、アフィニティー精製家兎（抗サ
ケ・カルシトニン）ＩｇＧ及びＦ（ａｂ′）2 を得た。
ロブリン不溶化アガロースゲル（セファロース４Ｂ、フ
ァルマシア ＬＫＢ バイオテクノロジー社）カラムに
家兎（抗サケ・カルシトニン結合卵白アルブミン）Ｉｇ
Ｇ及びＦ（ａｂ′）2 を結合させ、河野らの方法（Ｊ．
Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１００、ｐ１２４７、１９８６）で
アフィニティー精製し、アフィニティー精製家兎（抗サ
ケ・カルシトニン）ＩｇＧ及びＦ（ａｂ′）2 を得た。
【００３７】（２）アフィニティー精製家兎（抗サケ・
カルシトニン）Ｆａｂ′−ペルオキシダーゼ複合体の調
製 アフィニティー精製家兎（抗サケ・カルシトニン）Ｆａ
ｂ′を橋田らの方法（Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．、６、ｐ５６、１９８４）でマレイミド基を導入し
た西洋ワサビペルオキシダーゼ（酵素免疫測定用、ＲＺ
＝３．０、ベーリンガーマンハイム社、ドイツ）と結合
させた。
カルシトニン）Ｆａｂ′−ペルオキシダーゼ複合体の調
製 アフィニティー精製家兎（抗サケ・カルシトニン）Ｆａ
ｂ′を橋田らの方法（Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．、６、ｐ５６、１９８４）でマレイミド基を導入し
た西洋ワサビペルオキシダーゼ（酵素免疫測定用、ＲＺ
＝３．０、ベーリンガーマンハイム社、ドイツ）と結合
させた。
【００３８】（３）タンパク質不溶化ポリスチレン小球
の調製 家兎非特異ＩｇＧを河野らの方法（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｌａ
ｂ．Ａｎａｌ．、２、ｐ１９、１９８８）でビオチン化
した。
の調製 家兎非特異ＩｇＧを河野らの方法（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｌａ
ｂ．Ａｎａｌ．、２、ｐ１９、１９８８）でビオチン化
した。
【００３９】次に、石川らの方法（Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ．、８、ｐ４３、１９７８）を用いて前述
のアフィニティー精製家兎（抗サケ・カルシトニン）Ｉ
ｇＧ（１０ｍｇ／Ｌ）及びビオチン化家兎非特異ＩｇＧ
（０．１ｇ／Ｌ）をポリスチレン小球（イムノケミカル
社）に不溶化した。
ｍｍｕｎｏｌ．、８、ｐ４３、１９７８）を用いて前述
のアフィニティー精製家兎（抗サケ・カルシトニン）Ｉ
ｇＧ（１０ｍｇ／Ｌ）及びビオチン化家兎非特異ＩｇＧ
（０．１ｇ／Ｌ）をポリスチレン小球（イムノケミカル
社）に不溶化した。
【００４０】また、田中らの方法（Ａｎａｌ．Ｌｅｔ
ｔ．、２２、ｐ３５３、１９８９）を用いて、このビオ
チン化家兎非特異ＩｇＧ不溶化ポリスチレン小球にスト
レプトアビジン（ギグコ ＢＲＬ ライフテクノロジー
社、米国）を結合させ、ストレプトアビジン不溶化ポリ
スチレン小球を調製した。
ｔ．、２２、ｐ３５３、１９８９）を用いて、このビオ
チン化家兎非特異ＩｇＧ不溶化ポリスチレン小球にスト
レプトアビジン（ギグコ ＢＲＬ ライフテクノロジー
社、米国）を結合させ、ストレプトアビジン不溶化ポリ
スチレン小球を調製した。
【００４１】（４）ビオチン化標準カルシトニンの調製 標準カルシトニンは、カルシトニンを緩衝液Ｂに溶解
し、アミノ基を定量した後、直ちに等容量の０．２ｇ／
Ｌ ウシ・血清アルブミン（フラクションＶ、インタゲ
ン社）、１．６Ｍ塩化ナトリウム、２ｍＭ ＥＤＴＡ及
び０．２ｇ／Ｌバシトラシン（シグマ社）を含む０．２
Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を加えること
で得た。次いで、標準カルシトニンをセントリコン−３
０（アミコンディビジョン、Ｗ．Ｒ．グレース アンド
カンパニー、米国）を用いて４℃にて５０００×ｇ、
２０分間遠心分離し、濾液を得た。この標準カルシトニ
ン濾液（０．１ｍｌ）に、ＤＭＳＯに溶解した２２ｍＭ
Ｎ−ヒドロキシサクシイミド−ビオチン（１０μｌ、
ザイメット社、米国）溶液を加え、４℃にて１時間イン
キュベートし、続いて２．０Ｍグリシン−水酸化ナトリ
ウム緩衝液（ｐＨ７．０）を加え４℃にて３０分間イン
キュベートした。最後に１０μｌの０．４Ｍ塩化ナトリ
ウム、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５．５ｇ／Ｌ バシトラシ
ン、１３ｇ／Ｌウシ・血清アルブミン、及び１．０ｇ／
Ｌ アジ化ナトリウムを含む１０ｍＭリン酸ナトリウム
緩衝液（ｐＨ７．０）を加え、ビオチン化標準カルシト
ニン溶液を得た。
し、アミノ基を定量した後、直ちに等容量の０．２ｇ／
Ｌ ウシ・血清アルブミン（フラクションＶ、インタゲ
ン社）、１．６Ｍ塩化ナトリウム、２ｍＭ ＥＤＴＡ及
び０．２ｇ／Ｌバシトラシン（シグマ社）を含む０．２
Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を加えること
で得た。次いで、標準カルシトニンをセントリコン−３
０（アミコンディビジョン、Ｗ．Ｒ．グレース アンド
カンパニー、米国）を用いて４℃にて５０００×ｇ、
２０分間遠心分離し、濾液を得た。この標準カルシトニ
ン濾液（０．１ｍｌ）に、ＤＭＳＯに溶解した２２ｍＭ
Ｎ−ヒドロキシサクシイミド−ビオチン（１０μｌ、
ザイメット社、米国）溶液を加え、４℃にて１時間イン
キュベートし、続いて２．０Ｍグリシン−水酸化ナトリ
ウム緩衝液（ｐＨ７．０）を加え４℃にて３０分間イン
キュベートした。最後に１０μｌの０．４Ｍ塩化ナトリ
ウム、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５．５ｇ／Ｌ バシトラシ
ン、１３ｇ／Ｌウシ・血清アルブミン、及び１．０ｇ／
Ｌ アジ化ナトリウムを含む１０ｍＭリン酸ナトリウム
緩衝液（ｐＨ７．０）を加え、ビオチン化標準カルシト
ニン溶液を得た。
【００４２】（５）ヘテロ２点結合酵素免疫測定法によ
る測定 ビオチン化標準カルシトニンをアフィニティー精製家兎
（抗サケ・カルシトニン）ＩｇＧ不溶化ポリスチレン小
球と共に２０℃にて終夜インキュベートした。インキュ
ベート後、ポリスチレン小球を緩衝液Ｂにて２度洗浄し
た後、９０μｌの０．４Ｍ塩化ナトリウム、０．５ｇ／
Ｌ バシトラシン及び１．０ｇ／Ｌ ウシ・血清アルブ
ミンを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）及び１
８μｌの１．０Ｍ塩酸の混液と４℃にて１時間インキュ
ベートした。インキュベート後、ポリスチレン小球を取
り出し、反応混液を１８μｌの１．０Ｍの水酸化ナトリ
ウム及び１８μｌの１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
７．０）を加え中和した。中和後、５μｌの０．４Ｍ塩
化ナトリウム、０．５ｇ／Ｌバシトラシン、及び１．０
ｇ／Ｌウシ・血清アルブミンを含む１０ｍＭリン酸緩衝
液（ｐＨ７．０）に溶解した前記アフィニティー精製家
兎（抗サケ・カルシトニン）Ｆａｂ′−ペルオキシダー
ゼ複合体（１００ｆｍｏｌ）溶液を加え、２０℃にて１
時間インキュベートした。次に、前記ストレプトアビジ
ン不溶化ポリスチレン小球（２個）を加え更に２時間イ
ンキュベートした。最後にポリスチレン小球を前述のよ
うに洗浄し、結合したペルオキシダーゼの酵素活性をパ
ラヒドロキシフェニルプロピオン酸を水素供与体とした
今川らの蛍光法（Ａｎａｌ．Ｌｅｔｔ．、１６、ｐ１５
０９、１９８３）にて測定する。蛍光強度は５０ｍＭ硫
酸に溶解した０．２ｍｇ／Ｌ キニーネを標準として日
立蛍光分光光度計（Ｆ−３０１０）を用いて測定した。
結果を図１に示した。図１より明らかなように、本発明
による測定法により血中濃度約２pg／mlまでのサケ・カ
ルシトニンを測定することが可能であった。
る測定 ビオチン化標準カルシトニンをアフィニティー精製家兎
（抗サケ・カルシトニン）ＩｇＧ不溶化ポリスチレン小
球と共に２０℃にて終夜インキュベートした。インキュ
ベート後、ポリスチレン小球を緩衝液Ｂにて２度洗浄し
た後、９０μｌの０．４Ｍ塩化ナトリウム、０．５ｇ／
Ｌ バシトラシン及び１．０ｇ／Ｌ ウシ・血清アルブ
ミンを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）及び１
８μｌの１．０Ｍ塩酸の混液と４℃にて１時間インキュ
ベートした。インキュベート後、ポリスチレン小球を取
り出し、反応混液を１８μｌの１．０Ｍの水酸化ナトリ
ウム及び１８μｌの１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
７．０）を加え中和した。中和後、５μｌの０．４Ｍ塩
化ナトリウム、０．５ｇ／Ｌバシトラシン、及び１．０
ｇ／Ｌウシ・血清アルブミンを含む１０ｍＭリン酸緩衝
液（ｐＨ７．０）に溶解した前記アフィニティー精製家
兎（抗サケ・カルシトニン）Ｆａｂ′−ペルオキシダー
ゼ複合体（１００ｆｍｏｌ）溶液を加え、２０℃にて１
時間インキュベートした。次に、前記ストレプトアビジ
ン不溶化ポリスチレン小球（２個）を加え更に２時間イ
ンキュベートした。最後にポリスチレン小球を前述のよ
うに洗浄し、結合したペルオキシダーゼの酵素活性をパ
ラヒドロキシフェニルプロピオン酸を水素供与体とした
今川らの蛍光法（Ａｎａｌ．Ｌｅｔｔ．、１６、ｐ１５
０９、１９８３）にて測定する。蛍光強度は５０ｍＭ硫
酸に溶解した０．２ｍｇ／Ｌ キニーネを標準として日
立蛍光分光光度計（Ｆ−３０１０）を用いて測定した。
結果を図１に示した。図１より明らかなように、本発明
による測定法により血中濃度約２pg／mlまでのサケ・カ
ルシトニンを測定することが可能であった。
【００４３】（実施例３）異種カルシトニンの測定（種
特異性の評価） 本発明によるサケ・カルシトニン抗体の種特異性の評価
として、ヒト・カルシトニン（シグマケミカル社、米
国）及びラット・カルシトニン（シグマケミカル社、米
国）について実施例２と同様の実験系で測定した。結果
を図１に示した。これより本発明の抗体は非常に種特異
性が高いことが確認された。
特異性の評価） 本発明によるサケ・カルシトニン抗体の種特異性の評価
として、ヒト・カルシトニン（シグマケミカル社、米
国）及びラット・カルシトニン（シグマケミカル社、米
国）について実施例２と同様の実験系で測定した。結果
を図１に示した。これより本発明の抗体は非常に種特異
性が高いことが確認された。
【００４４】（比較例）従来法によるカルシトニンの測
定 比較例として、サケ・カルシトニンを従来の方法で測定
した。用いた方法は測定すべきサケ・カルシトニンを先
ず、通常の方法で得た抗サケ・カルシトニン抗体と、次
に 125Ｉ標識サケ・カルシトニンとインキュベートし、
続いて未反応の125Ｉ標識サケ・カルシトニンをチャコ
ール処理により除去し、最後に上清中の放射活性をγ−
カウンターにより測定する公知の競争結合法を用いたラ
ジオイムノアッセイ法である。本法によるサケ・カルシ
トニンの測定限界は約２０pg／mlであった。
定 比較例として、サケ・カルシトニンを従来の方法で測定
した。用いた方法は測定すべきサケ・カルシトニンを先
ず、通常の方法で得た抗サケ・カルシトニン抗体と、次
に 125Ｉ標識サケ・カルシトニンとインキュベートし、
続いて未反応の125Ｉ標識サケ・カルシトニンをチャコ
ール処理により除去し、最後に上清中の放射活性をγ−
カウンターにより測定する公知の競争結合法を用いたラ
ジオイムノアッセイ法である。本法によるサケ・カルシ
トニンの測定限界は約２０pg／mlであった。
【００４５】（実施例４）サケ・カルシトニン投与後の
血中濃度の測定 それぞれ１５匹よりなるウイスター系ラット（１０週
齢、雄）を３群（第一群〜第三群）準備し、各種投与経
路によりカルシトニンをラットに投与しカルシトニン血
中濃度を測定した。
血中濃度の測定 それぞれ１５匹よりなるウイスター系ラット（１０週
齢、雄）を３群（第一群〜第三群）準備し、各種投与経
路によりカルシトニンをラットに投与しカルシトニン血
中濃度を測定した。
【００４６】第一群には、ラット右大腿静脈よりサケ・
カルシトニンを投与し経時的（投与前、投与後１、４、
１０、３０、及び６０分後）にペントバルビタール麻酔
下で左大腿静脈より採血し、終濃度１０００ユニット／
Ｌとなるようにヘパリン（清水製薬社）を加え、直ちに
遠心分離して血漿を得た。採血は１匹当たり２回とし
た。尚、サケ・カルシトニン投与量は体重１ｋｇ当たり
５ユニットとし、生理的食塩水０．２５ｍｌに溶解して
投与した。
カルシトニンを投与し経時的（投与前、投与後１、４、
１０、３０、及び６０分後）にペントバルビタール麻酔
下で左大腿静脈より採血し、終濃度１０００ユニット／
Ｌとなるようにヘパリン（清水製薬社）を加え、直ちに
遠心分離して血漿を得た。採血は１匹当たり２回とし
た。尚、サケ・カルシトニン投与量は体重１ｋｇ当たり
５ユニットとし、生理的食塩水０．２５ｍｌに溶解して
投与した。
【００４７】第二群には、ラット頸部背部皮下にサケ・
カルシトニンを投与し、経時的（投与前、投与後１５、
３０、６０、１８０、３６０分後）に採血し前述の方法
で血漿を得た。採血は１匹当たり２回とした。尚、投与
量は体重１ｋｇ当たり５ユニットとし、生理的食塩水
０．２５ｍｌに溶解して投与した。
カルシトニンを投与し、経時的（投与前、投与後１５、
３０、６０、１８０、３６０分後）に採血し前述の方法
で血漿を得た。採血は１匹当たり２回とした。尚、投与
量は体重１ｋｇ当たり５ユニットとし、生理的食塩水
０．２５ｍｌに溶解して投与した。
【００４８】第三群には、ラット左鼻腔内にサケ・カル
シトニンを注入し、経時的（投与前、投与後１５、３
０、６０、１８０、３６０分後）に採血し、前述の方法
で血漿を得た。採血は１匹当たり２回とした。尚、投与
量は体重１ｋｇ当たり５ユニットとし、生理的食塩水５
０μｌに溶解して注入した。
シトニンを注入し、経時的（投与前、投与後１５、３
０、６０、１８０、３６０分後）に採血し、前述の方法
で血漿を得た。採血は１匹当たり２回とした。尚、投与
量は体重１ｋｇ当たり５ユニットとし、生理的食塩水５
０μｌに溶解して注入した。
【００４９】以上３群のラットから得られた血漿（０．
０１ｍｌ〜０．１ｍｌ）に０．１ｇ／Ｌ ウシ・血清ア
ルブミンを含む緩衝液Ｂを加え０．１ｍｌとした後、
１．６Ｍ塩化ナトリウム、２ｍＭ ＥＤＴＡ及び０．２
ｇ／Ｌバシトラシンを含む０．２Ｍ リン酸ナトリウム
緩衝液、ｐＨ７．０（０．１ｍｌ）を加え、セントリコ
ン−３０を用いて４℃にて５０００×ｇ、２０分間遠心
分離し、血漿濾液を得た。血漿濾液を前述の標準カルシ
トニンと同様にビオチン化後、ヘテロ２点結合酵素免疫
測定法によりサケ・カルシトニンの血中濃度を測定し
た。結果を図２に示した。図２より明らかなように、本
発明による測定法によって様々な条件による投与後のサ
ケ・カルシトニンの薬物動態を評価することができた。
０１ｍｌ〜０．１ｍｌ）に０．１ｇ／Ｌ ウシ・血清ア
ルブミンを含む緩衝液Ｂを加え０．１ｍｌとした後、
１．６Ｍ塩化ナトリウム、２ｍＭ ＥＤＴＡ及び０．２
ｇ／Ｌバシトラシンを含む０．２Ｍ リン酸ナトリウム
緩衝液、ｐＨ７．０（０．１ｍｌ）を加え、セントリコ
ン−３０を用いて４℃にて５０００×ｇ、２０分間遠心
分離し、血漿濾液を得た。血漿濾液を前述の標準カルシ
トニンと同様にビオチン化後、ヘテロ２点結合酵素免疫
測定法によりサケ・カルシトニンの血中濃度を測定し
た。結果を図２に示した。図２より明らかなように、本
発明による測定法によって様々な条件による投与後のサ
ケ・カルシトニンの薬物動態を評価することができた。
【００５０】
【発明の効果】従来法に比較してカルシトニンをより高
感度（約２pg／mlまで）で種特異的に測定でき、更に、
測定に要する時間も従来法の１週間程度から２日間に短
縮することができた。
感度（約２pg／mlまで）で種特異的に測定でき、更に、
測定に要する時間も従来法の１週間程度から２日間に短
縮することができた。
【図１】本発明による方法及び従来法によるカルシトニ
ンの測定感度を示すグラフである。
ンの測定感度を示すグラフである。
【図２】投与後のカルシトニン血中濃度の推移を示すグ
ラフである。
ラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ｃ０７Ｋ 14/585 8318−4Ｈ
Claims (10)
- 【請求項１】 抗カルシトニン抗体の作製方法であっ
て、カルシトニン分子中のジスルフィド結合を還元して
ＳＨ基を遊離させたカルシトニン誘導体で動物を免疫す
ることを特徴とする、前記抗カルシトニン抗体の作製方
法。 - 【請求項２】 前記カルシトニン誘導体の遊離ＳＨ基に
更にキャリアー物質が結合していることを特徴とする請
求項１の作製方法。 - 【請求項３】 前記キャリアー物質がペプチドもしくは
タンパク質、又はそれらの誘導体である請求項２の作製
方法。 - 【請求項４】 前記動物が鳥類又は哺乳類である請求項
１の作製方法。 - 【請求項５】 前記動物がニワトリ、ブタ、ヤギ、ウサ
ギ、ウシ、ラット及びマウスからなる群から選択される
請求項４の作製方法 - 【請求項６】 請求項１〜５のいずれかの方法から作製
され得る抗カルシトニン抗体。 - 【請求項７】 請求項６の抗体を用いたカルシトニンの
測定方法。 - 【請求項８】 酵素免疫反応法である請求項７の測定方
法。 - 【請求項９】 酵素免疫反応法がヘテロ２点結合法であ
る請求項８の測定方法。 - 【請求項１０】 ブロッキング剤にバシトラシンを使用
する請求項８又は９の測定方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP30894A JPH07196700A (ja) | 1994-01-06 | 1994-01-06 | 抗カルシトニン抗体及びその作製方法、並びに該抗体を用いたカルシトニンの測定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP30894A JPH07196700A (ja) | 1994-01-06 | 1994-01-06 | 抗カルシトニン抗体及びその作製方法、並びに該抗体を用いたカルシトニンの測定方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07196700A true JPH07196700A (ja) | 1995-08-01 |
Family
ID=11470285
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP30894A Pending JPH07196700A (ja) | 1994-01-06 | 1994-01-06 | 抗カルシトニン抗体及びその作製方法、並びに該抗体を用いたカルシトニンの測定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH07196700A (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20150361173A1 (en) | 2005-11-14 | 2015-12-17 | Labrys Biologics, Inc. | Antagonist antibodies directed against calcitonin gene-related peptide and methods using same |
| US9328167B2 (en) | 2008-03-04 | 2016-05-03 | Labrys Biologics, Inc. | Methods of treating chronic pain |
| US9896502B2 (en) | 2014-03-21 | 2018-02-20 | Teva Pharmaceuticals International Gmbh | Antagonist antibodies directed against calcitonin gene-related peptide and methods using same |
| US10392434B2 (en) | 2016-09-23 | 2019-08-27 | Teva Pharmaceuticals International Gmbh | Treating refractory migraine |
| US10556945B2 (en) | 2014-03-21 | 2020-02-11 | Teva Pharmaceuticals International Gmbh | Antagonist antibodies directed against calcitonin gene-related peptide and methods using same |
-
1994
- 1994-01-06 JP JP30894A patent/JPH07196700A/ja active Pending
Cited By (20)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| US9328168B2 (en) | 2005-11-14 | 2016-05-03 | Labrys Biologics, Inc. | Methods of using anti-CGRP antagonist antibodies |
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