JPS60224064A - 体液中の基底膜コラーゲンの測定法及び基底膜コラーゲン―ドメインｎｃ１に対する抗体の検出法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、基底膜コラーゲン（ＩＶ型）の球形ドメイｙ
　（ＤｏｍＭｎｅ　；　Ｄｏｍｉｎ　）　ＮＣ１，ｄ々
の動物組織からこのドメインＮＣ１を単ＩｅＥする間車
な方法及び前記蛋白質フラグメントな、体液中の基底膜
成分及び基底膜に対する自己免疫反応を免疫学的に測定
するために使用することに関するＯ 従来の技術 現在非常に多め疾病（Ｓ尿病血管炎、腎臓病、神経腺維
腫、肝臓線維症、上皮性腫瘍）においては、基底膜の変
化（肥厚化、俗解）が特に血営壁中で起こる。これらの
変化は屡々、致命的な合併症を起こさせる。この棟の変
化の検出は、電子顕微°鋭又は免役学的螢光を用いて行
なうことができるが、組成鏡検物質を必要とし、定性的
な検出のみが可能である。最近、適当な動物標本（例え
ば２ツテのストレグトゾトチンー糖尿病；　５ｔｒｅｐ
ｔｏｚｏｔｏｚｉｎ−Ｄｔａｂｅｔ＋ｅｓ　）で１　こ
の棟の基底膜変化は、比較的早期に、循環系内で又は他
の体液中の基底膜成分の増〃口で明示されることが明ら
かになった。

病理学的基紙１莫変化のもう１つの形は、後続反［６（
炎症、蛋白質分解的崩壊）χ介して種々の組＃ｃ（例え
ば腎臓、肺）中の基底膜の機能を妨害することができる
体物異的基底膜蛋白質に対する自己免役反応に基づ（。

この徳の疾病は、ヒトにおいては植々のクローン性腎臓
疾病、多発性硬化症、糖尿病、及び補な病気例えばグツ
ドパスツール症候群（Ｇｏｏｄｐａｓｔｕｒｅ　Ｓｙｎ
ｄｒｏｍ　）及び゛水泡性　天庖艙である。これらの多
くの自己免疫反応は、適当な敏感な試験法がないので、
従来は開発されていなかった。しかしながら、多（の動
物実験では、基底膜成分のい（つかが自己抗原特性を何
するか又は、抗体はこれら蛋白質に対して病理学的に変
化作用をすることを示して＾だ。

基底膜コラーゲン（■型）は、すべての基底膜中に存在
する成分であり、他の機能と並んで、特にこれらＳ造の
機械的安定性に関して責任がある。従って、基底膜の高
い脅威又は分解は、例えばその循環内での基底膜コラー
ゲンの構造の扁い出現と結び付いているはずである。約
６ｏｏｏｏｏの分子−の基底膜コ２−デンは、孤種の構
造のドメイン（ＤｏｍＫｎｅｎ　）即ち、約６６Ｑｎｍ
の長さのトリペルへりクス（ＴｒｉｐｅｌｈｅｌＬｘ入
更に短かい（６０ｎｍ）トリペルヘリクス（７Ｓ−ドメ
イン）及び球形ドメインＮＣ１より成っている。この組
成の基底膜コラ−ｒンの大部分は、共有の父叉網状化（
Ｑｕｅｒｖｅｒｎｅｔ、ｚｕｎｇ　）の結果、不溶であ
る。この交叉網状化は、分子の会合によりおそら（規則
的な大きな網を形成する。この際この会合は、７Ｓ−ド
メイン及び球形ドメインＮＣ１を介して行なわれ、この
際、それぞれ、４個もしくは２個の分子が相互に結合さ
れる。

この配列の結果、岨礒コラーｒンの球形ドメインＮＣ１
は、それぞれ２個の異なる分子からの会合物である。

ところで、本発明は、動物の球形基底膜コラ−Ｃンード
メインＮｅｔを得、基底膜コラーゲンから球形ドメイン
ＮＣ１を単離するために一般的に使用可能な方法を開発
し、動物に由来するこの物質を適当な標賊付けの後に、
体液中の基底膜コラーゲンの敏感で定敏的な検出のため
に使用することを課題としている。同時に、本発明は、
生物学的液体又は組賊を、自家抗体又は自己反応註免投
細砲の存在に関して検査することを可能とする。

この課題は、本発明により、約１７００００ダルトンの
分子量（平衡−超遠心及び元散乱により測定）、約２８
０００ダルトンの分子量のモノマー下位一単位を有する
ヘキテマー構造及び約２饅の炭化水素含有率を有する球
形基庶暎コラーデンードメインＮＣ１により解決される
。

本発明のもう１つの目的は、この球形基紙暎コラーデン
ードメインＮＣ１を収得し、槓ＪＡする方法であり、こ
、れは、動物脂ＬＩＩＲを細菌性コラ−ｒナーゼでの第
１制限処理に供し、優られる分解生成物から弱塩基性ア
ニオン交換体のクロマトグラフ−イにより、非コラーゲ
ン注蛋白質を分離し、欠いで、このコラーｒン分解生成
物を筒めた温度でへ第２コ２−グン分解し、球形ドメイ
ンＮＣ１を分子篩分別により！＃製することよりなる。

球形ドメインＮＣ１を精製する本発明の方法は、直接組
成から出発し、通例非常にロスの多い基低膜の予めの１
１１＃！は省略する０ コラーケ９ン註トリペルへりクスの球形ドメイン及び大
片を完全な形で物質から浴出する細菌性コラーダナーゼ
を用いるこのｍ歇の第１制限処理は重映である。この成
分から、容易に、例えばＤＥＡＥセルロースで、同伴非
コラー／ｙ４／性蛋白質（例えばラミニン）を分離する
ことができる。第２のきびしい条件下に実施されるコラ
−グツ分解は、交叉綱状化された７Ｓ−ドメイン及び球
形ドメインＮＣ１を例外とてる丁べてのコラーデン性ト
リペルヘリクス構造物をＮ４Ｎ４する。

双方の成分は、相互に、かつ同洋分解ペグチドから唯一
の分子篩（例えばアガロース）により分離することがで
き、高い純度で優られる。

この方法は、種々の組板上で使用でき、この除有利に、
胎盤、動物の宮城又は肺臓を使用することができる。こ
の際、球形ドメインＮＣ１の収量は、湿った組＃１にｇ
当り平均２０すである。

この方法は動物組織例えば牛大動脈、もしくはマウスの
ＰＨ８−肉腫にも使用できる。

本発明の方法では、塩合有緩衝溶液中でホモグナイズさ
れた組織かも出発するのが有利である。更に、ＮＣ４の
後の精製のために、組織を第１コラーデナーゼ処理の前
に、グロテアーゼ開薔剤の存在で、塩酸グアニシンを用
いて抽出するのが有利である。この顛特に、約Ｑ、５Ｍ
ＫＣｔを用いる抽出及び約６Ｍのグアニシン片荷浴液を
用いる抽出が有効である。

この工程は、球形ドメインＮＣ１が俗解又は崩解するこ
となしに、かなりの鴬の同伴蛋白負号を除去する〇 第１コラーデナーゼ処理は、１５〜２５℃の感反で実施
するのが有利である。これに反して第２の無制限コラー
デナーゼ処理は５０〜４５℃の一度で実施するのが何オ
リである。

球形ドメイｙ　ＮＣＩは、超遠心機中での精製の後に単
一であり、１７０００００分子重を有する。その構造は
原則的に、ヘキサマーであり、この際、モノマーの下位
単位は２８０００の分子ｉを有する。しかしながら、こ
のモノマーの大部分は、ゾスル７アイド橋又は他の共有
交叉結合を介して結合してシマーの下位単位になってい
る。これは、１〜２　ｆｌｉｌｉｌのモノマー帝及び２
個の通例強いシマー帝の特徴的電気泳動型（ドブフル硫
酸ナトリウムの存在で）を生じさせる。

このヘキサマー４４造は、生理学的条件（例えば中性緩
衝液）下に、蛋白分解に対しても安定である。下位単位
への解離は、酸性−で又は８Ｍ尿素の存在で行なう。こ
の解離は充分に可逆的である。中性緩衝剤に対する透析
は、ヘキサマーの球形構造の再構成を可能にｊ◇。

胎盤、動物の腎臓又は師からの球形ドメインＮＣ１のア
ミノ敗組成物は、非常に類似している（表）。この物質
の炭水化物含分は僅か（２０チ）であり、ゲルコツ°ミ
ンもガラクトチミンを本資有１．てぃ６ｏこの構造の種
々の下位単位は、基底膜コ之−ｒンのその轟初配列にお
いて異なる１（■）鎖及び２（■）ｌｉｔから生じる。

この基底膜構造ＮＣ１（以後抗原と称する）は、血液中
及び体液中の基戚膜コラーデンの本発明による測定を公
知の免疫学的検出法の使用下に可能にする。この方法は
、公知緻の標識抗原と被検試料中の未知蓋の抗原との共
通の抗体に対する競争に基づく。この際、ラジオイムノ
テスト（ＲＩＡ　）及び酵素免役テス）　（ＥＩＡ　）
の公印変形が使用できる。この櫨の方法は当業者にとっ
ては公知であり、詳細には述べない０これらの丁ぺての
方法は、適当な夷験勘物中の尚ａＪＡ抗体を用いて抗血
清（抗体）を＃造し１これ又は特異的に単離された抗体
を用いて、反応成分の相応するインキュベートにより、
慣用の抗体−仇涼一複合反応乞通行させることに基づ（
。

被検体液試料中に存在する標識されて＾ない抗原の緻に
応じて、この標識抗原の１部分のみが、この複合体中に
結合され、この複合体の単離によるか又は上澄み中で測
定することができる。

複合体中に結合した標識抗原の量は、非標識抗原の敏に
関係するから、こうして、体液中の基底膜コラーゲンも
しくはドメインＮＣ１の含分を測定することができる。

抗血清のＪＡ造は常法で、実験動物、有オリにクサイの
皮下注射により行なうことができる。この際、この抗原
は、完全なフロイントのアジュバント（Ｆ’ｒｅｕｎｄ
ｓｃｈｅｎ　Ａｄｊｕｖａｎｓ　）と共に適用するのが
有利である。この際、抗原として、球形ドメインＮＣ１
Ｏ，１〜０．２Ｉｖの２回注射で充分であることが判明
した。生じる抗血清は次いで常法で収得され、それ自体
として使用することができる。血清中に存在する抗体を
親和性クロマトグラフィの方法で梢製することも可能で
あΦＯ 仇涼０４Ｍ誠付けは、原則的に、放射性ｔ２櫨１１２５
を蛋白質中に導入する公知方法で行なうことができる。

この際、ポルトン−ハンターｇ＜（ＢＯｌｔＯｎ−Ｈｕ
ｎｌｅｒ−ＲｅａｇｅｎＺ　；　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ
、　１３６巻（１９７３年）５２９〜５３９頁）を用＾
る球形ドメインの襟−付けが特に有利であると判明シタ
。クロラミ７Ｔ法（Ｃｈｌｏｒａｍｔｎ　ＴＭｅｔｈｏ
ｄｓ　）による標識付けは、低い成果で進行し、抗体に
２０〜５０％のみが結合している標識抗原を生じさせる
。

本発明による測定の有利な実施形は、非結合抗原からの
特異的抗血清で形成された抗原−抗体−複合体の分離を
、第２の抗体（抗血清）の使用により実施することにあ
る。この際、第２抗体として、抗血清を収得するために
使用される動物の免役グロブリンＧに対する抗血清を使
用するのが有利である。溶液からのこれにより不溶の形
に変えられた抗原−抗体一複会体の分離は、このために
慣用の方法で、例えば遠心分離により行なうことができ
る。抗原−抗体−複合体の分離の後に、複合体中に結合
している襟ｇ（放射能、酵索后注）を測定する。公知の
抗原酋分の試料を用いて得られた校正曲線を用いて、被
検試料中にき有される抗原の瀘を測定することができる
◎ 本発明による免役学的測定法は、１ｎｌ／ｒｎｌの範囲
までの濃度の測定を可能にする。従って、この方法な体
液中の基底膜コラ−ｒノの測定のために使用することが
可能である。正常の個体では、抗原の一度は、５〜２０
　ｎ９７ｍ１の範囲にあり、基底膜変化を伴なう疾病（
糖尿病、腫瘍）時には、著るしく扁まる。

生物学的物質中の抗原の測定と並んで、この方法は、抗
原に対する抗体（有利に自家抗体）の慣用のためにも利
用することができる。このために、躊在的抗体諒例えば
血清の槙々の稀釈物を標−抗原と共に、前ｉ己と同様に
インキユベートシ、抗原−抗体−複合体を分離し、結合
した抗）ｊＡｉｔを分析丁り。これとの比較として、類
１以結合実験な芙′ＪＭする正常血清を用いて実施丁Φ
（負対照）。仄いで、この負対照に対する結合活性のち
がいを自家抗体の存在に関する尺度として計画する。

実施例 例　１ 動物組峨からの球形ドメインＮＣ１の製造胎盤、動物の
腎臓又は肺臓１ゆを［１，５Ｍ　ＫＣｔ　。

０．１　Ｍ　）リス−Ｈｃｔ（ｐ）１７．４　）からの
溶液５ノ中でホモｒナイズし、４°０で２４時間攪拌す
るＯ次いで、残留物を６Ｍグアニシン−塩酸＋４２７も
しくは１ノで各々１回４℃で抽出する。すべての抽出緩
衝液は、ｐ−ヒドロキシ安息香酸水銀及び弗化フェニル
メタンスルホニル（各々２０す／１３）をグロテアーゼ
明否剤として含何する。次めで残留物を水に対して透析
させ、凍結乾燥させる。この凍結乾燥させた残分子１２
．０．９を、Ｑ、２Ｍ　ＮａＣ２，０，００２Ｍ　Ｃａ
Ｃｌ２．０．０５Ｍトリス−Ｈｃｔ（Ｐ［（７，４）よ
りなる溶液８００ｄ中でホモデナイズし、細菌性コラー
ゲナーゼ８ダを用いて室温で２４時間分解させる。この
分解を１回くり返し、染めた上澄みを、ＥＤＴＡ（０゜
００５Ｍ）１７）添加の後に、３　Ｍ　ＮａＣ１で沈殿
させる。沈殿物を２Ｍ尿素、０．０５Ｍ）リス−圧ｔ（
ｐＨ８，６）よりなるｍ液中に蒔かし、同じ緩衝液で千
倫化されているＤＥＡＥセルロースのカラム（２，５ｘ
　２５ｃｍ）上に８口える。このカラムに結合しない物
質ン、０．２Ｍム炭酸アンモニウム（ｐｉ４７・９）に
対して透析させ、ニア２−グオーゼ５〜１Ｑ＋＋ｙの蚕
卵の民に、再度６７℃で２４時間分解させ、引続き凍結
乾祿させる。＃梃的櫂度ば、アガロースＡｉ、５ｍカラ
ム中で、ｌ　Ｍ　ＣａＣｔ２．０．０５　Ｍ　）リス−
ＨＣｔ（ｐＨ７，４）からなる溶液を柑いて行なう。こ
うして侍だ生成物は、次表に記載のアミノば組成冑を何
する。

胎盤、動物の′ｌｆ臓又は肺臓から単離されトリブトフ
ァン　６５−− メイ 中の列１で優られた球形ド〜＼ンＮＣ１２５μｇを、Ｉ
”　ｉ　ｍｃｉで標砿されたボルトンーハンｐ−ｇ楽（
３−沃素−１ｐ−ヒドロキシンエニルグロピオン酸〜Ｎ
−ヒにロキ７−スク７ンイミトエステル）と共に４℃で
４５分間イン牛ユベートする。この反応を、０．１Ｍホ
ウ酸塩緩衝液（ｐＨ８，５）　中ノ０．２　Ｍグリｖ　
７０．２　ｍＡ！のｖＪ衾７１０により停止させ旬。欠
いで、結合しなかった試薬を、緩衝液に対する透析又は
ビオデルＰ２（Ｂｉｏ（）ｅｌ　Ｆ　２　）でのケ９ル
濾過により除去する。

例　３ を欠の１告試験で測定する： 完全ンロインｒアシユバンス中のＮＣｔ　Ｏ，１５ｍノ
の２回注射により潜られる特異的抗体又は抗血清の一定
量を、未知の試料と共に４℃で１６時間前インキユベー
トシ、例２による標識抗原１　ｎｇの添加の後に、更に
４℃で８時間インキュベートする。その後、ウサギ−免
疫グロブリン０に対する過剰の抗体を添加し、４℃で更
に１６時間の後に、免疫複合体中に結合した抗原を遠心
により分離する。未知の試料の岨害活性を、Ｒ，＃、誠
抗原の標準濃度の活性と比較する。

手続（正置（自船 昭和６０年　５月ｌり日 特許庁長官殿 １、事件の表示 昭和６０年特許願第　５３５３４　号 ２、発明の名称 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 ４、代理人 ６、補正の対象 明細書の発明の名称の欄、特許請求の範囲の欄及び発明
の詳細な説明の欄 ７　補正の内容 （１）　発明の名称を次のとおシ補正する：「体液中の
基底膜コラーゲンの測定法及び基底膜コラーゲン−ドメ
インＮＣＩに対する抗体の検出法」 （２、特許請求の範囲を別紙のとおり補正する。

（３）明細書２頁下から２行の［；　Ｄｏｍｉｎ　Ｎ（
Ｊ、Ｊ　ヲ「；　Ｄｏｍａｉｎ）ＮＣＬＪと補正する。

（４）　同２頁末行の［￥メインＮＣ１Ｊを［ドメイン
Ｎ０月と補正する。

（５）同５頁牛行、同頁１０行、同頁１３行、同頁１７
行及び同頁１８行のｒ　ＮＣ７！Ｊを「ＮＣ１」と補正
する。

（６）同６頁１２行及び同頁１４行の「ＮＣｌ」を［Ｎ
Ｃ１ｊと補正する。

（７）　同７頁１行、同頁３行及び同頁１４行の「ＮＣ
ｅ」ヲ「ＮＣ１」ト補正スル。

（８）同８頁１行、同頁７行、同頁１３行及び同頁末行
の「ＮＣｌ」をｌｌ’、ＩｃＩＪと補正する。

（９）同９頁１７行の（−ＮＣＩＩＪをｒＮｃＩＪと補
正する。

１０）　同１０頁３行の「ＮＣｌ」を「ＮＣ１」と補正
する。

１１）同１１頁３行及び同頁１０行のｒＮ（ＪＪをｒＮ
ｃＩＪと補正する。

１２）　同１４頁２行の「ＮＣｌ」をｒＮｃｌＪと補正
する。

■３）同１６頁３行の「ＮＣｌ」をｒＮｃＩＪと補正す
る。

１４）　同１７頁２行、同頁手行、同頁１ｃ行及び同頁
１８行のＩＮ（ＪＪをｒＮｃｌＪと補正する。

２、特許請求の範囲 １、　ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ　）又は酵素分析
の方法で、体液中の基底膜コラーゲンを測定するために
、平衡限外遠心及び光散乱によシ測定した分子量約１７
００００ダルトンを有し、分子量約２８０００ダルトン
のモノマー下位単位を有するヘキサマー構造より成り、
約２チの炭水化物を含有し、標識された形の球形基底膜
コラーゲン−ドメインｙ≧ニ対スる抗体を使用すること
を特徴とする、体液中の基底膜コラーゲンの測定法。

２、抗血清、単離された抗体又はモノクロナール抗体の
形の抗−ＮＣＩ−抗体を特徴する特許請求の範囲第１項
記載の方法。

３、付加的に、抗−ＮＣＩ−抗体を得るために使用され
た動物の免疫グロブリンＧに対する抗体を特徴する特許
請求の範囲第１項又は第２項記載の方法。

牛、　ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ　）又は酵素分析
（ＥＩＡ）の方法で体液内の球形基底膜コラーゲン−ド
メイン−ＮＣＩに対する抗体を検出するために、平衡限
外遠心及び光散乱により測定した分子量約１７００００
ダルトンを有し、分子量約２８０００ダルトンのモノマ
ー下位単位を有するヘキサマー構造よシ成シ、約２係の
炭水化物を含有し、標識された形の球形基底膜フラーゲ
ンードメインＮＣ１を使用することを特徴とする、体液
内の球形基底膜コラーゲン−ドメインＮＣＩに対する抗
体を検出する方法。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、　ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ　）又は酵素分析
   の方法で、体液中の基底膜コラーゲンを測定するために
   、＋浦限外遠心及び元赦乱により測定した分子量約１７
   ００００ダルトンを有し、分子量約２８０００ダルトン
   のモノマー下位単位を有するヘキサマー構造より成り、
   約２％の炭水化物を含有し、係！された形の球形基祇換
   コラーｒンードメインＮＣｔに対する抗体を使用するこ
   とを特徴とする、体液中の基底膜コラ−ｒンの測定法。 ２、抗血清、単離された抗体又はモノクロナール抗体の
   形の抗−ＮＣ１−抗体を特徴する特許請求の範囲＠１項
   記載の方法。 ６、　付加的に、抗−ＮＣ１−抗体を得るために使用さ
   れた動物の免疫グロブリンＧに対する抗体を特徴する特
   許請求の範囲第１項又は第２項記載の方法。 ４、　ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ　）又は酵素分析
   （ＥＩＡ　）の方法で体液内の球形基底膜コラーゲンー
   タメインーＮＣ４に対する抗体を検出ｊΦために、平衡
   限外遠心及び元赦乱により測定した分子量約１７０００
   ０ダルトンを有し、分子量約２８０００ダルトンのモノ
   マー下位単位を有するヘキサマー構造より成り、約２％
   の炭水化物を合有し、標誠された形の球形基底−コラー
   ダン−ドメインＮＣ１を使用することを特徴とする、体
   液内の球形基底膜コラーデンードメインＮＣ１に対する
   抗体を検出する方法。