JP3245052B2 - Ｉ型プロコラーゲンのアミノ末端プロペプチドに対する抗体およびそれを用いるアッセイ法 - Google Patents
Ｉ型プロコラーゲンのアミノ末端プロペプチドに対する抗体およびそれを用いるアッセイ法Info
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin, cold insoluble globulin [CIG]
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6887—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids from muscle, cartilage or connective tissue
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin, cold insoluble globulin [CIG]
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、たとえば血清など
のサンプル中のＩ型プロコラーゲンのインタクトな（in
tact、以下本明細書では用語「インタクトな」とは、未
変性でトリマー形のままであることを意味する）、古典
形（classical）またはα１−ホモトリマー形のいずれ
かのアミノ末端プロペプチドを免疫学的に測定するため
の改良されたアッセイ法、ならびにこの方法に用いるの
に適した抗血清の調製に関する。
のサンプル中のＩ型プロコラーゲンのインタクトな（in
tact、以下本明細書では用語「インタクトな」とは、未
変性でトリマー形のままであることを意味する）、古典
形（classical）またはα１−ホモトリマー形のいずれ
かのアミノ末端プロペプチドを免疫学的に測定するため
の改良されたアッセイ法、ならびにこの方法に用いるの
に適した抗血清の調製に関する。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】Ｉ型
コラーゲンは、人体において最も豊富に存在するコラー
ゲンである。ほかの軟（soft）結合組織にもかなりの量
が含まれるが、その大部分は骨に見られる。たとえば骨
などの鉱物化された組織では、有機性マトリックスの約
９０％がＩ型コラーゲンであり、これらの組織には他の
型のコラーゲンは存在しない。したがって、Ｉ型コラー
ゲンの分析は、たとえば１次および２次骨粗鬆症を含む
代謝性の骨の疾病、乳ガンもしくは前立腺ガンにおける
骨転移、リウマチ性関節炎ならびに、たとえば骨形成不
全などの種々の遺伝的疾病などの骨に影響を与える疾病
において重要である。また、骨におけるコラーゲン合成
速度は、たとえば成長ホルモン、チロキシン、コルチゾ
ールおよびエストロゲン類などの種々のホルモンに影響
を受けることも知られている。
コラーゲンは、人体において最も豊富に存在するコラー
ゲンである。ほかの軟（soft）結合組織にもかなりの量
が含まれるが、その大部分は骨に見られる。たとえば骨
などの鉱物化された組織では、有機性マトリックスの約
９０％がＩ型コラーゲンであり、これらの組織には他の
型のコラーゲンは存在しない。したがって、Ｉ型コラー
ゲンの分析は、たとえば１次および２次骨粗鬆症を含む
代謝性の骨の疾病、乳ガンもしくは前立腺ガンにおける
骨転移、リウマチ性関節炎ならびに、たとえば骨形成不
全などの種々の遺伝的疾病などの骨に影響を与える疾病
において重要である。また、骨におけるコラーゲン合成
速度は、たとえば成長ホルモン、チロキシン、コルチゾ
ールおよびエストロゲン類などの種々のホルモンに影響
を受けることも知られている。
【０００３】Ｉ型コラーゲンは、分子の両端にプロペプ
チド伸長部を含有するプロコラーゲンとして合成され
る。Ｉ型コラーゲンの合成速度は、したがってプロコラ
ーゲンからコラーゲンへの変換の際に遊離されるプロペ
プチドの量を測定することにより評価することができ
る。血清中のＩ型プロコラーゲンのカルボキシ末端プロ
ペプチド（以下、ＰＩＣＰという）をアッセイすること
は知られている（メルッコ・ジェイ、ニエミ・エス、リ
ステリ・エル、リステリ・ジェイ（Melkko J,NiemiS,Ri
steli L,Risteli J）、クリニカル・ケミストリー（Cli
n. Chem.）（１９９０）３６、１３２８〜１３３２頁参
照）。しかしながら、このプロペプチドの循環からの消
失速度が低下して、そのためにＩ型プロコラーゲンの合
成速度とは関係なくＰＩＣＰの血中濃度が非常に高い特
定の個体がいる。他方、Ｉ型プロコラーゲンのアミノ末
端プロペプチド（以下、ＰＩＮＰという）用に開発され
た従来のアッセイは、合成モノマー線状ペプチド（エベ
リング・ピーアール、ピーターソン・ジェイエム、リグ
ス・ビーエル（Ebeling PR,Peterson JM,Riggs BL）、
ジャーナル・オブ・ボーン・アンド・ミネラル・リサー
チ（J.Bone Miner.Res.）（１９９２）７、１２４３〜
１２５０頁ならびにリンカート・エスジー、リンカート
・ティーエイ、タイラー・エイディ、ワーゲダール・ジ
ェイイー、ベッチカ・ピー、ベイリンク・ディジェイ
（Linkhart SG,Linkhart TA,Taylor AD,Wergedahl JE,B
ettica P,Baylink DJ）、クリニカル・ケミストリー、
（１９９３）３９、２２５４〜２２５８頁参照）、また
は羊水（テイスナー・ビー、ボジェ・ラスムッセン・エ
イチ、ホズラップ・ピー、イーデ−アンダーソン・イ
ー、スクジョエット・ケー（Teisner B,Boje Rasmussen
H,Hoejrup P,Yde-Anderson E,Skjoedt K）、アクタ・
パソロジカ・マイクロバイオロジカ・エト・イムノロジ
カ・スカンジナビア（APMIS）（１９９２）１００、１
１０６〜１１１４頁ならびにプライス・ケーエム、シル
マン・アール、アームストロング・ピー、グルジンスカ
ス・ジェイジー（Price KM,Silman R,Armstrong P,Grud
zinskas JG）、クリニカ・キミカ・アクタ（Clin.Chim
Acta）（１９９４）２２４、９５〜１０２頁参照）もし
くは細胞培養培地（ユッコラ・エイ、リステリ・エル、
メルッコ・ジェイ、リステリ・ジェイ（Jukkola A,Rist
eli L,Melkko J,Risteli J.）、ジャーナル・オブ・ボ
ーン・アンド・ミネラル・リサーチ（１９９３）８、６
５１〜６５７頁参照）から単離したプロペプチドのいず
れかにもとづくものである。そのようなアッセイは、ヒ
ト血清中の大きさの異なる２種の抗原性を有する形（fo
rm）を検出する、ということがわかっている。１つの形
は真性（authentic）トリマーであるプロペプチドと大
きさが一致するが、他方はそれがさらに分解された産物
であって、球形の、いわゆるプロペプチドのＣｏｌ１ド
メインに類似している。
チド伸長部を含有するプロコラーゲンとして合成され
る。Ｉ型コラーゲンの合成速度は、したがってプロコラ
ーゲンからコラーゲンへの変換の際に遊離されるプロペ
プチドの量を測定することにより評価することができ
る。血清中のＩ型プロコラーゲンのカルボキシ末端プロ
ペプチド（以下、ＰＩＣＰという）をアッセイすること
は知られている（メルッコ・ジェイ、ニエミ・エス、リ
ステリ・エル、リステリ・ジェイ（Melkko J,NiemiS,Ri
steli L,Risteli J）、クリニカル・ケミストリー（Cli
n. Chem.）（１９９０）３６、１３２８〜１３３２頁参
照）。しかしながら、このプロペプチドの循環からの消
失速度が低下して、そのためにＩ型プロコラーゲンの合
成速度とは関係なくＰＩＣＰの血中濃度が非常に高い特
定の個体がいる。他方、Ｉ型プロコラーゲンのアミノ末
端プロペプチド（以下、ＰＩＮＰという）用に開発され
た従来のアッセイは、合成モノマー線状ペプチド（エベ
リング・ピーアール、ピーターソン・ジェイエム、リグ
ス・ビーエル（Ebeling PR,Peterson JM,Riggs BL）、
ジャーナル・オブ・ボーン・アンド・ミネラル・リサー
チ（J.Bone Miner.Res.）（１９９２）７、１２４３〜
１２５０頁ならびにリンカート・エスジー、リンカート
・ティーエイ、タイラー・エイディ、ワーゲダール・ジ
ェイイー、ベッチカ・ピー、ベイリンク・ディジェイ
（Linkhart SG,Linkhart TA,Taylor AD,Wergedahl JE,B
ettica P,Baylink DJ）、クリニカル・ケミストリー、
（１９９３）３９、２２５４〜２２５８頁参照）、また
は羊水（テイスナー・ビー、ボジェ・ラスムッセン・エ
イチ、ホズラップ・ピー、イーデ−アンダーソン・イ
ー、スクジョエット・ケー（Teisner B,Boje Rasmussen
H,Hoejrup P,Yde-Anderson E,Skjoedt K）、アクタ・
パソロジカ・マイクロバイオロジカ・エト・イムノロジ
カ・スカンジナビア（APMIS）（１９９２）１００、１
１０６〜１１１４頁ならびにプライス・ケーエム、シル
マン・アール、アームストロング・ピー、グルジンスカ
ス・ジェイジー（Price KM,Silman R,Armstrong P,Grud
zinskas JG）、クリニカ・キミカ・アクタ（Clin.Chim
Acta）（１９９４）２２４、９５〜１０２頁参照）もし
くは細胞培養培地（ユッコラ・エイ、リステリ・エル、
メルッコ・ジェイ、リステリ・ジェイ（Jukkola A,Rist
eli L,Melkko J,Risteli J.）、ジャーナル・オブ・ボ
ーン・アンド・ミネラル・リサーチ（１９９３）８、６
５１〜６５７頁参照）から単離したプロペプチドのいず
れかにもとづくものである。そのようなアッセイは、ヒ
ト血清中の大きさの異なる２種の抗原性を有する形（fo
rm）を検出する、ということがわかっている。１つの形
は真性（authentic）トリマーであるプロペプチドと大
きさが一致するが、他方はそれがさらに分解された産物
であって、球形の、いわゆるプロペプチドのＣｏｌ１ド
メインに類似している。
【０００４】入手可能な証拠から、これらの低分子量分
解産物は、遊離されたプロペプチドのさらなる分解に由
来するのではなく、組織中にアミノ末端プロペプチドを
保持しているＩ型プロコラーゲン分子（いわゆるｐＮＩ
型コラーゲン）の分解に由来しているようである。その
ような分子はＩ型コラーゲン線維の表面、おもに軟結合
組織中および一時的には新生の非鉱物化骨様物質中に見
られる。さらに、真性アミノ末端プロペプチドは、肝臓
内皮細胞のスカベンジャー−レセプターをへて循環から
除去されるが、より小さいＣｏｌ１関連分解産物は、腎
臓をへて除去されることが示されている。したがって、
腎臓疾患ではＣｏｌ１関連ペプチドのクリアランスが減
少し、そのようなペプチドの血清中濃度に大きく影響し
て、コラーゲン合成に関する誤った結果を招くであろ
う。Ｉ型プロコラーゲンのインタクトなアミノ末端プロ
ペプチドは尿中には排泄されないので、本発明のアッセ
イは血清およびその他の尿以外の生物学的液体に適用可
能である。さらに、重病患者にしばしば見られる異化状
態は、ｐＮＩ型コラーゲンの組織分解を増加させ、同様
に血清中Ｃｏｌ１濃度を増加させ、患者の同化能につい
て誤った情報を与える。
解産物は、遊離されたプロペプチドのさらなる分解に由
来するのではなく、組織中にアミノ末端プロペプチドを
保持しているＩ型プロコラーゲン分子（いわゆるｐＮＩ
型コラーゲン）の分解に由来しているようである。その
ような分子はＩ型コラーゲン線維の表面、おもに軟結合
組織中および一時的には新生の非鉱物化骨様物質中に見
られる。さらに、真性アミノ末端プロペプチドは、肝臓
内皮細胞のスカベンジャー−レセプターをへて循環から
除去されるが、より小さいＣｏｌ１関連分解産物は、腎
臓をへて除去されることが示されている。したがって、
腎臓疾患ではＣｏｌ１関連ペプチドのクリアランスが減
少し、そのようなペプチドの血清中濃度に大きく影響し
て、コラーゲン合成に関する誤った結果を招くであろ
う。Ｉ型プロコラーゲンのインタクトなアミノ末端プロ
ペプチドは尿中には排泄されないので、本発明のアッセ
イは血清およびその他の尿以外の生物学的液体に適用可
能である。さらに、重病患者にしばしば見られる異化状
態は、ｐＮＩ型コラーゲンの組織分解を増加させ、同様
に血清中Ｃｏｌ１濃度を増加させ、患者の同化能につい
て誤った情報を与える。
【０００５】したがって、２種のプロペプチド形の異な
る起源および除去経路によって起こる結果の解釈の問題
を解決し、操作が迅速で簡単な、ヒト血清中の、Ｃｏｌ
１関連分解産物を除いた、Ｉ型プロコラーゲンのインタ
クトなアミノ末端プロペプチドのみをアッセイするため
の定量法を提供することが望まれる。
る起源および除去経路によって起こる結果の解釈の問題
を解決し、操作が迅速で簡単な、ヒト血清中の、Ｃｏｌ
１関連分解産物を除いた、Ｉ型プロコラーゲンのインタ
クトなアミノ末端プロペプチドのみをアッセイするため
の定量法を提供することが望まれる。
【０００６】インタクトなプロペプチドはトリマーの形
で存在するが、分解産物はＩ型プロコラーゲンのα１鎖
のモノマーの球形Ｃｏｌ１ドメインからなる。Ｉ型プロ
コラーゲンのインタクトなトリマーアミノ末端プロペプ
チドをガン患者の胸水から単離したところ、驚いたこと
に構成鎖が異なる２種の別々のプロペプチドが発見され
た。古典形Ｉ型プロコラーゲンは、Ｉ型プロコラーゲン
のプロα１鎖２本およびプロα２鎖１本からなるヘテロ
トリマーなので、ＤＥＡＥ−クロマトグラフィーカラム
から最初に溶出されたプロペプチド形中には、２種の異
なるポリペプチド鎖が見出された。酸性のプロペプチド
（プロα１−ホモトリマープロペプチド）は、電気泳動
でより速く移動し、Ｉ型プロコラーゲンのプロα２鎖に
由来することが知られている第２のポリペプチドを欠い
ていた。この非定形的なプロペプチドは、同一のプロα
１鎖３本を含有するα１−ホモトリマー形Ｉ型プロコラ
ーゲンに由来していた。そのようなコラーゲンについ
て、たとえば乳ガン、肺ガンおよび胃ガンなどの特定の
疾病状態の患者の組織から充分に処理された形について
は以前に記載されていたが、対応するプロペプチドは同
定されていなかった。プロα２鎖のアミノ末端部はプロ
α１鎖に比べて小さく、Ｃｏｌ１ドメインの全体を欠い
ているので、α１−ホモトリマー形プロペプチドは３つ
のＣｏｌ１ドメインを有し、古典形プロペプチドでは２
つだけ有している。Ｃｏｌ１ドメインはリン酸化されて
いるので、これら２つのインタクトなプロペプチドは、
たとえばｐＨ５．０においてＤＥＡＥ−クロマトグラフ
ィーを用いると、電荷の違いにもとづいて互いに分離す
ることができる。α１−ホモトリマー形プロペプチドは
３つのＣｏｌ１ドメインを有し、古典形プロペプチドは
２つしか持たないので、アニオン交換クロマトグラフィ
ーにおいて古典形プロペプチドはより早く溶出する。こ
れらのプロペプチドは双方とも低いｐＨ（５．０より
小）で変性されやすい。抗体を産生する際に適切な予防
策が採られないと、容易には検出されない何かが問題を
起こしうる。
で存在するが、分解産物はＩ型プロコラーゲンのα１鎖
のモノマーの球形Ｃｏｌ１ドメインからなる。Ｉ型プロ
コラーゲンのインタクトなトリマーアミノ末端プロペプ
チドをガン患者の胸水から単離したところ、驚いたこと
に構成鎖が異なる２種の別々のプロペプチドが発見され
た。古典形Ｉ型プロコラーゲンは、Ｉ型プロコラーゲン
のプロα１鎖２本およびプロα２鎖１本からなるヘテロ
トリマーなので、ＤＥＡＥ−クロマトグラフィーカラム
から最初に溶出されたプロペプチド形中には、２種の異
なるポリペプチド鎖が見出された。酸性のプロペプチド
（プロα１−ホモトリマープロペプチド）は、電気泳動
でより速く移動し、Ｉ型プロコラーゲンのプロα２鎖に
由来することが知られている第２のポリペプチドを欠い
ていた。この非定形的なプロペプチドは、同一のプロα
１鎖３本を含有するα１−ホモトリマー形Ｉ型プロコラ
ーゲンに由来していた。そのようなコラーゲンについ
て、たとえば乳ガン、肺ガンおよび胃ガンなどの特定の
疾病状態の患者の組織から充分に処理された形について
は以前に記載されていたが、対応するプロペプチドは同
定されていなかった。プロα２鎖のアミノ末端部はプロ
α１鎖に比べて小さく、Ｃｏｌ１ドメインの全体を欠い
ているので、α１−ホモトリマー形プロペプチドは３つ
のＣｏｌ１ドメインを有し、古典形プロペプチドでは２
つだけ有している。Ｃｏｌ１ドメインはリン酸化されて
いるので、これら２つのインタクトなプロペプチドは、
たとえばｐＨ５．０においてＤＥＡＥ−クロマトグラフ
ィーを用いると、電荷の違いにもとづいて互いに分離す
ることができる。α１−ホモトリマー形プロペプチドは
３つのＣｏｌ１ドメインを有し、古典形プロペプチドは
２つしか持たないので、アニオン交換クロマトグラフィ
ーにおいて古典形プロペプチドはより早く溶出する。こ
れらのプロペプチドは双方とも低いｐＨ（５．０より
小）で変性されやすい。抗体を産生する際に適切な予防
策が採られないと、容易には検出されない何かが問題を
起こしうる。
【０００７】Ｉ型プロコラーゲンのアミノ末端プロペプ
チドのアッセイにこれまでに用いられた抗血清は、イン
タクトなトリマー形プロペプチドに対してのみでなく、
かなりの強さでモノマー形にも親和性を有している。こ
れは、抗血清を作るのに用いる抗原の性質のためであ
る。線形合成ペプチド、または羊水由来でモノマーの形
で単離されたプロペプチドを抗体作製に用いると、これ
らの抗体はモノマーのＣｏｌ１分解産物に優先的に反応
する。他方、プロペプチドを細胞培養液から単離するば
あい、まずプロコラーゲンの形で精製し、のちに細菌性
コラゲナーゼによって消化し、コラーゲンから適切にプ
ロペプチドを遊離させる。真性のプロペプチドには依然
としてコラーゲンのドメインが含まれているので、細菌
性のコラゲナーゼの一部はそれに結合するが、イン・ビ
トロでの短いインキュベーションおよび単離操作のあい
だにはプロペプチドを消化することはできない。したが
って、そのようなプロペプチドを免疫原として用いる
と、酵素は機能することができ、イン・ビボでのプロペ
プチド分解およびその分解産物に対する抗体の作製が行
われる。さらに、Ｉ型プロコラーゲンのアミノ末端プロ
ペプチドの単離操作のあいだは、たとえわずかな部分で
もプロペプチドを変性させるような条件および方法（た
とえば５．０より低いｐＨでの高速液体クロマトグラフ
ィー）も避けることが必要である。これは、III型プロ
コラーゲンの対応プロペプチドとは対照的に（ＥＰ−Ｂ
−０−３０４２９２参照）、Ｉ型プロコラーゲンのアミ
ノ末端には、構造を安定化し、精製操作のあいだに生じ
た偶然のわずかな変性ののちの迅速な再生も容易にする
鎖間ジスルフィド結合がないためである。したがって、
III型プロコラーゲンからの混雑酵素の除去は、低いｐ
Ｈでの逆相分離によって行なうことが可能である。しか
しながら、Ｉ型プロコラーゲンには安定化するジスルフ
ィド結合がないので、これによりＩ型プロコラーゲンの
トリマー形ＰＩＮＰの変性が引き起こされるであろう。
チドのアッセイにこれまでに用いられた抗血清は、イン
タクトなトリマー形プロペプチドに対してのみでなく、
かなりの強さでモノマー形にも親和性を有している。こ
れは、抗血清を作るのに用いる抗原の性質のためであ
る。線形合成ペプチド、または羊水由来でモノマーの形
で単離されたプロペプチドを抗体作製に用いると、これ
らの抗体はモノマーのＣｏｌ１分解産物に優先的に反応
する。他方、プロペプチドを細胞培養液から単離するば
あい、まずプロコラーゲンの形で精製し、のちに細菌性
コラゲナーゼによって消化し、コラーゲンから適切にプ
ロペプチドを遊離させる。真性のプロペプチドには依然
としてコラーゲンのドメインが含まれているので、細菌
性のコラゲナーゼの一部はそれに結合するが、イン・ビ
トロでの短いインキュベーションおよび単離操作のあい
だにはプロペプチドを消化することはできない。したが
って、そのようなプロペプチドを免疫原として用いる
と、酵素は機能することができ、イン・ビボでのプロペ
プチド分解およびその分解産物に対する抗体の作製が行
われる。さらに、Ｉ型プロコラーゲンのアミノ末端プロ
ペプチドの単離操作のあいだは、たとえわずかな部分で
もプロペプチドを変性させるような条件および方法（た
とえば５．０より低いｐＨでの高速液体クロマトグラフ
ィー）も避けることが必要である。これは、III型プロ
コラーゲンの対応プロペプチドとは対照的に（ＥＰ−Ｂ
−０−３０４２９２参照）、Ｉ型プロコラーゲンのアミ
ノ末端には、構造を安定化し、精製操作のあいだに生じ
た偶然のわずかな変性ののちの迅速な再生も容易にする
鎖間ジスルフィド結合がないためである。したがって、
III型プロコラーゲンからの混雑酵素の除去は、低いｐ
Ｈでの逆相分離によって行なうことが可能である。しか
しながら、Ｉ型プロコラーゲンには安定化するジスルフ
ィド結合がないので、これによりＩ型プロコラーゲンの
トリマー形ＰＩＮＰの変性が引き起こされるであろう。
【０００８】したがって、本発明の方法のための原料と
しては、そのような混雑タンパク質分解酵素を含まない
ものが好ましい。
しては、そのような混雑タンパク質分解酵素を含まない
ものが好ましい。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明は、非変性条件下
にてタンパク質分解酵素を用いずに単離されたＩ型プロ
コラーゲンのインタクトなトリマーのα１−ホモトリマ
ー形アミノ末端プロペプチド、非変性条件下にてタンパ
ク質分解酵素を用いずに単離されたＩ型プロコラーゲン
のインタクトなヘテロトリマー形（古典形）アミノ末端
プロペプチド、これらの製造方法、これらに対する抗体
ならびにこの抗体を用いるアッセイ法およびアッセイキ
ットに関する。
にてタンパク質分解酵素を用いずに単離されたＩ型プロ
コラーゲンのインタクトなトリマーのα１−ホモトリマ
ー形アミノ末端プロペプチド、非変性条件下にてタンパ
ク質分解酵素を用いずに単離されたＩ型プロコラーゲン
のインタクトなヘテロトリマー形（古典形）アミノ末端
プロペプチド、これらの製造方法、これらに対する抗体
ならびにこの抗体を用いるアッセイ法およびアッセイキ
ットに関する。
【００１０】
【発明の実施の形態】本発明は、非変性条件下にてタン
パク質分解酵素を用いずに単離された、Ｉ型プロコラー
ゲンのインタクトな、トリマーの古典形アミノ末端プロ
ペプチドおよびＩ型プロコラーゲンのインタクトなトリ
マーのα１−ホモトリマー形アミノ末端プロペプチドを
提供する。また、単離されたプロペプチドは、プロペプ
チドを分解してモノマーの形にすることのできる酵素、
たとえば細菌性コラゲナーゼなどを含まない。本発明の
プロペプチドは、適切な標識を用いて標識されていても
よい。適切な標識の具体例としては、たとえば放射性標
識、ビオチン（ペルオキシダーゼと結合したアビジンま
たはストレプトアビジンにより検出することができ
る）、ランタニド類、アルカリホスファターゼおよび蛍
光標識（たとえばフルオレセインおよびローダミン）な
どがあげられる。
パク質分解酵素を用いずに単離された、Ｉ型プロコラー
ゲンのインタクトな、トリマーの古典形アミノ末端プロ
ペプチドおよびＩ型プロコラーゲンのインタクトなトリ
マーのα１−ホモトリマー形アミノ末端プロペプチドを
提供する。また、単離されたプロペプチドは、プロペプ
チドを分解してモノマーの形にすることのできる酵素、
たとえば細菌性コラゲナーゼなどを含まない。本発明の
プロペプチドは、適切な標識を用いて標識されていても
よい。適切な標識の具体例としては、たとえば放射性標
識、ビオチン（ペルオキシダーゼと結合したアビジンま
たはストレプトアビジンにより検出することができ
る）、ランタニド類、アルカリホスファターゼおよび蛍
光標識（たとえばフルオレセインおよびローダミン）な
どがあげられる。
【００１１】本発明はまた、ヒトＩ型プロコラーゲン
の、インタクトな古典形およびα１−ホモトリマー形ア
ミノ末端プロペプチドのための精製手順も提供する。さ
らに本発明は、インタクトなプロペプチドの２種の形の
いずれかに対して、好ましくはα１−ホモトリマーの形
に対して作られた抗体であって、プロペプチドのモノマ
ーの形に対する親和性をほとんどまたはまったく、好ま
しくはまったくもたない抗体も提供する。α１−ホモト
リマー形プロペプチドはとくに、適切な３次元配座（コ
ンホメーション）を備えており、モノマー鎖には見られ
ずインタクトなプロペプチドには見られる正しい配置
（コンフィグレーション）のみを認識する抗体を作製す
ることができる。
の、インタクトな古典形およびα１−ホモトリマー形ア
ミノ末端プロペプチドのための精製手順も提供する。さ
らに本発明は、インタクトなプロペプチドの２種の形の
いずれかに対して、好ましくはα１−ホモトリマーの形
に対して作られた抗体であって、プロペプチドのモノマ
ーの形に対する親和性をほとんどまたはまったく、好ま
しくはまったくもたない抗体も提供する。α１−ホモト
リマー形プロペプチドはとくに、適切な３次元配座（コ
ンホメーション）を備えており、モノマー鎖には見られ
ずインタクトなプロペプチドには見られる正しい配置
（コンフィグレーション）のみを認識する抗体を作製す
ることができる。
【００１２】本発明はまた、ヒトＩ型プロコラーゲン
の、インタクトな古典形およびα１−ホモトリマー形ア
ミノ末端ポリペプチドのための精製手順も提供する。原
料として、たとえば前記プロペプチドを充分量含むヒト
胸水、腹水または羊水などの生物学的材料を用いること
ができる。α１−ホモトリマー形プロペプチドは、ガン
性の胸水中に非常にしばしば見られるが、腹水中にはめ
ったに見られず、羊水中には今のところ見つかっていな
い。さらに、単離操作のあいだは、プロペプチドを部分
分解しうる活性のあるタンパク質分解酵素が存在してい
てはいけない。たとえば、ヒト羊水、とくに臨月の羊水
および多くのガン性腹水では、単離のあいだにモノマー
の形に分解されてしまう粗製のプロペプチドを生じるこ
とが分かっている。これは、ゲル濾過分析を繰り返すこ
とにより明らかにすることができる。ゲル濾過を行なう
と、最初はトリマーのプロペプチドが、分析後には真性
のプロペプチドとそのモノマーのＣｏｌ１ドメインとに
対応する２つのピークに分かれる。好ましい単離手順の
本質は以下のとおりである。最も多量に存在する混雑タ
ンパク質であるアルブミンを除去する。これはいかなる
適切な方法で行なってもよい。たとえば、硫酸アンモニ
ウム（５０％より少ない飽和、好ましくは４０％）でプ
ロペプチドを沈殿させることによって行なってよい。ア
ルブミンは沈殿しないので、これによりアルブミンは除
かれる。プロペプチド含有材料をさらに、第１のＤＥＡ
Ｅクロマトグラフィー工程（好ましくはｐＨ６．５ない
しｐＨ７．５の、たとえばｐＨ７．４などの中性のｐＨ
で行なう）、ゲル濾過工程、第２のＤＥＡＥクロマトグ
ラフィー工程（好ましくはｐＨ４．８ないしｐＨ５．２
の、たとえばｐＨ５．０などの低いｐＨで行なう）なら
びに逆相分離工程（好ましくはｐＨ６．５ないしｐＨ
７．５の、たとえばｐＨ７．４などの中性のｐＨで行な
う）により精製する。
の、インタクトな古典形およびα１−ホモトリマー形ア
ミノ末端ポリペプチドのための精製手順も提供する。原
料として、たとえば前記プロペプチドを充分量含むヒト
胸水、腹水または羊水などの生物学的材料を用いること
ができる。α１−ホモトリマー形プロペプチドは、ガン
性の胸水中に非常にしばしば見られるが、腹水中にはめ
ったに見られず、羊水中には今のところ見つかっていな
い。さらに、単離操作のあいだは、プロペプチドを部分
分解しうる活性のあるタンパク質分解酵素が存在してい
てはいけない。たとえば、ヒト羊水、とくに臨月の羊水
および多くのガン性腹水では、単離のあいだにモノマー
の形に分解されてしまう粗製のプロペプチドを生じるこ
とが分かっている。これは、ゲル濾過分析を繰り返すこ
とにより明らかにすることができる。ゲル濾過を行なう
と、最初はトリマーのプロペプチドが、分析後には真性
のプロペプチドとそのモノマーのＣｏｌ１ドメインとに
対応する２つのピークに分かれる。好ましい単離手順の
本質は以下のとおりである。最も多量に存在する混雑タ
ンパク質であるアルブミンを除去する。これはいかなる
適切な方法で行なってもよい。たとえば、硫酸アンモニ
ウム（５０％より少ない飽和、好ましくは４０％）でプ
ロペプチドを沈殿させることによって行なってよい。ア
ルブミンは沈殿しないので、これによりアルブミンは除
かれる。プロペプチド含有材料をさらに、第１のＤＥＡ
Ｅクロマトグラフィー工程（好ましくはｐＨ６．５ない
しｐＨ７．５の、たとえばｐＨ７．４などの中性のｐＨ
で行なう）、ゲル濾過工程、第２のＤＥＡＥクロマトグ
ラフィー工程（好ましくはｐＨ４．８ないしｐＨ５．２
の、たとえばｐＨ５．０などの低いｐＨで行なう）なら
びに逆相分離工程（好ましくはｐＨ６．５ないしｐＨ
７．５の、たとえばｐＨ７．４などの中性のｐＨで行な
う）により精製する。
【００１３】これらプロペプチドは、特定のセリン残基
がリン酸化されているために酸性であるので、広い範囲
のｐＨ（５．０から８．５）でＤＥＡＥカラムとしっか
り結合し、ＮａＣｌで鋭いピーク中に溶出する。第１の
ＤＥＡＥクロマトグラフィー工程では、ほかの混雑タン
パク質を多量に溶出し続けるように、中性のｐＨが好ま
しい。これによって、目的のプロペプチドを効果的に分
離することができる。次いで、ゲル濾過によりプロペプ
チドよりも大きいかまたは小さいタンパク質を除去す
る。カラムは種々の緩衝液で展開することができるが、
たとえばのちに凍結乾燥によって除去することができる
という利点を有する０．２Ｍ 炭酸アンモニウム（ｐＨ
７．９）を用いることができる。低いｐＨ（たとえば約
５．０）での第２のＤＥＡＥクロマトグラフィー工程に
より、材料が多量に存在するためにそれまでに完全には
分離されないで残っていたタンパク質を除去する。最後
の精製は逆相分離により行なわれ、これは、プロペプチ
ドのもともとのトリマー配座を保存するために、ｐＨ
６．５ないしｐＨ７．５の、たとえばｐＨ７．４などの
中性のｐＨで行なうべきである。広く用いられる、移動
相として０．１％ＴＦＡを用いる逆相分離は、部分的な
変性のためにプロペプチドの低収量を招き、トリマーに
特異的な抗体をえることが困難になる。実施例１は、ガ
ン性胸水からどのようにプロペプチドを単離することが
できるかについて詳細に説明する。
がリン酸化されているために酸性であるので、広い範囲
のｐＨ（５．０から８．５）でＤＥＡＥカラムとしっか
り結合し、ＮａＣｌで鋭いピーク中に溶出する。第１の
ＤＥＡＥクロマトグラフィー工程では、ほかの混雑タン
パク質を多量に溶出し続けるように、中性のｐＨが好ま
しい。これによって、目的のプロペプチドを効果的に分
離することができる。次いで、ゲル濾過によりプロペプ
チドよりも大きいかまたは小さいタンパク質を除去す
る。カラムは種々の緩衝液で展開することができるが、
たとえばのちに凍結乾燥によって除去することができる
という利点を有する０．２Ｍ 炭酸アンモニウム（ｐＨ
７．９）を用いることができる。低いｐＨ（たとえば約
５．０）での第２のＤＥＡＥクロマトグラフィー工程に
より、材料が多量に存在するためにそれまでに完全には
分離されないで残っていたタンパク質を除去する。最後
の精製は逆相分離により行なわれ、これは、プロペプチ
ドのもともとのトリマー配座を保存するために、ｐＨ
６．５ないしｐＨ７．５の、たとえばｐＨ７．４などの
中性のｐＨで行なうべきである。広く用いられる、移動
相として０．１％ＴＦＡを用いる逆相分離は、部分的な
変性のためにプロペプチドの低収量を招き、トリマーに
特異的な抗体をえることが困難になる。実施例１は、ガ
ン性胸水からどのようにプロペプチドを単離することが
できるかについて詳細に説明する。
【００１４】本発明はまた、Ｉ型プロコラーゲンのイン
タクトなヘテロトリマーの古典形アミノ末端のプロペプ
チドに対して、またはＩ型プロコラーゲンのインタクト
なトリマーのα１−ホモトリマー形のアミノ末端プロペ
プチドに対して特異的であって、前記プロペプチドのモ
ノマーの形には特異的に結合しない抗体をも提供する。
すなわち、本発明の抗体は、プロペプチドのモノマーの
形に対してはほとんどまたはまったく、好ましくはまっ
たく親和性をもたないが、古典形およびα１−ホモトリ
マー形のトリマー形のうちの１つまたは双方に結合す
る。この抗体は、ヒトＰＩＮＰの検出および定量的測定
において用いることができ、そのため本明細書中に前記
したような疾病および状態などにおける異常なＰＩＮＰ
濃度に結びつくような疾病および状態の診断において有
用である。
タクトなヘテロトリマーの古典形アミノ末端のプロペプ
チドに対して、またはＩ型プロコラーゲンのインタクト
なトリマーのα１−ホモトリマー形のアミノ末端プロペ
プチドに対して特異的であって、前記プロペプチドのモ
ノマーの形には特異的に結合しない抗体をも提供する。
すなわち、本発明の抗体は、プロペプチドのモノマーの
形に対してはほとんどまたはまったく、好ましくはまっ
たく親和性をもたないが、古典形およびα１−ホモトリ
マー形のトリマー形のうちの１つまたは双方に結合す
る。この抗体は、ヒトＰＩＮＰの検出および定量的測定
において用いることができ、そのため本明細書中に前記
したような疾病および状態などにおける異常なＰＩＮＰ
濃度に結びつくような疾病および状態の診断において有
用である。
【００１５】この抗体は、好ましくはモノクローナルで
あるが、ポリクローナルであってもよい。抗体を標識し
てもよい。適切な抗体の標識の具体例としては、放射性
標識、ビオチン（ペルオキシダーゼと結合したアビジン
またはストレプトアビジンによって検出することができ
る）、ランタニド類、アルカリ性ホスファターゼおよび
蛍光標識（たとえばフルオレセインおよびローダミン）
があげられる。用語「抗体」は、ここではインタクトな
抗体分子およびその断片の両方を含めて使われる。好ま
しい断片は、たとえばＦａｂおよびＦ（ａｂ′）２断片
などの少なくとも１つの抗原結合部位を含有する。ヒト
化抗体およびその断片も、用語「抗体」に含まれる。
あるが、ポリクローナルであってもよい。抗体を標識し
てもよい。適切な抗体の標識の具体例としては、放射性
標識、ビオチン（ペルオキシダーゼと結合したアビジン
またはストレプトアビジンによって検出することができ
る）、ランタニド類、アルカリ性ホスファターゼおよび
蛍光標識（たとえばフルオレセインおよびローダミン）
があげられる。用語「抗体」は、ここではインタクトな
抗体分子およびその断片の両方を含めて使われる。好ま
しい断片は、たとえばＦａｂおよびＦ（ａｂ′）２断片
などの少なくとも１つの抗原結合部位を含有する。ヒト
化抗体およびその断片も、用語「抗体」に含まれる。
【００１６】この抗体は、本発明のアミノ末端プロペプ
チドに対するまたはその抗原エピトープ（以下、「免疫
原」という）に対する抗体を宿主動物中に作らせること
により製造される。エピトープは、もちろんプロペプチ
ドのインタクトなトリマーの形を代表するもので、すな
わちそのエピトープに対する抗体はプロペプチドのモノ
マーの形は認識しない。したがって、典型的には、トリ
マーのプロペプチドの配置のため、そのようなエピトー
プは互いに接近して隣り合う異なる鎖に由来する２つ以
上の短いアミノ酸配列を含むもので、すなわち連続的で
はなく不連続エピトープである。この配置はプロペプチ
ドのモノマーの形には存在しないので、そのようなエピ
トープに対する抗体はモノマーを認識しない。典型的に
は、本発明の抗体はＰＩＮＰのアミノ末端の非コラーゲ
ン球形ドメインの大部分に対して作られている。ＰＩＮ
Ｐの古典的な形は、Ｉ型プロコラーゲンのプロ−α１お
よびプロ−α２鎖の双方に由来する鎖を含有するヘテロ
トリマーである。プロ−α２鎖はアミノ末端で短くなっ
ており、球形の抗体形成誘導ドメインを含有しない。プ
ロペプチドのトリマー形およびモノマー形を区別するた
めに、抗体は個々の鎖にではなく３次元の配座に反応し
なくてはならない。したがって、すべてこの球形ドメイ
ンを有する３つの類似した鎖を含有するα１−ホモトリ
マー形ＰＩＮＰがとくに、抗原決定基に含まれる正しい
配座中に３または２本の異なる鎖を含有する複数プロペ
プチド配座の特徴を認識する、本発明の抗体を作るのに
適している。線形の合成ペプチドまたはモノマー鎖を免
疫原として用いるときには、そのような抗体は形成され
えない。
チドに対するまたはその抗原エピトープ（以下、「免疫
原」という）に対する抗体を宿主動物中に作らせること
により製造される。エピトープは、もちろんプロペプチ
ドのインタクトなトリマーの形を代表するもので、すな
わちそのエピトープに対する抗体はプロペプチドのモノ
マーの形は認識しない。したがって、典型的には、トリ
マーのプロペプチドの配置のため、そのようなエピトー
プは互いに接近して隣り合う異なる鎖に由来する２つ以
上の短いアミノ酸配列を含むもので、すなわち連続的で
はなく不連続エピトープである。この配置はプロペプチ
ドのモノマーの形には存在しないので、そのようなエピ
トープに対する抗体はモノマーを認識しない。典型的に
は、本発明の抗体はＰＩＮＰのアミノ末端の非コラーゲ
ン球形ドメインの大部分に対して作られている。ＰＩＮ
Ｐの古典的な形は、Ｉ型プロコラーゲンのプロ−α１お
よびプロ−α２鎖の双方に由来する鎖を含有するヘテロ
トリマーである。プロ−α２鎖はアミノ末端で短くなっ
ており、球形の抗体形成誘導ドメインを含有しない。プ
ロペプチドのトリマー形およびモノマー形を区別するた
めに、抗体は個々の鎖にではなく３次元の配座に反応し
なくてはならない。したがって、すべてこの球形ドメイ
ンを有する３つの類似した鎖を含有するα１−ホモトリ
マー形ＰＩＮＰがとくに、抗原決定基に含まれる正しい
配座中に３または２本の異なる鎖を含有する複数プロペ
プチド配座の特徴を認識する、本発明の抗体を作るのに
適している。線形の合成ペプチドまたはモノマー鎖を免
疫原として用いるときには、そのような抗体は形成され
えない。
【００１７】モノクローナルまたはポリクローナル抗体
を産生する方法は、この分野においてよく知られてお
り、それらのうちのいずれの方法を用いて本発明の抗体
を調製してもよい。ポリクローナル抗体の産生の１つの
方法は、適切な宿主動物、たとえば実験動物を、免疫原
で免疫化する工程、ならびに適切に希釈した血清を用い
る工程または血清からイムノグロブリンを単離する工程
を含んでなる。したがって、動物に免疫原を接種し、つ
いでその動物から血液を採取し、ＩｇＧ画分を精製す
る。モノクローナル抗体を産生する方法は、典型的に
は、所望の抗体を産生する細胞を不死化することを含ん
でなる。接種された実験動物からの脾臓細胞を腫瘍細胞
と融合させることにより、ハイブリドーマ細胞を産生す
ることができる（コーラーおよびマイルスタイン（Kohl
er and Milstein）、ネイチャー（Nature）（１９７
５）２４５、４９５〜４９７頁参照）。また抗体は、た
とえばスケッラ（Skerra）ら（１９８８）（サイエンス
（Science）２４０、１０３８〜１０４１頁参照）によ
って記載されたように、組換えＤＮＡ技術によっても産
生しうる。
を産生する方法は、この分野においてよく知られてお
り、それらのうちのいずれの方法を用いて本発明の抗体
を調製してもよい。ポリクローナル抗体の産生の１つの
方法は、適切な宿主動物、たとえば実験動物を、免疫原
で免疫化する工程、ならびに適切に希釈した血清を用い
る工程または血清からイムノグロブリンを単離する工程
を含んでなる。したがって、動物に免疫原を接種し、つ
いでその動物から血液を採取し、ＩｇＧ画分を精製す
る。モノクローナル抗体を産生する方法は、典型的に
は、所望の抗体を産生する細胞を不死化することを含ん
でなる。接種された実験動物からの脾臓細胞を腫瘍細胞
と融合させることにより、ハイブリドーマ細胞を産生す
ることができる（コーラーおよびマイルスタイン（Kohl
er and Milstein）、ネイチャー（Nature）（１９７
５）２４５、４９５〜４９７頁参照）。また抗体は、た
とえばスケッラ（Skerra）ら（１９８８）（サイエンス
（Science）２４０、１０３８〜１０４１頁参照）によ
って記載されたように、組換えＤＮＡ技術によっても産
生しうる。
【００１８】所望の抗体を産生する不死化された細胞
は、従来の方法によって選択することができる。ハイブ
リドーマは培養により増殖させてもよいし、または同種
異系もしくは免疫能の低下した（薬剤（たとえばガン患
者に用いる薬剤）によってかまたは疾病（たとえばエイ
ズ）によって引き起こされる）宿主に腹腔内注射して腹
水を形成するか、血液中に注射することによって増殖さ
せてもよい。ヒト抗体は、ヒトリンパ球をイン・ビトロ
において免疫化し、ついでエプスタイン−バーウイルス
を用いてリンパ球を形質転換することによって調製でき
る。
は、従来の方法によって選択することができる。ハイブ
リドーマは培養により増殖させてもよいし、または同種
異系もしくは免疫能の低下した（薬剤（たとえばガン患
者に用いる薬剤）によってかまたは疾病（たとえばエイ
ズ）によって引き起こされる）宿主に腹腔内注射して腹
水を形成するか、血液中に注射することによって増殖さ
せてもよい。ヒト抗体は、ヒトリンパ球をイン・ビトロ
において免疫化し、ついでエプスタイン−バーウイルス
を用いてリンパ球を形質転換することによって調製でき
る。
【００１９】モノクロナールおよびポリクローナル抗体
双方の産生のための実験動物は、適切にはヤギ、ウサ
ギ、ニワトリ、ヒツジ、モルモット、ラットまたはマウ
スである。所望のばあいには、免疫原は、たとえばアミ
ノ酸残基のうちの１つの側鎖を介して、適切な担体に結
合しているコンジュゲートとして投与してもよい。担体
分子は、典型的には生理学的に許容可能な担体である。
えられた抗体を単離し、所望のばあいには、たとえば７
０％まで、８０％まで、９０％まで、９５％まで、９９
％まで、または１００％まで精製してもよい。
双方の産生のための実験動物は、適切にはヤギ、ウサ
ギ、ニワトリ、ヒツジ、モルモット、ラットまたはマウ
スである。所望のばあいには、免疫原は、たとえばアミ
ノ酸残基のうちの１つの側鎖を介して、適切な担体に結
合しているコンジュゲートとして投与してもよい。担体
分子は、典型的には生理学的に許容可能な担体である。
えられた抗体を単離し、所望のばあいには、たとえば７
０％まで、８０％まで、９０％まで、９５％まで、９９
％まで、または１００％まで精製してもよい。
【００２０】本発明はまた、Ｉ型プロコラーゲンのイン
タクトなアミノ末端プロペプチドをアッセイする方法で
あって、アッセイすべきサンプルを標識の存在下で、形
成されるプロペプチド／抗体複合体に標識が結合するよ
うに、本発明の抗体に接触させること、および結合およ
び／または非結合標識の量をアッセイすることを含んで
なる方法も提供する。
タクトなアミノ末端プロペプチドをアッセイする方法で
あって、アッセイすべきサンプルを標識の存在下で、形
成されるプロペプチド／抗体複合体に標識が結合するよ
うに、本発明の抗体に接触させること、および結合およ
び／または非結合標識の量をアッセイすることを含んで
なる方法も提供する。
【００２１】原則として、古典形ヘテロトリマーのプロ
ペプチドもしくはα１−ホモトリマー形のプロペプチド
のいずれかを検出および好ましくは定量を行なうことが
でき、かつ本発明の抗体によるこれらのうち１つのペプ
チドへの特異的結合に依存する、いかなるアッセイ技法
を用いてもよい。好ましいタイプの方法の１つは、標識
された抗体、好ましくは放射性標識された抗体の使用に
依存する。そのような方法において、（標識された）プ
ロペプチド（抗原）／抗体複合体の量をアッセイし、そ
れによりサンプル中のプロペプチド（抗原）の量の測定
を行なう。
ペプチドもしくはα１−ホモトリマー形のプロペプチド
のいずれかを検出および好ましくは定量を行なうことが
でき、かつ本発明の抗体によるこれらのうち１つのペプ
チドへの特異的結合に依存する、いかなるアッセイ技法
を用いてもよい。好ましいタイプの方法の１つは、標識
された抗体、好ましくは放射性標識された抗体の使用に
依存する。そのような方法において、（標識された）プ
ロペプチド（抗原）／抗体複合体の量をアッセイし、そ
れによりサンプル中のプロペプチド（抗原）の量の測定
を行なう。
【００２２】また別の好ましいタイプの方法は、標識さ
れた抗原（古典形またはホモトリマー形いずれかのイン
タクトなトリマーのプロペプチド）を本発明の抗体とと
もに用いることに依存する。そのような方法において
は、既知量の標識された、好ましくは放射性標識された
抗原を、未知量の標識されていないプロペプチド（抗
原）を含有するサンプルに加える。標識されたおよび標
識されていない双方の抗原が抗体と、たとえば競合的に
結合し、加えた既知の量と比較して結合している標識さ
れたプロペプチドの量をアッセイすることを用いて、サ
ンプル中にどれだけの標識されていない抗原が存在する
かを決定することができる。これらの好ましいタイプの
方法を、以下にくわしく述べる。
れた抗原（古典形またはホモトリマー形いずれかのイン
タクトなトリマーのプロペプチド）を本発明の抗体とと
もに用いることに依存する。そのような方法において
は、既知量の標識された、好ましくは放射性標識された
抗原を、未知量の標識されていないプロペプチド（抗
原）を含有するサンプルに加える。標識されたおよび標
識されていない双方の抗原が抗体と、たとえば競合的に
結合し、加えた既知の量と比較して結合している標識さ
れたプロペプチドの量をアッセイすることを用いて、サ
ンプル中にどれだけの標識されていない抗原が存在する
かを決定することができる。これらの好ましいタイプの
方法を、以下にくわしく述べる。
【００２３】α１−ホモトリマー形プロペプチドをアッ
セイするばあいには、サンプルを、古典形とα１−ホモ
トリマー形のプロペプチドに分離するために、アッセイ
の前にたとえばＤＥＡＥクロマトグラフィーで処理し
て、さらにトレーサーとして用いるα１−ホモトリマー
形プロペプチドを標識しなくてはならない。アッセイ自
身はこれら２つの形のプロペプチドを区別しないからで
ある。
セイするばあいには、サンプルを、古典形とα１−ホモ
トリマー形のプロペプチドに分離するために、アッセイ
の前にたとえばＤＥＡＥクロマトグラフィーで処理し
て、さらにトレーサーとして用いるα１−ホモトリマー
形プロペプチドを標識しなくてはならない。アッセイ自
身はこれら２つの形のプロペプチドを区別しないからで
ある。
【００２４】本発明は、サンプル中のインタクトなトリ
マーのヒトＰＩＮＰを検出および／または定量する方法
であって、（ａ）サンプルを、本発明の抗体、たとえば
放射性標識された抗体などの標識された抗体と接触させ
る工程、ならびに（ｂ）抗体の、インタクトなトリマー
の形のＰＩＮＰのいずれかとの結合を検出および／また
は定量する工程を含んでなる方法を提供する。
マーのヒトＰＩＮＰを検出および／または定量する方法
であって、（ａ）サンプルを、本発明の抗体、たとえば
放射性標識された抗体などの標識された抗体と接触させ
る工程、ならびに（ｂ）抗体の、インタクトなトリマー
の形のＰＩＮＰのいずれかとの結合を検出および／また
は定量する工程を含んでなる方法を提供する。
【００２５】さらにくわしくは、本発明はヒトＩ型プロ
コラーゲンのインタクトなトリマーのアミノ末端プロペ
プチドをアッセイする方法であって、（ｉ）そのような
プロペプチドを含有することが分かっている、もしくは
含有することが疑われるヒト体液のサンプル、（ii）ヒ
トＩ型プロコラーゲンのインタクトなトリマーのアミノ
末端プロペプチドに対して特異的に結合するが、該プロ
ペプチドがモノマーの形であるときは結合しない抗体、
および（iii）抗原として振る舞う、標識された既知量
の本発明のトリマー形プロペプチド、この前記の３つを
いかなる順序であれ、サンプル中に存在する非標識プロ
ペプチドの量に依存する量だけ標識が抗体に結合するよ
うに、接触させること、ならびにサンプル中のヒトＩ型
プロコラーゲンのインタクトなトリマーの非標識アミノ
末端プロペプチドの濃度を測定するものとして、結合お
よび／または非結合標識の量をアッセイすることを含ん
でなる方法を提供する。
コラーゲンのインタクトなトリマーのアミノ末端プロペ
プチドをアッセイする方法であって、（ｉ）そのような
プロペプチドを含有することが分かっている、もしくは
含有することが疑われるヒト体液のサンプル、（ii）ヒ
トＩ型プロコラーゲンのインタクトなトリマーのアミノ
末端プロペプチドに対して特異的に結合するが、該プロ
ペプチドがモノマーの形であるときは結合しない抗体、
および（iii）抗原として振る舞う、標識された既知量
の本発明のトリマー形プロペプチド、この前記の３つを
いかなる順序であれ、サンプル中に存在する非標識プロ
ペプチドの量に依存する量だけ標識が抗体に結合するよ
うに、接触させること、ならびにサンプル中のヒトＩ型
プロコラーゲンのインタクトなトリマーの非標識アミノ
末端プロペプチドの濃度を測定するものとして、結合お
よび／または非結合標識の量をアッセイすることを含ん
でなる方法を提供する。
【００２６】ヒト体液は、たとえば血液、血漿、血清、
治癒途中の創傷液、腹水、髄液、胸水、滑液、皮膚の水
泡から吸引された液または羊水であってよい。
治癒途中の創傷液、腹水、髄液、胸水、滑液、皮膚の水
泡から吸引された液または羊水であってよい。
【００２７】インタクトなトリマーのヒトＰＩＮＰを検
出または定量するひとつの方法は、ウエスタンブロッテ
ィングである。その方法は、（ｉ）標的であるインタク
トなトリマーのヒトＰＩＮＰを含有するもしくは含有す
ることが疑われるサンプルをゲル電気泳動に付して、サ
ンプル中のペプチドを分離する工程、（ii）分離された
ペプチドを固体支持体（たとえばニトロセルロース支持
体）上にブロッティングによって移す工程、ならびに
（iii）本発明の標識された抗体を、標的であるインタ
クトな、トリマーのヒトＰＩＮＰに結合させる工程とい
う工程を含むことができる。
出または定量するひとつの方法は、ウエスタンブロッテ
ィングである。その方法は、（ｉ）標的であるインタク
トなトリマーのヒトＰＩＮＰを含有するもしくは含有す
ることが疑われるサンプルをゲル電気泳動に付して、サ
ンプル中のペプチドを分離する工程、（ii）分離された
ペプチドを固体支持体（たとえばニトロセルロース支持
体）上にブロッティングによって移す工程、ならびに
（iii）本発明の標識された抗体を、標的であるインタ
クトな、トリマーのヒトＰＩＮＰに結合させる工程とい
う工程を含むことができる。
【００２８】定量方法には、たとえばＥＬＩＳＡ法など
の酵素標識免疫測定法またはラジオイムノアッセイ法が
含まれる。典型的には、ＥＬＩＳＡ法は、（ｉ）非標識
の本発明の抗体を固体支持体上に固定化する工程、（i
i）ＰＩＮＰが非標識抗体によって捕捉されるように、
標的であるインタクトな、トリマーのヒトＰＩＮＰを含
有するもしくは含有することが疑われるサンプルを加え
る工程、（iii）標識された本発明の抗体を加える工
程、ならびに（iv）結合された標識抗体の量を定量する
工程という工程を含んでなる。
の酵素標識免疫測定法またはラジオイムノアッセイ法が
含まれる。典型的には、ＥＬＩＳＡ法は、（ｉ）非標識
の本発明の抗体を固体支持体上に固定化する工程、（i
i）ＰＩＮＰが非標識抗体によって捕捉されるように、
標的であるインタクトな、トリマーのヒトＰＩＮＰを含
有するもしくは含有することが疑われるサンプルを加え
る工程、（iii）標識された本発明の抗体を加える工
程、ならびに（iv）結合された標識抗体の量を定量する
工程という工程を含んでなる。
【００２９】典型的にはラジオイムノアッセイ法は、
（ｉ）検出すべきプロペプチドを含有するもしくは含有
することが疑われるサンプルを本発明の抗体である１次
抗体、および標識された、好ましくは放射性標識された
本発明のプロペプチドと接触させる工程、（ii）えられ
た物質を、１次抗体と結合する固定化された２次抗体と
接触させる工程、（iii）固定化された物質を固定化さ
れなかった物質から分離する工程、ならびに（iv）固定
化された、または固定化されなかった物質の放射能を、
既知濃度のプロペプチドを有するサンプルを用いてえら
れた放射能と比較してアッセイしているサンプルのプロ
ペプチド濃度を決定する工程という工程を含んでなる。
（ｉ）検出すべきプロペプチドを含有するもしくは含有
することが疑われるサンプルを本発明の抗体である１次
抗体、および標識された、好ましくは放射性標識された
本発明のプロペプチドと接触させる工程、（ii）えられ
た物質を、１次抗体と結合する固定化された２次抗体と
接触させる工程、（iii）固定化された物質を固定化さ
れなかった物質から分離する工程、ならびに（iv）固定
化された、または固定化されなかった物質の放射能を、
既知濃度のプロペプチドを有するサンプルを用いてえら
れた放射能と比較してアッセイしているサンプルのプロ
ペプチド濃度を決定する工程という工程を含んでなる。
【００３０】本発明はまた、本発明のアッセイ法を行う
のに適するキットも提供する。このキットは、前記のよ
うなＩ型プロコラーゲンのインタクトなトリマーのアミ
ノ末端プロペプチドに対して特異的であって、モノマー
の形のプロペプチドにはほとんどまたはまったく、好ま
しくはまったく親和性をもたない抗体、たとえば標識さ
れている抗体を含んでいてよい。また、キットには本発
明の抗体、および標識、好ましくは放射性標識された本
発明のプロペプチドを含んでいてもよい。この抗体は抗
原として振る舞い、これによってサンプル中の非標識抗
原の量を測定することができる。
のに適するキットも提供する。このキットは、前記のよ
うなＩ型プロコラーゲンのインタクトなトリマーのアミ
ノ末端プロペプチドに対して特異的であって、モノマー
の形のプロペプチドにはほとんどまたはまったく、好ま
しくはまったく親和性をもたない抗体、たとえば標識さ
れている抗体を含んでいてよい。また、キットには本発
明の抗体、および標識、好ましくは放射性標識された本
発明のプロペプチドを含んでいてもよい。この抗体は抗
原として振る舞い、これによってサンプル中の非標識抗
原の量を測定することができる。
【００３１】以下の実施例によって本発明をさらにくわ
しく説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるも
のではない。
しく説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるも
のではない。
【００３２】
実施例１ タンパク質分解酵素を用いない、ヒトＩ型プロコラーゲ
ンのインタクトな古典形およびα１−ホモトリマー形ア
ミノ末端プロペプチドの未変性の配座での単離肺ガン患
者から症状の緩和のために採取したヒト胸水５ないし１
０リットルを、タンパク質分解酵素阻害剤（３ｍｇ／リ
ットルのフェニルメチルスルホニル液、Ｎ−エチルマレ
イミドおよびｐ−ヒドロキシマーキュリベンゾエート、
ならびに１０ｍＭ ＥＤＴＡ）の存在下で、固体（ＮＨ
4）2ＳＯ4（４０％飽和）で沈殿させた。沈殿したタン
パク質を１５０００×ｇにて３０分間遠心分離すること
により集め、前記のタンパク質分解酵素阻害剤を含有す
る５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣＩ、ｐＨ７．４中に溶解
し、さらにこの緩衝液中で透析した。ついで、サンプル
をこの緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ−セファセル（Seph
acel）カラム（商品名、ファルマシア・ファイン・ケミ
カルズ（Pharmacia Fine Chemicals）社製）（５×５０
ｃｍ）上でクロマトグラフィーに付した。ＮａＣｌの線
形濃度勾配（０から０．５Ｍ ＮａＣｌ、４０００＋４
０００ｍｌ）にて溶出を行なった。ヒトＩ型プロコラー
ゲンのインタクトな古典形およびα１−ホモトリマー型
アミノ末端プロペプチドは、勾配の終わりごろに、大部
分のほかのタンパク質ののちに溶出された。モノマーお
よびトリマー双方のプロペプチドを検出するイムノアッ
セイを用いると、ヒトＩ型プロコラーゲンの少量のモノ
マーのＣｏｌ１関連ペプチドが最初に溶出され、つぎに
インタクトな古典形プロペプチド、最後にα１−ホモト
リマー形アミノ末端プロペプチドが溶出された。２種の
プロペプチドを含有する画分を別々に集めて、以下に記
載する手順を用いて独立に精製した。画分を集めたもの
を０．２Ｍ ＮＨ4ＨＣＯ3、ｐＨ７．９に対して透析
し、凍結乾燥した。これらのサンプルを０．２Ｍ ＮＨ
4ＨＣＯ3中に溶解し、この溶液で平衡化されたセファク
リル（Sephacryl）Ｓ−３００カラム（商品名、ファル
マシア・ファイン・ケミカルズ社製）（１．５×１１０
ｃｍ）上でクロマトグラフィーに付した。プロペプチド
抗原性を含有する画分（ヒトＩｇＧとアルブミンのあい
だの溶出位置）を集め、凍結乾燥した。ついで、サンプ
ルを５０ｍＭ 酢酸アンモニウム緩衝液、ｐＨ５．０中
に溶解し、その溶液に対して短時間透析したのち、高速
液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）装置を用いてアニ
オン交換カラム（プロテイン−パック（Protein-Pak）
ＤＥＡＥ−５Ｐ（商品名、ウォーターズ・アソシエイツ
（Waters Associates）社、ミルフォード、マサチュー
セッツ州、アメリカ合衆国（Milford,MA,USA）製））上
でクロマトグラフィーに付した。ＮａＣｌの線形濃度勾
配（０から０．３Ｍ、０から６０分、流速１ｍｌ／分）
を用いてプロペプチドを溶出させた。プロペプチドの最
終的な精製は、ＨＰＬＣを用いて、プロペプチド含有画
分を直接０．４％酢酸アンモニウム、ｐＨ７．４中のｐ
Ｈ安定逆相カラム（ビダク（Vydac）、ヘスペリア（Hes
peria）、カリフォルニア）へ注入し、さらにアセトニ
トリルの濃度増加（０から７０％、０から４５分）で結
合しているプロペプチドを溶出させることにより行なっ
た。プロペプチドは勾配の初めの半分に鋭いピークとし
て溶出され、これをイムノアッセイにより検出し、集め
て凍結乾燥した。ヒト胸水から単離されたヒトＩ型プロ
コラーゲンの古典型およびα１−ホモトリマー形アミノ
末端プロペプチドの純度を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミ
ド・ゲル電気泳動（分離ゲル１５％）を用いて図１に示
す。Ｉ型プロコラーゲンは鎖間ジスフィド結合を含有し
ないので、構成鎖はこの手順により切断される。
ンのインタクトな古典形およびα１−ホモトリマー形ア
ミノ末端プロペプチドの未変性の配座での単離肺ガン患
者から症状の緩和のために採取したヒト胸水５ないし１
０リットルを、タンパク質分解酵素阻害剤（３ｍｇ／リ
ットルのフェニルメチルスルホニル液、Ｎ−エチルマレ
イミドおよびｐ−ヒドロキシマーキュリベンゾエート、
ならびに１０ｍＭ ＥＤＴＡ）の存在下で、固体（ＮＨ
4）2ＳＯ4（４０％飽和）で沈殿させた。沈殿したタン
パク質を１５０００×ｇにて３０分間遠心分離すること
により集め、前記のタンパク質分解酵素阻害剤を含有す
る５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣＩ、ｐＨ７．４中に溶解
し、さらにこの緩衝液中で透析した。ついで、サンプル
をこの緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ−セファセル（Seph
acel）カラム（商品名、ファルマシア・ファイン・ケミ
カルズ（Pharmacia Fine Chemicals）社製）（５×５０
ｃｍ）上でクロマトグラフィーに付した。ＮａＣｌの線
形濃度勾配（０から０．５Ｍ ＮａＣｌ、４０００＋４
０００ｍｌ）にて溶出を行なった。ヒトＩ型プロコラー
ゲンのインタクトな古典形およびα１−ホモトリマー型
アミノ末端プロペプチドは、勾配の終わりごろに、大部
分のほかのタンパク質ののちに溶出された。モノマーお
よびトリマー双方のプロペプチドを検出するイムノアッ
セイを用いると、ヒトＩ型プロコラーゲンの少量のモノ
マーのＣｏｌ１関連ペプチドが最初に溶出され、つぎに
インタクトな古典形プロペプチド、最後にα１−ホモト
リマー形アミノ末端プロペプチドが溶出された。２種の
プロペプチドを含有する画分を別々に集めて、以下に記
載する手順を用いて独立に精製した。画分を集めたもの
を０．２Ｍ ＮＨ4ＨＣＯ3、ｐＨ７．９に対して透析
し、凍結乾燥した。これらのサンプルを０．２Ｍ ＮＨ
4ＨＣＯ3中に溶解し、この溶液で平衡化されたセファク
リル（Sephacryl）Ｓ−３００カラム（商品名、ファル
マシア・ファイン・ケミカルズ社製）（１．５×１１０
ｃｍ）上でクロマトグラフィーに付した。プロペプチド
抗原性を含有する画分（ヒトＩｇＧとアルブミンのあい
だの溶出位置）を集め、凍結乾燥した。ついで、サンプ
ルを５０ｍＭ 酢酸アンモニウム緩衝液、ｐＨ５．０中
に溶解し、その溶液に対して短時間透析したのち、高速
液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）装置を用いてアニ
オン交換カラム（プロテイン−パック（Protein-Pak）
ＤＥＡＥ−５Ｐ（商品名、ウォーターズ・アソシエイツ
（Waters Associates）社、ミルフォード、マサチュー
セッツ州、アメリカ合衆国（Milford,MA,USA）製））上
でクロマトグラフィーに付した。ＮａＣｌの線形濃度勾
配（０から０．３Ｍ、０から６０分、流速１ｍｌ／分）
を用いてプロペプチドを溶出させた。プロペプチドの最
終的な精製は、ＨＰＬＣを用いて、プロペプチド含有画
分を直接０．４％酢酸アンモニウム、ｐＨ７．４中のｐ
Ｈ安定逆相カラム（ビダク（Vydac）、ヘスペリア（Hes
peria）、カリフォルニア）へ注入し、さらにアセトニ
トリルの濃度増加（０から７０％、０から４５分）で結
合しているプロペプチドを溶出させることにより行なっ
た。プロペプチドは勾配の初めの半分に鋭いピークとし
て溶出され、これをイムノアッセイにより検出し、集め
て凍結乾燥した。ヒト胸水から単離されたヒトＩ型プロ
コラーゲンの古典型およびα１−ホモトリマー形アミノ
末端プロペプチドの純度を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミ
ド・ゲル電気泳動（分離ゲル１５％）を用いて図１に示
す。Ｉ型プロコラーゲンは鎖間ジスフィド結合を含有し
ないので、構成鎖はこの手順により切断される。
【００３３】III型プロコラーゲンのアミノ末端プロペ
プチド（以下、ＰＩＩＩＮＰという）とは対照的に、Ｐ
ＩＮＰプロペプチドの古典形またはα１−ホモトリマー
形のいずれも、鎖間ジスルフィド結合を含まない。ＰＩ
ＩＩＮＰでは、鎖間ジスルフィド結合により、３つの構
成鎖が互いに共有結合的につながっている。したがっ
て、ＰＩＮＰのそれぞれの鎖はドデシル硫酸ナトリウム
（ＳＤＳ）スラブ・ゲル（Slab-gel）中でバラバラにな
り（図１）、トリマー構造を確かめることはできなかっ
た。しかしながら、サイズ排除クロマトグラフィーにお
いて、真性プロペプチドの大きさに対応する免疫反応性
ピークがただ１つ見られ、かつプロペプチドの分解産物
の溶出位置では反応が見られないので、単離された古典
形およびα１−ホモトリマー形プロペプチドはトリマー
である。プロペプチドを凍結状態で保存したのちに、再
びゲル濾過により分析すると、より小さい形への分解は
少しも見られなかった。
プチド（以下、ＰＩＩＩＮＰという）とは対照的に、Ｐ
ＩＮＰプロペプチドの古典形またはα１−ホモトリマー
形のいずれも、鎖間ジスルフィド結合を含まない。ＰＩ
ＩＩＮＰでは、鎖間ジスルフィド結合により、３つの構
成鎖が互いに共有結合的につながっている。したがっ
て、ＰＩＮＰのそれぞれの鎖はドデシル硫酸ナトリウム
（ＳＤＳ）スラブ・ゲル（Slab-gel）中でバラバラにな
り（図１）、トリマー構造を確かめることはできなかっ
た。しかしながら、サイズ排除クロマトグラフィーにお
いて、真性プロペプチドの大きさに対応する免疫反応性
ピークがただ１つ見られ、かつプロペプチドの分解産物
の溶出位置では反応が見られないので、単離された古典
形およびα１−ホモトリマー形プロペプチドはトリマー
である。プロペプチドを凍結状態で保存したのちに、再
びゲル濾過により分析すると、より小さい形への分解は
少しも見られなかった。
【００３４】実施例２ 抗血清の製造 ニュージーランド・ホワイト種のウサギに、高度に精製
したα１−ホモトリマーＰＩＮＰ（タンパク質分解酵素
を含有しない）１５０μｇ／ウサギを１ｍｌの０．９％
ＮａＣｌに溶解し、等容量のフロイント完全アジュバン
トと混合したものを皮内注射することにより、ＰＩＮＰ
に対するポリクローナル抗体を作製した。数回のブース
ター注射（７５μｇ／ウサギのα１−ホモトリマーＰＩ
ＮＰを１ｍｌの０．９％ＮａＣｌに溶解し、等容量のフ
ロイント不完全アジュバントと混合したもの）を、３週
間の間隔を開けて行なった。各ウサギについて数回採血
することにより、抗血清のプールを作った。
したα１−ホモトリマーＰＩＮＰ（タンパク質分解酵素
を含有しない）１５０μｇ／ウサギを１ｍｌの０．９％
ＮａＣｌに溶解し、等容量のフロイント完全アジュバン
トと混合したものを皮内注射することにより、ＰＩＮＰ
に対するポリクローナル抗体を作製した。数回のブース
ター注射（７５μｇ／ウサギのα１−ホモトリマーＰＩ
ＮＰを１ｍｌの０．９％ＮａＣｌに溶解し、等容量のフ
ロイント不完全アジュバントと混合したもの）を、３週
間の間隔を開けて行なった。各ウサギについて数回採血
することにより、抗血清のプールを作った。
【００３５】実施例３ ラジオイムノアッセイの平衡タイプの実行 Ｉ型プロコラーゲンの古典形（またはα１−ホモトリマ
ー形）アミノ末端プロペプチド１０μｇを、クロラミン
−Ｔ（１０μｇ）により１ミリキュリーの125ヨードで
標識した。ウシ血清アルブミン（１ｇ／リットル）含有
ＰＢＳ緩衝液で平衡化したセファクリルＳ−３００カラ
ム（１×２０ｃｍ）上でゲル濾過することによって、標
識されたプロペプチドを遊離ヨードから分離した。標識
されたプロペプチドは、遊離ヨードが溶出するかなり前
の鋭いピークとして、カラムから溶出された。標識プロ
ペプチド５００００カウント／分を用いて、抗血清結合
曲線をえた。未知の血清サンプルまたは尿以外のほかの
生物学的液体中のプロペプチド濃度を、以下のようなラ
ジオイムノインヒビションアッセイ（radioimmunoinhib
ition assay）により測定した。前もってテストしてあ
る希釈抗血清（２００μｌ）を、未知のサンプル（５０
μｌ）および５００００カウント／分のトレーサーとと
もに（１ｇ／リットルのウシ血清アルブミン含有ＰＢＳ
緩衝液２００μｌ中）、３７℃にて２時間インキュベー
トした。ついで、ウサギ ガンマグロブリンに対する固
相の２次抗体を加え、２０℃にて２０分間インキュベー
ションののち、遠心分離（２０００×ｇ、２０分間）に
より溶液から免疫複合体中の結合している抗原を分離し
た。未知のサンプルの阻害活性を、標準濃度の非標識の
Ｉ型プロコラーゲンのアミノ末端プロペプチドの活性と
比較した。
ー形）アミノ末端プロペプチド１０μｇを、クロラミン
−Ｔ（１０μｇ）により１ミリキュリーの125ヨードで
標識した。ウシ血清アルブミン（１ｇ／リットル）含有
ＰＢＳ緩衝液で平衡化したセファクリルＳ−３００カラ
ム（１×２０ｃｍ）上でゲル濾過することによって、標
識されたプロペプチドを遊離ヨードから分離した。標識
されたプロペプチドは、遊離ヨードが溶出するかなり前
の鋭いピークとして、カラムから溶出された。標識プロ
ペプチド５００００カウント／分を用いて、抗血清結合
曲線をえた。未知の血清サンプルまたは尿以外のほかの
生物学的液体中のプロペプチド濃度を、以下のようなラ
ジオイムノインヒビションアッセイ（radioimmunoinhib
ition assay）により測定した。前もってテストしてあ
る希釈抗血清（２００μｌ）を、未知のサンプル（５０
μｌ）および５００００カウント／分のトレーサーとと
もに（１ｇ／リットルのウシ血清アルブミン含有ＰＢＳ
緩衝液２００μｌ中）、３７℃にて２時間インキュベー
トした。ついで、ウサギ ガンマグロブリンに対する固
相の２次抗体を加え、２０℃にて２０分間インキュベー
ションののち、遠心分離（２０００×ｇ、２０分間）に
より溶液から免疫複合体中の結合している抗原を分離し
た。未知のサンプルの阻害活性を、標準濃度の非標識の
Ｉ型プロコラーゲンのアミノ末端プロペプチドの活性と
比較した。
【００３６】実施例４ ラジオイムノアッセイに先立つ、サンプル中のＩ型プロ
コラーゲンの古典形およびα１−ホモトリマー形アミノ
末端プロペプチドの、互いからの分離 血清または尿以外のほかの生物学的液体のいずれかであ
るサンプルが、Ｉ型プロコラーゲンの古典形およびα１
−ホモトリマー形アミノ末端プロペプチド双方を含有し
ているばあい、アニオン交換カラム（プロテイン−パッ
ク ＤＥＡＥ−５Ｐ）上で高速液体クロマトグラフィー
を用いたクロマトグラフィーにより、これらを分離する
ことができる。１ミリリットルのサンプルを５０ｍＭ酢
酸アンモニウム緩衝液、ｐＨ５．０に対して透析し、カ
ラムに注入してＮａＣｌの線形濃度勾配（０から０．３
Ｍ、０から６０分、流速１ｍｌ／分）を用いて溶出し、
各１ミリリットルの画分を集めた。ついでラジオイムノ
アッセイにより、これらの画分をＩ型プロコラーゲンの
古典形アミノ末端プロペプチドについて分析し、Ｉ型プ
ロコラーゲンの２つの形のアミノ末端プロペプチドの存
在および位置を検出した。正しい量の正確な測定が必要
であれば、前記プロペプチドを含有する画分を集めて、
蒸留水に対し短時間透析し凍結乾燥して、最終的にＰＢ
Ｓ緩衝液をサンプルの元の容積だけ用いて溶解し、Ｉ型
プロコラーゲンの古典形アミノ末端プロペプチドの濃度
を測定した。
コラーゲンの古典形およびα１−ホモトリマー形アミノ
末端プロペプチドの、互いからの分離 血清または尿以外のほかの生物学的液体のいずれかであ
るサンプルが、Ｉ型プロコラーゲンの古典形およびα１
−ホモトリマー形アミノ末端プロペプチド双方を含有し
ているばあい、アニオン交換カラム（プロテイン−パッ
ク ＤＥＡＥ−５Ｐ）上で高速液体クロマトグラフィー
を用いたクロマトグラフィーにより、これらを分離する
ことができる。１ミリリットルのサンプルを５０ｍＭ酢
酸アンモニウム緩衝液、ｐＨ５．０に対して透析し、カ
ラムに注入してＮａＣｌの線形濃度勾配（０から０．３
Ｍ、０から６０分、流速１ｍｌ／分）を用いて溶出し、
各１ミリリットルの画分を集めた。ついでラジオイムノ
アッセイにより、これらの画分をＩ型プロコラーゲンの
古典形アミノ末端プロペプチドについて分析し、Ｉ型プ
ロコラーゲンの２つの形のアミノ末端プロペプチドの存
在および位置を検出した。正しい量の正確な測定が必要
であれば、前記プロペプチドを含有する画分を集めて、
蒸留水に対し短時間透析し凍結乾燥して、最終的にＰＢ
Ｓ緩衝液をサンプルの元の容積だけ用いて溶解し、Ｉ型
プロコラーゲンの古典形アミノ末端プロペプチドの濃度
を測定した。
【００３７】α１−ホモトリマー形または古典的ヘテロ
トリマー形のいずれも、適切なトレーサーを用いること
により測定可能である。
トリマー形のいずれも、適切なトレーサーを用いること
により測定可能である。
【図１】ヒト胸水から単離されたヒトＩ型プロコラーゲ
ンの古典形およびα１−ホモトリマー形アミノ末端プロ
ペプチドの純度を示す、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド・
ゲル電気泳動（分離ゲル１５％）である。
ンの古典形およびα１−ホモトリマー形アミノ末端プロ
ペプチドの純度を示す、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド・
ゲル電気泳動（分離ゲル１５％）である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ユカ メルコ フィンランド共和国、フィン−90250 オウル、スオハウカンチエ １ ホー ９ (72)発明者 サイラ カウピラ フィンランド共和国、フィン−90100 オウル、セペンカツ 12 セー 20 (56)参考文献 特開 平１−139600（ＪＰ，Ａ) Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒ ｙ，（1993）Ｖｏｌ．39，Ｎｏ．11, ｐ．2254−2258 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｏｎｅ ａ ｎｄ Ｍｉｎｅｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃ ｈ，（1992）Ｖｏｌ．７，Ｎｏ．11, ｐ．1243−1250 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C07K 14/78 C07K 1/00 - 1/36 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (22)
- 【請求項１】 非変性条件下にてタンパク質分解酵素を
用いずに単離されたＩ型プロコラーゲンのインタクトな
トリマーのα１−ホモトリマー形アミノ末端プロペプチ
ド。 - 【請求項２】 非変性条件下にてタンパク質分解酵素を
用いずに単離されたＩ型プロコラーゲンのインタクトな
古典形のヘテロトリマー形アミノ末端プロペプチド。 - 【請求項３】 プロペプチドをそのモノマーの形に分解
することのできる酵素を含有しない、請求項１または２
記載のプロペプチド。 - 【請求項４】 細菌性コラゲナーゼを含有しない、請求
項１または２記載のプロペプチド。 - 【請求項５】 標識されている、請求項１、２、３また
は４記載のプロペプチド。 - 【請求項６】 標識が放射性標識、ランタニド、酵素ま
たは発光性もしくは蛍光性標識である請求項５記載のプ
ロペプチド。 - 【請求項７】 プロペプチドを非変性条件下でＤＥＡＥ
クロマトグラフィーに付すことを含んでなる、請求項
１、２、３、４、５または６記載のプロペプチドの製造
法。 - 【請求項８】 非変性条件が、ｐＨ約５．０でのＤＥＡ
Ｅクロマトグラフィーによる精製および中性ｐＨでの逆
相分離の適用を含んでなる請求項７記載の方法。 - 【請求項９】 逆相分離を５．０より高いｐＨで行な
う、請求項８記載の方法。 - 【請求項１０】 請求項７、８または９記載の方法によ
り製造される、または請求項１、２、３、４、５または
６記載のプロペプチドに対する抗体。 - 【請求項１１】 前記プロペプチドのモノマーの形に対
して親和性をもたない、請求項１０記載の抗体。 - 【請求項１２】 標識されている、請求項１０または１
１記載の抗体。 - 【請求項１３】 Ｉ型プロコラーゲンのインタクトなト
リマーのα１−ホモトリマー形アミノ末端プロペプチド
またはＩ型プロコラーゲンのインタクトな古典型のヘテ
ロトリマー形アミノ末端プロペプチドのアッセイ法であ
って、１）アッセイするサンプルを、標識の存在下で請
求項１０、１１または１２記載の１次抗体に、形成され
たプロペプチド／１次抗体複合体に標識が結合するよう
に接触させる工程、および２）結合および／または非結
合標識の量をアッセイする工程からなるアッセイ法。 - 【請求項１４】 標識されたＩ型プロコラーゲンのアミ
ノ末端プロペプチドおよびアッセイされるサンプルを非
標識の１次抗体と接触させ、形成されたプロペプチド／
１次抗体複合体を複合化していない物質から分離して、
複合化または非複合化標識をアッセイする、請求項１３
記載の方法。 - 【請求項１５】 プロペプチド／抗体複合体を１次抗体
に対して特異的な２次抗体と接触させ、プロペプチド／
１次抗体／２次抗体複合体を複合化していない物質から
分離する、請求項１３または１４記載の方法。 - 【請求項１６】 ２次抗体が固体支持体に結合してい
る、請求項１５記載の方法。 - 【請求項１７】 標識が放射性標識、ランタニド、酵素
または発光性もしくは蛍光性標識である請求項１２記載
の抗体。 - 【請求項１８】 標識が放射性標識、ランタニド、酵素
または発光性もしくは蛍光性標識である請求項１３、１
４、１５または１６記載の方法。 - 【請求項１９】 請求項１３、１４、１５、１６または
１８記載の方法において用いるのに適したアッセイキッ
トであって、 １）請求項１０または１１記載の抗体、および ２）請求項５もしくは６記載の標識プロペプチドまたは
請求項７、８もしくは９記載の方法により製造された標
識プロペプチドからなるアッセイキット。 - 【請求項２０】 標識プロペプチドが放射性標識されて
いる請求項１９記載のアッセイキット。 - 【請求項２１】 １）プロペプチドを含む原料を、タン
パク質分解酵素阻害剤の存在下で（ＮＨ4）2ＳＯ4の５
０％より少ない飽和で沈殿させる工程、 ２）前記１）の工程でえられた沈殿をｐＨ６．５から
７．５でＤＥＡＥクロマトグラフィーに付し、ＮａＣｌ
の濃度勾配にて溶出する工程、 ３）プロペプチドを含む前記２）の工程でえられた画分
を集め、ゲルろ過に付す工程、 ４）プロペプチドを含む前記３）の工程でえられた画分
を集め、ｐＨ４．８から５．２でＤＥＡＥクロマトグラ
フィーに付し、ＮａＣｌの濃度勾配にて溶出する工程、
および ５）プロペプチドを含む前記４）の工程でえられた画分
を、ｐＨ６．５から７．５で逆相分離に付す工程 からなる請求項７記載の製造法。 - 【請求項２２】 イムノアッセイを行なう前に、サンプ
ル中のＩ型プロコラーゲンの古典型とα１−ホモトリマ
ー形アミノ末端プロペプチドとを分離する方法であっ
て、 １）サンプルをＤＥＡＥクロマトグラフィーに付し、Ｎ
ａＣｌの濃度勾配にて溶出する工程、および ２）２つの形の位置を検出するためにラジオイムノアッ
セイを行なう工程からなる分離方法。
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