JP2002518676A - 軟骨吸収アッセイ - Google Patents

軟骨吸収アッセイ

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Abstract

(57)【要約】 II型コラーゲン（軟骨）のインビボ吸収を測定する免疫アッセイは１つか又は２つの抗体を使用する。第１の抗体はＥＫＧＰＤＰ（配列番号２）と結合するがＥＫＧＰＤＰＬＱ（配列番号１０）とは結合しない；その際、上記式中、Ｋの記号はリシン又は好ましくは架橋３−ヒドロキシピリジニウム残基を言う。該第１の抗体と結合する血清中のアナライトを測定することによって、非鉱質化軟骨のインビボ吸収の指標が提供される。第２の抗体はＥＫＧＰＤＰＬＱと結合するがＥＫＧＰＤＰとは結合しない。該第２の抗体と結合する血清中のアナライトを測定することによって、鉱質化軟骨のインビボ吸収の指標が提供される。総（非鉱質化及び鉱質化）軟骨インビボ吸収の指標は、該第１の抗体と結合する尿中のアナライトを測定することによってか、又は該第１及び第２の抗体と結合する血清中の総アナライトを測定することによって提供される。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本出願は１９９８年６月１９日に出願された仮出願番号６０／０８９，８２３
の一部継続出願である。 本発明は国立衛生研究所から授与された助成金ＡＲ３７３１８及びＡＲ３６７
９４の１つ又はそれより多くの政府援助でなされた。米国政府は本発明に一定の
権利を有している。
【０００２】 （発明の分野） 本発明はII型コラーゲン（軟骨）のインビボ（in vivo）吸収を示す架橋テロ
ペプチドアナライト（分析物）を検出するアッセイに関しており、そして特に鉱
質化していない軟骨と鉱質化した軟骨の吸収を測定し、識別する免疫アッセイ、
並びに軟骨の総インビボ吸収を測定する免疫アッセイを提供する。
【０００３】 （発明の背景） 本出願人の先の米国特許第４，９７３，６６６号、第５，１４０，１０３号、
第５，３００，４３４号、第５，３２０，９７０号、第５，８１７，７５５号及
び第５，７０２，９０９号を参照し、そしてこれらは参照して本明細書に組み入
れる。 コラーゲンのインビボ吸収を示すテロペプチドアナライトを検出する免疫アッ
セイが知られている。骨吸収を測定する上記のようなＩ型コラーゲンアッセイの
例には：ＷＯ８９／０４４９１（Eyre）；ＷＯ８９／１２８２４（Robins）；Ｗ
Ｏ９１／０８４７８（Eyre）；ＥＰ０５０５２１０Ａ２（Risteli & Risteli）
；ＷＯ９２／２１６９８（Eyre）；ＷＯ９４／０３８１３（Naser等）；ＷＯ９
４／１４８４４（Baylink）；ＷＯ９５／０４２８２（Naser等）；ＷＯ９５／０
８１１５（Qvist & Bonde）；ＷＯ９６／１２１９３（Bonde & Qvist）；ＥＰ０
７１８３０９Ａ１（Naser等）；及びＷＯ９６／３６６４５（Eyre等）が含まれ
る。
【０００４】 軟骨吸収を測定するII型コラーゲンテロペプチドアッセイの例には、ＷＯ９１
／０８４７８（Eyre）；ＷＯ９５／０８１１５（Qvist & Bonde）；及びＷＯ９
６／１２１９３（Bonde & Qvist）が含まれる。 III型コラーゲンテロペプチドアッセイの例には、ＷＯ８８／０８９８０
（Risteli & Risteli）及びＷＯ９１／０８４７８（Eyre）が含まれる。
【０００５】 以下の特許の開示も重要である：米国特許第４，６２８，０２７号（Gay）は
、連結組織タンパク質のモノクローナル抗体を使用するインビトロ診断方法を開
示している。米国特許第５，３１６，９１４号（Oshima等）は、肝臓疾患の診断
に適用できるヒトIII、IV及びVI型コラーゲンの酵素サンドイッチ免疫アッセイ
を開示している。ＷＯ９４／１４０７０（Poole & Hollander）は、軟骨におけ
るコラーゲン開裂を測定する免疫アッセイを開示している。ＷＯ９４／１８５６
３（Barrach等）は、関節炎に関連したII型コラーゲン由来のペプチドを検出す
るサンドイッチ免疫アッセイ方法を開示している。
【０００６】 本出願人の先の国際公開、ＷＯ９１／０４７８が特に重要である。これは、II
型コラーゲンの次の尿吸収産生物：
【０００７】
【化１５】
【０００８】 （式中、括弧は選択自由のアミノ酸残基を示し、そしてＨｙｌ−Ｈｙｌ−Ｈｙｌ
として表されている架橋残基はヒドロキシリシルピリジノリン（ＨＰ）、即ち種
々の組織の成熟コラーゲン原繊維中に存在する天然の３−ヒドロキシピリジニウ
ム残基である）を開示している。これらのアナライトはII型コラーゲンのＣ末端
架橋テロペプチドドメインに由来するので、本明細書では集合的に「col2ＣＴx
」と表される。
【０００９】 本発明の開示はまた、アミノ酸を略記する１文字記号も採用する；それ故、上
記で示したアナライトのＧｌｕ−Ｈｙｌ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−（Ｐｒｏ）
−（Ｌｅｕ）テロペプチド構成成分は、本明細書では以下、ＥＫＧＰＤ（配列番
号１）、ＥＫＧＰＤＰ（配列番号２）及びＥＫＧＰＤＰＬ（配列番号３）と表さ
れる。更に、本明細書で使用するとき、記号「Ｋ」は線状ペプチドの場合におけ
るリシンを表すか、又はヒドロキシリシルピリジノリン（ＨＰ）及びリシルピリ
ジノリン（ＬＰ）のなかから選択される架橋３−ヒドロキシピリジニウム残基を
表す。
【００１０】 本出願人と同僚は最近の抄録中でもcol2ＣＴxを記載している：エア（Eyre）
等、Bone Miner. Res. １１（Ｓ１）：Ｓ４１３、１９９６年は、ヒト尿中のＩ
、II及びIII型コラーゲンから得られる架橋テロペプチドを記載している。 アトレィ（Atley）等、Arth. Rheum. ４０（９Ｓ）：５８４、１９９７年は、
ＲＳ−１３０８３０、コラーゲナーゼ−３の選択的インヒビターが、ＩＬ−１α
に曝露されたウシ軟骨からのヒドロキシプロリン及びメタロプロテイナーゼ（Ｍ
ＭＰ）特異的ネオエピトープ、col2ＣＴx、の放出を阻害することを報告してい
る。
【００１１】 アトレィ等、Trans. Orthop. Res. Soc.、ニューオーリンズ、１９９８年は、
軟骨II型コラーゲンからの免疫反応性テロペプチドのマトリックスメタロプロテ
イナーゼ介在性放出を報告している。この研究の目的は、α１（II）Ｃ−テロペ
プチドＥＫＧＰＤＰのドメインを認識するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）２Ｂ４
に基づく免疫アッセイが、軟骨内のＭＭＰ開裂産生物を測定するのかどうかを評
価することであった。図１を参照すると、ｍＡｂ ２Ｂ４は合成ペプチドＡＦＡ
ＧＬＧＰＲＥＫＧＰＤＰＬＱＹＭＲＡ（配列番号５）のマトリリシン消化インビ
トロ産生物ＡＦＡＧＬＧＰＲＥＫＧＰＤＰ（配列番号４）を認識するが、ＡＦＡ
ＧＬＧＰＲＥＫＧＰＤＰＬＱ（配列番号６）、ＡＦＡＧＬＧＰＲＥＫＧＰＤＰＬ
ＱＹ（配列番号７）、ＬＱＹＭＲＡ（配列番号８）又はＹＭＲＡ（配列番号９）
は認識しない。これらの著者はまた、滑液、血清及び尿中におけるｍＡｂ ２Ｂ
４免疫反応性の検出も認めた。彼等はこの２Ｂ４エピトープが、II型コラーゲン
のインビボ吸収の有用なマーカーである可能性を有していると結論した。
【００１２】 モスコヴィッツ（Moskowitz）等、Amer. Coll. Rheum.、カリフォルニア州サ
ンジエゴ、１９９８年１１月８〜１２日は、II型コラーゲンＣ−テロペプチド２
Ｂ４エピトープが家族性骨関節症における軟骨吸収のマーカーであることを報告
している。 アトレィ等、合同整形外科研究学会会議（Combined Orthopaedic Research So
cieties Meeting）、フランス国ビッテル、１９９８年９月２８〜３０日は、尿
中のII型コラーゲン分解による架橋テロペプチド産生物（col2ＣＴx）を含む、
骨及びコラーゲン分解の生化学的マーカーを議論している。 更に、報告によれば、リウマチ様関節炎の診断用マーカーとしてII型コラーゲ
ンのＣ−テロペプチドに対するモノクローナル抗体がオステオメーター・バイオ
テク（Osteometer Biotech）Ａ／Ｓで開発中である。バイオ・ワールド・インタ
ーナショナル（Bio World International）、３頁、１９９７年１２月３日。
【００１３】 （発明の要約） 本発明は、II型コラーゲン（軟骨）のインビボ吸収を測定する改良されたアッ
セイを提供する。本主題の免疫アッセイは非鉱質化軟骨の吸収と鉱質化軟骨の吸
収を識別し、そして総軟骨インビボ吸収を測定するのに有用である。これらの開
示された免疫アッセイは、２つの抗体のうちの１つか又はそれらを組み合わせて
使用する。第１の抗体はＥＫＧＰＤＰ（配列番号２）と結合するがＥＫＧＰＤＰ
ＬＱ（配列番号１０）とは結合しない；その際、上記式中、Ｋの記号は好ましく
は架橋３−ヒドロキシピリジニウム残基を表す。該第１の抗体と結合する血清中
のアナライトを測定することによって、非鉱質化軟骨のインビボ吸収の指標が提
供される。 第２の抗体はＥＫＧＰＤＰＬＱと結合するが、ＥＫＧＰＤＰとは結合しない；
その際、上記式においても、Ｋの記号は好ましくは架橋３−ヒドロキシピリジニ
ウム残基を表す。該第２の抗体と結合する血清中のアナライトを測定することに
よって、鉱質化軟骨のインビボ吸収の指標が提供される。
【００１４】 総（非鉱質化及び鉱質化）軟骨インビボ吸収の指標は、該第１の抗体と結合す
る尿中のアナライトを測定することによってか、又は該第１及び第２の抗体と結
合する血清中の総アナライトを測定することによって提供される。 本発明の主題軟骨マーカーは、好ましくは、Ｉ型コラーゲンのアミノ末端テロ
ペプチド、Ｉ型コラーゲンのカルボキシ末端テロペプチド及び遊離リシルピリジ
ノリン（デオキシピリジノリン）架橋のなかから選択される、骨コラーゲン吸収
マーカーと関連させて測定される。
【００１５】 （好ましい実施態様の詳細な説明） モノクローナル抗体２Ｂ４は、配列ＥＫＧＰＤＰ中のＣ末端エピトープを認識
する。この抗体ではＣ末端プロリンが結合していない（即ち、Ｐｒｏ−Ｃ００Ｈ
）ことが必要であり、そしてこの抗体にとってはＫがその側鎖（イプシロン）ア
ミノ基を介して誘導体化されている（例えば、架橋されている）ことが好ましい
。このプロリンに対して余分のＣ末端アミノ酸が存在すると、このペプチドドメ
インに対するｍＡｂ ２Ｂ４の結合が妨げられる。
【００１６】 コラーゲナーゼ（ＭＭＰ１及びＭＭＰ１３）、ゼラチナーゼ（ＭＭＰ２及び９
）、ストロメリシン（ＭＭＰ３）及びマトリリシン（ＭＭＰ７）を含む種々のマ
トリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）は、軟骨II型コラーゲン又は合成Ｃ
−テロペプチドドメイン（ＡＦＡＧＬＧＰＲＥＫＧＰＤＰＬＱＹＭＲＡ）からｍ
Ａｂ ２Ｂ４エピトープを産生させることができる。マトリリシン（ＭＭＰ７）
は、組換え酵素を使用するインビトロ試験に基づけば、最も強力である。
【００１７】 しかしながら、カテプシンＫは２Ｂ４エピトープ放出に必要なＰ−Ｌ結合を開
裂することができず、より長いフラグメント、ＥＫＧＰＤＰＬＱを産生する。こ
のことは、カテプシンＫは本質的に破骨細胞だけが発現するプロテアーゼであり
そして破骨細胞が骨を吸収するときに石灰化コラーゲンの吸収に関与する重要な
酵素であるので、重要である。破骨細胞（又は非常に類似する細胞）は石灰化軟
骨の分解にも関与する。石灰化軟骨は成長中の動物の成長板で一時的に形成され
、そして成人骨格では全てのタイプの関節の骨と軟骨間の界面にも存在する。関
節炎においては、吸収及び骨リモデリングが促進された結果、破骨細胞による石
灰化軟骨の広範な吸収が生じるであろう。この過程は、２Ｂ４によって認識され
ないコラーゲンII型Ｃ−テロペプチド（ＥＫＧＰＤＰＬＱ）を血流中に放出する
ことができる。
【００１８】 II型コラーゲンテロペプチドアナライトの尿中形態は、ＥＫＧＰＤＰ又はこれ
より小さいので、尿に放出される前に腎臓及び／又は肝臓内のプロテアーゼがＣ
末端−ＬＱを除去している。それ故、免疫反応性col2ＣＴxの次の２つの起源を
特定することができる：（１）ＭＭＰによってマトリックスコラーゲンを分解す
るように活性化された軟骨細胞による直接的産生、及び（２）石灰化軟骨の破骨
細胞吸収による循環産生物からの腎臓及び／又は肝臓における二次的な産生。
【００１９】 関節炎（リウマチ様関節炎（ＲＡ）及び骨関節炎（ＯＡ））においては、ＭＭ
Ｐは関節軟骨のコラーゲン性マトリックス破壊における重要な作用物であること
が知られている。両形態の関節炎においては、骨構造も大いに影響を受ける。Ｒ
Ａにおいては、骨粗鬆症は炎症性サイトカインの影響によって疾患過程自体から
直接及びコルチコステロイド療法の副作用として、これらの両方で生じる通常の
結果である。骨吸収の促進は関係のある関節で最も顕著であり、そしてこれには
関節表面下の石灰化軟骨の除去が含まれよう。ＯＡにおいては、骨増殖体（骨副
産物）がしばしば、関節病理学で突出した特徴となる。ここでもまた、骨増殖体
成長の一部として石灰化軟骨が形成されそしてその後分解されよう（後者は破骨
細胞によって）。それ故、関節炎の主要な両形態をモニターしそして管理するた
めに、ＭＭＰ介在性及び破骨細胞介在性（カテプシンＫ）II型コラーゲン破壊を
識別測定することが望ましいであろう。血液又は滑液中では、col2ＣＴx（ＥＫ
ＧＰＤＰ）の測定は前者の活性を示すことができ、一方破骨細胞産生物（ＥＫＧ
ＰＤＰＬＱ）の測定は後者の活性を示すことができる。加えて、尿col2ＣＴxは
総吸収（非鉱質化及び鉱質化軟骨の両方）の指数を提供することができる。この
ような尿アッセイは好ましくは、尿試料のクレアチニン含有量を測定し、そして
抗体の検出された結合対クレアチニン含有量の比を相関させて尿量に関係のない
総II型コラーゲン吸収の尿指数を提供する段階を含んでいる。
【００２０】 本発明主題のＥＫＧＰＤＰ及びＥＫＧＰＤＰＬＱ免疫活性の識別測定は、個々
の患者の疾患活性の評価で診断的価値を有している。総骨吸収活性を評価するＩ
型コラーゲンマーカーの測定及び／又は他の非鉱質化連結組織破壊原因を評価す
るIII型コラーゲンマーカーの測定を組み合わせると、適切な療法を指示するこ
とができそしてその所望の効果をモニターすることができる。同様に、このよう
な識別アッセイを使用して、新規な医薬品候補を同定し（インビトロでそして動
物で）、そして標的組織及び細胞プロセスに与える所望の有益な効果を証明する
ための臨床試験における代用マーカーを提供することができる。
【００２１】 この目的のためのＩ型コラーゲン吸収マーカーの代表的なアッセイには、Ｉ型
コラーゲンのアミノ末端テロペプチド（Osteomark（登録商標）、Ostex Interna
tional、ワシントン州シアトル）、Ｉ型コラーゲンのカルボキシ末端テロペプチ
ド（CrossLaps（登録商標）、Osteometer Biotech、デンマーク国ヘーレブ）及
び遊離リシルピリジノリン架橋（Pyrilinks（登録商標）-D、Metra Biosystems
、カリフォルニア州マウンテンビュー）が含まれる。
【００２２】 III型コラーゲン吸収マーカーの代表的なアッセイには、III型コラーゲンのア
ミノ末端テロペプチド及びIII型コラーゲンのカルボキシ末端テロペプチドが含
まれる。このようなアッセイは米国特許第５，５３２，１６９号、米国特許第５
，６４１，６８７号及び米国出願番号０８／９２３，１７５に開示されている。
III型コラーゲン吸収マーカーを使用して、血管コラーゲン分解（アテローム性
動脈硬化症）、肺組織分解（例えば、気腫及び他の破壊性肺疾患）、筋肉消耗、
高齢者の脆弱症候群、肝疾患、甲状腺機能亢進、連結組織に与える糖尿病の二次
的影響、並びに非鉱質化連結組織破壊を促進する他の炎症性及び感染性状態を評
価することができる。
【００２３】 かくして、本発明は、第１の実施態様では、或る生理学的状態を示すアナライ
トの存在について体液試料を分析する改良された方法を提供し、この方法は該体
液試料を該アナライトと結合する抗体と接触させ、この体液試料中の抗体の結合
を検出し、そして検出された結合を該生理学的状態と相関させる段階を含んでお
り、そして該改良方法は血清試料を
【００２４】
【化１６】 と結合するが
【００２５】
【化１７】
【００２６】 （上記式中、Ｋ−Ｋ−Ｋはヒドロキシリシルピリジノリン又はリシルピリジノリ
ンであり、そして括弧は選択自由のアミノ酸残基を表す）とは結合しない抗体と
接触させ、そして検出された結合を非鉱質化II型コラーゲンのインビボ吸収と相
関させることを含んでいる。
【００２７】 第２の実施態様では、本発明は或る生理学的状態を示すアナライトの存在につ
いて体液試料を分析する改良された方法を提供し、この方法は該体液試料を該ア
ナライトと結合する抗体と接触させ、この体液試料中の抗体の結合を検出し、そ
して検出された結合を該生理学的状態と相関させる段階を含んでおり、そして該
改良方法は血清試料を
【００２８】
【化１８】 と結合するが、
【００２９】
【化１９】
【００３０】 （上記式中、Ｋ−Ｋ−Ｋはヒドロキシリシルピリジノリン又はリシルピリジノリ
ンであり、そして括弧は選択自由のアミノ酸残基を表す）とは結合しない抗体と
接触させ、そして検出された結合を鉱質化II型コラーゲンのインビボ吸収と相関
させることを含んでいる。
【００３１】 第３の実施態様では、本発明は或る生理学的状態を示すアナライトの存在につ
いて体液試料を分析する改良された方法を提供し、この方法は該体液試料を該ア
ナライトと結合する抗体と接触させ、この体液試料中の抗体の結合を検出し、そ
して検出された結合を該生理学的状態と相関させる段階を含んでおり、そして該
改良方法は尿試料を
【００３２】
【化２０】 と結合するが、
【００３３】
【化２１】
【００３４】 （上記式中、Ｋ−Ｋ−Ｋはヒドロキシリシルピリジノリン又はリシルピリジノリ
ンであり、そして括弧は選択自由のアミノ酸残基を表す）とは結合しない抗体と
接触させ、そして検出された結合を非鉱質化と鉱質化の両方のII型コラーゲンの
インビボ吸収と相関させることを含んでいる。
【００３５】 第４の実施態様では、本発明は或る生理学的状態を示すアナライトの存在につ
いて体液試料を分析する改良された方法を提供し、この方法は該体液試料を該ア
ナライトと結合する抗体と接触させ、この体液試料中の抗体の結合を検出し、そ
して検出された結合を該生理学的状態と相関させる段階を含んでおり、そして該
改良方法は血清試料を
【００３６】
【化２２】 と結合するが、
【００３７】
【化２３】 とは結合しない第１の抗体と接触させ、そして該血清試料を
【００３８】
【化２４】 と結合するが
【００３９】
【化２５】
【００４０】 （上記式中、Ｋ−Ｋ−Ｋはヒドロキシリシルピリジノリン又はリシルピリジノリ
ンであり、そして括弧は選択自由のアミノ酸残基を表す）とは結合しない第２の
抗体と接触させ、そして該第１及び第２の抗体の検出された総結合を鉱質化及び
非鉱質化の両方のII型コラーゲンのインビボ吸収と相関させることを含んでいる
。
【００４１】 第５の実施態様では、本発明は或る生理学的状態を示すアナライトの存在につ
いて体液試料を分析する改良された方法を提供し、この方法は該体液試料を該ア
ナライトと結合する抗体と接触させ、この体液試料中の抗体の結合を検出し、そ
して検出された結合を該生理学的状態と相関させる段階を含んでおり、そして該
改良方法は血清試料を
【００４２】
【化２６】 と結合するが、
【００４３】
【化２７】 とは結合しない第１の抗体と接触させ、そして尿試料を
【００４４】
【化２８】 と結合するが
【００４５】
【化２９】
【００４６】 （上記式中、Ｋ−Ｋ−Ｋはヒドロキシリシルピリジノリン又はリシルピリジノリ
ンであり、そして括弧は選択自由のアミノ酸残基を表す）とは結合しない第２の
抗体と接触させ、そして該第１の抗体の検出された結合を鉱質化II型コラーゲン
のインビボ吸収と相関させ、そして該第２の抗体の検出された結合を鉱質化及び
非鉱質化の両方のII型コラーゲンのインビボ吸収と相関させることを含んでいる
。
【００４７】 本明細書中の用語「抗体」は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体及び
これらの抗原結合性フラグメントを包含するものである。このようなＥＫＧＰＤ
ＰＬＱ結合性及びＥＫＧＰＤ（Ｐ）（Ｌ）結合性抗体は、当該技術分野において
周知の標準的な方法で産生させることができる。代表的なプロトコールは次のと
おりである。
【００４８】 ＥＫＧＰＤＰＬＱハイブリドーマの調製：雌ＲＢＦ／ＤｎＪマウスに、完全フ
ロイントアジュバントと、グルタルアルデヒドを介して担体タンパク質キーホー
ルリンペット・ヘマシアニン（ＫＬＨ）に架橋したＥＫＧＰＤＰＬＱ合成ペプチ
ド（ＫＬＨ−ＥＫＧＰＤＰＬＱ）とのエマルジョンを腹腔内に（ｉｐ）注射する
。１カ月後、ＫＬＨ−ＥＫＧＰＤＰＬＱのブースター注射を不完全フロイントア
ジュバントとのエマルジョンでｉｐ投与する。概ね８週間後、マウスを屠殺し、
そして脾細胞を、ポリエチレングリコールによって、ＦＯＸ−ＮＹマウスミエロ
ーマ細胞系（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１７３２）と融合させる。融合細胞は、アデニ
ン、アミノプテリン及びチミジン（ＡＡＴ）を含有する選択培地の９６ウェルの
プレート中で増殖させる。
【００４９】 概ね１週間後、融合ハイブリドーマコロニー培養上清液は、グルタルアルデヒ
ドを介してウシ血清アルブミンに架橋したＥＫＧＰＤＰＬＱ合成ペプチド（ＢＳ
Ａ−ＥＫＧＰＤＰＬＱ）との反応性について、ＥＬＩＳＡ法で試験する。ＢＳＡ
−ＥＫＧＰＤＰＬＱと反応性の抗体を産生するハイブリドーマコロニーは、他の
合成ペプチド配列に対するＥＬＩＳＡ法における反応の特異性について二次的に
試験する。試験したものの中には、グルタルアルデヒドを介してＢＳＡに架橋し
たＥＫＧＰＤＰ合成ペプチド（ＢＳＡ−ＥＫＧＰＤＰ）がある。ＢＳＡ−ＥＫＧ
ＰＤＰＬＱとの反応が陽性であり、そしてＢＳＡ−ＥＫＧＰＤＰとの反応が陰性
であるハイブリドーマコロニーを凍結保存する。候補ハイブリドーマは、限界希
釈法でモノクローン性になるまでクローン化する。 競合ＥＬＩＳＡ法では、可溶性ＢＳＡ−ＥＫＧＰＤＰＬＱだけでなくヒト血清
標本も、候補抗体に関して固相ＢＳＡ−ＥＫＧＰＤＰＬＱと競合することが見ら
れる。
【００５０】 免疫化及びスクリーニング目的のために、II型コラーゲンのカテプシンＫ消化
物を調製することもできる。プロテオグリカンは、タンパク質変性剤、例えば４
ＭグアニジンＨＣｌを使用してヒト関節軟骨の組織試料から抽出される。残渣を
水で洗浄し、そして組換えカテプシンＫで消化する（３７℃、ｐＨ５．８）。こ
の消化物を高速液体クロマトグラフィーで、例えば逆相でフラクション化し、そ
してピリジノリン架橋を含有するフラクションは３９０ｎｍでの蛍光放射（２９
７ｎｍ励起）でモニターする。配列ＥＫＧＰＤＰＬＱの架橋Ｃ−テロペプチドを
含有する蛍光フラクションは、Ｎ末端配列分析で同定される。このフラクション
はブースター注射、スクリーニング目的及び抗体特異性確認用に使用することが
できる。
【００５１】 本発明の主題抗体は、当該技術分野で良く知られている多種多様な免疫アッセ
イフォーマットで使用することができる。例えば、ハーロー（Harlow）及びレー
ン（Lane）、抗体（Antibodies）：実験室マニュアル（Laboratory Manual）、
コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Cold Spring Harbor Laborat
ory）、５５３〜６１２頁、１９８８年；免疫アッセイの原理と実務（Principle
s and Practice of Immunoassay）、プライス（Price）及びニューマン（Newman
）（編集）、ストックトン・プレス（Stockton Press）、１９９１年；並びに免
疫アッセイ（Immunoassay）、ダイアマンディス（Diamandis）及びクリストポウ
ロス（Christopoulos）（編集）、アカデミック・プレス（Academic Press）、
１９９６年、参照。
【００５２】 本特許出願で引用した先行する科学刊行物及び特許刊行物の開示は、全て参照
して本明細書に組み入れる。 本発明は好ましい実施態様に関連して記載したが、上記明細書を読んだ後に通
常の技倆を有する者は、本明細書に述べられている主題に対して種々の変更、均
等物置換及び改変を行うことができよう。それ故、本発明は本明細書で特定的に
記載されている方法以外の方法で実施することができる。それ故、特許によって
本発明に付与される保護は、特許請求の範囲及びそれらの均等物によってしか限
定されないことが意図されている。
【配列表】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，Ｚ Ａ，ＺＷ

Claims (17)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 体液試料を、生理学的状態を示すアナライトと結合する抗体
    と接触させ、該体液試料中の該抗体の結合を検出し、そして検出された結合を該
    生理学的状態と相関させる段階を含んでいる、該アナライトの存在について該体
    液試料を分析する方法において、血清試料を 【化１】 と結合するが、 【化２】 （上記式中、Ｋ−Ｋ−Ｋはヒドロキシリシルピリジノリン又はリシルピリジノリ
    ンであり、そして括弧は選択自由のアミノ酸残基を表す）とは結合しない抗体と
    接触させ、そして検出された結合を非鉱質化II型コラーゲンのインビボ吸収と相
    関させることを含んでいる改良方法。
  2. 【請求項２】 該血清試料を、Ｉ型コラーゲンのアミノ末端テロペプチド、
    Ｉ型コラーゲンのカルボキシ末端テロペプチド及び遊離リシルピリジノリン架橋
    のなかから選択される骨吸収マーカーと結合する第２の抗体と接触させ、そして
    該試料中の該第２の抗体の検出された結合を骨のインビボ吸収と相関させる段階
    を更に含んでいる請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】 該血清試料を、III型コラーゲンのアミノ末端テロペプチド
    及びIII型コラーゲンのカルボキシ末端テロペプチドのなかから選択されるIII型
    コラーゲン吸収マーカーと結合する第２の抗体と接触させ、そして該試料中の該
    第２の抗体の検出された結合をIII型コラーゲンのインビボ吸収と相関させる段
    階を更に含んでいる請求項１に記載の方法。
  4. 【請求項４】 体液試料を、生理学的状態を示すアナライトと結合する抗体
    と接触させ、該体液試料中の該抗体の結合を検出し、そして検出された結合を該
    生理学的状態と相関させる段階を含んでいる、該アナライトの存在について該体
    液試料を分析する方法において、血清試料を 【化３】 と結合するが、 【化４】 （上記式中、Ｋ−Ｋ−Ｋはヒドロキシリシルピリジノリン又はリシルピリジノリ
    ンであり、そして括弧は選択自由のアミノ酸残基を表す）とは結合しない抗体と
    接触させ、そして検出された結合を鉱質化II型コラーゲンのインビボ吸収と相関
    させることを含んでいる改良方法。
  5. 【請求項５】 該血清試料を、Ｉ型コラーゲンのアミノ末端テロペプチド、
    Ｉ型コラーゲンのカルボキシ末端テロペプチド及び遊離リシルピリジノリン架橋
    のなかから選択される骨吸収マーカーと結合する第２の抗体と接触させ、そして
    該試料中の該第２の抗体の検出された結合を骨のインビボ吸収と相関させる段階
    を更に含んでいる請求項４に記載の方法。
  6. 【請求項６】 該血清試料を、III型コラーゲンのアミノ末端テロペプチド
    及びIII型コラーゲンのカルボキシ末端テロペプチドのなかから選択されるIII型
    コラーゲン吸収マーカーと結合する第２の抗体と接触させ、そして該試料中の該
    第２の抗体の検出された結合をIII型コラーゲンのインビボ吸収と相関させる段
    階を更に含んでいる請求項４に記載の方法。
  7. 【請求項７】 体液試料を、生理学的状態を示すアナライトと結合する抗体
    と接触させ、該体液試料中の該抗体の結合を検出し、そして検出された結合を該
    生理学的状態と相関させる段階を含んでいる、該アナライトの存在について体液
    試料を分析する方法において、尿試料を 【化５】 と結合するが、 【化６】 （上記式中、Ｋ−Ｋ−Ｋはヒドロキシリシルピリジノリン又はリシルピリジノリ
    ンであり、そして括弧は選択自由のアミノ酸残基を表す）とは結合しない抗体と
    接触させ、そして検出された結合を非鉱質化及び鉱質化の両方のII型コラーゲン
    のインビボ吸収と相関させることを含んでいる改良方法。
  8. 【請求項８】 該尿試料のクレアチニン含有量を測定し、そして該抗体の検
    出された結合対クレアチニン含有量の比を相関させて尿量と関係のないII型コラ
    ーゲンの総吸収の尿指数を得る段階を更に含んでいる請求項７に記載の方法。
  9. 【請求項９】 該尿試料を、Ｉ型コラーゲンのアミノ末端テロペプチド、Ｉ
    型コラーゲンのカルボキシ末端テロペプチド及び遊離リシルピリジノリン架橋の
    なかから選択される骨吸収マーカーと結合する第２の抗体と接触させ、そして該
    試料中の該第２の抗体の検出された結合を骨のインビボ吸収と相関させる段階を
    更に含んでいる請求項７に記載の方法。
  10. 【請求項１０】 該尿試料を、III型コラーゲンのアミノ末端テロペプチド
    及びIII型コラーゲンのカルボキシ末端テロペプチドのなかから選択されるIII型
    コラーゲン吸収マーカーと結合する第２の抗体と接触させ、そして該試料中の該
    第２の抗体の検出された結合をIII型コラーゲンのインビボ吸収と相関させる段
    階を更に含んでいる請求項７に記載の方法。
  11. 【請求項１１】 体液試料を、生理学的状態を示すアナライトと結合する抗
    体と接触させ、該体液試料中の該抗体の結合を検出し、そして検出された結合を
    該生理学的状態と相関させる段階を含んでいる、該アナライトの存在について体
    液試料を分析する方法において、血清試料を 【化７】 と結合するが、 【化８】 とは結合しない第１の抗体と接触させ、そして該血清試料を 【化９】 と結合するが、 【化１０】 （上記式中、Ｋ−Ｋ−Ｋはヒドロキシリシルピリジノリン又はリシルピリジノリ
    ンであり、そして括弧は選択自由のアミノ酸残基を表す）とは結合しない第２の
    抗体と接触させ、そして該第１及び第２の抗体の検出された総結合を鉱質化及び
    非鉱質化の両方のII型コラーゲンのインビボ吸収と相関させることを含んでいる
    改良方法。
  12. 【請求項１２】 該血清試料を、Ｉ型コラーゲンのアミノ末端テロペプチド
    、Ｉ型コラーゲンのカルボキシ末端テロペプチド及び遊離リシルピリジノリン架
    橋のなかから選択される骨吸収マーカーと結合する第３の抗体と接触させ、そし
    て該試料中の該第３の抗体の検出された結合を骨のインビボ吸収と相関させる段
    階を更に含んでいる請求項１１に記載の方法。
  13. 【請求項１３】 該血清試料を、III型コラーゲンのアミノ末端テロペプチ
    ド及びIII型コラーゲンのカルボキシ末端テロペプチドのなかから選択されるIII
    型コラーゲン吸収マーカーと結合する第３の抗体と接触させ、そして該試料中の
    該第３の抗体の検出された結合をIII型コラーゲンのインビボ吸収と相関させる
    段階を更に含んでいる請求項１１に記載の方法。
  14. 【請求項１４】 体液試料を、生理学的状態を示すアナライトと結合する抗
    体と接触させ、該体液試料中の該抗体の結合を検出し、そして検出された結合を
    該生理学的状態と相関させる段階を含んでいる、該アナライトの存在について該
    体液試料を分析する方法において、血清試料を 【化１１】 と結合するが、 【化１２】 とは結合しない第１の抗体と接触させ、そして尿試料を 【化１３】 と結合するが、 【化１４】 （上記式中、Ｋ−Ｋ−Ｋはヒドロキシリシルピリジノリン又はリシルピリジノリ
    ンであり、そして括弧は選択自由のアミノ酸残基を表す）とは結合しない第２の
    抗体と接触させ、そして該第１の抗体の検出された結合を鉱質化II型コラーゲン
    のインビボ吸収と相関させ、そして該第２の抗体の検出された結合を鉱質化及び
    非鉱質化の両方のII型コラーゲンのインビボ吸収と相関させることを含んでいる
    改良方法。
  15. 【請求項１５】 該尿試料のクレアチニン含有量を測定し、そして該第２の
    抗体の検出された結合対該クレアチニン含有量の比を相関させて尿量と関係のな
    いII型コラーゲンの総吸収の尿指数を得る段階を更に含んでいる請求項１４に記
    載の方法。
  16. 【請求項１６】 該血清及び尿試料のうちの少なくとも１つを、Ｉ型コラー
    ゲンのアミノ末端テロペプチド、Ｉ型コラーゲンのカルボキシ末端テロペプチド
    及び遊離リシルピリジノリン架橋のなかから選択される骨吸収マーカーと結合す
    る第３の抗体と接触させ、そして該試料中の該第３の抗体の検出された結合を骨
    のインビボ吸収と相関させる段階を更に含んでいる請求項１４に記載の方法。
  17. 【請求項１７】 該血清及び尿試料のうちの少なくとも１つを、III型コラ
    ーゲンのアミノ末端テロペプチド及びIII型コラーゲンのカルボキシ末端テロペ
    プチドのなかから選択されるIII型コラーゲン吸収マーカーと結合する第３の抗
    体と接触させ、そして該試料中の該第３の抗体の検出された結合をIII型コラー
    ゲンのインビボ吸収と相関させる段階を更に含んでいる請求項１４に記載の方法
    。
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