JP3423720B2 - 体液中のコラーゲン断片を測定する方法、該方法を実施するためのテストキット及び手段、並びにコラーゲンの代謝に関連する疾患の存在を診断するために該方法を使用する方法・用途 - Google Patents

体液中のコラーゲン断片を測定する方法、該方法を実施するためのテストキット及び手段、並びにコラーゲンの代謝に関連する疾患の存在を診断するために該方法を使用する方法・用途

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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、体液中のコラーゲン断片を測定する方法に
関する。本発明は、さらに、本発明の該方法を実施する
のに用いる、合成ペプチド、モノクローナルおよびポリ
クローナル抗体ならびに細胞系を含む手段に関する。な
おさらに、本発明は、コラーゲンの代謝に関連する疾
患、特に骨粗鬆症を診断するために前記方法を使用する
方法・用途に関する。
発明の背景 コラーゲンとコラーゲン代謝疾患 骨粗鬆症はヒトにおいて最も広範に認められる骨の疾
病である。原発性骨粗鬆症は、高い骨折受傷性を伴うの
であるが、骨格の骨質量の漸進的減少に起因する疾患で
あり、アメリカ合衆国だけでも1500万乃至2000万の人々
が罹患していると推定されている。この疾患の基礎は、
骨の再形成、即ち骨組織の形成および吸収の速度が年齢
に依存して不均衡になることである。
アメリカ合衆国においては、毎年、骨粗鬆症に関連し
た骨折が約120万件も老人に起こっており、これには約5
38000の脊髄の圧縮骨折、約227000の股関節骨折および
相当数の末梢骨の初期骨折を含む。股関節骨折について
は、その12乃至20％が致命的である。その理由は、重度
の外傷および出血を引き起こし、而も助かった患者の半
分は家庭での看護を必要とする。骨粗鬆症関連傷害から
生じる合計コストは今や、米国で年間少なくとも100億
ドルに達する（Riggs、New England Journal of Medici
ne.327:620−727（1992））。
骨粗鬆症は、閉経後の女性に最も広範に生起するので
あるが、それは平均して閉経後10年以内にその骨の質量
の15％を失うからである。またこの疾病は、老齢になる
に従い男性でも若い無月経の女性運動競技者でも起こ
る。骨粗鬆症が持つ社会的かつ経済的影響の重要性は大
きく而も増大しているにも係わらず、患者または健常な
被験者において骨吸収速度を測定するための信頼できる
測定方法は、その利用可能性は極めて限定されている。
コラーゲン代謝の異常を必然的に伴う（およびこれに関
連した）他の疾患としては、パジェット病、マルファン
症候群、骨形成不全、コラーゲン組織における新生物増
殖、小人症、慢性関節リウマチ、変形性関節症および脈
管炎症候群などがある。
ヒトコラーゲンには、これまでに三種類のものが公知
であり報告されている。クラスＩコラーゲンは、Ｉ型、
II型、III型、Ｖ型およびXI型にさらに細分され、フィ
ブリルを形成することが知られている。Ｉ型乃至III型
のアミノ酸配列を（これまでに解明されたところまで）
添付書類Ａとして添付する。
Ｉ型コラーゲンは、骨の有機マトリックスの90％以上
を占めており、従って原理的にはＩ型コラーゲンの分解
を追跡することによって骨吸収速度を推定することが可
能でる。同様に、結合組織を包含する他の疾病状態は多
数あるが、コラーゲンの分解を測定することによって追
跡することが出来る。その例としては、慢性関節リウマ
チおよび変形性関節症に関連するII型コラーゲンの分解
および脈管炎症候群におけるIII型コラーゲンの分解が
挙げられる。
ヒトIII型コラーゲン、ヒト・プロα１（II）コラー
ゲン及びヒトIII型コラーゲンの全プレプロα１（III）
鎖のアミノ酸配列並びにこれらに対応するcDNAクローン
が、いくつかのグループの研究者によって研究されその
結果決定されている；即ち、Loil et al.,Nucleic Acid
s Research 12:9383−9394（1984）;Sangiorgi et al.,
Nucleic Acids Research,13:2207−2225（1985）;Baldw
in et al.,Biochem.J.,262:521−528（1989）；およびA
la−Kokko et at.,Biochem.J.260:509−516（1989）を
参照。
Ｉ、IIおよびIII型コラーゲンは全て、プロコラーゲ
ン分子として生体内で形成されるのであるが、このプロ
コラーゲン分子は、コアコラーゲン分子に結合したＮ−
末端およびＣ−末端プロペプチド配列から構成されて成
る。コアコラーゲン合成の過程で生体内で自然に生成す
るプロペプチドを除去すると、残るコラーゲン分子のコ
アは、その大半は非三重ラセンである末端テロペプチド
配列を有する三重ラセンから成っている。これらのテロ
ペプチド配列は、細胞外でのコラーゲンフィブリルの分
子間架橋が起こる部位として重要な機能を有する。また
このアルファラセン領域も架橋可能な部位を含んでいる
が、この領域から得られるペプチドは本発明の一部を構
成する。
分子間架橋結合は、コラーゲンフィブリルに対して生
物力学的安定性を付与する。これらの架橋結合の形成
は、リシンおよびヒドロキシリシンの対応するアルデヒ
ドへの修飾によって開始される。コラーゲンの隣接鎖に
位置するそれらの残基のうちのいくつかは、自発的に相
異なる分子間架橋結合を形成する。コラーゲンテロペプ
チド上にラセン領域から架橋する部位の正確な位置は、
既に以前に報告済である。例えば、Kuehn,K.,Immunoche
mistory of the extracellular matrix,1:1−29、CRC P
ress,Inc.,Boca Raton,Florida（1982）、Eyre,D.R.,An
n.Rev.Biochem.,53:717−48（1984）または米国特許第5
140103号を参照。さらに、Ｉ型、II型およびIII型コラ
ーゲンにおいて架橋するためのいくつかの潜在的可能性
のある部位について、アミノ酸配列を後記表１に示す。
繊維状蛋白質であるコラーゲンおよびエラスチンは、
リシンまたはヒドロキシリシンの側鎖からのアルデヒド
形成に基づくユニークな機構によって架橋される。架橋
の４つの相同な座がＩ型、II型およびIII型コラーゲン
の分子で明らかにされている（総説については、Kuehn,
K.,Immunochemistry of the extracellular matrix,1:1
−29（1982））を参照）。２つはアルデヒド部位であ
り、それぞれ各テロペプチド領域におけるものである。
残りの二つの部位は、分子の各末端から約90残基離れて
対称的に位置するヒドロキシリシンである。コラーゲン
分子がフィブリルにパックすると、ラセン領域における
これらの後者の部位は一列に配列し、隣接分子中のテロ
ペプチドアルデヒドと反応する。かくして、３−ヒドロ
キシピリジニウム残基がヒドロキシリシン由来アルデヒ
ドからの成熟架橋結合であるという強力な証拠が得られ
る。しかしながら、別の経路、すなわち、リシン残基の
アルデヒド結合からの成熟架橋残基は依然知られていな
い。
コラーゲン分解に関する先行技術による測定方法 これまでに生体内（in vivo）でのコラーゲンの分解
を追跡するため開発されてきた測定方法は、コラーゲン
の分解産物を含む種々の生化学的マーカーを測定するこ
とによるものであった。しかしながら、これらの方法は
いずれも、架橋可能部位を持つコラーゲン断片から本質
的に誘導した配列を有する合成ペプチドと免疫反応性を
示す抗体の形態をとる免疫学的結合性パートナーを使用
するものではなかった。
例えば、ヒドロキプロリンは、その大半がコラーゲン
および骨や他の全ての結合組織における主要構造タンパ
ク質に限定されているアミノ酸であるが、尿中に排泄さ
れる。その排泄速度は、ある種の状態、特に前記したご
ときパジェット病−骨の代謝回転が大幅に増大する代謝
的骨疾患である−において増加することが知られてい
る。
このような理由で、これまで尿中ヒドロキシプロリン
がコラーゲン分解についてのアミノ酸マーカーとして広
く使用されてきたのである;Singer,F.R.et al.,Metabol
ic Bone Disease,Vol.II（eds.Avioli,L.V.,and Kane,
S.M.）,489−575（1978）,Academic Press,New Yorkを
参照。
米国特許第３、600、132号は、コラーゲン代謝におけ
る変動を軌跡するため血清、尿、腰椎液やその他の細胞
間液などの体液中のヒドロキシプロリンの測定方法を開
示している。該特許においては、ヒドロキシプロリン
は、パジェット病、マルファン症候群、骨形成不全、コ
ラーゲン組織における新生物増殖及び種々の形態の小人
症のような病理学的状態に関連して、コラーゲンの同化
および異化が増大することと相関関係がある旨述べられ
ている。
パジェット病に関連する骨吸収はまた、骨コラーゲン
の分解の後に尿に排泄されるヒドロキシプロリンを含ん
だ小さいペプチドを測定することによっても追跡されて
きた;Russel et al.,Metab.Bone Die.and Rel.Res.4 an
d 5,255−262（1981）及び前掲Singer,F.R.,et al.を参
照。
パジェット病の場合は、尿中ヒドロキシプロリンの増
加は恐らくは、その大半は骨分解に基くものであろう；
しかしながら、ヒドロキシプロリンは一般には、骨分解
についての特異的指標としては使用することは出来な
い。尿中のヒドロキシプロリンの多くは、新規のコラー
ゲン合成（新たに産生された蛋白質のうちのかなりの量
が組織繊維に一体化させることなく分解され、排泄され
る）に由来し且つある種の血中タンパク質やヒドロキシ
プロリンを含有する他のタンパク質の代謝変化に由来す
る可能性があるからである。
さらには、タンパク質分解に由来する遊離ヒドロキシ
プロリンの約80％は肝臓で代謝され、決して尿には出現
しない。Kiviriko,K.I.,Int.Rev.Connect.Tissue Res.
5:93（1970）及びWeiss,P.H.and Klein,L.,J.Clin.Inve
st.48:1（1969）を参照。ヒドロキシプロリンは骨粗鬆
症の良好なマーカーであるが、扱うのが面倒であって、
骨に含まれるコラーゲンに特異的である。
ヒドロキシリシンおよびその配糖体誘導体は、共にコ
ラーゲン性タンパク質にとって独特なものであって、コ
ラーゲン分解のマーカーとしてヒドロキシプロリンより
も正確であると考えられてきた。しかしながら、ヒドロ
キシプロリンについて前記したと同様の理由によって、
ヒドロキシリシンおよびその配糖体は、恐らくは骨吸収
の非特異的マーカーとしては同等であろう;Krane,S.M.a
nd Simon,L.S.,Develop.Biochem.22:185（1981）を参
照。
また別の研究者は、関節疾病におけるコラーゲン分解
の指標として架橋性化合物である３−ヒドロキシプリジ
ニウムを測定してきている。その背景および例について
は、Wu and Eyre,Biochemistry,23−1850（1984）;Blac
k et al.,Annals of the Rhematic Diseases,48:641−6
44（1989）;Robins et al;Annals of the Rhematic Dis
eases,45:969−973（1986）；およびSeibel et al.,The
Journal of Dermatology,16:964（1989）を参照。本発
明とは異なって、これらの先行研究者は体液から得たペ
プチドを加水分解し、次いで個々の３−ヒドロキシピリ
ジニウム残基の存在を探索していたのである。
Ｉ型、II型およびIII型コラーゲンの分解を測定する
ための測定方法は、米国特許第４、973、666号および米
国特許第５、140、103号に開示されている。しかしなが
ら、これらの両特許とも、架橋剤である３−ヒドロキシ
ピリジニウムを含有するコラーゲン断片に限定されてお
り、一方本発明は、この具体的な特別の架橋構造の存在
または不存在に依存しないのである。さらに、前記した
測定方法は、抗体を産生させるためおよび測定における
抗原のために用いる３−ヒドロキシピリジニウムを含有
するコラーゲン断片を尿から精製するという退屈で複雑
な操作を必要とする。
現在のところ、米国特許第４、973、666号および米国
特許第３、149、103号に記載されたアプローチを用いる
臨床データはほとんど利用できない。特に、（前記特許
に記載された方法によって測定した）Ｉ型コラーゲンの
テロペプチドを含有する３−ヒドロキシピリジニウムの
尿中濃度と（骨デンシトメトリーによって反復測定した
数値により測定した）現実の骨喪失との間の相関関係に
関するデータは公表されていない。尿中でのテロペプチ
ドを含有する３−ヒドロキシピリジニウムの存在は、骨
再吸収過程前の異なる時点においてこのような特異的架
橋構造が骨組織において正当に形成されることを必要と
する。これらの過程については情報は、殆ど入手出来な
いので、本発明においては、架橋構造の正確な形成とい
う、このような依存性を回避しようと意図したのであ
る。更には予備的データによれば、本発明の一つの実施
態様においてはこの測定方法で反応性を有する分子の大
部分は分子量が４、000ダルトン以上であることが判っ
ている。これとは逆に、２、000ダルトン未満の分子量
を持つ分子のみが本測定方法で用いたモノクローナル抗
体によって尿中で同定されるのである;Hanson et al.,J
ournal of Bone and Mineral Research 7:1251−1258
（1992）を参照。このことは、本発明の方法は反応性の
プロフィールが極めて多様であること、即ち、この方法
は前記米国特許に記載された方法とは違って、極めて異
なる分子を検出することを証明するものである。
前記研究者は何れも、本発明に記載するように、コラ
ーゲン分解に際して生体内（in vivo）で自然に生成す
る線状の架橋可能コラーゲン断片を特異的に測定するこ
とを報告していない。
英国特許出願第２、205、643号では、体内でのIII型
コラーゲンの分解は、体液中のIII型コラーゲン由来の
Ｎ−末端テロペプチドの濃度を測定することによって定
量的に測定出来ることが報告されている。この方法は、
架橋可能構造の周辺における特異的で、低分子量である
配列と反応性を有する抗体を使用する方法に関するもの
ではない。つまりこの方法は、III型コラーゲン細菌性
コラゲナーゼで分解することによって放出・遊離された
Ｎ−末端テロペプチドに対して生成した抗体を使用する
ものであって、前記テロペプチドは、この方法において
は標識されたうえで使用されるのである。
Schroeter−Kermaniらは、Immunol.Invset.19:475−4
91（1990）においてＩ型およびII型コラーゲンのCNBr断
片に基づいた免疫学的測定システムを記載報告してい
る。ペプシン可溶化コラーゲンを用い、かかるテロペプ
チドは組織に残される（前記英国特許出願第２、205、6
43号参照）。従って、断片およびそれから生成した抗体
の間に一致関係はない。更にはこの文献には、抽出され
た組織試料についての測定値しか記載されていない。
ペプシン可溶化Ｉ型コラーゲンに対して生成させたモ
ノクローナル抗体の開発が、WerkmeisterらによってEu
r.J.Biochem.187:439−443（1990）に記載報告されてい
る。この抗体は、組織セグメントの免疫組織学的染色を
行うためにまた細胞培養液中のコラーゲン含量を測定す
るために使用される。このような測定は体液について実
施されるものではない。
欧州特許出願第0505210号は、Ｉ型コラーゲン由来の
Ｃ−末端テロペプチドに対する抗体試薬の開発について
記載している。免疫原は、ヒト骨コラーゲンを細菌性コ
ラゲナーゼで可溶化することによって調製される。この
ようにして調製された抗体は、架橋および非架橋テロペ
プチドとも反応する能力があり、ピリジノリン以外の架
橋剤を使用することができる。しかしながら、この方法
は、本発明の測定方法とは顕著に異なる免疫測定方法が
得られることになる。
国際特許出願WO91/09114号によれば、固体基質への細
胞接着を促進するのに使用される、幾つかの合成ペプチ
ドが開示されている。免疫学的試薬としての合成ペプチ
ドの使用については、言及されていない。
コラーゲン分解は、ある種のプロコラーゲンペプチド
を数量化することによって測定できることを示す多数の
報告がある。プロペプチドは、プロコラーゲン分子中の
位置および生体内（in vivo）でのその切断のタイミン
グによってコラーゲンコアのテロペプチドおよびアルフ
ァラセン領域から区別される；米国特許第4,504,587
号；米国特許第4,312,853号;Pierard et al.,Analytica
l Biochemistry 141:127−136（1984）;Niemala,Clin.C
hem.31/8:1301−1304（1985）；およびRohde et al.,Eu
ropean Journal of Clinical Investigation,9:451−45
9（1979）を参照。
欧州特許出願第0298210号および第0339443号は共に、
III型プロコラーゲンペプチドおよびその断片の免疫学
的測定を記載している。更には、プロコラーゲンの測定
に基づく方法が欧州特許出願0465104号に開示されてい
る。プロコラーゲンペプチドの形成およびコラーゲン断
片の形成は異なる時期に起こり、且つこのような断片は
コラーゲン分子の異なる部分に由来するので、これらの
方法は、本発明の方法とは明らかに異なる。
免疫学的試薬を開発するためにIX型コラーゲンに由来
する配列を有する合成ペプチドの使用が、PCT特許出願W
O90/08195号に開示されている。また同様に、該出願に
は、液体中のIX型コラーゲン断片の測定するためにこの
ようにして産生された抗体を使用する用途が記載されて
いる。IX型コラーゲンは、架橋可能な部位を含有してい
ないので、この特許出願は本発明を予測させるものでは
ない。
米国特許第４、778、768号は、滑液の液状試料中のプ
ロテオグリカンモノマーまたはその抗原断片の定量を行
うことから成る、関節軟骨内部で生起する変化を測定す
る方法に関するものである。この米国特許は、分解コラ
ーゲンに由来するコラーゲン断片の検出には関するもの
ではない。
Dodge,J.は、Clin.Invest.83:647−661（1981）にお
いて、ヒトおよびウシのII型コラーゲンの解かれたアル
ファ鎖および臭化シアン誘導ペプチドと特異的に反応す
るポリクローナル抗血清を用いるII型コラーゲンの分解
を分析する方法を幾つか開示している。本発明とは異な
り、コラーゲンの分解産物は体液中にて検出されるので
はなく、細胞培養の染色によって、即ち「in situ」検
出によって組織化学的に検出されているのである。Dodg
eと本発明の間の主要な差異は、DodgeはII型コラーゲン
の分解をin situにて測定する点である。
前記文献のいずれも、分解したフィブリルコラーゲン
の量をin vivoで測定するために実測可能であるよう
な、具体的なテロペプチドまたはアルファラセンの構造
を特定してはいない。
1994年２月17日に公開された国際出願94/03813号は、
とりわけすべての締約国についての欧州特許を指定して
いる。従って、それはEPC第54（３）条の規定になる先
行技術となる。
該出願は、試料中のコラーゲンまたはコラーゲン断片
を検出するに際して、コラーゲンのＣ−末端またはＮ−
末端ドメインに対応する合成線状ペプチドを含有する結
合性パートナーを線状合成ペプチドに対する抗体および
試料と共にインキュベートし、該抗体の該結合性パート
ナーに対する抗体の結合を測定することから成る競合的
免疫測定方法を記載している。この特許出願は、架橋出
来る潜在的な部位を含有する合成ペプチドに言及してお
らず、従って、本出願の新規性を阻害するものではな
い。
発明の概要 本発明は、患者および健常なヒト被験者の体液中にお
いて特定のコラーゲン断片が存在するという発見に基づ
く。このコラーゲン断片は、コラーゲン分解と共に生成
されるので、架橋出来る潜在的な部位の存在によって、
例えば、リシンまたはヒドロキシリシンの存在によって
部分的に特徴ずけられる（Kuehn,K.,Immonochemistry o
f the extracellular matrix,1:1−29（1982））。
本発明の方法は、Ｉ型、II型及びIII型のヒト・コラ
ーゲンの分解の測定に使用可能である。
本発明は、コラーゲン分解に際してin vivoで産生さ
れる特定種のコラーゲン断片の存在およびその量を測定
し；次いで、健常な個人、即ちコラーゲン代謝に影響を
及ぼす疾患に罹患していない個人において同一種のコラ
ーゲンを測定することによって作成した所定の標準値と
前記コラーゲン断片検出値とを比較してコラーゲンの分
解を測定する方法を提供するものである。なお、該個人
は試験を受けるべき被験者と性別および年齢は一致させ
るものとする。
本発明は、これらの架橋構造を有さない合成ペプチド
と免疫反応性を示す抗体を用いる。
好ましいある実施態様においては、本方法は、体液中
のコラーゲン断片とコラーゲンに実質的に由来する合成
ペプチドとが免疫学的結合性パートナーに対して起こる
競争的結合に基づく。
本発明は、コラーゲン分解に際して生じるコラーゲン
断片の（定性的および定量的）検出を行うたの新規でか
つ非常に簡単な方法を提供する。
本明細書において開示し特許請求する本発明の目的の
ために、下記する用語は以下の通り定義される。
「抗体」：モノクローナルもしくはポリクローナル抗
体またはその免疫反応性断片（即ち、同一の抗原決定基
に結合できる能力を持つ）、Fab、Fab'およびＦ（ab'）
２断片を含むがこれらに限定されない。
「架橋可能部位」:in vivoで他のコラーゲン分子のテ
ロペプチドまたはラセンアミノ酸配列とで架橋結合を形
成できるリシンまたはヒドロキシリシンを含有するコラ
ーゲンのテロペプチドまたはラセンアミノ酸配列におけ
る座。
「架橋可能ペプチド」：少なくとも１つの架橋可能部
位を含むコラーゲン配列の断片を含有するペプチド。
テストキット：測定を行うのに用いる試薬と指示薬の
組合せ。
実質的に由来する（構造について）：類似の抗原性を
持つ構造、すなわち、前記合成ペプチド何れもが該合成
ペプチドに対して免疫反応性を持つ免疫学的結合性パー
トナーに結合するのを、非関連ペプチドのレベルを超え
て阻害する能力を持つ構造。
CrossLaps ELISA:α１（１）C1アミノ酸配列EKAHDGGR
に対する抗血清の反応性に基づく競合的免疫アッセイ。
このアッセイは8AA ELISAとも呼ばれる。
この方法は又動物体液中のコラーゲン断片を測定する
ためにも、例えばコラーゲン代謝を測定するために用い
ることもできると想定される。また本方法は、新規医薬
品のコラーゲン代謝に対する影響を評価するために該医
薬品の臨床試験中においても使用することもできる。
より具体的には、本発明は、コラーゲンの前記配列に
対応した合成ペプチドを使用することによってコラーゲ
ン断片を測定する方法に関する。一般に、これらの合成
ペプチドは全コラーゲン分子よりも少ないアミノ酸残基
を有し、10アミノ酸よりも少ない場合が多いであろう。
また、体液、例えば尿中に存在する分子に対応する合成
ペプチドは架橋出来る潜在的部位、好ましくはリシンま
たはヒドロキシリシンを構造中に結合させているであろ
う。
本発明は、前記合成ペプチドに対して免疫反応性を持
つ抗体を使用することによってコラーゲン断片を測定す
ることを包含するが、なお該ペプチドは各々架橋可能部
位を有するコラーゲン断片に由来する配列を有する。
また、本発明は、前記合成ペプチドと免疫反応性のモ
ノクローナル抗体を産生する細胞系（例えば、ハイブリ
ドーマ）をも含む。更には本発明は、融合細胞ハイブリ
ッドによって産生されたモノクローナル抗体、および検
出可能なマーカーにカップリングしたその抗体（ならび
にその結合性断片、例えばFab）を含む。検出可能なマ
ーカーの例としては、以下に限定されるものではない
が、酵素、発色団、発蛍光団、補酵素、酵素阻害剤、化
学ルミネッセンス物質、常磁性金属、スピン標識および
放射性同位体が挙げられる。
本発明の方法は、体液中においてコラーゲン分解に由
来する特定のコラーゲン断片の濃度を数量化することか
ら成り、代表的な測定法において、患者体液中のコラー
ゲン断片および固体表面に固定化された合成ペプチド
を、合成ペプチドに免疫反応性を持つ免疫学的結合性パ
ートナーと接触させる。適当な体液としては、例えば、
ヒト尿、血液、血清、血漿および滑液がある。また本方
法は、例えば唾液および汗に対しても使用可能であるこ
とも想定している。この体液はそのまま使用するか又は
接触工程に先立って精製しても構わない。この精製工程
は、例えば以下に限定されるものではないが、カートリ
ッジ吸着および溶出、分子ふるいクロマトグラフィー、
透析、イオン交換、アルミナクロマトグラフィー、ヒド
ロキシアパタイトクロマトグラフィー、およびそれらの
組合せを含めた多数の標準的な手法を用いて実施するこ
とができる。
本発明は、体液中のコラーゲン断片の定量のための簡
便化された方法を実現することにある。ある代表的な方
法において、架橋出来る潜在的な部位を含有する合成ペ
プチドを抗体の産生に使用し、その後にコラーゲン分解
によってin vivoで生じたコラーゲン断片の定量のため
の検定に組み込み使用するのである。従って、該合成ペ
プチドも免疫原性剤として特徴ずけられ、免疫原性組成
物で使用できる。
また本発明は、体液中においてコラーゲンの分解に由
来するコラーゲン断片の量を定量するのに有用なキット
を包含する。本キットは、少なくとも１種の免疫学的結
合性パートナー、例えばコラーゲンの分解に由来するペ
プチドに特異的なモノクローナルまたはポリクローナル
抗体から成る。所望ならば、テストキットの免疫学的結
合性パートナーは前記したもののごとき検出可能なマー
カーに結合してもよい。従って一般的に言って、免疫学
的結合性パートナーも診断剤としてに有用である。以下
に本発明を詳細に説明する。添付図面を参照されたい。
図面の簡単な説明 図１、２および３は、実施例で詳細に記載するα１
（Ｉ）C1免疫アッセイ（「CrossLaps」とも称する）
（図１）、α１（Ｉ）NI免疫アッセイ（図２）及びα２
（Ｉ）N1免疫アッセイ（図３）についての典型的標準曲
線である。図４は全ピリジノリン（HPLC）とCrossLaps
免疫アッセイとの間の相関関係を示す。
図５は、全ピリジノリン（HPLC）とα１（Ｉ）免疫ア
ッセイとの間の相関関係を示す。
図６は、抗体MAbA7のエピトープ特異性を示す。
図７は、α１（Ｉ）C1ペプチド断片に基づくCrossLap
s ELISAとMAbA7ELISAとの間の相関相関を示す。
図８は、CrossLaps ELISAとα２（Ｉ）N1）ペプチド
断片に基ずいたＮα2 EISAとの間の相関関数を示す。
図９は、閉経に関連した骨吸収の増加をMAbA7ELISAに
よって検出する方法を示す。
図10は、閉経に関連する骨吸収の増加のCrossLaps E
LISAによる検出を示す。
図11は、CrossLaps ELISAおよびMAbA7ELISAによって
測定した、ホルモン置換療法の間に於ける生物化学的マ
ーカーの変化を示す。
図12は、健常な年齢適合させた婦人からの採取した尿
試料のCrossLapsにおける測定の個々の数値を示す。
図13は、ホルモン置換療法を受けている婦人およびCr
ossLaps免疫アッセイにおけるプラセボからの尿試料の
測定の個々の値を示す。
図14は、CrossLaps免疫アッセイについて選択された8
AAペプチドの位置の模式的表示である。
図15は、初期閉経後婦人（ｎ＝245）および後記閉経
婦人からの個々の8AA値を示す。ハッチングを施した領
域は閉経前婦人（ｎ＝102）の群からの平均値±2SDを示
す。
図16は、Ｄ−Pyrおよび8AA ELISAの相関を示す。214
人の年齢が30.0−65.0歳の健康な婦人について、8AA EL
ISAで得られた値をＤ−Pyr（HPLC）と比較した。
図17は、Hprおよび8AA ELISAの間の相関を示す。421
人の健康な年令が30.0−54.0歳の婦人について、8AAELI
SAで得られた値をHprと比較した。
図18は、CrossLapsTM ELISAで得られた値とHPLCでの
ピリジノリン（ｎ＝81）との相関を示す。
図19は、閉経前（ｎ＝104）および閉経後（ｎ＝180）
の婦人におけるCrossLapTM、Hprおよびオステオカルシ
ン（osteocalcin）を示す。Ｔ−スコアはBottom panel
で示す。
図20は、ベースライン値のパーセントとして表した、
12カ月のホルモン置換療法（ｎ＝80）（．）またはプラ
セボ（ｎ＝35）療法後における生化学的パラメーターな
らびに前腕（ｏ）および脊髄（．）の骨質量の平均変化
を示す。ハッチングを施した領域は閉経前婦人での変動
を表す。
図21は、24カ月の期間におけるCrossLaps TM/Crのベ
ースライン値と９回の前腕骨質量測定値から決定した喪
失速度（％／年）との間の相関相関を示す。
本発明の詳細な記載および本発明を実施する最良の態様 本発明の方法の好ましい一つの実施態様においては、
尿中のＩ、IIおよびIII型コラーゲン断片は、尿試料を
計量して取り、コラーゲンに由来する配列を有する合成
ペプチドおよび該合成ペプチドに免疫反応性を示す抗体
とこの試料とを接触させることによって行う阻害ELISA
（酵素結合イムノソルベント検定法）を用いて測定す
る。合成ペプチドは固体支持体に固定化し、また抗体は
該合成ペプチドに対して生成させる。
これら試薬と試料を合わせてインキュベートし、ペル
オキシダーゼ結合（リビーリング）（revealing）抗体
を添加する。もう１度インキベーションした後、ペルオ
キシダーゼ基質溶液を添加する。最終のインキュベーシ
ョンを短時間で行った後、酵素反応を停止し、吸光度を
450nmで測定し、同一手法によって標準溶液で得られた
標準曲線と比較する。
合成ペプチドを標準の調製に用いる。関連合成ペプチ
ドのストック溶液中の合成ペプチドの濃度を、アミノ酸
定量測定法によって測定する。ストック溶液の３倍希釈
物を調製し、引き続いて、阻害ELISAにおける標準曲線
の作成で用いる。
合成ペプチドの調製 合成ペプチドの調製は、当該分野でよく知られた手法
に準じて、例えば、通常「Merrifield合成」と表記され
る固相ペプチド合成技術によって行うことができる。ま
た、古典的液相技術を用いることもできる、対象となる
配列は、潜在的架橋可能な部位を含む（例えば、Kuehn,
K.,Immunochemistry of the extracellular matrix,1:1
−29（1982）、Eyre,D.R.,Ann,Rev.Biochem.53:717−48
（1984）、または米国特許第５、140、103号参照）。こ
のようなペプチド配列の例を幾つか後記表１に示す。
合成ペプチドに関しては、（ａ）対応する天然コラー
ゲン断片を認識する抗体を生起させる、または（ｂ）か
かる抗体の天然断片への結合を阻害する、という二つの
能力を喪失させることなく、架橋可能部位から（または
それへ）１以上のアミノ酸残基を省略（または付加）す
ることができる。抗体を生成させるためにより長いコラ
ーゲン断片および／またはキメラペプチドを用いること
ができ、原理的には、本測定法において免疫原および競
合体と同一のペプチドを用いる必要はない。
下記表１において、本発明に従って合成ペプチドの基
準・基礎として使用するべき潜在的架橋可能な部位を有
するアミノ酸配列の例をコラーゲンの型別に分けて示す
が、本発明においては、Ｉ型コラーゲンのテロペプチド
領域におけるGln−Tyr−Asp−Gly−Lys−Gly−Val−Gly
を選択する。
抗体の調製 モノクローナルおよびポリクローナル両抗体の調製方
法は当該分野でよく知られている。例えば、Campbell,
A.M.,Laboratory Techniques in Biochemistry and Mol
ecular Biology,Vol.13（1986）を参照。免疫化によっ
て合成ペプチドに対する抗体を産生できる。しかしなが
ら、これらの化合物は分子量が比較的小さいため、ハプ
テンを担体分子に結合させるのが好ましい。適当な担体
分子としては、以下に限定されるものではないが、例え
ばウシ血清アルブミン、チログロブリン、オバルミン、
破傷風毒素及びキイホール・リンペット（Keyhole limp
et）ヘモシアニンがある。好ましい担体は、ウシ血清ア
ルブミンである。免疫化動物の抗体産生細胞に対してそ
の最も免疫原性の高い形態でハプテンを提示するため
に、多数の代替カップリングプロトコルを使用できる。
適当な手法としては、以下に限定されるものではない
が、グルタルアルデヒド、カルボジイミドおよび過ヨウ
素酸塩が挙げられる。好ましい結合剤は、グルタルアル
デヒドおよびカルボジイミドである。
抗体の調製は、コラーゲン断片または担体に結合させ
た合成ペプチドによる免疫化を含む従来公知の技法によ
って行われる。免疫原性を改善するためには、注射前に
免疫原をアジュバントと混合する。アジュバントの例と
しては、以下に限定されるものではないが、水酸化アル
ミニウム、フロイントのアジュバント、および免疫刺激
複合体（ISCOM）がある。ISCOMは、Morein,B.ら（Natur
e 308:457−560（1984））によって記載されている方法
に準じて作成できる。
ハプテン担体分子に対するモノクローナルまたはポリ
クローナル抗体はいずれでも産生させることが出来る。
モノクローナル抗体の産生を行うには、マウスを免疫化
するのが好ましい。免疫化マウスから脾臓細胞を収集
し、ホモジナイズし、その後にポリエチレングリコール
の存在下で癌細胞と融合させて、コラーゲンに由来する
ペプチド断片に特異的なモノクローナル抗体を産生する
細胞ハイブリッドを得る。適当な癌細胞としては、以下
に限定されるものではないが、骨髄腫、肝癌、および肉
腫細胞がある。モノクローナル抗体の産生についての詳
細な記載は、Goding,J.M.のMonoclonal Antibodies:Pri
nciples and Practice（1986）においてなされている。
好まし予備的スクリーニングプロトコルは、担体に結合
され且つマイクロタイタープレートの固体表面に被覆さ
れた合成ペプチドを使用することから成る。
コラーゲンに由来するペプチド断片と反応性を示すポ
リクローナル抗体を調製するには、種々の動物種を免疫
化させればよい。適当な動物種としては、以下に限定さ
れるものではないが、ニワトリ、ウサギ、およびヤギが
ある。ニワトリおよびウサギが好ましい。
抗体断片は、当該分野で公知である種々の方法によっ
て調製される（E.Ishikawa,Journal of Immunoassay 3:
209−327（1983）参照）。
免疫学的測定法の実施 従って、前記した方法で調製した抗体を用いた免疫学
的測定を利用することによって、事前に分別または加水
分解することなく生物学的流体試料を測定することがで
きる。生物学的液体中で所望コラーゲンが持つ特異性
は、測定構成法において一種の合成ペプチド（抗体の産
生に際して用いたか又は何れにしろ抗体が免疫化学的な
反応性を示す）の使用と組み合わせるとかかる抗体によ
って供されるのである。
この代替法として、かかる免疫学的測定をモノクロー
ナル抗体を用いて実施しても構わない。この測定設計の
基礎的考え方は、検定の特異性を抗原（コラーゲンに対
する合成ペプチド）から抗体（モノクローナル抗体に対
するウサギ抗血清からの）にシフトさせることである。
このような構成法を用いると、測定は合成ペプチドを用
いる必要がない。このような免疫学的測定の変法は、精
製したコラゲナーゼ処理コラーゲンで予め被覆したマイ
クロタイタープレート中でペルオキシダーゼ結合抗体溶
液と共に患者試料または標準溶液をインキュベートする
ことによって行われる。洗浄した後、プレートのウェル
を基質溶液と共に暗所でインキュベートする。停止溶液
の添加によって発色反応を停止し、最後に吸光度を測定
する。
これらの免疫学的測定法それ自体は、当該分野で広く
公知となっている種々の標準的な測定プロトコルから選
択されるいずれかの手法を用いて行われる。一般に理解
されているように、測定法の構成は、特異的免疫学的結
合性パートナーと所望の特異性分析物との相互反応に依
存し且つ分析物と免疫学的結合性パートナーとによって
形成された複合体を検出する何らかの手段を利用するも
のである。免疫学的結合性パートナーは，固体支持体に
複合体化し、分析物に対する捕捉性免疫学的結合性パー
トナーとして使用される。このプロトコルは，直接的形
態で実行出来るのであって、この場合は、分析物／免疫
学的結合性パートナーの複合体の形成は、例えば、蛍
光、放射性または酵素標識によって検出される。又は競
合的形態で実行可能であって、この場合標識化標準は免
疫学的結合性パートナーを求めて分析物と競合するので
ある。このような形態はまた、凝集測定法として構成し
てもよく又は複合体を適当な沈澱剤を反応混合物に添加
することによって沈澱させてもよい。この免疫学的測定
のプロトコルの具体的設計は、種々幅広い選択が可能で
あって、当該分野で利用可能な臨床測定装置およびプロ
トコルの数は膨大である。このような種々のプロトコル
については、米国特許第５、001、225号を参照。
標準的な検出プロトコル、例えば、放射性同位体標
識、蛍光標識又はELISAを用いた免疫学的測定法を実施
するための抗体およびリビーリング試薬は、直接的また
は競合的形態の何れであっても、測定のために必要な成
分および指示を含むキットとして好便に供されてもよ
い。本発明の一つの具体例においては、かかるキット
は、関連合成ペプチドで被覆したマイクロタイタープレ
ート、標準曲線の作成のための標準溶液、分析実行の定
性的テストのための尿対照、前記合成ペプチドと反応性
のウサギ抗体、基質溶液、停止溶液、洗浄緩衝液および
指示マニュアルを含む。
免疫学的測定法の構成は、抗体および特異的合成ペプ
チドを用いて行うことが出来るので、適宜の生物学的液
体中における対応するコラーゲン断片配列の比並びにそ
の個別の含有量とその合計を測定すればよい。即ち、こ
の測定法は、いくつかの天然ペプチド配列を決定できる
か又は単一のペプチド配列か若しくはこれらの如何なる
所望の組合せをも決定できるような抗体を含むように設
計することが可能である。
骨吸収のインジケーターとして本明細書で特定したペ
プチドを使用するのに加えて、骨代謝バランスの測定
も、同一個体から採取した同一または他の適宜の生物学
的液体中における骨形成マーカーを実質的に同時に測定
することによって有利に行える。「実質的に同時」と
は、同一日、好ましくは４時間以内を意味する。例えば
かかるマーカーとしては、（BGPの骨GLA蛋白質としても
公知の）オステオカルチン、Ｉ型プロコラーゲン、骨ア
ルカリ性ホスファターゼおよび合成アルカリ性ホスファ
ターゼがある。これらのマーカーの適当な測定方法は、
例えば、Delmase,P.D.らのJ.Bone Min,Res.（1986）1:3
33−337に見い出すことができる。
本発明の測定法法は、分解が起こった場合コラーゲン
誘導ペプチドを生じるような組織の代謝状態を測定する
ための指標を提供するものであるので、種々の意味で有
用である。先ずＩ型コラーゲンの分解を検討する場合、
これら測定法は、例えば過剰骨吸収を明示することによ
って被験者の異常状態を評価する方法となる。つまりこ
のことによって、骨粗鬆症症状の存在または悪性疾患の
転移的進行が判る。過剰骨吸収によって特徴付けられる
他の疾患症状としては、パジェット病および上皮小体亢
進症がある。同様に、結合組織に関係する多くの他の疾
病状態を、コラーゲンの分解の測定によって追跡でき
る。その例としては、慢性関節リウマチおよび変形性関
節症に関連するII型コラーゲン分解および脈管炎症候群
におけるIII型コラーゲン分解がある。被験者の状態は
連続的に追跡できるので、これらの測定法の適用は、こ
れらのまたは他の症状を治療するために適用した療法の
進行状態を追跡するのにも使用できる。さらにこれらの
測定法は、毒性物質の投与はしばしば組織分解の結果を
もたらすので、毒性の尺度としても使用できる。
即ち、これら測定法は、疾患病状、治療または被験者
に直接投与された物質または被験者が環境で暴露された
物質の効果の指標としてコラーゲン組織の代謝状態を使
用することが可能である如何なる状況においても適用し
て構わない。
以下に記載する実施例は、本発明を具体的に説明する
ものであって、本発明を限定するものではない。
実施例1:尿中の特異的ペプチド配列の免疫学的測定 固相技術によって調製した３種のペプチド（α１
（Ｉ）C1、α１（Ｉ）N1およびα２（Ｉ）N1）（19ペー
ジ、表１参照）を免疫原の調製に用いる。免疫化を行う
ために、当該分野でよく知られたグルタルアルデヒド試
薬および方法を用いて、該ペプチドをウシ血清アルブミ
ンに共有結合させる。モノクローナルおよびポリクロー
ナル両抗体を該ペプチドに対して生成させる。モノクロ
ーナル抗体の産生のために、Ba1b/cマウスをペプチド−
BSA結合体で免疫化し、脾臓またはリンパ節からの細胞
とAg8骨髄種細胞とを融合させて標準的な技術を用い
て、ハイブリドーマ細胞系を調製する。ポリクローナル
をウサギおよびニワトリで生起させる。抗血清およびハ
イブリドーマ細胞培地のスクリーニングは、カルボジイ
ミド試薬および当該分野で公知の方法を用いて調製した
適当なペプチド−ゼラチン結合体で被覆したマイクロタ
イタープレートを用いてELISAによって行った。
尿中における３種のペプチド配列（α１（Ｉ）C1、α
１（Ｉ）N1およびα２（Ｉ）N1）の測定は、阻害ELISA
によって以下のように行う。
各々、コラーゲン断片を可能性として含有する尿試料
（10または25μｌ）または参照標準として0.05〜15μｇ
ペプチド/mlを含有する溶液を、0.1％Tween−20界面活
性剤PBS−Ｔ）を含有し且つ0.1％（w/v）BSAを含むリン
酸緩衝生理食塩水中に1:5,000〜1:20,000に希釈したペ
プチドに対する免疫学的結合性パートナー75μｌに添加
する。各試料は、適当なペプチドを含有するゼラチン結
合体で予め被覆した平底96−ウェルのマイクロタイター
プレートにおいて二回繰り返して調製する。60分後、該
プレートをPBS−Ｔ（３回）で洗浄し、一次抗体の種に
対して調製したホースラディッシュペルオキシダーゼ標
識抗体を用いる標準的技法によって結合抗体を検出す
る。ペルオキシダーゼ基質を添加し、1MH3PO4を用いて
酵素反応を停止させた後に自動マイクロタイタープレー
ト中で発色を450nmで測定する。分析物を含有する試料
は、プレート中の固定化ペプチドに対する一次抗体の結
合を減少させ、かくして色濃度が低下する。試料中の分
析物の量は、log−linプロットを用いてコンピューター
計算した各プレートに含まれる標準からの予め確立した
曲線を参照して定量する。図１、２および３は、α１
（Ｉ）C1（CrossLaps）免疫測定（図１）、α１（Ｉ）N
1免疫検定（図２）およびα２（Ｉ）N1免疫検定（図
３）についての典型的な標準曲線を示す。
実施例2:HPLCにてのピリジノリン測定に対する相関関係 多数の非選択尿試料について、全ピリジノリンの濃度
（HPLC法、例えば、Uebelhart,D.,Bona and Mineral,8:
87−96（1990）参照）を測定した。このHPLCシステムで
得られた値は、二回の免疫学的測定で得られた値（Cros
sLapsおよびα１（Ｉ）N1ペプチドに基づく測定）と相
関関係にあった。
図４は、全ピリジノリン（HPLC）およびCrossLaps免
疫学的測定（ｎ＝59）との相関関係を示す。直線回帰分
析で計算した相関はｒ＝0.80である。
図５は、全ピリジノリン（HPLC）およびα１（Ｉ）N1
免疫学的検定（ｎ＝36）の間の相関関係を示す。直線回
帰分析で計算した相関はｒ＝0.95である。
実施例3:I型コラーゲンの分解産物の測定のためのモノ
クローナル抗体を用いる測定 モノクローナル抗体は、適当な担体蛋白質に結合させ
たα１（Ｉ）C1合成ペプチドでのマウスの免疫化によっ
て生じさせた。細胞融合、クローニングおよびハイブリ
ドーマ増殖は、標準的操作方法により行った。スクリー
ニング操作には、マイクロタイタープレート中に固定し
たα１（Ｉ）C1合成ペプチドに対する反応性に関する試
験を含むものであった。
抗体の特異性は、Ｉ型コラーゲンのＣ−テロペプチド
に基く異なる重複配列を用いた阻害実験によって試験し
た。
かかる抗体の一つであるMAbA7の特異性を図６に示
す。
抗体MAbA7を用い検定を開発した。略言すれば、グル
タルアルデヒドを用いて合成ペプチドα１（Ｉ）C1をウ
シ血清アルブミンに結合させ、該結合体をマイクロタイ
タープレートの被覆に用いた。また代替の物質を用いる
こともできるが、必須の要件はアルギニンの後で解離切
断された配列EKAHDGGR（Ｒ）の露呈である。
かかる代替物の一つは、細菌コラゲナーゼで処理した
Ｉ型コラーゲンである。また別の代替物は、組換えペプ
チドにおけるEKAHDGGR配列の発現物であってもよく、必
須の要件は再度EKAHDGGR配列のカルボキシ末端（すなわ
ち、アルギニン残基）の露呈である。
被覆に続き、マイクロタイタープレートのウェルを、
尿15μｌおよびホースラディッシュペルオキシダーゼに
結合したMAbA7の100μｌと共にインキュベートする。
１時間後、該プレートを洗浄し、基質（例えば、TM
B）を添加する。
MAbA7のエピトープ特異性は図６から明らかである。
マイクロタイタープレート中での固定化EKAHDGGRに対す
るMAbA7の反応性は、異なる合成ペプチドでのコインキ
ュベーションによって開始させた。得られた結果から、
アルギニンの後の切断はMAbA7ELISAにおける検定に必須
であることが判った。
実施例4:他のペプチド断片および抗体に基づくELISA測
定結果に対するCrossLaps ELISAの相関関係 20人の閉経後婦人から採取した尿についてのCrossLap
s ELISとMAbA7ELISAとの間の相関を図７に示す。MAbA7E
LISAは競合アッセイであり、ここに、マイクロタイター
トレイ中に固定化した合成8AAペプチド（EKAHDGGR）は
モノクローナル抗体（MAbA7）への結合について患者試
料中のコラーゲン断片と競合する。
結果は高い相関関係を示し、二回の測定結果は同一ま
たは関連した代謝過程を反映していることが判る。
同様に、CrossLapsとＮα2ELISA間の相関を図８に示
す。Ｎα２は競合測定法であり、この場合Ｉ型コラーゲ
ンにおけるα２鎖中のＮ−テロペプチドからのＮα２
（Ｉ）N1ペプチド断片（QYDGKGVG）は、前記と同様に生
成させた抗−QYDGKGVG抗血清に対する結合につき、患者
試料中のコラーゲン断片と競合する。結果は高い相関関
係を示し、これから二回の測定結果は同一または関連す
る代謝過程を反映することが判る。
実施例5:CrossLaps ELISAの検討 現在好ましい合成ペプチドGlu−Lys−Ala−His−Asp
−Gly−Gly−Arg（またはEKAHDGGR）を、前記したよう
に「CrossLapsTTM」と命名される酵素結合イムノソルベ
ント測定法（ELISA）において一体化させた。CrossLaps
ELISAは、フランスの専門家（Garnroら）のグループに
よって調べられており、結果はJ.Clin.Indocrinol.Meta
b.79,No.3（1994）に発表されるであろう。
検討結果の要約を以下に記載する。
CrossLaps ELISAは、Ｉ型コラーゲンのα１鎖のＣ−
テロペプチドの一部（Glu−Lys−Ala−His−Asp−Gly−
Gly−Arg,CrossLaps抗原）に特異的な８アミノ酸（8A
A）のアミノ酸配列を持つ固定化合成ペプチドに基づ
く。この配列に対して生成させた抗体でのインキュベー
ションの間に、該固定化ペプチドと尿中のＩ型コラーゲ
ンのα１鎖の分解産物との間で競合が起こる。
略言すれば、25μＬ尿試料または標準をCrossLaps抗
原−被覆マクイロプレートの各ウェルに添加し、続い
て、75μＬの抗−CrossLaps抗血清に添加する。該プレ
ートを撹拌下で室温にて１時間インキュベートし、洗浄
緩衝液で５回洗浄する。ヤギ抗ウサギ免疫グロブリンＧ
ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合体（100μ
Ｌ）を各ウェルに添加する。室温での１時間のインキュ
ベーションの後に、プレートを前記したごとくに５回洗
浄する。酵素基質（100μL/ウェル）を添加し、暗所で
の15分間のインキュベーションの後に、100μＬのリン
酸（１モル/L）を添加することによって反応を停止す
る。450nmにおける光学密度をマクイロプレートリーダ
ーにて測定する。二連の測定を各尿試料について行い、
データを、標準比色技術によって測定して、尿クレアチ
ニン（Cr）mmol当たりのマイクログラムとして表す。
いくつかの試料においては、PyrおよびＤ−Pyrの全排
出を、HPLCによって加水分解試料について測定し、尿中
ヒドロキシプロリンを分光光度法によって測定した。
CrossLaps ELISAを用いて、年齢が31〜89歳である146
人の婦人および60人の男性からなる健康成人の標本にお
いてまた代謝的骨疾病に罹患した患者において、骨マト
リックス分解の間に放出されたＩ型コラーゲンペプチド
の尿中排泄量を測定した。測定内および測定間の変動係
数は、各々、10％および13％以下であった。尿試料から
のCrossLaps抗原の回収は92〜115％の範囲であり、該EL
ISAは連続試料希釈について直線的であった。CrossLaps
測定は、遊離ピリジノリン（Pyr）または遊離デオキシ
ピリジノリン（Ｄ−Pyr）いずれとも交差反応しない。E
LISAによって測定したCrossLapsおよび高速液体クロマ
トグラフィーによって測定したPyrの全排泄量は、正常
婦人において高度に相関していた（ｎ＝91;r＝0.73;P＜
0.001）。尿中CrossLaps排泄量は婦人の年齢と共に増加
したが、男性ではそうはならなかった。婦人において
は、閉経は、HPLCによって測定した全Ｄ−Pyr（＋91
％）および全Pyr（＋47％）り平均増加よりも高い骨ア
ルカリ性ホスファターゼ（＋48％）およびオステオカル
チン［＋41％;217ないし524μg/mmolクレアチニン（C
r）］のCrossLaps排泄量が141％増加したことによって
反映された。尿中CrossLaps排泄量は、パジェット秒に
おいて（ｎ＝32;平均、1810±2300μg/mmolCr;P＜0.00
1）、および一次上皮小体亢進症を持つ患者において
（ｎ＝10;平均、780±380μg/mmol Cr;P＜0.001）、お
よび甲状腺機能亢進症を持つ患者において（ｎ＝27;平
均、1280±970μg/mmol Cr;P＜0.001）、対照値から増
加しており、Ｚ−スコア（性別および年齢が合致した対
照の平均からのSD数）は各々4.4±6.6、1.5±1.2および
6.7±6.5であった。パジェット病の患者においては、尿
中ヒドロキシプロリンのレベルと高度に相関し（ｒ＝0.
91;P＜0.001）、３日間のビス・ホスホネートパミドロ
ネートによる静脈内治療を行った場合、尿中CrossLaps
排泄量の減少は尿中ヒドロキシプロリンのそれよりも大
きかった（−71％−対−−17％;P＜0.001）。甲状腺機
能亢進症の患者においては、CrossLaps排泄量はほとん
どの患者において（78％）正常範囲を超えて上昇し、甲
状腺機能亢進症の治療１カ月内に正常に戻った。
これらの観察に基づき、Garneroらは、この新しい便
利な測定法は、骨吸収速度の指標として感度が優れ且つ
特異的でありまた骨粗鬆症や他の代謝的骨疾患の患者の
臨床検査および治療的追跡にで有用であると結論ずけて
いる。
実施例6:MAbA7ELISAの検査 前記したごとく、モノクローナル抗体MAb7Aに基づく
測定構成では、合成ペプチドを使用する必要がない。こ
のような種類の測定法は、３段階にて以下のごとくに実
施される。
第１の段階において、精製したコラゲナーゼ処理コラ
ーゲン（CTC）で事前被覆したマイクロタイタープレー
トのウェルを15μｌの標準溶液または尿試料および100
μｌのペルオキシダーゼ結合モノクローナル抗体溶液と
共に室温で１時間インキュベートする。
第２の段階で洗浄を行った後、ウェルを100μｌの基
質溶液と共に室温で15分間暗所でインキュベートする。
最後に、第３の段階において、発色反応を100μｌの停
止溶液の添加によって停止する。450nmにおける吸光度
を２時間以内に測定する。
図９は、閉経に伴う骨吸収の増加に関するMAb7A ELIS
Aの検出を示す。18人の閉経前および38人の閉経後の婦
人からの尿試料をテストした。ｔ−スコア（閉経前婦人
の標準偏差数として表した平均値の差）は、二つの集団
間の比較的微小な分離を示す。
図10は、CrossLaps ELISAによって行った閉経に伴う
骨吸収の増加係わる同様の検定を示す。尿試料は図８の
ものと同一である。
ホルモン置換療法（HRT）に過程において生化学的マ
ーカーにおける変化が図11から明らかである。エストロ
ゲン（塗りつぶした丸）またはプラセボ（塗りつぶさな
い丸）を服用した婦人から採取した尿試料をベースライ
ンにおいて又12カ月間の治療を行った後で試験した。12
カ月後の値をベースライン値の100分率として表す。得
られた結果から、CrossLaps ELISAおよびMAb7A ELISA
（被覆剤としてCTCまたは合成ペプチドEKAHDGGRを使
用）は、抗吸収治療に対して同等の感度を有することが
判る。
実施例7:臨床結果 実施例１に記載した免疫学的測定方法（α１（Ｉ）Cl
ペプチド、即ちCross Laps ELISAを使用した）を異なる
個体からの尿試料に適用し、分析物の量を数量化した。
得られた値は、尿検定で通常行われているように、尿試
料中の尿クレアチニン含有量と関連ずけた。年令マッチ
ングさせた健常婦人（閉経前および閉経後）で得られた
値を表２に示す。
個々の値については、図12を参照。
閉経前および閉経後の値の間の差は、高度に有意であ
る（Ｐ＜0.0001）。
定量的試験方法のＺ−スコアは、二つの集団の間を差
別化する当該方法の能力を表わす。表３は、年令マッチ
ングさせた健常な閉経前（ｎ＝140）および閉経後婦人
（ｎ＝180）から採取した同一セットの尿試料に適用し
た場合におけるCrossLaps免疫学的測定法とHPLCによる
ピリジノリンに関する最新の技術水準測定法のＺ−スコ
アを示す。
表３から分かるように、２の方法の差別化能力はほぼ
同様である。
ある測定法を吸収の指標として使用するためには、ホ
ルモン置換療法（HRT）のインパクトを測定出来ること
が非常に重要である。表４は、かかる検討においてCros
sLaps ELISAで得られた結果を示す。
個々の値については、図13を参照。
HRTを受ける群における高度に有意な低下が、12カ月
後に観察される（Ｐ＜0.001）。
実施例8:尿中のＩ型コラーゲン分解産物の定量・数量化
に際しての本発明の免疫学的測定法（CrossLap ELISA）
の評価 ピリジノリン（Pyr）およびデオキシピリジノリン
（Ｄ−Pyr）は成熟コラーゲン間の架橋物であり、主と
して骨および軟骨で見い出されるのであるが、他方では
皮膚には存在ない。Ｄ−PyrはPyrよりも骨により特異的
であるが、いずれも絶対的には骨特異的ではない。しか
しながら、PyrおよびＤ−Pyrの全排泄量の測定は、骨吸
収の指標として使用できる。PyrおよびＤ−Pyrは、通常
はHPLCを用いて分離した後加水分解された尿において蛍
光分光学的に測定されるのであるが、時間を浪費する、
複雑な方法で、ルーチンの使用には適さない。
本実施例は、尿中においてPyrおよびＤ−Pyrの構造と
は独立したＩ型コラーゲン特異的ペプチド配列を測定す
る想定法、即ちCrossLaps ELISAを記載するものであ
る。骨の有機マトリックスは90％異常がＩ型コラーゲン
から成りので、この測定法で測定したペプチド配列は、
骨吸収の潜在的なマーカーである。
この測定法について参照値を確立するために、年齢が
30〜51歳（平均±1SD;39.3±5.56）の102人の健康な閉
経前婦人から採取した試料を検定した。全ての婦人は正
常な膣出血の経歴を有し、カルシウム代謝に影響するこ
とが知られている医薬は一切服用していなかった。同様
に、年齢が45〜57歳（平均±1SD;51.1±2.38）の初期閉
経後婦人から採取した料を測定したが、これらの婦人は
全て、自然な閉経の履歴の持主であった（平均閉経年齢
20.1±9.90月）。更に年齢が68〜72歳（平均±1SD;70.0
±1.19）の後期閉経後婦人から採取した試料（ｎ＝16
5）を測定したが、これらの婦人は全て自然な閉経の経
歴の持主であった（平均閉経年齢268±682月）。これら
の婦人のいずれもカルシウム代謝に影響することが知ら
れている医薬品は一切服用していなかった。
テストした測定法及びＤ−Pyr（HPLC法）の比較を行
うために、年齢30.0〜65.0歳の214人の健康な婦人から
採取した尿試料を測定した。この測定法およびHprを比
較するために、年齢30.0〜54.0歳の健康な婦人から成る
もう１つの集団から採取した試料を測定した（ｎ＝42
1）。
実験は、8AA特異的合成ペプチドに基づくCrossLaps E
LISAについては実施例５に概説したのと実質的に同様に
行った。略言すれば、25μＬの標準または未知試料を予
め被覆したELISAプレート中の適当なウェルに二連にて
ピペットを用いて入れる。次いで、75μＬの抗体溶液
（8AAに対するウサギ抗体）を各ウェルに添加し、該プ
レートをシーリングテープで覆い、振盪器具上室温にて
60分間インキュベートする。また、下記の手法は全て室
温で行った。インキュベーション後に、該プレートを希
釈した洗浄緩衝液で３回洗浄した。
ペルオキシダーゼ結合抗体（ウソギIgGに対するHRP−
結合ヤギ抗体、100μL/ウェル）を添加し、シールした
ウェルを振盪器具上、60分間インキュベートした。もう
一度洗浄した後、100μＬのTMB基質溶液をすべてのウェ
ルに添加し、これをシールし、15分間インキュベートし
た。100μＬの停止溶液の添加して15分後酵素反応を停
止した。光学密度を450nmでELISAレーダーで読み取っ
た。
補正曲線は、五つのの標準液（0.5〜10.5μg/ml）の
平均吸光度をプロットすることによって対数−直線グラ
フ紙上で作成した。各患者の試料における8AA相当物の
濃度を、補正曲線上で内挿法によって決定した。
その他のマーカー Pyrの尿中濃度をHPLC法によって測定した。略言すれ
ば、架橋物は、セルロースクロマトグラフィーによって
加水分解尿試料から抽出し、逆相HPLCによって分離し、
分光蛍光光度法によって同定した。蛍光ピークの面積
は、ヒト骨皮質から精製した補正済Pyr外部標準との比
較によって数量化した。測定内および全測定変動係数
は、標準曲線の範囲内では10％以下であった（14.4〜21
6pmol、注入試料用量:130μＬ）。
Hprの尿中濃度は、分光光度法によって測定した。測
定内および全測定変動係数は標準曲線の範囲（38〜305
μmpl/L）では13％以下であった。
8AA測定、PyrおよびHprについての値は、正規化のた
めに対応するクレアチニン値で除した。
結果 図14は、本測定法にて用いた抗体を生成させるために
選択した8AAペプチドの位置の模式図である。測定で用
いた標準液は、0.5ないし10.5mg/Lの測定範囲を規定す
るものである。テストした尿試料の約５％は10.5mg/Lよ
りも高い値を有していた。これらの試料を標準液Ａ中で
１＋３に希釈し、再テストした。検出限界（ゼロ標準マ
イナス2x SD（ゼロ標準）なる平均吸光度に等しい吸光
度に対応する濃度として定義）は0.2mg/Lである。
技術的なバリデーションを行うために、検定の精度を
計算した。表５には、内部および全変動係数をまとめて
示す。これらのデータは、同一ロットのELISAを用いて
三つの尿試料を４日間の毎日６回測定した数値に基づい
て計算した。平均の試験内及び全CVsは、各々5.3および
6.6％であった。分析的回収率は、三つの異なる尿試料
に対して合成ペプチドを量を増やしながら添加した後に
測定したが、平均して100％であった（表６）。
ELISA法において高濃度の試料のを稀釈した場合の効
果を表７に示す。試料は、ゼロ標準液で稀釈した（500m
M TRIS、0.1％Tween20、0.1％ BSA pH＝8.0）。未希
釈尿試料中の含有量に対して、100％なる数値を割り当
てた。尿試料の種々の希釈液についての全平均は99％で
あった。
これらのデータは、同一ロットの8AA ELISAを用いて
三つの尿試料を４日間毎日６回測定した数値に基づいて
計算した。
尿試料における8AA濃度は、0.61〜3.44μg/mLであっ
た。
凍結および解凍を５回までの反復した後本測定法で測
定を行っても、テストした五つの試料において尿中濃度
は有意に変化しなかった（５回の凍結−解凍サイクル後
の初期値のパーセント：平均±SD、ｎ＝5:98.5±4.5
％）。さらに、別の五つの試料においては、測定した抗
原は、20℃において少なくとも７日間、如何なる添加物
を加えなくても安定であった（初期値のパーセント：平
均±SD、ｎ＝5:99.8±5.1％）。
図15は、二つの閉経後集団（初期閉経後、ｎ＝254、
後期閉経後ｎ＝165）における8AA ELISAの個別値を、ハ
ッチングを施した領域によって示してある健常な閉経前
範囲（平均±2SD）と比較して示してある（閉経後範囲2
50±220mg/mol Cr、ｎ＝102）。初期閉経後婦人のうち
36.7％は、閉経前婦人の3SD限界を超える値を有してい
た。この数字は、後期閉経後群に対しては31.5％であっ
た。初期閉経後婦人に対して得られた平均値は後期閉経
後婦人のそれとは異ならず（419mh/mol対412mg/mol）、
閉経年齢の増加に伴って値が変化する傾向はなかった。
図16は、8AA ELISAとHPLCで測定したＤ−Pyrとの間の
相関関係を示す。相関関係は高度に有意であり、ｒ−値
として0.83が得られた。
図17は、ELISAとHprの間の相関関係を示す。また、こ
の相関関係も高度に有意であり、ｒ−値は0.78であっ
た。
上記にて説明した測定法おいては、Ｉ型コラーゲンの
Ｃ−テロペプチドに特異的であって現在のところ好まし
いペプチド配列としてGlu−Lys−Ala−His−Asp−Gly−
Gly−Argを抗体の生成に使用した（図14参照）。このよ
うな分子部分を選択する理由はいくつかあって、この配
列は分子間架橋物にとって重要な領域を含有しており、
さらに架橋残基の近傍部とこれらの分子の持つコンパク
トな構造とが、かかるペプチドが更に一層腎臓分解され
るのを防御することが以前から示唆されている。従っ
て、成熟Ｉ型コラーゲンの部分的分解から生じるかかる
ペプチド配列が尿中で見い出され得ることが予測され
る。
この実験の結果から、評価したELISA法は、精度、回
収率、および尿試料の希釈の点で良好な性能を有するこ
とが判った（表５、６および７）。尿試料の長期取扱い
および測定に関して、テストした試料は反復して凍結し
解凍ことが出来又これらの試料中の抗原は20℃で少なく
とも７日間安定であることが判明したのである。
図15から判るように、テストした婦人の各々36.7％お
よび31.5％は数値が高かった（平均＋2SD以上）。また
この知見は、全ての婦人の約1/3が閉経後に加速された
骨喪失を経験するものと推定する従前の知見とよく合致
する。
Ｄ−Pyrは骨吸収マーカーとして充分に確立されたも
のである。Ｄ−Pyr測定法（HPLC）および8AA ELISAにお
いて平行試料（ｎ＝214）について得られた結果を比較
することによって、高度の相関関係が見い出された（ｒ
＝0.83）。このことは、8AA ELISAが、ピリジノリンに
よって反映されることと類似または平行した代謝過程を
反映するものであることを示唆している。骨吸収のもう
１つのよく確立されたマーカーであるHprに対しても相
関関係があるので、さらに8AA ELISAがin vivoでの骨吸
収を反映するものであることが判る。
実施例9:骨吸収の新しいマーカーとしての本発明の免疫
学的検査法（CrossLaps ELISA）の使用 骨吸収NO増大は骨喪失が増大したことの直接的な病原
性因子であるため、これまでに骨吸収に対して特異的で
あるマーカーを発見すべく多大な努力が傾注されてき
た。カルシウムやヒドロキシプロリンの尿中排泄量が、
骨吸収の指標として長年使用されてきたが、いずれも骨
代謝に対しては特異的ではない。
本実施例は、骨吸収のマーカーとしての本発明に基づ
く好ましい免疫学的測定法（CrossLapsTTM ELISA）を評
価する。骨代謝回転に対する他のマーカーも比較する目
的で評価に含める。
閉経前婦人：血清および尿試料を年齢30〜50歳（平均
±1SD;39.1±5.5）の104人の健康な閉経前婦人から採取
して分析したが、全ての婦人は規則的な膣出血の経歴の
持主であり、カルシウム代謝に影響することが知られて
いる医薬品は一切服用していなかった。
閉経後婦人：閉経後婦人は、二つの大規模な、二重盲検
プラセボ対照、無作為化試験の一部を構成するものあっ
た。この試験の主要目的は、初期閉経後骨喪失について
の異なる予防的療法を評価することであった。
ベースライン値は、年齢45〜55歳の180人の無作為に
選択した健康な閉経後婦人（平均±1SD;50.6±2.36）で
測定したが、これら婦人は全て６カ月から３年の自然の
閉経の履歴を有し（平均±1SD;20.0±10.4カ月）また誰
もカルシウム代謝に影響することが知られている医薬品
を服用していなかった。
更に、長期間に亘る血清及び尿試料について、12カ月
間のホルモン置換療法終えて無作為に選択した80人の婦
人及び12カ月間のプラセボ治療を終えて無作為選択した
35人の婦人から採取して測定した。ホルモン療法は、2m
gの経口エストラジオールに1mgのシプロテロンアセテー
ト、0.75mgのレボノルゲステレル、1mgのデソゲステロ
ル、または10mgのメドロキシプロゲステロンアセテート
いずれかを組み合わせて成るものであった。何れのグル
ープもホルモンおよびプラセボ療法内で同様に反応した
ので、データは一緒に分析した。プラセボ治療を受けた
これらの婦人のうち35人は２年間追跡し、３カ月毎に反
復して前腕質量測定し、これにより骨喪失の速度が計算
できた（％／年）。
血液および尿試料 血液試料を採取し、二日目の朝の尿を少なくとも８時
間の絶食の後に午前８と10時の間にて採集した。試料は
分析するまで−20℃まで貯蔵した。
測定法は前記したごとくに行った（実施例６）。測定
内および測定間変動係数は、各々、６％および８％以下
であり、検出限界は0.2g/mlであった。
ピリジノリン（Pyr）およびデオキシピリジノリン
（Ｄ−Pyr）の尿中濃度をHPLC法によって、これら試料
から無作為に選択したサブセット、即ち合成した81の試
料で測定した（29人の閉経前および52人の閉経後試
料）。略言すれば、架橋物は、セルロースクロマトグラ
フィーによって加水分解した尿試料から抽出し、逆相HP
LCによって分離し、分光光度法によって同定した。蛍光
ピークの領域は、ヒト骨皮質から精製した、補正済のPy
rおよびＤ−Pyr外部標準と比較することによって定量し
た、測定内および測定間変動はPyrについては10％以下
であり、Ｄ−Pyrについては15％以下であった。ヒドロ
キシプロリン（Hpr）の尿中含有量は、分光光度法によ
って測定し、オステオカルチンの血清中含有量はラジオ
イムノアッセイ（RIA）によって測定した。
クレアチニンは自動分析器で測定し、得られた値を用
いて尿中パラメーターを補正した（CrossLaps,Pyr,D−P
yr,Hpr）。遠位前腕の骨ミネラル含量（BMC）は、骨デ
ンシトメーターを用いて単一ホトン吸収法によってベー
スラインにて３カ月毎に測定した。とう骨と尺骨の間の
距離が8mmとなったところで走査を開始した。長期in vi
vo精度は１％未満である。腰椎脊髄の骨ミネラル密度
（BMD）は二重エネルギーホトンまたはＸ−線吸収法い
ずれかによって測定した。
統計的解析 CrossLapsおよびPyrのベースライン値は直線回帰分析
によって補正した。両軸にクレアチニンを導入するのを
回避するために、用いた値はクレアチニンについて補正
しなかった。閉経前および閉経後グループ間の差異は、
対となっていないデータにつき、スチューデントｔ−検
定によって評価した。Ｔ−スコアは、閉経前標準偏差に
おける閉経前平均値からの閉経後偏差として計算した。
Ｔ−スコアは、偏差分析によって比較した。12カ月のホ
ルモン療法の間の異なるマーカーおよび骨におけるベー
スラインからの減少は、対のデータについて、スチュー
デントｔ−検定によって評価した。プラセボおよびホル
モングループにおける変化は、パーセント尺度で評価し
た。個々のベースライン値は100％と定義し、その後の
値は全てベースライン値のパーセントとして計算した。
各グループの平均値は、対になっていないデータについ
てスチューデントｔ−検定によって比較した（喪失の速
度）。CrossLapsのベースライン値は、直線回帰分析に
よって喪失速度に対して相関つけた。
結果 図18において、CrossLapsとPyrとの間の相関関係が可
視化されている（ｎ＝81）。ｒ−値は0.83である。
図19は、閉経前（ｎ＝104）および閉経後（ｎ＝180）
婦人におけるCrossLaps/Cr、Hpr/Crおよびオステオカル
チンの個別の数値を示す。閉経後婦人は、これら３種の
マーカーの全ての数値が71％（CrossLaps）、23％（Hp
r）および52％（オステオカルチン）となり数値が有意
に増加した。閉経に対する応答がＴ−スコアで表される
場合、CrossLapsはＴ−スコアが1.6であり、Hprは0.7で
あり、オステオカルチンについては1.0であった（Ｐ＜
0.001）。試料から無作為に選択したサブセットにおい
て（閉経前ｎ＝29および閉経後ｎ＝29）、パーセントで
の増加は、Pyrについて31％、Ｄ−Pyrについては50％で
あった。対応するＴ−スコアは、PyrならびにＤ−Pyrに
ついては1.3であり、これはCrossLapsのＴ−スコアと有
意に異ならなかった（CrossLapsについてのＴ−スコア
は同一サブグループで1.5であった）。ベースラインで
測定した180人の閉経後婦人のうち、41％は閉経前平均
値の２倍標準偏差以上のCrossLaps値を有していた。Hpr
およびオステオカルチンについて対応する値は、各々12
％および23％であった。
図20は、ベースライン値のパーセントで表した、12カ
月のホルモン置換（ｎ＝80）またはプラセボ（ｎ＝35）
療法後のCrossLaps/Cr、オステオカルチンおよび前腕骨
質量を示す。すべてのマーカーにおいて、プラセボグル
ープと比較すると、ホルモングループにおいては統計的
に有意に減少した。CrossLapsは60.7％減少し、hprは3
0.5％減少し、オステオカルチンは55.4％減少した。試
料のランダムに選択したサブセットにおいて（ホルモン
置換ｎ＝12およびプラセボｎ＝12）、パーセント減少は
Pyrについて22％、Ｄ−Pyrについて29％であった。１年
につき前腕骨質量は3.1％減少し、脊髄骨質量は3.1％で
あった、 図21は、24カ月にわたる前腕骨質量測定によって測定
したCrossLaps/Crのベースライン値および喪失の速度
（％／年）の間の相関関係を示す。この相関関係から、
ｔ−値として−0.61が得られた（Ｐ＜0.001）。Hprおよ
びオステオカルチンについての対応する相関関係から、
−0.46および−0.44がｒ−値として得られた。
前記したことから、CrossLapsは、骨吸収の感受性マ
ーカーであることが示されているピリジノリンに対して
高度に有意に相関関係を有することが証明される。この
ことは、CrossLapsが骨吸収の感受性マーカーであり得
ることを示している。本試験における試料は、婦人の均
質な群を代表するものであり、従って数値の範囲は比較
的狭い。もしパジェット病および極端に高い骨代謝回転
を持つ患者が含まれていたならば、相関関係はより高く
なったと予測される。CrossLapsにおける閉経時の増加
は顕著であり（70％を超える）、このことから、閉経時
に起こる代謝変化の感受性マーカーであることが判る。
Ｔ−値は試験集団が異なると大幅に異なり得るので、注
意深く解釈されるべきである。しかしながら、異なるマ
ーカーを比較磨る場合には、Ｔ−値は、注目するマーカ
ーの感度の指標を与える価値ある手段である。かくして
本試験のデータは、CrossLapsがカルシウム代謝に及ぼ
す閉経の影響に対して感受性であることを示す。閉経前
婦人は閉経後婦人と年齢が一致しなかった。しかしなが
ら、彼女らは平均して40歳であり、かくして、年齢のイ
ンパクトはもしあったとしても、些細のものに違いな
い。さらにこのような比較試験において、マーカーは同
様の方法で影響を最も受け易いであろう。
CrossLaps値は、ホルモン置換療法に応答して実質的
に減少し、このことから、治療効果を追跡するための有
用なマーカーとなる可能性が開ける。ホルモン置換療法
（オステオカルチン、Hpr、PyrおよびＤ−Pyr）を追跡
するのに通常使用されるマーカーと比較して、CrossLap
sはテストした他の吸収マーカーよりも良好に機能し
た。しかしながら、PyrおよびＤ−Pyr実験で使用した試
料は比較的少数であったため、これ以上の確固たる結論
を得る可能性が制限されている。
また、Ｘ−スコアは、標準偏差においてプラセボグル
ープからの活性グループの偏差として算出されるもので
あるが、他のマーカーについてよりもCrossLapsについ
て高くなる（CrossLaps TMにつき1.5、Hprにつき0.7、
およびオステオカルチンにつき1.1;P＜0.001）。
閉経後骨質量喪失の速度は、骨代謝回転の生化学的マ
ーカーのパネルによって評価できることが示された。喪
失速度は、骨粗鬆症の危険の第１の指針となり、骨質量
測定に付託する件数を減少できるであろう。CrossLaps
と単一ホトン吸収法マーカーによって測定された喪失速
度との間の相関関係は、−0.61であることが判明したが
（図21）、これは、骨代謝回転の他のマーカーを用いて
従前に見い出されているものよりも高い。かくして、尿
中CrossLaps濃度は、喪失速度を予測するのに使用され
るであろう。もし3.0％／年を超える骨喪失が危険因子
であると定義されるならば、この集団における600μg/m
molCrなるCrossLapsカットオフ限界を使用すると、診断
感度は73％となりまた特異性は79％となる。３％／年の
骨質量喪失のレベルを用いて「速い」および「遅い」骨
喪失者を区別した。何故ならば、喪失のこの速度は２つ
のモードがある骨喪失分布において適当な分離を与える
ことが以前に見い出されているからである。
本実施例において、脊髄骨喪失の速度は必要な精度で
測定されなかった。というのも、測定の多くはDPAで行
われたからである。従ってベースラインCrossLapsに対
する相関関係は算出されない。
健康な閉経後のグループの15年の追跡において、喪失
の速度は骨折の後期発生に有意に関係し、喪失速度はそ
れ自体危険因子であることが判った。一般に、たとえ同
一の結果が得られるとしても、急速な変化は遅い変化よ
りも身体によって充分に許容されないことが広く受け入
れられている。この事実によって、骨代謝回転が大きい
人を同定することが一層重要となってくる。この意味
で、ほとんど80％の特異性および70％を超える感度であ
ることから、本発明の方法は、閉経後骨粗鬆症の危険評
価における潜在的に有用なスクリーニングパラメーター
となる。
すべての引用した特許、特許出願および文献はその全
体を出典明示して本明細書の一部とみなす。しかしなが
ら、矛盾する場合は、本開示が優先、支配する。
上記においては、具体的な実施例を述べて本発明を記
載してきた。しかしながら、以下にて特許請求する本発
明の精神を逸脱することなく、多くの追加、削除および
修飾が可能であることは当業者に明らかであろう。
付属書類 Ａ コラーゲン１（Ｉ）鎖の前駆体−ヒト（断片）ホモサ
ピエンス（人） 残基の数＝1341 コラーゲンアルファ１（Ｉ）鎖の前躯体の配列は以下
から調製： Chu,M.L.,de Wet,W.,Bernard,M.,Ding,J.F.,Morabit
o,M.,Myers,J.,Williams,C.,and Ramirez,F.,Nature 31
0,337−340,1984（ヒト、残基１−181の配列、DNA配列
から翻訳） Click,E.M.,and Bornstein,P.,Biochemistry 9,4699
−4706,1970（ヒト皮膚、CNBr0−1,CNBr2,CNBr4,CNBr5,
残基162−301の部分配列） Morgan,P.H.,Jacob,H.G.,Segrest,J.P.,and Cunningh
am,L.W.,J.Biol.Chem.245,5042−5048,1970（ヒト皮
膚、残基263−268の配列） Bernard,M.P.,Chu,M.L.,Myers,J.C.,Ramirez,F.,Eike
nberry,E.F.,and Prockop,D.J.,Biochemistry 22,5213
−5223,1983（mRN配列から翻訳した残基302−1341の配
列） プロコラーゲンアルファ２（Ｉ）鎖前駆体 ホモサピ
エンス（人） 残基の数＝1366 コラーゲンアルファ２（Ｉ）鎖の前躯体の配列は以下
から調製： de Wet,W.,Bernard,M.,Benson−Chanda,V.,Chu,M.L.,
Dickson,L.,Weil,D.,and Ramirez,F.,J.Biol.Chem.262,
16032−16036,1987（mRNA配列から翻訳した配列） 表題：ヒトプロ−アルフア−２（Ｉ）コラーゲン遺伝
子の構成 コラーゲンアルファ１（II）鎖前駆体 ホモサピエン
ス（人） 残基の数＝1418 コラーゲンアルファ１（II）鎖前躯体の配列は、以下
から調製 Su,M.W.,Lee,B.,Ramirez,F.,Manchdo,M.and Horton,
W.,Nucleic Acids,Res,17,9473,1989 ヒトII型プロコラーゲンをコードする全cDNAのヌクレ
オチド配列 Baldwi,C.T.,Reginato,A.M.,Smith,C.,Jimenez,S.A.,
and Prockop,D.J.,Biochem.J.262,521−528,1989 ヒトII型プロコラーゲンをコードするcDNAクローンの
構造。アルファ−１（II）鎖はフィブリル状コラーゲン
の２つの他のアルファ鎖よりもアルフア−１（Ｉ）鎖に
より類似する。
Ala−Kokko,L.,Baldwin,C.T.,Moskowitz,R.W.,and Pr
ockop,D.J.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87,6565−6568,1
990 中度軟骨形成不全症に伴う原発性変形性関節症の原因
としてのII型プロコラーゲン遺伝子（COL2A1）における
単一塩基突然変異 Ramirez,F. EMBL Data Libraryに提出、1988年12月 参照番号:S04892 Vikkula,M.and Peltonen,L. FEBS Lett.250,171−174,1989 II型コラーゲン遺伝子における多形領域の構造分析 コラーゲンアルフア−１（III）鎖前駆体 ホモサピ
エンス（人） 残基の数＝1078 コラーゲンアルフア−１（III）鎖前躯体の配列、以下
から調製 Janeczko,R.A.,and Ramirez,F.,Nucleic Acids Res.1
7,6742,1989 全ヒト・アルファ−１（III）コラーゲンのヌクレオ
チドおよび核酸配列
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 国際公開91／008478（ＷＯ，Ａ１) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) G01N 33/53 C07K 5/083 C07K 7/06 C07K 14/78

Claims (14)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】液体中のＩ型コラーゲン断片を定量する方
    法において、前記体液中のコラーゲン断片及び固体表面
    に固定化したコラーゲン架橋構造を一切有さない合成ペ
    プチドの一種を、該固定化合成ペプチドと前記体液中の
    コラーゲン断片に対して免疫反応性を示す免疫学的結合
    性パートナーに接触させるに際して、該免疫学的結合性
    パートナーが、Gln−Tyr−Asp−Gly−Lys−Gly−Val−G
    lyなるアミノ酸配列から構成される固定化ペプチドに対
    して免疫学的反応性を示すものである、前記方法。
  2. 【請求項２】下記する二つの工程：即ち、 （ａ）該体液中の試料を固体担体に固定化した合成ペプ
    チドの一種及び前記固定化合成ペプチドに対して免疫学
    的反応性を示す免疫学的結合性パートナーと接触させる
    に際して、該コラーゲン断片が、該免疫学的結合性パー
    トナーとの結合に対して前記合成ペプチドと拮抗するこ
    と；及び （ｂ）前記該免疫学的結合性パートナーと前記合成ペプ
    チドとの結合量を測定することによって、該体液中のコ
    ラーゲン断片の量を定量化すること； から成る、請求項１に記載された方法において、 前記免疫学的結合性パートナーが、固体担体に固定化さ
    れた、Gln−Tyr−Asp−Gly−Lys−Gly−Val−Glyなるア
    ミノ酸配列から構成される固定化ペプチドに対して免疫
    学的反応性を示すものであり；且つ、 前記固定化合成ペプチドが、コラーゲン架橋結合を一切
    含有せず、天然において前記架橋結合が形成されるＩ型
    コラーゲンの一種の配列から成る領域を貫通しまた前記
    免疫学的結合性パートナーに対して免疫学的反応性を示
    すものである、前記方法。
  3. 【請求項３】固定化合成ペプチドが、10個以下のアミノ
    酸から構成される、請求項２に記載された方法。
  4. 【請求項４】該固定化合成ペプチドが、Gln−Tyr−Asp
    −Gly−Lys−Gly−Val−Glyなるアミノ酸配列を有する
    か、又は相当する天然のコラーゲン断片を認識する抗体
    を産生する能力又は相当する天然のコラーゲン断片にか
    かる抗体が結合するのを阻害する能力を保持させる範囲
    で一つ以上のアミノ酸を付加又は欠失させることによっ
    てGln−Tyr−Asp−Gly−Lys−Gly−Val−Glyなる前記ア
    ミノ酸配列を修飾したものである、請求項２又は請求項
    ３に記載された方法。
  5. 【請求項５】前記免疫学的結合性パートナーが全抗体で
    ある、請求項１乃至４の何れか一項に記載された方法。
  6. 【請求項６】前記免疫学的結合性パートナーがモノクロ
    ーナル抗体である、請求項１乃至５の何れか一項に記載
    された方法。
  7. 【請求項７】試料中のＩ型コラーゲン断片を定量する方
    法にコラーゲン架橋構造を一切有さないペプチドを使用
    する使用法において、該ペプチドが、Gln−Tyr−Asp−G
    ly−Lys−Gly−Val−Glyなるアミノ酸配列から構成され
    るか、又は相当する天然のコラーゲン断片を認識する抗
    体を産生する能力又は相当する天然のコラーゲン断片に
    かかる抗体が結合するのを阻害する能力を保持させる範
    囲で一つ以上のアミノ酸を付加又は欠失させることによ
    ってGln−Tyr−Asp−Gly−Lys−Gly−Val−Glyなる前記
    アミノ酸配列を修飾した配列から構成されるものであ
    る、前記使用法。
  8. 【請求項８】該ペプチドが、固体担体に固定化されるか
    又はキャリアー分子に共役接合させる、請求項７に記載
    された使用法。
  9. 【請求項９】該キャリアー分子が、ウシ血清アルブミ
    ン、チログロブリン、オボアルブミン、破傷風トキソイ
    ド又はキーホールリンペットヘモシアニンである、請求
    項８に記載された使用法。
  10. 【請求項１０】下記を包含して成る、体液中のＩ型コラ
    ーゲン断片を定量する試験キット： （ａ）固体担体に固定化した合成ペプチドの一種に対し
    て免疫学的反応性を示し且つGln−Tyr−Asp−Gly−Lys
    −Gly−Val−Glyなるアミノ酸配列を有する免疫学的結
    合性パートナー；及び （ｂ）固体担体に固定化した合成ペプチドの一種であっ
    て、コラーゲン架橋結合を一切含有することなく、天然
    において前記架橋結合が形成されるＩ型コラーゲンの一
    種の配列から成る領域を貫通し且つ前記免疫学的結合性
    パートナーに対して免疫学的反応性を示す前記合成ペプ
    チド。
  11. 【請求項１１】前記固定化ペプチドが、10個以下のアミ
    ノ酸から構成されるものである、請求項10に記載された
    キット。
  12. 【請求項１２】該固定化合成ペプチドが、Gln−Tyr−As
    p−Gly−Lys−Gly−Val−Glyなるアミノ酸配列から構成
    されるか又は相当する天然のコラーゲン断片を認識する
    抗体を産生する能力又は相当する天然のコラーゲン断片
    にかかる抗体が結合するのを阻害する能力を保持させる
    範囲で一つ以上のアミノ酸を付加又は欠失させることに
    よってGln−Tyr−Asp−Gly−Lys−Gly−Val−Glyなる前
    記アミノ酸配列を修飾した配列から構成されるものであ
    る、請求項第10又は請求項11に記載されたキット。
  13. 【請求項１３】前記免疫学的結合性パートナーが全抗体
    である。請求項10乃至12の何れか一項に記載されたキッ
    ト。
  14. 【請求項１４】前記抗体がモノクローナル抗体である、
    請求項13に記載されたキット。
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