JP7341774B2

JP7341774B2 - 骨質の評価方法

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Publication number: JP7341774B2
Application number: JP2019140363A
Authority: JP
Inventors: 尚孝保田; 宏昭是金; 達也新里; 安則紀平
Original assignee: Oriental Yeast Co Ltd
Current assignee: Oriental Yeast Co Ltd
Priority date: 2019-07-30
Filing date: 2019-07-30
Publication date: 2023-09-11
Anticipated expiration: 2039-07-30
Also published as: JP2021021715A

Description

本発明は、骨質の評価方法に関し、より詳細には、最終糖化産物（ＡＧＥｓ）の１種であるメチルグリオキサール－ハイドロイミダゾロン（ＭＧ－Ｈ１）化したＩ型コラーゲン又は該Ｉ型コラーゲンの断片を測定することを含む骨質の評価方法に関する。

高齢化社会の顕在化に伴い骨粗鬆症患者が急増し、その予防と治療は喫緊の課題となっている。ＮＩＨにおける２０００年の合意文書では、「骨粗鬆症は骨強度が低下し骨折リスクが上昇する疾患であり、また、骨強度には骨密度と骨質が関連する（骨強度＝骨密度×骨質）」と定義された。従来、骨粗鬆症の日常診断の現場では、骨折リスクの評価方法として、骨密度の測定が汎用されてきたが、骨密度が高いにも関わらず骨折する症例が少なからず存在する等、骨密度以外の骨強度規定因子である骨質への関心が急速に高まっている。

特開２０１７－９６８３７号公報

ＮＩＨｃｏｎｓｅｎｓｕｓｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｐａｎｅｌｏｎｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ，ｄｉａｇｎｏｓｉｓ，ａｎｄｔｈｅｒａｐｙ、ＪＡＭＡ（２００１）２８５（６）：７８５－７９５総説骨粗鬆症の新たな治療戦略―骨質評価の重要性― 慈恵医大誌（２０１４）１２９：１０７－１１８１２ｔｈＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＳｙｍｐｏｓｉｕｍｏｆＭａｉｌｌａｒｄＲｅａｃｔｉｏｎ抄録集Ｐ４８

骨質規定因子については諸説あるが、骨体積の５０％を占めるコラーゲン繊維の分子間を繋ぐ「架橋構造」が骨強度を規定する重要因子の一つであることが知られている。コラーゲン繊維の架橋構造には、骨芽細胞由来の酵素によって秩序正しく分子を繋ぎ止め、適度な弾力を保ちつつ骨をしなやか且つ強くする「善玉架橋」と、老化に伴い骨内で過形成された最終糖化産物（ＡＧＥｓ）により無秩序に分子が繋ぎ止められ、骨が硬くもろくなる「悪玉架橋」の大きく二種類が存在することが知られている（非特許文献２参照）。また、骨内総ＡＧＥｓ（悪玉架橋量）のサロゲートマーカーとして、血／尿中ペントシジン並びにホモシステインが知られている（非特許文献２参照）。ペントシジンはＡＧＥｓの一種である。ホモシステインは、酵素阻害を介して善玉架橋形成を抑制することが知られている。

従来、骨粗鬆症の診断と治療においては、骨密度の測定とその改善に焦点が当てられてきたが、前述の様に骨質についても重要な骨強度規定因子の一つであり、骨密度と同時に骨質を評価し、病型に応じた適切な治療介入を実施していくことが望ましい。しかし骨質マーカーについては前述のペントシジン及びホモシステインについても研究段階にあり、現時点で実用化されたものがない。骨質評価の早期の実現化が大きな課題の一つである。

上述のように、ＡＧＥｓの過形成と骨質劣化には関連性のあることが示唆されている。事実、原発性骨粗鬆症や糖尿病、腎不全といった糖化が充進する病態では骨コラーゲン線維の善玉架橋率が低下し、代わってＡＧＥｓ過形成を介した悪玉架橋率が増加し、骨強度の低下をきたすことが報告されている。また、骨内ＡＧＥｓ蓄積量は加齢とともに増大し、骨強度が低下することも明らかにされている。さらに摘出した骨ブロックに対しｉｎｖｉｔｒｏにてＡＧＥｓ形成を誘導すると骨ブロックの強度が低下することが見い出されており、ＡＧＥｓ過形成（悪玉架橋形成）と骨質劣化との関連性が強く示唆されている。

メチルグリオキサール－ハイドロイミダゾロン（ＭＧ－Ｈｌ）はＡＧＥｓの一種として知られ、糖尿病やその合併症、その他加齢性疾患との関連が示唆されている。とりわけ骨疾患に関しては、特許文献１において被験者より採取した血清中のＭＧ－Ｈｌが骨粗鬆症において高値を示すことが見い出されており、疾患の発症やリスク評価に利用し得る可能性が示唆された。また非特許文献３においては、ヒト骨内に存在するＣＭＬ、ＣＥＬ、ＭＧ－Ｈｌ及びＣＥＡの４種類のＡＧＥｓが測定されており、これらの内、ＭＧ－Ｈ１が最も多量にヒト骨内に蓄積していることが見い出されている。

本発明の課題は、骨質を簡便に評価できる骨質の評価方法を提供することにある。

本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、被験者から採取した生体試料中の、メチルグリオキサール－ハイドロイミダゾロン（ＭＧ－Ｈ１）化したＩ型コラーゲン又は該Ｉ型コラーゲンの断片を測定することが、骨質の評価に有用であることを知見した。

本発明は、上記の知見に基づきなされたもので、下記の（１）～（６）の骨質の評価方法、及び（７）の骨粗鬆症の罹患又はそのリスクを予測する方法を提供するものである。
（１）被験者から採取した生体試料中の、メチルグリオキサール－ハイドロイミダゾロン（ＭＧ－Ｈ１）化したＩ型コラーゲン又は該Ｉ型コラーゲンの断片を測定することを含むことを特徴とする、骨質の評価方法。
（２）測定方法が、モノクローナル抗ＭＧ－Ｈ１抗体及び抗Ｉ型コラーゲン抗体を使用するサンドイッチＥＬＩＳＡ法である、（１）に記載の方法。
（３）生体試料が血清又は血漿である、（２）に記載の骨質の評価方法。
（４）モノクローナル抗ＭＧ－Ｈ１抗体が、ＮＩＴＥＰ－１８９８（ＯＹＣ１１１）、ＮＩＴＥＰ－１８９９（ＯＹＣ１１２）又はＮＩＴＥＰ－２０６４（ＯＹＣ１１３）として寄託されたハイブリドーマが産生する抗体である、（２）又は（３）のいずれかに記載の骨質の評価方法。
（５）抗Ｉ型コラーゲン抗体が、ポリクロ―ナル抗体である、（２）～（４）のいずれかに記載の骨質の評価方法。
（６）被験者から採取した生体試料中の、ＭＧ－Ｈ１化したＩ型コラーゲン又は該Ｉ型コラーゲンの断片の量が、健常者から採取した生体試料中の、ＭＧ－Ｈ１化したＩ型コラーゲン又は該Ｉ型コラーゲンの断片の量と比較して、有意に高い場合に、前記被験者は骨質が低下していると評価する、（１）～（５）に記載の骨質の評価方法。
（７）（１）～（６）に記載の骨質の評価方法による評価に基づき、骨粗鬆症の罹患又はそのリスクを予測する方法。

本発明の骨質の評価方法によれば、骨質の評価を、人体等から採取した生体試料を用いて簡便に、且つ被験者の負担やダメージが極めて低い侵襲性の低い方法として行うことができる。また、本発明は、該評価方法の骨質の評価に基づき、骨粗鬆症の罹患又はそのリスクを予測することもできる。

モノクローナル抗ＭＧ－Ｈ１抗体及びポリクロ―ナル抗Ｉ型コラーゲン抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法による健常者及び骨粗鬆症患者の血清中のＭＧ－Ｈ１化したＩ型コラーゲン量のグラフである。

以下、本発明をその好ましい実施形態（態様）に基づいて説明する。
本発明の骨質の評価方法は、被験者から採取した生体試料中の、メチルグリオキサール－ハイドロイミダゾロン（以下、ＭＧ－Ｈ１とも言う。）化したＩ型コラーゲン又は該Ｉ型コラーゲンの断片を測定することを含む。ＭＧ－Ｈ１は、ＡＧＥｓの前駆体であるメチルグリオキサール（ＭＧ）が、タンパク質中のアルギニン残基側鎖と反応して生じ、生体中ではタンパク質と結合した非遊離体又はタンパク質と結合しない遊離体として存在する。本発明の骨質の評価方法における測定対象であるＭＧ－Ｈ１化したＩ型コラーゲン（以下、ＭＧ－Ｈ１化Ｉ型コラーゲンとも言う。）においては、ＭＧ－Ｈ１は非遊離体となっている。Ｉ型コラーゲンは、コラーゲンの１種である。コラーゲンは、骨の体積の約５０％を占めており、該コラーゲンを構成するポリペプチド鎖の組み合わせにより複数の型に分類されている。Ｉ型コラーゲンは、２本のα１鎖と１本のα２鎖とからなる。骨に含まれるコラーゲンの大部分は、Ｉ型コラーゲンであり、本発明では、ＭＧ－Ｈ１化Ｉ型コラーゲンを測定する。

「ＭＧ－Ｈ１化Ｉ型コラーゲン」は、Ｉ型コラーゲンのタンパク質中のアルギニンがＭＧと非酵素的に反応して、そのアルギニンがメチルグリオキサール－ハイドロイミダゾロン（ＭＧ－Ｈ１）となったＩ型コラーゲンを意味する。「Ｉ型コラーゲンの断片」とは、Ｉ型コラーゲンのペプチド鎖が切断され、断片化・低分子量化したものである。Ｉ型コラーゲンは、前述のように骨中に多く含まれているが、骨から漏れ出て血液等の骨外に存在するＩ型コラーゲンは、切断され断片となったＩ型コラーゲンである可能性がある。実際、骨代謝マーカーとして知られるＣＴｘ－Ｉ及びＮＴｘ－Ｉは骨を形成するＩ型コラーゲンのＣ末端及びＮ末端の小断片であり、骨代謝の過程で血中に漏れ出ることが知られている。そのため、本発明の骨質の評価方法においては、断片化されていないＩ型コラーゲン又はＩ型コラーゲンの断片を検出する。本発明においては、Ｉ型コラーゲンのみを測定してもよいし、Ｉ型コラーゲンの断片のみを測定してもよいし、Ｉ型コラーゲンとＩ型コラーゲンの断片との両者を区別し又は区別することなく測定してもよい。Ｉ型コラーゲンの断片は、例えば、Ｉ型コラーゲンが酵素等により分解されたものであってもよい。

骨質は、上述のように、Ｉ型コラーゲンの架橋構造と関連しており、ＡＧＥｓの過形成によりＩ型コラーゲンの悪玉架橋が形成されることが、骨質の低下と関連している。骨中に存在するＡＧＥｓの中では、ＭＧ－Ｈ１が最も多く存在することから、骨質が低下している場合、ＭＧ－Ｈ１を介して形成されたＩ型コラーゲンの悪玉架橋が多く存在していると考えられる。したがって、ＭＧ－Ｈ１化Ｉ型コラーゲンを骨質の評価の指標として用いることができると考えられる。

本発明の骨質の評価方法によれば、ＭＧ－Ｈ１化Ｉ型コラーゲンを骨質の評価の指標とすることで、骨質の評価を、人体等から分離された生体試料を用いて簡便に且つ侵襲性の低い方法として行うことができる。またそれにより、例えば、骨質の良否や骨質の低下の程度、骨質が大きく影響する骨強度等、骨質に関連する評価を簡便に且つ被験者にダメージや負担を与えることなく行うこともできる。また、本発明は、該評価方法の骨質の評価に基づき、骨粗鬆症の罹患又はそのリスクを予測することができる。

本発明の骨質の評価方法において、ＭＧ－Ｈ１化Ｉ型コラーゲン又はＭＧ－Ｈ１化Ｉ型コラーゲンの断片を測定する方法としては、ＭＧ－Ｈ１化Ｉ型コラーゲン又はＭＧ－Ｈ１化Ｉ型コラーゲンの断片を検出できる各種の方法を特に制限なく採用できる。検出は、定性的であってもよいし、定量的であってもよいが、定量的であることが好ましい。ＭＧ－Ｈ１化Ｉ型コラーゲン又はＭＧ－Ｈ１化Ｉ型コラーゲンの断片を検出する方法としては、例えば、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法)、放射免疫アッセイ法（ＲＩＡ）、発光免疫測定法、沈降法、凝集法、ウエスタンブロット分析、フローサイトメトリー等が挙げられる。これらの中でも、簡便且つハイスループットな検体測定を行う観点から、ＥＬＩＳＡ法が好ましく、サンドイッチＥＬＩＳＡ法がより好ましい。ＥＬＩＳＡ法において用いる二次抗体、標識等は、常法に従って適宜選択すればよい。

サンドイッチＥＬＩＳＡ法においては、モノクローナル抗ＭＧ－Ｈ１抗体及び抗Ｉ型コラーゲン抗体を使用して、ＭＧ－Ｈ１化Ｉ型コラーゲン又はＭＧ－Ｈ１化Ｉ型コラーゲンの断片を測定することが好ましい。そのサンドイッチＥＬＩＳＡ法は、好ましくは下記工程（１）～（３）を具備するとともに、サンドイッチＥＬＩＳＡ法において常法である下記工程（４）を具備する。モノクローナル抗ＭＧ－Ｈ１抗体は、いわゆる捕捉抗体であり、遊離又は非遊離のＭＧ－Ｈ１に特異的に結合する。抗Ｉ型コラーゲン抗体は、いわゆる検出抗体であり、捕捉抗体に補足されたＭＧ－Ｈ１化Ｉ型コラーゲンを検出する。
（１）モノクローナル抗ＭＧ－Ｈ１抗体を固相化する工程
（２）固相化されたモノクローナル抗ＭＧ－Ｈ１抗体に、抗原を結合させる工程
（３）モノクローナル抗ＭＧ－Ｈ１抗体に結合した抗原に、抗Ｉ型コラーゲン抗体を結合させる工程
（４）抗原に結合した抗Ｉ型コラーゲンを検出する工程

以下、上記の工程（１）～（４）について説明する。
〔工程（１）：捕捉抗体の固相化工程〕
前記工程（１）は、捕捉抗体であるモノクローナル抗ＭＧ－Ｈ１抗体の固相化工程であり、モノクローナル抗ＭＧ－Ｈ１抗体をマイクロプレートのウェル等に吸着させ固相化する。モノクローナル抗ＭＧ－Ｈ１抗体をマイクロプレートのウェル等に吸着させる手段としては、疎水的相互作用、共有結合、静電相互作用、水素結合、その他電荷移動等が挙げられる。

〔工程（２）：抗原を捕捉抗体に結合させる工程〕
前記工程（２）は、抗原を、捕捉抗体である固相化されたモノクローナル抗ＭＧ－Ｈ１抗体に結合させる工程である。前記工程（２）における抗原は、被験者から採取した生体試料に含まれる抗原である。

前記工程（２）において使用するモノクローナル抗ＭＧ－Ｈ１抗体は、タンパク質に結合している非遊離体のＭＧ－Ｈ１に対する結合能を有する抗体である。またモノクローナル抗ＭＧ－Ｈ１抗体は、タンパク質に結合していない遊離体のＭＧ－Ｈ１に対する結合能を有していてもよい。
タンパク質に結合していない遊離体のＭＧ－Ｈ１に対する結合能を有し、固相化されたモノクローナル抗ＭＧ－Ｈ１抗体に、遊離体のＭＧ－Ｈ１及びタンパク質に結合した非遊離のＭＧ－Ｈ１を有するＭＧ－Ｈ１化Ｉ型コラーゲン又はその断片が結合した場合であっても、後述する工程（３）において、抗Ｉ型コラーゲン抗体を用いて、モノクローナル抗ＭＧ－Ｈ１抗体に結合したＭＧ－Ｈ１化Ｉ型コラーゲン又はその断片のみが検出されることにより、モノクローナル抗ＭＧ－Ｈ１抗体を用いた高感度のＭＧ－Ｈ１化Ｉ型コラーゲン又はその断片の検出が可能となる。

前記工程（２）において使用するモノクローナル抗ＭＧ－Ｈ１抗体としては、下記のハイブリドーマが産生する抗体１～３が挙げられる。抗体１及び２を産生するハイブリドーマは、２０１４年７月１５日付け、抗体３を産生するハイブリドーマは、２０１５年６月５日付けで、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許生物寄託センターに寄託されており、それぞれの受託番号は下記の通りである。
抗体１を産生するハイブリドーマ（ＯＹＣ１１１）：受託番号ＮＩＴＥＰ－１８９８
抗体２を産生するハイブリドーマ（ＯＹＣ１１２）：受託番号ＮＩＴＥＰ－１８９９
抗体３を産生するハイブリドーマ（ＯＹＣ１１３）：受託番号ＮＩＴＥＰ－２０６４

〔工程（３）：検出抗体を抗原に結合させる工程〕
前記工程（３）は、検出抗体である抗Ｉ型コラーゲン抗体を抗原に結合させる工程である。より具体的には、前記工程（２）においてモノクローナル抗ＭＧ－Ｈ１抗体に結合した抗原に、抗Ｉ型コラーゲン抗体を結合させる。

前記工程（３）において使用する抗Ｉ型コラーゲン抗体は、断片化されていないＩ型コラーゲンのみならず、Ｉ型コラーゲンの断片に対する結合能を有する抗体であることが好ましい。また、前記工程（３）において使用する抗Ｉ型コラーゲン抗体は、モノクローナル抗体であってもよいし、ポリクロ―ナル抗体であってもよいが、ＭＧ－Ｈ１化Ｉ型コラーゲンの断片を検出できるようにする観点から、ポリクロ―ナル抗体であることが好ましい。

〔工程（４）：検出抗体を検出する工程〕
前記工程（４）は、検出抗体を検出する工程である。検出抗体である抗Ｉ型コラーゲン抗体を検出する方法としては、各種公知の方法を用いることができる。例えば、前記工程（３）において検出抗体として酵素標識済みの抗Ｉ型コラーゲン抗体を用い、前記工程（４）にて該抗Ｉ型コラーゲン抗体を直接検出してもよい。また、抗Ｉ型コラーゲン抗体と結合する二次抗体により該Ｉ型コラーゲン抗体を検出してもよい。

また、本発明において、生体試料としては、生体から採取されたあらゆる細胞、組織、及び体液等が挙げられ、例えば、皮膚、筋肉、骨、脂肪組織、脳神経系、心臓及び血管等の循環器系、肺、肝臓、脾臓、膵臓、腎臓、消化器系、胸腺、リンパ、血液、全血、血清、血漿、リンパ液、唾液、尿、腹水、喀痰等、並びにそれらの培養液物が挙げられるが、採取のし易さ等の理由から、血清又は血漿が好ましい。生体試料は、必要に応じて、生理食塩水や水等の液体による希釈、濾過処理、ホモジネート処理、化学処理等の任意の処理を行ったものを用いる。

本発明の骨質の評価方法においては、被験者から採取した生体試料中の、ＭＧ－Ｈ１化Ｉ型コラーゲン又はＭＧ－Ｈ１化Ｉ型コラーゲンの断片の量が、健常者から採取した生体試料等の標準試料中の、ＭＧ－Ｈ１化Ｉ型コラーゲン又はＭＧ－Ｈ１化Ｉ型コラーゲンの断片の量と比較して、有意に高い場合に、被験者は骨質が低下していると評価することが、被験者の骨質を簡便に評価する観点から好ましい。より具体的には、被験者及び健常者から採取した生体試料中のＭＧ－Ｈ１化Ｉ型コラーゲン又はＭＧ－Ｈ１化Ｉ型コラーゲンの断片の量を、例えば上述のサンドイッチＥＬＩＳＡ法によって測定する。そして、測定された測定値を比較し、被験者の生体試料から測定された測定値が、健常者の生体試料から測定された測定値よりも有意に高い場合に、被験者は骨質が低下していると評価する。健常者としては、骨質又は骨強度を示す指標が所定値以上の者や集団等、骨質の評価の目的等に応じて任意に適宜に設定することができる。また、被験者から採取した生体試料と比較する対象は、健常者から採取した生体試料に代えて、ＭＧ－Ｈ１化Ｉ型コラーゲンを既知の濃度で含有する標準試料であっても良い。ＭＧ－Ｈ１化Ｉ型コラーゲンを既知の濃度で含有する標準試料は、例えば、ＭＧをＩ型コラーゲンに反応させて得られた人工のＭＧ－Ｈ１化Ｉ型コラーゲン（断片に相当するものでも良い）であっても良い。

以下、本発明を実施例により更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら制限されるものではない。

１．ＭＧ－Ｈ１化Ｉ型コラーゲンスタンダードの作製
以下のようにして調製したＭＧ－Ｈ１化Ｉ型コラーゲンを、検量線を作成するためのスタンダードとして用いた。
〔ＭＧ－Ｈ１化Ｉ型コラーゲンの調製〕
２ｍｇ／ｍＬＣＯｌＩウシ真皮由来と２０ｍＭ又は２ｍＭに希釈したＭＧリン酸緩衝溶液を当量混合し、３７℃で１６時間インキュベートした。反応後の試料を透析バックに充填し、試料容量に対して３００倍量以上のＰＢＳを用いて４℃で６時間以上透析した後、外液を新鮮ＰＢＳに交換し、更に４℃で１６時間以上透析を継続した。透析後の試料を回収し、該試料をＭＧ－Ｈ１化Ｉ型コラーゲンスタンダードとした。ＭＧ－Ｈ１化Ｉ型コラーゲンスタンダードは、以下の〔タンパク質定量法〕によりタンパク質量を定量し、以下の〔ＳＤＳ－ＰＡＧＥ〕及び〔ウェスタンブロッティング〕により、ＭＧ－Ｈ１化Ｉ型コラーゲンスタンダード中にＭＧ－Ｈ１化Ｉ型コラーゲンが含まれることを確認した。ＭＧ－Ｈ１化Ｉ型コラーゲンスタンダードは、一２０℃にて保存した。

〔タンパク質定量法〕
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）をスタンダードとし、ビシコニン酸（ＢＣＡ）法キット（ＰＩＥＲＣＥ、サーモサイエンティフィック社）を用いて実施した。

〔ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動）〕
試料蛋白質（１ｕｇ相当）をＬａｅｍｍｌｉ法に従って還元条件下にてＳＤＳ－ＰＡＧＥした。分離された蛋白質はクーマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色法を用いて検出した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果、上記のように調製した試料は、未処理のコラーゲンと比較して、処理したＭＧの濃度依存的に、高分子量側へのバンドシフトが観察され、試料蛋白質中に、ＭＧ－Ｈ１化Ｉ型コラーゲンが存在することが確認された。

〔ウェスタンブロッティング〕
試料蛋白質（１ｕｇ相当）を還元条件下にてＳＤＳ－ＰＡＧＥした後、ＰＶＤＦ膜上に定電圧１５Ｖ、１時間にて転写した（セミドライブロッティング）。試料転写後のＰＶＤＦ膜を市販ブロッキング溶液を用いて室温、１時間ブロッキングした後、ＴＢＳ－Ｔによる室温５分間の洗浄を２回繰り返した。マウスモノクローナル抗ＭＧ－Ｈ１抗体を１０％（ｖ／ｖ）ブロッキング溶液を用いて５ｕｇ／ｍＬに希釈した後、洗浄後のＰＶＤＦ膜に加え、室温１時間インキュベートした。ＴＢＳ－Ｔによる室温５分間の洗浄を２回繰り返した後、免疫反応促進剤（ＣａｎＧｅｔＳｉｇｎａｌ溶液２）を用いて１万倍希釈したＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ１抗体を加え、室温１時間インキュベートした。ＴＢＳ－Ｔによる室温７分間の洗浄を３回繰り返した後、更にＴＢＳによる室温５分間の洗浄を２回繰り返した。ＰＶＤＦ膜上に化学発光検出試薬を加え、免疫反応性蛋白質を検出した。

２．骨質の評価方法
以下のサンドイッチＥＬＩＳＡ法により、健常女性及び骨粗鬆症患者女性から採取した生体試料中のＭＧ－Ｈ１化Ｉ型コラーゲン又はＭＧ－Ｈ１化Ｉ型コラーゲンの断片を測定した。生体試料は、ＰＲＯＭＥＤＤＸ社より購入したヒト血清検体を用いた。
〔サンドイッチＥＬＩＳＡ法〕
（１）固相化バッファーを用いて５ｕｇ／ｍＬに希釈したマウスモノクローナル抗ＭＧ－Ｈ１抗体を５０ｕＬ／ｗｅｌｌでマイクロタイタープレートに加え、室温で２時間インキュベートした。
（２）マイクロタイタープレート内の液を除去し、ＰＢＳ－Ｔを０．２ｍＬ／ｗｅｌｌ加え、そのまま液を除去する工程を３回実施した。
（３）１０％（ｖ／ｖ）ブロッキング溶液を０．２ｍＬ／ｗｅｌｌ加え、室温で１時間インキュベートした。
（４）上記（２）の操作を行った。
（５）２％（ｖ／ｖ）ブロッキング溶液を用いてＭＧ－Ｈ１化Ｉ型コラーゲンスタンダード、健常女性由来のヒト血清検体、又は骨粗鬆症患者女性由来のヒト血清検体を適度に希釈し、５０ｕＬ／ｗｅｌｌで上記マイクロタイタープレートに添加した後、４℃で一晩インキュベートした。健常女性由来のヒト血清検体、及び骨粗鬆症患者女性由来のヒト血清検体はそれぞれ、１０個のウェルに添加した。
（６）上記（２）の操作を行った。
（７）免疫反応促進剤（ＣａｎＧｅｔＳｉｇｎａｌ溶液１）を用いて０．５ｕｇ／ｍＬに希釈したウサギポリクローナル抗ヒトＣｏｌＩ抗体を５０ｕＬ／ｗｅｌｌで添加し、室温で２時間インキュベートした。
（８）上記（２）の操作を行った。
（９）免疫反応促進剤（ＣａｎＧｅｔＳｉｇｎａｌ溶液２）を用いて４，０００倍に希釈したＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧ抗体を５０ｕＬ／ｗｅｌｌで添加し、室温で１時間インキュベートした。
（１０）上記（２）の操作を行った。
（１１）ＴＭＢ試薬を５０ｕＬ／ｗｅｌｌ加え、室温で３０分間インキュベートした。
（１２）反応停止液を５０ｕＬ／ｗｅｌｌ加え、４５０ｎｍで吸光度を測定した。

３．試薬・備品
使用した試薬・備品は以下の通りである。
・コラーゲンＩ型（ＣｏｌＩ）ウシ真皮由来：ペプシン可溶化、５ｍＭ酢酸溶液、３ｍｇ／ｍＬ、ニッピ（株）
・２ｍｇ／ｍＬＣｏＩ１酢酸溶液：３ｍｇ／ｍＬＣｏｌ１ウシ真皮由来を５ｍＭ酢酸を用いて２ｍｇ／ｍＬに希釈した。
・メチルグリオキサール（ＭＧ）水溶液：４０％、シグマ（株）
・２０ｍＭ及び２ｍＭＭＧリン酸緩衝溶液：４０％（６．５Ｍ）ＭＧ水溶液を、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（Ｎａ－ＰＯ_４、ｐＨ７．５）を用いて目的濃度に希釈した。
・１０－２０％ポリアクリルアミドグラジエントゲル：スーパーセップ^ＴＭエース、和光純薬（株）
・６ＸＳＤＳ－ＰＡＧＥ試料緩衝液：還元剤含有、ナカライテスク（株）：終濃度１Ｘとなるよう蛋白質試料に加え使用した。
・ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜：ＩｍｍｏｂｉｌｏｎＰ、メルクミリポア社
・ブロッキング溶液：牛乳由来蛋白質、塩化ナトリウムを含むトリス緩衝塩類溶液（ＴＢＳ）、ｐＨ７．２、ナカライテスク（株）
・１０％（ｖ／ｖ）及び２％（ｖ／ｖ）ブロッキング溶液：上記ブロッキング溶液を１００％としてＴＢＳ又はＰＢＳを用いて目的濃度に希釈した。
・免疫反応促進剤：ＣａｎＧｅｔＳｉｇｎａｌ（登録商標）溶液１及び溶液２、東洋紡（株）
・化学発光検出基質試薬：ＬｕｍｉｎａｔａＦｏｒｔｅ（登録商標）、メルクミリポア社
・マウスモノクローナル抗ＭＧ－Ｈ１抗体：クローン＃ＯＹＣ１１３、オリエンタル酵母工業（株）
・西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗マウスＩｇＧ１ヤギポリクローナル抗体：サザンバイオテック社
・ウサギポリクローナル抗ヒトＣｏｌＩ抗体：アクリスアンチボディーズ社
・９６ウェルマイクロタイタープレート：Ｆ９６ＭＡＸＩＳＯＲＰ、ＮＵＮＣ、サーモサイエンティフィック社
・３，３’，５，５’テトラメチルベンジジンＴＭＢ基質試薬；ＢＤＯｐｔＥＩＡ^ＴＭ、ＢＤバイオサイエンス社
・リン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ）
・ＴＢＳ－Ｔ：０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ－２０含有ＴＢＳ
・ＰＢＳ－Ｔ：０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ－２０含有ＰＢＳ
・固相化バッファー：５０ｍＭ炭酸ナトリウムバッファー（Ｎａ_２ＣＯ_３），ｐＨ９．６
・反応停止液：１ＮＨ_２ＳＯ_４
・その他一般試薬についてはナカライテスク（株）又は和光純薬（株）より購入した。

４．結果
図１に、健常女性及び骨粗鬆症患者女性の血清中のＭＧ－Ｈ１化Ｉ型コラーゲン量（平均値）を示した。ＭＧ－Ｈ１化Ｉ型コラーゲンスタンダードの測定については、０．０４６μｇ／ｍＬ～０．２２５μｇ／ｍＬの検量範囲で良好な直線性が得られ、これを測定可能範囲として設定した。図１に示すように、健常女性と比べ、骨粗鬆症患者女性において、血清中におけるＭＧ－Ｈ１化Ｉ型コラーゲンのレベルが明らかに高値傾向であることが分かった。したがって、本発明の骨質の評価方法による評価に基づき、骨粗鬆症の罹患又はリスクを予測することができることが分かる。また、ＭＧ－Ｈ１化Ｉ型コラーゲンは、骨質の評価の指標として用いることができることから、図１に示す骨粗鬆症患者女性は、骨質が低下していると考えられる。

Claims

被験者から採取した血清中の、
メチルグリオキサール－ハイドロイミダゾロン（ＭＧ－Ｈ１）化したＩ型コラーゲン又は該Ｉ型コラーゲンの断片を測定することを含むことを特徴とする、骨質の評価方法。
測定方法が、モノクローナル抗ＭＧ－Ｈ１抗体及び抗Ｉ型コラーゲン抗体を使用するサンドイッチＥＬＩＳＡ法であり、
モノクローナル抗ＭＧ－Ｈ１抗体が、ＭＧ－Ｈ１化したＩ型コラーゲン又は該Ｉ型コラーゲンの断片に対するモノクローナル抗体であり、
抗Ｉ型コラーゲン抗体が、ヒトＩ型コラーゲンに対するポリクロ―ナル抗体である、請求項１に記載の骨質の評価方法。
モノクローナル抗ＭＧ－Ｈ１抗体が、ＮＩＴＥＰ－１８９８（ＯＹＣ１１１）、ＮＩＴＥＰ－１８９９（ＯＹＣ１１２）又はＮＩＴＥＰ－２０６４（ＯＹＣ１１３）として寄託されたハイブリドーマが産生する抗体である、請求項２に記載の骨質の評価方法。
被験者から採取した血清中の、ＭＧ－Ｈ１化したＩ型コラーゲン又は該Ｉ型コラーゲンの断片の量が、健常者から採取した血清中の、ＭＧ－Ｈ１化したＩ型コラーゲン又は該Ｉ型コラーゲンの断片の量と比較して、有意に高い場合に、前記被験者は骨質が低下していると評価する、請求項１～３の何れか１項に記載の骨質の評価方法。
請求項１～４の何れか１項に記載の骨質の評価方法により、骨粗鬆症の罹患又はそのリスクを予測するために用いられる、被験者の骨質の評価を得る、骨質の評価の取得方法。