JP2009085759A

JP2009085759A - 固形癌の検査方法

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Publication number: JP2009085759A
Application number: JP2007255497A
Authority: JP
Inventors: Hiroyuki Matsumoto; 浩幸松本
Original assignee: Hamamatsu Photonics KK
Current assignee: Hamamatsu Photonics KK
Priority date: 2007-09-28
Filing date: 2007-09-28
Publication date: 2009-04-23
Anticipated expiration: 2027-09-28
Also published as: JP4916409B2

Abstract

【課題】被験者の尿を使用して、被験者が固形癌に罹患しているか否かを簡易に判定すること。
【解決手段】本発明は、分子量５２ＫＤａのα１−アンチトリプシン（α１−ＡＴ^５２）が尿中に検出された場合に固形癌に罹患していると判定する、固形癌の検査方法を提供する。
【選択図】なし

Description

本発明は、固形癌の検査方法に関する。

癌疾患に関連するタンパク質は古くから研究されており、腫瘍マーカーと称される多くのタンパク質が見出されている。腫瘍マーカーとは、癌の進行に伴って増加する生体因子のことであり、癌の補助診断、治療効果判定、進行度の予測、予後の推定及び特異症状の原因究明等の指標に使用されている。

α１−アンチトリプシン（以下、α１−ＡＴ^５２）は、３９４個のアミノ酸からなる分子量５２ｋＤａの糖タンパク質であり、血液中に存在するトリプシンインヒビターとして発見された。現在では、α１−ＡＴ^５２は、炎症時に血液中で増加する急性相反応物質であることが明らかとなり、炎症及び感染症の患者では、血清中α１−ＡＴ^５２濃度が上昇することが知られている（非特許文献１）。

また、遺伝性α１−アンチトリプシン欠損症、肝不全及び低蛋白血症の患者では、血清中α１−ＡＴ^５２濃度が異常低値を示すことが知られており、α１−ＡＴ^５２の欠損と慢性閉塞性肺疾患及び慢性肝疾患との間には関連性があることが指摘されている（非特許文献１）。

さらに最近の研究では、α１−ＡＴ^５２が部位特異的に加水分解されて生じる分子量４１ｋＤａのタンパク質（以下、α１−ＡＴ^４１）が、急性骨髄性白血病患者の尿で検出され、尿中のα１−ＡＴ^４１の量は、白血病細胞の減少と相関していることが報告されている（非特許文献２〜４）。

貫和敏博、日本臨床、増刊号１１、２００４年、６２巻、ｐ．２６２−２６５Ｄｅｎｇｌｅｒら、Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｈｏｐｐｅｒ−Ｓｅｙｌｅｒ、１９９２年、３７３巻、ｐ．５８１−５８８Ｄｅｎｇｌｅｒら、Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｈｏｐｐｅｒ−Ｓｅｙｌｅｒ、１９９５年、３７６巻、ｐ．１６５−１７２Ｄｅｎｇｌｅｒら、ＣｌｉｎｉｃａｌＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ、１９９５年、１巻、ｐ．１９９−２０５Ｔｅｎｃｅｒら、Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、１９９４年、５４巻、ｐ．１９９−２０６

しかしながら、α１−ＡＴ^５２は、乳癌、結腸直腸癌、肺癌、神経芽細胞腫、生殖腺奇形腫、滑膜肉腫及び横紋筋肉腫の患者の尿中では検出されず（非特許文献４）、尿中では室温で分解されやすいことが報告されていたため（非特許文献５）、尿中のα１−ＡＴ^５２が臨床生化学的検査の指標とされることはなかった。

また、腫瘍マーカーの検査は、そのほとんどが被験者の血液を用いて行われるため、医師や看護師等による採血行為が必要となり、家庭では手軽に検査できないのが現状である。

さらに、臨床生化学的検査で使用されている腫瘍マーカーは、進行度Ｉ程度の初期段階の癌の検出効率が不十分であることが問題となっており、“癌の種類や臓器に対する特異性”よりも“癌自身に対する特異性”の強い腫瘍マーカー及び検査方法が強く求められている。

そこで本発明は、被験者の尿を使用して、被験者が固形癌に罹患しているか否かを簡易に判定することを目的とするものである。

本発明は、分子量５２ＫＤａのα１−アンチトリプシン（α１−ＡＴ^５２）が尿中に検出された場合に固形癌に罹患していると判定する、固形癌の検査方法を提供する。

本発明者らは、固形癌患者の尿に含まれるタンパク質について鋭意研究を重ねた結果、固形癌患者の尿には健常人の尿には含まれない分子量約５２ｋＤａのタンパク質が存在することを発見し、このタンパク質がα１−ＡＴ^５２であることを明らかにした。さらに、本発明者らは、被験者の尿中のα１−ＡＴ^５２の有無を調べれば、固形癌に罹患しているか否かを簡易に判定できることを見出した。

上記検査方法によれば、被験者の尿を使用するため、医師や看護師等による採血行為が不要となり、家庭においても手軽に固形癌の検査を行うことができる。これに伴い、臨床生化学的検査の費用や採血における安全性の面で、固形癌の検査を大きく改善できる。

上記検査方法は、被験者から採取された尿を凍結乾燥して凍結乾燥尿を得る凍結乾燥ステップと、凍結乾燥尿中に分子量５２ＫＤａのα１−アンチトリプシンが検出された場合に固形癌に罹患していると判定する判定ステップとを備える検査方法であることが好ましい。

被験者の尿中に含まれるα１−ＡＴ^５２は、採尿後一定の期間内であれば分解を受けることなく検出できるが、一定期間内に検査できない場合であっても、尿を凍結乾燥して凍結乾燥尿としておけば、α１−ＡＴ^５２の分解を防ぐことができ、正確な検査を実施できる。

上記検査方法は、被験者から採取された尿に有効量のプロテアーゼインヒビターを添加する添加ステップと、プロテアーゼインヒビターを添加された尿中に分子量５２ＫＤａのα１−アンチトリプシンが検出された場合に固形癌に罹患していると判定する判定ステップとを備える検査方法であることが好ましい。

被験者の尿を一定期間内に検査できない場合であっても、尿中にプロテアーゼインヒビターを添加しておけば、α１−ＡＴ^５２の分解を防ぐことができ、正確な検査を実施できる。

上記α１−ＡＴ^５２は、抗α１−アンチトリプシン抗体又はその機能的断片に結合する性質を利用して検出されることが好ましい。

抗α１−アンチトリプシン抗体又はその機能的断片を使用すれば、α１−ＡＴ^５２を特異的に検出することができるため、大型の分析機器を使用することなく、簡易に固形癌の検査を実行できる。抗α１−アンチトリプシン抗体又はその機能的断片と結合する性質を利用した検出法としては、例えば、ウェスタンブロッティング法又はＥＬＩＳＡ法が例示でき、抗α１−アンチトリプシン抗体を含むα１−ＡＴ^５２検出キットを作成すれば、α１−ＡＴ^５２の検出に必要な試薬等の持ち運びが便利になり、家庭内での検出も容易になる。

上記抗α１−アンチトリプシン抗体は、ハイブリドーマ１６Ｃ２（ＦＥＲＭＡＢＰ−１０９０９）が生産する抗体であることが好ましい。

ハイブリドーマ１６Ｃ２（ＦＥＲＭＡＢＰ−１０９０９）が生産する抗体は、ヒトの尿中のα１−ＡＴ^５２を特異的にかつ高親和性をもって認識するため、固形癌の検出感度を高め、より正確な検査を実現できる。

上記固形癌は、大腸癌、胃癌又は食道癌であることが好ましい。

大腸癌、胃癌及び食道癌を早期に発見するには、Ｘ線造影検査では不十分であり、内視鏡検査を行うことが必要であると考えられているが、上記検査方法によれば、これらの癌の初期段階の癌を検出できる。

さらに、本発明は、上記の検査方法を用いて固形癌の検査を行うための検査キットであって、ハイブリドーマ１６Ｃ２（ＦＥＲＭＡＢＰ−１０９０９）が生産する抗体を含む検査キットを提供する。

上記の検出キットを使用すれば、被験者の尿を使用して、簡易かつ簡便に固形癌の検査を行うことができる。

本発明によれば、被験者の尿を使用して固形癌の検査を簡易に行うことができ、Ｘ線造影検査では検出が困難であるといわれている初期の固形癌についても検出できる。さらに本発明によれば、被験者の尿中のα１−ＡＴ^５２の分解を防ぐことができ、採尿後一定期間経過した後の尿サンプルであっても固形癌の検査を実施できる。

以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。

本発明の固形癌の検査方法は、分子量５２ＫＤａのα１−アンチトリプシン（α１−ＡＴ^５２）が尿中に検出された場合に固形癌に罹患していると判定することを特徴としている。

α１−ＡＴ^５２は、分子量５２ｋＤａのセリンプロテアーゼインヒビターであり、当業者がタンパク質の定量又は同定に通常用いる方法によって、尿中から検出できる。タンパク質の定量又は同定法としては、例えば、ウェスタンブロッティング法、ＥＬＩＳＡ法、フローストリップ法及びラテックス凝集免疫法等の抗原抗体反応検出法、並びにアミノ酸配列決定法及び質量分析法を例示できる。但し、大型の機器を使用することなく簡易に固形癌の検査を実施するためには、尿中のα１−ＡＴ^５２が、抗α１−アンチトリプシン抗体又はその機能的断片に結合する性質を利用して検出されることが好ましい。

抗α１−アンチトリプシン抗体は、精製したα１−ＡＴ^５２やα１−ＡＴ^５２に特異的な領域の部分配列ペプチドをマウスやウサギなどの小動物に免疫して抗血清を採取したり、抗α１−ＡＴ^５２抗体を産生するハイブリドーマを作製したりすることによって取得できる。また、市販品の抗α１−ＡＴ^５２抗体であっても、必要とする特異性及び力価を有することが確認できればウェスタンブロッティング法で使用できる。

尿中のα１−ＡＴ^５２の検出に用いる抗体としては、尿中のα１−ＡＴ^５２を認識するものであればポリクローナル抗体、モノクローナル抗体又はその機能的断片のいずれもが利用できるが、特異性の観点からはモノクローナル抗体であることが好ましい。

ヒトの尿中のα１−ＡＴ^５２を特異的にかつ高親和性をもって認識するモノクローナル抗体としては、国際寄託されたハイブリドーマ１６Ｃ２（原受託についての受領日：２００７年９月１１日；受領番号：ＦＥＲＭＡＢＰ−１０９０９）が生産するモノクローナル抗体が特に好ましい。ハイブリドーマ１６Ｃ２は、国際寄託当局である独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（郵便番号３０５−８５６６））に寄託されており、入手可能である。

検査に供される尿は、採尿後５時間以内であれば、そのまま固形癌の検査に使用できるが、採尿後５時間以降に固形癌の検査を実施する場合は、尿を凍結保存したり、凍結乾燥したり、あるいは尿にプロテアーゼインヒビターを添加しておくことが好ましい。なお、採尿後の尿は、冷蔵又は氷冷しておくことが好ましい。

尿に添加するプロテアーゼインヒビターとしては、例えば、アンチトロンビンＩＩＩ（ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｉｎＩＩＩ）、アプロチニン（ａｐｒｏｔｉｎｉｎ）、ロイペプチン（ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ）、ペプスタチン（ｐｅｐｓｔａｔｉｎ）、ＰＭＳＦ（ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌｆｌｕｏｒｉｄｅ）が例示でき、これらを単独で又は複数組み合わせて使用できる。

上記の検査方法では、白血病のような血液の癌を除く固形癌であれば被験者の尿を調べることによって検出できるが、肺癌、食道癌、乳癌、胃癌、肝臓癌、胆嚢・胆管癌、膵臓癌、大腸・直腸癌、膀胱癌、前立腺癌及び子宮癌の検出に適しており、大腸癌、胃癌及び食道癌の検出に特に適している。

次に、本発明の第一実施形態に係る固形癌の検査方法について説明する。

第一実施形態に係る固形癌の検査方法は、被験者から採取された尿を凍結乾燥して凍結乾燥尿を得る凍結乾燥ステップと、凍結乾燥尿中に分子量５２ＫＤａのα１−アンチトリプシンが検出された場合に固形癌に罹患していると判定する判定ステップとを備えることを特徴としている。

凍結乾燥ステップでは、固形癌の検査の精度を上げるために、被験者から採取された尿をすぐに冷蔵又は氷冷し、採尿後５時間以内に凍結乾燥することが好ましいが、採尿後５時間以内に尿を−２０℃以下、好ましくは−８５℃の冷凍庫で凍結保存しておけば、凍結尿の凍結乾燥はその後いつ行っても同じ精度で検査できる。その際、被験者から採取された尿は、凍結乾燥又は凍結保存する前に、例えば、３，０００×ｇ、４℃で１０分間、遠心分離を行うことによって、沈殿物を除去しておく方がより好ましい。

得られた凍結乾燥尿は、例えば、密封容器に入れて冷蔵庫又は冷凍庫に入れておけば、以下で説明する判定ステップにおいて使用するまで保存でき、固形癌の検査用検体として長期にわたって使用できる。

判定ステップでは、凍結乾燥尿を蒸留水又は緩衝液で溶解し、上述したウェスタンブロッティング法、ＥＬＩＳＡ法、フローストリップ法、ラテックス凝集免疫法、アミノ酸配列決定法又は質量分析法などの方法によって尿中のα１−ＡＴ^５２を検出し、α１−ＡＴ^５２が検出された場合に固形癌に罹患していると判定すればよい。但し、判定ステップで使用する緩衝液は、塩を含まない水溶液であることが好ましく、蒸留水又は塩を含まない緩衝液で凍結乾燥尿を溶解することにより、凍結乾燥尿に含まれる塩の影響を最小限に食い止め、固形癌の検査に及ぼす悪影響を排除できる。

次に、本発明の第二実施形態に係る固形癌の検査方法について説明する。

第二実施形態に係る固形癌の検査方法は、被験者から採取された尿に有効量のプロテアーゼインヒビターを添加する添加ステップと、プロテアーゼインヒビターを添加された尿中に分子量５２ＫＤａのα１−アンチトリプシンが検出された場合に固形癌に罹患していると判定する判定ステップとを備えることを特徴としている。

添加ステップでは、被験者から採取された尿に有効量のプロテアーゼインヒビターを添加するが、プロテアーゼインヒビターの添加は、採尿後５時間以内に添加することが好ましい。プロテアーゼインヒビターを添加した尿サンプルは、判定ステップにおいてそのまま固形癌の検査用検体として使用できるが、すぐに検査を行わない場合は、この尿サンプルを−２０℃以下、好ましくは−８５℃の冷凍庫で長期間凍結保存できる。

判定ステップは、プロテアーゼインヒビターを添加した尿サンプルをそのまま使用し、上述したウェスタンブロッティング法、ＥＬＩＳＡ法、フローストリップ法、ラテックス凝集免疫法、アミノ酸配列決定法又は質量分析法などの方法によって尿サンプル中のα１−ＡＴ^５２を検出し、α１−ＡＴ^５２が検出された場合に固形癌に罹患していると判定すればよい。

また、本発明の検査キットは、上記の検査方法を用いて固形癌の検査を行うための検査キットであって、ハイブリドーマ１６Ｃ２（ＦＥＲＭＡＢＰ−１０９０９）が生産する抗体を含むことを特徴としている。

上記の検査キットとしては、例えば、ハイブリドーマ１６Ｃ２（ＦＥＲＭＡＢＰ−１０９０９）が生産する抗体（一次抗体）が予め固相された９６穴マイクロプレートと、当該抗体と異なるエピトープを認識するとともに、予め酵素又は蛍光色素が標識された抗α１−ＡＴ^５２抗体（二次抗体）と、凍結乾燥尿を溶解するための蒸留水と、９６穴マイクロプレートを洗浄するための洗浄バッファーとを含む、ＥＬＩＳＡキットが挙げられる。この検査キットは、必要に応じて、二次抗体に標識した酵素の基質と、α１−ＡＴ^５２の標品を標準品（スタンダード）として含んでいてもよい。

また、その他の検査キットとしては、例えば、抗原（α１−ＡＴ^５２）が予め固相化された９６穴マイクロプレートと、ハイブリドーマ１６Ｃ２（ＦＥＲＭＡＢＰ−１０９０９）が産生する抗体（一次抗体）と、酵素又は蛍光色素が標識された抗マウスIｇＧ抗体（二次抗体）と、凍結乾燥尿を溶解するための蒸留水と、９６穴マイクロプレートを洗浄するための洗浄バッファーとを含む、ＥＬＩＳＡキットが挙げられる。この検査キットは、競合ＥＬＩＳＡ法などに従って好適に使用される。また、この検査キットは、必要に応じて、標識した酵素の基質と、α１−ＡＴ^５２の標品を標準品（スタンダード）として含んでいてもよい。

上記二次抗体に標識する蛍光色素としては、ＴＥＸＡＳＲＥＤ、ＲＩＴＣ（ローダミン）、ＦＩＴＣ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）、ＰＥ（フィコエリスリン）、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５を例示できる。

上記二次抗体に標識する酵素としては、Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＨＲＰ）及びＡｌｋａｌｉｎｅｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅを例示できる。Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＨＲＰ）の基質としては、例えば、３，３’−Ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＤＡＢ）やｏ−Ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＯＰＤ）が挙げられ、Ａｌｋａｌｉｎｅｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅの基質としては、例えば、Ｂｒｏｍｏｃｈｏｒｏｉｎｄｏｌｅｐｈｏｓｐｈａｔｅ／ｎｉｔｒｏｂｌｕｅｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍやｐ−Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｅｄｉｓｏｄｉｕｍｓａｌｔｈｅｘａｈｙｄｒａｔｅ（ＮＰＰ）が挙げられる。

以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

１）抗ヒトα１−ＡＴ^５２抗体を産生するハイブリドーマの作製及び抗ヒトα１−ＡＴ^５２抗体の調製
まず、血漿由来のヒトα１−ＡＴ^５２の標品タンパク質（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ社製）をＤ−ＰＢＳ（−）に溶解した抗原液（６０μｇ／０．３ｍＬ）にフロイント完全アジュバント（ＦＣＡ；ＤＩＦＣＯ社）を１：１（ｖ／ｖ）の割合で加え、２本のガラス製注射器を用いて十分に乳濁化し、抗原とアジュバントを含む乳濁液を調製した。

その後、この乳濁液を皮下及び皮内に７日毎に４回注射することによって、Ｂａｌｂ／ｃマウスを免疫した。４回目の免疫を行った後には、尾静脈より採血して抗体力価を測定し、抗体力価の上昇が確認されたＢａｌｂ／ｃマウスの脾臓細胞を分離した。

分離した脾臓細胞は、常法に従って培養マウス骨髄細胞Ｘ−６３Ａｇｅ８と細胞融合させ、一定期間の培養後にヒトα１−ＡＴ^５２に対する抗体を産生するクローンをスクリーニングした。

その結果、ヒトα１−ＡＴ^５２に対する抗体を産生する８種類のクローンを得ることができた。８種類のクローンのうち、ヒトα１−ＡＴ^５２に対して最も親和性の高い抗体を産生したハイブリドーマ１６Ｃ２については、大量培養を行い、培養上清からプロティンＡカラム（ファルマシアバイオテク社製）を用いて抗ヒトα１−ＡＴ^５２抗体を精製した。こうして得られた抗ヒトα１−ＡＴ^５２抗体は、０．０５％のＮａＮ_３を防腐剤として加えて４℃に保存し、以下の実験に用いた。

尚、抗ヒトα１−ＡＴ^５２抗体の調製に用いたハイブリドーマ１６Ｃ２（原受託についての受領日：２００７年９月１１日；受領番号：ＦＥＲＭＡＢＰ−１０９０９）は、国際寄託当局である独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（郵便番号３０５−８５６６））に寄託した。

２）抗ヒトα１−ＡＴ^５２抗体の反応性の確認
まず、１）で抗ヒトα１−ＡＴ^５２抗体の抗原タンパク質として用いたヒトα１−ＡＴ^５２の標品タンパク質（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ社製）の分子量を、ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で確認した。

具体的には、ヒトα１−ＡＴ^５２の標品タンパク質をトリスＳＤＳβ−ＭＥサンプル処理液（第一化学薬品社製）に溶解し、１００℃で５分間煮沸して変性させ、４−２０％ポリアクリルアミドグラジエントゲル（テフコ社製）で電気泳動を行い、泳動後のゲルをＣＢＢ（クーマシ―・ブリリアント・ブルー・Ｒ２５０；第一化学薬品社製）で染色し、分子量マーカー（第一化学薬品社製）の位置と比較した。

図１は、ＣＢＢで染色されたα１−ＡＴ^５２の標品タンパク質のバンドの位置を示した図である。

その結果、抗ヒトα１−ＡＴ^５２抗体の抗原タンパク質として用いたヒトα１−ＡＴ^５２の標品タンパク質の分子量は５２ｋＤａであり、分解等を受けていないインタクトなタンパク質であったことが確認された。

そこで、５２ｋＤａのヒトα１−ＡＴ^５２の標品タンパク質が抗ヒトα１−ＡＴ^５２抗体によって特異的に認識されるか否かについても、ウェスタンブロッッティング法で確認した。

まず、ヒトα１−ＡＴ^５２の標品タンパク質を上記と同じ方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、電気泳動後のゲルを０．３７５％ＳＤＳ含有４８ｍＭＴｒｉｓ―３９ｍＭグリシン緩衝液で平衡化し、同緩衝液で親水化処理したＰＶＤＦ膜（バイオラッド社製）に対して電気的に転写した。ＰＶＤＦ膜への転写は、１５Ｖの定電圧下、ＰＶＤＦ膜の１ｃｍ^２当たり５．５ｍＡとなるようにして、２時間通電して行った。

転写後のＰＶＤＦ膜は、３％スキムミルク（ブロックエース；大日本住友製薬社製）含有Ｄ−ＰＢＳ（−）に１時間振盪してブロッキングを行い、引き続き、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有Ｄ−ＰＢＳ（−）に浸漬して５分間振盪する操作を５回繰り返して洗浄した。その後、３％スキムミルク含有Ｄ−ＰＢＳ（−）に抗ヒトα１−ＡＴ^５２抗体を２．５μｇ／ｍＬ濃度となるよう添加し、そこに洗浄後のＰＶＤＦ膜を浸漬し、４℃で２４時間反応させた。反応後、ＰＶＤＦ膜は０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有Ｄ−ＰＢＳ（−）に浸漬して５分間振盪する操作を５回繰り返して洗浄した。

その後、ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ヤギＩｇＧＦａｂ’（免疫生物研究所社製）を二次抗体として３％スキムミルク含有Ｄ−ＰＢＳ（−）に０．５μｇ／ｍＬ濃度となるよう添加し、そこに洗浄後のＰＶＤＦ膜を浸漬して２時間振盪して反応させた。反応後、ＰＶＤＦ膜は０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有Ｄ−ＰＢＳ（−）に浸漬して５分間振盪する操作を５回繰り返して洗浄し、洗浄後のＰＶＤＦ膜をＰＯＤイムノステインセット（和光純薬工業社製）で染色した。

図２は、抗ヒトα１−ＡＴ^５２抗体で検出されたヒトα１−ＡＴ^５２の標品タンパク質のバンドの位置を示した図である。

その結果、抗ヒトα１−ＡＴ^５２抗体で検出されるバンドは、５２ｋＤａのバンドのみであり、抗ヒトα１−ＡＴ^５２抗体はインタクトなヒトα１−ＡＴ^５２の標品タンパク質のみを認識することが確認された。

次に、抗ヒトα１−ＡＴ^５２抗体がヒトの血漿中に存在するα１−ＡＴ^５２を特異的に認識するか否かについて、ウェスタンブロッッティング法で調べた。

まず、健常人の肘正中静脈よりヘパリン含有下で採血した血液（１０ｍＬ）を１，６００×ｇ、４℃で１０分間、遠心分離を行い、血漿を得た。得られた血漿にはトリスＳＤＳβ−ＭＥサンプル処理液（第一化学薬品社製）を加え、１００℃で５分間煮沸して変性させ、上記と同じ方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ＣＢＢ染色及抗ヒトα１−ＡＴ^５２抗体を用いたウェスタンブロッッティング法による解析を行った。

図３は、健常人の血漿中に存在するタンパク質をＣＢＢで染色した図（図３Ａ）と、抗ヒトα１−ＡＴ^５２抗体を用いたウェウタンブロッティング法で、健常人の血漿中に存在するヒトα１−ＡＴ^５２を検出した図（図３Ｂ）である。

その結果、健常人の血漿中には、５０ｋＤａ付近に多くのタンパク質の存在が認められるが、抗ヒトα１−ＡＴ^５２抗体で認識されるバンドは、５２ｋＤａのバンドのみであり、１）で調製した抗ヒトα１−ＡＴ^５２抗体は、ヒト血液中に存在するα１−ＡＴ^５２と特異的に反応する抗体であることが証明された。

（実施例１）抗ヒトα１−ＡＴ^５２抗体を用いた固形癌の検査
固形癌患者の尿には健常人の尿に含まれない分子量５２ｋＤａのタンパク質が存在することが予備実験で明らかとなっていたため、このタンパク質がα１−ＡＴ^５２であるかどうかについて、抗ヒトα１−ＡＴ^５２抗体を用いたウェスタンブロッティング法で調べた。

表１は、尿を採取した５人の癌患者の年齢、性別、癌の種類及び癌の進行度を示した表である。表中の癌の進行度のＩ〜ＩＶは、食道癌については日本食道学会の「食道癌取扱い規約」のステージ分類であり、胃癌については日本胃癌学会の「胃癌取扱い規約」のステージ分類であり、大腸癌については大腸癌研究会の「大腸癌取扱い規約」のステージ分類であり、数字が大きいほど癌が進行し、Ｉ及びＩａは初期段階の癌であることを意味している。

まず、表１に示した５人の癌患者と１４人の健常人から尿を採取し、採尿後直ちに、３，０００×ｇ、４℃で１０分間、遠心分離を行い、その上清を４００μＬずつ小分けして、−８５℃の冷凍庫で保存した。その後、凍結したそれぞれの尿サンプルを凍結乾燥し、４μＬの蒸留水（ｕｌｔｒａＰＵＲＥ；インビトロジェン社製）に溶解し、そこにトリスＳＤＳβ−ＭＥサンプル処理液（第一化学薬品社製）を加え、１００℃で５分間煮沸して変性させ、上記と同じ方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行うと共に、ウェスタンブロッティング法で解析した。

図４は、抗ヒトα１−ＡＴ^５２抗体を用いたウェウタンブロッティング法で、癌患者の尿中に存在するα１−ＡＴ^５２を解析した図である。

図５は、抗ヒトα１−ＡＴ^５２抗体を用いたウェウタンブロッティング法で、健常人の尿中に存在するα１−ＡＴ^５２を解析した図である。

その結果、５人の癌患者から採取した尿サンプルの全てにおいて、５２ｋＤａの位置にα１−ＡＴ^５２のバンドが検出された。一方、１４人の健常人から採取した尿サンプルにおいては、いずれの尿サンプルにおいても、抗ヒトα１−ＡＴ^５２抗体と結合するタンパク質は検出されなかった。

興味深いことに、α１−ＡＴ^５２のバンドが検出された２人の胃癌患者と大腸癌患者はいずれも進行度Ｉの初期段階の癌であり、α１−ＡＴ^５２のバンドが尿から検出されるか否かによって、進行度Ｉの初期段階の癌患者と健常人とを明確に区別できることが判明した。

（実施例２）ヒトα１−ＡＴ^５２の検出に及ぼす尿サンプルの調製及び保存条件の影響
子宮癌患者（５０歳代女性、肺転移有り）より採取した尿サンプルを、以下の３種類の条件で調製及び保存し、尿中のα１−ＡＴ^５２の検出に及ぼす影響について調べた。
・条件１：尿を採取後直ちに氷冷し、３，０００×ｇ、４℃で１０分間、遠心分離を行い、その上清を回収した。回収した上清は、その後直ちに−８５℃の冷凍庫で保存した。
・条件２：尿を採取後直ちに室温（２８℃）で６時間放置し、３，０００×ｇ、４℃で１０分間、遠心分離を行い、その上清を回収した。回収した上清は、その後直ちに−８５℃の冷凍庫で保存した。
・条件３：尿を採取後直ちにプロテアーゼ阻害剤であるコンプリート（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ；ロシュ・ダイアグノスティックス社製）及びペプスタチン（Ｐｅｐｓｔａｔｉｎ；ロシュ・ダイアグノスティックス社製）を添加した。コンプリートは、１錠/２ｍＬ（水溶解）のストック溶液を調製し、その１６μＬを４００μＬの尿サンプルに添加し、ペプスタチンは、１ｍｇ／ｍＬ（ＭｅＯＨ溶解）のストック溶液を調製し、さらにＭｅＯＨで１０倍に希釈し、その２．８μＬを４００μＬの尿サンプルに添加した。プロテアーゼ阻害剤の添加後、尿サンプルを室温で６時間放置し、３，０００×ｇ、４℃で１０分間、遠心分離を行い、その上清を回収した。回収した上清は、その後直ちに−８５℃の冷凍庫に保存した。

条件１〜３のそれぞれの条件で調製・保存した上清は、解凍後、それぞれ４００μＬずつマイクロチューブに分取し、直ちに液体窒素に浸漬することにより再凍結し、凍結乾燥を行った。凍結乾燥後、それぞれのマイクロチューブに４μＬの蒸留水（ｕｌｔｒａＰＵＲＥ；インビトロジェン社製）を加えて溶解し、そこにトリスＳＤＳβ−ＭＥサンプル処理液（第一化学薬品社製）を加え、１００℃で５分間煮沸して変性させ、上記と同じ方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、抗ヒトα１−ＡＴ^５２抗体を用いたウェスタンブロッッティング法による解析を行った。

図６は、条件１〜３の条件で調製・保存した尿サンプル中に存在するα１−ＡＴ^５２を、抗ヒトα１−ＡＴ^５２抗体を用いたウェスタンブロッティング法で解析した図である。

その結果、条件１で調製・保存した尿サンプルにおいては、５２ｋＤａのインタクトなヒトα１−ＡＴ^５２のバンドが特異的に検出された（図６、レーン１）。

一方、条件２で調製・保存した尿サンプルにおいては、抗ヒトα１−ＡＴ^５２抗体によって複数のバンドが検出されるものの、５２ｋＤａのインタクトなヒトα１−ＡＴ^５２のバンドは検出されなかった（図６、レーン２）。すなわち、尿中のヒトα１−ＡＴ^５２が分解されたことを意味している。

しかしながら、尿サンプルにプロテアーゼ阻害剤を添加して尿サンプルを調製・保存した条件３では、条件１と同様に５２ｋＤａのインタクトなヒトα１−ＡＴ^５２のバンドが特異的に検出された（図６、レーン３）。このことは、尿中のヒトα１−ＡＴ^５２の分解は、主に尿中のプロテアーゼによって引き起こされていることを示唆している。

以上の結果より、これまで尿中のα１−ＡＴ^５２は非常に分解されやすいことが報告されていたが（Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、１９９４年、５４巻、ｐ．１９９−２０６；Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、１９９６年、５６巻、ｐ．６９１−７００）、尿サンプルを凍結保存するか、プロテアーゼ阻害剤を添加して調製・保存することにより、尿中のα１−ＡＴ^５２の分解を抑制することができ、固形癌に伴って尿中に排泄されたα１−ＡＴ^５２をインタクトな状態で特異的に検出できることが明らかとなった。但し、コンプリート及びペプスタチンのストック溶液は、−２０℃以下で凍結保存することが必要であり、一連の操作はコストがかかる上、操作が煩雑であるという問題点があるため、尿サンプルを採取後直ちに氷冷し、−８５℃で保存する条件１が、固形癌の検査には最も適していると思われた。

ＣＢＢで染色されたα１−ＡＴ^５２の標品タンパク質のバンドの位置を示した図である。抗ヒトα１−ＡＴ^５２抗体で検出されたヒトα１−ＡＴ^５２の標品タンパク質のバンドの位置を示した図である。健常人の血漿中に存在するタンパク質をＣＢＢで染色した図（図３Ａ）と、抗ヒトα１−ＡＴ^５２抗体を用いたウェウタンブロッティング法で、健常人の血漿中に存在するヒトα１−ＡＴ^５２を検出した図（図３Ｂ）である。抗ヒトα１−ＡＴ^５２抗体を用いたウェウタンブロッティング法で、癌患者の尿中に存在するα１−ＡＴ^５２を解析した図である。抗ヒトα１−ＡＴ^５２抗体を用いたウェウタンブロッティング法で、健常人の尿中に存在するα１−ＡＴ^５２を解析した図である。条件１〜３の条件で調製し保存した尿サンプル中に存在するα１−ＡＴ^５２を、抗ヒトα１−ＡＴ^５２抗体を用いたウェスタンブロッティング法で解析した図である。

Claims

分子量５２ＫＤａのα１−アンチトリプシンが尿中に検出された場合に固形癌に罹患していると判定する、固形癌の検査方法。
被験者から採取された尿を凍結乾燥して凍結乾燥尿を得る凍結乾燥ステップと、
前記凍結乾燥尿中に分子量５２ＫＤａのα１−アンチトリプシンが検出された場合に固形癌に罹患していると判定する判定ステップと、
を備える、請求項１記載の検査方法。
被験者から採取された尿に有効量のプロテアーゼインヒビターを添加する添加ステップと、
プロテアーゼインヒビターを添加した前記尿中に分子量５２ＫＤａのα１−アンチトリプシンが検出された場合に固形癌に罹患していると判定する判定ステップと、
を備える、請求項１記載の検査方法。
前記α１−アンチトリプシンは、抗α１−アンチトリプシン抗体又はその機能的断片に結合する性質を利用して検出される、請求項１〜３のいずれか一項記載の検査方法。
前記抗α１−アンチトリプシン抗体は、ハイブリドーマ１６Ｃ２（ＦＥＲＭＡＢＰ−１０９０９）が生産する抗体である、請求項４記載の検査方法。
前記固形癌は、大腸癌、胃癌又は食道癌である、請求項１〜５のいずれか一項記載の検査方法。
請求項１〜６記載の検査方法を用いて固形癌の検査を行うための検査キットであって、ハイブリドーマ１６Ｃ２（ＦＥＲＭＡＢＰ−１０９０９）が生産する抗体を含む、検査キット。