JPH03127800A

JPH03127800A - 腫瘍壊死因子活性抑制物質

Info

Publication number: JPH03127800A
Application number: JP1264887A
Authority: JP
Inventors: Jun Suzuki; 純鈴木; Kenji Yone; 米　賢二; Yataro Ichikawa; 市川　弥太郎
Original assignee: Teijin Ltd
Current assignee: Teijin Ltd
Priority date: 1989-10-13
Filing date: 1989-10-13
Publication date: 1991-05-30

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〈産業−Ｅの技術分野〉本発明は腫瘍壊死因子の活性を抑制しうる尿中物、質に
関する。更に詳しく説明すると、膜性増殖型糸球体腎炎
患者尿中に含まれる腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）のＬ９２９
細胞に対する殺細胞効果を抑制しうる物質に関する。

〈発明の背景〉腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）はＣＤ　−Ｉ　　５ｗ１ｓｓマ
ウスにＢａｃｉ　ｆｌｕｓ　Ｃａ１ｎ’ｅｔｔｅ−Ｇｕ
ｅｒｉｎ　（Ｂ　ＣＧ　）菌を投与し、その２週間後に
細菌内毒素（エンドトキシン）を投与した際に血中に現
われる生理活性物質として発見され、１９７５年にＣａ
ｒｓｗｅｌｌらが報告［Ｅ。

＾、　Ｃａｒｓｗｅｌｌら、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａ
ｃａｄ、Ｓｃｉ、、ＵＳＡ、７２゜３６６６（１９７５
）］　した生理活性蛋白質で、そのアミノ酸配列は１９
８５年にＡｇｇａｒｗａｌら［Ｂ、Ｂ、Ａ（１ｇａｒＷ
ａ＋ら。

Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｎ＋、２６０，２３４５（１９８
５）］により明らかにされている。

またＰｅｎｎ１ｃａ　ｅｔ　ａｌ　、　５ｈｉｒａｉ　
ｅｔ　ａｌおよびＨａｎｇｅｔ　ａｌによって、ヒトＴ
ＮＦのアミノ酸配列および遺伝子配列が明らかにされた
。

［Ｐｅｎｎ１ｃａ　ｅｔ　ａｌ　Ｎａｔｕｒｅ　３１２
．７２４（１９８５）、５ｈｉｒａｉｅｔ　ａｔ　Ｎａ
ｔｕｒｅ　３１３　８０３（１９８５）　、　Ｗａｎｇ
ｅｔ　ａｌＳｉｅｎｃｅ　　２８８　１４９（１９８５
）］　、当初その抗腫瘍活性から、癌治療薬とての開発
か進められている′Ｉ”　ＮＦは、最近種々の生理活性
か明らかにされ、生体内での諸機能が解明されつつある
。

例えば、細菌感染によるエンド１〜キシンシヨツクの生
体内のメゾイエイタ−としての活性［８゜Ｂｅ１Ｊｔｌ
Ｏｒら５ｃｉｅｎｃｅ　　２２９，８６９（１９８５）
］　、血管内皮細胞への炎症反応の惹起［Ｊ、Ｒ，Ｇａ
＋ａｂｌｅら、Ｒｖｏｃ　。

Ｎａｔｌ、八ｃａｄ、Ｓｃｉ、　　ＵＳ八、　　８２．
８６６７（１９８５）　　］　　、　　発熱作用［Ｃ，
＾、ＤｉｎａｒｅｌｌｏらＪ、Ｅｘｐ、Ｈｅｄ、１６３
，１４４３．　（１９８６）］、炎症の起因物質のひと
つであるインターリウｑ　ン１　　［ＰＰ、Ｎａｗｒｏ
ｔｈら　Ｊ、Ｅｘｐ、Ｈｅｄ、、　　１Ｇ３，１３６３
゜（１９８６）］やプＯスタダランジン類［Ｐ、Ｒ，Ｂ
ａｃｋｗｉｃｈら、　Ｂｉｏｃｈｅｎ＋、Ｂｉｏｐｈｙ
ｓ、Ｒａｓ、ＣｏＩｎ■、　１３６．９４（１９８６）
］の産生誘導などが挙げられる。又、肝患者への関与［
木本ら、第２５凹肝臓学会（１９８９）　］や、腎腎不
全症への関与［実験医学、　２　、１１［１９８９）］
　、川崎病の病態との関連［Ｆｕｒｕｋａｗａ、Ｓ、ら
Ｃｌ１ｎ。

ｌ１ｕｎｏ１．　Ｉｍ＋ｎｕｒｏ　ｐｏｔｂｏｌ、４８
．２４７（１９８ｇ）］を示唆する報告も行なわれてい
る。

このような多くの研究結果か明らかになるにつれ、Ｔ”
　Ｎ　Ｆは、種々の生理作用を促す生体内の情報伝達物
質と１−で、ホルモン様の作用を有すると考えられる。

その結果本発明者らは′Ｉ″ＮＦの生体内における異常
亢進、減少などの量的変化は、多くの疾患の病態と関連
する可能性が示唆され、血液などの体液中の’ＦＮＦの
存在およびその量を測定することは、多くの疾患のモニ
ターリングに有益であると推察するに至った。

一方本発明者らの研究によれは、成る種の病気の患者の
体液中には、’ＦＮＦ’が含まれており、そのＴ’　Ｎ
　Ｆの含有量とその患者の病態の進行には深い関係かあ
ること、従って体液中のＴ”　Ｎ　Ｆの含有量を正確に
検出しその量的変化を測定することにより病態の変化、
特に悪化を成る程度予測できること、そのような変化や
悪化になる前に予防または治療手段を講じることにより
、患者の病気の亢進を阻止でき、時には回復させること
かできることかわかった。（特願昭６３−１００１８６
号公報）このようにＴ”ＮＦが全身の種々の器官や組織
に劇的な影響を及ぼずホルモン様の物質であること、及
び’Ｔ’　Ｎ　Ｆの体液中の含有量と疾患との間に相関
かあることを明らかにしたことにより、本発明者は、生
体中にＴＮＦの活性と拮抗的に作用する物質が存在する
と推察するに至った。

」二連したように、Ｔ　Ｎ　Ｆの過剰産生により、病態
の悪化が生じていると考えられる患者か多く存在する。

このような疾患に対して、抗Ｔ　Ｎ　Ｆ作用を有する物
質を投与することにより、病態の改首が行なえうろこと
は、容易に推察かできる。事実、エンドトキシンショッ
クに対して心よ、抗゛Ｉ″ＮＦ作用を有する物質として
、抗Ｔ　Ｎ　Ｔ？抗体の投ｊｊ−が、動物を用いて行な
われ、顕著な効果を示したことが報告されている［：　
Ｂ、Ｂｅｕｔｌｅｒら５ｃｉｅｎｃｅ、　２９９１８６
９（１９８５）］。しかし、現花のところ、抗’Ｉ”　
Ｎ　ｒ？抗体はヒｌへ以外の動物山来のものしか作成さ
れておらず人体に対する投りにはこの上うな抗体では大
きな問題かあると考えられる。さらに、Ｔ　Ｎ　Ｆか関
りしていると考えられる急性、慢性の炎症反ＬＬにおい
では、免疫複合体の形成が、少なくとも病状を悪化させ
る要因のひとつであることか広く知られており、このよ
うな疾患に対して、抗Ｔ’　ＮＦ作用を有する物質とし
て、抗’Ｔ”　Ｎ　Ｆ抗体を治療のために用いることは
難しいと考えら、れる。そこで本発明者は、ヒトの体液
中に天然に存在しうる抗ＴＮＦ作用物質を用いれば、Ｔ
ＮＦか関与している疾患に対して、充分、有効かつ安全
な治療薬として使用しうるちのであると推察するに至っ
た。

膜性増殖型糸球体腎炎は、臨床的には、腎糸球体への免
疫複合体の沈着が認められ、さらに血中補体価の低下、
糸球体基痙膜の肥厚、メサンギウム細胞の増殖等が認め
られる腎疾患である。重症発症原因はいまた不明である
か、最近、メザンギウム細胞増殖型腎炎にはサイＩ・カ
イン類、特にインターロイキン６の関与が示唆される。

［実験医学２　、１１（１９８９）］インターロイキン
６の産生は、Ｔ　Ｎ　Ｆやインターロイキン１によって
誘導されることが、多くの細胞で報告されており［実験
医学２　、２１（１９８９）　　現代免疫学９３（１９
８８）］本疾患においてもＴ’ＮＦの産生亢進かおこっ
ていることか推測された。生体の反応として、異常冗進
がおこった生体内物質に対しては抑制的に働く物質も産
生されうると本発明者は推測した。

〈発明の目的〉本発明は新規な抗’Ｉ’　Ｎ　Ｆ作用物質、それを含有
する組成物及び該物質の製造方法を提供することを目的
とする。

〈発明の構成〉そこで本発明者は、種々の腎疾患患者の血中′■゛ＮＦ
含量を測置したところ、膜性増殖型糸球体腎炎患者血中
に高濃度の’Ｉ’ＮＦが含有されていることを明らかと
した。さらに、疾患患患者尿を用いて、ＴＮＦの活性抑
制能を検討したところ、高いＴＮＦ活性抑制能があるこ
とを見出した。この′ｒＮＦ活性抑制因子の性状を明ら
かにする研究を鋭意進めた所、ゲル濾過において、３０
，０００±５，０００の分子量を有する物質であること
が明らかとなった。又、本物質がタンパク質、糖タンパ
ク質様のものであるのか、さらに、単なるプロテアーセ
作用により’Ｉ”ＮＦを分解して、その活性を失活させ
ているのかにつき検討したところ本物質はプロテアーゼ
処理によりその活性を失う、タンパク質様の物質である
ことを明らかにした。又、５６℃、６０分間の熱処理を
行なっても活性は低ｒしない。比較的熱安定性の高いタ
ンパク様物質であることも明らかとなった。

’Ｉ’　Ｎ　Ｆの活性抑制物質に関しては、ｃ、ｐｅｅ
ｔｒｅら［Ｅｕｒ、　Ｊ、　１ｌａａｌａｔｏ　ｌ　、
　４１．４１４　（１９８８）、　４２．２７０（１９
８９）　］及び、Ｐ、Ｓｅｃｋｉｎｇｅｒら［Ｊ、Ｅｘ
ｐ、Ｈａｄ、１６７．１５５１（１９８８）］による報
告、及びり、Ｗａｌｌａｃｈら［ＥＰ０３０８３７８　
］による報告があるが本発明者が見出した物質は、上記
の報告による’ｆ’　Ｎ　Ｉ”結合物質、もしくはＴＮ
Ｆ阻害物質とはゲル濾過における分子量が異なり、新規
なものである。

すなわち本発明は、下記発明を包含する。

尿を精製することにより得られる物質であり、１）腫瘍
壊死因子のＬ９２９ＡｌｌＩ胞への殺細胞効果を抑制し
、２）　ゲル濾過における分子量か３００００±５，００
０であり、３）等電点かＰ　Ｉ　＝５．７±１，０であり、４）プ
ロテーアーゼ処理によって活性が消失し、５）５６℃、
６０分間の熱処理に安定、である物質。

また、尿が膜性増殖型糸球体腎炎患者由来のものである
上記の物質。

また本発明は、膜性増殖型糸球体腎炎患者由来の尿を精製し、１）腫瘍
壊死因子のＬ９２９細胞への殺細胞効果を抑制し、２）ゲル濾過における分子量か３０，０００±ｓ、ｏｏ
。

であり、３）等電点がＰ　Ｉ　＝５．７±ｉ、ｏであり、４）プ
ロテーアーゼ処理によって活性が消失し、５）５６℃、
６０分間の熱処理に安定、である物質を製造する方法を
包含する。

また本発明は尿を精製することにより得られる組成物で
あり、１）　　ｌ１ｆｉ癌壊死因子のＬ９２９細胞への殺細胞
効果を抑制し、２）ゲル濾過における分子量が３０，０００±５，００
０であり、３）等電点がＰ　Ｉ　＝５．７　ｆ：１．０　テあり、
４）プロテーアーゼ処理によって活性が消失し、５）５
６℃、６０分間の熱処理に安定、である物質を含有する
組成物を包含する。

尿がＷｉｆｌ：増殖型糸球体腎炎患者出来のものである
上記組成物を包含する。

尿は腎炎、肺炎患者の尿を用いるとよい。膜性増殖型糸
球体腎炎あるいは紫斑病性腎炎患者の尿が好ましい。ゲ
ル濾過に用いるカラムはウルトロゲル、セファロースセ
ファデックス、ＴＳＫ−Ｇ３０００ＳＷ（ＬＫＢ社）等
があるが、’ｒ”　Ｓ　Ｋ　−Ｇ３０００ＳＷが好まし
い。

本発明の物質はＴＳＫ　　Ｇ３０００ＳＷカラム（８ｘ
３００１ｍ！１１．　ＬＫＢ社〉にがけ、Ｐ　Ｂ　Ｓ　
＆、：て０．３ｍｌ／ｎ＋ｉｎの流速にて溶出を行った
ときに分子量マーカーのオボアルブミン（分子量４４，
０００）とマイオグロビン（分子量１７．０００　＞の
間に存在する物質である。

検体尿の調製　０尿は、初尿、蓄尿、スポッ１〜尿のいずれを用いてもか
まわない。好ましくは、後に、バイオアッセイを行なう
ために、できるだ番−）熊菌もしくは無菌に近い状態で
採取されたものかよい。

採取した尿は、ずみやかに冷凍保存し、使用直前に融解
して用いることが望ましい。カビやバクテリアの繁殖を
抑えるために、ＮａＮ３や抗生物質、又、プロプアーゼ
による分解を防ぐためにプロテアーゼインヒビター等を
、尿採取直後に添加してもかまわないが、尿採取後、速
やかに冷凍保存に移行ずれはこれらの添加物は不要であ
る。それらの添加物を添加した場合には、適当な操作、
例えば、透析、限外濾過、ゲルが過等の操作により、バ
イオアッセイを行なう前に充分、添加物を除去する心変
がある。

検体尿からの精製精製は、通常のタンパク質の精製法に従って行なえばよ
い。尿原液では、通常、低い活性しか認められないので
、まず濃縮を行なうことが好ましい。濃縮法としては、
限外濾過、凍結乾１燥、塩析等の通常の生化学実験法に基づいて行なえばよ
いが、限外濾過、塩析等を行なう場合には、目的とする
物質の分子量や、沈澱を開始する塩濃度等をあらかじめ
調べておく必要かある。

濃縮後は、適当な精！！！操作、例えばイオン交換、ゲ
ルｐ過、アフィニーティークロマトクラフィー１等電点
電気泳動、疎水クロマトクラフィー、逆相クロマトグラ
フィー等を組み合わせて、精製を進めることができる。

ＴＮＦ活性抑制能の測定ＴＮＦ活性の抑制能の測定法としては、既に知られてい
るゴＮ　Ｆｉ８性の測定を行なう系に、被験サンプルを
添加すればよい。すなわち、′「ＮＦのアッセイ法とし
て知られている１ｎ　ｖｉｔｒ。

での種々の腫瘍細胞に対する殺細胞効果、細胞増殖抑制
効果、脂肪細胞の脂肋酸代謝抑制効果。

正常線維非細胞の増殖促進効果やＴＬ−６産生誘導効果
好中球の内皮細胞への付＠促進効果や、スーパーオキサ
イド分泌促進効果、血管内皮細２胞の凝固活性亢進効果、骨細胞への破骨効果種々の細胞
でのＩ　ｌ、−１やプロスタクランデイン類の誘導効果
を測定する系か利用できる。特にＬ９２９細胞ｌ＼の殺
細胞効果で測定することか好適である又、ｉｎ　ｖｉｖ
ｏにおいてもある種の癌細胞に対する出血壊死効果、エ
ンドトキシンショックの誘導効果１発熱効果を測定する
系を利用することかできる。しかし、ｉｎ　ｖｉｖｏで
の活性や、多くのｉｎ　ＶｉｔｒＯでの活性は、Ｔ　Ｎ
　Ｆ以外の物質でも誘導しうる反応か多くあるため、で
きるだけ単純で、かつ、ＴＮＩ”以外の物質の影響を受
けない系例えは、ｉｎ　ＶｉｔｒＯの癌（社）１胞に対
する殺細胞活性を測定する系を用いることか望ましい。

〈発明の効果〉本発明によれは尿由来の腫瘍壊死因子（’Ｔ″Ｎ　Ｆ　
＞のＬ９２９細胞への殺細胞効果を抑制する新規な物質
を提供し、Ｔ　Ｎ　Ｆが関与している疾患の治療。

診断等に利用できる。また上記物質の効率的な製造方法
を提供することか可能となった。

　３く実施例〉以下、実施例を掲げて本発明について詳細に説明するか
、本発明Ｇよ以下の実施例に限定されるものではない。

実施例１各種疾患患者尿中のＴＮＦ抑制活性検討血中ＴＮＦ量の
測定により、比較的’Ｉ’　Ｎ　Ｆ量か高い患者尿、６
検体及び健常人１検体計り尿検体、各２ｍｌを集め、セ
ントリコン１０　（ＡＩＩｌｉＣＯｎ社）による限外濾
過で分子Ｍ１万以」二の両分を濃縮、ＰＢＳにバッファ
ー交換を行ない４倍濃縮したサンプルをアッセイに用い
た。アッセイは、９６ウエルプレーＩ・に４　Ｘ　１０
５ｃｅｌｌｓ　／　ｍｌのＬ９２９細胞を、２μｇ／ｍ
ｌのアクチノマイシンＤと混合し、１００μ夕／ウエル
で播種、５％ＣＯ２、３７°Ｃにて２時間培養した細胞
を用いた。この細胞に５０μｙウエルでサンプルを加え
、直後に２．６ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ溶液５０μｌ／ウェ
ルをさらに添加し、５％ＣＯ２３７°Ｃにて１８時間培
養を行なった。培養後、クリス４タルバイオレッ１〜による生細胞の染色を行ない、染色
された細胞を０．５％Ｓ　Ｄ　Ｓにて溶解し、５９５ｎ
ｌ＋の吸光度により細胞の生残率を測″）トした。結果
は下記衣１に示すように膜性増殖型糸球体腎炎患者圧の
分子量１万以］二の分画に、有意に高い、Ｉ。

９２９細胞に対するＴ　Ｎ　Ｆの殺細胞効果を抑制しう
る物質か存在することが明らかとなった。

表　　１実施例２ ’ｒ’　Ｎ　Ｆ活性抑制因子−のゲル濾過による分子量
同定膜性増殖型糸球体腎炎患者圧１１を集め、ミニタンＣミ
リボッ社）による限外濾過を行ない、分子量１万以上の
画分を３０倍濃縮した。この画分をｒ−’　Ｂ　Ｓにバ
ッファー交換した後１　ｍｌをＴ　Ｓ　Ｋ−Ｇ３０００
ＳＷカラム（８Ｘ３００　ｌｎｍ、　ＬＫＢ社）にがけ
、ＰＢＳにて０．３　ｍｌ　／　Ｉｎ１ｎの流速にて溶
出を行ない、０．６ｍｌずつフラクションを集めた。各
フラクションのＴ　Ｎ　Ｆ活性抑制能及び２８０ｎ１１
１の吸光度を図１に示ず。分子量マーカーとしては、サ
イＩ７グロプリン（分子量６８０，０００）、カンマグ
ロブリン（分子量１５８，０００）、オボアルブミン（
分子量４４０００＞マイオクロビン（分子ｆｉ１７，０
００）　、ビタミンＢ１２（分子量１，３５０）を用い
たか、主たるＴＮＦ活性抑制能は、分子量３０．０００
±５，０００であることが明らかとなった。

図１より、タンパク質濃度のピークとＴ　Ｎ　Ｆ活性抑
制能のピークがずれていることより、ＴＮＦ活性性能か
単なる高濃度タンパク質溶液によって生じているのでは
ないことは明らかであるが、このことを確認するために
、陰イオン交換カラムを６通して、■精製したサンプルを再度、ゲル濾過にか４−
）て、分子量の同定を行なった。ミニタンに土って、３
０倍に濃縮した尿１３ｍ１を、ＤＥＡＥ−５ＰＷ　（８
Ｘ７５＋ｎｍ、　ＬＫＢ社）に通し、０−２５０ｍＭの
ＮａＣｆ濃度勾配により溶出させることを１３回繰り返
し、活性画分を集めた。この活性画分を、セントリコン
１０（へｍ１ｃｏｎ礼）により？Ｆｊ４縮、バ・ンファ
ー交換を行ない、Ｔ”　Ｓ　Ｋ　Ｇ　３０００Ｓ　Ｗ　
（８Ｘ　３００　ｍｍＬＫＢ社）にかけ、ｒ−’　Ｂ　
Ｓにて０．５　ｍｌ　／ｍｉｎの流速にて溶出を行ない
、１　ｍｌずつフラクションを集めた。各フラクション
の’Ｉ’　Ｎ　ｌ？活性抑制能、及び２８０ｎｍの吸光
度を図２に示ず。この結果からも′ＦＮＦ活性抑制能は
分子ｊｉｂ：３０，０００≦±５，０００であることが
明らかとなった。

実施例３　　等電点の決定膜性増殖型糸球体腎炎患者圧８６０　ｍｌを集めペリコ
ン（ミリポア社）による限外濾過を行ない分子量１万以
上の両分を２９倍濃縮した。この両分を１１０１ｎ　Ｔ
ｒｉｓ　ｐＨ８，０にバッファー交換した後、総量７４０ｍ１となるように１０＋ｎＭ　Ｔｒｉｓ　ｐＨ８，
ｏを加え、さらにＢｌｏ−１ｙｔｅ　３／１０　　（Ｂ
ＪＯ−８６０社）を最終濃度２％となるように加え、Ｒ
ｏｔｏｆｏｒ　　（ＢＩＯ−８６０社）にて、１２Ｗ定
電力、５℃、４時間の等電点電気泳動を行なった。泳動
終了後、サンプルを２０本　チューブに分取し、各チュ
ーブのＩＩＨ及び、タンパク量を測定した。さらに各チ
ューブのサンプルは、１、　Ｍ　　Ｎ　ａ　Ｃｆｌに対
して透析を行なってＢｉｏ−Ｌｙｔｅを除去した後、セ
ントリコン１０を用いてＰＢＳにバッファー交換し、Ｔ
　Ｎ　Ｆ活性抑制能を測定した。

結果は図３に示したように、Ｔ　Ｎ　Ｆ活性抑制能を有
する物質はｐ１５．７±１．０であることが明らかとな
った。

実施例４　　プロテアーセ処理によるＴＮＦ活性抑制能
の失活膜性増殖型糸球体腎炎患者圧の分′Ｔ−量１万以−■二
の両分をミニタンにより、３０倍濃縮、　１０ｍＭＴｒ
Ｉｓ−ｔｌｃｌ　ｐＨ８，ｏにバッファー交換し、ＤＥ
ＡＥ５　ｒ’Ｗ　（８Ｘ７５ｍｍ、　ＬＫ　８社）に吸
着させた。

　８１０１ｎＨＴｒｉｓ　ｐＨｇ、ｏでカラムをよく洗い非
吸着成分を充分除去した後、０→２５Ｏｎ＋ＭのＮａｃ
ｌ濃度勾配により溶出させ活性画分を集めた。活性画分
を、セントリーｙ　ン１０　（Ａｎ＋１ｃｏｎ社）によ
り濃縮、ＰＢＳにバッファー交換したものをサンプルと
した。このサンプル中のＴ　Ｎ　Ｆ？活性能は２７Ｕ／
■、タンパク質濃度は１５■／　ｍｌであった。なお、
１Ｕは０．６５■／　ｍｌのＴ　Ｎ　Ｆ活性を、３０％
Ｉ！Ｉｔ害するのに必要なサンプル稀釈倍率の逆数とし
てＳ１算した。

このサンプル１００μｌに、１０■／　ｍｌのトリプシ
ン、２０）１１及び、０．２ＨＴｒ＋５−ｔｌｃｌ　ｐ
ｔ１８．ｏ　、　２１′ＩＩＨＣａｃｆ　２　、１４０
　ｕｌを加え、３７℃、４時間インキュベートした後の
’Ｉ”　Ｎ　Ｆ活性抑制能を測定した。

さらに、０．２Ｍ　Ｔｒｉｓ−１１ｃＩ　ｐＨａ、ｏ　
−２ｍＨＣａ　Ｃ１□１００μｍ、１０■／　ｍｌのト
リプシン２０μｍ及び、２０■／　ｍｌの１〜リプシン
−キモトリプシンインヒビター４０μｍを混合し、３７
°Ｃ，４時間インキュベートした後、サンプル１００Ｊ
Ｊ、Ｆを添加したもの、及び、サンプル１００μＦに０
．２ＨＴｒｉｓ−ｔｌｃｌ　ｐＨ８，ｏ　−２ｎ＋ＨＣ
ａ（、ｆ２１２０μｍ、トリプシン−キモｌ−リプ９シンインヒビター４０μｍを添加した後、３７°Ｃ，４
時間インキュベー１〜したもののＴ’　Ｎ　Ｆ活性抑制
能を測定した。ネガティブコン１〜Ｖ′フールとしては
、ＰＢＳ１００μＦに０．２ＨＴｒｉｓ−１１ＣＩ　ｐ
ｔ１８．ｏ　　２ｍＨＣａｃＦ　２　、１４０　μｌ　
、　１０ｍｇ／ｍｌ　ｌ〜リプシン２０μ２を添加、３
７°Ｃ，４時間インキュベーｌ〜したものを用いた。

表　　２結果は表２に示したように膜性増殖型糸球体腎炎患者尿
中の’ｒＮ　Ｆ活性抑制物質は、１−リプシン処理によ
り、完全に失活するタンパク性もしくは、糖タンパク性
物質であることか明らかになった。

さらにｌ・リプシン−キモｌ−リプシンインヒビター０存在ｒにおいても、本尿中の’ｒ”　Ｎ　Ｆ活性抑制物
質は、全く活性を失わなかったことより、単なるプロテ
アーゼ様物質でないことも明らかとなった。

実施例５　　　ＴＮＦ活性抑制因子の熱安定性実施例３
で用いたものと同じ、比活性２７Ｕ／■。

タンパク質濃度１５■／　ｍｌのＤＥＡＥ粗稍製粗金製
品て、熱安定性を検討した。サンプル１６０μ夕をチュ
ーブに入れ、５６°Ｃ１７５°Ｃ１９５°Ｃの温浴にて
、１０、３０．６０分間処理し、インキュベ−１・終了
直後に、Ｌ９２９，１ｌｌｌ胞ニＴ　Ｎ　Ｆと同時に加
えて、ＴＮ　Ｆ活性抑制能を測定した。

結果は図４に示したように、５６℃、６０分間の処理で
も’Ｔ’　Ｎ　Ｆ活性抑制能は、全く失活せず、７５°
Ｃの処理によって部分失活、９５℃の処理によってほぼ
失活する性質の物質であることが明らかとなった。

実施例６　　　ＴＮＦ活性抑制物質の粕製膜性増殖型系
球体腎炎患者尿１１を集め、ミニ１タン（ミリポア社）による限外？過を行ない分子［１Ｈ
以上の両分を３９倍濃縮した。この画分を１０ｉＨＴｒ
ｉｓｌ　ｐＨ８，ｏにバッファー交換した後、２０ｍ１
を１００ｍ１のｇｅｌ　ｂｅｄ　ｖｏｌｕｎ＋ｅを有す
るＤＥＡＥ−３ｅｐｈａｒｏｓｅ　ＣＬ　−６８（Ｐｈ
ａｒｌａｃｉａ社）に４０ｍ１／ｈｒにて通し、溶出画
分の２８ＯｎＩ１１の吸収かなくなるまで１０ｎｌＨＴ
ｒｉｓ　ｐｔ１８．ｏにて洗浄した。洗浄後、１０１Ｉ
ＨＴｒｉｓ　ｐＨ８，ｏ　−１００１１８Ｎ　ａ　ｃ　
ｌにて溶出を行ない、５ｍ１／フラクシヨンにて両分し
、各両分をセン１〜リコン１０にて濃縮ＰＢＳにバッフ
ァー交換した後、ＴＮＦ活性抑制能のアッセイを行ない
、活性画分を集めた。この活性画分のうち０．３ｍｌを
０．１％トリフルオロ酢酸にて平衡化したＰｒｏｔｅｉ
ｎＣ４逆相カラム（０，４６Ｘ２５（７）、ＶＹＤＡＣ
社）に流速０．５ｍｌ／Ｎｎにてかけ、充分洗浄した後
、アセ）−二トリル○→８０％の直線濃度勾配により、
溶出を行ない０．５ｍｌ／フラクションにて分画を行な
った。各フラクションを凍結乾燥した後、０．３ｍｌ／
フラクションのＰＢＳで溶解し、ＴＮＦ活性抑制能、及
び、タンパク量の定量を行なった。結果２は、表３に示す様にこの精製操作により、約５６０倍も
の精製か行なえることか］すｊらかとなった。

表３

【図面の簡単な説明】

図１は、濃縮尿のゲル濾過におけるタンパク量と’ｒＮ
Ｆ活性抑制能を示したものである。図２は、陰イオン交
換カラムによる粗精製を行なった後のサンプルのゲル濾
過にお（つるタンパク量と′Ｔ″ＮＦ活性性能を示した
ものである。図３は等重点の測定結果を示したのである
。図４は、陰イオン交換カラムによる粗精製を行なったサ
ンプルの熱安定を示したものである。３手続補正書平底２年２月／、）日特言午庁長′「殿１、事件の表示特願平６４８８７号／２、発明の名称腫瘍壊死因子活性抑制物質３、補正をする者事件との関係　特許出願人大阪府大阪市中央区南本町１丁目６番７号（３００）帝
人株式会社明細書の「発明の詳細な説明」の欄及び「特許請求の範
囲Ｊの欄補正の内容ぷ芥眠（１）明細書の特許請求の範囲を別紙のとおり訂正する
。（２）明細書第１頁下から１行〜第２頁１行の「膜性増
殖型糸球体」を「膜性増殖性糸球体」と訂正する。（３）同第６頁８行の「膜性増殖型糸球体ｊを「膜性増
殖性糸球体」と訂正する。（４）同第７頁９行の「膜性増殖型糸球体」を「膜性増
殖性糸球体」と訂正する。（５）同第９頁４行の「膜性増殖型糸球体」を１膜性増
殖性糸球体」と訂正する。（６）同第１０頁６行の「膜性増殖型糸球体」を「膜性
増殖性糸球体」と訂正する。（７）同第１０頁８〜９行の「膜性増殖型糸球体」を「
膜性増殖性糸球体」と訂正する。（８）同第１５頁４行の「膜性増殖型糸球体」を「膜性
増殖性糸球体」と訂正する。（９）同第１５頁表１中の「膜性増殖型糸球体」を「膜
性増殖性糸球体」と訂正する。（１０）同第１６頁１行の「膜性増殖型糸球体」を「膜
性増殖性糸球体」と訂正する。（１１）同第１７頁１６行の「膜性増殖型糸球体」を「
膜性増殖性糸球体」と訂正する。（１２）同第１８頁下から４行の「膜性増殖型糸球体」
を「膜性増殖性糸球体Ｊと訂正する。（１３）同第２０真下から５行の「膜性増殖型糸球体」
を「膜性増殖性糸球体」と訂正する。（１４）同第２１頁下から１行の「膜性増殖型糸球体」
を「膜性増殖性糸球体」と訂正する。（１５）同第３頁７行のｒ　Ｒｖｏｃ、　Ｊをｒ　Ｐｒ
ｏｃ、　Ｊと訂正する。（１６）同第３頁１１行のｒＰＰ、　Ｎａｗｒｏｔｈら
」をｒｐ、ｐ。Ｎａｗｒｏｔｈら」と訂正する。（１７）同第３頁１８行のｒ　ｌ１ｌｕｒｏ　ｐｏｔｈ
ｏｌ、　Ｊをｒ　Ｉｎｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ、　Ｊと訂
正する。（１８）同第５頁１４行のｒ　１８６９　（１９８５）
　、を「８６９（１９８５）　Ｊと訂正する。（１つ）同第６頁１０行の「糸球体基痙膜の」を「糸球
ｔ＊基底膜の」と訂正する。（２０）同第６頁１４行の「示唆される」を「示唆され
ている」と訂正する。（２１）同第８頁３〜４行の「活性は低下しない。比較
的熱安定性の高い」を「活性は低下しない、比較的熱安
定性の高い」と訂正する。（２２）同第１０頁１１行の「セファロースセファデッ
クス」を「セファロース、セファデックス」と訂正する
。（２３）同第１２頁下から２行の「誘導効果好中球のｊ
を「誘導効果、好中球の」と訂正する。（２４）同第１３頁５行の「好適である又、ｉｎ　ｖｉ
ｖｏ　」を「好適である６又、ｉｎ　ＶｉＶＯＪと訂正
する。（２５）同第１４頁８行の「１検体計り尿検体、」を「
１検体より尿検体、」と訂正する。（２６）同第１４頁下から４行の「５０μｍウェル」を
「５０μｌ／ウエル」と訂正する。（２７）同第１６頁１〜２行の「ミニタンＣミリボッ社
」を「ミニタン（ミリボア社〉Ｊと訂正する。（２８）同第１７頁８行のｒＴｓＫＧ３０００ｓＷＪを
ｒＴｓＫ−Ｇ３０００ＳＷＪと訂正する。（２９）同第１７頁１３行のｒ　３０，０００≦±５，
０００　Ｊをｒ　３０，０００±５，０００　Ｊと訂正
する。（３０）同第１９頁８行の「ｍｇ　／　ｍｌ　」を’　
ｎｇ／　ｍｌ　」と訂正する。（３１）同第１９頁１１行の’　ｐｈａ、ｏ　、　２１
＋１ＭＪをｒｐＨ８，０２１１１ＨＪと訂正する。（３２）同第２０頁４行のｒｐＨ８，ｏ　、　２１ｎＨ
」をｒｐ＋ｉ８．。２１＋１ＨＪと訂正する。（３３）同第２２頁８行のｒｌｏｏｌｌｌＨＮａＣＩＪ
をｒ　１００ｍＨＮａＣＩＪと訂正する。（３４）同第２２頁９行の「にて画分し、」を「にて分
画し、」と訂正する。（３５）同第２２頁１０行の「にて濃縮ＰＢＳに」を「
にて濃縮、　ＰＢＳに」と訂正する。（３６）同第２３頁下から１行の「熱安定」を「熱安定
性」と訂正する。以別紙特許請求の範囲１、尿を精製することにより得られる物質であり、１）
腫瘍壊死因子のＬ９２９細胞への殺細胞効果を抑制し、２）ゲル濾過における分子量が３０．０００±５，００
０であり、３）等電点がＰＩ＝５．７±１．０であり、４）プロテ
ーアーゼ処理によって活性が消失し、５）５６℃、６０
分間の熱処理に安定、である物質。２、尿が膜性増殖性糸球体腎炎患者由来のものである請
求項１記載の物質。

Claims

【特許請求の範囲】１、尿を精製することにより得られる物質であり、１）
腫瘍壊死因子のＬ９２９細胞への殺細胞効果を抑制し、２）ゲルろ過における分子量が３０，０００±５，００
０であり、３）等電点がＰＩ＝５．７±１．０であり、４）プロテ
ーアーゼ処理によって活性が消失し、５）５６℃、６０
分間の熱処理に安定、である物質。２、尿が膜性増殖型糸球体腎炎患者由来のものである請
求項１記載の物質。