JPH05500809A - 新規タンパク質及びその製造 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 新規タンパク質及びその製造 本発明は、新規タンパク質及びその製造に関する。

水蛭が血液凝固を妨げる物質、ヒルジンを製造することは、公知である（Ｔｈｅ 　Ｍｅｒｃｋ　Ｉｎｄｅｘ　１０版、Ｎｏ、４６１３参照）。ヒルジンは、分子 量約６５００を有するポリペプチドである。

血液凝固を妨げる物質は、他の吸血寄生物、例えばダニによっても製造される。

しかし、この物質は、従来、純粋形でも得られず、合成的にも製造されていなか った（Ｎａｔｕｒｗｉｓｓｅｎｓｃｈａｆｔｅｎ　１１．３０（１９６１）　） 　。

ところで、新規タンパク質がダニから単離された。

本発明の目的物は、分子量が約１５０００ドルトンであり、かつアミノ末端でア ミノ酸配列：５ＤＹＥＦＰＰＰＫＫＸＲＰＧ ［ここでＸは、Ｓ又はＮである］を有する新規タンパク質並びにその突然変異タ ンパク質（Ｍｕｔｅｉｎ）である。

突然変異タンパク質とは、新規タンパク質から、タンパク質鎖中のアミノ酸又は ペプチドの交換、欠失及び／又は付加により、これによ５υ新規タンパク質の作 用を実質的に変えることなく、生じるタンパク質である。

この新規タンパク質は、ダニから単離することができるにのために、ダニを緩衝 液中にｐＨ６〜９、特に７．５で、入る。混合物をホモジナイザーで均質化後に 、不溶成分を遠心分離する。こうして得られた溶液から、トリクロル酢酸を最終 濃度２．５％まで添加することにより、不作用タンパク質を沈殿させ、かつ遠心 分離により除去する。こうして得られた溶液がら、タンパク質を冷たいアセトン を用いて沈殿させる。新規タンパク質は、イオン交換−及びｐＨ−勾配クロマト グラフィーにより、沈殿生成物がら単離することができる。

ここに記載のタンパク質は、ダニ中に濃度１〜１゜Ｏμｇ／ｋｇで存在している 。薬剤学的目的のためのタンパク質を多量に入手するためには、公知の遺伝子技 術法（Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｔ、等：　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ 　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、Ｃｏ１ｃｌ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏ ｒ　Ｐｒｅｓｓ、　ニューヨーク、１９８２参照）を使用することができる。こ の目的のためには、先ず、新規タンパク質に関する遺伝情報を同定し、かつ相当 する核酸を単離させるべきである。このために、純粋なタンパク質をジチオトレ イトールを用いて還元し、次いでヨードアセトアミドを加えて遊離ＳＨ−基を誘 導体化させ、かつ引き続き、こうして処理されたタンパク質をブロムシアン及び トリプシンを用いて分解して小さいペプチドにする。ペプチドの分離は、逆相− クロマトグラフィーにより行なう。この特表平５−５００８０９　（２） ｆＩＩ製したペプチドのＮ−末端配列決定では、配列、５ＤＹＥＦＰＰＰＫＫＳ ＲＰＧを示した。

存在するペプチド配列は、相当するオリゴヌクレオチドの合成により、配列特異 性フィルターハイブリッド形成（ｓｅｑｕｅｎｚｓｐｅｚｉｆｉｓｃｈｅ　Ｆｉ １℃ｅｒｈｙｂｒｉｄｉｓｉｅｒｕｎｇ）によるゲノム又は相当するｃ−ＤＮＡ −パンク（Ｂａｎｋ）から、遺伝子の明白な同定を可能にする。

次いで、こうして得られたタンパク質の遺伝情報を、種々異なる寄主細胞、例え ば真核性細胞、酵母、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ）又は大腸 菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）中に、自体公知の方法により入れ、かっこうしてタンパク質 を得ることができる。その際、真核性細胞中に、グリコジル化された形のタンパ ク質が生じる。

新規タンパク質のアミノ酸又はペプチドの交換、欠失及び／又は付加により誘導 された突然変異タンパク質は、特に、遺伝子技術法により製造される。

新規タンパク質は、血液凝固阻止特性を有し、がっ血管疾病、例えば心臓梗塞、 肺塞栓、動脈塞栓症及び静脈血栓病の予防及び治療のために使用することができ る。更に、血液の保存のために好適である。新規タンパク質の低い毒性は、その 使用のために有利である。

更に、新規タンパク質は、ダニ特有のタンパク質に対する家畜の免疫付けのため に好適である。こうして、中和抗体により、ダニの食物摂取を妨げることができ る。これにより、ダニは、寄生を妨げられ、従って、死滅する。

例１〜３ 例Ｊ 血栓抑制剤（Ｔｈｒｏｍｂｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）の精製実験室中で、２８℃及び ８０％相対湿度で保持された飼育皮ダニ（オルニトドルス・モウパータ；０ｒｎ ｉ℃ｈ。

ｄｏｒｕｓ　ｍｏｕｂａｔａ）に、これらがイエウサギを吸うことができるよう に、１４日間隔で餌をやった。餌をやる前又は後の全ての発育段階のダニを、− ２０℃で冷凍し、かつ引き続（後処理で使用した。ここで、ダニ１０ｇをリン酸 塩−緩衝塩水２０ｍＩ中に入れ（リン酸ナトリウム２０ｍＭ、ＮａＣｌ　１５０ ｍＭ、ＥＤＴＡｌｍＭ、ｐＨ７，５）、かっ２０’Ｃで均質化させた。不溶成分 を遠心分離により分離した。

澄明な赤色上澄に、トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）を、最終濃度ＴＣＡ２．５％まで 加えた。大量の赤い沈殿物が生じるから、これを遠心分離により分離した。その 後、溶液を、その１／１０の量のエーテルで３回振出した。水溶液をＮａＯＨを 用いて中和した。

これに、冷たい（−７８℃）アセトン４倍量を加えた。その際、溶液をドライア イス上の冷気中に置いた。

２４時間までの経過時間で、綿くず状の白い沈降物が生じた。これを遠心分離し 、かつ乾燥器中で乾燥させた。収率は、使用ダニの重量の１％であった。ＳＤＳ −ゲル電気泳動で、この生成物は、クーマシーブリリアントブルーでの染色後に 、４０ｋＤａまでの低分子量範囲で、なおタンパク質バンド１０〜２０個を示し た。

このタンパク質の等重点は、ｐＨ４〜ｐＨ７であった。

このタンパク質混合物（２００ｍｇ）を、リン酸塩−緩衝塩水、ｐＨ５中に入れ 、タンパク質濃度２０ｍｇ／ｍｌｉ：し、かっＱ−セファロース（Ｓｅｐｈａｒ ｏｓｅ）　’Ｄカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、 ｆａｓｔ−ｆｌｏｗ）上に置いた。

カラムの容量は、１０ｍ１であった。カラムを、その中にも試料を入れたと同じ 緩衝液を用いて平衡させた。

カラムを３カラム量の平衡Ｍ養液を用いて洗浄後に、カラムをｐＨ−勾配液を用 いて溶離させた。更に、洗浄緩衝液（ｐＨ５，０）１０カラム量を、勾配混合機 上で、洗浄緩衝液（ｐＨ１〜３）１０カラム容量と、ゆっくり混合した。この条 件下に、血栓抑制剤をｐＨ４，５で溶離した。タンパク質は、こうして、純粋で 、かつ活性の形で得られた。これは、ゲル電気泳動で、分子量１５０００±１０ ００を示した。このタンパク質のアミン末端配列は、次のものである：　５ＤＹ ＥＦＰＰＰＫＫＳＲＰＧ、その等電点は、ｐＨ４〜５である。

例２ 活性血栓抑制剤−分子からの不活性血栓抑制剤−分子の分離 分子量に関して均一な、例１により得られ、かっ血栓抑制剤−作用により同定さ れたタンパク質を、例１の記載と同様に、冷アセトン４倍過剰により沈殿させ、 かつ乾燥させた。その後に、残分をリン酸塩−緩衝塩水、ｐＨ７，５中に入れ（ タンパク質濃度２０　ｍｇ／ｍｌ　）、かつ同じ緩衝液を用いて平衡させたモノ ーＱ−カラム（カラム容量１ｍ１）上に加えた（約０．１ｍｇ）。

カラムを流動速度０．５ｍｌ／分で洗浄し、かつ次いで、ＮａＣ１１５０ｍＭか らＮａｃｌ　３５０　ｍＭ　（各２．５ｍ１）、次いでＮａＣｌ　３５０　ｍＭ からＮａＣ１４５０ｍＭ（各２．５ｍ１）、引き続きＮａＣ１４５０ｍＭからＮ ａＣＮａＣ１５５Ｏ各１０ｍ１）の勾配で、最後にＮａＣｆ８００ｍＭで溶離さ せた。タンパク質は、ＮａＣｌ３５０ｍＭ及びＮａＣｌ３５０ｍＭの間で生じた 。しかしながら、活性（血栓抑制剤作用として測定）は、ＮａＣｌ４５０’ｍＭ での吸収最大とのみ結びついた。しかしながら、溶離された全てのタンパク質の 配列分析では、全てが同じアミノ末端配列を有すること、従って、その−次構造 に関して一致していることが明らかになった。

例３ 不活性血栓抑制剤分子の復元 ２で得られた不活性血栓抑制剤フラクションを、例１の記載のように沈殿させ、 かつ尿素８Ｍ及びジチオトレイトール（ＤＴＴ）２００ｍＭを含有する復元緩衝 液中に入れた。３７℃で１時間後に、タンパク質をリン酸塩−緩衝塩水１００倍 容量に対して透析させた（透析管の排出量１０ｋＤａ）。４℃で２時間の透析後 に、タンパク質は、活性であり、がっモノーＱ−カラムで、塩勾配にょる溶離後 に、例２の活性フラクションと同じ挙動を示した。

国際調査報告 −１−−＾−ｍｍｓ、、　ＰＣＴ／ＥＰ　９０７０１５７８国際調査報告

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. １．Ｎ−末端アミノ酸配列；ＳＤＹＥＦＰＰＰＫＫＸＲＰＧ［式中Ｘは、Ｓ又は Ｎである］及び分子量約１５０００ドルトンを有することを特徴とする、タンパ ク質並びにその突然変異タンパク質。
2. ２．疾病の予防に使用する、請求項１記載のタンパク質。
3. ３．ダニ発生に対する抗体の製造もしくはダニ発生に対する家畜の免疫付けのた めの、請求項１記載のタンパク質の使用。
4. ４． ａ）ダニを均質化し、この均質物から不溶成分を除去し、上澄からトリクロロ酢 酸を用いる沈殿により不作用タンパク質を沈殿させ、かつ溶液中に存在するタン パク質を、アセトンを用いて沈殿後に、クロマトグラフィーにかけるか、又は ｂ）タンパク質を公知の遺伝子技術法により製造する、請求項１記載のタンパク 貧の製法。