EP0493494A1 - Neue proteine geeignet zur bekämpfung von krankheiten sowie zum schutz von weidevieh gegen zecken - Google Patents
Neue proteine geeignet zur bekämpfung von krankheiten sowie zum schutz von weidevieh gegen zeckenInfo
- Publication number
- EP0493494A1 EP0493494A1 EP90914720A EP90914720A EP0493494A1 EP 0493494 A1 EP0493494 A1 EP 0493494A1 EP 90914720 A EP90914720 A EP 90914720A EP 90914720 A EP90914720 A EP 90914720A EP 0493494 A1 EP0493494 A1 EP 0493494A1
- Authority
- EP
- European Patent Office
- Prior art keywords
- protein
- ticks
- protecting
- new proteins
- grazing cattle
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 48
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 47
- 241000238876 Acari Species 0.000 title claims abstract description 13
- 201000010099 disease Diseases 0.000 title claims abstract description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 title claims abstract description 4
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 title claims description 3
- 238000009304 pastoral farming Methods 0.000 title claims description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 239000000470 constituent Substances 0.000 claims description 4
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 claims description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims 2
- 201000001064 tick infestation Diseases 0.000 claims 2
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 claims 1
- 244000144972 livestock Species 0.000 abstract 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 22
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 11
- 101000712605 Theromyzon tessulatum Theromin Proteins 0.000 description 7
- 229940122388 Thrombin inhibitor Drugs 0.000 description 7
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 7
- 239000003868 thrombin inhibitor Substances 0.000 description 7
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000007625 Hirudins Human genes 0.000 description 2
- 108010007267 Hirudins Proteins 0.000 description 2
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- WQPDUTSPKFMPDP-OUMQNGNKSA-N hirudin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(OS(O)(=O)=O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@@H]2CSSC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N2)=O)CSSC1)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)C(C)C)[C@@H](C)O)CSSC1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 WQPDUTSPKFMPDP-OUMQNGNKSA-N 0.000 description 2
- 229940006607 hirudin Drugs 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 2
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 2
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 108091028026 C-DNA Proteins 0.000 description 1
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010014513 Embolism arterial Diseases 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241000545744 Hirudinea Species 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 241000238887 Ornithodoros Species 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 208000010378 Pulmonary Embolism Diseases 0.000 description 1
- 239000012614 Q-Sepharose Substances 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002429 anti-coagulating effect Effects 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 235000011089 carbon dioxide Nutrition 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000012847 fine chemical Substances 0.000 description 1
- 230000037406 food intake Effects 0.000 description 1
- 235000012631 food intake Nutrition 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N iodoacetamide Chemical compound NC(=O)CI PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 239000010985 leather Substances 0.000 description 1
- 231100000053 low toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000000034 method Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 208000019553 vascular disease Diseases 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/81—Protease inhibitors
- C07K14/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
- C07K14/811—Serine protease (E.C. 3.4.21) inhibitors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
Definitions
- the present invention relates to new proteins and their production.
- Hirudin is a polypeptide with a molecular weight of approximately 106,500.
- the invention relates to a new protein which has a molecular weight of about 15,000 daltons and the amino acid sequence at the amino terminus
- Muteins are to be understood as proteins that arise from the new protein through exchange, deletion and / or addition of amino acids or peptides in the protein chain without the effect of the new protein thereby changing significantly.
- the new protein can be isolated from ticks.
- the ticks are taken up in a buffer at pH 6 to 9, preferably 7.5.
- the insoluble constituents are centrifuged off.
- Inactive protein is precipitated from the solution thus obtained by adding trichloroacetic acid to a final concentration of 2.5% and removed by centrifugation.
- ether-soluble constituents are removed by extraction and the protein is then precipitated with cold acetone.
- the new protein can be isolated from the precipitated product by ion exchange and pH gradient chromatography.
- the protein described here is present in the ticks in a concentration between 1 - 100 ⁇ g / kg.
- the genetic information thus obtained for the protein can then be expressed in various host cells, such as eukaryotic cells, yeasts, Bacillus subtilis or E. coli, using known methods, and the protein can be obtained in this way.
- the protein is produced in glycosylated form in the eukaryotic cells.
- the muteins which are derived from the new proteins by exchange, deletion or addition of amino acids or peptides are preferably prepared by genetic engineering methods.
- the new protein has anticoagulant properties and can be used to prevent and treat vascular diseases such as heart attack, pulmonary embolism, arterial embolism and phlebothrobose. They are also suitable for the preservation of blood.
- vascular diseases such as heart attack, pulmonary embolism, arterial embolism and phlebothrobose. They are also suitable for the preservation of blood.
- One advantage for these uses is the low toxicity of the new protein.
- the new protein is also suitable for the immunization of grazing cattle against tick-specific proteins.
- neutralizing antibodies can disrupt ticks' food intake. This causes the ticks to leave the host and thus die. Examples 1 to 3
- TCA trichloroacetic acid
- This protein mixture (200 mg) was then taken up to a protein concentration of 20 mg / ml in phosphate-buffered saline, pH 5, and applied to a Q-Sepharose® column (Pharmacia Fine Chemicals, fast-f ow).
- the volume of the column was 10 ml.
- the column was equilibrated with the same buffer in which the sample was taken up. After washing the column with three column volumes of squilibration buffer, the column was eluted with a pH gradient.
- 10 column volumes of the wash buffer (pH 5.0) were slowly mixed with 10 column volumes of wash buffer (pH 1 to 3) using a gradient mixer. Under these conditions, the thrombin inhibitor eluted at pH 4.5.
- the protein was thus obtained in a pure and active form. It showed a molecular weight of 15,000 + 1000 in gel electrophoresis.
- the amino-terminal sequence of this protein is: SDYEFPPPKKSRPG. Its isoelectric point is pH 4 to 5.
- the protein which was homogeneous according to molecular weight and obtained according to Example 1 and identified by the thrombin inhibitor effect, was precipitated and dried as described in Example 1 by a 4-fold excess of cold acetone. The residue was then taken up in phosphate-buffered saline, pH 7.5 (protein concentration 20 mg / ml) and placed on a Mono-Q column (column volume 1 ml) equilibrated with the same buffer (approx. 0.1 mg) .
- the column was washed at a flow rate of 0.5 ml / min and then with a gradient of 150 mM NaCl to 350 M NaCl (2.5 ml each) and then of 350 mM NaCl to 450 mM NaCl (2.5 ml each) ), followed by 450 mM NaCl after 550 mM NaCl (10 ml each) and then eluted to 800 mM NaCl.
- the protein appeared between 350 mM NaCl and 550 mM NaCl.
- activity measured as thrombin inhibitor activity
- sequence analysis of all eluted proteins showed that they all have the same amino-terminal sequence and are therefore identical in terms of their primary structure.
- the inactive thrombin inhibitor fraction obtained in 2 was precipitated as described in Example 1 and taken up in a renaturation buffer which contained 8 M urea and 200 mM dithiothreitol (DTT). After 1 h at 37 ° C., the protein was dialyzed against 100 times the volume of phosphate-buffered saline (cut-off volume of the dialysis tube 10 kDa). After 2 h dialysis at 4 ° C., the protein was active and showed the same behavior on the Mono-Q column after elution through a salt gradient as the active fraction in Example 2.
- DTT dithiothreitol
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
l
NEUE PROTEINE GEEIGNET ZUR BEKÄMPFUNG VON KRANKHEITEN SOWIE ZUM SCHUTZ VON WEIDEVIEH GEGEN ZECKEN
Beschreibung
5 Die vorliegende Erfindung betrifft neue Proteine und deren Herstellung.
Es ist bereits bekannt, daß Blutegel einen die Blutgerinnung hemmende Substanz, das Hirudin, produzieren (vgl. The Merck Index, 10. Auflage, Nr. 4613). Hirudin ist ein Polypeptid mit dem Molekulargewicht von etwa 106.500.
Substanzen, die die Blutgerinnung hemmen, werden auch von anderen blut¬ saugenden Parasiten, z.B. den Zecken, produziert. Diese Substanzen sind aber bislang weder in reiner Form erhalten noch synthetisch hergestellt 5 worden (Naturwissenschaften 11, 30 (1961).
Es wurde nun ein neues Protein aus Zecken isoliert.
Gegenstand der Erfindung ist ein neues Protein welches ein Molekular- 0 gewicht von etwa 15.000 Dalton besitzt und am Aminoterminus die Amino¬ säuresequenz
SDYEFPPPKKXRPG
5 aufweist, worin X S oder N ist, sowie dessen Muteine.
Als Muteine sind Proteine zu verstehen, die sich von dem neuen Protein durch Austausch, Deletion und/oder Addition von Aminosäuren oder Peptiden in der Proteinkette entstehen, ohne daß sich dadurch die Wirkung des neuen 0 Proteins wesentlich verändert.
Das neue Protein läßt sich aus Zecken isolieren. Hierzu werden die Zecken in einem Puffer bei pH 6 bis 9, vorzugsweise 7,5, aufgenommen. Nach dem Homogenisieren der Mischung mit einem Homogenisator werden die unlöslichen 5 Bestandteile abzentrifugiert. Aus der so erhaltenen Lösung wird durch Zu¬ gabe von Trichloressigsäure bis zu einer Endkonzentration von 2,5 % un¬ wirksames Protein ausgefällt und durch Zentrifugieren entfernt. Aus der so erhaltenen Lösung werden etherlösliche Bestandteile durch Extraktion ent¬ fernt und anschließend das Protein mit kaltem Aceton ausgefällt. Das neue Protein läßt sich durch Ionenaustausch- und pH-Gradientenchromatographie aus dem ausgefälllten Produkt isolieren.
Das hier beschriebene Protein liegt in den Zecken in Konzentration zwischen 1 - 100 μg/kg vor. Um das Protein für pharmazeutische Zwecke in größeren Mengen verfügbar zu machen, kann man bekannte gentechnische Methoden (vgl. Maniatis, T. et al: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y., 1982) heranziehen. Für diesen Zweck muß zunächst die genetische Information für das neue Protein identifiziert und die entsprechende Nukleinsäure isoliert werden. Dazu wird das reine Protein mit Dithiothreitol reduziert, dann wird lodacetamid zur Derivati- sierung der freien SH-Gruppen zugesetzt und anschließend wird das so be- handelte Protein mit Bromcyan und Trypsin in kleine Peptide gespalten. Die Auftreπnung der Peptide erfolgt über reversed phase-Chromatographie. Die N-terminale Sequenzierung eines dieser gereinigten Peptide ergab die Sequenz SDYEFPPPKKSRPG.
Die vorhandenen Peptidsequenzen erlauben nun durch die Synthese entspre¬ chende Oligonukleotide eine eindeutige Identifizierung des Gens aus dem Genom oder aus entsprechenden c-DNA-Bänken durch sequenzspezifische Filterhybridisierung.
Die so erhaltene genetische Information für das Protein kann dann in verschiedene Wirtszellen, wie eukaryontische Zellen, Hefen, Bacillus subtilis oder E. coli nach bekannten Methoden zur Expression gebracht und das Protein so erhalten werden. In den eukaryotischen Zellen entsteht dabei das Protein in glykosylierter Form.
Die Muteine, die sich durch Austausch, Deletion oder Addition von Amino¬ säuren oder Peptiden von den neuen Proteinen ableiten, werden vorzugsweise nach gentechnischen Methoden dargestellt.
Das neue Protein besitzt blutgerinnungshemmende Eigenschaften und kann zur Prävention und Behandlung von Gefäßerkrankungen wie Herzinfarkt, Lungen- embolie, arterielle Embolie und Phlebothro bose eingesetzt werden. Weiter eignen sich zur Konservierung von Blut, on Vorteil für diese Verwendungen ist die niedrige Toxizität des neuen Proteins.
Weiter eignet sich das neue Protein zur Immunisierung von Weidevieh gegen zeckenspezifische Proteine. So kann durch neutralisierende Antikörper die Nahrungsaufnahme der Zecken gestört werden. Dadurch werden die Zecken zum Verlassen des Wirtes und damit zum Absterben gebracht.
Beispiel 1 bis 3
Beispiel 1
Reinigung des Thrombininhibitors
Eine im Labor bei 28°C und 80 % relativer Luftfeuchte gehaltene Kultur Lederzecken (Ornithodorus oubata) wurde in 14-tägigen Abständen dadurch gefüttert, daß sie an Kaninchen saugen konnten. Zecken aller Entwicklungs- Stadien vor oder nach der Fütterung wurden bei -20°C eingefroren und bei der anschließenden Aufarbeitung eingesetzt. 10 g Zecken wurden hierzu in 20 ml Phosphat-gepufferter Saline aufgenommen (20 mM Natriumphosphat, 150 mM NaCl, 1 M EDTA, pH 7,5 und bei 20°C homogenisiert. Die unlöslichen Bestandteile wurden durch Zentrifugation abgetrennt.
Der klare, rote überstand wurde mit Trichloressigsäure (TCA) bis zu einer Endkonzentration von 2, 5 % TCA versetzt. Es bildete sich ein massiger, roter Niederschlag der durch Zentrifugation abgetrennt wurde. Danach wurde die Lösung mit 1/10 ihres Volumens an Ether 3mal ausgeschüttelt. Die wäßrige Lösung wurde mit NaOH neutralisiert.
Dazu wurde das 4fache Volumen an kaltem (-78°C) Aceton gegeben. Die Lösung stand dabei in der Kälte auf Trockeneis. Es bildete sich im Verlauf von bis zu 24 h ein flockiges, weißes Präzipitat. Dieses wurde abzentrifugiert und im Exsikkator getrocknet. Die Ausbeute lag bei 1 % des Gewichts der eingesetzten Zecken. In der SDS-Gelelektrophorese zeigte dieses Produkt noch 10 bis 20 Proteinbanden im niedermolekularen Bereich bis 40 kDa nach Färbung mit Coomassie Brilliantblau. Der isoelektrische Punkt dieser Proteine lag zwischen pH 4 und pH 7.
Dieses Proteingemisch (200 mg) wurde nun zu einer Proteinkonzentration von 20 mg/ml in Phosphat-gepufferter Saline, pH 5, aufgenommen und auf eine Q-Sepharose® Säule (Pharmacia Fine Chemicals, fast-f ow) aufgetragen. Das Volumen der Säule betrug 10 ml. Die Säule wurde mit dem gleichen Puffer äquilibriert, in dem auch die Probe aufgenommen wurde. Nach Waschen der Säule mit drei Säulenvolumina Squilibrierungspuffer wurde die Säule mit einem pH-Gradienten eluiert. Dazu wurden 10 Säulenvolumina des Wasch¬ puffers (pH 5,0) über einen Gradientenmischer langsam mit 10 Säulen¬ volumina Waschpuffer (pH 1 bis 3) gemischt. Unter diesen Bedingungen elu- ierte der Thrombininhibitor bei pH 4,5. Das Protein wurde so in reiner und aktiver Form erhalten. In der Gelelektrophorese zeigte es ein Molekular¬ gewicht von 15.000 +_ 1000. Die aminoterminale Sequenz dieses Proteins lautet: SDYEFPPPKKSRPG. Sein isoelektrischer Punkt liegt bei pH 4 bis 5.
Beispiel 2
Trennung aktiver von inaktiven Thrombininhibitor-Molekülen.
Das nach Molekulargewicht homogene, nach Beispiel 1 erhaltene und durch Thrombininhibitor-Wirkung identifizierte Protein wurde wie in Beispiel 1 beschrieben durch den 4fachen Überschuß kalten Acetons gefällt und ge¬ trocknet. Danach wurde der Rückstand in Phosphat-gepufferter Saline, pH 7,5, aufgenommen (Proteinkonzentration 20 mg/ml) und auf eine mit dem gleichen Puffer äüquilibrierte Mono-Q-Säule (Säulenvolumen 1 ml) gegeben (ca. 0,1 mg). Die Säule wurde bei einer Fließgeschwindigkeit von 0,5 ml/min gewaschen und dann mit einem Gradienten von 150 mM NaCl nach 350 M NaCl (je 2,5 ml) und dann von 350 mM NaCl nach 450 mM NaCl (je 2,5 ml), gefolgt von 450 mM NaCl nach 550 mM NaCl (je 10 ml) und schließ- lieh auf 800 mM NaCl eluiert. Das Protein erschien zwischen 350 mM NaCl und 550 mM NaCl. Jedoch war Aktivität (gemessen als Thrombininhibitor- wirkung) nur mit einem Absorptionsmaximum bei 450 mM NaCl verbunden. In der Sequenzanalyse aller eluierten Proteine zeigte sich jedoch, daß alle die gleiche aminoterminale Sequenz haben, somit hinsichtlich ihrer Primärstruktur identisch sind.
Beispiel 3
Renaturierung der inaktiven Thrombininhibitormoleküle
Die in 2 erhaltene, inaktive Thrombininibitorfraktion wurde wie in Bei¬ spiel 1 beschrieben gefällt und in einem Renaturierungspuffer aufgenommen, der 8 M Harnstoff und 200 mM Dithiothreitol (DTT) enthielt. Nach 1 h bei 37°C wurde das Protein gegen das lOOfache Volumen Phosphat-gepufferte Saline dialysiert (Ausschlußvolumen des Dialyseschlauchs 10 kDa). Nach 2 h Dialyse bei 4°C war das Protein aktiv und zeigte auf der Mono-Q-Säule nach Elution durch einen Salzgradienten das gleiche Verhalten wie die aktive Fraktion in Beispiel 2.
Claims
1. Protein, gekennzeichnet durch die N-terminale Aminosäuresequenz SDYEFPPPKKXRPG, worin X S oder N ist, und das Molekulargewicht von
5 etwa 15.000 Dalton, sowie dessen Muteine.
2. Protein gemäß Anspruch 1 zur Verwendung bei der Bekämpfung von Krankheiten.
103. Verwendung des Proteins gemäß Anspruch 1 zur Herstellung von
Antikörpern gegen Zeckenbefall bzw. zur Immunisierung von Weidevieh gegen Zeckenbefall.
4. Verfahren zur Herstellung des Proteins gemäß Anspruch 1, dadurch 15 gekennzeichnet, daß man
a) Zecken homogenisiert, aus dem Homogenisat die unlöslichen Be¬ standteile entfernt, aus dem überstand durch Fällung mit Tri- chloressigsäure unwirksame Proteine ausfällt und das in Lösung 0 gebliebene Protein nach Ausfällung mit Aceton einer Chromato¬ graphie unterwirft oder
b) das Protein nach bekannten gentechnischen Methoden herstellt.
5
0
5
0
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE3931839 | 1989-09-23 | ||
DE3931839A DE3931839A1 (de) | 1989-09-23 | 1989-09-23 | Neue proteine und ihre herstellung |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
EP0493494A1 true EP0493494A1 (de) | 1992-07-08 |
Family
ID=6390068
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
EP90914720A Withdrawn EP0493494A1 (de) | 1989-09-23 | 1990-09-18 | Neue proteine geeignet zur bekämpfung von krankheiten sowie zum schutz von weidevieh gegen zecken |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0493494A1 (de) |
JP (1) | JPH05500809A (de) |
CA (1) | CA2054190A1 (de) |
DE (1) | DE3931839A1 (de) |
WO (1) | WO1991004275A1 (de) |
Families Citing this family (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE4134814A1 (de) * | 1991-10-22 | 1993-04-29 | Basf Ag | Neues thrombininhibitorisches protein aus zecken |
DE4136087A1 (de) * | 1991-10-31 | 1993-05-06 | Basf Ag, 6700 Ludwigshafen, De | Neues thrombininhibitorisches protein aus zecken |
DE4136513A1 (de) * | 1991-11-06 | 1993-05-13 | Basf Ag | Neues thrombininhibitorisches protein aus raubwanzen |
US5321010A (en) * | 1991-12-10 | 1994-06-14 | Merck & Co., Inc. | Proteins for inhibiting adhesion of platelets to collagen |
US5876971A (en) * | 1992-12-04 | 1999-03-02 | Schering Aktiengesellschaft | Thrombin inhibitor from the saliva of protostomia |
CN115553287B (zh) * | 2022-10-27 | 2023-08-08 | 北京标驰泽惠生物科技有限公司 | 一种蜱虫保存液及其制备方法和应用 |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
ZM5186A1 (en) * | 1985-07-03 | 1986-12-29 | Coopers Animal Health | Tick vaccine |
DE3819078A1 (de) * | 1988-06-04 | 1989-12-07 | Hoechst Ag | Amblyommin, ein neuer wirkstoff fuer die antikoagulationstherapie |
-
1989
- 1989-09-23 DE DE3931839A patent/DE3931839A1/de not_active Withdrawn
-
1990
- 1990-09-18 JP JP2513587A patent/JPH05500809A/ja active Pending
- 1990-09-18 WO PCT/EP1990/001578 patent/WO1991004275A1/de not_active Application Discontinuation
- 1990-09-18 EP EP90914720A patent/EP0493494A1/de not_active Withdrawn
- 1990-09-18 CA CA002054190A patent/CA2054190A1/en not_active Abandoned
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
See references of WO9104275A1 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPH05500809A (ja) | 1993-02-18 |
CA2054190A1 (en) | 1991-03-24 |
DE3931839A1 (de) | 1991-04-04 |
WO1991004275A1 (de) | 1991-04-04 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
EP0207956B1 (de) | Hirudin-pa und dessen derivate, verfahren zu deren herstellung und deren verwendung | |
EP0471701B2 (de) | Neue proteine mit tnf-hemmender wirkung und ihre herstellung | |
DE69028671T2 (de) | Löslisches extrazellulares Fragment des menschlischen IFN-beta 2/IL-6-Rezeptors, seine Herstellung und diesen Fragment enthaltende pharmazeutische Mischung | |
DE3689191T2 (de) | Gereinigtes protein mit angiogenischer wirkung und dessen herstellung. | |
DE2429191A1 (de) | Isolierung von koagulationsfaktoren aus biologischem material | |
DE3886175T2 (de) | Trigramin, ein Polypeptid, das die Aggregation der Blutplättchen hemmt. | |
DE68918246T2 (de) | Verbindungen zur Verhinderung von Thrombose. | |
EP0101063B1 (de) | Neues Polypeptid mit Wirkung auf das Immunsystem, Verfahren zu seiner Isolierung und Reinigung, seine Verwendung und dieses enthaltende Mittel | |
DE3587526T2 (de) | Serinproteaseinhibitoren und isolierungsverfahren dazu. | |
DE69429062T2 (de) | Thrombin-inhibitoren | |
EP0493494A1 (de) | Neue proteine geeignet zur bekämpfung von krankheiten sowie zum schutz von weidevieh gegen zecken | |
DE69735694T2 (de) | Polypeptide mit L-Asparaginase Aktivität | |
DE2457047C3 (de) | Verfahren zur Herstellung eines Derivates der leichten Kette des Tetanustoxins, dessen Verwendung zur Tetanusprophylaxe | |
EP0345614B1 (de) | Amblyommin, ein neuer Wirkstoff für die Antikoagulationstherapie | |
DE2715748C3 (de) | Gereinigte aktive Verbindung des Plasminogen-Typs menschlichen Ursprungs und ihre Verwendung | |
DE3124384A1 (de) | Dermatanpolysulfat, verfahren zu dessen herstellung und dieses enthaltendes virushemmendes mittel | |
DE3914354C1 (de) | ||
DE3850407T2 (de) | Protein mit inhibierender wirkung auf die entzündungserregende phospholipase a2. | |
EP0610246B1 (de) | Neues thrombininhibitorisches protein aus zecken | |
DE4136513A1 (de) | Neues thrombininhibitorisches protein aus raubwanzen | |
EP0609242B1 (de) | Neues thrombininhibitorisches protein aus zecken | |
DE3835815A1 (de) | Neue isohirudine | |
DE69921505T2 (de) | Serinprotease-inhibitor | |
DE3213963A1 (de) | Neurotropher faktor | |
DE3426049A1 (de) | Humaner-tumor-nekrose-faktor |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PUAI | Public reference made under article 153(3) epc to a published international application that has entered the european phase |
Free format text: ORIGINAL CODE: 0009012 |
|
17P | Request for examination filed |
Effective date: 19911026 |
|
AK | Designated contracting states |
Kind code of ref document: A1 Designated state(s): AT BE CH DE ES FR GB IT LI NL |
|
STAA | Information on the status of an ep patent application or granted ep patent |
Free format text: STATUS: THE APPLICATION HAS BEEN WITHDRAWN |
|
18W | Application withdrawn |
Withdrawal date: 19930908 |