DE69921505T2 - Serinprotease-inhibitor - Google Patents

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Description

  • Diese Erfindung betrifft ein Protein und Zusammensetzungen, die es enthalten. Insbesondere betrifft sie ein Protein, das unter anderem eine Aktivität als Metallkationenbindungsmittel und als Antithrombinmittel zeigt.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Thrombin ist eine Serinprotease, die an der Blutgerinnung beteiligt ist. Sie weist eine Spezifität für die Spaltung von Argin-Lysin-Bindungen sowie die Spaltung eine Arginin-Threonin-Bindung in Pro-Thrombin auf, wodurch Prä-Thrombin freigesetzt wird, das anschließend gespalten wird, um aktives Thrombin zu erzeugen. Dieses aktive Thrombin kann dann mehr Thrombin aus Pro-Thrombin freisetzen. Bei der Blutverklumpung und der Gerinnung spaltet Thrombin Fibrinopeptid B aus Fibrinogen sowie es die Blutfaktoren IX in IXa, V in Va, VIII in VIIIa und XIII in XIIIa umwandelt.
  • Inhibitoren des Thrombins behindern daher die Koagulation und weisen eine Verwendbarkeit in jedem Verfahren auf bei dem die Koagulation unerwünscht ist. Eine solche Verwendbarkeit besteht in der Sammlung und Lagerung von Blutprodukten. Eine andere ist in Medikamenten für die Verhinderung oder Verringerung der Koagulation beispielsweise bei der Behandlung oder Vorbeugung von Herzfehlfunktionen.
  • Anti-Thrombinmittel sind bekannt. Ein Beispiel ist Anti-Thrombin-III (AT-III). AT-III ist jedoch nur in Gegenwart von Heparain dazu in der Lage, effizient Thrombin zu inhibieren.
  • Die Anmelder haben nunmehr ein neues Protein identifiziert, das eine Spanne von Aktivitäten aufweist, die eine Anti-Thrombinaktivität umfaßt und daß, wenn es gegenüber Thrombin aktiv ist, Heparin nicht als Kofaktor benötigt. Auf dieses Protein ist die vorliegende Erfindung breit gerichtet.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • In einem ersten Aspekt stellt die Erfindung ein isoliertes Protein zur Verfügung, das ein Molekulargewicht von etwa 55 kDa und eine Aminosäuresequenz aufweist, die eines oder mehrere der folgenden umfaßt:
    • (a) DGEQCNDGQN (SEQ ID NR: 1);
    • (b) QGGHEVESERVACCVIGRA (SEQ ID NR: 2);
    • (c) GQSHPEIVH (SEQ ID NR: 3);
    • (d) YHGHDDA (SEQ ID NR: 4);
    • (e) VVNEVHH (SEQ ID NO: 5);
    oder ein aktives Fragment davon.
  • In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein isoliertes Protein zur Verfügung, das die Aminosäuresequenz
    Figure 00020001
    oder ein aktives Fragment davon umfaßt.
  • In noch einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein isoliertes Protein zur Verfügung, das aus dem Haemolymph von Perna canaliculus erhältlich ist, das ein durch PAGE bestimmtes scheinbares Molekulargewicht von 75 kDa aufweist, und das eine Aktivität als einen Serinproteaseinhibitor und/oder ein zweiwertige Kationen-bindender Wirkstoff aufweist oder ein aktives Fragment davon.
  • Geeigneterweise weißt das Protein oder Fragment davon eine Aktivität als:
    • (i) ein Serinproteasehemmer oder
    • (ii) ein zweiwertige Kationen-bindender Wirkstoff.
    auf.
  • Die Erfindung stellt des weiteren ein Protein zur Verfügung, das aus Perna canaliculus oder einem anderen Schalentier als Perna canaliculus erhätlich ist und das eine funktionell äquivalente Variante eines oben beschriebenen Proteins oder Fragments darstellt, indem es immunologisch mit einem oben beschriebenen Protein oder Fragment kreuzreaktiv ist und mindestens dieselbe Serinproteasehemmungs- und/oder zweiwertige Kationen-bindende Aktivität, wie das oben beschriebene Protein oder Fragment davon aufweist.
  • In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein Polynukleotid zur Verfügung, das für ein wie oben definiertes Protein oder Fragment kodiert.
  • Das Polynukleotid kann die folgende Nukleotidsequenz
    Figure 00030001
    Figure 00040001
    oder eine Variante davon umfassen.
  • Die Erfindung stellt auch Polynukleotide zur Verfügung, die eine Nukleotidsequenz SEQ ID NR: 8 aufweisen sowie Polynukleotide, die unter stringenten Bedingungen an ein wie oben definiertes Polynukleotid hybridisieren.
  • Des weiteren stellt die Erfindung einen Vektor oder ein Konstrukt zur Verfügung, das ein wie oben definiertes Polynukleotid umfaßt, sowie eine Wirtszelle, die ein wie oben definiertes Polynukleotid exprimiert.
  • In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung eine Zusammensetzung zur Verfügung, die ein wie oben definiertes Protein oder Fragment umfaßt.
  • Die Zusammensetzung kann ein Medikament, ein Lebensmittel, ein Nahrungsergänzungsmittel, (gegebenenfalls umfassend ein Protein oder Fragment, das mit mindestens einem zweiwertigen Kation mit Bedeutung für die Ernährung, wie Kalzium, Magnesium oder Zink assoziiert oder daran gebunden ist) oder ein Bioremediations-Wirkstoff sein.
  • Beschreibung der Zeichnungen
  • Während die vorliegende Erfindung wie oben definiert bereit ist, umfaßt sie auch Ausführungsformen für die die folgende Beschreibung Beispiele zur Verfügung stellt. Insbesondere kann ein besseres Verständnis der vorliegenden Erfindung durch den Verweis auf die beigefügten Zeichnungen erhalten werden, in denen
  • 1: Reinigung von Pernin aus dem Muschel-Haemolymph
    • a) Lichtstreuungsbande nach der Zentrifugation von P. canaliculus Haemolymph in CsCl; das Haemolymph wurde zuerst bei niedriger Geschwindigkeit zentrifugiert, um Haemozyten zu entfernen und dann bei hoher Geschwindigkeit; der erneut suspendierte Niederschlag wurde dann in CsCl zentrifugiert.
    • b) Das UV-Absorptionsprofil (245 nm Wellenlänge) aus einer Fraktionierung des CsCl-Gradienten; das Licht-streuende Material in der 1a erscheint als Signalspitze.
    • c) Die Proteinzusammensetzung in 1 ml Fraktionen des CsCl-Gradienten nach einer Elektrophorese in einem 12% Polyacrylamidgel; die stark gefärbten (Coomassie) Banden stimmen mit der Position der Licht-streuenden und UV-absorbierenden Region des Gradienten überein; beim Vergleich mit Polypeptidmolekulargewichtsstandards (Spur 6) betrug das Molekulargewicht ungefähr 75 kDa (siehe 4a für Standards). Die Spuren 1-5 und 7-9 enthielten Proben aus dem CsCl Gradienten.
  • 2: Virus-ähnliche Partikel, die durch Durchlichtelektronenmikroskopie des Materials in der lichtstreuenden Bande in einem CsCl-Gradienten beobachtet werden. Der Balken in der Mikroabbildung stellt 100 nm dar.
  • 3: Das HPLC-Elutionsprofil von Pernin bei 280 nm Wellenlänge gereinigt durch CsCl-Gradientenzentrifugation.
  • 4: Die SDS-PAGE-Profile (12% Gele) von aneinanderhaftenden Proteinspezies aus P. canaliculus und anderen Schalentierspezies
    • a) Proteine, die aus ganzen Schalentier extrahiert wurden und wie in Material und Methoden gereinigt wurden: Spur 1: Molekulargewichtsstandards (Bio-Rad, USA); pb Phosphorylase B, 97,4 kDa; bsa Rinderserumalbumin, 66 kDa; ova Ovalbumin, 45 kDa; ca Kohlensäureanhydrase, 31 kDa; Spur 2: GreenshellTM Muschel P. canaliculus; Spur 3: blaue Muschel Mytilis edulis; Spur 4: Auster Crassostrea gigas; Spur 5: Muschel Paphies australis.
    • b) PAGE-Analyse humanen Transferrins (Sigma, USA, MW ca. 80 kDa), ein glykosyliertes Protein und Pernin aus P. canaliculus nach der Behandlung mit Endoglycosidase-F: Spur 1: unbehandeltes Transferrin; Spur 2: Transferrin, das mit Glykosidase-F behandelt wurde; Spur 3: unbehandeltes Pernin; Spur 4: Pernin, das mit Glykosidase-F behandelt wurde.
  • 5: Aktivität des P. canaliculus Haemolymphproteins nach der Zentrifugation in einem 30 kDa Molekulargewichtsausschlußfilters für 10 min bei 1000 g (Ultrafree-MC filter, 30,000 MW Ausschluß, Millipore, USA)
    • a) SDS-PAGE-Profil des Haemolymphproteins in verschiedenen Stadien der Reinigung. Spur 1: „roh" Haemolymph (Haemocyten entfernt); Spur 2: wieder suspendierter Niederschlag unter Zentrifugation des „rohen" Haemolymphs nach 80 Min. bei 250.000 g; Spur 3: Perninrückstand; Spur 4: Filtrat (kein Protein erkennbar); Spur 5: Molekulargewichtsmarker, (siehe 4a); Spur 6,7: 10-fach Verdünnungen der Proben aus den Spuren 2 und 3.
    • b) Anti-Thrombinaktivität des 30.000 MW Ausschlußfilterrückstands und des Filtrats. con+ = die Standard 1/41 Verdünnung menschlichen Plasmas (d.h. Standardanti-Thrombin III Aktivität); con– = Thrombin ohne hinzugefügtes Plasma (Pufferkontrolle); Filtrat: Material, das durch einen 30.000 MW Ausschlußfilter durchfloß; Rückstand: Perninprotein, das im Ausschlußfilter zurückgehalten wurde.
  • BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Wie oben breit dargestellt, stellt die Erfindung in einem Aspekt ein neues Protein zur Verfügung. Das Protein der Erfindung hat auf der Grundlage der Polyakrylamidgelelektrophorese (PAGE) berechnet ein scheinbares Molekulargewicht von 75 kDa. Das aus der Gensequenz abgeleitete Molekulargewicht beträgt ungefähr 55 kDa.
  • Ein spezifisches Protein der Erfindung wurde anfänglich als ein Extrakt aus der neuseeländischen grünlippigen Muschel P. canaliculus identifiziert. Es ist daher durch Extraktion direkt aus P. canaliculus erhältlich.
  • Das Protein hat die Aminosäuresequenz der SEQ ID NR. 7
  • Das Protein der Erfindung kann seine gesamte native Aminosäuresequenz oder nur Teile dieser Sequenz umfassen, wenn solche Teile Fragmente darstellen, die biologisch aktiv bleiben (aktive Fragmente). Eine solche Aktivität wird normalerweise ein Serinproteasehemmer oder ein zweiwertiger Kationen-bindender Wirkstoff sein, ist aber nicht auf diese Aktivitäten beschränkt.
  • Die Erfindung umfaßt in ihrem Umfang funktionell äquivalente Varianten des Proteins der SEQ ID NR.7.
  • Der Begriff „funktionell äquivalente Varianten" erkennt, daß es möglich ist, die Aminosäuresequenz eines Proteins zu verändern, während eine im wesentlichen äquivalente Funktionalität bewahrt wird. Beispielsweise kann ein Protein als ein funktionelles Äquivalent eines anderen Proteins für eine spezifische Funktion angesehen werden, wenn das äquivalente Protein immunologisch kreuzreaktiv mit und im wesentlichen dieselbe Funktion wie das ursprüngliche Protein hat.
  • Das funktionell äquivalente Protein braucht nicht dieselbe Größe wie das Original aufzuweisen. Das Äquivalent kann beispielsweise ein Fragment des Proteins, eine Fusion des Proteins mit einem anderen Protein oder Träger oder eine Fusion eines Fragments mit weiteren Aminosäuren sein. Es ist auch möglich Aminosäuren in einer Sequenz mit gleichwertigen Aminosäuren unter Verwendung üblicher Verfahren zu ersetzen. Die Aminosäuregruppen, die normalerweise als äquivalent angesehen werden, sind:
    • (a) Ala, Ser, Thr, Pro, Gly;
    • (b) Asn, Asp, Glu, Gln;
    • (c) His, Arg, Lys;
    • (d) Met, Leu, Ile, Val; und
    • (e) Phe, Tyr, Trp.
  • Die Polypeptidsequenzen können miteinander abgeglichen werden und der Prozentsatz der identischen Aminosäuren in einer bestimmten Region kann gegenüber einer anderen Sequenz unter Verwendung von Computeralgorithmen, die öffentlich erhältlich sind, bestimmt werden. Die Ähnlichkeit von Polypeptidsequenzen kann unter Verwendung des BLASTP-Algorithmus untersucht werden. Die BLASTP-Software ist auf dem anonymen NCBI FTP-Server (ftp://ncbi.nlm.nih.gov) unter /blast/executables/ erhältlich. Die Verwendung der Algorithmen der BLAST-Familie, die BLASTP umfaßt, wird auf NCBI's Website unter dem URL http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/newblast.html und in der Publikation von Altschul, Stephen F., et al. (1997), „Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25: 3389-34023 beschrieben.
  • Das Protein der Erfindung kann zusammen mit seinen aktiven Fragmenten und anderen Varianten durch synthetische oder rekombinante Mittel erzeugt werden. Synthetische Polypeptide, die weniger als 100 Aminosäuren und im allgemeinen weniger als 50 Aminosäuren aufweisen, können durch Verfahren, die dem Fachmann gut bekannt sind, hergestellt werden. Beispielsweise können solche Peptide unter Verwendung jeder der kommerziell erhältlichen Festphasentechniken wie des Merryfield-Festphasensyntheseverfahrens, wobei die Aminosäuren sequentiell an eine wachsende Aminosäurekette angefügt werden, synthetisiert werden (siehe Merryfield, J. Am. Chem. Soc 85: 2146-2149 (1963)). Ausrüstungen für die automatische Synthese von Peptiden sind kommerziell von Anbietern wie Perkin Elmer/Applied Biosystems, Inc. erhältlich und können gemäß den Empfehlungen des Herstellers bedient werden.
  • Das Protein oder ein Fragment oder eine Variante davon kann auch rekombinant durch die Einführung einer Polynukleotidsequenz (üblicherweise DNA), die für das Protein kodiert, in einen Expressionsvektor und durch die Expression des Proteins in einem geeigneten Wirt hergestellt werden. Jeder einer Vielzahl von Expressionsvektoren, die im Stand der Technik bekannt sind, können verwendet werden. Die Expression kann in jeder geeigneten Wirtszelle erreicht werden, die mit einem Expressionsvektor, der ein DNA-Molekül enthält, das für das rekombinante Protein kodiert, transformiert oder transfiziert wurde. Geeignete Wirtszellen umfassen Prokaryoten, Hefen und höhere eukaryotische Zellen. Vorzugsweise sind die verwendeten Wirtszellen E. coli, Hefen oder eine Säugetierzellinie wie COS oder CHO oder eine Insektenzellinie wie SF9 unter Verwendung eines Baculovirusexpressionsvektors. Die DNA-Sequenz, die in dieser Weise exprimiert wird, kann das natürlich vorkommende Protein, Fragmente des natürlich vorkommenden Proteins oder für Varianten davon kodieren.
  • Die DNA-Sequenzen, die für das Protein oder Fragmente kodieren, können durch das Durchsuchen einer geeigneten P. canaliculus cDNA oder genomischen DNA-Bibliothek nach DNA-Sequenzen, die mit einem degenerierten Oligonukleotid hybridisieren, das aus einer Teilaminosäuresequenz des Proteins abgeleitet ist, erhalten werden. Geeignete degenerierte Oligonukleotide können entworfen werden und durch Standardverfahren synthetisiert werden und die Durchsuchung kann wie beispielsweise in Maniatis et al. Molecular Cloning – A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratories, Cold Spring Harbour, NY (1989) durchgeführt werden. Die Polymerasekettenreaktion (PCR) kann verwendet werden, um eine Nukleinsäuresonde aus genomischer DNA, einer cDNA oder einer genomischen DNA-Bibliothek zu isolieren. Das Durchsuchen der Bibliothek kann unter Verwendung der isolierten Sonde durchgeführt werden.
  • Varianten des Proteins können unter Verwendung von Standardmutageneseverfahren, wie der Oligonukleotid-gesteuerten ortsspezifischen Mutagenese hergestellt werden.
  • Ein spezifisches Polynukleotid der Erfindung hat die folgende Nukleotidsequenz der SEQ ID NR. 6:
  • Figure 00090001
  • Figure 00100001
  • Ein weitere Polynukleotid hat die folgende Sequenz SEQ ID NR. 8:
    Figure 00100002
    Figure 00110001
    wobei TGA das Opal Stopcodon und AATAAA das Polyadenylierungssignal ist.
  • Varianten oder Homologe der obigen Polynukleotidsequenzen bilden auch einen Teil der vorliegenden Erfindung. Die Polynukleotidsequenzen können aneinander angeordnet werden und der Prozentsatz der identischen Nukleotide in einer bestimmten Region gegenüber einer anderen Sequenz unter Verwendung von öffentlich erhältlichen Computeralgorithmen bestimmt werden. Zwei beispielhafte Algorithmen für die Anordnung und Identifizierung der Ähnlichkeit von Polynukleotidsequenzen sind die BLASTN- und FASTA-Algorithmen. Die BLASTN-Software ist auf dem anonymen NCBI FTP-Server (ftp://ncbi.nlm.nih.gov) unter /blast/executables/ erhältlich. Der BLASTN Algorithmus Version 2.0.4 [24. Feb. 1998] auf die Standardparameter eingestellt, die in der Dokumentation beschrieben und mit dem Algorithmus verteilt werden, ist für die Verwendung bei der Bestimmung von Varianten gemäß der vorliegenden Erfindung bevorzugt. Die Verwendung der Familie der BLAST-Algorithmen, die BLASTN umfassen, wird auf der NCBI Website unter URL http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/newblast.html und in der Publikation von Altschul, Stephen F. et al. (1997) „Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25. 3389-3402 beschrieben. Der Computeralgorithmus FASTA is auf der ftp-Seite ftp://ftp.virginia.edu.pub/fasta/ erhältlich. Die Version 2.0u4 vom Februar 1996, auf die in der Dokumentation beschriebenen und mit dem Algorithmus verbreiteten Standardparameter eingestellt, ist für die Verwendung bei der Bestimmung von Varianten gemäß der vorliegenden Erfindung bevorzugt. Die Verwendung des FASTA-Algorithmus wird in W. R. Pearson und D. J. Lipman, „Improved Tools for Biological Sequence Analysis", Proc. Natl. Acad. Sci. LISA 85: 2444-2448 (1988) und W. R. Pearson, „Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA", Methods in Enzymology 183: 63-98 (1990) beschrieben.
  • Alle Sequenzen, die wie oben identifiziert werden, eignen sich als "Varianten" sowie der Begriff hierin verwendet wird.
  • Variante Polynukleotidsequenzen werden im allgemeinen an die wiedergegebene Polynukleotidsequenzen unter stringenten Bedingungen hybridisieren. Wie hierin verwendet bezeichnen „stringente Bedingungen" ein Vorwaschen in einer Lösung aus 6X SSC, 0,2% SDS; Hybridisierung bei 65°C, 6X SSC, 0,2% SDS über Nacht; gefolgt von zwei Waschungen bei 30 Min. jeweils in 1X SSC, 0,1% SDS bei 65°C und zwei Waschungen für 30 Min. jede in 0,2 X SSC, 0,1% SDS bei 65°C. Solche hybridisierbaren Sequenzen umfassen die, die für äquivalente Proteine anderen Quellen als P. canaliculus (wie Schalentiere) kodieren.
  • Während die obigen synthetischen oder rekombinanten Ansätze verwendet werden können, um das Protein der Erfindung herzustellen, ist es jedoch praktikabel (und tatsächlich gegenwärtig bevorzugt) das Protein durch die Isolation aus P. canaliculus zu erhalten. Dies spiegelt die Beobachtungen des Anmelders wider, daß das Protein, das vorherrschende Protein des Haemolymphs von P. canaliculus ist und daß dieses Protein selbstaggregierend ist. Es kann daher in kommerziell bedeutenden Mengen direkt aus der Muschel selbst isoliert werden. Beispielsweise können ungefähr 2 mg Protein pro ml Haemolymph erhalten werden.
  • Sobald es erhalten wurde, kann das Protein wenn gewünscht ohne weiteres gereinigt werden. Dies wird im allgemeinen eine Zentrifugation beinhalten, bei der die selbstaggregierende Na tur des Proteins wichtig ist. Andere Ansätze für die Reinigung (z.B. Chromatographie) könne jedoch auch verfolgt werden.
  • Des weiteren können, wenn es als wünschenswert erachtet wird, weitere Reinigungsschritte unter Verwendung von Ansätzen, die im Stand der Technik üblich sind, eingesetzt werden. Diese Ansätze sind vollständig dazu in der Lage, eine hochreine Zubereitung des Proteins zu ergeben.
  • Sobald es erhalten ist, kann das Protein und/oder seine aktiven Fragmente in einer Zusammensetzung formuliert werden. Die Zusammensetzung kann beispielsweise eine therapeutische Zusammensetzung für die Anwendung als ein Pharmazeutikum sein oder kann ein Gesundheits- oder Nahrungsergänzungsmittel sein. Wiederum können Standardansätze für die Formulierungen solcher Zusammensetzungen verwendet werden.
  • Des weiteren kann die Zusammensetzung ein Lebensmittel sein, in dem das Protein und/oder seine aktiven Fragmente enthalten sind. Dies kann durch das Hinzufügen des Proteins zu einem vorzubereiteten Nahrungsmittel oder durch das Aufnehmen des Proteins in einen Schritt des Herstellungsprozesses für das Nahrungsmittel stattfinden.
  • Die Erfindung wird nunmehr umfassender in dem folgenden Experimentalteil, der lediglich für veranschaulichende Zwecke zur Verfügung gestellt wird, beschrieben werden.
  • EXPERIMENTALTEIL
  • Teil 1
  • A. Materialien und Methoden
  • A.1 Schalentier:
  • Perna canaliculus (die neuseeländische grünlippige Muschel; die GreenshellTM-Muschel) wurden in Einzelhandelssupermärkten oder direkt von Muschelfarmern erhalten; andere Schalentierspezies mit Ausnahme der blauen Muschel Mytili edulis, die von Sanford's Fisheries (Havelock, Neuseeland) angeliefert wurde, wurden vom Einzelhandel erhalten.
  • A.2 Die Extrakte:
  • Muschelextrakte wurden durch die Homogenisierung gesamter, enthültster Muscheln (bis zu 120 mm Länge) in einer gewerblichen Küchenmaschine unter Zusatz von 0,02 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,2, homogenisiert. Dichlormethan (1/2 Volumen) wurde mit dem wäßrigen Extrakt gemischt, bei niedriger Geschwindigkeit (6000 rpm, GSA-Rotor, Sorvall RC-5B Zentrifuge bei 4°C) zentrifugiert. Polyethylenglykol (PEG) (MW 6000) wurde zu der wäßrigen Phase bis zu einer Endkonzentration von 10% (w/v) und NaCl auf 0,5 M hinzugefügt und bei 4-6°C über Nacht gerührt. Nach der Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit wurde das PEG-Präzipitat in ungefähr 1/10 Volumen Natriumphosphatpuffer resuspendiert. Nach einem weiteren Zentrifugationszyklus mit niedriger Geschwindigkeit wurde der Überstand mit hoher Geschwindigkeit (50.000 rpm in einem Beckman 60Ti-Rotor bei 4°C für 60-80 Min.) zentrifugiert. Der sich ergebende Niederschlag wurde in einem kleinem Volumen Phosphatpuffer resuspendiert und durch Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit geklärt.
  • A.3 Polyacrylamidgelelektrophorese:
  • 12% Polyacrylamidgele (8 × 10 cm; 1 mm dick) wurden unter Verwendung einer vorbereiteten Stammlösung gemäß dem Herstellerinstruktionen (40% Acrylamid/Bis-Lösung 37,5:1, Bio-Rad, USA) hergestellt, käuflich erhältliche 12% Gele (Bio-Rad, USA) wurden auch verwendet. Proben (10 μl) wurden auf die Spuren aufgetragen und die Gele wurden bei 160 V unter Verwendung eines Standard Tris/Glycine/SDS-Puffers (Bio-Rad, Katalog 161-0732) laufen gelassen, bis der Bromphenol Blaumarker den Boden des Gels erreichte. Die Gele wurden mit BM Fast Stain Coomassie® (Boehringer Mannheim, Deutschland) gefärbt und gemäß den Herstellerinstruktionen entfärbt.
  • A.4 Glykosylierungstest:
  • Proben wurden mit N-Glykosidase F (PNGase F aus Flavobacterium meningosepticum; Boehringer Mannheim Biochemica, Deutschland) gemäß den Herstelleranweisungen behandelt. Behandelte und unbehandelte Proben wurden auf einem standard 12% Polyacrylamidgel laufen gelassen.
  • A.5 Isopycnische Gradienten:
  • Die CsCl-Lösungen (Boehringer Mannheim, Deutschland) wurden in 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,2, zubereitet und zur Klärung durch eine 0,22 μm Membran (Acrodisc, Gelman Sciences, USA) filtriert. Zweistufengradienten (1,25 g/cc eine obere Schicht, die die Probe enthielt, und 1,45 g/cc einer unteren Schicht) wurden wie durch Scotti (1985) beschrieben, hergestellt und für ungefähr 17 Stunden bei 20°C in einem Beckman 70Ti-Rotor bei 30.000 rpm zentrifugiert. Der sich ergebende Gradient wurde durch das Einführen einer 100 μl Glas Kapillarröhre in den Gradienten und das langsame Auspumpen des Inhalts fraktioniert. Die UV-Absorption wurde durch das Hindurchführen durch ein Uvicord Spektrophotometer (LKB Produkter, Sweden) überwacht. Die Fraktionen wurden gesammelt und die Brechungsindizes unter Verwendung eines Abbé Refraktometers (Bellingham and Stanley, UK) gemessen und die Dichte unter Verwendung von Regressionsgleichungen gemäß dem Verfahren von Scotti (1985) abgeschätzt.
  • A.6 Poröse Glaschromatographie:
  • Kontrolliert poröses Glas (CPG 240-80, Sigma Chemical Co., USA) wurde gemäß den Zuliefererinstruktionen behandelt. Eine 1 cm × 100 cm Säule (Bio-Rad, USA) wurde hergestellt. Die Proben (1-2 ml) wurden auf die Säule geladen und mit 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,2, durch ein Uvicord Spektrophotometer eluiert, die Fraktionen wurden in gleichmäßigen Intervallen gesammelt.
  • A.7 Abschätzungen der Proteinkonzentration:
  • Die Konzentrationen wurden unter Verwendung eines Rinderserumalbuminstandards (BSA mit Blot-Qualität, Promega, USA) durch UV-Absorption gemäß dem Verfahren von Layne (1957) unter Verwendung der Gleichung: mg/ml Protein = 1,55·A280 – 0,76·A260 abgeschätzt. Alternativ wurden die Konzentrationen durch die Bradford-Reaktion unter Verwendung der Reagenz, die durch Bio-Rad (USA) geliefert wird, bei einer Wellenlänge von 620 nm abgeschätzt.
  • A.8 Hochleistungsflüssigchromatographie:
  • HPLC mit umgekehrter Phase wurde auf einem HP 1050 Ti-Serien HPLC (Hewlett Packard, USA), der mit einer analytischen 300 Å Vydac C-18 Säule, 25 cm × 4,6 mm i.D. ausgerüstet war, durchgeführt. Die 10 μl Probe in Wasser wurde mit einem 0-100% Acetonitrilgradienten in Wasser (v/v) über 60 Min. eluiert und die Absorption bei 218 und 280 nm wurde aufgezeichnet.
  • B. Ergebnisse
  • Eine Licht-streuende Bande wurde nach der Zentrifugation der Extrakte aus ganzen GreenshellTM Muscheln in CsCl-Gradienten gesehen (1a und 1b). Die Dichte dieser Bande wurde auf 1,36 g/cc geschätzt. Eine kleinere Bande wurde manchmal bei ungefähr 1,390 g/cc beobachtet. Wenn sie erneut in CsCl gebandet wurde, führte die 1,390 Bande zu zwei Banden – eine bei 1,390 g/cc und eine zweite bei 1,368 g/cc. Die SDS-PAGE-Analyse der Fraktionen von beiden Dichten ergab ähnliche Polypeptidprofile mit einer einzelnen Hauptbande. Das Molekulargewicht des Proteins wurde durch PAGE auf 75.000 (75 kDa) geschätzt (1c). Mehrere kleinere Banden höheren Molekulargewichts und eine weitere kleinere Bande mit 45 kDa wurden auch beobachtet. Die Hauptbande bei 75 kDa (Pernin genannt) lag immer im Vergleich zu den kleineren Banden in großem Überschuß vor. Wenn Material aus dem Lichtstreuenden Material der CsCl-Gradienten durch Elektronenmikroskopie untersucht wurde, wurden Partikel, die denen von „leeren" kleinen RNA-Viren ähnelten, beobachtet (2). Ein UV-Lichtwellenscan (Daten werden nicht gezeigt) deutete jedoch daraufhin, daß nur wenig wenn überhaupt Nukleinsäuren vorhanden waren und daß die Partikel in erster Linie aus Proteinen zusammengesetzt waren. Die HPLC zeigte, daß die CsCl-Bande fast ausschließlich aus einer einzelnen Proteinspezies zusammengesetzt war (3). Da die HPLC einen hohen Grad der Reinheit aufzeigte, wird angenommen, daß die Polypeptide höheren Molekulargewichts Multimere von Pernin sind. Es ist wahrscheinlich, daß die kleinere Bande niederen Molekulargewichts abgebautes Pernin ist.
  • Die Chromatographie von halbgereinigten Extrakten oder von Material, das in CsCl gebandet wurde, auf einer CPG 240-80 Säule zeigte, daß der Großteil des Pernins unter Verwendung von Phosphat- oder Trispuffer niedriger Molarität als Elutionsmittel im Ausschlußvolumen eluiert wurde. Im Gegensatz dazu wurde ein Protein ähnlicher Größe, Rinderserumalbumin (68 kDa) in die Säulenmatrix aufgenommen. Es erscheint daher, daß unter bestimmten Bedingungen Pernin zu großen, Partikel-ähnlichen Strukturen aggregiert, wie es aufgrund der in 2 gesehenen Partikel vermutet wurde. Die HPLC bestätigte, daß Pernin aus P. canaliculus, das durch CPG Chromatographie erhalten wurde, hochgereinigt war. Aggregierende Proteinspezies wurden auch in Extrakten aus anderen Schalentieren beobachtet: der Blauen Muschen Mytilis edulis, der Auster Crassostrea gigas, und der Neuseeländischen Muschel Paphies australis aber nicht in der Jakobsmuschel Pecten novaezealandiae. Diese Polypeptide hatten ein niedrigeres Molekulargewicht als Pernin (4a). Das Pernin aus P. canaliculus ist N-glykosyliert, wie durch eine Verringerung des Molekulargewichts nach Behandlung mit der Endoglykosidase-F vor den PAGE gezeigt (4b).
  • Die Perninausbeute aus Gesamtmuschelextraktionen betrug durchschnittlich etwa 200 μg/Muschel. Verbesserte Perninausbeuten wurden durch die Extraktion des Haemolymphs direkt aus lebenden P. canaliculus erhalten. Ein kleiner Einschnitt wurde in der Schale unter Verwendung einer dreieckigen Feile gemacht und eine Nadel des Kalibers 30 wurde in den posterioren Adduktormuskel eingeführt. Bis zu 1-5 ml können einfach entnommen werden.
  • Das Haemolymph wurde mit niedriger Geschwindigkeit (≈ 1000 g) zentrifugiert um Haemocyten zu entfernen, und der sich ergebende Überstand wurde durch Ultrazentrifugation, beispielsweise bei 250.000 g für 40 Min. gefolgt von entweder einer CPG-Chromatographie mit Elution mit 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,2, oder von isopygnischem Banden in CsCl in Phosphatpuffer bearbeitet. Das in dieser Weise erhaltene Pernin schien nicht anders zu sein als das aus Gesamtmuscheln gereinigte und hatte den Vorteil einer durchschnittlich 30-fachen Ausbeuteerhöhung von jeder Muschel. Das Haemolymph enthielt ungefähr 2 mg/ml (Durchschnitt ≈ 5-6 mg/Muschel) Pernin, das bei weitem die vorherrschendste Polypeptidspezies ist (5a). Die Zeit, um Pernin zu reinigen, wurde von etwa 5 Tagen auf 1 Tag verringert.
  • Die Mikrosequenzierung der N-terminalen Region und interner Fragmente, die durch chemische und enzymatische Spaltung aus gereinigtem Pernin erzeugt wurden, wurde durchgeführt, und erzeugte die folgenden Sequenzen der Spaltungsfragmente:
    • (a) DGEQCNDGQN
    • (b) QGGHEVESERVACCVIGRA
    • (c) GQSHPEIVH
    • (d) YHGHDDA
    • (e) VVNEVHH.
  • Diese Sequenzen kodieren für die folgenden Aminosäuren:
  • Code:
    • A
      Alanin
      C
      Cystin
      D
      Asparginsäure
      E
      Glutaminsäure
      F
      Phenylalanin
      G
      Glycin
      H
      Histidin
      I
      Isoleucin
      K
      Lysin
      L
      Leucin
      M
      Methionin
      N
      Asparagin
      P
      Prolin
      Q
      Glutamin
      R
      Arginin
      S
      Serin
      T
      Threonin
      V
      Valin
      W
      Tryptophan
      Y
      Tyrosin
  • Die Sequenzdaten wurden mit Aminosäuresequenzen in durchsuchbaren Computerdatenbanken verglichen. Einige Sequenzen wurden als besonders interessant angesehen:
    • a) eine 10 Aminosäurerestesequenz des N-Terminus des Pernins (Sequenz (a) oben) zeigte nur eine Homologie mit einer 8 Basen anti-Thrombinproteinsequenz aus terrestrischen Blutegeln (Daten aus US Patent 5,455,181, 3. Okt. 1995: Sequenz 10).
      Perna canaliculus Pernin 2 GEQCNDGQ 9
      Übereinstimmende Aminosäuren G+ CND GQ
      Blutekel anti-Thrombin 5 GQSCNDGQ 12
      Identität: 6/8 (75%) positive: 7/8 (87%); „ +" deutet auf eine äquivalente Aminosäure hin; die fett-gedruckten Nummern deuten die Aminosäureposition an
    • b) Für ein internes Spaltungsprodukt (Sequenz (b) oben) wurde gezeigt, daß es eine Homologie zu der Cu-Zn-Proteinklasse, die als „SOD" („Superoxidismutasen") bekannt sind, aufweißt.
  • Jedes der Fragmente (a) bis (e) ist ein Teil der größeren Pernin-Aminosäuresequenz:
    Figure 00180001
    (Fette Buchstaben deuten die direkten sequenzierten Fragmente (a) bis (e) an).
  • Abschnitt 2
  • Anti-Thrombinaktivität
  • Die Möglichkeit, daß Pernin als ein anti-Thrombinmittel wirken könnte, wurde in einem kinetischen Test der Thrombinhemmung untersucht.
  • Thrombinhemmungstest
  • Kinetische Tests wurden unter Verwendung eines AccucolorTM Antithrombin III Kits (Katalog Nr. CRS 105, Sigma Diagnostics, USA) durchgeführt, wobei die Reagenzien gemäß den Anweisungen des Lieferanten hergestellt wurden. Standardplasma wurde durch Instrumentation Laboratories (Italien) geliefert und in der empfohlenen Verdünnung von 1/41 verwendet. Proben gereinigten Muschelproteins in Wasser wurden durch das Hinzufügen von den 10X Sigma Probenpuffer 9/10 verdünnt. Heparin wurde von Instrumentation Laboratories gekauft. Die Thrombinaktivität wurde colorimetrisch bei 405 nm unter Verwendung des Chromogensubstrats (H-D-HHT-L-Ala-L-Arg-pNa.2AcOH, Katalog Nr. A 8058, Sigma, USA) und eines Multiskan Biochromatischen Plattenlesers (Labsystems, Finland) abgeschätzt.
  • Dies bestätigte, daß Pernin eine hemmende Aktivität aufwies. Wenn eine gereinigte Zubereitung des Pernins durch ein 30.000 MW Ausschlußfilter (5a) zentrifugiert wurde, war alle anti-Thrombinaktivität im Rückstand und keine nachweisbare Aktivität war im Filtrat nachweisbar (5b). Das Standardserum wurde wie für dieses Testsystem empfohlen 1/41 verdünnt. Die Perninkonzentration wurde nicht direkt bestimmt, war aber im 1 mg/ml Bereich. Aus diesen kinetischen Daten wurde die Perninhemmung auf etwa 50% des Niveaus menschlichen Plasmas abgeschätzt (ungefähr 1 mg/ml Pernin 9/10 verdünnt, verglichen mit der 1/41 Plasmaverdünnung in dem Standard ATIII Testsystem). Heparin, ein für die ATIII Thrombimhemmung erforderlicher Cofaktor, war für die Hemmungswirkung des Pernins nicht erforderlich.
  • Metallbindungsaktivität
  • Hi Trap® Chelating-Affinitätssäulen (Amersham Pharmacia Biotech, 1 ml Größe) wurden gemäß den Herstellerinstruktionen vorbereitet. Die Säulen wurden mit entweder 0,1 M Kupferchlorid oder Zinkchlorid vor der Äquilibrierung in einem Puffer (0,050 M Natriumphosphat und 0,5 M Natriumchlorid, das 0,5 mM Imidazol, pH 7,0 enthielt) aufgeladen. Proteinproben, die unter Verwendung der CsCl-Zentrifugation gereinigt wurden, wurden in diesem Puffer resuspendiert und unter Verwendung eines chromatographischen Systems auf die Säulen aufgetragen (Econo System, Bio-Rad Laboratories, USA). Nach dem Waschen der Säule für 5 Min. mit Puffer währenddessen kein Protein im Eluat erschien, wurde ein linearer Gradient unter Verwendung eines Puffers mit einer Imidazolkonzentration von 100 mM von 0-100% über 20 Min. mit 1 ml/Min verwendet, um die Säule zu entwickeln. Das Protein eluierte in Gradienten, wobei es länger auf der Kupfer- als auf der Zinkchelatisierungssäule zurückgehalten wurde. Die Absorption des Eluats wurde bei 254 nm überwacht.
  • Der zweiwertige Metallionengehalt des CsCl-gereinigten Proteins wurde durch das Auflöse des Proteins in Wasser bei 10 mg/ml und Analyse des Metallgehalt sowohl durch Atomabsorptions- und Plasmaemissionsspektrometrie durch Vergleich mit einer Wasserleerprobe bestimmt. Mit dieser Methode ergab sich kein bedeutender Gehalt eines zweiwertigen Kations in dem Protein. Die Reinigung mit anderen Methoden, die keine chaotrophen Mittel wie CsCl verwendeten, der hohe Gehalt an Histidin gekoppelt mit aziden Aminosäureresten und der wahrscheinliche Ursprung dieses Proteins von einem SOD-Vorläufer deuten jedoch daraufhin, daß Pernin endogene Metallionen als Teil seiner nativen Struktur aufweißt.
  • Abschnitt 3
  • Genesequenzierungsverfahren
  • Eine Folge nicht-spezifischer Primer, die pUZ5 genannt wurden, wurde beruhend auf der Nterminalen Sequenz des Pernins durch Gibco-BRL für die anfängliche Sequenzierung synthetisiert. Die allgemeine Formel war:
    GAY GGN GAR CAR TGY AAY GAY GGN CAR AA wobei Y eine Pyrimidinbase darstellt, R eine Purinbase darstellt und N jede der vier Nukleotidbasen darstellt. Die Sequenzierung wurde anfänglich unter Verwendung von pUZ5 und einem auf Oligo-dT beruhendem „unterem Strang"-Primer aus PCR-vervielfältigter cDNA durchgeführt. Die Sequenzierung wurde durch Farbstoffterminationszyklussequenzierung unter Verwendung der „BigDye"-Prismatechnologie (Applied Biosystems Incorporated, USA) gemäß deren Instruktionen durchgeführt. Die Produkte wurden auf einem ABI 377 automatisierten Sequenzierer aufgelöst. Nach der anfänglichen Sequenzierung von ungefähr 500 Basenpaaren wurden Pernin-spezifische Primer konstruiert und verwendet, um die Sequenzierung des Perningens abzuschließen.
  • Dies führte zu dem folgenden:
    Figure 00210001
  • Diskussion
  • Die vorliegende Erfindung ist ein neues Protein, das aus Perna canaliculus, der neuseeländischen grünlippigen (GreenshellTM) Muschel erhältlich ist. Das Protein scheint zur Selbstaggregation in Strukturen, die kleinen virusähnlichen Partikeln (VLP = „virus like particles") mit ungefähr 25 nm Durchmesser aber ohne Nukleinsäuren ähneln, in der Lage zu sein. Das Protein wurde in Extrakten aus Gesamtmuscheln gefunden und scheint das vorherrschende Protein im Haemolymph zu sein. Das Molekulargewicht des Proteins wurde mit PAGE auf 75 kDa geschätzt und es wurde aus seiner Polynukleotid-kodierenden Sequenz auf 55 kDa geschlossen, aber aufgrund seiner Fähigkeit zu aggregieren kann das Protein durch Ultrazentrifugation in einer kurzen Zeit (z.B. 40 Minuten bei 250.000 g) sedimentiert werden, wobei das monomere Protein nicht sedimentiert werden würde. Jeder ml Haemolymph ergibt im Durchschnitt etwa 2 mg Pernin. Das Haemolymph wird einfach durch die Entnahme von Flüssigkeit aus dem posterioren Adduktormuskel von Schalentieren erhalten, was ohne offensichtliche Verletzung bis zu 5 ml ergeben kann; es ist nicht notwendig die Muschel zu töten. Das erhaltene Haemolymph enthält nicht nur hohe Perninmengen sondern ist auch frei von kontaminierenden Materialien insbesondere im Vergleich zu Gesamtmuschelextrakten, so daß die Reinigung von Pernin einfach ist. Für hochreine Perninzubereitungen folgt auf die Ultrazentrifugation ein isopycnisches Banden in einem geeigneten Dichtegradientenmedium wie CsCl.
  • Die Sequenz des N-Terminus des Pernins deutete darauf hin, daß das Protein möglicherweise anti-Thrombinaktivität aufweist. Dies wurde in kinetischen Tests mit gereinigten Heparin gezeigt. Da Thrombin eine Serinprotease ist, wirkt Pernin auch als ein Serinproteasehemmer.
  • Der Vergleich der Sequenzen, die aus verschiedenen gespaltenen Fragmenten erhalten wurden, mit Aminosäuresequenzen in einer Computerdatenbank legte nahe, daß das Protein zusätzlich zu der anti-Thrombinaktivität des Pernins auch andere Aktivitäten besitzt. Eine dieser ist die Fähigkeit, zweiwertige Kationen wie Zn2+ und Cu2+ zu binden.
  • INDUSTRIELLE ANWENDUNG
  • Das bevorzugte Protein der Erfindung Pernin hat eine Anzahl von Verwendbarkeiten.
  • Aufgrund seiner anti-Thrombinaktivität ist Pernin möglicherweise als anti-Koagulierungsmittel nützlich. Thrombin wirkt normalerweise als eine Protease, die Fibrinogen im Blut zu Fibrin umwandelt. Der Blutzirkulation wird durch Hemmer entgegengewirkt, normalerweise anti-Thrombin-III (ATIII); für Pernin ist auch gezeigt worden, daß es die Thrombinaktivität in einem ATIII-Testsystem hemmt. Im Gegensatz zu ATIII, dessen Wirkung durch die Gegenwart von Heparin (ein sulfiertes Mukopolysaccharid) beschleunigt wird, erfordert Pernin Heparin nicht als Cofaktor.
  • Das Perninprotein aus P. canaliculus hat damit einen Wert als ein Pharmazeutikum. Da es in seinem nativen Zustand als anti-Koagulant aktiv ist, kann es auch als ein natürliches therapeutisches Mittel oder als Gesundheitszusatzstoff nützlich sein. Es wird ohne weiteres als natürliches Produkt in hohen Konzentrationen aus Muschelhaemolymph erhalten. Um eine hochreine Zubereitung zu erhalten, ist es nur notwendig Haemozyten durch Zentrifugation (oder jedes andere geeignete Verfahren) zu entfernen gefolgt von entweder einer Ultrazentrifugation (da Pernin Aggregate bildet, die ohne weiteres sedimentieren) und Resuspension, durch isopycnisches Banden in einem geeigneten Medium wie CsCl, durch Ausschlußfiltration durch eine geeignete Membran, die Pernin zurückhält oder durch Chromatographie durch ein Medium, wie eines mit kontrollierter Porengröße geeigneter Porösität. Das Ergebnis ist eine hochreine Perninzubereitung.
  • Die Muschel P. canaliculus erzeugt natürlicherweise große Mengen des Proteins, wobei die Herstellung, Bearbeitung oder Reinigung nur geringe Kosten oder Aufwand erzeugen.
  • Eine weitere Nützlichkeit des Proteins entsteht aus der Tatsache, daß dem Pernin die zweiwertigen Kationen (beispielsweise durch CsCl isopynisches Banden oder durch pH-Änderung) genommen werden können. Dies erlaubt, daß Hinzufügen von zweiwertigen Kationen der Wahl (wie Mg++, Cd++, Zn++ oder Ca++ zum dem Metall-freien Pernin. So ein Protein mit einer veränderten und vorausgewählten zweiwertigen Kationenbeladung hat eine Verwendung in der Nahrungsmittel- und Nahrungsmittelergänzungsmittelindustrie.
  • Die Fähigkeit zweiwertige Metallkationen zu binden, führt auch zu Verwendungen des Proteins in der Biosanierung und/oder in Kationenwiedergewinnungsverfahren. Die zweiwertigen Kationen können als Verunreinigung oder Verschmutzung in beispielsweise einer Lösung vorhanden sein und die Lösung, kann über ein Substrat geleitet werden, an das das Protein gebunden ist, so daß die Kationen extrahiert werden.
  • Noch eine weitere Verwendbarkeit ergibt sich aus der Tatsache, daß das Protein „selbst aggregierend" ist und Strukturen bilden kann, die leeren, virusähnlichen Partikeln mit einem Durchmesser von ungefähr 25 nm ähneln. Diese leeren, virusähnlichen Partikel sind dazu in der Lage in ihrem Inneren andere Moleküle einzuschließen, mit der darausfolgenden Fähigkeit als Verabreichungsvehikel für diese anderen Moleküle zu wirken. Beispiele von Molekülen, die in dieser Weise verabreicht werden können, umfassen pharmazeutisch wirksame Verbindungen.
  • Die Fachleute werden verstehen, daß die obige Beschreibung lediglich zur Illustration zur Verfügung gestellt wird und das die Erfindung nur durch die angefügten Ansprüche beschränkt wird.
  • LITERATURZITATE
    • Layne, E. (1957). Spectophotometric and turbidometric methods for measuring proteins, Methods in Enzymology III 447.1
    • Scotti, P.D. (1985). The estimation of virus density in isopycnic cesium chloride gradients. Journal of Virological Methods 12, 149.
  • SEQUENCE LISTING
    Figure 00250001
  • Figure 00260001
  • Figure 00270001
  • Figure 00280001
  • Figure 00290001
  • Figure 00300001
  • Figure 00310001
  • Figure 00320001

Claims (16)

  1. Isoliertes Protein mit einem Molekulargewicht von ungefähr 55 kDa und einer Aminosäuresequenz, welche eine oder mehrere der folgenden Sequenzen aufweist: (a) SEQ ID Nr. 1; (b) SEQ ID Nr. 2; (c) SEQ ID Nr. 3; (d) SEQ ID Nr. 4; (e) SEQ ID Nr. 5; oder ein aktives Fragment davon.
  2. Isoliertes Protein, welches die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 7 oder ein aktives Fragment davon enthält.
  3. Isoliertes Protein, das aus der Hämolymphe der Perna canaliculus erhältlich ist, das ein durch PAGE bestimmtes scheinbares Molekulargewicht von 75 kDa und Aktivität als Serinproteasehemmer und/oder als zweiwertiger Kationen-bindender Wirkstoff aufweist, oder ein aktives Fragment davon.
  4. Protein oder Fragment nach Anspruch 1 oder 2, welches Aktivität als (i) Serinproteasehemmer oder (ii) Zweiwertiger Kationen-bindender Wirkstoff aufweist.
  5. Protein, das aus Perna canaliculus oder einer anderen Muschel als Perna canaliculus erhältlich ist und insofern eine funktional äquivalente Variante eines Proteins oder Fragmentes nach Anspruch 3 oder 4 ist, als es mit einem Protein oder Fragment nach Anspruch 3 oder Anspruch 4 immunologisch kreuzreaktiv ist und mindestens denselben Serinproteasehemmer und/oder dieselbe zweiwertige Kationenbindende Aktivität wie ein Protein oder Fragment nach Anspruch 3 oder Anspruch 4 aufweist.
  6. Polynukleotid, das ein Protein oder ein Fragment nach einem der Ansprüche 1 bis 5 kodiert.
  7. Polynukleotid nach Anspruch 6, welches die Nukleotidsequenz von SEQ ID Nr. 6 oder einer Variante davon aufweist.
  8. Polynukleotid, welches die Nukleotidsequenz von SEQ ID Nr. 8 aufweist.
  9. Polynukleotid, welches unter stringenten Bedingungen mit einem Polynukleotid nach einem der Ansprüche 6 bis 8 hybridisiert.
  10. Vektor, welcher ein Polynukleotid nach einem der Ansprüche 6 bis 9 enthält.
  11. Wirtszelle, welche ein Polynukleotid nach einem der Ansprüche 6 bis 9 exprimiert.
  12. Zusammensetzung, welche ein Protein oder ein Fragment nach einem der Ansprüche 1 bis 5 enthält.
  13. Zusammensetzung nach Anspruch 12, welche ein Medikament, Nahrungsmittelergänzungsmittel oder dietätisches Ergänzungsmittel ist.
  14. Dietätisches Ergänzungsmittel nach Anspruch 13, wobei das Protein oder das Fragment mit mindestens einem zweiwertigen Kation von dietätischer Bedeutung assoziiert oder an ein solches gebunden ist.
  15. Dietätisches Ergänzungsmittel nach Anspruch 14, wobei das zweiwertige Kation Kalzium, Magnesium oder Zink ist.
  16. Zusammensetzung nach Anspruch 12 welche ein Bioremediations-Wirkstoff ist.
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