DE60126026T2

DE60126026T2 - PROTEIN MIT HäMOLYTISCHER AKTIVITäT UND DIESES PROTEIN KODIERENDE GEN

Info

Publication number: DE60126026T2
Application number: DE60126026T
Authority: DE
Inventors: Hiroshi Koto-ku NAGAI; Kyoko Kyoto-shi KURODA; Terumi Shinjuku-ku NAKAJIMA
Original assignee: Suntory Ltd
Current assignee: Suntory Holdings Ltd
Priority date: 2000-03-21
Filing date: 2001-03-21
Publication date: 2007-05-24
Anticipated expiration: 2021-03-22
Also published as: US7282577B2; US6855803B2; EP1179539A1; DE60126026D1; JP3802729B2; EP1179539B1; US20050106676A1; WO2001070799A1; US20040110919A1; EP1179539A4; AU779885B2; AU4273301A; BR0105179A; JP2001258566A

Description

TECHNISCHES GEBIET
Die vorliegende Erfindung betrifft neue Proteine mit hämolytischer Aktivität und Gene, die dafür codieren. Genauer betrifft die vorliegende Erfindung neue Proteine mit hämolytischer Aktivität, ein Verfahren zu ihrer Herstellung, Reagenzien, Pestizide und Medikamente, die physiologische Aktivitäten davon nutzen.
STAND DER TECHNIK
Die Stichverletzung durch die Qualle beim Baden im Meer ist in verschiedenen Teilen der Welt aufgetreten. Die Stichverletzung durch Carybdea rastonii oder Physalia physalis ist in Japan jedes Jahr in der Meeresbadesaison der Sommerzeit häufig aufgetreten. Der Grad des Symptoms durch den Stich unterscheidet sich je nach Quallenart und den individuellen Unterschieden der Patienten. Das erste Symptom sind Dermatosen, wie zum Beispiel Schmerz, flächenhafte Hautrötung („flare"), Papeln, Vesikel usw., an der Stichstelle. Bei einer schweren Erkrankung können Patienten sterben, wobei sie hämorrhagische Flecken und Necrose und auch konstitutionelle Symptome, wie zum Beispiel Kopfschmerz, hohes Fieber, Übelkeit, Dyspnoe und schwankenden Puls, entwickeln. Obwohl eine derartige Stichverletzung häufig auftritt, sind die Bestimmung und pharmakologischen Eigenschaften der toxischen Komponenten der Qualle noch nicht intensiv untersucht worden. Daher ist die Entwicklung von Medikamenten für die Behandlung des Stichs durch die Qualle vor der vorliegenden Erfindung kaum erfolgt.
Zum Beispiel ist die schwere Stichverletzung durch Carybdea alata in Hawaii oder an anderen Orten berichtet worden (R. H. Tamanaha et al., J. Am. Acad. Dermatol., 1996, 35, 991–993); jedoch sind die Bestimmung und die pharmakologischen Eigen schaften der toxischen Komponenten dieser Qualle nicht untersucht worden. Im Gegensatz dazu sind die Studien an den toxischen Komponenten von Carybdea rastonii, die in familiärer Beziehung zu Carybdea alata steht, gut studiert worden und die chemischen und physiologischen Eigenschaften der toxischen Komponente von Carybdea rastonii sind aufgeklärt worden (Akihiko Sato, „Research on the toxic component of Carybdea rastonii", The Journal of the Ochanomizu Medico-dental Society, Bd. 33, Nr. 2, 131–151, Juni 1985; international offengelegtes Patent, Veröffentlichungsnummer WO 99/50294).
Da andererseits die bekannten Gifte aus der Nematocyste einer Qualle ein nicht-dialysierbares Hochpolymer bzw. Makromolekül waren und durch Behandlung mit Säure oder Alkali oder durch Hitzebehandlung, Bearbeitung bzw. Prozessierung mit organischem Lösungsmittel, Proteasebehandlung usw. inaktiviert wurden, wurde angenommen, dass die Hauptkomponenten des Gifts Proteine seien.
Darüber hinaus ist auch die Reinigung des von einer Qualle stammenden Proteintoxins versucht worden; jedoch wurden die Isolierung und die Reinigung der aktiven bzw. wirksamen Komponenten unter Erhaltung der hämolytischen Aktivität nicht durchgeführt, da das Toxin einer Qualle selbst sehr leicht zu deaktivieren bzw. inaktivieren war. Deshalb sind die physikalischen und chemischen Eigenschaften des Toxins aus Quallen bis heute niemals aufgeklärt worden. Das Verfahren zur Isolierung und Reinigung der instabilen toxischen Komponenten von Quallen bei guten Ausbeuten ist jedoch vor kurzem in der internationalen Offenlegungsschrift, Veröffentlichungsnummer WO 99/50294 beschrieben worden.
Daneben betrifft auch die EP 1 067 140 A hämolytisch aktive Proteine und Gene, die dafür codieren. Dieses Dokument ist ein Stand der Technik gemäß Art. 54(3) EPÜ. Weiterhin offenbaren Rottini G. et al., in Toxicon (1995), Bd. 33, Nr. 3, Seiten 315–326, die Reinigung und Eigenschaften eines cytolytischen Toxins im Venom der Qualle Carybdea marsupialis.
Darüber hinaus ähneln die folgenden Artikel von Nagai, H. et al. nachveröffentlichten Dokumenten:
„Novel proteinaceous toxins from the box jellyfish (sea wasp) Carybdea rastoni" und „Isolation and characterization of a novel Protein toxin from the Hawaiian box jellyfish (sea wasp) Carybdea alata", Biochem Biophys Res Commun. 2000 Aug. 28; 275(2); Seiten 582–8 bzw. 589–94; „Hajimete Akirakani sareta Kurgae Doku no Kagakuteki Seijo", Bioscience to Industry, (1. November 2000), Bd. 58, Nr. 11, Seiten 1797 bis 798.
Die detaillierten Studien an den toxischen Komponenten einer Qualle sind sehr wichtig für die Entwicklung von Wirkstoffen bzw. Arzneimitteln, die ihre verschiedenen physiologischen Aktivitäten, insbesondere spezifische hämolytische Aktivität und die cytotoxische Wirkung, anwenden, und für die Entwicklung von Medikamenten zur Behandlung der Stichverletzung durch die Qualle.
Daher sind die durch die vorliegende Erfindung zu lösenden Aufgaben die Bereitstellung eines Ansatzes für die Entwicklung der Wirkstoffe zur Behandlung der Stichverletzung durch die Qualle mittels Isolieren der Proteine oder Peptide, die eine hämolytische Aktivität besitzen, die so stark ist wie möglich, in dem Zustand, in dem die physiologische Aktivität erhalten bleibt bzw. beibehalten wird. Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin den Ansatz zum Untersuchen von Ähnlichkeiten in der Embryologie oder Struktur und der Artspezifität des Proteins mit hämolytischer Aktivität zum Bewerten von dessen Struktur-Aktivität-Beziehung bereit.
OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
Die Erfinder haben ausgiebige Untersuchungen zum Isolieren der Proteine mit der hämolytischen Aktivität aus der Nematozyste von Carybdea alata durchgeführt, wobei die hämolytische Aktivität als Parameter verwendet wurde, und wobei diese hämolytischen Aktivitäten beibehalten wurden. Im Ergebnis haben sie das Verfahren zum Isolieren und Reinigen der Proteine unter Beibehaltung hämolytischer Aktivitäten erfunden und das Protein aus Carybdea alata aufgeklärt, das die chemische Teilstruktur, die aus den nachstehenden Aminosäuresequenzen (1) und (2) besteht, und das molekulare Gewicht von näherungsweise 50.000 Da (bestimmt durch SDS-Gelelektrophorese) aufweist.
Aminosäuresequenz (1):
Tyr-Arg-Asp-Gln-Glu-Leu-Glu-Asp-Asn-Val-Lys (SEQ ID NO:1)
Aminosäuresequenz (2):
Lys-Trp-Pro-Asp-Tyr-Phe-Val-Tyr-Met-Glu-Ser-Ser-Ala-His-Gly-Tyr-Ile-Arg (SEQ ID NO:2)
(wobei ein Aminosäurerest mittels der Drei-Buchstaben-Notierung, wie sie durch die IUPAC und die IUB definiert ist, geschrieben wird)
Weiterhin haben sie auf der Grundlage der chemischen Teilstrukturen des Proteins Primer hergestellt und die Gensequenz von näherungsweise 900 Basenpaaren dieses Proteins untersucht, und zwar durch Durchführung der RT-PCR an Gesamt-RNA, die aus der Tentakel von Carybdea alata hergestellt wurde, und wobei diese Primer verwendet wurden. Folglich haben sie weiterhin die vollständige primäre Aminosäuresequenz des hä molytisch aktiven Proteins von Carybdea alata mittels Untersuchung der Gensequenz am 5'-Ende und am 3'-Ende unter Verwendung des 5'-RACE-Verfahrens und des 3'-RACE-Verfahrens bestimmt.
Deshalb stellt eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung das spezifische Protein mit der Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID NO:3 wiedergegeben wird, bereit.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung stellt auch das Verfahren zum Herstellen derartiger Proteine bereit.
Weiterhin stellt eine weitere Ausführungsform das Gen, das für derartige Proteine codiert, das Verfahren zur Herstellung der spezifischen Proteine unter Verwendung des Gens und die Arzneimittel bzw. Wirkstoffe oder Pestizide, die dieses verwenden, bereit.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner pharmazeutische Zusammensetzungen, enthaltend die Proteine, unter Verwendung dieser Eigenschaften etc., oder Pestizide, die die cytotoxischen Eigenschaften des Proteins nutzen, bereit.
Da ein spezifischer Antikörper auch aus diesem hämolytisch aktiven Protein nach einem herkömmlichen Verfahren erhalten werden kann (Cell Technology, Einzelband, „Experimental protocol of antipeptide antibody", Shujunsha Co.), offenbart die vorliegende Erfindung auch die pharmazeutischen Zusammensetzungen, die diesen Antikörper enthalten.
BESTE WEISE ZUR AUSFÜHRUNG DER ERFINDUNG
Die Isolierung und Reinigung der Proteine mit der spezifischen physiologischen Aktivität, die durch die vorliegende Erfindung bereitgestellt werden, kann wie folgt spezifisch durchgeführt werden. Beispielsweise wird die Ultraschallbehandlung der Nematozyste von Carybdea alata in Phosphorsäurepufferlösung durchgeführt und dann werden die Überstände durch Zentrifugalabscheidung bzw. -trennung gesammelt, um einen Rohextrakt zu erhalten. Diese Zielproteine („object proteins") können gereinigt und getrennt werden, indem dieser Rohextrakt Ionenaustausch-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie unter Verwendung einer Ionenaustauschsäule, wie zum Beispiel TSK-GEL (Toso Co.), und der Gelfiltrations-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie mit einer Gelfiltrationssäule, wie zum Beispiel Superdex-75 (Pharmacia Co.), unterworfen wird.
Die Struktur des erfindungsgemäß bereitgestellten Proteins, das auf diesem Wege erhalten wird, kann durch Kombinieren der Analysenvorgehensweisen der Aminosäuresequenz durch den selektiven Abbau unter Verwendung des bzw. eines Enzyms und der Analysenverfahrensweise einer Gensequenz unter Verwendung des PCR-Verfahrens etc. bestimmt werden. Beispielsweise kann die Aminosäuresequenz bestimmt werden, indem das Protein, wie oben stehend erwähnt, abgetrennt und gereinigt, mit einer Lysyl-Endopeptidase bearbeitet wird, das Fragment unter Verwendung von Hochleistungsflüssigkeitschromatographie fraktioniert wird und es unter Verwendung eines Aminosäuresequenziergeräts analysiert wird usw. Als Nächstes kann die Gensequenz des Proteins durch RT-PCR-Verfahren etc. bestimmt werden, wobei die auf der Grundlage der Aminosäuresequenz hergestellten Primer verwendet werden. Schließlich kann die vollständige primäre Aminosäuresequenz des Proteins durch Bestimmung der Aminosäuresequenz auf der Grundlage der Gensequenz aufgeklärt werden.
Durch eine derartige Analyse bzw. Untersuchung wurde bestätigt, dass das gemäß der vorliegenden Erfindung bereitgestellte Protein ein Molekulargewicht von ungefähr 50.000 Da (gemessen durch SDS-Gelelektrophorese) hat und die partiellen Aminosäuresequenzen, die oben stehend erwähnt sind, Aminosäuresequenzen (1) und (2) haben.
Als Ergebnis einer Homologierecherche anhand der partiellen Aminosäuresequenzen wurde festgestellt, dass die Homologie zwischen dem erfindungsgemäßen Protein und den bekannten anderen Proteinen sehr gering war, abgesehen davon, dass es eine näherungsweise 40%-ige Homologie zwischen dem erfindungsgemäßen Protein und den hämolytisch aktiven Proteinen aus Carybdea rastonii, die in familiärer Beziehung zu Carybdea alata steht, aufwies. Deshalb wurde nahegelegt, dass das erfindungsgemäße Protein, das die hämolytische Aktivität besitzt, ein vollständig neues Protein ist, das zu den bekannten Proteinen nicht ähnlich ist.
Als nächstes wurden die Bestimmung der Gensequenz von näherungsweise 1.000 Basenpaaren durch Durchführung von RT-PCR an Gesamt-RNA, die aus der Tentakel von Carybdea alata hergestellt wurde, unter Verwendung der auf der Grundlage der partiellen Aminosäuresequenz hergestellten Primer, und die Bestimmung der Gensequenzen des 5'-Endes und des 3'-Endes unter Verwendung des 5'-RACE-Verfahrens und des 3'-RACE-Verfahrens durchgeführt. Es wurde daher gefolgert, dass das hämolytisch aktive Protein von Carybdea alata die vollständige primäre Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID NO:3 wiedergegeben wird, hat, und dass das Gen, das dafür codiert, die Basensequenz hat, die von SEQ ID NO:4 wiedergegeben wird.
Das Verfahren zur Herstellung des spezifischen Proteins der vorliegenden Erfindung durch Abtrennung und Reinigung ist gekennzeichnet dadurch, dass es die hämolytische Aktivität beibehält. Die Auftrennung und Reinigung im Zustand der Erhaltung solcher hämolytischer Aktivität werden zum Beispiel er reicht, indem die Prozessierung, wie zum Beispiel Ultraschallbehandlung unter Verwendung der oben stehend erwähnten Phosphorsäurepufferlösung oder verschiedenartiger Hochleistungsflüssigkeitschromatographie in 10 mM Phosphorsäurepufferlösung (pH 6,0), enthaltend über 0,1 M NaCl, bevorzugt über 0,3 M und stärker bevorzugt über 0,5 M, bei unter 10°C, bevorzugt unter 5°C, durchgeführt wird.
Deshalb stellt die vorliegende Erfindung das Verfahren zur Herstellung des Proteins durch Extraktion und Reinigung aus der Nematozyste von Carybdea alata im Zustand der Beibehaltung der physiologischen Aktivität bereit.
Das spezifische erfindungsgemäße Protein kann auch durch das Genrekombinationsverfahren hergestellt werden. Die Herstellung durch das Genrekombinationsverfahren kann gemäß einem herkömmlichen Verfahren durchgeführt werden. Es kann beispielsweise erhalten werden durch Herstellen des Vektors, in den das von SEQ ID NO:4 wiedergegebene Gen integriert ist, Transformieren einer Wirtszelle mit dem Vektor, Inkubieren oder Wachsenlassen der Zelle und Isolieren und Reinigen der Proteine mit der hämolytischen Aktivität von Interesse aus der Wirtszelle oder Kulturlösung.
Da das gemäß der vorliegenden Erfindung bereitgestellte Protein eine hämolytische Aktivität besitzt, kann es beispielsweise für Medikamente, die Zytolysewirkung haben, und für Reagenzien für die Forschung an Hämolyse verwendet werden. Weiterhin stellt es einen neuen Ansatz für die Entwicklung von Wirkstoffen, wie zum Beispiel einem Wirkstoff für die Behandlung des Stichs durch die Qualle, und die Entwicklung von Pestiziden, wie zum Beispiel einem Insektizid, unter Verwendung der hämolytischen oder cytotoxischen Aktivität bereit.
BEISPIELE
Die vorliegende Erfindung wird unter Bezug auf die nachstehenden Beispiele im Detail beschrieben; die vorliegende Erfindung ist jedoch nicht auf die Beispiele beschränkt.
Beispiel 1
1) Extraktion aus der Nematozyste von Carybdea alata
200 mg der Nematozyste von Carybdea alata, erhalten am Waikiki-Strand, Hawaii, und kältekonserviert bei –80°C, wurden in 8 ml 10 mM Phosphorsäurepufferlösung (pH 6,0) getaucht und 15 Minuten lang mit Ultraschallwellen (Ultraschallreiniger VS150, Iuchi Co.) behandelt. Die überstehenden Flüssigkeiten wurden durch Zentrifugalabscheidung (3.000 U/min für 20 Minuten) gesammelt. Dieser Arbeitsvorgang wurde insgesamt dreimal durchgeführt. Weiterhin wurde der gleiche Extraktionsarbeitsgang dreimal mit 8 ml 10 mM Phosphorsäurepufferlösungen (pH 6,0), enthaltend 1 M NaCl, wiederholt und dann wurden alle überstehenden Flüssigkeiten gesammelt. Nach dem Extraktionsarbeitsgang wurde unverzüglich die Ionenaustausch-HPLC (Hochleistungsflüssigkeitschromatographie) der folgenden Reinigungsstufe durchgeführt.
2) Die Reinigung durch Ionenaustausch-HPLC (Säule: TSK-GEL CM650S, Säulengröße: 20 × 220 mm, Toso Co.)
Die oben genannte Säule wurde mit 10 mM Phosphorsäurepufferlösung (pH 6,0), enthaltend 0,3 M NaCl, äquilibriert. Nach der Äquilibrierung wurden die durch Extraktion im oben genannten Arbeitsgang 1) erhaltenen überstehenden Flüssigkeiten kombiniert bzw. vereinigt und mit 10 mM Phosphorsäurepufferlösung (pH 6,0) vierfach verdünnt. Die Lösung wurde bei einer Flussrate von 3 ml/min auf die oben genannte Säule geladen. Die Säule wurde mit 100 ml 10 mM Phosphorsäurepufferlösungen (pH 6,0) nach der Aufbringung der Probe gewaschen. Die Elution wurde durch einen 60-minütigen Gradienten von 0 bis 0,7 M NaCl-Konzentration (in 10 mM Phosphorsäurepufferlösung: pH 6,0) durchgeführt. Die hämolytische Aktivität wurde in vielen Fraktionen gezeigt, die zwischen 45 und 65 Minuten nach dem Beginn des Gradienten eluierten. Zusätzlich wurde die hämolytische Aktivität über die hämolytische Wirkung auf Schaf-Hämatozyten untersucht (siehe nachstehendes Beispiel 2).
3) Reinigung durch Ionenaustausch-HPLC (Säule: TSK-GEL CM5PW, Säulengröße: 7,5 × 75 mm, Toso Co.)
Die oben genannte Säule wurde gut mit 10 mM Phosphorsäurepufferlösung (pH 6,0), enthaltend 0,3 M NaCl, äquilibriert. Die hämolytisch aktiven Fraktionen, die durch den oben genannten Reinigungsarbeitsgang 2) erhalten wurden, wurden mit 10 mM Phosphorsäurepufferlösung (pH 6,0) vierfach verdünnt. Die Lösung wurde auf die oben genannte Säule bei einer Flussrate von 2 ml/min geladen. Die Säule wurde mit 30 ml 10 mM Phosphorsäurepufferlösungen (pH 6,0) nach der Aufbringung der Probe gewaschen. Nach dem Waschen wurde die Elution durch einen 60-minütigen Gradienten von 0 bis 0,8 M NaCl-Konzentration (in 10 mM Phosphorsäurepufferlösung: pH 6,0) durchgeführt. Fraktionen mit hämolytischer Aktivität wurden zwischen 25 und 35 Minuten nach dem Beginn des Gradienten eluiert und jede Fraktion wurde auf SDS-PAGE aufgebracht. Die Trennbedingungen der aktiven Komponente wurden verifiziert und die gut getrennten Anteile wurden gesammelt und in der nächsten Stufe verwendet. Im Gegensatz dazu wurden die nicht getrennten bzw. abgetrennten Anteile weiter durch Chromatographie bearbeitet, um die Abtrennung der aktiven Komponente abzuschließen.
4) Konzentration der hämolytischen aktiven Komponente durch Ionenaustausch-HPLC (Säule: TSK-GEL CM5PW, Säulengröße: 7,5 × 75 mm, Toso Co.)
Die Säule wurde gut mit 10 mM Phosphorsäurepufferlösung (pH 6,0), enthaltend 0,3 M NaCl, äquilibriert. Die hämolytisch aktiven Fraktionen, erhalten durch den oben stehend unter 3) erwähnten Reinigungsarbeitsgang, wurden mit 10 mM Phosphor säurepufferlösung (pH 6,0) vierfach verdünnt. Die Lösung wurde bei einer Flussrate von 2 ml/min auf die oben genannte Säule geladen. Nach dem Aufbringen der Probe wurde die Säule mit 30 ml 10 mM Phosphorsäurepufferlösung (pH 6,0) gewaschen. Nach dem Waschen wurde mit 10 mM Phosphorsäurepufferlösung (pH 6,0), enthaltend 0,8 M NaCl, gespült und die in der Säule gebundene Probe wurde eluieren gelassen. In etwa 5 Minuten nach dem Austausch des Lösungsmittels wurde der Anteil der hämolytisch aktiven Komponente, der sich verdichtete bzw. kondensierte und in einen Bereich bzw. Zeitraum eluierte, gesammelt.
5) Die Reinigung durch Gelfiltrations-HPLC (Säule: Superdex-75, Säulengröße: 16 × 600 mm, Pharmacia Co.)
Jeweils 0,5–1,0 ml der durch Ionenaustausch-HPLC, oben unter 4), verdichteten Probe wurden auf die oben genannte Säule, äquilibriert mit 10 mM Phosphorsäurepufferlösung (pH 6,0), die 0,8 M NaCl enthielt, aufgebracht und bei einer Flussrate von 1 ml/min eluieren gelassen. Eine starke hämolytische Aktivität wurde in der Fraktion gefunden, die zwischen 50 und 60 Minuten nach der Injektion der Probe eluierte. Nach Bestätigung der Trennungsbedingungen durch SDS-PAGE wurde das Protein der vorliegenden Erfindung, ein hämolytisches Toxin, durch Sammeln der aktiven Fraktionen abgetrennt (näherungsweise 10 μg).
Beispiel 2: Messung der hämolytischen Aktivität
Die Messung der hämolytischen Aktivität in jeder Reinigungsstufe im oben genannten Beispiel 1 und die Messung der hämolytischen Aktivität des schließlich erhaltenen erfindungsgemäßen Proteins wurden wie folgt durchgeführt.
1) Methode
Die hämolytische Aktivität wurde durch Hämolyse an Schaf-Erythrozyten gemessen. Das heißt, je 200 μl PBS(+)- Pufferlösung, enthaltend 0,8% Schaf-Erythrozyten, wurden in Mikrotiterplatten mit 96 Kavitäten bzw. Wells (Rundbodentyp) gegeben. 10 μl der Lösung der Fraktion, die in jeder Reinigungsstufe des oben genannten Beispiels 1 erhalten wurde, wurde in 10 mM Phosphorsäurepufferlösung (pH 6,0) gelöst zu der Platte gegeben. Sie wurde bei Raumtemperatur drei Stunden lang stehen gelassen und dann wurde der Hämolysezustand bzw. der hämolytische Zustand der Schaf-Erythrozyten jeder Platte beobachtet. Zusätzlich wurde das Vorhandensein oder das Fehlen der Retention der hämolytischen Aktivität dadurch bestimmt, ob die Fraktionen, die in jeder Reinigungsstufe erhalten wurden, eine perfekte bzw. vollständige Hämolyse aufwiesen.
2) Ergebnisse

2-1) Die in jeder Reinigungsstufe des oben genannten Beispiels 1 erhaltene Fraktion wies die vollständige Hämolyse an den Schaf-Erythrozyten auf und es wurde deshalb deutlich bzw. klar, dass sie die hämolytische Aktivität beibehält.
2-2) Darüber hinaus bewirkte das erfindungsgemäße Protein mit der hämolytischen Aktivität, endgültig erhalten durch den Reinigungsarbeitsgang der oben stehend in 5) von Beispiel 1 erwähnt ist, die vollständige Hämolyse an den Schaf-Erythrozyten bei einer Konzentration von weniger als 100 ng/ml (näherungsweise 2 nM).

Beispiel 3: Bestimmung des Molekulargewichts und der Partial- bzw. Teilstruktur der Proteine
3-1) Bestimmung des Molekulargewichts
Die einzelne Bande, die durch Aufbringen des erfindungsgemäßen Proteins, das die hämolytische Aktivität besitzt, das durch den Reinigungsarbeitsgang von 5) in Beispiel 1 erhalten wurde, auf SDS-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) gemäß dem herkömmlichen Verfahren visualisiert worden war, wurde mit dem Proteinmolekulargewichtsmarker (Pharmacia Co.) verglichen. Als Ergebnis wurde festgestellt, dass das Molekulargewicht des erfindungsgemäßen Proteins näherungsweise 50.000 Da beträgt.
3-2) Abbau mit der Lysylendopeptidase
Das Protein wurde durch Zugabe von 3 pM Achromobacter-Protease I (stammend von Achromobacter lyticus M497-1: Takara Shuzo Co.) zu 10 μg erfindungsgemäßem Protein, das die hämolytische Aktivität besitzt und durch den Reinigungsarbeitsgang, der oben unter 5) in Beispiel 1 genannt ist, erhalten wurde, und Inkubieren in 10 mM Tris-HCl-Pufferlösung (pH 9,0) bei 30°C für 20 Stunden abgebaut bzw. gespalten. Das mit dem Enzym verdaute Protein wurde auf die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (Säule: Bakerbond wide pore ODS) aufgebracht und mit einem 60-minütigen Gradienten von 10 bis 62% Acetonitrilkonzentration (in Wasser, das 0,1% Trifluoressigsäure enthielt) bei einer Flussrate von 0,7 ml/min aufgetrennt. In der Folge wurden zwei Peptidfragmente, die jeweils bei einer Retentionszeit von 25 bis 49 Minuten eluierten, erhalten.
3-3) Bestimmung der Aminosäuresequenz von jedem der Fragmente durch das Aminosäuresequenzierungsgerät
Die Aminosäuresequenz der drei Peptidfragmente, die erhalten wurden wie es oben stehend erwähnt ist, wurde gemäß den herkömmlichen Verfahren unter Verwendung eines Proteinsequenziergeräts vom Typ Shimadzu PSQ-1 (Shimadzu Co.) bestimmt.
Als Ergebnis besitzen die zwei Fragmente die folgenden Aminosäuresequenzen (1) bzw. (2).
Aminosäuresequenz (1):
Tyr-Arg-Asp-Gln-Glu-Leu-Glu-Asp-Asn-Val-Lys
Aminosäuresequenz (2):
Lys-Trp-Pro-Asp-Tyr-Phe-Val-Tyr-Met-Glu-Ser-Ser-Ala-His-Gly-Tyr-Ile-Arg
(wobei ein Aminosäurerest mittels der Drei-Buchstaben-Notierung, wie sie durch die IUPAC und die IUB definiert ist, geschrieben wird).
Die Homologierecherche über jedes Fragment, für das die Aminosäuresequenz bestimmt wurde, wurde wie oben stehend erwähnt durchgeführt und zeigte, dass die Homologie zwischen diesen Fragmenten und den bekannten Proteinen sehr niedrig war, abgesehen davon, dass eine näherungsweise 40%-ige Homologie mit hämolytisch aktiven Proteinen von Carybdea rastonii gezeigt wurde. Es wurde deshalb vorgeschlagen, dass das spezifische Protein der vorliegenden Erfindung, das unter Beibehaltung der hämolytischen Aktivität aus der Nematozyste von Carybdea alata fraktioniert bzw. abgetrennt wurde, ein vollständig neues Protein ist.
Beispiel 4: Bestimmung der vollständigen Aminosäuresequenz des Proteins und des Gens, das für die Aminosäuren codiert
4-1) Herstellung von Gesamt-RNA aus Carybdea alata
Die Tentakel (näherungsweise 0,5 g Nassgewicht) von Carybdea alata wurde in flüssigem Stickstoff zerdrückt und in 5 ml TRIzol (registrierte Marke)-Reagenz (GIBCO BRL Co.) homogenisiert. Zu diesem Gemisch wurde 1 ml Chloroform zugesetzt und das Gemisch wurde gerührt bzw. geschüttelt und mit einer Kühlzentrifuge (Sakuma Co.) zentrifugiert [13.000 U/min für 15 Minuten bei 4°C]. Die obere wässrige Schicht wurde fraktioniert und zu dieser Lösung wurden 2,5 ml Isopropanol zugegeben. Dann wurde das Gemisch bei Raumtemperatur 10 Minuten lang stehen gelassen. Die überstehende Flüssigkeit wurde nach der Zentrifugationsabscheidung (13.000 U/min für 10 Minuten bei 4°C) unter Verwendung der Kühlzentrifuge entfernt und dann wurden dem Rückstand 5 ml 75% Ethanol zugegeben. Die überstehende Flüssigkeit wurde nach dem Zentrifugieren (10.000 U/min für 5 Minuten bei 4°C) entfernt, um den Rückstand zu erhalten. Dann wurde eine Lufttrocknung des Rückstands für näherungsweise 10 Minuten durchgeführt. 100 μl RNase-freies Wasser wurden zu dem resultierenden Rückstand zugegeben und das Gemisch wurde 10 Minuten lang bei 60°C inkubiert, um die RNA zu lysieren. Näherungsweise 0,5 mg Gesamt-RNA wurden gemäß dem oben stehenden Verfahren erhalten.
4-2) Klonierung einer partiellen cDNA
Auf der Basis der Aminosäuresequenz (1) und der Aminosäuresequenz (2) wurden die folgenden degenerierten Primer entworfen und mittels des herkömmlichen Verfahrens synthetisiert:
Vorwärtsprimer; GAY CAR GAR YTI GAR GAY AA (SEQ ID NO:5)
Rückwärtsprimer; ATR TAI CCR TGI GCI SWI SWY TCC (SEQ ID NO:6)
(wobei die obigen alphabetischen Zeichen basierend auf der „Nucleotide Abbreviation List" (Cell Technology, Einzelband, „Biotechnology Experiment Illustrated": Shujunsha Co.) geschrieben wurden).
Als Nächstes wurde gemäß der nachstehenden Verfahrensweise einzelsträngige cDNA synthetisiert, wobei das SUPERSCRIPT (eingetragene Marke) Preamplifikationssystem für die Erststrang-cDNA-Synthese verwendet wurde. Das heißt, 1 μg Gesamt-RNA, oligo(dT)_12–18 und DEPC-behandeltes Wasser wurden gemischt und das Gemisch wurde 10 Minuten lang bei 70°C stehen gelassen. Dann wurden PCR-Puffer, 25 mM MgCl₂, 10 mM dNTP-Gemisch und 0,1 M DTT zu diesem Gemisch zugegeben und das resultierende Gemisch wurde 5 Minuten lang bei 42°C präinkubiert. Superscript II RT (200 Units/μl) wurde zu diesem Ge misch zugegeben und das Gemisch wurde 50 Minuten lang bei 42°C und 15 Minuten lang bei 70°C inkubiert. Die RNase H wurde zu dem Gemisch zugegeben und dann wurde das resultierende Gemisch 20 Minuten lang bei 37°C inkubiert, um ErststrangcDNA zu erhalten.
Nachfolgend wurde gemäß den nachstehenden Bedingungen PCR unter Verwendung eines Thermocyclers vom Typ GeneAmp PCR System 2400 (Perkin-Elmer Co.) durchgeführt. Das heißt, dass Erststrang-cDNA-PCR-Puffer, dNTP-Gemisch, Vorwärtsprimer, Rückwärtsprimer, TaKaRa Ex Taq (eingetragene Marke, Takara Shuzo Co.) und Wasser gemischt wurden. Die Reaktion wurde durch Erhitzen des Gemischs auf 94°C für 5 Minuten, dann Wiederholen von 3 Zyklen von 30 Sekunden bei 94°C, 30 Sekunden bei 45°C und 2 Minuten bei 72°C und weitere 27 Zyklen von 30 Sekunden bei 94°C, 30 Sekunden bei 55°C und 2 Minuten bei 72°C durchgeführt. Der Reaktant wurde dann für 5 Minuten bei 72°C behandelt.
Die erhaltene Reaktionslösung wurde an einem 0,8%-igen Agarosegel elektrophoretisch getrennt, um das amplifizierte PCR-Produkt in der Kombination von Vorwärtsprimer und Rückwärtsprimer zu bestätigen. Die Größe des PCR-Produkts betrug näherungsweise 900 bp.
4-3) Sequenzierung der partiellen cDNA
Das PCR-Produkt wurde in den TA-Klonierungsvektor pCR2.1 (Invitrogene Co.) inseriert und Escherichia coli JM109 wurde mit der Rekombination transformiert. Die Transformante wurde auf LB-Agarmedium (enthaltend 50 μg/μl Ampicillin) kultiviert. Gemäß den nachstehenden Bedingungen wurde Kolonie-PCR an den erhaltenen Kolonien als Matrize unter Verwendung des M13-Universalprimers durchgeführt. Der Escherichia-coli-Stamm, PCR-Puffer, dNTP-Gemisch, M13-Vorwärtsprimer, M13-Rückwärtsprimer, TaKaRa Ex Taq (eingetragene Marke, Takara Shuzo Co.) und Wasser wurden gemischt. Die Reaktion wurde durch Erhitzen des Gemischs auf 90°C für 10 Minuten, dann Wiederholen von 30 Zyklen von 30 Sekunden bei 94°C, 30 Sekunden bei 55°C und 2 Minuten bei 72°C und weiteres Erhitzen auf 72°C für 5 Minuten durchgeführt. Die Reaktionslösung wurde an einem 0,3%-igen Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennt und das Ziel-Kolonie-PCR-Produkt wurde an der Zentrifugensäule („spin column") vom Typ MicroSpin (eingetragene Marke) 5-400 (Amersham Pharmacia Co.) gereinigt. Dann wurde die Sequenzierung des erhaltenen Produkts unter Verwendung eines Gensequenzierungsgeräts mit der Bezeichnung ABI PRISM 310 (Applied Biosystems Co.) durchgeführt.
Die erhaltene Sequenz wurde unter Verwendung der Genanalyse-Software GENETYX-MAC (Software Development Co.) untersucht. Als Ergebnis wurde die partielle cDNA-Sequenz von näherungsweise 900 bp untersucht.
4-4) Sequenzierung der Volllängen-cDNA
Die folgenden Primer wurden basierend auf der Basensequenz der partiellen cDNA synthetisiert:
5'-RACE-1-Rückwärtsprimer; ACA GCA TCT CTG ACC GAA TC (SEQ ID NO:7)
5'-RACE-2-Rückwärtsprimer; AAT GGA CCT CGG TCA GAT TC (SEQ ID NO:8)
5'-RACE-3-Rückwärtsprimer; CAC TGT TGA CGA AGG TGA TG (SEQ ID NO:9)
3'-RACE-1-Vorwärtsprimer; GGA ACA GCT GAT GAA GAT CC (SEQ ID NO:10)
3'-RACE-2-Vorwärtsprimer; GGT GAG CAA GGT TAC TTC RC (SEQ ID NO:11)
Anschließend wurden gemäß der nachstehenden Verfahrensweise 5'-RACE und 3'-RACE durchgeführt, wobei der 5'/3'-RACE-Kit (Boehringer Mannheim Co.) verwendet wurde.
(a) 5'-RACE
1 μg Gesamt-RNA, cDNA-Synthesepuffer, dNTP-Gemisch, 5'-RACE-1-Rückwärtsprimer, AMV-Reversetranskriptase und DEPC-behandeltes Wasser wurden gemischt und das Gemisch wurde 60 Minuten lang bei 55°C und 10 Minuten lang bei 65°C inkubiert, um Erststrang-cDNA zu erhalten.
Anschließend wurde die so erhaltene Erststrang-cDNA an der Zentrifugensäule gereinigt und dann wurden Reaktionspuffer und 2 mM dATP zu der Erststrang-cDNA zugegeben und das Gemisch wurde drei Minuten lang bei 94°C stehen gelassen. Terminale Transferase (10 Units/μl) wurde zu dem Gemisch zugegeben und das resultierende Gemisch wurde 20 Minuten lang bei 37°C inkubiert. Nach der Inkubation wurden Erststrang-cDNA, PCR-Puffer, dNTP-Gemisch, 5'-RACE-2-Rückwärtsprimer, oligo(dT)-Ankerprimer und Wasser zu dem obigen Gemisch zugegeben. Die Reaktion wurde durch Erhitzen des Gemischs auf 94°C für 5 Minuten, dann Wiederholen von 30 Zyklen von 30 Sekunden bei 94°C, 30 Sekunden bei 55°C und eine Minute bei 72°C und weiterhin Erhitzen auf 72°C für 5 Minuten durchgeführt. In der Folge wurde geschachtelte PCR bzw. Nested-PCR mit dem ersten PCR-Produkt als Matrize, wobei die Kombination von 5'-RACE-3-Rückwärtsprimer und PCR-Ankerprimer unter den gleichen Bedingungen wie bei der ersten PCR verwendet wurde, durchgeführt.
Das erste PCR-Produkt und das Nested-PCR-Produkt wurden an einem 1,5%-igen Agarosegel elektrophoretisch getrennt, um die Bande von näherungsweise 600 bp zu bestätigen. Dieses Nested-PCR-Produkt wurde in den TA-Klonierungsvektor inseriert und die Sequenzierung wurde gemäß der Bestimmung der Basensequenz von cDNA, die oben stehend unter 4-3) beschrieben ist, durchgeführt und dann wurde die Sequenz analysiert.
(b) 3'-RACE
1 μg Gesamt-RNR, cDNA-Synthesepuffer, dNTP-Gemisch, oligo(dT)-Ankerprimer, AMV-Reversetranskriptase und DEPC-behandeltes Wasser wurden gemischt und das Gemisch wurde 60 Minuten lang bei 55°C inkubiert. Nachfolgend wurde der Reaktant 10 Minuten lang bei 65°C behandelt, um Erststrang-cDNA zu erhalten.
Anschließend wurde die so erhaltene erste PCR unter den nachfolgenden Bedingungen durchgeführt. Erststrang-cDNA, PCR-Puffer, dNTP-Gemisch, 3'-RACE-1-Vorwärtsprimer, PCR-Ankerprimer, TaKaRa Ex Taq (eingetragene Marke, Takara Shuzo Co.) und Wasser wurden gemischt. Die Reaktion wurde durch Erhitzen des Gemischs auf 94°C für 5 Minuten, dann Wiederholen von 30 Zyklen von 30 Sekunden bei 94°C, 30 Sekunden bei 55°C und 2 Minuten bei 72°C und weiteres Erhitzen auf 72°C für 5 Minuten durchgeführt. Die Nested-PCR wurde am ersten PCR-Produkt als Matrize durchgeführt, wobei die Kombination von 3'-RACE-2-Vorwärtsprimer und PCR-Ankerprimer unter den gleichen Bedingungen wie bei der ersten PCR verwendet wurde.
Das erste PCR-Produkt und das Nested-PCR-Produkt wurden an einem 1,5%-igen Agarosegel elektrophoretisch getrennt, um die Bande von näherungsweise 600 bp zu bestätigen. Das Nested-PCR-Produkt wurde in den TA-Klonierungsvektor inseriert und die Sequenzierung wurde gemäß der Bestimmung der Basensequenz von cDNA, die oben stehend unter 4-3) beschrieben ist, durchgeführt und die Sequenz wurde analysiert.
Als Ergebnis wurde die Größe (2000 bp) und die Sequenz von cDNA, die für das neue hämolytisch aktive Protein von Carybdea alata codiert, und die Anzahl (463 AS) und die Sequenz der Aminosäuren des Proteins ermittelt. Das bedeutet, dass das hämolytisch aktive Protein von Carybdea alata die Aminosäuresequenz besitzt, die durch SEQ ID NO:3 wiedergegeben wird und das Gen, das dafür codiert, die Basensequenz besitzt, die durch SEQ ID NO:4 wiedergegeben wird.
Das neue Protein der vorliegenden Erfindung, das wie oben stehend erwähnt erhalten wurde, ist das spezifische Protein, das die folgende physiologische Aktivität und physikalischen und chemischen Eigenschaften besitzt, wie sie durch das Beispiel angegeben werden:

(a) hämolytische Aktivität;
(b) ein Molekulargewicht von näherungsweise 50.000 Da (bestimmt durch SDS-Gelelektrophorese);
(c) die oben stehend beschriebenen Aminosäuresequenzen 1 und 2 als eine partielle Aminosäuresequenz; und
(d) die durch SEQ ID NO:3 wiedergegebene Aminosäuresequenz als die vollständige Aminosäuresequenz.

Industrielle Anwendbarkeit
Da das hämolytische Aktivität besitzende Protein, das von der Nematozyste von Carybdea alata stammt, und erfindungsgemäß bereitgestellt wird, ein neues Protein ist, das als Ergebnis der Homologierecherche anhand der partiellen Aminosäuresequenz und den vollständigen primären Aminosäuresequenzen zu bekannten Proteinen nicht ähnlich ist, ist es als biochemisches Reagenz zum Beispiel zur Aufklärung des Mechanismus einer Hämolyse etc. verwendbar.
Es stellt auch einen neuen Ansatz bereit, der gerichtet ist auf die Entwicklung von Wirkstoffen, wie zum Beispiel dem Medikament zur Behandlung des Stichs durch die Qualle, auf der Basis der Untersuchung der Korrelation der strukturellen Aktivität auf einer molekularen Ebene, und dem Antikörper am Protein oder dem partiellen Peptid etc. Weiterhin ist es verwendbar als Wirkstoff, der eine Blutplättchen agglutinierende Wirkung usw. besitzt und als Pestizide, wobei eine hämolytische Aktivität genutzt wird. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Protein, das die folgenden Eigenschaften besitzt: (1) hämolytische Aktivität; (2) ein Molekulargewicht von etwa 50.000 Da (bestimmt durch SDS-Gelelektrophorese) und (3) die Aminosäuresequenz, die durch eine beliebige von SEQ ID NO 1 und SEQ ID NO 2 wiedergegeben wird, als eine partielle Aminosäuresequenz.
Protein nach Anspruch 1, wobei das Protein von der Nematocyste von Carybdea alata erhalten wird.
Protein nach Anspruch 1, wobei das Protein aus dem Kulturprodukt der transformierten Zelle, die durch genetische Rekombinationstechnik hergestellt wurde, erhalten wird.
Protein nach Anspruch 1, das die durch SEQ ID NO 3 wiedergegebene Aminosäuresequenz besitzt.
Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Protein aus Kulturlösung der transformierten Zelle, die durch genetische Rekombinationstechnik unter Verwendung eines Polynucleotids, das mit einem Polynucleotid hybridisiert, das wenigstens eine der durch SEQ ID NO 1 und SEQ ID NO 2 wiedergegebenen Aminosäuresequenzen codiert, hergestellt wurde, erhalten wird.
Verfahren zur Herstellung des Proteins nach Anspruch 1, 2 oder 4, umfassend Ultraschallbehandlung der Nematocyste von Carybdea alata in Phosphorsäure-Pufferlösung und Extraktion und Reinigung der überstehenden Flüssigkeit nach Zentrifugation durch Ionenaustausch-Hochleistungsflüssigkeits chromatographie und Gelfiltrations-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie, um das Protein zu erhalten.
Verfahren nach Anspruch 6, gekennzeichnet durch Ausführen der Ultraschallbehandlung für eine Nematocyste in Phosphorsäure-Pufferlösung oder Ausführen der Ionenaustausch-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie und Gelfiltrations-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie in 10 mM Phosphorsäure-Pufferlösung (pH 6,0), enthaltend nicht weniger als 0,1 M NaCL, bei nicht mehr als 10°C.
Gen, codierend für die Aminosäuresequenz des Proteins nach einem der Ansprüche 1 bis 5, das eine hämolytische Aktivität besitzt.
Vektor, umfassend das Gen nach Anspruch B.
Wirtszelle, transformiert durch den Vektor, wie er in Anspruch 9 beansprucht wird.
Verfahren zur Herstellung eines Proteins nach einem der Ansprüche 1 bis 5, umfassend Kultivieren oder Wachsenlassen einer Wirtszelle, wie sie in Anspruch 10 beansprucht wird, und Gewinnung des Proteins aus der Wirtszelle oder der Kulturlösung.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend das Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 5 als einen aktiven Bestandteil.
Pestizid, umfassend das Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 5 als einen aktiven Bestandteil.