DE3852255T3

DE3852255T3 - Tumor-Nekrose-Faktor-inhibierendes Protein und dessen Reinigung

Info

Publication number: DE3852255T3
Application number: DE3852255T
Authority: DE
Inventors: David Wallach; Hartmut Engelmann; Dan Aderka; Menachem Rubinstein
Original assignee: Yeda Research and Development Co Ltd
Current assignee: Yeda Research and Development Co Ltd
Priority date: 1987-09-13
Filing date: 1988-09-13
Publication date: 2005-06-02
Anticipated expiration: 2008-09-14
Also published as: ES2067486T3; US5695953A; JPH09118631A; AU2206888A; US20050245731A1; JPH02200A; DE3852255T2; AU619482B2; ATE114715T1; ZA886818B; IL83878A0; DE3852255D1; ES2067486T5; CA1341575C; EP0308378B2; EP0308378A2; EP0308378A3; JP2755394B2; GR3014976T3; IL83878A

Description

Diese Erfindung betrifft ein Tumor-Nekrose-Faktor(TNF)-inhibierendes Protein, Salze, funktionelle Derivate und aktive Fraktionen davon, mit Ausnahme von Vorläufern, die die Bindung von TNF an seine Rezeptoren und den cytotoxischen Effekt von TNF inhibieren und gegen nachteilige Effekte von TNF verwendet werden können. Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Reinigung dieses TNF-inhibierenden Proteins und ein im wesentlichen aufgereinigtes Protein, seine Clonierung und Produktion durch DNA-Rekombinationsverfahren. Sie betrifft außerdem zum Schutz vor den nachteiligen Effekten von TNF verwendete Arzneimittel, die ein derartiges Protein oder Salze, funktionelle Derivate oder aktive Fraktionen davon enthalten.
Der Tumor-Nekrose-Faktor-alpha (TNF-alpha) und Lymphotoxin oder TNF-beta (hier nachstehend bezeichnet die Abkürzung TNF sowohl TNF-alpha als auch TNF-beta) sind Cytokine, die in vielfältiger Weise auf Zellen wirken (D. Wallach, in: Interferon 7 (1986), 83–122, (Hrsg.: Ion Gresser), Academic Press, London, und B. Beutler und A. Cerami, New England J. Med. 316 (1987), 379–385). Die Wirkung von TNF-alpha sowie TNF-beta beginnt damit, daß sie an spezifische Zelloberflächenrezeptoren binden. Einige Effekte sind für den Organismus wahrscheinlich vorteilhaft: Sie können beispielsweise Tumorzellen oder Virus-infizierte Zellen zerstören und die antibakteriellen Wirkungen von Granulocyten erhöhen. Sowohl TNF-alpha als auch TNF-beta weisen allerdings ziemlich eindeutig auch sehr nachteilige Effekte auf. Es gibt Befunde, die bestätigen, daß TNF-alpha ein Hauptpathogen bei mehreren Krankheiten sein kann, wenn es in zu großen Mengen produziert wird. Es ist bekannt, daß TNF- alpha durch seine primäre Wirkung auf Gefäße eine Hauptursache für die Symptome eines septischen Schocks ist (K. J. Tracey et al., Science 234 (1986), 470–474). Bei einigen Krankheiten kann TNF einen starken Gewichtsverlust (Cachexia) bewirken, indem er die Aktivität von Fettzellen hemmt und eine Appetitlosigkeit bewirkt, und daher erhielt TNF-alpha die Bezeichnung Cachectin. Er wurde ferner als Mediator bei Gewebeschädigungen im Zusammenhang mit rheumatischen Krankheiten beschrieben (Beutler, s. o.) und als ein Hauptmediator bei Schädigungen, die im Zusammenhang mit Transplantatabstoßungsreaktionen beobachtet werden.
Es ist daher erforderlich, Möglichkeiten zu finden, um endogen gebildetes oder exogen verabreichtes TNF zu entfernen oder diesem durch einen Antagonisten entgegenzuwirken. Ein erster Versuch in diesem Zusammenhang war die Entwicklung von monoclonalen Antikörpern, die die cytotoxische Aktivität von TNF-alpha neutralisieren konnten und von denen gezeigt werden konnte, daß sie Mäuse vor der tödlichen Wirkung von TNF-alpha unter Bedingungen, die einen septischen Schock auslösen, schützen konnten (vgl. die am 9. Juli 1986 veröffentlichte europäische Patentanmeldung EP 0 186 833 ). Besonders eine wiederholte therapeutische Verabreichung von monoclonalen Maus-Antikörpern ist jedoch für Menschen nicht immer empfehlenswert. Daher mußten biologische Wirkstoffe entwickelt werden, die als Antagonisten in ähnlicher Weise den nachteiligen Effekten von TNF entgegenzuwirken können. Vor der Einreichung der Prioritätsanmeldung der vorliegenden Anmeldung waren keine biologischen Wirkstoffe bekannt, die als Antagonisten der cytotoxischen Aktivität von TNF entgegenwirken konnten. Es gab Veröffentlichungen über Uromodulin, einem immunsuppressiven 85 kD-Glycoprotein, das aus dem Urin von schwangeren Frauen isoliert worden war (Andrew V. Muchmare und Jean M. Decker, Science 229 (1985), 479–481) und nachweislich ein Ligand mit einer hohen Affinität für und ein potenter Inhibitor von Interleukin 1 (IL-1) war (Andrew V. Muchmore und Jean M. Decker, J. Biol. Chem. 261 (1986), 13404–13407, K. M. Brown et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 (1986), 9119–9123). Später wurde nachgewiesen, daß Uromodulin mit dem Tamm-Horsfall-Glycoprotein, dem häufigsten Protein der Niere im normalen Urin, identisch war (Diane Pennica et al., Science 236 (1987), 83–88). Ein weiterer im Urin von Patienten mit Fieber festgestellter Inhibitor von IL-1 wurde in einigen Veröffentlichungen beschrieben (Zenghua Liao et al., J. Exp. Med. 159 (1984), 126–136, und Phillippe Seckinger et al., J. Immunol. 139 (1987), 1546–1549). Es wurde gezeigt, daß dieser IL-1-Inhibitor aus Urin zahlreiche biologische Aktivitäten von beiden rekombinanten IL-1-Formen, IL-1-alpha und IL-1-beta, gleichermaßen beeinflußt. Obwohl menschliches TNF-alpha und IL-1 einige gemeinsame biologische Aktivitäten aufweisen, inhibierte dieser IL-1-Inhibitor die biologischen Aktivitäten von TNF-alpha nicht (Phillippe Seckinger et al., J. Immunol. 139 (1987), 1541–1545).
Nach dem Einreichungsdatum der Prioritätsanmeldung der vorliegenden Anmeldung wurde berichtet, daß Uromodulin und das Tamm-Horsfall-Glycoprotein rekombinantes IL-1-alpha, IL-1-beta und TNF-alpha in einer Lectin-artigen Interaktion binden, und es wurde davon ausgegangen, daß es eine wichtige Rolle bei der Regulierung der zirkulierenden Mengen dieser Lymphokine spielt (Catherine Hession et al., Science 237 (1987), 1479–1484). Obwohl Uromodulin die cytotoxische Aktivität von TNF-alpha nicht inhibierte, wie durch eine Lyse von Tumorzielzellen ermittelt werden konnte, interagiert es mit rekombinantem TNF-alpha über Kohlehydratketten, und diese Interaktion kann für eine verbesserte Beseitigung und/oder Reduktion der Toxizität von TNF und anderer Lymphokine in vivo kritisch sein (Anne P. Sherblom, J. Biol. Chem. 263 (1988), 5418–5424). In einer kürzlichen Veröffentlichung von Seckinger et al. (J. Exp. Med. 167 (1988), 1511–1516) wurde ein aus dem Urin von Patienten mit Fieber erhaltener menschlicher Inhibitor von TNF-alpha als ein 40 bis 60 kD-Protein charakterisiert, das die cytotoxische Aktivität von TNF-alpha inhibiert. Es wurde ge zeigt, daß es sich von Uromodulin und dem vorstehend beschriebenen IL-1-Inhibitor unterscheidet.
Die vorliegende Erfindung liefert ein Tumornekrosefaktor (TNF)-inhibierendes Protein mit den folgenden Merkmalen:

(a) es inhibiert die Bindung von TNF an seine Rezeptoren und den cytotoxischen Effekt von TNF;
(b) wenn Urinrohpräparationen davon über eine Ultrogel AcA 44-Filtrationssäule chromatographiert werden, eluiert der Hauptpeak mit TNF-inhibierender Aktivität kurz vor der Hauptmenge an Protein und zeigt ein relatives Molekulargewicht von etwa 40 bis 80 kDa; und
(c) wenn Urinrohpräparationen davon analysiert werden, liegt der isoelektrische Punkt des aktiven Proteins zwischen pH 6 und 8.

In einer Ausführungsform ist das TNF-inhibierende Protein aus menschlichem Urin erhältlich durch

(a) Lectinaffinitätschromatographie mit der Fraktion, die nicht durch eine Membran mit einem molekularen Ausschlußvolumen von 10 kDa dialysierbar ist;
(b) Elution des an das Lectin adsorbierten Proteins;
(c) Gelfiltration oder Ionenaustauschchromatographie mit dem eluierten Protein; und
(d) Gewinnung derjenigen Fraktionen, die die Bindung von TNF an seine Rezeptoren und den cytotoxischen Effekt von TNF inhibieren.

Die Erfindung betrifft ferner das TNF-inhibierende Protein in im wesentlichen aufgereinigter Form, das die folgende Aminosäuresequenz in seinem N-terminalen Bereich enthält:
worin X ein nicht-identifizierter Aminosäurerest ist, oder ein Salz, funktionelles Derivat oder ein aktiver Bestandteil davon mit Ausnahme von Vorläufern, wobei der aktive Bestandteil die Bindung von TNF an seine Rezeptoren und den cytotoxischen Effekt von TNF inhibieren kann.
Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Reinigung des TNF-inhibierenden Proteins.
Die Erfindung betrifft ferner rekombinante DNA-Moleküle, die die dieses Protein codierende Nucleotidsequenz enthalten, die sie enthaltenden Expressionsvehikel und damit transformierte Wirtszellen und ein Verfahren zur Produktion des TNF-inhibierenden Proteins durch Züchtung dieser transformierten Zellen in einem geeigneten Kulturmedium.
Das erfindungsgemäße TNF-inhibierende Protein und Salze, funktionellen Derivate oder aktive Fraktionen davon können als Wirkstoffe in Arzneimitteln zum Schutz von Säugern vor den nachteiligen Wirkungen von TNF verwendet werden.
Beschreibung der Figuren
1A zeigt das Elutionsprofil des TNF-inhibierenden Proteins in einer Ultrogel ACA 44-Gelfiltrationssäule. Zwei (2) ml-Fraktionen wurden gesammelt, und der Proteingehalt wurde durch Messung der Absorption bei 258 nm ermittelt
die Interferenz mit ¹²⁵I-TNF-alpha, das an dessen Zelloberflächenrezeptoren binden kann, bestimmt
und die Hemmung der cytotoxischen Aktivität von TNF-alpha
gemessen. Der Hauptpeak mit TNF-inhibierender Aktivität eluierte kurz vor der Hauptmenge an Protein.
1B zeigt das Elutionsprofil des TNF-inhibierenden Proteins, wenn es vor dem Auftragen auf eine Ultrogel ACA 44-Gelfiltrationssäule gegen Wasser dialysiert wurde. 2 ml-Fraktionen wurden gesammelt und wie in 1A getestet. Die Dialyse gegen Wasser änderte das Elutionsprofil im Vergleich zu 1A nicht.
2 zeigt die Morphologie von Maus-A9-Zellen, die mit Cycloheximid (CHI) (a), TNF-alpha-CHI (b) und TNF-alpha-CHI zusammen mit TNF-inhibierendem Protein (c) behandelt wurden.
3 zeigt die Ergebnisse des zweiten Reinigungsschritts des TNF-inhibierenden Proteins. Carboxymethyl(CM)-Sepharose-gereinigtes TNF-inhibierendes Protein wurde in 8 × 2 ml-Portionen auf eine S 5/5-Kationenaustauchersäule geladen und mit einem linearen NaCl-Gradienten von 0 bis 350 mM (– – – –) in einem Puffer, der 10 mM Zitronensäure und 0,02% Natriumazid, pH 5,0, enthielt, eluiert. Mit einer Fließgeschwindigkeit von 0,5 ml/Minute wurden 0,5 ml-Fraktionen gesammelt und auf eine Hemmung der TNF-Toxizität für Maus-A9-Zellen getestet. Bei einer Salzkonzentration von 180 bis 200 mM NaCl eluierte die Hauptmenge an TNF-inhibierendem Protein
Der Proteingehalt wurde durch Absorption bei 280 nm gemessen
4 zeigt die Ergebnisse des dritten Reinigungsschritts des TNF-inhibierenden Proteins. Das durch eine Reinigung auf CM-Sepharose und Mono S erhaltene aktive Protein wurde gegen einen Puffer, der 5 mM Natriumborat und 0,02% Natriumazid, pH 9,0, enthielt, dialysiert und auf eine Mono Q 5/5-Anionenaustauschersäule geladen. Die gebundenen Proteine wurden mit einer Fließgeschwindigkeit von 0,5 ml/Minute mit einem linearen Salzgradienten von 0 bis 60 mM NaCl und anschließend von 60 bis 300 mM NaCl eluiert (– – – –). 0,5 ml-Fraktionen wurden gesammelt und auf eine Hemmung der TNF-Cytotoxizität für Maus-A9-Zellen getestet
Der Proteingehalt wurde während der Elution durch Messung der Absorption bei 280 nm gemessen
Wie dargestellt, eluierte die Hauptmenge der Aktivität bei einer Salzkonzentration von 30 bis 40 mM.
5 zeigt die Trennung des TNF-inhibierenden Proteins durch eine Umkehrphasen-HPLC. 1,6 ml des aus Mono Q 5/5 eluierten aktiven Proteins wurden auf eine Aquapore RP-300-HPLC-Säule (Brownlee Labs), die mit wäßrigem 0,3% TFA (Puffer F) in Wasser mit einer Fließgeschwindigkeit von 0,5 ml/Minute betrieben wurde, injiziert. Die Säule wurde anschließend mit einem linearen Acetonitril-Gradienten von 0 bis 20% in F-Puffer 5 Minuten, anschließend mit einem linearen Gradienten von 20 bis 50% 60 Minuten und dann mit einem linearen Gradienten von 50 bis 80% 5 Minuten (– – – –) eluiert. 0,5 ml-Fraktionen wurden gesammelt und auf eine Hemmung der TNF-Cytotoxizität für Maus-A9-Zellen getestet. Der Proteingehalt wurde bei der Elution durch Messung der relativen Fluoreszenz von Vergleichsproben jeder Fraktion nach einer automatischen Umsetzung mit Fluorescamin ermittelt
Die TNF-inhibierende Aktivität eluierte als scharfer Peak zusammen mit einem isolierten Proteinpeak.
6: Proben des aktiven Materials von jedem Reinigungsschritt.
Das erfindungsgemäße TNF-inhibierende Protein kann aus menschlichem Urin erhalten werden. Wenn aus menschlichem Urinkonzentrat stammende Rohpräparate auf einer Ultrogel ACA 44-Gelfiltrationssäule chromatographiert wurden, zeigten sie ein relatives Molekulargewicht von 40 bis 80 kD. Das im wesentlichen von Proteinverunreinigungen freie, aufgereinigte Protein wies bei einer Analyse durch SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen ein Molekulargewicht von etwa 26 bis 28 kD auf, und es wanderte als einzelner Peak in einer Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC). Der durch isoelektrische Fokussierung bestimmte isoelektrische Punkt des aktiven Proteins war zwischen pH 6 und 8. Seine Aktivität wurde durch seine Fähigkeit zur Hemmung der Bindung von TNF-alpha an seine Zelloberflächen-Rezeptoren auf menschlichen HeLa- und FS11-Fibroblastenzellen und/oder durch seine Fähigkeit zur Hemmung des cytotoxischen Effekts von TNF-alpha auf Maus-A9-Zellen gemessen.
Das Protein ist ferner dadurch gekennzeichnet, daß es die nachstehend beschriebene Aminosäuresequenz am N-Terminus enthält:
in der die mit X abgekürzte Aminosäure in Position 14 nicht identifiziert wurde und das Cystein (Cys) in Position 4 theoretisch ist, da PTH (Phenylthiohydantoin)-Cys als solches nicht identifiziert werden kann und kein anderer Rest in dieser Position nachgewiesen wurde.
Der hier verwendete Begriff "Salze" betrifft sowohl Salze der Carboxylgruppen als auch saure Anlagerungssalze von Aminogruppen des Proteinmoleküls, die die Bindung von TNF an seine Rezeptoren und den cytotoxischen Effekt von TNF auf Zellen inhibieren können. Salze einer Carboxylgruppe können durch im Stand der Technik bekannte Verfahren hergestellt werden und schließen anorganische Salze, beispielsweise Natrium-, Calcium-, Ammonium-, Eisen-, Zinksalze etc., und Salze mit organischen Basen, die beispielsweise mit Aminen, beispielsweise Triethanolamin, Arginin, Lysin, Piperidin, Procain, etc. gebildet werden, ein. Saure Anlagerungssalze beinhalten beispielsweise Salze mit Mineralsäuren, beispielsweise mit Chlorwasserstoffsäure oder Schwefelsäure, und Salze mit organischen Säuren, beispielsweise mit Essigsäure oder Oxalsäure.
Der hier verwendete Begriff "funktionelle Derivate" betrifft Derivate, die die Bindung von TNF an seine Rezeptoren und den cytotoxischen Effekt von TNF auf Zellen inhibieren und durch im Stand der Technik bekannte Verfahren mit den als Seitenketten auf den Resten vorhandenen funktionellen Gruppen oder den N- oder C-terminalen Resten hergestellt werden können, und sie sind dann in die Erfindung mit eingeschlossen, wenn sie ihre pharmazeutische Verträg 1ichkeit behalten, d. h., wenn sie die Aktivität des Proteins nicht zerstören und auch keine toxischen Eigenschaften auf sie enthaltende Zusammensetzungen übertragen.
Beispiele für diese Derivate sind aliphatische Ester der Carboxylgruppen, Amide der Carboxylgruppen durch Umsetzung mit Ammoniak oder mit primären oder sekundären Aminen, N-Acyl-Derivate der freien Aminogruppen der Aminosäurereste, die mit Acyleinheiten (z. B. Alkanoyl- oder carbocyclischen Aroyl-Gruppen) gebildet werden, oder O-Acyl-Derivate einer freien Hydroxylgruppe (beispielsweise von Seryl- oder Threonylresten), die mit Acyl-Einheiten gebildet werden.
Der Begriff "aktive Fraktionen" des TNF-inhibierenden Proteins betrifft erfindungsgemäß jedes Fragment der Polypeptidkette des Proteinmoleküls allein oder zusammen mit assoziierten Molekülen oder daran gebundenen Resten, z. B. Zucker- oder Phosphatresten, oder Aggregate aus Proteinmoleküle oder Zuckerresten, die mit sich selber Aggregate bilden, vorausgesetzt, daß diese Fraktion die Bindung von TNF an seine Rezeptoren und den cytotoxischen Effekt von TNF auf Zellen inhibieren kann.
Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem Gemische der vorstehend beschriebenen Substanzen.
1. Erste Charakterisierung und Vorreinigunq des TNF-inhibierenden Proteins
Eine erste Charakterisierung im Rohzustand zeigte, daß das Protein die nachstehend beschriebenen Eigenschaften und Aktivitäten aufwies.

a) Die TNF-inhibierende Aktivität konnte im Urin von gesunden und kranken Spendern festgestellt werden.
b) Das aktive Protein konnte nicht durch Membranen mit einer molekularen Ausschlußgrenze von 10 kD dialysiert werden.
c) Es wurde festgestellt, daß das relative Mole- kulargewicht des aktiven TNF-inhibierenden Proteins bei einer Chromatographie auf einer Ultrogel ACA 44-Gelfil trationssäule zwischen 40 und 80 kD lag. Eine ausgedehnte Dialyse gegen Wasser veränderte das Verhalten des Proteins in diesem Verfahren nicht (1A und 1B).
d) Der isoelektrische Punkt des aktiven Proteins lag gemäß einer Bestimmung durch präparative isoelektrische Fokussierung zwischen pH 6 und 8.
e) Das aktive Protein konnte teilweise an Concanavalin A-Sepharose gebunden und mit Methyl-alpha-D-mannopyranosid spezifisch eluiert werden, was den Schluß nahelegt, daß das Protein glycosyliert ist.
f) Die TNF-inhibierende Aktivität war Hitze-labil.
g) Einige Protease-Inhibitoren hemmten die biologische Aktivität des TNF-inhibierenden Proteins nicht, was den Schluß nahelegt, daß der der TNF-Hemmung zugrundeliegende Mechanismus durch im ungereinigten Urin vorhandene proteolytische Aktivitäten nicht erklärt werden kann.
h) Die Bindung von TNF-alpha an seine Zelloberflächenrezeptoren wurde nur gehemmt, wenn das das TNF-inhibierende Protein enthaltende Proteinrohgemisch gleichzeitig mit TNF aufgetragen wurde (Tabelle 1).

Das erfindungsgemäße TNF-inhibierende Protein unterscheidet sich daher von Uromodulin durch einige der vorstehend beschriebenen Eigenschaften, beispielsweise durch (a) sein durch Gelfiltration bestimmtes relatives Molekulargewicht, (b) seinen isoelektrischen Punkt und (c) die Tatsache, daß keine starke Aggregation des Proteins bei einer Dialyse gegen Wasser beobachtet werden konnte.
Teilweise gereinigte TNF-inhibierende Proteinpräparate wurden erhalten, indem die Urinproteine durch Gelfiltration gemäß dem nachstehend beschriebenen Verfahren fraktioniert wurden: Urin wurde durch Ultrafiltration durch eine Membran mit einer molekularen Ausschlußgrenze von 10 kD konzentriert und anschließend durch Ultrafiltration durch eine Membran mit einer molekularen Ausschlußgrenze von 5 000 kD (Amicon YM5-Membran) weiter konzentriert. Das Konzentrat wurde gegen PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung), die 1 mM Mg²⁺ und 1 mM Ca²⁺ enthielt, dialysiert und anschließend auf eine mit dem gleichen Puffer äquilibrierte Concanavalin A-Sepharosesäule aufgetragen. Die Säule wurde gewaschen und die spezifisch an die Säule gebundenen Proteine wurden mit 0,5 M Methyl-alpha-D-Mannopyranosid eluiert. Es wurde festgestellt, daß die Hauptmenge, jedoch nicht die gesamte Aktivität, die die Bindung von TNF-alpha an seine Rezeptoren hemmt, spezifisch an Lectin adsorbierte und mit Methyl-alpha-D-Mannopyranosid eluiert werden konnte.
Eine Probe von 3,5 mg der von Concanavalin A eluierten Proteine wurde gegen PBS dialysiert und durch Gelfiltrationschromatographie auf einer 2 × 45 cm-Ultrogel ACA 44-Säule (LKB, Schweden) fraktioniert. Die Absorption der eluierten Proteine bei 258 nm wurde ermittelt
Die 2 ml-Fraktionen wurden gesammelt, 1 : 20 verdünnt und durch die nachstehend in 2.1
und 2.2 beschriebenen Verfahren daraufhin untersucht, ob sie vor TNF-alpha schützen können, wobei der letzte Test so modifiziert wurde, daß TNF-alpha in einer Konzentration von 75 E/ml verwendet wurde, und BALB/c-CL.7-Zellen im Test verwendet wurden. Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde nach 12 Stunden durch Bestimmung der Aufnahme von Neutralrot
(1A) untersucht.
Eine identische Probe der von Concanavalin A eluierten Proteine wurde 48 Stunden gegen destilliertes Wasser dialysiert und anschließend zur Entfernung unlöslicher Proteine zentrifugiert. Sie wurde gefriergetrocknet, anschließend in PBS rekonstituiert und, wie vorstehend beschrieben, auf der Ultrogel ACA 44-Säule chromatographiert.
Die Fraktionen wurden gesammelt und, wie vorstehend beschrieben, getestet. Es gibt keine signifikante Veränderung im Fraktionierungsmuster der schützenden Aktivität (1B). Ein Vergleich mit der Retentionszeit von Molekulargewichtsmarkern (Rinderserumalbumin 67 kD, Ovalbumin 43 kD, Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor 20,1 kD und Cytochrom C 12,3 kD) zeigte, daß die Aktivität etwas vor dem Hauptproteinpeak mit maximaler Aktivität bei einem relativen Molekulargewicht von etwa 50 bis 70 kD eluierte. Tabelle I Untersuchung des Effekts des das TNF-inhibierende Protein enthaltenden Urinkonzentrats durch eine Verabreichung an Zellen vor der Zugabe von oder zusammen mit TNF-alpha Bindung von ¹²⁵I-TNF-alpha an Zellen. Effekt des verwendeten TNF-inhibierenden Proteins
Eine Abnahme der Bindung von ¹²⁵I-TNF-alpha an Zellen aufgrund des im Urinkonzentrat vorhandenen TNF-inhibierenden Proteins wird nur beobachtet, wenn ¹²⁵I-TNF-alpha und das Protein zusammen den Zellen verabreicht werden und nicht, wenn das Protein zuerst den Zellen verabreicht und anschließend vor der Verabreichung von TNF-alpha entfernt wird. Dies zeigt, daß die Hemmung der Bindung von TNF-alpha an Zellen weder durch eine Wirkung des TNF-inhibierenden Proteins auf die Zellen, noch durch die Gegenwart des TNF-alpha selbst im Urin bewirkt wird, sondern es zeigt, daß das erfindungsgemäße Protein und TNF-alpha irgendwie in Wechselwirkung treten.
2. Tests des erfindungsgemäßen TNF-inhibierenden Proteins
Zwei Testverfahren wurden verwendet, um die Aktivität des TNF-inhibierenden Proteins in den verschiedenen Fraktionen während des Reinigungsverfahrens zu messen.
2.1 Hemmung der Bindung von TNF-alpha an seine Rezeptoren
Das Testverfahren zur quantitativen Bestimmung der TNF-Bindung an Zellen wurde, wie beschrieben, durchgeführt (S. Israel et al., Immunol. Letters 12 (1986), 217–224, und H. Holtmann und D. Wallach, J. Immunol. 139 (1987), 1161–1167).
Zellen (HeLa- oder FS11-Vorhaut-Fibroblastenzellen) wurden in ein DMEM-Medium (essentielles Dulbecco's Modified Eagle's Minimal Medium"), das sich in den 15 mm-Vertiefungen von Trägerplatten befand, mit einer Dichte von 2,5 × 10⁵ Zellen/Vertiefung gesät. Nach einer Inkubation von 24 Stunden bei 37°C in 5% CO₂ wurden die Platten auf Eis transferiert, das Wachstumsmedium wurde entfernt, Aliquots der das TNF-inhibierende Protein enthaltenden Proben wurden mit 10 Einheiten von markiertem ¹²⁵I-TNF-alpha (10⁵ cpm) in 0,15 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), der 1 mM Ca²⁺, 1 mM Mg²⁺, 0,5 mg/ml Rinderserumalbumin (BSA) und 0,1 Natriumazid (PBS/BSA) zugesetzt wurde, vermischt, auf die Zellen aufgetragen und 2 Stunden bei 4°C inkubiert. Die Zellen wurden anschließend mit PBS/BSA gespült, in Gefäße zur radioaktiven Messung überführt und der gebundene Marker in einem Gammazähler quantitativ bestimmt. Die unspezifische Bindung wurde durch Zugabe eines Überschusses an nicht markiertem TNF zum Test ermittelt und der Wert jedesmal subtrahiert.
2.2 Hemmung der cytytoxischen Aktivität von TNF-alpha
Die Entwicklung dieses biologischen Tests beruhte auf dem cytotoxischen Effekt von TNF auf mit Cycloheximid (CHI)-sensibilisierte Zellen und deren quantitativer Bestimmung durch das Neutralrot-Aufnahmeverfahren, wie von D. Wallach, J. Immunol. 132 (1984), 2464–2469, beschrieben.
– Mit den Proben, die auf die Gegenwart des Proteins getestet werden sollten, wurde bei 4°C durch Verdünnung mit DMEM auf das doppelte Volumen eine Verdünnungsreihe hergestellt und ein gleiches Volumen des gleichen Mediums, das außerdem 40 E/ml TNF-alpha und 400 μg/ml Cycloheximid (CHI) enthielt, zugesetzt.

– Maus-A9-Zellen wurden in Mikrotiterplatten gesät, die 96 Vertiefungen mit flachem Boden aufwiesen und 100 μl DMEM-CS (DMEM mit 5% fötalem Kälberserum und 5% Kälberserum) enthielten (1,5 × 10⁴ Zellen/Vertiefung).
– 100 μl-Aliquots der Protein-TNF-alpha-CHI-Gemische der Verdünnungsreihe wurden in jede Vertiefung gegeben und die Inkubation der Zellen 14 Stunden fortgesetzt.
– Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde durch 2-stündige Inkubation mit Neutralrot, Abwaschen von überschüssigem Farbstoff, Extraktion von Neutralrot, das von den Zellen aufgenommen worden war, mit einem Sorenson-Zitratpuffer-Ethanolgemisch und seine kolorimetrische quantitative Bestimmung bei 570 nm mit einem "Microelisa Auto-reader" ermittelt.
– 1 E/ml TNF-Inhibitor-Aktivität wurde als Verdünnungsfaktor definiert, der einen statistisch signifikanten Schutz vor einer tödlichen Wirkung von TNF (p < 0,05) liefert.

Der biologische Test wird in der vorliegenden Erfindung vorzugsweise zur Bestimmung der Aktivität des Proteins während der Reinigung verwendet, da er weniger arbeitsaufwendig ist und kein radioaktiv markiertes Material verwendet werden muß. Es ist nicht erforderlich, die Zellen aus den einzelnen Vertiefungen in Zählgefäße zu überführen, und viele Tests können unter Verwendung des "Microelisa Auto-readers" ziemlich schnell durchgeführt werden.
Die Morphologie der Maus-A9-Zellen, die unter den Bedingungen dieses biologischen Tests behandelt wurden, ist in 2 dargestellt. (a) stellt Zellen dar, die lediglich mit CHI inkubiert wurden, (b) Zellen, die mit einem TNF-alpha-CHI-Gemisch inkubiert wurden, und (c) Zellen, die mit einem TNF-alpha-CHI-Gemisch zusammen mit einer Probe des TNF-inhibierenden Proteins (im Anschluß an eine Reinigung über CM-Sepharose, wie nachstehend beschrieben) inkubiert wurden. Die Schutzwirkung des TNF-inhibierenden Proteins vor dem cytotoxischen Effekt von TNF-alpha ist in (c) sehr deutlich zu erkennen.
3. Reinigung des TNF-inhibierenden Proteins
In der bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform wird das im wesentlichen aufgereinigte erfindungsgemäße Protein durch ein Verfahren produziert, das

a) die Gewinnung der Proteinrohfraktion aus einem dialysierten menschlichen Urinkonzentrat,
b) die Durchführung einer Ionenaustauschchromatographie mit dieser in Schritt (a) erhaltenen Proteinrohfraktion, um teilweise gereinigte aktive Fraktionen des TNF-inhibierenden Proteins zu erhalten, die durch ihre Fähigkeit zur Hemmung sowohl der Bindung von TNF an seine Rezeptoren als auch des cytotoxischen Effekts von TNF definiert sind,
c) die Durchführung einer Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) mit diesen in Schritt (b) erhaltenen, teilweise gereinigten Fraktionen des TNF-inhibierenden Proteins, um im wesentlichen aufgereinigte aktive Fraktionen des TNF-inhibierenden Proteins zu erhalten, das durch seine Fähigkeit zur Hemmung sowohl der Bindung von TNF an seine Rezeptoren als auch des cytotoxischen Effekts von TNF definiert sind, und
d) die Gewinnung des im wesentlichen aufgereinigten Proteins aus Schritt (c), das als ein einzelner Peak bei der Umkehrphasen-HPLC wandert, umfaßt.

In einer bevorzugten Ausführungsform dieses Verfahrens wies das im wesentlichen aufgereinigte Protein auf einer SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen ein Molekulargewicht von etwa 26 bis 28 kD auf.
Die Ionenaustauschchromatographie von Schritt (b) wird vorzugsweise in 3 Schritten durchgeführt und schließt eine chromatographische Reinigung an Carboxymethyl-Sepharose-, Mono S HR 5/5 FPLC- und Mono Q HR 5/5 FPLC-Säulen, vorzugsweise in dieser Reihenfolge, ein. Die Umkehrphasen-HPLC wird vorzugsweise in einer Aquapore-RP300-Säule durchgeführt.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wurden alle Reinigungsschritte des Verfahrens durch Messung der Proteinkonzentration (Absorption bei 280 nm oder relative Fluoreszenz, nach einer automatischen Umsetzung der jeweiligen Aliquots mit Fluorescamin) und der Hemmung der cytotoxischen Aktivität von TNF-alpha gemäß dem in 2.2 vorstehend beschriebenen biologischen Test überwacht.
3.1 Herstellung des Urinkonzentrats
Ein 200 ml-Pool aus männlichem Urin von gesunden Spendern wurde einer Mikrofiltration durch eine Pellicon-Membran mit einem Porendurchmesser von 0,45 μm unterzogen. Das Filtrat wurde durch Ultrafiltration unter Verwendung einer Pellicon-Membran mit einer molekularen Ausschlußgrenze von 10 kD auf ein Endvolumen von 500 ml konzentriert. Das Konzentrat wurde gegen eine phosphatgepufferte Kochsalzlösung, die 1 mM Benzamidin und 0,1% Natriumazid enthielt, dialysiert.
3.2 Carboxymethyl (CM)-Sepharose-Chromatographie
Eine CM-Sepharose-Kationenaustauschersäule mit einer Abmessung von 2,7 × 10 cm (Pharmacia) wurde mit 1 M NaCl und 10 mM Zitronensäurepuffer, pH 5,0, der 0,02% Natriumazid enthielt, (Puffer C) vorgewaschen und mit 10 mM Zitronensäurepuffer, pH 5,0, der 0,02% Natriumazid enthielt, (Puffer A) äquilibriert. Das Urinkonzentrat aus dem vorstehend beschriebenen Schritt 3.1 wurde gegen das zweimal ausgetauschte 100fache Probenvolumen an Puffer A dialysiert und 15 Minuten mit 8 000 Upm zentrifugiert. Der Überstand wurde bei 4°C mit einer Fließgeschwindigkeit von 2 ml/Minute auf eine CM-Sepharosesäule aufgetragen, und es wurden 50 ml-Fraktionen gesammelt. Die Säule wurde mit Puffer A gewaschen bis kein Protein mehr nachgewiesen werden konnte (etwa 1500 ml) und anschließend mit dem 5fachen Säulenvolumen aus 200 mM NaCl und 10 mM Zitronensäurepuffer, pH 5,0, der 0,02 Natriumazid enthielt, (Puffer B) (5 Fraktionen) und anschließend mit dem 3fachen Säulenvolumen an Puffer C (3 Fraktionen) eluiert. Die Fraktionen wurden gesammelt und, wie beschrieben, getestet. Der Hauptteil mit der biologischen Aktivität des TNF-inhibierenden Proteins wurde in der zweiten mit dem Puffer B eluierten Fraktion festgestellt.
3.3 Kationenaustauschchromatographie auf einer Mono S HR 5-FPLC-Säule
Die Mono S HR 5/5-Säule (Pharmacia) wurde mit einem 10 mM Zitronensäurepuffer, pH 5,0, der 0,02% Natriumazid enthielt, (Puffer A) vorgewaschen, bis sich eine stabile Basislinie zeigte (die bei 280 nm durch einen W-Detektor kontrolliert wurde). Die aus der CM-Sepharosesäule eluierten aktiven Fraktionen wurden vereinigt und gegen das zweimal ausgetauschte 100fache Probenvolumen an Puffer A dialysiert. Die Probe wurde in 8 × 2 ml Portionen auf die Säule inji ziert, bis die maximale Bindungskapazität der Säule (28 mg) erreicht war. Die Säule wurde mit Puffer A gewaschen, bis eine flache Basislinie zu sehen war. Die gebundenen Proteine wurden mit einem linearen NaCl-Gradienten (0 bis 350 mM) in Puffer A eluiert. Mit dem Gradienten wurde 40 Minuten mit einer Fließgeschwindigkeit von 0,5 ml/Minute eluiert. Anschließend wurde die Säule 10 Minuten mit 350 mM NaCl in Puffer A (Puffer D) gewaschen. Die Proteine, die mit einer NaCl-Konzentration von 350 mM nicht eluiert werden konnten, wurden anschließend mit Puffer C aus der Säule eluiert. 0,5 ml-Fraktionen wurden gesammelt und, wie beschrieben, getestet. Die Ergebnisse sind in 3 dargestellt. Es wurde festgestellt, daß der Hauptteil der Aktivität in den Fraktionen 20 bis 23, die den NaCl-Konzentrationen von 180 bis 220 mM entsprachen, eluierte.
3.4 Anionenaustauscherchromatographie an einer Mono Q HR 5/5 FPLC-Säule
Die Mono Q HR 5/5-Säule (Pharmacia) wurde mit einem 5 mM Natriumboratpuffer, pH 9,0, der 0,02% Natriumazid enthielt, (Puffer E) vorgewaschen, bis eine stabile Basislinie erhalten wurde. Die aus der Mono S-Säule eluierten aktiven Fraktionen wurden vereinigt und gegen das zweimal ausgetauschte 100fache Probenvolumen an Puffer E dialysiert. Die Probe wurde in 2 ml-Portionen auf die Säule injiziert, und die Säule mit Puffer E bis zum Erreichen einer flachen Basislinie eluiert. Die gebundenen Proteine wurden mit einem linearen 30 mM NaCl-Gradienten (0 bis 60 mM) in Puffer E und anschließend 30 Minuten mit einem linearen Gradienten von 60 bis 300 mM NaCl in Puffer E. eluiert. Die Säule wurde anschließend 10 Minuten mit 300 mM NaCl in Puffer E und 4 Minuten mit 1 M NaCl in Puffer E mit einer Fließgeschwindigkeit von 0,5 ml/Minute gewaschen. 0,5 ml-Fraktionen wurden gesammelt und auf Aktivität und Proteingehalt getestet. Wie in 4 dargestellt, eluierte der Hauptteil der Aktivität in den Fraktionen 15 bis 18 bei einer NaCl-Konzentration von etwa 40 mM.
3.5 Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie HPLC
Die Umkehrphasen-HPLC-Säule Aquapore RP 300 4,6 × 30 mm (Brownlee Labs) wurde mit wäßriger 0,3% Trifluoressigsäure (TFA) (Puffer F) vorgewaschen, bis das Fluorescamin-Nachweissystem eine stabile Basislinie zeigte. Die aus der Mono Q-Säule eluierten aktiven Fraktionen wurden vereinigt und 1,6 ml davon auf die Säule injiziert. Die Säule wurde mit Puffer F mit einer Fließgeschwindigkeit von 0,5 ml/Minute betrieben, bis das Fluorimeter kein Protein mehr nachwies. Die Säule wurde anschließend mit einer Fließgeschwindigkeit von 0,5 ml/Minute 5 Minuten mit einem linearen Gradienten von 0 bis 20% Acetonitril in Puffer F, anschließend 60 Minuten mit einem linearen Gradienten von 20 bis 50% Acetonitril und schließlich 5 Minuten mit einem linearen Gradienten von 50 bis 80% Acetonitril eluiert. Die Säule wurde anschließend 15 Minuten mit 80% Acetonitril gewaschen. 0,5 ml-Fraktionen wurden gesammelt und auf Proteingehalt und Aktivität getestet. Wie in 4 dargestellt ist, eluierte die Aktivität der Fraktionen 21 bis 23 mit einem scharfen Peak (Fraktion 22 zeigte den größten Peak) zusammen mit einem isolierten Proteinpeak. Diese Fraktionen wurden bei 27% Acetonitril eluiert.
3.6 SDS-PAGE
Zur Überwachung des Reinigungsergebnisses wurde gemäß dem Verfahren von U. K. Laemmli et al., Nature 227 (1970), 680, eine Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) durchgeführt (6). Eine Probe der aktiven Fraktionen, die aus der Ionenaustauschersäule der Schritte 3.2, 3.3 und 3.4 eluierten und 5 μg Protein enthielten (Bahn B: aktive Fraktion, die aus der CM-Sepha rosesäule eluierte, Bahn C: aktive Fraktionen, die aus einer Mono S-Säule eluierten, und Bahn D: aktive Fraktionen, die aus der Mono Q-Säule eluierten), oder eine 40 μl-Probe der von der Umkehrphasen-HPLC stammenden Fraktionen 21 bis 23 (Bahnen E bis G) wurde mit 3fach konzentriertem Probenpuffer, der 6% (Gew./Vol.) SDS und 15% (Vol./Vol.) beta-Mercaptoethanol enthielt, vermischt und auf ein 15% Acrylamidgel geladen. Zur Ermittlung des Molekulargewichts wurde ein Gemisch von Molekulargewichtsmarkern (alpha-Lactalbumin 14,4 kD, Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor 20,1 kD, Kohlenstoffanhydrase 30 kD, Ovalbumin 43 kD, Rinderserumalbumin 67 kD und Phosphorylase b. 94 kD) wie vorstehend beschrieben behandelt und auf Bahn A aufgetragen. Eine Kontrolle, die lediglich Probenpuffer enthielt, wanderte auf Bahn H. Das Gel wurde mit 160 Volt betrieben und die Proteinbanden wurden durch Färbung mit Silber sichtbar gemacht (B. R. Oakley et al., Anal. Biochem. 105, S. 361). Wie in 6 dargestellt, wanderte das gereinigte TNF-inhibierende Protein als eine einzelne Bande mit einem relativen Molekulargewicht von 26 bis 28 kD (Bahnen E bis G).
3.7 Automatisierte Proteinsequenz-Mikroanalyse
Proben des im wesentlichen aufgereinigten erfindungsgemäßen TNF-inhibierenden Proteins (jeweils 1 bis 5 μg bzw. 50 bis 200 pmol) wurden auf vorbehandelte, Biobren-beschichtete Glasfaserscheiben aufgetragen. Mit den getrockneten Scheiben wurde ein Edman-Abbau mit sich wiederholenden Arbeitsabläufen in einem automatisierten, pulsierenden Protein-Mikrosequenzierer im Flüssig/Gas-Phasenbetrieb (Modell 475) mit einem HPLC-PTH-Aminosäureanalysator im "On-line"-Betrieb (Modell 120) und einer Datenaufnahme- und Verarbeitungseinheit Modell 900, alle von Applied Biosystems Inc. Foster City, CA, USA, durchgeführt. Die vom Computer erhaltene Sequenz wurde mit den experimentellen Ursprungsdaten verglichen und gegebenenfalls korrigiert. Insgesamt wurden drei getrennte Analysen zur Bestätigung der Sequenz ergebnisse durchgeführt. Die anfängliche Ausbeute war mehr als 40%, wodurch angezeigt wird, daß das Hauptprotein im Präparat (27 kD-Bande) mit der erhaltenen Sequenz in Bezug steht.
Die Sequenzierung des N-Terminus des TNF-inhibierenden Proteins lieferte die nachstehend beschriebene Aminosäuresequenz:
Die Aminosäure an Position 14 wurde nicht identifiziert. Die Gegenwart des Cysteinrestes in Position 4 ist theoretisch, da PTH (Phenylthiohydantoin)-Cys als solches nicht identifiziert werden kann und kein anderer Aminosäurerest in dieser Position nachgewiesen wurde. Eine mit Computerhilfe durchgeführte. Suche in der Proteinbank der National Biomedical Research Foundation (Update Nr. 16) mit dem FASTP-Verfahren zeigte keine signifikante Homologie zu irgendeinem bekannten Protein.
4. Gentechnische Herstellung des TNF-inhibierenden Proteins
Diese Erfindung betrifft ferner DNA-Moleküle, die die das erfindungsgemäße TNF-inhibierende Protein codierende Nucleotidsequenz enthalten, diese DNA-Moleküle enthaltende, replizierbare Expressionsvehikel, damit transformierte Wirte und das durch Expression in so transformierten Wirten produzierte TNF-inhibierende Protein. Der Begriff "DNA-Moleküle" schließt genomische DNA, cDNA, synthetische DNA und Kombinationen davon ein.
Die Clonierung des TNF-inhibierenden Proteins kann mit verschiedenen Verfahren durchgeführt werden. Gemäß einer Vorgehensweise werden spezifische Antikörper (polyclonale oder monoclonale) gegen das TNF-inhibierende Protein produziert und zur Clonierung der cDNA des TNF-inhibierenden Proteins verwendet. Diese Vorgehensweise umfaßt die drei nachstehend beschriebenen Schritte:
a) Herstellung der Antikörper
Die Antikörper gegen das TNF-inhibierende Protein können produziert werden, indem entweder das erfindungsgemäße, im wesentlichen aufgereinigte TNF-inhibierende Protein oder ein oder mehrere synthetische Peptide, deren Sequenz mit der des bekannten Proteins identisch ist, z. B. mit der Proteinsequenz des N-Terminus, verwendet werden oder indem eine der Nucleotidsequenzen, die von der Aminosäuresequenz des TNF-inhibierenden Proteins abgeleitet werden können, an das das Protein A codierende Gen fusioniert und das fusionierte Protein aus Protein A - TNF-inhibierendem Protein in E. coli exprimiert wird. Um polyclonale Antikörper zu erhalten, werden das im wesentlichen aufgereinigte TNF-inhibierende Protein oder die an ein Trägerprotein gebundenen synthetischen Peptide in Kaninchen injiziert. Zur Produktion von monoclonalen Antikörpern wird das synthetische Gen des Fusionsproteins aus Protein A - TNF-inhibierendem Protein in E. coli exprimiert, das erhaltene Fusionsprotein durch Affinitätschromatographie an einer IgG-Sepharosesäule gereinigt und in Mäuse injiziert. Alternativ wird das aufgereinigte erfindungsgemäße TNF-inhibierende Protein in Mäuse injiziert.
b) Absuchen von das TNF-inhibierende Protein produzierenden Zellen
Die Antikörper gegen das TNF-inhibierende Protein werden im Immunofluoreszenz- oder Western-Blot-Verfahren zur Suche nach Zellen, die das TNF-inhibierende Protein produzieren, verwendet.
c) Herstellung von cDNA aus produzierenden Zellen
mRNA wird aus den das TNF-inhibierende Protein produzierenden Zellen extrahiert und aus ihr unter Verwendung von Reverser Transkriptase cDNA hergestellt. Die cDNA wird in einen Expressionvektor, beispielsweise λgt11, cloniert und unter Verwendung der Antikörper abgesucht. Der λgt11-Expressionsvektor kann zur Insertion von DNA mit einer Länge von bis zu 7 kb in die einzige EcoRI-Stelle 53 Basen stromaufwärts des beta-Galactosidase-Terminationscodons verwendet werden. Daher können Fremd-DNA-Sequenzen in diese Stelle inseriert und unter geeigneten Bedingungen als Fusionsproteine exprimiert werden. Der λgt11-Expressionsvektor kann besonders zur Konstruktion von cDNA-Banken, die mit Antikörpersonden abgesucht werden, wie hier beschrieben, verwendet werden (T. V. Huynh et al., in: DNA Cloning Techniques: A Practical Approach, David Glover (Hrsg.), IRL Press, Oxford (1984), S. 49–78).
In einer anderen Ausführungsform wird ein synthetisches Oligonucleotid oder ein Gemisch von synthetischen Oligonucleotiden, deren Sequenz von der Sequenz eines Fragments des Proteins, z. B. der N-terminalen Aminosäuresequenz des TNF-inhibierenden Proteins, abgeleitet ist, produziert, und dieses Oligonucleotid oder das Gemisch von Oligonucleotiden werden als Sonde zur Clonierung der das TNF-inhibierende Protein codierenden cDNA oder genomischen DNA verwendet.
Die genomische DNA kann gegebenenfalls natürlich vorkommende Introns enthalten. Sie kann beispielsweise durch Extraktion aus geeigneten Zellen und Reinigung durch im Stand der Technik bekannte Verfahren erhalten werden. Geeignete DNA-Präparate, beispielsweise menschliche genomische DNA, werden durch Restriktionsenzyme enzymatisch oder durch Scherkräfte unspezifisch gespalten und die Fragmente zur Konstruktion einer Genbank in geeignete rekombinante Vektoren inseriert. Derartige Vektoren können anschließend mit synthetischen Oligonucleotidsonden abgesucht werden, um eine das erfindungsgemäße TNF-inhibierende Protein codierende Sequenz zu identifizieren.
Alternativ wird mRNA aus einer das erfindungsgemäße Protein exprimierenden Zelle isoliert und zur Herstellung von cDNA durch im Stand der Technik übliche Verfahren verwendet. Diese cDNA kann nach ihrer Umwandlung in die doppelsträngige Form cloniert werden und der erhaltene Clon mit einer geeigneten Sonde für die die gewünschten Sequenzen codierende cDNA abgesucht werden. Nach der Isolierung des gewünschten Clons kann die cDNA im wesentlichen so wie die genomische DNA behandelt werden. cDNA enthält jedoch keine Introns oder intervenierende Sequenzen.
Zur Synthese der als Sonden verwendeten Oligonucleotide kann entweder eine Sequenzanalyse des intakten TNF-inhibierenden Proteins durchgeführt werden, oder es können Peptidfragmente davon gewonnen und deren Aminosäuresequenz ermittelt werden. Zur Gewinnung von Peptidfragmenten werden gereinigte Proteinpräparate durch im Stand der Technik übliche Verfahren fragmentiert, z. B. durch Spaltung mit Proteasen, beispielsweise Trypsin, Chymotrypsin oder Papain (Y. Oike et al., J. Biol. Chem. 257 (1982), 9751–9758). Die durch Spaltung produzierten Peptidfragmente werden durch Umkehrphasen-HPLC getrennt und durch automatische Aminosäuresequenzierungsverfahren sequenziert.
Wie vorstehend beschrieben, wurde die den ersten 16 Aminosäuren am N-Terminus des Proteins entsprechende Sequenz durch Analyse des im wesentlichen aufgereinigten TNF-inhibierenden Proteins in einem automatischen Sequenzierer ermittelt und die nachstehend beschriebene Aminosäuresequenz erhalten:
Nach der Sequenzierung eines oder mehrerer geeigneter Peptidfragmente oder der Bestimmung einer partiellen Sequenz des Proteins werden die sie codierenden DNA-Sequenzen untersucht. Aufgrund der Degeneration des genetischen Codes kann mehr als ein Codon zur Codierung einer bestimmten Aminosäure verwendet werden, und es können ein oder mehrere verschiedene Oligonucleotide produziert werden, die alle Peptidfragmente des TNF-inhibierenden Proteins codieren können (J. D. Watson, in: Molecular Biology of the Gene, 3. Aufl. (1977), 356–357, W. A. Benjamin, Inc., Menlo Park, CA). Jedoch nur ein Oligonucleotid dieses Sets enthält die Nucleotidsequenz, die mit der Nucleotidsequenz des Gens identisch ist. Seine Gegenwart im Set und seine Fähigkeit zur Hybridisierung an die DNA selbst in Gegenwart der anderen Oligonucleotide des Sets ermöglichen die Verwendung des nichtfraktionierten Sets von Oligonucleotiden in der gleichen Weise, in der ein einzelnes Oligonucleotid zur Clonierung des das Peptid codierenden Gens verwendet wird. Die Verwendung eines derartigen Oligonucleotids oder dieses Sets von Oligonucleotiden, die die Sequenz enthalten, die die Genfragmente des TNF-inhibierenden Proteins mit der theoretisch höchsten Wahrscheinlichkeit codieren können (gemäß den "Gesetzmäßigkeiten der Codonverwendung", die von R. Lathe et al., J. Mol. Biol. 183 (1985), 1–12, beschrieben werden), ermöglicht die Identifizierung der Sequenz eines komplementären Oligonucleotids oder Sets von Oligonucleotiden, die an die Sequenz mit der höchsten Wahrscheinlichkeit hybridisieren können, die das TNF-inhibierende Protein oder an mindestens einen Teil davon oder ein Set derartiger Sequenzen codieren können. Dieses eine komplementäre Sequenz enthaltende Oligonucleotid kann anschließend synthetisiert und als Sonde zur Identifizierung und Isolierung des Gens des erfindungsgemäßen TNF-inhibierenden Proteins verwendet werden (T. Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1982)).
Ein geeignetes Oligonucleotid oder Set von Oligonucleotiden, die ein Genfragment des TNF-inhibierenden Proteins codieren können (oder das zu einem derartigen Oligo nucleotid oder Set von Oligonucleotiden komplementär ist), wird nach der durch das vorstehend beschriebene Verfahren durchgeführten Identifizierung synthetisiert und an eine DNA oder vorzugsweise ein cDNA-Präparat hybridisiert, die von Zellen stammen, die das gewünschte Gen exprimieren können, vorzugsweise nachdem die gewünschten Sequenzen in der cDNA-Quelle angereichert wurden, z. B. durch Extraktion von RNA aus Zellen, die große Mengen des gewünschten Gens produzieren, und anschließende Umwandlung in die entsprechende cDNA unter Verwendung des Enzyms Reverse Transkriptase.
Verfahren zur Hybridisierung von Nucleinsäuren sind bekannt und werden beispielsweise von T. Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, s. o., und von B. T. Haymes et al., Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach, IRL Press, Oxford, England (1985), beschrieben. Durch Hybridisierung mit der vorstehend beschriebenen Nucleotidsonde oder mit einem Set von Nucleotidsonden können in einer cDNA-Bank oder Genombank die hybridisierenden DNA-Sequenzen identifiziert und anschließend analysiert werden, um festzustellen, in welchem Umfang sie das erfindungsgemäße TNF-inhibierende Protein codierende Sequenzen enthalten.
Durch gleiche oder ähnliche Verfahren konnten die Gene für mehrere menschliche Proteine, beispielsweise für den Gewebe-Plasminogenaktivator, erfolgreich cloniert werden (D. Pennica et al., Nature 301 (1983), 214–221).
Die DNA-Moleküle, die das erfindungsgemäße TNF-inhibierende Protein codieren und durch die vorstehend beschriebenen Verfahren erhalten wurden, werden anschließend durch im Stand der Technik übliche Verfahren in passend konstruierte Expressionsvektoren inseriert (vgl. Maniatis et al., s. o.). Doppelsträngige cDNA wird nach Versehen mit homopolymeren Enden oder Restriktionsverknüpfung, wobei synthetische DNA-Linker oder Ligierungsverfahren mit glatten Enden verwendet werden, in Plasmidvektoren ligiert. DNA-Ligasen werden zur Ligierung der DNA-Moleküle verwendet und durch Behandlung mit alkalischer Phosphatase eine unerwünschtes Zusammenlagern verhindert.
Damit ein Expressionsvektor ein gewünschtes Protein exprimieren kann, muß er auch spezifische Nucleotidsequenzen enthalten, die für die Regulation von Transkription und Translation wichtige Informationen enthalten und so mit der das gewünschte Protein codierenden DNA verknüpft sind, daß eine Genexpression und Produktion des Proteins möglich sind. Zur Transkription des Gens muß sich vor ihm zunächst ein von einer RNA-Polymerase erkennbarer Promotor befinden, an den die Polymerase binden kann, um dadurch die Transkription zu initiieren. Es können mehrere dieser unterschiedlich effizienten Promotoren (starke und schwache Promotoren) verwendet werden. Es gibt Unterschiede zwischen Promotoren von prokaryotischen und eukaryotischen Zellen.
Die in der vorliegenden Erfindung verwendbaren Promotoren können entweder konstitutiv, beispielsweise der int-Promotor des Bacteriophagen λ, der bla-Promotor des beta-Lactamasegens von pBR322 und der CAT-Promotor des Chloramphenicol-Acetyl-Transferasegens von pPR325 etc., oder induzierbar sein, beispielsweise prokaryotische Promotoren, wobei die rechten und linken Hauptpromotoren des Bacteriophagen λ (P_L und P_R), die trp-, recA-, lacZ-, lacI-, ompF und gal-Promotoren von E. coli oder der trp-lac-Hybridpromotor etc. eingeschlossen sind ( B. R. Glick, J. Ind. Microbiol. 1 (1987), 277–282).
Außer der Verwendung von starken Promotoren zur Erzeugung großer Mengen mRNA für ein hohes Genexpressionsniveau in prokaryotischen Zellen müssen auch Ribosomenbindungsstellen verwendet werden, um eine effiziente Translation der mRNA sicherzustellen. Ein Beispiel dafür ist die Shine-Dalgarno-Sequenz (SD-Sequenz), die vor dem Initiationscodon richtig positioniert werden muß und zu der 3'-terminalen Sequenz der 16S RNA komplementär ist.
In eukaryotischen Wirten können in Abhängigkeit von der Natur des Wirts unterschiedliche transkriptionale und translationale Regulationssequenzen verwendet werden. Sie können von Viren stammen, beispielsweise Adenovirus, Rinder-Papillomavirus, Simianvirus etc., in denen die regulatori schen Signale mit einem bestimmten Gen mit einem hohen Expressionsniveau assoziiert sind. Beispiele dafür sind der TK-Promotor des Herpesvirus, der frühe SV40-Promotor, der Hefe-gal4-Genpromotor etc. Es können regulierende Signale zur Initiation der Transkription gewählt werden, die eine Repression und Aktivierung ermöglichen, so daß die Expression der Gene moduliert werden kann.
Die DNA-Moleküle, die die das erfindungsgemäße TNF-inhibierende Protein codierende Nucleotidsequenz und die funktionell verbundenen regulatorischen Signale für Transkription und Translation enthalten, werden in einen Vektor inseriert, der die gewünschten Gensequenzen in das Wirtszellchromosom integrieren kann. Die Zellen, die die eingeführte DNA stabil in ihr Chromosom integriert haben, können selektiert werden, indem zusätzlich ein oder mehrere Marker, die die Selektion der den Expressionsvektor enthaltenden Wirtszellen ermöglichen, eingeführt werden. Der Marker kann einem auxotrophen Wirt eine Prototrophie und eine biozide Resistenz, z. B. gegen Antibiotika oder Schwermetalle, beispielsweise Kupfer, etc. verleihen. Das selektierbare Markergen kann entweder direkt mit den exprimierenden DNA-Gensequenzen verknüpft sein oder durch Cotransfektion in die gleiche Zelle eingeführt werden. Weitere Elemente können ebenfalls für eine optimale Synthese der einzelsträngigen mRNA eines Bindungsproteins erforderlich sein. Diese Elemente können Spleißsignale, sowie Transkriptionspromotoren, Enhancer und Terminationssignale einschließen. cDNA-Expressionsvektoren, die derartige Elemente enthalten, schließen auch die von H. Okayama, Mol. Cel. Biol. 3 (1983), 280, beschriebenen ein.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird das eingeführte DNA-Molekül in ein Plasmid oder einen Virusvektor, die im Wirt autonom replizieren können, eingeschlossen. Beispiele für wichtige Faktoren bei der Wahl eines bestimmten Plasmids oder Virusvektors sind: Die Einfachheit, mit der Vektor-enthaltende Rezipientenzellen erkannt und von den Rezipientenzellen ohne Vektor unterschieden werden können, die in einem bestimmten Wirt gewünschte Kopienzahl des Vektors, und die Möglichkeit den Vektor in Wirtszellen unterschiedlicher Arten zu verwenden.
Beispiele für bevorzugte prokaryotische Vektoren sind beispielsweise in E. coli replizierende Plasmide, beispielsweise pBR322, ColE1, pSC101, pACYC 184 etc. (vgl. Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, s. o.), Bacillus-Plasmide, beispielsweise pC194, pC221, pT127 etc. (T. Gryczan, The Molecular Biology of the Bacilli, Academic Press, NY, (1982), S. 307–329), Streptomyces-Plasmide, beispielsweise pIJ101 (K. J. Kendall et al., J. Bacteriol. 169 (1987), 4177–4183), Streptomyces-Bacteriophagen, beispielsweise ϕC31 (K. F. Chater et al., in: Sixth International Symposium on Actinomycetales Biology, Akademiai Kaido, Budapest, Ungarn (1986), S. 45–54) und Pseudomonas-Plasmide (J. F. John et al., Rev. Infect. Dis. 8 (1986), 693–704, und K. Izaki, Jpn. J. Bacteriol. 33 (1978), 729–742).
Beispiele für bevorzugte eukaryotische Plasmide sind PBV, Vaccinia, SV40, 2-Micron-Plasmid etc. oder deren Derivate. Derartige Plasmide sind im Stand der Technik gut bekannt (D. Botstein et al., Miami Wint. Symp. 19 (1982), 265–274, J. R. Broach, in: The Molecular Biology Of the Yeast Saccharomyces: Life Cycle and Inheritance, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, (1981), S. 445–470, J. R. Broach, Cell 28 (1982), 203–204, D. P. Bollon et al., J. Clin. Hematol. Oncol. 10 (1980), 39–48, und T. Maniatis, in: Cell Biology: A Comprehensive Treatise, Bd. 3: Gene Expression, Academic Press, N. Y., (1980), S. 563–608).
Nach der Herstellung des Vektors oder der DNA-Sequenz, die das (die) Konstrukt(e) enthalten, kann (können) das (die) Konstrukt(e) durch verschiedene Verfahren, beispielsweise durch Transformation, Transfektion, Konjugation, Protoplastenfusion, Elektroporation, Calciumphosphatfällung, direkte Mikroinjektion etc. in eine geeignete Wirtszelle eingeführt werden.
In dieser Erfindung können prokaryotische oder eukaryotische Wirtszellen verwendet werden. Beispiele für bevorzugte prokaryotische Wirte sind Bakterien, beispielsweise E. coli, Bacillus, Streptomyces, Pseudomonas, Salmonella, Serratia etc. Der am meisten bevorzugte prokaryotische Wirt ist E. coli. Beispiele für bakterielle Wirte von besonderem Interesse sind die E. coli-Stämme K12 294 (ATCC 31446), x1776 (ATCC 31537), W3110 (F^–, lambda^–, prototroph (ATCC 27325)) und weitere Enterobakterien, beispielsweise Salmonella typhimurium oder Serratia marcescens und verschiedene Pseudomonas-Arten. Unter derartigen Bedingungen wird das Protein nicht glycosyliert. Der prokaryotische Wirt muß mit dem Replikon und den Kontrollsequenzen im Expressionsplasmid kompatibel sein.
Bevorzugte eukaryotische Wirte sind Säugerzellen, z. B. menschliche Zellen, Affenzellen, Mauszellen und Ovarialzellen des chinesischen Hamsters (CHO-Zellen), da sie Proteinmoleküle posttranslational modifizieren, wozu eine korrekte Faltung oder eine Glycosylierung an den richtigen Stellen gehören. Hefezellen können ebenfalls posttranslationale Peptidmodifikationen, einschließlich einer Glycosylierung, durchführen. Es gibt einige DNA-Rekombinationsverfahren, in denen zur Produktion der gewünschten Proteine in Hefe starke Promotorsequenzen und Plasmide mit hoher Kopienzahl verwendet werden. Die Hefe erkennt Leadersequenzen auf clonierten Säuger-Genprodukten und sezerniert Leadersequenzen tragende Peptide (d. h. Präpeptide).
Nach der Einführung des Vektors werden die Wirtszellen in einem selektiven Medium, das auf das Wachstum von Vektor-enthaltenden Zellen selektiert, gezüchtet. Die Expression der clonierten Gensequenz(en) bewirkt die Produktion des gewünschten TNF-inhibierenden Proteins oder eines Fragments davon. Das exprimierte Protein wird anschließend isoliert und durch in der vorliegenden Anmeldung beschriebene Reinigungsverfahren (Abschnitt 3, s. o.) oder jedes andere übliche Verfahren, das eine Extraktion, Aus fällung, Chromatographie, Elektrophorese etc. einschließt, gereinigt.
Ein weiteres Reinigungsverfahren, das bevorzugt zur Reinigung des erfindungsgemäßen Proteins verwendet werden kann, ist die Affinitätschromatographie. Zu diesem Zweck werden monoclonale Antikörper gegen das TNF-inhibierende Protein produziert und auf einer Gelmatrix innerhalb einer Säule immobilisiert. Ungereinigte Präparate, die das rekombinante Protein enthalten, werden durch die Säule geleitet. Das Protein wird durch den spezifischen Antikörper an die Säule gebunden, während Unreinheiten durchlaufen. Nach dem Waschen wird das Protein durch eine Veränderung des pH-Werts oder der Ionenstärke aus dem Gel eluiert.
Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten monoclonalen Antikörper können unter Verwendung von üblichen Hybridom-Verfahren (Köhler et al., Nature 256 (1975), 495, und Köhler et al., Eur. J. Immunol. 6 (1976), 511) produziert werden. Üblicherweise wird in diesen Verfahren ein Tier mit dem gewünschten gereinigten Proteinantigen oder einem synthetischen Peptid, das die an einen geeigneten Träger, beispielsweise Rinderserumalbumin, konjugierte N-terminale Sequenz des gewünschten Proteins aufweist, immunisiert. Milzzellen derartiger Tiere werden isoliert und mit einer geeigneten Myelomzellinie fusioniert. Nach der Fusion werden die erhaltenen Hybridomzellen in einem HAT-Selektionsmedium gezüchtet und anschließend cloniert. Die durch eine derartige Selektion erhaltenen Hybridomzellen werden anschließend untersucht, um Clone zu identifizieren, die das TNF-inhibierende Protein bindende Antikörper sezernieren. Nach der Identifizierung kann der gewünschte Clon in großen Mengen entweder in einer Suspensionskultur oder in Aszitesflüssigkeit durch Injektion der Zellen in das Peritoneum von geeigneten Wirtsmäusen gezüchtet werden.
Mit diesen von diesen Hybridomen produzierten, gereinigten und immobilisierten monoclonalen Antikörpern kann das TNF-inhibierende Protein in einem Affinitätsreinigungs verfahren unter Verwendung einer Immunadsorbtionssäule sehr effizient gereinigt werden.
5. Verwendbarkeit und Zusammensetzungen
Das TNF-inhibierende Protein, Salze, funktionelle Derivate oder aktive Fraktionen, mit Ausnahme von Vorläufern, und Gemische davon können zur Bekämpfung der schädlichen Wirkungen von TNF in Säugern verwendet werden, d. h., zur Behandlung von Zuständen, in denen ein TNF-Überschuß endogen gebildet oder exogen verabreicht wird.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner Arzneimittel, die einen pharmazeutisch verträglichen Träger und das erfindungsgemäße TNF-inhibierende Protein oder Salze, funktionelle Derivate oder aktive Fraktionen, mit Ausnahme von Vorläufern, oder Gemische davon als aktive(n) Bestandteil(e) enthalten. Diese Zusammensetzungen können für alle Zustände verwendet werden, in denen eine Überproduktion von endogenem TNF erfolgt, beispielsweise bei einem septischen Schock, Kachexie, Transplantat-Abstoßungsreaktionen, Autoimmunkrankheiten wie rheumatische Arthritis etc. Der Verabreichungsweg kann einer der üblichen Verabreichungswege für ähnliche Wirkstoffe sein und vom zu behandelnden Zustand abhängen, z. B. eine intravenöse Injektion bei einem septischen Schock oder eine lokale Injektion bei rheumatischer Arthritis (beispielsweise in das Knie) oder kontinuierlich durch Infusion etc. Die Zusammensetzungen können außerdem bei einer durch exogene Verabreichung von großen TNF-Mengen (Überdosen) bewirkten TNF-Intoxikation verwendet werden.
Die erfindungsgemäßen Arzneimittel werden zur Verabreichung durch Vermischen des Proteins oder seiner Derivate mit physiologisch verträglichen Trägern, Stabilisatoren und Excipienten und in Dosierungsform, z. B. durch Gefriertrocknung in Dosierungsgefäßen, hergestellt. Die Menge des zu verabreichenden aktiven Bestandteils hängt vom Verabreichungsweg, der zu behandelnden Krankheit und dem Zustand des Patienten ab. Das TNF-inhibierende Protein muß dem Körpergewicht entsprechend verabreicht werden, wenn eine lokale Injektion bei akuter rheumatischer Athritis oder eine intravenöse Infusion bei einem septischen Schock behandelt werden soll.
Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung des oben beschriebenen Antikörpers gegen das TNF-inhibierende Protein zur Aufreinigung dieses Proteins. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Antikörper ein monoclonaler Antikörper.

Claims

Tumornekrosefaktor (TNF)-inhibierendes Protein mit den folgenden Merkmalen: (a) es inhibiert die Bindung von TNF an seine Rezeptoren und den cytotoxischen Effekt von TNF; (b) wenn Urinrohpräparationen davon über eine Ultrogel AcA 44-Filtrationssäule chromatographiert werden, eluiert der Hauptpeak mit TNF-inhibierender Aktivität kurz vor der Hauptmenge an Protein und zeigt ein relatives Molekulargewicht von etwa 40 bis 80 kD; und (c) wenn Urinrohpräparationen davon analysiert werden, liegt der isoelektrische Punkt des aktiven Proteins zwischen pH 6 und 8.
TNF-inhibierendes Protein nach Anspruch 1, erhältlich aus menschlichem Urin durch (a) Lectinaffinitätschromatographie mit der Fraktion, die nicht durch eine Membran mit einem molekularen Ausschlußvolumen von 10 kD dialysierbar ist; (b) Elution des an das Lectin adsorbierten Proteins; (c) Gelfiltration oder Ionenaustauschchromatographie mit dem eluierten Protein; und (d) Gewinnung derjenigen Fraktionen, die die Bindung von TNF an seine Rezeptoren und den cytotoxischen Effekt von TNF inhibieren.
TNF-inhibierendes Protein nach Anspruch 1 oder 2 in im wesentlichen aufgereinigter Form, das die folgende Aminosäuresequenz in seinem N-terminalen Bereich enthält:
worin X ein nicht-identifizierter Aminosäurerest ist, oder ein Salz, funktionelles Derivat oder ein aktiver Bestandteil davon mit Ausnahme von Vorläufern, wobei der aktive Bestandteil die Bindung von TNF an seine Rezeptoren und den cytotoxischen Effekt von TNF inhibieren kann.
TNF-inhibierendes Protein nach Anspruch 3 mit einem Molekulargewicht von etwa 26 bis 28 kD, wenn das im wesentlichen aufgereinigte Protein durch SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen analysiert wird.
TNF-inhibierendes Protein nach Anspruch 3 oder 4, das als einzelner Peak auf Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) wandert.
TNF-inhibierendes Protein nach einem der Ansprüche 3 bis 5, das die Bindung von TNF-α an seine Zelloberflächenrezeptoren auf menschlichen HeLa- und FS11-Fibroblasten-Zellen inhibieren kann.
TNF-inhibierendes Protein nach einem der Ansprüche 3 bis 6, das den cytotoxischen Effekt von TNF-α auf Maus-A9-Zellen inhibieren kann.
TNF-inhibierendes Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 7, das aus Urin isoliert wird.
TNF-inhibierendes Protein nach Anspruch 8, wobei der Urin menschlicher Urin ist.
Verfahren zur Isolierung von im wesentlichen aufgereinigtem TNF-inhibierendem Protein, das umfaßt: (a) Gewinnung der Proteinrohfraktion aus einem dialysierten Konzentrat aus menschlichem Urin; (b) Ionenaustauschchromatographie mit der Proteinrohfraktion aus Schritt (a), wodurch partiell aufgereinigte aktive Fraktionen des TNF-inhibierenden Proteins erhalten werden, das durch seine Fähigkeit definiert wird, sowohl die Bindung von TNF an seine Rezeptoren als auch den cytotoxischen Effekt von TNF zu inhibieren; (c) Umkehrphasen-HPLC mit den partiell aufgereinigten aktiven Fraktionen des TNF-inhibierenden Proteins aus Schritt (b), wodurch im wesentlichen aufgereinigte aktive Fraktionen des TNF-inhibierenden Proteins erhalten werden, das durch seine Fähigkeit definiert wird, sowohl die Bindung von TNF an seine Rezeptoren als auch den cytotoxischen Effekt von TNF zu inhibieren; und (d) Gewinnung des im wesentlichen aufgereinigten Proteins aus Schritt (c), das als einzelner Peak auf Umkehrphasen-HPLC wandert.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei das im wesentlichen aufgereinigte Protein ein Molekulargewicht von etwa 26 bis 28 kD in einer SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen aufweist.
Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, wobei die Ionenaustauschchromatographie in Schritt (b) in drei Schritten durchgeführt wird und chromatographische Reinigung in Carboxylmethyl-Sepharose-, Mono S HR 5/5 FPLC- und Mono Q HR 5/5 FPLC-Säulen, vorzugsweise in dieser Reihenfolge, einschließt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 12, wobei die Aktivität der Fraktionen in den Schritten (b), (c) und (d) durch die Fähigkeit des TNF-inhibierenden Proteins definiert wird, die Bindung von TNF-α an seine Zelloberflächenrezeptoren auf menschlichen HeLa- und FS11-Fibroblasten- Zellen zu inhibieren.
Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 13, wobei die Aktivität der Fraktionen in den Schritten (b), (c) und (d) durch die Fähigkeit des TNF-inhibierenden Proteins definiert wird, den cytotoxischen Effekt von TNF-α auf Maus-A9-Zellen zu inhibieren.
TNF-inhibierendes Protein nach einem der Ansprüche 3 bis 9, hergestellt nach dem Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 14.
TNF-inhibierendes Protein nach einem der Ansprüche 3 bis 7, das ein rekombinantes Protein ist.
TNF-inhibierendes Protein nach Anspruch 16, das in einem prokaryontischen Wirt, vorzugsweise in E. coli, oder in einem eukaryontischen Wirt, vorzugsweise in einer Säugerzelle, hergestellt wird.
DNA-Molekül, umfassend eine Nucleotidsequenz, die das TNF-inhibierende Protein oder ein funktionelles Derivat oder einen aktiven Bestandteil davon, mit Ausnahme von Vorläufern, nach einem der Ansprüche 3 bis 9 codiert, wobei das TNF-inhibierende Protein die folgende Aminosäuresequenz in seinem N-terminalen Bereich enthält:
worin X ein nicht-identifizierter Aminosäurerest ist, und wobei der aktive Bestandteil die Bindung von TNF an seine Rezeptoren und den cytotoxischen Effekt von TNF inhibieren kann.
DNA-Molekül nach Anspruch 18, wobei die Nucleotidsesquenz eine genomische DNA-Sequenz oder eine cDNA-Sequenz ist.
Replizierbares Expressionsvehikel umfassend die DNA-Sequenz nach Anspruch 18 oder 19, das TNF-inhibierendes Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 9, 16 oder 17 in einer transformierten Wirtszelle exprimieren kann.
Wirtszelle, die mit dem replizierbaren Expressionsvehikel nach Anspruch 20 transformiert ist.
Wirtszelle nach Anspruch 21, die eine prokaryontische Wirtszelle ist.
Wirtszelle nach Anspruch 21, die eine eukaryontische Wirtszelle ist.
Verfahren zur Herstellung eines TNF-inhibierenden Proteins, das die folgenden Schritte umfaßt: (a) Züchtung einer transformierten Wirtszelle nach einem der Ansprüche 21 bis 23 in einem geeigneten Kulturmedium; und (b) Isolierung des TNF-inhibierenden Proteins.
Rekombinantes TNF-inhibierendes Protein, hergestellt nach dem Verfahren nach Anspruch 24.
Arzneimittel, enthaltend ein TNF-inhibierendes Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 9, 15 bis 17 oder 25, oder ein Gemisch der vorstehend genannten Stoffe als Wirkstoff(e) zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger, wobei der aktive Bestandteil die Bindung von TNF an seine Rezeptoren und den cytotoxischen Effekt von TNF inhibieren kann.
Arzneimittel nach Anspruch 26 zur Bekämpfung der nachteiligen Wirkungen von TNF in Säugern.
Arzneimittel nach Anspruch 26 zur Behandlung von Zuständen, bei denen ein Überschuß an TNF endogen gebildet oder exogen zugeführt wird.
Verwendung eines Proteins nach einem der Ansprüche 1 bis 9, 15 bis 17 oder 25 zur Herstellung eines Arzneimittels nach einem der Ansprüche 26 bis 28.
Verwendung eines Antikörpers gegen das TNF-inhibierende Protein nach einem der Ansprüche 3 bis 9, 15 bis 17 oder 25 zur Aufreinigung dieses Proteins.
Verwendung nach Anspruch 30, wobei der Antikörper ein monoclonaler Antikörper ist.