DE3920282A1 - Tnf-rezeptor, tnf bindende proteine und dafuer kodierende dnas - Google Patents
Tnf-rezeptor, tnf bindende proteine und dafuer kodierende dnasInfo
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Description
Die Erfindung bezieht sich auf einen TNF-Rezeptor
sowie auf ein TNF bindendes Protein.
Tumornekrosefaktor (TNF-α) wurde erstmals im Serum von
Mäusen und Kaninchen gefunden, die mit Bacillus
Calmette-Guerin infiziert und denen Endotoxin
injiziert worden war,und auf Grund seiner
cytotoxischen und Antitumoreigenschaften erkannt (1).
Er wird vor allem von aktivierten Makrophagen und
Monozyten produziert. Zahlreiche Zelltypen, die Ziele
für TNF sind, weisen Oberflächenrezeptoren mit hoher
Affinität für dieses Polypeptid auf (2); es wurde
angenommen, daß Lymphotoxin (TNF-β) an denselben
Rezeptor bindet (3, 4). TNF-α ist identisch mit einem
als Cachectin bezeichneten Faktor (5), der die
Lipoproteinlipase unterdrückt und bei chronisch
entzündlichen und malignen Erkrankungen zur
Hypertriglyceridämie führt (6, 7). TNF-α dürfte an der
Regulation des Wachstums sowie an der Differenzierung
und Funktion von Zellen, die bei Entzündungen,
Immunvorgängen und Hämatopoese eine Rolle spielen,
beteiligt sein.
TNF kann auf den Wirtsorganismus durch Stimulation von
Neutrophilen (8, 9) und Monocyten sowie durch Hemmung
der Replikation von Viren (10, 11) eine positive
Wirkung ausüben. Darüber hinaus aktiviert TNF-α die
Immunabwehr gegen Parasiten und wirkt direkt und/oder
indirekt als Mediator bei Immunreaktionen,
entzündlichen Prozessen und anderen Vorgängen im
Organismus, wobei die Wirkmechanismen in vielen Fällen
noch ungeklärt sind.
Die Verabreichung von TNF-α (12) kann jedoch auch von
schädlichen Erscheinungen (13) wie Schock und
Gewebeschädigungen begleitet sein, die durch Antikörper
gegen TNF-α aufgehoben werden können (14). Eine Reihe
von Beobachtungen läßt auf eine Rolle von endogen
freigesetztem TNF-α bei verschiedenen pathologischen
Zuständen schließen. So scheint TNF-α ein Mediator der
Kachexie zu sein, die bei chronisch-invasiven, z.B.
parasitären Erkrankungen auftreten kann. TNF-α scheint
auch eine wesentliche Rolle bei der Pathogenese des
durch gram-negative Bakterien verursachten Schocks
(Endotoxin-Schock) zu spielen; er dürfte an einigen,
wenn nicht allen Wirkungen von Lipopolysacchariden
beteiligt sein (18). Ebenso wurde eine Funktion von TNF
bei den im Rahmen von entzündlichen Prozessen in
Gelenken und anderen Geweben auftretenden
Gewebeschädigungen sowie bei der Letalität und
Morbidität der Graft-versus-host reaction (GVHR,
Transplantat-Abstoßung (15) postuliert. Auch wurde ein
Zusammenhang zwischen der Konzentration von TNF im
Serum und dem tödlichen Ausgang von
Meningokokkenerkrankungen berichtet (16).
Weiters wurde beobachtet, daß die Verabreichung von
TNF-α über einen längeren Zeitraum einen Zustand von
Anorexie und Auszehrung verursacht, die eine ähnliche
Symptomatik aufweist wie die Kachexie, die mit
neoplastischen und chronischen infektiösen Erkrankungen
einhergeht (19).
Es wurde über eine TNF inhibierende Aktivität eines
Proteins aus dem Harn von Fieberpatienten berichtet,
von dessen Wirkung vermutet wird, daß sie auf einen
kompetitiven Mechanismus auf Rezeptorebene selbst
(ähnlich der Wirkung des Interleukin-1 Inhibitors (17))
zurückzuführen ist (20).
In der EP-A2 3 08 378 wird ein TNF inhibierendes Protein
beschrieben, das aus menschlichem Harn gewonnen wurde.
Seine Wirkung wurde im Harn gesunder und kranker
Personen nachgewiesen und aufgrund der Fähigkeit
bestimmt, die Bindung von TNF-α an seine Rezeptoren auf
humanen HeLa Zellen und FS 11 Fibroblasten sowie die
zytotoxische Wirkung von TNF-α auf murine A9 Zellen zu
inhibieren. Das Protein wurde im wesentlichen zur
Homogenität gereinigt und durch seinen N-Terminus
charakterisiert. In dieser Patentveröffentlichung
werden zwar grundsätzlich mögliche Wege dargelegt, zur
für das Protein kodierenden DNA und zum rekombinanten
Protein zu gelangen; es werden jedoch keine konkreten
Angaben gemacht, welcher der theoretisch möglichen
Lösungswege zum Ziel führt.
In Vorversuchen zur vorliegenden Erfindung konnte aus
Dialyseharn von Urämiepatienten ebenfalls ein Protein
identifiziert werden, das die biologischen Wirkungen
von TNF-α hemmt, indem es durch Wechselwirkung mit
TNF-α dessen Bindung an seinen Zelloberflächenrezeptor
verhindert (21). Von diesem Protein wurde auch eine
Affinität zu TNF-β festgestellt.
Die Anwesenheit dieses Proteins (im folgenden TNF-BP
genannt) im konzentrierten Dialyseharn wurde durch
Kompetition mit der Bindung von radioaktiv markiertem
rekombinantem TNF-α an einen Subklon von HL-60 Zellen
nachgewiesen, wobei der Einfluß von dialysiertem Harn
auf die Bindung von 125I-TNF-α an die Zellen gemessen
wurde. Die durchgeführten Bindungsversuche zeigten
eine dosisabhängige Hemmung der TNF-α-Bindung an die
Zelle durch konzentrierten Dialyseharn(die Möglichkeit
der Interpretation, daß die beobachtete Verringerung
der Bindung durch gegebenenfalls im Harn vorhandenen
TNF-α selbst oder TNF-β, der um die Bindung
konkurriert, verursacht werden könnte, wurden durch
den Befund, daß die Verringerung der Bindung durch
Anwendung von TNF-α- und TNF-β-Antikörpern nicht
aufgehoben werden konnte, ausgeschlossen).
In analoger Weise wurde in Vorversuchen zur
vorliegenden Erfindung nachgewiesen, daß TNF-BP auch
Affinität zu TNF-β aufweist, sie beträgt ca. 1/50
seiner Affinität zu TNF-α.
Mittels Gelchromatographie auf Sephacryl 200 wurde
festgestellt, daß eine Substanz im Harn und Serum von
Dialysepatienten sowie im Serum von gesunden Personen
mit rekombinantem TNF-α einen Komplex mit einem
Molekulargewicht von ca. 75 000 bildet.
TNF-BP wurde aus mehreren Proben Dialyseharn von
Urämiepatienten durch partielle Reinigung mittels
Druckultrafiltration, Ionenaustauschchromatographie
und Gelchromatographie 62fach angereichert.
Die erhaltenen Präparationen wurden zum Nachweis der
biologischen Aktivität von TNF-BP durch Hemmung der
wachstumshemmenden Wirkung von TNF-α auf HL-60-10
Zellen verwendet. Es zeigte sich eine dosisabhängige
Wirkung von TNF-BP auf die biologische Wirkung von
TNF-α. Es wurde weiters das Bindungsverhalten von
Zellen durch Vorbehandlung mit TNF-BP und
ausschließendem Kompetitionsbindungstest untersucht.
Dabei wurde nachgewiesen, daß Vorbehandlung der Zellen
mit TNF-BP die Bindung von TNF-α an die Zelle nicht
beeinträchtigt. Dies zeigt, daß die Wirkung von TNF-BP
nicht auf seiner etwaigen Bindung an die Zelle und
Konkurrenzierung mit TNF-α um die Bindung an den
Rezeptor beruht.
Das im wesentlichen homogene Protein wurde in
hochgereinigter Form erhalten, indem Harn von
Dialysepatienten durch Ultrafiltration konzentriert,
der konzentrierte Harn dialysiert und zunächst in
einem ersten Reinigungsschritt mittels DEAE-Sephacel-
Chromatographie auf das Vierfache angereichert wurde.
Die weitere Anreicherung erfolgte mittels
Affinitätschromatographie durch an Sepharose
gebundenen TNF-α. Die Endreinigung wurde mittels
Reverse Phase Chromatographie (FPLC) durchgeführt.
Es konnte gezeigt werden, daß das im wesentlichen
hochgereinigte Protein die zytotoxische Wirkung von
TNF-α auf WEHI 164 Klon 13 Zellen hemmt (22).
Vom im wesentlichen hochgereinigten Protein wurde die
N-terminale Aminosäuresequenz aufgeklärt. Sie wurde mit
Asp-Ser-Val-X-Pro-Gln-Gly-Lys-Tyr-Ile-His-Pro-Gln-
(Hauptsequenz) bestimmt (daneben wurde in Spuren die
folgende N-terminale Sequenz nachgewiesen:
Leu-(Val)-(Pro)-(His)-Leu-Gly-X-Arg-Glu-
(Nebensequenz)). Der Vergleich der Hauptsequenz mit der
N-terminalen Sequenz des in der EP-A2 3 08 378
geoffenbarten TNF inhibierenden Proteins zeigt die
Identität der beiden Proteine.
Es wurde folgende Aminosäurezusammensetzung, angegeben
in Mol-Aminosäure pro Mol Protein und in Mol %
Aminosäure, bestimmt als Mittelwert einer 24 und 48
stündigen Hydrolyse, ermittelt:
Ein Gehalt an Glukosamin wurde mittels
Aminosäureanalyse nachgewiesen. Die Ergebnisse eines
mit Concanavalin A und Weizenkeimlektin durchgeführten
Affinoblots zeigten ebenfalls, daß es sich bei TNF-BP
um ein Glykoprotein handelt.
Das im wesentlichen homogene Protein wurde tryptisch
verdaut und von 17 der erhaltenen Spaltpeptide die
Aminosäuresequenzen bestimmt. Weiters wurde der C-
Terminus analysiert.
TNF-BP kommt offensichtlich die Funktion eines
Regulators der TNF-Aktivität mit der Fähigkeit zu, die
Konzentrationsänderungen von freiem, biologisch
aktivem TNF-α abzupuffern. TNF-BP dürfte auch die
Ausscheidung von TNF durch die Niere beeinflussen,
weil der mit TNF gebildete Komplex, dessen
Molekulargewicht mittels Gelpermeationschromatographie
auf Sephadex G 75 mit ca. 75 000, bestimmt wurde, im
Gegensatz zu TNF offensichtlich nicht durch den
Glomerulus zurückgehalten wird.
Das TNF-BP wurde aus dem Harn von Dialysepatienten als
eine von drei Hauptproteinkomponenten, die Affinität
zu TNF aufweisen und die gemeinsam mit TNF-BP von der
TNF-Affinitätschromatographiesäule eluieren,
nachgewiesen. Die beiden anderen Proteine binden
jedoch offensichtlich in einer Weise, die die Bindung
von TNF-α an seinen Zelloberflächenrezeptor nicht
beeinträchtigt.
Die zur biologischen Wirkung des TNF-BP erhaltenen
Ergebnisse, insbesondere der Vergleich der
Bindungskonstante mit der für den TNF-Rezeptor
beschriebenen Bindungskonstante (23) lieferten einen
ersten Hinweis dafür, daß es sich bei diesem Protein
um den löslichen Teil eines TNF-Rezeptors handeln
könnte.
Auf Grund seiner Fähigkeit, die biologische Wirkung
von TNF-α und TNF-ß zu inhibieren, ist das TNF
bindende Protein geeignet, bei Indikationen eingesetzt
zu werden, bei denen eine Herabsetzung der TNF-
Aktivität im Organismus angezeigt ist. Geeignet zur
Anwendung bei diesen Indikationen sind auch Derivate
oder Fragmente des TNF bindenden Proteins mit der
Fähigkeit, die biologische Wirkung von TNF zu
inhibieren.
TNF-BP (bzw. seine funktionellen Derivate oder aktiven
Fragmente) kann zur prophylaktischen und
therapeutischen Behandlung des menschlichen oder
tierischen Körpers bei Indikationen, bei denen eine
schädigende Wirkung von TNF-α auftritt, eingesetzt
werden. Zu diesen Erkrankungen zählen insbesondere
entzündliche sowie infektiöse und parasitäre
Erkrankungen oder Schockzustände, bei denen endogenes
TNF-α freigesetzt wird, weiters Kachexie, GVHR und
Autoimmunerkrankungen wie Rheumatoide Arthritis, etc.
Es sind darunter auch pathologische Zustände zu
verstehen, die als Nebenwirkungen bei der Therapie mit
TNF-α, besonders bei hoher Dosierung, auftreten
können, z.B. schwere Hypotension oder Störungen des
Zentralnervensystems.
Als Arzneimittel kommen insbesondere pharmazeutische
Zubereitungen für die parenterale Anwendung in
Betracht, z.B. in Form von Lyophilisaten oder
Lösungen, gegebenenfalls zusammen mit physiologisch
verträglichen Zusatzstoffen, wie Stabilisatoren. Auf
Grund seiner TNF bindenden Eigenschaften ist TNF-BP
auch als Diagnostikum für die Bestimmung von TNF-α
und/oder TNF-β geeignet, z.B. als eine der Komponenten
in Radioimmunoassays oder Enzymimmunoassays,
gegebenenfalls zusammen mit Antikörpern gegen TNF.
Auf Grund seiner Eigenschaften ist dieses Protein ein
pharmakologisch wertvoller Wirkstoff, der aus
natürlichen Quellen nicht in ausreichender Menge
mittels proteinchemischer Methoden darstellbar ist.
Es bestand daher das Bedürfnis, dieses Protein (bzw.
verwandte Proteine mit der Fähigkeit, TNF zu binden)
auf rekombinantem Weg herzustellen, um es für die
therapeutische Anwendung in ausreichender Menge zur
Verfügung zu stellen.
Unter der "Fähigkeit, TNF zu binden" ist im Rahmen der
vorliegenden Erfindung die Eigenschaft eines Proteins
zu verstehen, an TNF-α derart zu binden, daß die
Bindung von TNF-α an den funktionellen Teil des
Rezeptors verhindert und die Wirkung von TNF-α im
menschlichen oder tierischen Organismus gehemmt oder
aufgehoben wird. Durch diese Definition ist die
Fähigkeit eines Proteins, auch an andere Proteine,
z.B. an TNF-β, binden und deren Wirkung inhibieren zu
können, mit eingeschlossen.
Der vorliegenden Erfindung lag die Aufgabe zugrunde,
die für TNF-BP kodierende DNA zur Verfügung zu
stellen, um auf deren Basis die Herstellung
rekombinanter DNA-Moleküle zu ermöglichen, mit denen
geeignete Wirtsorganismen transformiert werden können,
um TNF-BP bzw. funktionelle Derivate und Fragmente
davon zu produzieren.
Im Rahmen dieser Aufgabenstellung sollte auch
festgestellt werden, ob es sich beim TNF-BP um den
löslichen Teil eines TNF-Rezeptors handelt, um
ausgehend davon die Grundlage für die Aufklärung der
Rezeptorsequenz zu schaffen und einen rekombinanten
TNF-Rezeptor bereitzustellen.
Das Vorhandensein eines spezifischen Rezeptors mit
hoher Affinität zu TNF-α auf verschiedenen Zelltypen
wurde von mehreren Arbeitsgruppen gezeigt. Kürzlich
wurde erstmals von der Isolierung und vorläufigen
Charakterisierung eines TNF-α Rezeptors berichtet
(32). Da die Bindung von radioaktiv markiertem TNF-α
durch einen Überschuß an TNF-β aufgehoben werden kann
(33), wurde vorgeschlagen, daß TNF-α und TNF-β einen
gemeinsamen Rezeptor teilen. Da jedoch andererseits
gezeigt werden konnte, daß bestimmte Zelltypen, die
auf TNF-α ansprechen, gegen TNF-β teilweise oder
gänzlich unempfindlich sind (34) , wurde die Existenz
eines gemeinsamen Rezeptors wieder in Zweifel gezogen.
Im Gegensatz dazu scheinen kürzlich erhaltene
Ergebnisse zu den Bindungseigenschaften von TNF-β an
Rezeptoren die Theorie eines gemeinsamen Rezeptors
wieder zu erhärten (35), wobei in dieser Arbeit
vorgeschlagen wird, daß zwischen TNF-α und TNF-β
Unterschiede hinsichtlich der Wechselwirkung mit dem
Rezeptor bzw. zusätzlich hinsichtlich der in der Zelle
nach der Ligand-Rezeptorwechselwirkung eintretenden
Ereignisse bestehen.
Die Verfügbarkeit der für einen TNF-Rezeptor
kodierenden DNA stellt die Voraussetzung für die
Herstellung von rekombinantem Rezeptor und damit u.a.
eine wesentliche Erleichterung für die Durchführung
vergleichender Untersuchungen verschiedener Zelltypen
auf ihre(n) TNF-α- und/oder TNF-β - Rezeptor(en) bzw.
auf die durch die Bindung von TNF an den Rezeptor in
der Zelle ausgelösten Reaktionen dar. Dadurch wird
weiters die Aufklärung der dreidimensionalen Struktur
des Rezeptors ermöglicht und damit die Voraussetzung
für ein rationales Design für die Entwicklung von
Agonisten und Antagonisten der TNF-Wirkung geschaffen.
Das Durchsuchen von cDNA-Bibliotheken mit Hilfe von
Hybridisierungssonden, die von Aminosäuresequenzen
kurzer Peptide abgeleitet sind, stößt auf Grund der
Degeneration des genetischen Codes mitunter auf
größere Schwierigkeiten. Zusätzlich erschwert wird
diese Vorgangsweise dann, wenn von einem Protein, wie
z.B. dem TNF-BP, nicht bekannt ist, in welchen Geweben
es synthetisiert wird. In diesem Fall kann bei einem
Versagen dieser Methode unter Umständen nicht mit
Bestimmtheit festgestellt werden, ob es auf die Wahl
einer ungeeigneten cDNA-Bibliothek oder auf die zu
geringe Spezifität der Hybridisierungssonden
zurückzuführen ist.
Zur Lösung der gestellten Aufgabe wurde daher
erfindungsgemäß wie folgt vorgegangen: Als cDNA-
Bibliothek wurde eine Bibliothek der
Fibrosarkomzellinie HS913 T, die mit TNFα induziert
worden war und in Lambda gt11 vorlag, eingesetzt. Um
aus dieser Bibliothek Lambda DNA mit TNF-BP Sequenzen
zu erhalten, wurde die große Empfindlichkeit der
Polymerase Kettenreaktion (PCR, (26)) ausgenützt. (Mit
Hilfe dieser Methode kann aus einer gesamten cDNA-
Bibliothek eine unbekannte DNA-Sequenz erhalten
werden, die flankiert ist von Oligonukleotiden, die
auf Basis bekannter Aminosäureteilsequenzen entworfen
und als Primer eingesetzt wurden. Ein solches längeres
DNA-Fragment kann nachfolgend als
Hybridisierungssonde, z.B. zur Isolierung von cDNA-
Klonen, insbesondere des ursprünglichen cDNA-Klons,
eingesetzt werden).
Die Aufgabe wurde erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß
auf Basis der N-terminalen Aminosäuresequenz
(Hauptsequenz) und Aminosäuresequenzen von tryptischen
Peptiden, die vom hochgereinigten TNF-BP erhalten
worden waren, Hybridisierungssonden hergestellt wurden
und mit Hilfe dieser Sonden zunächst mittels PCR aus
der cDNA-Bibliothek HS913T eine cDNA, die einen Teil
der für TNF-BP kodierenden cDNA darstellt, erhalten
wurde. Diese cDNA weist die folgende Nukleotidsequenz
auf:
Diese DNA stellt eine von möglichen Varianten dar, die
geeignet sind, mit TNF-BP-DNAs bzw. TNF-BP-RNAs zu
hybridisieren (solche Varianten umfassen z.B.
diejenigen DNA-Moleküle, die durch PCR-Amplifikation
mit Hilfe von Primern erhalten werden, deren
Nukleotidsequenz nicht exakt mit der gesuchten Sequenz
übereinstimmt, etwa aufgrund von zu Klonierungszwecken
vorgesehenen Restriktionsschnittstellen oder aufgrund
von bei der Aminosäuresequenzanalyse etwa nicht
eindeutig ermittelten Aminosäuren).
Unter "TNF-BP-DNAs" bzw. "TNF-BP-RNAs" sind
Nukleinsäuren zu verstehen, die für TNF-BP bzw.
verwandte Proteine mit der Fähigkeit, TNF zu binden
kodieren bzw. die für ein solches Protein kodierende
Sequenz enthalten.
Unter TNF-BP-DNAs (bzw. TNF-BP-RNAs) sind auch cDNAs,
abgeleitet von mRNAs, die durch alternatives Splicing
entstanden sind (bzw. diese mRNAs selbst), mitumfaßt.
Unter "alternativem Splicing" wird die Entfernung von
Introns verstanden, bei der vom gleichen mRNA-
Precursor verschiedene Spliceacceptor- und/oder
Splicedonorstellen verwendet werden. Die dabei
entstehenden mRNAs unterscheiden sich voneinander
durch das gänzliche oder teilweise Vorhandensein oder
Fehlen von bestimmten Exonsequenzen, wobei es
gegebenenfalls zu einer Verschiebung des Leserasters
kommen kann.
Die zunächst erfindungsgemäß erhaltene, einen Teil der
für TNF-BP kodierenden Sequenz enthaltende cDNA (bzw.
Varianten davon) kann somit als Hybridisierungssonde
verwendet werden, um aus cDNA-Bibliotheken cDNA-Klone,
enthaltend TNF-BP-DNAs, zu erhalten. Weiters kann sie
als Hybridisierungssonde für mRNA-Präparationen
eingesetzt werden, um TNF-BP-RNAs zu isolieren und
daraus z.B. angereicherte cDNA-Bibliotheken
herzustellen, die ein wesentlich vereinfachtes und
effizienteres Screening ermöglichen. Ein weiteres
Anwendungsgebiet ist die Isolierung der gewünschten
DNAs aus genomischen DNA-Bibliotheken mit Hilfe dieser
DNAs als Hybridisierungssonden.
Da die oben definierte DNA (bzw. ihre Varianten) in
der Lage ist, mit DNAs (bzw. RNAs) zu hybridisieren,
die für TNF-BP kodieren bzw. die für TNF-BP kodierende
Sequenz enthalten, können mit Hilfe dieser DNA als
Sonde auch cDNAs erhalten werden, die für Proteine
kodieren, deren Prozessierung TNF-BP ergibt. Unter
Prozessierung ist die in vivo Abspaltung von
Teilsequenzen zu verstehen. Dabei kann es sich N-
terminal um die Signalsequenz und/oder andere
Sequenzen und gegebenenfalls zusätzlich (falls sich
die Annahme bestätigt, daß TNF-BP den löslichen Teil
eines TNF-Rezeptors darstellt) C-terminal um die
transmembrane und zytoplasmatische Region des
Rezeptors handeln. Mit Hilfe dieser
Hybridisierungssonde ist es daher möglich, geeignete
cDNA-Bibliotheken auf das Vorhandensein von cDNA, die
die vollständige für einen TNF-Rezeptor kodierende
Sequenz enthält, zu durchsuchen (dieser Vorgang kann
erforderlichenfalls in mehreren Schritten erfolgen).
Erfindungsgemäß wurde die cDNA der oben definierten
Sequenz, die mittels PCR aus der cDNA-Bibliothek der
TNF-α induzierten Fibrosarkomzellinie HS913 T (in
Lambda gt11), erhalten worden war, zum nochmaligen
Durchsuchen der cDNA-Bibliothek verwendet, von den
hybridisierenden Klonen die Lamda-DNA präpariert,
subkloniert und sequenziert. Es wurde ein 1334 Basen
langes cDNA Insert erhalten, das die für TNF-BP
kodierende DNA enthält.
Die Erfindung betrifft eine DNA, kodierend für ein
Polypeptid mit der Fähigkeit, TNF zu binden, bzw. für
ein Polypeptid, von dem dieses TNF bindende Protein
eine Teilsequenz darstellt.
Darunter sind auch solche DNAs zu verstehen, die für
Teile dieser Polypeptide kodieren.
Die vollständige Nukleotidsequenz des längsten
erhaltenen cDNA-Inserts ist in Fig. 1 abgebildet.
Diese Nukleotidsequenz weist einen durchgehenden
offenen Leserahmen auf, beginnend mit Base 213, bis
zum Ende des 1334 bp langen cDNA Inserts. Da sich in
demselben Leserahmen 4 Codons vor dem potentiellen
Translationsstartcodon ATG (213-215) ein Stopcodon
(TAG) befindet, kann davon ausgegangen werden, daß es
sich bei dem Startcodon tatsächlich um den in vivo
verwendeten Translationsstart handelt.
Der Vergleich der von der Nukleotidsequenz
abgeleiteten Aminosäuresequenz mit den
Aminosäuresequenzen, die vom aminoterminalen Ende von
TNF-BP und von tryptischen Peptiden bestimmt worden
waren, zeigt hohe Übereinstimmung. Daraus ergibt sich,
daß die isolierte cDNA die für das authentische TNF-BP
kodierende Sequenz enthält.
Vom N-Terminus ausgehend ist die erste Sequenz, die
eine Übereinstimmung mit einer tryptischen
Spaltpeptidsequenz zeigt, die Sequenz von Fraktion 12
(Leu-Val-Pro-...), die auch als Nebensequenz bei der
Analyse des N-Terminus von TNF-BP erhalten worden war.
Dieses N-terminale Leucin entspricht der 30.
Aminosäure in der cDNA Sequenz. Da der vorangehende
Abschnitt von 29 Aminosäuren einen stark hydrophoben
Charakter aufweist und es sich bei TNF-BP um ein
sekretiertes Protein handelt, kann gefolgert werden,
daß diese 29 Aminosäuren das für den Sekretionsvorgang
benötigte Signalpeptid darstellen, das bei der
Sekretion abgespalten wird (in Fig. 1 mit S1-S29
bezeichnet).
Die als Hauptsequenz bei der N-terminalen Analyse von
TNF-BP erhaltene Aminosäuresequenz entspricht den
Aminosäuren beginnend mit Asp-12 in der cDNA Sequenz.
Dieser Asparaginsäurerest folgt direkt dem basischen
Dipeptid Lys-Arg. Da nach diesem Dipeptid in vivo sehr
viele Proteine proteolytisch gespalten werden, ist
anzunehmen, daß TNF-BP mit N-terminalem Asp nicht
direkt durch Prozessierung eines Precursors beim
Sekretionsvorgang entsteht, sondern daß vom
prozessierten Protein die N-terminalen 11 Aminosäuren
zu einem späteren Zeitpunkt durch extrazelluläre
Proteasen abgespalten werden.
Das carboxy-terminale Ende von TNF-BP war mit Ile-Glu-
Asn bestimmt worden (C-terminale Analyse; tryptisches
Peptid Fraktion 27: Aminosäuren 159-172, tryptisches
Peptid Fraktion 21: Aminosäuren 165-172), wobei Asn
der Position 172 in der cDNA Sequenz entspricht.
Potentielle N-Glykosylierungsstellen der allgemeinen
Formel Asn-X-Ser/Thr, wobei X jede beliebige
Aminosäure außer Prolin sein kann, befinden sich an
den Positionen 25-27 (Asn-Asn-Ser), 116-118 (Asn-Cys-
Ser) und 122-124 (Asn-Gly-Thr) der TNF-BP cDNA
Sequenz. (Daß Asn-25 glykosyliert ist, ergibt sich
daraus, daß bei der Sequenzierung des entsprechenden
tryptischen Spaltpeptids an dieser Stelle Asn nicht
identifiziert werden konnte.)
Die Analyse der Nukleotid - bzw. der davon
abgeleiteten Aminosäuresequenz im Zusammenhang mit den
durchgeführten proteinchemischen Untersuchungen zeigt,
daß es sich bei TNF-BP um ein glykosyliertes
Polypeptid mit 172 Aminosäuren, das durch
proteolytische Spaltung nach der 11. Aminosäure in ein
Glykoprotein mit 161 Aminosäuren umgewandelt wird,
handelt.
Die nachfolgende Tabelle zeigt die sequenzierten
tryptischen Peptide und die aus der cDNA Sequenz
abgeleiteten korrespondierenden Aminosäurensequenzen:
Die erhaltene cDNA stellt die Voraussetzung für die
Herstellung von rekombinantem TNF-BP dar.
Gegenstand der Erfindung ist somit weiters die für,
vorzugsweise sekretierbares, TNF-BP kodierende DNA.
Durch Einbringen eines DNA-Konstruktes enthaltend die
für TNF-BP kodierende Sequenz mit einer für ein
Signalpeptid kodierenden Sequenz unter Kontrolle eines
geeigneten Promoters in geeignete Wirtsorganismen,
zweckmäßigerweise in eukaryotische, bevorzugt höhere
eukaryotische Zellen, kann TNF-BP produziert werden,
das in den Zellüberstand sekretiert wird.
Im Falle der Verwendung eines Signalpeptids im
Hinblick auf die Sekretion des Proteins wird
zweckmäßigerweise die für das Signalpeptid kodierende
DNA vor das Codon für Asp-12 gefügt, um ein
einheitliches Produkt zu erhalten. Grundsätzlich ist
jedes Signalpeptid geeignet, das im entsprechenden
Wirtsorganismus die Sekretion des reifen Proteins
gewährleistet. Gegebenenfalls kann die Signalsequenz
auch vor das für Leu-1 kodierende Triplett gesetzt
werden, wobei in diesem Fall erforderlich sein kann,
die durch Abspaltung des aus 11 Aminosäuren
bestehenden Peptids am N-Terminus entstehende Form von
TNF-BP vom nicht oder nicht vollständig prozessierten
TNF-BP in einem zusätzlichen Reinigungsschritt zu
trennen.
Da die cDNA nach dem Codon für Asn-172, das aufgrund
der C-terminalen Analyse den C-Terminus darstellt,
kein Stopcodon enthält, wird zweckmäßigerweise im
Hinblick auf die Expression von TNF-BP nach dem Codon
für Asn 172 durch gerichtete Mutagenese ein
Translationsstopcodon eingeführt.
Die für TNF-BP kodierende DNA kann durch Mutation,
Transposition, Deletion, Addition oder Verkürzung
modifiziert werden, sofern derartig modifizierte DNAs
für (Poly) peptide mit der Fähigkeit, TNF zu binden,
kodieren. Derartige Modifikationen können z.B. darin
bestehen, eine oder mehrere der potentiellen,
gegebenenfalls für die biologische Aktivität nicht
erforderlichen Glykosylierungsstellen zu verändern,
indem z.B. das Asn-Codon durch ein für eine andere
Aminosäure kodierendes Triplett ersetzt wird. Unter
Berücksichtigung der Erhaltung der biologischen
Aktivität können auch Modifikationen vorgenommen
werden, die in einer Änderung der Disulfidbrücken
(z.B. Verringerung deren Anzahl) resultieren.
Die angeführten DNA-Moleküle stellen somit die
Voraussetzung für die Konstruktion rekombinanter DNA-
Moleküle dar, die ebenfalls Gegenstand der Erfindung
sind. Mit solchen rekombinanten DNA-Molekülen in Form
von Expressionsvektoren, enthaltend die für ein
Protein mit TNF-BP Aktivität kodierende,
gegebenenfalls in geeigneter Weise modifizierte DNA,
vorzugsweise mit einer vorgeschalteten Signalsequenz,
und die für die Expression des Proteins erforderlichen
Kontrollsequenzen, können geeignete Wirtsorganismen
transformiert, gezüchtet und das Protein gewonnen
werden.
Ebenso wie etwaige Modifikationen der DNA-Sequenz
erfolgt die Auswahl von für die Expression geeigneten
Wirtsorganismen insbesondere im Hinblick auf die
biologische Wirkung des Proteins, TNF zu binden.
Darüberhinaus gehen die bei der Herstellung
rekombinanter Proteine üblichen Kriterien wie
Verträglichkeit mit dem gewählten Vektor,
Prozessierungsfähigkeit, Isolierung des Proteins,
Expressionscharakteristika, Sicherheits- und
Kostenaspekte in die Entscheidung über den
Wirtsorganismus ein. Die Wahl eines geeigneten Vektors
ergibt sich aus dem für die Transformation
vorgesehenen Wirt. Grundsätzlich sind alle Vektoren
geeignet, die die erfindungsgemäßen für TNF-BP
kodierenden DNAs (bzw. Modifikationen davon)
replizieren und exprimieren.
Im Hinblick auf die biologische Aktivität des Proteins
ist bei der Expression der für TNF-BP kodierenden DNA
vor allem der etwaigen Relevanz der beim natürlichen
Protein festgestellten Kriterien Glykosylierung und
hoher Anteil an Cysteinresten für die Eigenschaft, TNF
zu binden, Rechnung zu tragen. Zweckmäßig werden daher
für die Expression Eukaryonten insbesondere geeignete
Expressionssysteme höherer Eukaryonten, verwendet.
Auf Grund ihrer Fähigkeit, TNF zu binden, sind die
erfindungsgemäßen rekombinanten Polypeptide geeignet,
bei der prophylaktischen und therapeutischen
Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers
bei Indikationen eingesetzt zu werden, bei denen eine
schädigende Wirkung von TNF-α auftritt.
Da beim TNF-BP auch eine TNF-β inhibierende Wirkung
nachgewiesen wurde, kann es (bzw. die verwandten bzw.
modifizierten Polypeptide) in geeigneter Dosierung,
gegebenenfalls in im Hinblick auf eine gesteigerte
Affinität zu TNF-β modifizierter Form, auch für die
Inhibierung der Wirkung von TNF-β im Organismus
verwendet werden.
Gegenstand der Erfindung sind daher weiters
pharmazeutische Zubereitungen, enthaltend eine die
biologische Wirkung von TNF-α und/oder TNF-β wirksam
hemmende Menge von TNF-BP bzw. einem verwandten
Polypeptid mit der Fähigkeit, TNF zu binden.
Die cDNA enthält, wie bereits erwähnt, nach dem Codon
für Asn-172 nicht das Stopcodon, das aufgrund der
Analyse des C-Terminus zu erwarten wäre, sondern der
offene Leserahmen wird fortgesetzt. Die Region
zwischen Val-183 und Met-204 hat einen stark
hydrophoben Charakter. Dieser hydrophobe Bereich von
22 Aminosäuren, gefolgt von einem Abschnitt mit einem
Gehalt an positiv geladenen Aminosäuren (Arg-206, Arg-
209) weist die typischen Merkmale einer
Transmembrandomäne auf, die Proteine in der
Zellmembran verankert. Der in Richtung C-Terminus
folgende Proteinanteil ist dagegen wieder stark
hydrophil.
Das Hydrophobizitätsprofil ist in Fig. 2 abgebildet
(der Hydrophobizitätsplot wurde mit Hilfe des Mac
Molly Programms (Fa. Soft Gene Berlin) erstellt; die
Fensterweite für die Berechnung der Werte betrug 11
Aminosäuren. Hydrophobe Bereiche entsprechen
positiven, hydrophile Bereiche negativen Werten auf
der Ordinate. Auf der Abszisse ist die Zahl der
Aminosäuren, beginnend mit dem Startmethionin S1,
dargestellt).
Aus der Proteinstruktur ergibt sich, daß die für das
lösliche, sekretierte TNF-BP kodierende DNA Teil einer
für ein größeres Protein kodierenden DNA ist: Dieses
Protein weist die Merkmale eines in der Zellmembran
verankerten Proteins auf, enthält TNF-BP in für eine
extrazelluläre Domäne typische Weise und weist einen
beträchtlichen für zytoplasmatische Domänen typischen
Abschnitt auf. Lösliches TNF-BP wird offensichtlich
von dieser membrangebundenen Form durch proteolytische
Spaltung knapp außerhalb der Transmembrandomäne
erhalten.
Die Struktur des von der erhaltenen cDNA kodierten
Proteins im Zusammenhang mit der Fähigkeit von TNF-
BP, TNF zu binden, bestätigen die Annahme, daß es sich
bei TNF-BP um einen Teil eines zellulären
Oberflächenrezeptors für TNF handelt, dessen
extrazelluläre, für die Bindung von TNF
verantwortliche Domäne proteolytisch abgespalten
werden kann und in Form des löslichen TNF-BP
wiedergefunden wird. (Dabei soll nicht ausgeschlossen
werden, daß im Hinblick auf die Funktionsfähigkeit des
Rezeptors dieses Protein gegebenenfalls mit einem oder
mehreren anderen Proteinen assoziiert ist.)
(Für Zwecke der Produktion von TNF-BP in größerem
Maßstab wird vorteilhafterweise nicht von der gesamten
cDNA ausgegangen, weil das Erfordernis der Abspaltung
von TNF-BP von dem Teil des Proteins, das den
membrangebundenen Teil des TNF-Rezeptors darstellt,
berücksichtigt werden müßte. Es wird vielmehr, wie
bereits angeführt, zweckmäßigerweise nach dem Codon
für Asn-172 durch gerichtete Mutagenese ein
Translationsstopcodon eingeführt, um eine über das C-
terminale Ende von TNF-BP hinausgehende
ProteinsYnthese zu verhindern.)
Mit der erfindungsgemäß erhaltenen cDNA, die eine
Teilsequenz der für einen TNF-Rezeptor kodierenden DNA
darstellt, gelangt man zur vollständigen
Rezeptorsequenz, indem z.B. mittels modifizierter PCR
(RACE = "rapid amplification of cDNA ends" (36)) das
fehlende 3′-Ende mit Hilfe eines Primers, der aufgrund
einer möglichst weit in Richtung 3′-Ende der
vorhandenen cDNA gelegenen Sequenz konstruiert wurde,
amplifiziert wird.
Eine alternative Methode besteht im konventionellen
Screenen der cDNA-Bibliothek mit der verfügbaren cDNA
bzw. Teilen davon als Sonde.
Gegenstand der Erfindung ist somit weiters die für
einen TNF-Rezeptor kodierende DNA, die den in vivo
translatierten Abschnitt der erfindungsgemäß
erhaltenen cDNA bzw. degenerierte Varianten davon
enthält. Damit sind auch DNAs mitumfaßt, die für C-
und/oder N-terminal verkürzte, z.B. prozessierte, oder
für modifizierte (z.B. durch Änderungen an
proteolytischen Spaltstellen, Glykosylierungsstellen
oder bestimmten Domänenbereichen) Formen bzw. für
Fragmente, z.B. die verschiedenen Domänen, des TNF-
Rezeptors kodieren.
Diese DNAs können in Verbindung mit den für die
Expression erforderlichen Kontrollsequenzen als
Bestandteil rekombinanter DNA-Moleküle zur
Transformation von prokaryotischen oder eukaryotischen
Wirtsorganismen verwendet werden. Dadurch wird
einerseits die Voraussetzung geschaffen, den TNF-
Rezeptor in größeren Mengen auf rekombinantem Weg
herzustellen, um z.B. die Aufklärung seiner
dreidimensionalen Struktur zu ermöglichen.
Andererseits können mit diesen DNAs höhere
eukaryotische Zellen transformiert werden, um Studien
über Mechanismen und Dynamik der TNF/
Rezeptor-Wechselwirkung, der Signalübertragung bzw.
über die diesbezügliche Relevanz der verschiedenen
Rezeptordomänen bzw. Abschnitten davon zu erhalten.
Der rekombinante TNF-Rezeptor (bzw. Fragmente oder
Modifikationen davon) kann dazu verwendet werden,
Substanzen auf ihre Wechselwirkung mit TNF oder den
TNF-Rezeptor bzw. auf ihren Einfluß auf die durch TNF
induzierte Signalübertragung zu untersuchen. Derartige
Screenings (unter Verwendung der Proteine/Fragmente
bzw. von entsprechend transformierten höheren
eukaryotischen Zellen) schaffen die Voraussetzung für
die Identifizierung von Substanzen, die TNF
substituieren, seine Bindung an den Rezeptor hemmen
bzw. solche, die den Mechanismus der durch TNF
ausgelösten Signalübertragung blockieren oder
verstärken können.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung mitumfaßt sind
auch Nukleinsäuren, die nicht für TNF-BP oder den
Rezeptor kodieren, die jedoch unter Bedingungen
niedriger Stringenz mit der erfindungsgemäß erhaltenen
cDNA hybridisieren.
Im einzelnen wurde die gestellte Aufgabe wie folgt
gelöst:
Vom hochgereinigten TNF-BP wurden die N-terminale Aminosäuresequenz sowie die Aminosäuresequenzen von durch tryptischen Verdau des Proteins erhaltenen Peptiden bestimmt.
Vom hochgereinigten TNF-BP wurden die N-terminale Aminosäuresequenz sowie die Aminosäuresequenzen von durch tryptischen Verdau des Proteins erhaltenen Peptiden bestimmt.
Weiters wurde der C-Terminus durch Carboxypeptidase P
Verdau, Derivatisierung der abgespaltenen Aminosäuren
und chromatographische Auftrennung bestimmt.
Aus den durch tryptischen Verdau erhaltenen
Peptidsequenzen wurden im Hinblick auf ihren Einsatz
in der PCR für die Herstellung von Oligonukleotiden
Bereiche einerseits aus dem N-Terminus und
andererseits aus einem tryptischen Peptid derart
ausgewählt, daß die Komplexität von
Mischoligonukleotiden für die Hybridisierung mit cDNA
möglichst gering ist. Auf Basis dieser beiden Bereiche
wurde je ein Satz Mischoligonukleotide hergestellt,
wobei der vom N-terminal gelegenen Bereich abgeleitete
entsprechen der mRNA und der vom tryptischen Peptid
abgeleitete revers komplementär zur mRNA synthetisiert
wurde. Um das nachfolgende Klonieren eines mit PCR
amplifizierten Segments zu erleichtern, wurde der vom
tryptischen Peptid abgeleitete Satz von
Oligonukleotiden mit einer BamHI-Restriktionsstelle
versehen. Darauf wurde Lambda-DNA aus der TNF-α
induzierten Fibrosarkom cDNA-Bibliothek isoliert und
daraus eine TNF-BP-Sequenz mittels PCR amplifiziert.
Das erhaltene Fragment wurde kloniert und sequenziert;
es weist 158 Nukleotide auf und enthält zwischen den
beiden von den Primer Oligonukleotiden stammenden
Sequenzabschnitten die für das tryptische Peptid 20
kodierende Sequenz.
Dieses DNA-Fragment wurde nachfolgend radioaktiv
markiert und als Sonde zur Isolierung von cDNA-Klonen
aus der Fibrosarkom-Bibliothek verwendet. Es wurde
dazu so verfahren, daß zunächst Plaques mit der Sonde
hybridisiert, Phagen von hybridisierenden Plaques
vereinzelt und daraus Lambda DNA gewonnen wurden.
Einzelne cDNA-Klone wurden subkloniert und
sequenziert; zwei der charakterisierten Klone
enthielten die für TNF-BP kodierende Sequenz.
Die Erfindung wird an Hand der folgenden Vorversuche
und Beispiele näher erläutert:
- a) Konzentration des Harns
200 l Dialyseharn von Urämiepatienten, aufbewahrt in Flaschen enthaltend EDTA (10 g/l), Tris (6 g/l), NaN3 (1 g/l) und Benzamidinhydrochlorid (1 g/l) sowie kühl gelagert, wurden durch Ultrafiltration mittels einem hochdurchlässigen Hämokapillarfilter mit einer asymmetrischen Hohlfasermembran (FH 88H, Gambro) auf 4,2 l mit einem Proteingehalt von 567 g konzentriert. Der konzentrierte Harn wurde gegen 10mM/l Tris HCl, pH 8 dialysiert. Während dieses Vorgangs wurde, wie in den nachfolgenden Schritten (außer bei der Reverse Phase Chromatographie), 1 mM/l Benzamidinhydrochlorid zugefügt, um proteolytischem Verdau entgegenzuwirken. Alle nachfolgenden Reinigungsschritte wurden, wenn nicht anders angegeben, bei 4°C durchgeführt. - b) Ionenaustauschchromatographie
Dieser Schritt wurde durchgeführt indem DEAE-Sephacel- Säulen (2,5×40 cm) mit Proben konzentrierten und dialysierten Harns, enthaltend je ca. 75 g Protein, beschickt wurden. Eluiert wurde mit 800 ml eines NaCl /10 mM Tris/HCl pH-8-Gradienten, wobei die NaCl Konzentration 0 bis 0,4 M betrug. Die das TNF-BP enthaltenden Fraktionen von sieben Säulen mit einem Gesamtproteingehalt von 114 g wurden bei -20°C gelagert. - c) Affinitätschromatographie
Zur Herstellung der TNF-Sepharosesäule wurde rTNF-α (15 mg) in 0,1 M NaHCO3, 1 M NaCl, pH 9 (Kopplungspuffer) an 1,5 g cyanogenbromidaktivierte Sepharose 4B (Pharmacia) gekoppelt. Die Sepharose wurde in 1 mM HCl gequollen und mit Kopplungspuffer gewaschen. Nach Zusatz von rTNF-α wurde die Suspension 2 Stunden lang bei Raumtemperatur rotieren gelassen. Der Überschuß an CNBr-Gruppen wurde durch eineinhalbstündige Rotation mit 1 M Ethanolamin, pH 8 blockiert. Die TNF-Sepharose wurde einige Male abwechselnd in 1M NaCl, 0,1 M Natriumacetat pH 8 und 1 M NaCl, 0,11 M Borsäure pH 4 gewaschen und anschließend in phosphatgepufferter Kochsalzlösung mit 1 mM Benzamidinhydrochlorid gelagert. Die aus Schritt b) erhaltenen Fraktionen wurden auf eine Konzentration von 0,2 M NaCl, 10 mM Tris/HCl, pH 8 eingestellt. Die TNF-Sepharose wurde in eine Säule gepackt und mit 0,21 M NaCl, 10 mM Tris HCl, pH 8 gewaschen und die TNF-BP enthaltenden Fraktionen, entsprechend ca. 30 g Protein, bei einer Durchflußrate von 10 ml/h aufgetragen und ausgiebig mit 0,2 M NaCl, 10 mM Tris HCl, pH 8 gewaschen, bis im Eluat bei 280 nm keine Absorption mehr nachweisbar war. Anschließend wurde TNF-BP mit 0,2 M Glycin/HCl, pH 2,5 eluiert.
TNF-BP enthaltende Fraktionen aus 4 Auftrennungen
wurden vereinigt und nach Zusatz von Polyethylenglykol
(MG 6000) - bis zu einer Endkonzentration von 10 mg/ml
- lyophilisiert. Die lyophilisierte Probe wurde in
destilliertem Wasser gelöst und gegen destilliertes
Wasser dialysiert. (Die dialysierte Probe (4 ml) wurde
in tiefgefrorenem Zustand gelagert.)
Dieser Reinigungsschritt brachte gegenüber dem
vorangegangenen eine weitere Anreicherung um das ca.
9000fache. SDS-PAGE (durchgeführt, wie in Vorversuch 2
beschrieben) der TNF-BP enthaltenden Fraktionen zeigte
die Elution von drei Hauptkomponenten mit
Molekulargewichten von
28 000, 30 000 und 50 000.
- d) Reverse Phase Chromatographie
Ein aliquoter Anteil (1 ml) der aus Schritt c) erhaltenen Fraktionen mit einem Zusatz von 0,1% Trifluoressigsäure wurde auf eine ProRPC HR 5/10 Säule (Pharmacia) , die an ein FPLC-System (Pharmacia) angeschlossen war, aufgetragen. Die Säule wurde mit 0,1%iger Trifluoressigsäure equilibriert und bei Raumtemperatur mit einem linearen 15 ml Gradienten von 10 Vol% bis 50 Vol% Acetonitril, enthaltend 0,1% Trifluoressigsäure, beschickt; die Durchflußrate betrug 0,3 ml/min. Fraktionen von 0,5 ml wurden gesammelt und die Absorption bei 280 nm sowie die Aktivität des TNF-α bindenden Proteins mit Hilfe des Kompetitionsbindungstest, wie im Beispiel 1 angegeben, bestimmt, wobei jeweils 0,01 µl Probe verwendet wurden. TNF-BP eluierte als ein einziger Aktivitätspeak entsprechend einem scharfen UV- Absorptionspeak.
Dieser letzte Reinigungsschritt brachte eine Zunahme
der spezifischen Aktivität um das ca. 29fache, die
Gesamtzunahme an Aktivität gegenüber dem
Ausgangsmaterial (konzentrierter Dialyseharn) betrug
das ca. 1,1 × 106fache.
SDS-PAGE der reduzierten und nicht reduzierten Probe,
durchgeführt wie in Vorversuch 2 angegeben, ergab eine
diffuse Bande, die auf das Vorhandensein eines
einzigen Polypeptids mit einem Molekulargewicht von
ca. 30 000 hinwies. Das diffuse Erscheinungsbild der
Bande kann auf das Vorliegen einer oder mehrerer
heterogener Glykosylierungen und/oder eines zweiten,
in geringer Menge vorhandenen Polypeptids
zurückzuführen sein. Die Annahme, dabei könnte es sich
um ein Polypeptid mit dem in Vorversuch 3d als
Nebensequenz bestimmten N-Terminus handeln, das
gegenüber TNF-BP am N-Terminus verlängert ist, wurde
durch die Sequenz der cDNA bestätigt, wonach zwischen
der Signalsequenz und Asn (Pos. 12) ein Abschnitt von
11 Aminosäuren vorliegt, dessen Sequenz mit der N-
terminalen Nebensequenz übereinstimmt und der
offensichtlich vom prozessierten Protein abgespalten
wird.
SDS-PAGE wurde nach der Methode von Laemmli (24) auf
18 cm langen, 16 cm breiten und 1,5 mm dicken
Flachgelen mit 10 Taschen mittels einer LKB 2001
Elektrophorese-Einheit durchgeführt. Der Proteingehalt
der Proben aus den Reinigungsschritten c) und d)
(Vorversuch 1) wurde mittels Bio-Rad Protein Assay
bestimmt bzw. aus der Absorption bei 280 nm berechnet,
wobei einer Absorption von 1,0 ein Gehalt von 1 mg
TNF-BP/ml zugeordnet wurde.
Die Proben, enthaltend ca. 25 µg Protein (aus
Vorversuch 1c) bzw. ca. 5 µg (aus 1d) in reduzierter
(β-Mercaptoethanol) und nicht reduzierter Form wurden
auf ein 3%iges Sammelgel und ein 5 bis 20%iges lineares
Polyacrylamidgradientengel aufgetragen. Die
Elektrophorese wurde bei 25 mA/Gel ohne Kühlung
gefahren. Als Molekulargewichtsmarker (Pharmacia)
wurden Phosphorylase B (MG 94 000), Rinderserumalbumin
(MG 67 000), Ovalbumin (MG 43 000), Karboanhydrase (MG
30 000), Sojabohnen-Trypsininhibitor (MG 20 100) und a-
Laktalbumin (MG 14 400) verwendet. Die Gele wurden mit
Coomassie Blue in 7%iger Essigsäure/40%igem Ethanol
gefärbt und in 7%iger Essigsäure/25%igem Ethanol
entfärbt.
Das Ergebnis der SDS-PAGE zeigte TNF-BP als
Polypeptidkette mit einem Molekulargewicht von ca.
30 000 .
- a) Probenvorbereitung
15 µg des nach Vorversuch 1d) gereinigten Proteins wurden über Reverse Phase HPLC entsalzt und weiter gereinigt. Dazu wurden eine Bakerbond WP C18 Säule (Baker; 4,6×250 mm) und 0,1%ige Trifluoressigsäure in Wasser (Eluens A) bzw. in Acetonitril (Eluens B) als mobile Phase verwendet. Die Gradientensteigerung betrug 20 bis 68% Eluens B in 24 min. Die Detektion erfolgte parallel bei 214 nm und bei 280 nm. Die TNF-BP enthaltende Fraktion wurde gesammelt, getrocknet und in 75 µl 70%iger Ameisensäure gelöst und direkt für die Aminosäuresequenzanalyse verwendet. - b) Aminosäuresequenzanalyse
Die automatische Aminosäuresequenzanalyse wurde mit einem Applied Biosystems 477 A Flüssigphasensequenator durch On-line Bestimmung der freigesetzten Phenylthiohydantoin-Derivate mittels Applied Biosystems Analysator, Modell 120 A PTH, durchgeführt. - Sie ergab die folgende N-terminale Sequenz als Hauptsequenz (ca. 80% der Proteinmenge): Asp-Ser-Val-X-Pro-Gln-Gly- Lys-Tyr-Ile-His-Pro-Gln-.
- Daneben war folgende Nebensequenz nachzuweisen: Leu- (Val)-(Pro)-(His)-Leu-Gly-X-Arg-Glu-. (Die in Klammer stehenden Aminosäuren konnten nicht eindeutig identifiziert werden.)
Die Probenvorbereitung wurde wie im Vorversuch 3
durchgeführt mit dem Unterschied, daß die Probenmenge
10 µg betrug. Die Probe wurde in 50 µl Wasser
aufgenommen und in 4 Portionen geteilt. Einer der vier
aliquoten Teile wurde zur Reinheitsbestimmung mittels
SDS-PAGE nach der Methode von Laemmli (24) mit DTT
(Dithiothreitol) reduziert und auf Minigelen (Höfer,
55×80×0,75 mm, 15%) getrennt; als
Molekulargewichtsmarker wurde der im Vorversuch 8
angegebene verwendet. Die Färbung erfolgte nach der
Methode von Oakley (25). Das Elektropherogramm ist in
Fig. 9 dargestellt. Es zeigt eine einzige Bande bei
einem Molekulargewicht von ca. 30 000.
- a) Tryptic Peptide Mapping
Etwa 60 µg des nach Vorversuch 1d) gereinigten Proteins wurden über Reverse Phase HPLC entsalzt und damit weiter gereinigt. Dazu wurden eine Bakerbond WP C18 Säule (Baker; 4,6×250 mm) und 0,1%ige Trifluoressigsäure in Wasser (Eluens A) bzw. in Acetonitril (Eluens B) als mobile Phase verwendet. Die Gradientensteigerung betrug 20 bis 68% Eluens B in 24 min. Die Detektion erfolgte parallel bei 214 nm und bei 280 nm. Die TNF-BP enthaltende Fraktion (Retentionszeit etwa 13,0 min) wurde gesammelt, getrocknet und in 60 µl 1%igem Ammoniumbicarbonat gelöst. - Dieser Lösung wurden 1% w/w, entsprechend 0,6 µg Trypsin (Boehringer Mannheim) zugesetzt und die Reaktionsmischung 6 Stunden bei 37°C inkubiert. Danach wurden nochmals 1% w/w Trypsin zugesetzt und die Inkubation über Nacht fortgesetzt.
- Zur Reduktion der Disulfidbrücken wurde der Reaktionsansatz anschließend mit 60 µl 6 M Harnstoff und mit 12 µl 0,5 M Dithiothreitol versetzt und 2 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen.
- Die Auftrennung der entstandenen tryptischen Spaltpeptide erfolgte über Reverse Phase HPLC, wobei eine Delta Pak C18 Säule (Waters, 3,9× 150 mm, 5 µm Teilchendurchmesser, 100 A Porendurchmesser) bei 30°C und 0,1%ige Trifluoressigsäure in Wasser (Eluens A) bzw. in Acetonitril (Eluens B) als mobile Phase verwendet wurden. Die Gradientensteigerung betrug 0 bis 55% Eluens B in 55 min, danach wurde 55% B für 15 min beibehalten. Die Flußrate betrug 1 ml/min, die Detektion erfolgte parallel bei 214 nm (0,5 AUFS) und bei 280 nm (0,05 AUFS).
- b) Sequenzanalyse von tryptischen Peptiden
Einige der nach a) gewonnenen tryptischen Spaltpeptide von TNF-BP wurden der automatischen Aminosäuresequenzanalyse unterworfen. Dazu wurden die entsprechenden Fraktionen aus der Reverse Phase HPLC gesammelt, getrocknet und in 75 µl 70%iger Ameisensäure gelöst. Diese Lösungen wurden direkt für die Sequenzierung in einem Applied Biosystems 477 A Pulsed Liquid Phase Sequenator eingesetzt. Tab. 1 enthält die Ergebnisse der Sequenzanalyse der tryptischen Peptide, wobei die in Klammern angeführten Aminosäuren nicht mit Sicherheit nachgewiesen werden konnten. Die Angabe "X" bedeutet, daß an dieser Stelle die Aminosäure nicht identifiziert werden konnte.
In der Fraktion 8 konnte die Aminosäure in
Position 6 nicht identifiziert werden. Die
Sequenz -X-N-S- für die Position 6-8 läßt
vermuten, daß die Aminosäure 6 in glykosylierter
Form vorliegt.
In der Fraktion 17 konnte die Aminosäure in
Position 6 ebenfalls nicht identifiziert werden.
Die Sequenz -X-N-S- (bereits in Fraktion 8
auftretend) für die Positionen 6 bis 8 läßt
vermuten, daß die Aminosäure 6 in glykosylierter
Form vorliegt. Die ersten 13 Aminosäuren der
Fraktion 17 sind weitgehend identisch mit der
Fraktion 8; bei Fraktion 17 dürfte es sich somit
um ein Peptid handeln, das durch unvollständige
tryptische Spaltung entstanden ist.
Auffallend ist die Identität der Fraktion 21 mit
den Positionen 7 bis 14 der Fraktion 27. Sowohl
in Fraktion 21 als auch in Fraktion 27 bricht
die Sequenz nach der Aminosäure Asparagin
(Position 8 bzw. 14) plötzlich ab, obwohl hier
keine tryptische Spaltung zu erwarten ist. Dies
ist ein Hinweis darauf, daß die Aminosäure
Asparagin (Position 8 in Fraktion 21 bzw.
Position 14 in Fraktion 27) die C-terminale
Aminosäure von TNF-BP sein könnte.
Auffallend ist die weitgehende Identität der
Sequenz der nur in geringer Menge auftretenden
Fraktion 12 mit der in Vorversuch 10 bestimmten
Nebensequenz des N-Terminus. Daß die Proteine
der Haupt- und Nebensequenz auf einer
analytischen Reverse Phase HPLC-Säule
(Vorversuch 3b) nicht trennbar waren, lieferte
einen Hinweis dafür, daß es sich bei dem Protein
mit der Nebensequenz um eine am N-Terminus
verlängerte Form des TNF-BP handelt, die durch
Prozessierung zum Großteil in das Protein mit
der Hauptsequenz überführt wird.
Aminosäuresequenzen der analysierten tryptischen Peptide von TNF-BP | |
Fraktion | |
Aminosäuresequenz | |
1 | |
D-S-V-C-P-Q-G-K | |
2 | X-X-L-S-(C)-S-K |
3 | D-T-V-(C)-G-(C)-R |
4 | E-N-E-(C)-V-S-(C)-S-N-(C)-K |
5 | E-N-E-(C)-V-S-(C)-(S)-N-(C)-K-(K) |
8 | Y-I-H-P-Q-X-N-S-I-X-X-X-K |
11 | E-C-E-S-G-S-F-T-A-S-E-N-(N)-(K) |
12 | L-V-P-H-L-G-D-R |
13 | K-E-M-G-Q-V-E-I-S-S-(C)-T-V-D-(R) |
14/I | G-T-Y-L-Y-N-D-C-P-G-P-G-Q- |
14/II | (E)-M-G-Q-V-(E)-(I)-(S)-X-X-X-(V)-(D)- |
15 | K-E-M-G-Q-V-E-I-S-S-(C)-T-V-D-R-D-T-V-(C)-G- |
17 | Y-I-H-P-Q-X-N-S-I-(C)-(C)-T-K-(C)-H-K-G-X-Y- |
20 | G-T-Y-L-Y-N-D-C-P-G-P-G-Q-D-T-X-X-R |
21 | L-(C)-L-P-Q-I-E-N |
26 | Q-N-T-V-(C)-T-X-(H)-A-G-F-(F)-L-(R) |
27 | S-L-E-(C)-T-K-L-(C)-L-P-Q-I-E-N |
Diese Analyse wurde nach dem Prinzip der in (31)
beschriebenen Methode durchgeführt.
Etwa 60 µg des nach Vorversuch 2d) gereinigten Proteins
wurden über Reverse Phase HPLC entsalzt und damit
weiter gereinigt. Dazu wurden eine Bakerbond WP C18
Säule (Baker; 4,6×250 mm) und 0,1%ige
Trifluoressigsäure in Wasser (Eluens A) bzw. in
Acetonitril (Eluens B) als mobile Phase verwendet. Die
Gradientensteigerung betrug 20 bis 68% Eluens B in 24
min. Die Detektion erfolgte parallel bei 214 nm und bei
280 nm. Die TNF-BP enthaltende Fraktion (Retentionszeit
etwa 13,0 min) wurde gesammelt, getrocknet und in
120 µl 10 mM Natriumacetat (auf pH 4 gestellt mit 1 N
HCl) gelöst.
Dieser Lösung wurden 6 µl Brÿ 35 (10 mg/ml in Wasser)
sowie 1,5 µl Carboxypeptidase P (0,1 mg/ml in Wasser,
Boehringer Mannheim, Nr. 8 10 142) zugesetzt. Das
entspricht einem Gewichtsverhältnis Enzym zu Protein
von 1 zu 400 (36).
Sofort nach Zusatz des Enzyms wurde eine Probe von
20 µl der Reaktionsmischung entnommen und darin die
enzymatische Reaktion durch Ansäuern mit 2 µl
konzentrierter Trifluoressigsäure und durch Gefrieren
bei -20°C unterbrochen.
Die Reaktionsmischung wurde im Kühlschrank (ca. 8°C)
stehengelassen und Proben zu je 20 µl nach 10, 20, 60
und 120 Minuten entnommen. Der Rest der
Reaktionsmischung wurde weitere 120 Minuten bei
Raumtemperatur belassen. Alle Proben wurden sofort nach
der Entnahme durch Zusatz von 2 µl konzentrierter
Trifluoressigsäure angesäuert und bei -20°C
eingefroren, wodurch die enzymatische Reaktion
unterbrochen wurde.
Parallel zum beschriebenen Probenansatz mit etwa 60 µg
TNF-BP wurde unter identischen Bedingungen ein
Reagentienblindwert angesetzt, dem kein Protein
zugesetzt worden war.
Nach der letzten Probennahme wurden alle Proben 30
Minuten lang in einem Speed Vac Concentrator
getrocknet, mit 10 µl einer Lösung aus 2 Teilen
Äthanol, 2 Teilen Wasser und 1 Teil Triäthylamin
(= "Redrying solution" des Picotag-
Aminosäureanalysesystems der Fa. Waters) versetzt und
nochmals kurz getrocknet. Danach wurden die Proben zur
Derivatisierung der vom C-Terminus abgespalteten
Aminosäuren mit je 20 µl des "Derivatisation Reagens"
(7 : 1 : 1 : 1=Äthanol : Wasser : Triäthylamin :
Phenylisothiocyanat; Picotag-System) versetzt, 20
Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen und dann 1
Stunde in einem Speed Vac Concentrator getrocknet.
Zur Analyse der derivatisierten Aminosäuren wurden die
Proben in 100 µl "Sample Diluent" (Picotag-System der
Fa. Waters) gelöst. Von diesen Lösungen wurden je 50 µl
mit Reverse Phase HPLC (Säule, mobile Phase und
Gradient nach Originalvorschrift des Picotag-Systems
der Fa.Waters) analysiert. Die Chromatogramme der
Proben und Reagentienblindwerte wurden mit dem
Chromatogramm eines analog derivatisierten Gemisches
(100 pMol/Aminosäure) von Standardaminosäuren
(Fa. Beckman) verglichen.
Wie aus den quantitativen Ergebnissen der Picotag-
Aminosäureanalyse (Tabelle 2) ersichtlich ist, ist
Asparagin mit hoher Wahrscheinlichkeit die C-terminale
Aminosäure von TNF-BP. Neben Asparagin konnten nach 240
Minuten Reaktionszeit auch Glutaminsäure und in
geringerer Menge Isoleucin nachgewiesen werden.
Signifikant über dem Reagentienblindwert liegende
Mengen von anderen Aminosäuren konnten auch nach 240
Minuten Reaktionszeit nicht gefunden werden. Dieses
Ergebnis (-I-E-N als C-Terminus) bestätigt die aus der
N-terminalen Sequenzierung der tryptischen Peptide 21
und 27 abgeleitete Vermutung, daß die bei diesen
Peptiden C-terminal identifizierten Aminosäuren -I-E-N
(Beispiel 1b) den C-Terminus von TNF-BP darstellen.
Um die Beschreibung der nachfolgenden Beispiele zu
vereinfachen, werden oft wiederkehrende Methoden bzw.
Bezeichnungen kurz beschrieben:
"Schneiden" oder "Verdauen" von DNA bezieht sich auf die katalytische Spaltung der DNA mittels Restriktionsendonukleasen (Restriktionsenzymen) an für diese spezifischen Stellen (Restriktionsstellen). Restriktionsendonukleasen sind käuflich erhältlich und werden unter den von den Herstellern empfohlenen Bedingungen (Puffer, Rinderserumalbumin (BSA) als Trägerprotein, Dithiothreitol (DTT) als Oxidationsschutz) eingesetzt.
Restriktionsendonukleasen werden mit einem Großbuchstaben, meist gefolgt von Kleinbuchstaben und normalerweise einer römischen Ziffer, bezeichnet. Die Buchstaben hängen von dem Mikroorganismus ab, aus dem die betreffende Restriktionsendonuklease isoliert wurde (z.B.: Sma I: Serratia marcescens) . Üblicherweise wird etwa 1 µg DNA mit einer oder mehreren Einheiten des Enzyms in etwa 20 µl Pufferlösung geschnitten. Normalerweise wird eine Inkubationsdauer von 1 Stunde bei 37°C verwendet, kann aber laut den Verwendungsvorschriften des Herstellers variiert werden. Nach dem Schneiden wird manchmal die 5′Phosphatgruppe durch Inkubation mit alkalischer Phosphatase aus Kalbsdarm (CIP) entfernt. Dies dient zur Verhinderung einer ungewünschten Reaktion der spezifischen Stelle in einer nachfolgenden Ligasereaktion (z.B. Zirkularisierung eines linearisierten Plasmids ohne Insertierung eines zweiten DNA-Fragmentes). Wenn nicht anders angegeben, werden DNA-Fragmente nach dem Schneiden mit Restriktionsendonukleasen normalerweise nicht dephosphoryliert. Reaktionsbedingungen für die Inkubation mit alkalischer Phosphatase sind z.B. dem M13 Cloning und Sequencing Handbuch (Cloning and Sequencing Handbook, Fa Amersham, PI/129/83/12) zu entnehmen.Nach der Inkubation wird Protein durch Extraktion mit Phenol und Chloroform entfernt und die DNA aus der wäßrigen Phase durch Zusatz von Äthanol präzipitiert.
"Schneiden" oder "Verdauen" von DNA bezieht sich auf die katalytische Spaltung der DNA mittels Restriktionsendonukleasen (Restriktionsenzymen) an für diese spezifischen Stellen (Restriktionsstellen). Restriktionsendonukleasen sind käuflich erhältlich und werden unter den von den Herstellern empfohlenen Bedingungen (Puffer, Rinderserumalbumin (BSA) als Trägerprotein, Dithiothreitol (DTT) als Oxidationsschutz) eingesetzt.
Restriktionsendonukleasen werden mit einem Großbuchstaben, meist gefolgt von Kleinbuchstaben und normalerweise einer römischen Ziffer, bezeichnet. Die Buchstaben hängen von dem Mikroorganismus ab, aus dem die betreffende Restriktionsendonuklease isoliert wurde (z.B.: Sma I: Serratia marcescens) . Üblicherweise wird etwa 1 µg DNA mit einer oder mehreren Einheiten des Enzyms in etwa 20 µl Pufferlösung geschnitten. Normalerweise wird eine Inkubationsdauer von 1 Stunde bei 37°C verwendet, kann aber laut den Verwendungsvorschriften des Herstellers variiert werden. Nach dem Schneiden wird manchmal die 5′Phosphatgruppe durch Inkubation mit alkalischer Phosphatase aus Kalbsdarm (CIP) entfernt. Dies dient zur Verhinderung einer ungewünschten Reaktion der spezifischen Stelle in einer nachfolgenden Ligasereaktion (z.B. Zirkularisierung eines linearisierten Plasmids ohne Insertierung eines zweiten DNA-Fragmentes). Wenn nicht anders angegeben, werden DNA-Fragmente nach dem Schneiden mit Restriktionsendonukleasen normalerweise nicht dephosphoryliert. Reaktionsbedingungen für die Inkubation mit alkalischer Phosphatase sind z.B. dem M13 Cloning und Sequencing Handbuch (Cloning and Sequencing Handbook, Fa Amersham, PI/129/83/12) zu entnehmen.Nach der Inkubation wird Protein durch Extraktion mit Phenol und Chloroform entfernt und die DNA aus der wäßrigen Phase durch Zusatz von Äthanol präzipitiert.
"Isolierung" eines bestimmten DNA Fragments bedeutet
die Auftrennung der durch den Restriktionsverdau
erhaltenen DNA-Fragmente, z.B. auf einem 1%
Agarosegel. Nach der Elektrophorese und dem
Sichtbarmachen der DNA im UV-Licht durch Anfärben mit
Äthidiumbromid (EtBr) wird das gewünschte Fragment
anhand mitaufgetragener Molekulargewichtsmarker
lokalisiert und durch weitere Elektrophorese an DE 81
Papier (Schleicher und Schüll) gebunden. Die DNA wird
durch Spülen mit Niedrigsalzpuffer (200 mM NaCl, 20 mM
Tris pH=7,5, 1 mM EDTA) gewaschen und anschließend mit
einem Hochsalzpuffer (1 M NaCl, 20 mM Tris pH=7,5, 1
mM EDTA) eluiert. Die DNA wird durch Zusatz von
Äthanol präzipitiert.
"Transformation" bedeutet das Einbringen von DNA in
einen Organismus, so daß die DNA dort replizierbar
ist, entweder extrachromosomal oder chromosomal
integriert. Transformation von E.coli folgt der im M13
Cloning and Sequencing Handbuch (Cloning and
Sequencing Handbook, Fa. Amersham, PI/129/83/12)
angegebenen Methode.
"Sequenzieren" einer DNA bedeutet die Bestimmung der
Nukleotidsequenz. Dazu wird zunächst die zu
sequenzierende DNA mit verschiedenen
Restriktionsenzymen geschnitten, und die Fragmente
werden in entsprechend geschnittene M13 mp8, mp9, mp18
oder mp19 Doppelstrang DNA eingebracht, oder es werden
die DNA mittels Ultraschall fragmentiert, die Enden
repariert und die größenselektionierten Fragmente in
Sma I geschnittene, dephosphorylierte M13 mp8 DNA
eingebracht (Shotgun Methode). Nach der Transformation
von E.coli JM 101 wird Einzelstrang DNA aus
rekombinanten M13 Phagen entsprechend dem M13 Cloning
and Sequencing manual (Cloning and Sequencing
Handbook, Fa Amersham, PI/129/53/12) isoliert und nach
der Didesoxymethode (30) sequenziert. Als Alternative
zur Verwendung des Klenowfragment der E.coli DNA
Polymerase I bietet sich dabei die T7-DNA Polymerase
an ("Sequenase, Fa. United States Biochemical
Corporation"). Die Sequenzreaktionen werden
entsprechend dem Handbuch "Sequenase: Step-by-Step
Protocols for DNA Sequencing With Sequenase"
durchgeführt.
Eine weitere Sequenziermethode besteht im Klonieren
der zu sequenzierenden DNA in einen Vektor, der unter
anderem einen Replikationsursprung eines DNA-
Einzelstrangphagen (M13, f1) trägt (z.B. Bluescribe
oder Bluescript M13 von Stratagene). Nach
Transformation von E.coli JM101 mit dem rekombinanten
Molekül können die Transformanten mit einem
Helferphagen, z. B. M13K07 oder R408 von Promega)
infiziert werden. Als Resultat erhält man eine
Mischung aus Helferphagen und verpacktem,
einzelsträngigem rekombinanten Vektor. Die
Aufarbeitung der Sequenziervorlage (Template) erfolgt
in Analogie zu der M13 Methode.
Die Auswertung der Sequenzen erfolgt mittels der
ursprünglich von R. Staden (27) entwickelten und von
Ch. Pieler (28) modifizierten Computerprogramme.
"Ligieren" bezieht sich auf den Prozeß der Bildung von
Phosphodiesterbindungen zwischen zwei Enden von
Doppelstrang-DNA Fragmenten. Üblicherweise werden
zwischen 0,02 und 0,2 µg DNA-Fragmente in 10 µl mit
etwa 5 units T4-DNA Ligase ("Ligase") in einer
geeigneten Pufferlösung ligiert (29: 474).
"Präparation" von DNA aus Transformanten bedeutet die
Isolierung der Plasmid DNA aus Bakterien mittels der
alkalischen SDS Methode, modifiziert nach Birnboim und
Doly (29: 368-369) unter Weglassen des Lysozyms. Dabei
werden die Bakterien aus 1,5 bis 50 ml Kultur
verwendet.
"Oligonukleotide" sind kurze Polydesoxynukleotide, die
chemisch synthetisiert werden. Dazu wurde der Applied
Biosystems Synthesizer Modell 381A verwendet. Die
Oligonukleotide werden entsprechend dem Modell 381A
User Manual (Applied Biosystems) aufgearbeitet.
Sequenzprimer werden ohne weitere Reinigung direkt
eingesetzt. Andere Oligonukleotide werden bis zu einer
Kettenlänge von 70 durch die "OPC"-Methode gereinigt
(OPC = Oligonucleotid purification column, Applied
Biosystems, Product Bulletin, January 1988) . Längere
Oligonukleotide werden durch
Polyacrylamidgelelectrophorese (6% Acrylamid, 0,15%
Bisacrylamid, 6 M Harnstoff, TBE-Puffer) gereinigt und
nach der Elution aus dem Gel über eine G-25
Sepharosesäule entsalzt.
Die Auswahl der Oligonukleotide wurde im Hinblick auf
deren Verwendung zur Amplifizierung von cDNA mittels
PCR getroffen:
- a) Aus der N-terminalen Aminosäuresequenz des TNF-
Bindungsproteins (Hauptsequenz, erhalten aus
Vorversuch 3 und Beispiel 1, Fraktion 1)
Asp-Ser-Val-Cys-Pro-Gln-Gly-Lys-Tyr-Ile- His-Pro-Gln-
wurde ein Heptapeptid-Bereich ausgewählt, der die niedrigste Komplexität eines gemischten Oligonukleotids zum Hybridisieren an cDNA zuläßt: Es sind dies die Aminosäuren 6 bis 12. Um die Komplexität des Mischoligonukleotids herabzusetzen, wurden vier Mischoligonukleotide mit einer Komplexität von jeweils 48 hergestellt. Die Oligonukleotide wurden in Richtung der mRNA hergestellt, sie sind somit zum 3′Ende der Sequenz orientiert und identisch mit dem nichtkodierenden Strang des TNF-BP-Gens: - b) Aus der Aminosäuresequenz eines tryptischen Peptides (Fraktion 11 des tryptischen Verdaus) der Aminosäuresequenz wurde ein Peptid-Bereich ausgewählt und ein weiterer Satz von Mischoligonukleotiden synthetisiert:
- Die Oligonukleotide wurden komplementär zur mRNA synthetisiert und sind somit zum 5′Ende der Sequenz orientiert. Um das amplifizierte DNA-Fragment im Anschluß an die PCR effizient klonieren zu können, wurde auch ein BamHI-Linker am 5′Ende der Oligonukleotide vorgesehen. Werden z.B. die Oligonukleotide TNF-BP #4/5-8 gemeinsam mit TNF-BP #3/1-4 für die PCR an der gesamten Lambda-DNA einer Bibliothek eingesetzt, kann ein etwa resultierendes DNA Fragment mit BamHI nachgeschnitten werden. Die Partner-Oligonukleotide ergeben ein gerades Ende am 5′Terminus, das Fragment kann somit in die SmaI-BamHI- Stellen eines geeigneten Vektors kloniert werden. Jedes Mischoligonukleotid TNF-BP #4/5 bis 8 ist eine Mischung aus 48 Einzelnukleotiden und berücksichtigt einige Codons nicht, und zwar:
- Bei GCT wird die Möglichkeit in Betracht gezogen, daß das zu GCC (Ala) komplementäre Triplett CGG durch Ausbildung einer G-T Brücke wirksam sein kann, bei TCG (Ser) und AAT (Asn) gilt dasselbe bezüglich AGT bzw. TTG.
- ACG, GCG und TCG sind äußerst seltene Codons (CG- Regel) und wurden deshalb nicht berücksichtigt.
Amplifizierung einer für TNF-BP kodierenden
Teilsequenz aus einer cDNA-Bibliothek.
- a) Isolierung von Lambda-DNA einer cDNA Bibliothek
Die Herstellung der cDNA Bibliothek erfolgte nach der in der EP-A1-02 93 567 für die humane plazentale cDNA Bibliothek beschriebenen Methode mit dem Unterschied, daß als Ausgangsmaterial 109 Fibrosarkomzellen der Zellinie HS 913 T, die unter Stimulierung mit humanem TNF-α (10 ng/ml) hochgezüchtet worden waren, verwendet wurden. Statt Lambda gt10 wurde Lambda gt11 verwendet (cDNA Synthese: Amersham RPN 1256; EcoRI verdaute Lambda gt11 Arme: Promega Biotech; in vitro Verpacken der ligierten DNA: Gigapack Plus, Stratagene). - 5 ml des Phagenüberstandes der amplifizierten cDNA Bibliothek der humanen Fibrosarkom Zellinie HS913T in Lambda gt11 wurden mit 0,5 µg RNase A und 0,5 µg DNase I versetzt und eine Stunde bei 37°C inkubiert. Die Mischung wurde 10 min bei 5000xg zentrifugiert, der Überstand durch Extraktion mit Phenol und Chloroform von Protein befreit und die DNA aus der wässrigen Phase durch Zusatz von Ethanol präzipitiert. Die Lambda-DNA wurde in TE-Puffer (10 mM Tris pH=7,5; 1 mM EDTA) gelöst.
- b) PCR Amplifizierung einer TNF-BP Sequenz aus einer
cDNA Bibliothek
Für die Anwendung der PCR (26) auf DNA der HS913T cDNA Bibliothek wurden 16 Einzelreaktionen durchgeführt, in welchen jeweils eines der 4 Mischoligonukleotide EBI- 1639, EBI-1640, EBI-1641, EBI-1642 als erster Primer und eines der vier Mischoligonukleotide EBI-1653, EBI- 1654, EBI-1657, EBI-1658 als zweiter Primer eingesetzt wurde. Jedes dieser Mischoligonukleotide enthält 48 verschiedene Oligonukleotide gleicher Länge. Die Amplifizierung mittels PCR fand in 50 µl Reaktionsvolumen, enthaltend 250 ng Lambda-DNA der cDNA-Bibliothek, 50 mM KC1, 10 mM Tris pH=8,3, 1,5 mM MgCl2, 0,01% Gelatine, 0,2 mM jedes der 4 desoxy- Nukleosidtriphosphate (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), je 200 pMol erster und zweiter Primer, 1,25 Einheiten Taq Polymerase (Perkin-Elmer Cetus) statt. Um ein Verdunsten zu verhindern, wurde die Lösung mit einigen Tropfen Mineralöl (0,1 ml) überschichtet. Die PCR wurde in einem DNA Thermal Cycler (Perkin Elmer Cetus) folgendermaßen durchgeführt: Die Proben wurden 5 Minuten auf 94°C erhitzt, um die DNA zu denaturieren, und anschließend 40 Amplifikationszyklen unterworfen. Ein Zyklus bestand aus 40 Sekunden Inkubation bei 94°C, 2 Minuten Inkubation bei 55°C und 3 Minuten Inkubation bei 72°C. Am Ende des letzten Zyklus wurden die Proben für weitere 7 Minuten bei 72°C inkubiert, um sicherzustellen, daß die letzte Primer-Verlängerung vollständig verläuft. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur wurden die Proben mit Phenol und Chloroform von Protein befreit und die DNA mit Äthanol präzipitiert. - 5 µl jeder der 16 PCR-Proben wurden auf ein Agarosegel aufgetragen und die Länge der amplifizierten DNA- Fragmente nach elektrophoretischer Auftrennung bestimmt. Die stärkste DNA Bande, ein Fragment von 0,16 kb Länge, war in den PCR-Proben zu sehen, die mit dem Oligonukleotid EBI-1653 als erstem Primer und einem der Oligonukleotide EBI-1639, EBI-1640, EBI-1641 oder EBI-1642 als zweitem Primer amplifiziert worden waren. Da die mit dem Primerpaar EBI-1653 und EBI-1642 amplifizierte Probe die größte Menge an diesem 0,16 kb DNA-Fragment enthielt, wurde diese Probe für die weitere Aufarbeitung ausgewählt.
Das erhaltene PCR-Produkt der Primer EBI-1642 und EBI-
1653 wurde mit BamHI geschnitten und nachfolgend
elektrophoretisch in einem Agarosegel (1,5% NuSieve
GTG Agarose plus 1% Seakem GTG Agarose, FMC
Corporation) nach der Größe aufgetrennt. Die
Hauptbande, ein DNA Fragment von 0,16 kb Länge, wurde
aus dem Gel elektroeluiert und mit Ethanol
präzipitiert. Dieses DNA Fragment wurde mit BamHI/SmaI
geschnittenem Plasmid pUC18 (Pharmacia) ligiert und E.
coli JM101 mit dem Ligationsgemisch transformiert. Die
nach der Minipräparationsmethode hergestellten
Plasmide wurden durch Schneiden mit den
Restriktionsenzymen PvuII und EcoRI-BamHI und
nachfolgender Elektrophorese in Agarosegelen
charakterisiert. Das Plasmid pUC18 enthält zwei
Schnittstellen für PvuII, die in einem 0,32 kb DNA-
Fragment die Polyklonierstelle flankieren. Sehr kurze
DNA-Inserts in der Polyklonierstelle des Plasmids
können nach Schneiden mit PvuII leichter im Agarosegel
sichtbar gemacht werden, da sich die Länge um 0,32 kb
vergrößert. Durch Schneiden mit EcoRI und BamHI kann
das in den mit BamHI und SmaI geschnittenen
Plasmidvektor ligierte DNA-Fragment inklusive einiger
Basenpaare der Polylinkersequenz erhalten werden. Ein
Klon mit dem gewünschten Insert wurde als pTNF-BP3B
bezeichnet. Das gesamte DNA-Insert dieses Klons wurde
nach Subklonieren eines EcoRI-BamHI Fragments in
M13mp18 (Pharmacia) nach der modifizierten Didesoxy
Methode mit Sequenase (United States Biochemical
Corporation) sequenziert.
Die Analyse der durch PCR-amplifizierten DNA ergab
folgende Sequenz (nur der nicht kodierende Strang ist
abgebildet, darüber die abgeleitete
Aminosäuresequenz):
Die ersten 20 und die letzten 29 Nukleotide (in
Kursivschrift) entsprechen den Sequenzen der Primer-
Oligonukleotide EBI-1642 bzw. dem Komplement von EBI-
1653. Die Aminosäuren 38 bis 43 bestätigen die
restliche Sequenz des tryptischen Peptides 11.
Weiters enthält das mittels PCR erzeugte DNA-Fragment
die Sequenz des Peptides der Fraktion 20 des
tryptischen Verdaus (Aminosäuren 20 bis 34,
unterstrichen). Damit ist erwiesen, daß der Klon pTNF-
BP3B von einer cDNA abgeleitet wurde, die für TNF-
Bindungsprotein kodiert.
pTNF-BP3B stellt damit eine Sonde, z.B. zum
Durchsuchen von cDNA-Bibliotheken nach
TNF-BP cDNAs, dar.
Ca. 720 000 Phagen der HS913T cDNA Bibliothek in
Lambda gt11 wurden auf E.coli Y1088 (ΔlacU169,
pro: Tn5, tonA2, hsdR, supE, supF, metB, trpR, F⁻,
λ⁻, (pMC9)) plattiert (ca. 60 000 Phagen pro 14,5 cm
Petrischale, LB-Agar: 10 g/l Trypton, 5 g/l
Hefeextrakt, 5 g/l NaCl, 1,5% Agar, Plattieren in Top-
Agarose: 10 g/l Trypton, 8 g/l NaCl, 0,8% Agarose).
Von jeder Platte wurden zwei Nitrozellulosefilter-
Abzüge hergestellt. Die Filter wurden vorgewaschen (16
Stunden bei 65°C) in:
50 mM Tris/HCl, pH = 8,0
1 M NaCl
1 mM EDTA
0,1% SDS
1 M NaCl
1 mM EDTA
0,1% SDS
Die Filter wurden zwei Stunden bei 65°C
prähybridisiert in:
6× SSC (0,9 M NaCl, 0,09 M tri-Nacitrat)
5× Denhardt's (0,1% Ficoll, 0,1% Polyvinylpyrrolidon, 0,1% BSA [= Rinderserumalbumin])
0,1% SDS
6× SSC (0,9 M NaCl, 0,09 M tri-Nacitrat)
5× Denhardt's (0,1% Ficoll, 0,1% Polyvinylpyrrolidon, 0,1% BSA [= Rinderserumalbumin])
0,1% SDS
pTNF-BP 3B wurde mit BamHI und EcoRI doppelt
geschnitten und das ca. 0,16 kb Insert isoliert.
0,6 µg des Inserts in 32 ml werden bei 100°C denaturiert
und mit je 60 pMol EBI-1642 und EBI-1653 durch
Abkühlen auf 80°C über 10 Minuten und jähes Abkühlen
in Eiswasser geprimt. Nach Zusatz von
10 µl α-³²P-dCTP (100 µCi, 3,7 MBq)
5 µl 10× Priming Puffer (0,1 M Tris/HCl, pH = 8,0, 50 mM mgCl₂)
2 µl je 1 mM dATP, dGTP, dTTP
1 µl PolIK (Klenow Fragment der E. coli DNA Polymerase I, 5 Einheiten)
5 µl 10× Priming Puffer (0,1 M Tris/HCl, pH = 8,0, 50 mM mgCl₂)
2 µl je 1 mM dATP, dGTP, dTTP
1 µl PolIK (Klenow Fragment der E. coli DNA Polymerase I, 5 Einheiten)
wurde 90 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Nach
Hitzeinaktivierung (10 Minuten auf 70°C) erfolgt das
Abtrennen der nichteingebauten Radioaktivität durch
Chromatographie über Biogel P6DG (Biorad) in TE Puffer
(10 mM Tris/HCl pH=8, 1 mM EDTA). Eingebaut wurden
65×106 cpm.
Das Hybridisieren der Filter erfolgte in einem
Gesamtvolumen von 80 ml 6×SSC/5X Denhardt′s/0,1% SDS
plus hitzedenaturierter Hybridisiersonde während 16
Stunden bei 65°C.
Die Filter wurden zweimal 30 Minuten bei
Raumtemperatur in 6×SSC/0,01% SDS und einmal 45
Minuten bei Raumtemperatur in 2×SSC/0,01% SDS und
dreimal 30 Minuten bei 65°C in 2×SSC/0,01% SDS
gewaschen. Die Filter wurden luftgetrocknet und
anschließend an Amersham Hyperfilm 16 Stunden unter
Verwendung einer Verstärkerfolie bei -70°C exponiert.
Insgesamt wurden 30 hybridisierende Plaques
identifiziert (Lambda-TNF-BP #1-30)
Die Regionen mit den hybridisierenden Plaques wurden
möglichst präzise ausgestochen, und die Phagen in 300
ml SM Puffer plus 301ml Chloroform eluiert.
Durch "Plaquereinigung" (Plattieren von ca. 200 Phagen
pro 9 cm Petrischale beim zweiten Durchgang, bzw. ca.
20 Phagen pro 9 cm Petrischale beim dritten Durchgang,
Filterabzüge doppelt, Vorbereiten, Hybridisieren und
Waschen wie beim erstmaligen Durchsuchen beschrieben)
wurden letztlich 25 hybridisierende Phagen vereinzelt
(Lambda-TNF-BP #1-10, 12-24, 29, 30).
Darstellung der rekombinanten Lambda-DNA von den
Klonen Lambda-TNF-BP #13, 15, 23, 30.
2×106 Phagen wurden auf E.coli Y1088 in Topagarose (10
g/l Trypton, 8 g/l NaCl, 0,8% Agarose) plattiert (14,5
cm Petrischale mit LB-Agarose (1,5% Agarose, 0,2%
Glucose, 10 mM MgSO4 10 g/l Trypton, 5 g/l
Hefeextrakt, 5 g/l NaCl) und 6 Stunden bei 37°C
inkubiert. Nach Abkühlen der Platten (30 Minuten bei
4°C) wurde mit 10 ml Lambda-Diluent (10 mM Tris/HCl
pH=8,0, 10 mM MgCl2, 0,1 mM EDTA) überschichtet und 16
Stunden bei 4°C eluiert. Der Überstand wurde in 15 ml
Corex Röhrchen transferiert und 10 Minuten bei 15 000
rpm und 4°C zentrifugiert (Beckman J2-21 Zentrifuge,
JA20 Rotor) . Der Überstand wurde in 10 ml
Polycarbonat-Röhrchen dekantiert und bei 50 000 rpm,
20°C bis ω2t=3×1010 zentrifugiert (Beckman L8-70, 50
Ti Rotor). Das Pellet wurde in 0,5 ml Lambda-Diluent
resuspendiert und in Eppendorf Röhrchen (1,4 ml)
transferiert. Nach Zusatz von 5 mg RNase A und 0,5 mg
DNaseI und Inkubation bei 37°C während 30 Minuten und
Zusatz von 25 ml 0,5 M EDTA, 12,5 ml 1 M Tris/HCl
pH=8,0, 6,5 ml 20% SDS erfolgte weitere Inkubation bei
70°C für 30 Minuten. Die Lambda DNA wurde durch
Phenol/Chloroform Extraktion gereinigt und mit Ethanol
gefällt. Abschließend wurde die DNA in 100 ml TE-
Puffer gelöst.
Um die cDNAs der Klone Lambda-TNF-BP15 und Lambda-TNF-
BP23, die bei der Hybridisierung die stärksten Signale
gezeigt hatten, näher zu charakterisieren, wurden die
cDNA-Inserts mit EcoRI aus der Lambda-DNA
herausgeschnitten, nach elektrophoretischer
Auftrennung aus einem Agarosegel eluiert und mit
Äthanol präzipitiert. Die DNA-Fragmente von 1.3 kb
(von Lambda-TNF-BP15) und 1.1 kb (von Lambda-TNF-BP23)
wurden mit EcoRI geschnittenem und mit alkalischer
Phosphatase aus Kalbsdarm dephosphoryliertem
Plasmidvektor pT7/T3α-18 (Bethesda Research
Laboratories) mit T4 DNA Ligase ligiert und E.coli
JM101 transformiert. Von einzelnen Bakterienkolonien,
die nach Selektion auf Agaroseplatten mit Ampicillin
und X-gal keine blaue Färbung aufwiesen, wurde im
Minipräparationsverfahren Plasmid-DNA hergestellt und
durch Schneiden mit EcoRI und HindIII das
Vorhandensein und die Orientierung des cDNA Inserts
festgestellt. Plasmide, die das EcoRI Insert der
Phagen Lambda-TNF-BP15 bzw. Lambda-TNF-BP23 so
orientiert enthielten, daß das dem 5′-Ende der mRNA
entsprechende Ende dem T7 Promoter zugewandt ist,
wurden pTNF-BP15 bzw. pTNF-BP23 benannt.
Die EcoRI Inserts von Lambda-TNF-BP15 und Lambda-TNF-
BP23 wurden ebenfalls in mit EcoRI geschnittenen und
dephosphorylierten M13mp19 Vektor ligiert und E.coli
JM101 transformiert. Von einigen wahllos ausgewählten
M13 Klonen wurde Einzelstrang-DNA präpariert und als
Vorlage für die Sequenzierung nach der Didesoxy-
Methode verwendet.
An M13 Klonen, die die cDNA-Inserts in
entgegengesetzter Orientierung enthielten, wurden mit
dem universellen Sequenzierprimer und spezifisch
synthetisierten Oligonukleotidprimern, die an das
cDNA-Insert binden, beide DNA-Stränge vollständig
sequenziert.
Die vollständige Nukleotidsequenz von 1334 Basen des
cDNA-Inserts von Lambda-TNF-BP15 bzw. pTNF-BP15 ist in
Fig. 1 dargestellt. Die Basen 1-6 und 1328-1334
entsprechen den EcoRI-Linkern, die bei der Herstellung
der cDNA-Bibliothek an die cDNA angefügt worden waren.
Die Nukleotidsequenz des cDNA-Inserts von Lambda-TNF-
BP23 entspricht der von Lambda-TNF-BP15 (Basen 22-1100),
flankiert von EcoRI-Linkern.
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36. Frohman, M. A., et al. 1988. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 85: 8998-9002.
Claims (30)
1. DNA, kodierend für ein Polypeptid mit der
Fähigkeit, TNF zu binden bzw. für ein
Polypeptid, von dem dieses TNF bindende Protein
eine Teilsequenz darstellt.
2. DNA nach Anspruch 1, kodierend für TNF bindendes
Protein, dadurch gekennzeichnet, daß sie die
Formel
aufweist, wobei R2 gegebenenfalls fehlt oder
eine für ein in vivo abspaltbares (Poly)peptid
kodierende DNA darstellt, einschließlich ihrer
degenerierten Varianten.
3. DNA nach Anspruch 2, kodierend für
sekretierbares TNF bindendes Protein, dadurch
gekennzeichnet, daß sie die in Anspruch 2
definierte Formel aufweist, wobei R2 eine zur
Gänze oder teilweise für eine Signalsequenz
kodierende DNA darstellt.
4. DNA nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß
R2 die Formel CTG GTC CCT CAC CTA GGG GAC AGG
GAG AAG AGA aufweist.
5. DNA Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß R2
für R3 CTG GTC CCT CAC CTA GGG GAC AGG GAG AAG
AGA steht, wobei R3 eine für ein Signalpeptid
kodierende DNA darstellt.
6. DNA nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß
R3 für
ATG GGC CTC TCC ACC GTG CCT GAC CTG CTG CTG CCA
CTG GTG CTC CTG GAG CTG TTG GTG GGA ATA TAC CCC
TCA GGG GTT ATT GGA
steht.
7. DNA nach Anspruch 1, kodierend für einen TNF-
Rezeptor bzw. einen Abschnitt davon, dadurch
gekennzeichnet, daß sie die Formel
aufweist, wobei R1 für einen DNA-Abschnitt
steht, der für die C-terminale Region der
zytoplasmatischen Domäne des TNF-Rezeptors
kodiert, bzw. daß sie den für den entsprechenden
Rezeptor-Abschnitt kodierenden Abschnitt
darstellt, einschließlich ihrer degenerierten
Varianten.
8. Nukleinsäure, dadurch gekennzeichnet, daß sie
mit der im Anspruch 7 definierten DNA unter
Bedingungen niedriger Stringenz hybridisiert.
9. Rekombinantes DNA Molekül, dadurch
gekennzeichnet, daß es mindestens eine in einem
der Ansprüche 1 bis 6 definierte DNA enthält.
10. Rekombinantes DNA Molekül, dadurch
gekennzeichnet, daß es mindestens eine in
Anspruch 1 oder 7 definierte DNA enthält.
11. Rekombinantes DNA Molekül nach Anspruch 9,
replizierbar in prokaryotischen oder
eukaryotischen Wirtsorganismen, dadurch
gekennzeichnet, daß es mit der in einem der
Ansprüche 1 bis 6 definierten DNA funktionell
verbundene Expressionskontrollsequenzen enthält.
12. Rekombinantes DNA Molekül nach Anspruch 10,
replizierbar in eukaryotischen Wirtsorganismen,
dadurch gekennzeichnet, daß es mit einer in
Anspruch 1 oder 7 definierten DNA funktionell
verbundene Expressions-Kontrollsequenzen
enthält.
13. Wirtsorganismus, dadurch gekennzeichnet, daß er
mit mindestens einem rekombinantem DNA Molekül
gemäß Anspruch 11 transformiert ist.
14. Wirtsorganismus, dadurch gekennzeichnet, daß er
mit mindestens einem rekombinantem DNA Molekül
gemäß Anspruch 12 transformiert ist.
15. Wirtsorganismus nach Anspruch 14, dadurch
gekennzeichnet, daß er eine Säugetierzelle ist.
16. Verwendung des Wirtsorganismus nach Anspruch 15
zum Untersuchen von Substanzen auf ihre
Beeinflussung der biologischen Wirkung von TNF-α
und/oder TNF-β.
17. Polypeptid, dadurch gekennzeichnet, daß es von
einer in einem der Ansprüche 1 bis 6 definierten
DNA kodiert wird.
18. Polypeptid, dadurch gekennzeichnet, daß es von
einer in Anspruch 1 oder 7 definierten DNA
kodiert wird.
19. Verwendung von Polypeptiden nach Anspruch 17
oder 18 zum Untersuchen von Substanzen auf ihre
Wechselwirkung mit TNF-α und/oder TNF-β bzw.
deren Rezeptor und/oder ihre Beeinflussung deren
biologischer Wirkung.
20. Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids nach
Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß ein
geeigneter Wirtsorganismus mit rekombinanter DNA
gemäß Anspruch 11 transformiert und gezüchtet
und das exprimierte Protein isoliert wird.
21. Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids nach
Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß ein
geeigneter Wirtsorganismus mit rekombinanter DNA
gemäß Anspruch 12 transformiert und gezüchtet
und das exprimierte Protein isoliert wird.
22. Polypeptid nach Anspruch 17 zur prophylaktischen
oder therapeutischen Behandlung des menschlichen
oder tierischen Körpers bei Indikationen, bei
denen eine schädigende Wirkung von TNF auftritt.
23. Polypeptid nach Anspruch 17 zur Behandlung von
entzündlichen Erkrankungen.
24. Polypeptid nach Anspruch 17 zur Behandlung von
infektiösen Erkrankungen.
25. Polypeptid nach Anspruch 17 zur Behandlung von
parasitären Erkrankungen.
26. Polypeptid nach Anspruch 17 zur Behandlung von
Schockzuständen.
27. Polypeptid nach Anspruch 17 zur Behandlung von
pathologischen Zuständen, die als Nebenwirkungen
bei der Therapie mit TNF-α auftreten.
28. Polypeptid nach Anspruch 17 als Diagnostikum zur
Bestimmung von TNF-α und/oder TNF-β.
29. Pharmazeutische Zubereitungen, enthaltend eine
die biologische Aktivität von TNF-α wirksam
hemmende Menge eines Polypeptids nach Anspruch
17.
30. Pharmazeutische Zubereitungen, enthaltend eine
die biologische Aktivität von TNF-β wirksam
hemmende Menge eines Polypeptids nach Anspruch
17.
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1989
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