ES2238070T3 - Receptor del tnf, proteina ligante del tnf y adn codante para estos. - Google Patents

Abstract

SECUENCIAS DE DNA QUE CODIFICAN PARA UNA PROTEINA LIGANTE DE TNF Y PARA EL RECEPTOR DE TNF, DEL CUAL ESTA PROTEINA REPRESENTA EL DOMINIO SOLUBLE. LAS SECUENCIAS DE DNA PUEDEN UTILIZARSE PARA LA PRODUCCION DE MOLECULAS DE DNA RECOMBINANTE, PARA LA PRODUCCION DE LA PROTEINA LIGANTE DEL TNF Y DEL RECEPTOR DE TNF. LA PROTEINA RECOMBINANTE LIGANTE DE TNF SE UTILIZA EN LOS PREPARADOS FARMACEUTICOS DESTINADOS AL TRATAMIENTO DE INDICACIONES EN LAS QUE SE MANIFIESTA UN EFECTO PERJUDICIAL DEL TNF. CON AYUDA DEL RECEPTOR DE TNF, O DE UN FRAGMENTO DE ESTE, O MEDIANTE LOS ORGANISMOS-HUESPED ADECUADOS TRANSFORMADOS CON MOLECULAS DE DNA RECOMBINANTE QUE CONTENGAN EL DNA QUE CODIFICA PARA LOS RECEPTORES DE TNF, O UN FRAGMENTO, O UNA MODIFICACION DE ELPUEDE SER EXAMINADO EL EFECTO DE CAMBIO QUE EJERCEN CIERTAS SUSTANCIAS CON EL RECEPTOR TNF Y/O TAMBIEN SU INFLUENCIA SOBRE EL EFECTO BIOLOGICO DEL TNF.

Description

Receptor de TNF, proteína ligante del TNF y ADN codante para estos.

La invención se refiere a un ADN, que codifica para un polipéptido con la capacidad de ligar con TNF, un ácido nucleico, una molécula de ADN recombinante, células huésped, procedimientos para la preparación de una proteína recombinante que fije TNF, un polipéptido recombinante, la utilización del polipéptido recombinante y una composición farmacéutica.

El factor de necrosis tumoral (TNF-\alpha) se halló por primera vez en el suero de ratones y cobayas que habían sido infectados con Bacillus Calmette-Guerin y a los que se había inyectado endotoxina, y que fue reconocido debido a sus propiedades citotóxicas y antitumorales (Carswell et al., 1975). Es producido principalmente por macrófagos y monolitos activados. Numerosos tipos de células que son objetivos para TNF presentaron receptores superficiales con alta afinidad para este polipéptido (Old et al., 1987); se supuso que la linfotoxina (TNF-\beta) fija con el mismo receptor (Aggarwal et al., 1985, Gullberg et al., 1978). El TNF-\alpha es idéntico a un factor designado como Cachectin (Beutler et al., 1985), que suprime la lipoproteinlipasa, y que en el caso de enfermedades inflamatorias crónicas y malignas da lugar a hipertrigliceridemia (Torti et al., 1985, Mahoney et al., 1985. El TNF-\alpha podría intervenir en la regulación del crecimiento y en la diferenciación y función de las células que juegan un papel en las inflamaciones, procesos inmunes y hematopoyesis.

El TNF puede ejercer un efecto positivo en el organismo huésped mediante la estimulación de los neutrófilos (Shalaby et al., 1985, Klebanoff et al., 1986), así como por la inhibición de la replicación de virus (Mestan et al., 1986, Wong et al., 1986). Además de esto, el TNF-\alpha activa la defensa inmune contra parásitos y actúa de forma directa y/o indirecta como mediador en reacciones inmunes, procesos inflamatorios y otros procesos en el organismo, estando todavía sin aclarar los mecanismos de actuación en numerosos casos. La administración de TNF-\alpha (Cerami et al., 988) puede sin embargo ir acompañada también de manifestaciones nocivas (Tracey et al. 1986) tales como daños por conmoción y de los tejidos, que se pueden neutralizar mediante anticuerpos contra el TNF-\alpha (Tracey et al. 1987). Una serie de observaciones permite deducir un papel del TNF-\alpha liberado endógeno en diversos estados patológicos. Así el TNF-\alpha parece ser un mediador de la caquexia, que puede surgir en el caso de enfermedades crónico-invasivas, por ejemplo parasitarias. El TNF-\alpha también parece jugar un papel importante en la patogénesis del choque causado por bacterias gram-negativas (choque de endotoxinas); podría intervenir en algunos, por no decir en todos los efectos de los lipopolisacáridos (Beuthler et al., 1988). Igualmente se ha postulado una función del TNF en los daños de tejidos que surgen dentro del marco de los procesos inflamatorios en las articulaciones y otros tejidos, así como en la letalidad y morbilidad de la reacción Graft-versus-host reaction (GVHR) (Reacción injerto versus huésped, rechazo de trasplantes) (Piguet et al., 1987)). También se informa sobre una relación entre la concentración de TNF en el suero y el resultado letal de las enfermedades por meningococos (Waage et al., 1987).

Igualmente se ha observado que la administración de TNF-\alpha a lo largo de un período de tiempo prolongado produce un estado de anorexia y consunción que presenta una sintomática semejante a la de la caquexia, que acompaña a las enfermedades neoplásticas e infecciosas (Oliff et al., 1987).

Se ha informado sobre una actividad inhibidora del TNF de una proteína procedente de la orina de pacientes febriles, cuyo efecto se supone que se debe achacar a un mecanismo competitivo al mismo nivel del receptor (semejante al efecto del inhibidor Interleukin-1 (Seckinger et al., 1987)) (Seckinger et al., 1998).

En la patente EP-A2 308 378 se describe una proteína inhibidora del TNF con un peso molecular de sólo 26 a 28 kD, que se ha obtenido de orina humana. Su efecto se demostró en la orina de personas sanas y enfermas, y se determinó debido a su capacidad para inhibir la fijación del TNF-\alpha sobre sus receptores en células HeLa humanas y fibroblastos FS 11, así como el efecto citotóxico del TNF-\alpha sobre células murinas A9. La proteína se purificó esencialmente para obtener su homogeneidad, y se caracterizó por su término N. En esta publicación de patente se exponen algunas vías básicamente posibles para obtener el ADN que codifica la proteína y la proteína recombinante; sin embargo no se ofrecen indicaciones concretas sobre cuál de las vías de solución teóricamente posibles conduce al objetivo.

En ensayos previos a la presente invención se pudo identificar también una proteína en la orina de diálisis de pacientes de uremia, que inhibe los efectos biológicos del TNF-\alpha, al impedir mediante la interacción con el TNF-\alpha su fijación a su receptor de la superficie celular (Olsson et al., 1988). De esta proteína también se comprobó su afinidad con el TNF-\beta.

La presencia de esta proteína (denominada en lo sucesivo TNF-BP) en la orina concentrada de diálisis se demostró mediante la competición con la fijación del TNF-\alpha recombinante marcado radioactivamente a un sub-clon de células HL-60, viéndose la influencia de la orina dializada sobre la fijación de 125_{I-TNF-\alpha}a las células. Los ensayos de fijación realizados mostraron una inhibición de la fijación del TNF-\alpha a la célula en función de la dosis debido a la orina de diálisis concentrada (quedó excluida la posibilidad de interpretación de que la disminución de fijación observada podría estar causada por el TNF-\alpha propiamente dicho presente en la orina o por el TNF-\beta, que compite por la fijación, por el resultado de que no se pudo suspender la disminución de fijación mediante la aplicación de anticuerpos TNF-\alpha y TNF-\beta).

De forma análoga se demostró en ensayos previos a la presente invención que el TNF-BP también presenta afinidad con el TNF-\beta, que es aproximadamente 1/50 de su afinidad con el TNF-\alpha.

Mediante cromatografía de gel sobre Sephacryl 200 se comprobó que una sustancia en la orina y el suero de pacientes de diálisis así como en el suero de personas sanas forma con el TNF-\alpha recombinante un complejo con un peso molecular de aprox. 75.000.

El TNF-BP procedente de varias muestras de orina de diálisis de pacientes de uremia se enriqueció 62 veces mediante depuración parcial por ultrafiltración a presión, cromatografía de intercambio de iones y cromatografía de gel.

Las preparaciones obtenidas se emplearon para demostrar la actividad biológica de TNF-BP mediante la inhibición del efecto inhibidor del crecimiento del TNF-\alpha en células HL-60-10. Se observó un efecto del TNF-PB dependiente de la dosis sobre el efecto biológico del TNF-\alpha. También se investigó el comportamiento de fijación de las células mediante tratamiento previo con TNF-BP y un ensayo de fijación de competición excluyente. De esta manera se demostró que el tratamiento previo de las células TNF-BP no afecta a la fijación del TNF-\alpha sobre la célula.

Esto demuestra que el efecto del TNF-BP no se basa en su eventual fijación sobre la célula y competencia con el TNF-\alpha por la fijación en el receptor.

La proteína esencialmente homogénea se obtuvo en forma altamente depurada, para lo cual se concentró la orina de pacientes de diálisis mediante ultrafiltración, se dializó la orina concentrada y se enriqueció al cuádruplo mediante cromatografía DEAE-Sephacel. El ulterior enriquecimiento se realizó mediante cromatografía de afinidad por medio del TNF-\alpha fijado a sefarosa. La depuración final se realizó mediante cromatografía de fase inversa (FPLC).

Se pudo demostrar que la proteína esencialmente sometida a alta depuración inhibe el efecto citotóxico del TNF-\alpha
sobre células WEHI 164 clon 13 (Olsson et al., 1989).

De la proteína esencialmente sometida a alta depuración se aclaró la secuencia de aminoácido N-terminal. Se determinó mediante Asp-Ser-Val-Xaa-Pro-Gln-Gly-Lys-Tyr-Ile-His-Pro-Gln- (secuencia principal) (además se demostró en las trazas la siguiente secuencia N-terminal: Leu-(Val)-(Pro)-(His)-Leu-Gly-Xaa-Arg-Glu (secuencia secundaria)). La comparación de la secuencia principal con la secuencia N-terminal de la proteína inhibidora del TNF explicada en la patente EP-A2 308 378 demuestra la identidad de la secuencia N-terminal de las dos proteínas.

Se determinó la siguiente composición del aminoácido, expresado en mol-aminoácido por mol de proteína y en mol % aminoácido, determinado como valor medio de una hidrólisis de 24 y de 48 horas:

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(Tabla pasa a página siguiente)

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Se demostró un contenido de glucosamina mediante análisis del aminoácido. Los resultados de un afinoblot realizado con Concanavalin A y lectina de germen de trigo demostraron también que el TNF-BP es una glicoproteína.

La proteína esencialmente homogénea se dirigió trípticamente y de 17 de los polipéptidos de fracción obtenidos se determinaron las secuencias de aminoácidos. Igualmente se analizó el término C.

El TNF-BP cumple aparentemente la función de un regulador de la actividad del TNF, con la facultad de compensar las variaciones de concentración del TNF-\alpha libre, biológicamente activo. El TNF-BP también podría influir en la segregación del TNF por el riñón, ya que el complejo formado con TNF, cuyo peso molecular se determinó que es aprox. 75.000, mediante cromatografía de permeación por gel sobre Sephadex G 75, evidentemente no queda retenido por el glomérulo.

El TNF-BP se demostró, en la orina de pacientes de diálisis, como uno de los tres componentes de proteína principales que presentan afinidad con el TNF y que se eluyen junto con el TNF-BP en la columna de cromatografía de afinidad del TNF. Las otras dos proteínas sin embargo fijan manifiestamente de una manera tal que no afecta a la fijación del TNF-\alpha sobre su receptor de superficie celular.

Los resultados obtenidos respecto al efecto biológico del TNF-BP, en particular la comparación de la constante de fijación con la constante de fijación descrita para el receptor TNF (Creasey et al., 1987) dieron una primera indicación de que esta proteína podría ser una parte soluble de un receptor del TNF.

Debido a su facultad de inhibir el efecto biológico del TNF-\alpha y del TNF-\beta, la proteína que fija el TNF es adecuada para ser utilizada en indicaciones donde proceda reducir la actividad del TNF en el organismo. Para su aplicación en estas indicaciones también son adecuados los derivados o fragmentos de la proteína que fija el TNF, con la facultad de inhibir el efecto biológico del TNF.

El TNF-BP (o sus derivados funcionales o fragmentos activos) se puede emplear para el tratamiento profiláctico o terapéutico del cuerpo humano animal en indicaciones en las que aparece un efecto nocivo del TNF-\alpha. Entre estas enfermedades se cuentan especialmente las enfermedades inflamatorias así como las infecciosas y parasitarias o estados de shock en los que se libera TNF-\alpha endógeno, así como la caquexia, GVHR (Graft-versus-host reaction), ARDS (Adult Respiratory Distress Symptom) y las enfermedades autoinmunes tales como la artritis reumatoide, etc. Deben entenderse como tales también los estados patológicos que pueden aparecer como efectos secundarios en la terapia con TNF-\alpha, en el caso de dosificación alta, por ejemplo hipotensión aguda o alteraciones del sistema nervioso central.

Por sus propiedades de fijación del TNF, el TNF-BP también es adecuado como elemento de diagnóstico para la determinación del TNF-\alpha y/o del TNF-\beta, por ejemplo como uno de los componentes en ensayos de radioinmunidad o ensayos de enzimoinmunidad, eventualmente junto con anticuerpos contra el TNF.

Debido a sus propiedades, esta proteína es una sustancia activa farmacológicamente valiosa, que no se puede obtener de fuentes naturales en cantidad suficiente por métodos de química de proteínas.

Por lo tanto existía la necesidad de preparar esta proteína (o proteínas afines que tengan la facultad de fijar el TNF) por una vía recombinante, para poder disponer de ello en cantidad suficiente para aplicaciones terapéuticas. Dentro del marco de la presente invención debe entenderse por "facultad de fijar el TNF", la propiedad de una proteína de fijarse de tal manera en TNF-\alpha que impida la fijación del TNF-\alpha a la parte funcional del receptor, y se inhiba o suspenda el efecto del TNF-\alpha en el organismo humano o animal. Gracias a esta definición queda incluida también la facultad de una proteína de fijarse también en otras proteínas, por ejemplo en TNF-\beta, y poder inhibir su efecto.

La presente invención se había planteado como objetivo facilitar los ADN que codifican para TNF-BP, haciendo posible sobre esta base la preparación de moléculas de ADN recombinantes, mediante las cuales se pudieran transformar organismos huésped adecuados para producir a partir de ellos TNF-BP o derivados y fragmentos funcionales de los mismos.

Dentro del marco de este planteamiento se trataba de comprobar también si el TNF-BP es la parte soluble de un receptor TNF. Esta hipótesis se confirmó, con lo cual se había creado la base para la aclaración de la secuencia receptora.

Otro planteamiento dentro del marco de la presente invención consistió en la facilitación de un ADNc que codificara para un receptor TNF, para la preparación de un receptor TNF humano recombinante.

La presencia de un receptor específico con alta afinidad con el TNF-\alpha para diversos tipos de células quedó demostrada por varios grupos de trabajo. Recientemente se ha informado por primera vez del aislamiento y caracterización provisional de un receptor TNF-\alpha (Stauber et al., 1988). Dado que la fijación del TNF-\alpha marcado radioactivamente se puede neutralizar mediante un exceso de TNF-\beta (Aggarwal et al., 1985) se ha propuesto que TNF-\alpha y TNF-\beta comparten un receptor común. Pero como por otra parte se ha podido demostrar que determinados tipos de células que reaccionan ante TNF-\alpha, son en cambio total o parcialmente insensibles frente a TNF-\beta (Locksley et al., 1987), se volvió a dudar de la existencia de un receptor común.

A diferencia de esto, los resultados obtenidos recientemente respecto a las propiedades de fijación del TNF-\beta en los receptores, han vuelto a dar fuerza a la teoría de un receptor común (Stauber et al., 1989) donde en este trabajo se propone que entre TNF-\alpha y TNF-\beta existen diferencias en cuanto a la interacción con el receptor o adicionalmente en cuanto a los acontecimientos que se producen en la célula después de la interacción entre ligando y receptor.

Recientemente se ha informado de otra proteína que fija al TNF, de la que se sospecha que se trata de la forma soluble de otro receptor TNF (Engelmann et al., 1990).

La disponibilidad de un ADN que codifique para un receptor TNF presupone la preparación de un receptor recombinante, y con ello entre otras cosas una simplificación notable para realizar investigaciones comparativas de diferentes tipos de células, en cuanto a sus reacciones provocadas sobre su(s) receptor(es) TNF-\alpha y/o TNF-\beta, o en la célula, debido a la fijación del TNF en el receptor. De esta manera se posibilita además la aclaración de la estructura tridimensional del receptor, y por lo tanto se crean las condiciones necesarias para un diseño racional para el desarrollo de agonistas y antagonistas del efecto del TNF.

Para la solución del problema planteado se ha partido de la observación de que la investigación de las bibliotecas de ADNc por medio de sondas de hibridización, que están derivadas de secuencias de aminoácidos de péptidos breves, tropieza a veces con grandes dificultades debido a la degeneración del código genético. Esta forma de proceder se ve dificultada además cuando en una proteína, como por ejemplo el TNF-BP, no se conoce en qué tejidos se sintetiza. En este caso, si falla este método, a veces no se puede determinar con certeza si se debe a la elección de una biblioteca de ADNc inadecuada o a la escasa especificidad de las sondas de hibridización.

Para obtener el ADN que codifique para TNF-BP se procedió primeramente de acuerdo con la invención en la forma siguiente:

Como biblioteca de ADNc se empleó una biblioteca de la línea de células de fibrosarcoma HS913T, que había sido inducida con TNF-\alpha, y que estaba presente en \lambda gt11. Para obtener a partir de esta biblioteca ADN de \lambda con secuencias del TNF-BP se aprovechó la alta sensibilidad de la reacción en cadena de polimerasa (PCR, (Saiki, 1988)). (Sirviéndose de este método se puede obtener de un conjunto de biblioteca ADNc una secuencia de ADN desconocida, flanqueada de oligonucleótidos, que habían sido proyectados basándose en secuencias parciales de aminoácido y que se habían empleado como cebadores. Un fragmento de ADN largo de esta clase se puede emplear a continuación como sonda de hibridización, por ejemplo para el aislamiento de clones ADNc, en particular del clon ADNc original).

Basándose en la secuencia de aminoácidos N-terminal (secuencia principal) y en las secuencias de aminoácidos de péptidos trípticos, que se habían obtenido a partir de TNF-BP altamente depurado se prepararon sondas de hibridización. Con estas sondas y mediante PCR se obtuvo de la biblioteca ADNc HS913T un ADNc, que representa una parte del ADNc codificado para TNF-BP. Este ADNc presenta la siguiente secuencia de nucleótidos:

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Este ADN representa una de las posibles variantes que son adecuadas para hibridizar con TNF-BP-ADNs o
TNF-BP-ARNs (estas variantes comprenden por ejemplo aquellas moléculas ADN que se obtienen mediante amplificación PCR sirviéndose de cebadores, cuya secuencias de nucleótidos no coincide exactamente con la secuencia buscada, eventualmente debido a interfaces de restricción previstos para fines de clonización o debido a aminoácidos que quizás no se hayan determinado unívocamente en el análisis de la secuencia de aminoácidos). Se entiende por "TNF-BP-ADNs" o "TNF-BP-ARNs", ácidos nucleicos que codifican para TNF-BP o proteínas afines con la facultad de fijar TNF, o que contengan secuencias codificadas para tal proteína.

Dentro de los TNF-BP-ADNs (o TNF-BO-ARNs) se incluyen también los ADNc derivados de ARNm, que se han formado por empalme alternativo (o bien estos mismos ARNm). Se entiende por "empalme alternativo" la eliminación de Introns, en la que por el mismo precursor ARNm se emplean diferentes puntos aceptadores de empalme y/o puntos donadores de empalme. Los ARNm formados de esta manera se diferencian entre sí por la presencia o ausencia total o parcial de determinadas secuencias exon, pudiendo producirse eventualmente un desplazamiento de la trama de lectura.

El ADNc (o sus variantes) obtenido primeramente de acuerdo con la invención y que contiene una parte de la secuencia que codifica para TNF-BP, se puede utilizar por lo tanto como sonda de hibridización para obtener a partir de las bibliotecas de ADNc unos clones ADNc que contengan TNF-BP-ADNs. También se puede emplear como sonda de hibridización para preparaciones ARNm, con el fin de aislar TNF-BP-ARNs y preparar a partir de ellos, por ejemplo, bibliotecas ADNc enriquecidas, que permiten una clasificación considerablemente más simplificada y eficaz. Otro campo de aplicación es el aislamiento de los ADNs deseados a partir de bibliotecas de ADN fenómicas, sirviéndose de estos ADNs como sondas de hibridización.

El ADN antes definido (o sus variantes) está en condiciones de hibridizar con ADNs (o ARNs) que codifiquen para TNF-BP o que contengan la secuencia que codifique para TNF-BP. Sirviéndose de este ADN como sonda se pueden obtener también ADNc que codifiquen para proteínas y cuyo procesamiento dé lugar a TNF-BP. Debe entenderse por procesamiento la disociación in vivo de secuencias parciales. Se puede tratar de modo N-terminal de la secuencia de señales y/o de otras señales y eventualmente adicionalmente de modo C-terminal de la región transmembránica y citoplasmática del receptor. Mediante esta sonda de hibridización se tiene por lo tanto la posibilidad de investigar bibliotecas ADNc adecuadas en cuanto a la presencia de ADNc que contenga la secuencia íntegra que codifique para un receptor TNF (este proceso se puede efectuar en caso de necesidad en varias fases).

De acuerdo con la invención, se empleó el ADNc de la secuencia antes definida, que se había obtenido mediante PCR a partir de la biblioteca ADNc de la línea de células fibrosarcoma inducida por TNF-\alpha HS913 T (en \lambda gt11), para la nueva investigación de la biblioteca ADNc, preparando, subclonando y secuenciando el ADN de \lambda de los clones hibridizantes. Se obtuvo un inserto de ADNc con una longitud de 1334 bases, que contiene la secuencia que codifica para TNF-BP.

Se prepararon por lo tanto en primer lugar ADNs que codificaran para un polipéptido que tuviera la facultad de fijar el TNF, o para un polipéptido del que dicha proteína que fija el TNF representa una secuencia parcial. Aquí deben incluirse también aquellos ADNs que codifiquen para partes de este polipéptido.

La secuencia completa de nucleótidos del inserto de ADNc más largo que se ha obtenido está reproducido en la figura 1.

Esta secuencia de nucleótidos presenta un marco de lectura abierto continuo que comienza por la base 213, hasta el final del inserto de ADNc con una longitud de 1334 bp. Puesto que en el mismo marco de lectura se encuentran 4 codones anteriores al potencial codón de inicio de la traslación ATG (213-215), un codón de parada (TAG), se ha supuesto que el codón inicial efectivamente es el inicio de traslación empleado in vivo.

Comparando la secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia de nucleótidos con las secuencias de aminoácidos que se habían determinado por el final aminoterminal de TNF-BP y de péptidos trípticos, se observa un alto grado de coincidencia. De ahí se deduce que el ADNc aislado contiene la secuencia que codifica para el TNF-BP auténtico.

Partiendo de N-terminus, la primera secuencia que muestra una coincidencia con una secuencia de división tríptica es la secuencia de la fracción 12 (Leu-Val-Pro-...), que se había obtenido como secuencia secundaria en el análisis del N-terminus de TNF-BP. Esta leucina N-terminal se corresponde con el 30 aminoácido de la secuencia ADNc. Dado que el tramo anterior de 29 aminoácidos presenta un carácter fuertemente hidrófogo, y puesto que TNF-BP es una proteína secretada, se puede deducir que estos 29 aminoácidos representan el péptido de señal necesario para el proceso de secreción, que se disocia durante la secreción (designado en la figura 1 por S1-S29). La secuencia de aminoácidos obtenida como secuencia principal en el análisis N-terminal de TNF-BP corresponde a los aminoácidos que comienzan por Asp-12 en la secuencia ADNc. Este resto de ácido asparagínico va directamente a continuación del dipéptido básico Lys-Arg. Puesto que después de este dipéptido se disocian en vivo numerosas proteínas por vía proteolítica cabe suponer que el TNF-BP con el Asp N-terminal no se forma directamente por procesamiento de un precursor durante el proceso de secreción sino que de la proteína procesada se disocian en un momento futuro los 11 aminoácidos N-terminales por medio de proteasas extracelulares. El extremo carboxi-terminal de TNF-BP había sido determinado mediante Ile-Glu-Asn (análisis C-terminal; polipéptido tríptico fracción 27: aminoácidos 159-172, polipéptido tríptico fracción 21: aminoácidos 165-172), donde Asn corresponde a la posición 172 en la secuencia ADNc.

En las posiciones 25-27 (Asn-Asn-Ser), 116-118 (Asn-Cys-Ser), y 122-124 (Asn-Gly-Thr) de la secuencia ADNc del TNF-BP se encuentran potenciales posiciones de N-glicosilización de la fórmula general Asn-Xaa-Ser/Thr, donde Xaa puede ser cualquier aminoácido excepto prolin. (El hecho de que Asn-25 esté glicosilizado es consecuencia de que durante la secuenciación del correspondiente péptido de disociación tríptico no se pudo identificar Asn en esta posición).

El análisis de la secuencia de nucleótidos o de la secuencia de aminoácidos derivada de aquélla, en relación con las investigaciones de química de proteínas realizadas, muestra que el TNF-BP es un polipéptido glicosilizado con 172 aminoácidos, que mediante disociación proteolítica después del 11 aminoácido se transforma en una glicoproteína con 161 aminoácidos.

La siguiente tabla muestra los péptidos trípticos secuenciados y las correspondientes secuencias de aminoácidos derivadas de la secuencia de ADN:

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El ADNc obtenido representa la condición necesaria para la preparación de TNF-BP recombinante.

El ADNc aislado en primer lugar conforme a la invención no contiene, tal como ya se ha mencionado, después del codón para Asn-172 el codón de parada que cabría esperar debido al análisis del término C, sino que se continúa el marco de lectura abierto. La región entre Val-183 y Met-204 tiene intenso carácter hidrófobo. Esta zona hidrófoba de 22 aminoácidos, seguida de un tramo con un contenido de aminoácidos con carga positiva (Arg-206, Arg-209) muestra las características típicas de un dominio de transmembrana, que ancla las proteínas en la membrana celular. En cambio la proporción de proteínas que sigue en sentido hacia el término C vuelve a ser fuertemente hidrófila.

El perfil de hidrofobicidad está representado en la figura 2 (el trazado de hidrofobicidad fue preparado sirviéndose del programa Mac Molly (Fa. Soft Gene Berlín); la amplitud de ventana para el cálculo de los valores fue de 11 aminoácidos. Las zonas hidrófobas corresponden a valores positivos en la ordenada y las zonas hidrófilas a valores negativos. Sobre la abscisa está representado el número de aminoácidos, comenzando con la metionina inicial S1).

A partir de la estructura proteica se deduce que el ADN que codifica para el TNF-BP soluble, secretado, es parte de un ADN que codifica para una proteína mayor: esta proteína presenta las características de una proteína anclada en la membrana celular, contiene TNF-BP en una forma típica para un dominio extracelular y presenta un tramo considerable típico de dominios citoplasmáticos. El TNF-BP soluble se obtiene aparentemente de esta forma fijada en la membrana mediante disociación proteolítica, escasamente fuera del dominio de transmembrana.

La estructura de la proteína codificada ADNc que se ha obtenido, en combinación con la facultad de TNF-BP de fijar TNF, confirman la hipótesis de que el TNF-BP es una parte de un receptor celular superficial para TNF, cuyo dominio extracelular responsable de la fijación de TNF se puede disociar proteolíticamente, y recuperar en forma del TNF-BP soluble. (Al mismo tiempo no se debe excluir que con vistas a la funcionalidad del receptor esta proteína eventualmente esté asociada con una o varias otras proteínas).

Con vistas a la producción de TNF-BP a gran escala no se parte preferentemente del conjunto de ADNc, porque sería necesario tener en cuenta la necesidad de disociación de TNF-BP de aquella parte de la proteína que representa la parte del receptor TNF fijado en la membrana. Tal como ya se indicó, se introduce más bien convenientemente después del codón para Asn-172 un codón de parada de traslación mediante una mutagénesis dirigida, con el fin de evitar una síntesis de proteína que rebase el final terminal C de TNF-BP.

Con el ADNc obtenido primeramente de acuerdo con la invención, que representa una secuencia parcial del ADN que codifica para un receptor TNF, se puede llegar a la secuencia receptora completa, amplificando para ello, por ejemplo, mediante PCR modificado (RACE = "rapid amplification of cDNA ends" (Frohman et al., 1988)) el extremo 3' que falta mediante un cebador que se construyó basándose en una secuencia situada lo más lejos posible en sentido hacia el extremo 3' del ADNc existente. Otro método alternativo consiste en la clasificación convencional de la biblioteca ADNc con el ADNc disponible o partes de éste, como sonda.

De acuerdo con la invención se aisló en primer lugar el ADNc receptor del TNF de ratas, mediante una secuencia parcial de éste se obtuvo el ADNc completo receptor TNF humano y se llevó a la expresión.

El objeto de la invención es un receptor TNF humano así como el ADN que codifica para ello. Dentro de esta definición se incluyen también los ADNs que codifican para formas o fragmentos, por ejemplo los diversos dominios, del receptor TNF, acortados en terminal C y/o terminal N, por ejemplo procesados o modificados (por ejemplo, mediante modificaciones en los puntos de disociación proteolítica, puntos de glicosilización o determinadas zonas de dominio). Estos ADNs se pueden emplear en combinación con las secuencias de control necesarias para la expresión, como componente de moléculas de ADN recombinantes, que también son objeto de la presente invención, para la transformación de organismos huésped procarióticos o eucarióticos. De esta manera se crea por una parte la condición necesaria para preparar el receptor TNF o las modificaciones o fragmentos del mismo, en grandes cantidades por vía recombinante, por ejemplo, para permitir la aclaración de la estructura tridimensional del receptor. Por otra parte se pueden transformar con estos ADNs células eucarióticas superiores con el fin de poder llevar a cabo estudios sobre mecanismos y sobre la dinámica de la interacción TNF/receptor, de la transmisión de señales o sobre la correspondiente relevancia de los diversos dominios receptores o tramos de los mismos.

El receptor TNF recombinante (o fragmentos o modificaciones del mismo) puede emplearse para investigar sustancias en cuanto a su interacción con el TNF o el receptor TNF, o en cuanto a su influencia sobre la transmisión de señal inducida por el TNF. Este tipo de clasificaciones (empleando proteínas / fragmentos o células eucarióticas superiores correspondientemente transformadas, crean la condición necesaria para la identificación de sustancias que sustituyen al TNF, frenan su fijación en el receptor, o aquellas que bloquean o pueden intensificar el mecanismo de la transmisión de señales provocadas por el TNF.

Una posibilidad para la localización de agonistas y antagonistas de TNF o del receptor TNF consiste en el establecimiento de una clasificación de alta capacidad. Para ello se transforma una línea de células adecuada, preferentemente una que no exprese ningún receptor TNF humano endógeno, mediante un vector que contiene el ADN que codifique un receptor TNF funcional, eventualmente modificado frente a la secuencia natural. El efecto de los agonistas o antagonistas se puede investigar en una clasificación de este tipo, siguiendo la respuesta a la interacción de la sustancia con el receptor por medio de un reportador adecuado (actividad enzimática modificada, por ejemplo proteinquinasa C o activación genética, por ejemplo manganeso-superoxidismutasa, NF-KB).

También se pueden realizar investigaciones relativas a los mecanismos y a la dinámica de la interacción TNF/ receptor, de la transmisión de señales o del correspondiente papel de los dominios receptores, por ejemplo también codificando tramos de ADN que codifiquen para los dominios extracelulares del receptor TNF (o partes del mismo), con tramos ADN que codifiquen para diversos dominios transmembránicos y/o diversos dominios citoplasmáticos, llevándolos a la expresión en células eucarióticas. Los productos de expresión híbridos que así se obtienen pueden ser adecuados para aclarar la correspondiente relevancia de los diversos dominios receptores, eventualmente basándose en propiedades alteradas para la transducción de señales, con lo cual se facilita una clasificación selectiva.

La disponibilidad de los ADNc o tramos de los mismos que codifiquen para el receptor TNF supone la condición necesaria para poder llegar al ADN genómico. Para ello se clasifica en condiciones rigurosas una biblioteca de ADN, y los clones obtenidos se analizan para comprobar si además de las regiones que se han de codificar, presentan también los elementos de secuencia reguladores necesarios para la expresión del gen (por ejemplo análisis en cuanto a función promotora mediante fusión con regiones que codifiquen genes portadores adecuados). La obtención de la secuencia ADN genómica ofrece la posibilidad de investigar las secuencias reguladoras que no estén situadas en la zona que codifique para el receptor TNF, en particular en las regiones adyacentes 5', en cuanto a una eventual interacción con sustancias conocidas que modulen la expresión genética, por ejemplo factores de transcripción, esteroides, o hallar eventualmente nuevas sustancias que posiblemente tengan un efecto específico para la expresión de este gen. Los resultados de estos análisis ofrecen la base para el empleo selectivo de tales sustancias para la modulación de la expresión receptora del TNF, y por lo tanto para influir directamente en la facultad que tiene la célula para la interacción con el TNF. Con esto se puede impedir tanto la reacción específica con el ligando como los efectos resultantes de
ello.

Dentro del marco de la presente invención se comprenden también aquellos ADNs que codifiquen para subtipos del receptor TNF o de sus formas solubles, que eventualmente presenten propiedades diferentes con respecto al receptor TNF presente. Se trata de productos de expresión que han sido formados debido a un empalme alternativo, y que presentan estructuras modificadas en zonas parciales, por ejemplo estructuras que pueden provocar una alteración de la afinidad y especificidad para el ligando (TNF-\alpha /TNF-\beta) o una alteración en cuanto a clase y eficiencia en la transmisión de señales.

Mediante el ADNc que codifica para el receptor TNF se pueden obtener ácidos nucleicos que hibridicen con el ADNc o tramos del mismo en condiciones de baja estringencia, y que codifiquen para un polipéptido que tenga la facultad de fijar en el TNF, o que contengan una secuencia que codifique para tal polipéptido.

En otro aspecto, es objeto de la invención el TNF-BP recombinante, preferentemente en forma secretable, que representa la parte soluble del receptor TNF objeto de la invención así como el ADN que codifique para ello.

Introduciendo un constructo ADN que contenga la secuencia que codifique para TNF-BP, con un secuencia que codifique para un péptido de señalización, bajo control de un promotor adecuado en organismos huéspedes adecuados, convenientemente en células eucarióticas, preferentemente células eucarióticas superiores, se puede producir TNF-BP que se secreta en el sobrante celular.

En el caso de que utilicen siempre péptidos de señalización con vistas a la secreción de la proteína se añade convenientemente delante del codón para Asp-12 el ADN que codifique para el péptido de señalización, con el fin de obtener un producto uniforme. En principio es adecuado cualquier péptido de señalización que asegure la secreción de la proteína madura en el respectivo organismo huésped. Eventualmente se puede colocar la secuencia de señalización también delante del triplete que codifica para Leu-1, donde en este caso puede ser necesario separar en una fase de depuración adicional la forma de TNF-BP que se produce por la disociación del péptido compuesto por 11 aminoácidos en el término N, del TNF-BP que no ha sido procesado o no ha sido procesado íntegramente.

Comoquiera que el ADNc siguiente al codón para Asn-172, que debido al análisis C-terminal representa el término C, no contiene ningún codón de parada, se introduce convenientemente un codón de parada de traslación mediante mutagénesis dirigida, después del codón para Asn 172, con vistas a la expresión de TNF-BP.

El ADN codificado para TNF-BP se puede modificar por mutación, transposición, supresión, adición o acortamiento, en la medida en que los ADNs modificados de esta clase codifiquen para (poli)péptidos con la facultad de fijar el TNF. Estas modificaciones pueden consistir por ejemplo en alterar algunos de los puestos de glicosilización potenciales que eventualmente no sean necesarios para la actividad biológica, sustituyendo por ejemplo el codón Asn por un triplete que codifique para otro aminoácido. Teniendo en cuenta la conservación de la actividad biológica se pueden efectuar también modificaciones que resulten en una alteración de los puentes de disulfuro (por ejemplo reducción del número de los mismos).

Las moléculas de ADN expuestas constituyen por lo tanto la condición necesaria para la construcción de moléculas de ADN recombinantes, que también son objeto de la invención. Con tales moléculas de ADN recombinantes en forma de vectores de expresión, que contengan el ADN que codifique para una proteína con actividad TNF-BP, eventualmente modificado en forma adecuada, preferentemente con una secuencia de señalización antepuesta, y las secuencias de control necesarias para la expresión de la proteína, se pueden transformar y cultivar organismos huésped adecuados y obtener la proteína.

Al igual que las eventuales modificaciones de la secuencia de ADN se efectúa la selección de los organismos huésped adecuados para la expresión, en particular con vistas al efecto biológico de la proteína, de fijar el TNF. Por lo demás, intervienen en la decisión relativa al organismo huésped los criterios usuales en la preparación de proteínas recombinantes, tales como su compatibilidad con el vector seleccionado, facultad de procesado, aislamiento de la proteína, características de expresión, aspectos de seguridad y de coste. La elección de un vector adecuado viene dada por el huésped previsto para la transformación. En principio son adecuados todos los vectores que repliquen y expresen los ADNs que conforme a la invención codifiquen para TNF-BP (o las modificaciones de éstos).

Con vistas a la actividad biológica de la proteína hay que tener en cuenta en la expresión del ADN que codifique para TNF-BP, principalmente la eventual relevancia de los criterios observados en la proteína natural, de glicosilización y alta proporción de residuos de cisteína, para la propiedad de fijar el TNF. Por ese motivo se emplean convenientemente para la expresión eucariontes, en particular sistemas de expresión adecuados de eucariontes superiores.

En el marco de la presente invención se comprobó la expresión tanto transitoria como permanente del TNF-BP en células eucarióticas.

El TNF-BP recombinante objeto de la invención así como las modificaciones adecuadas del mismo que presentan la facultad de fijar TNF, se pueden utilizar en el tratamiento profiláctico y terapéutico del cuerpo humano o animal en el caso de indicaciones en las que aparezca un efecto nocivo de TNF-\alpha.

Comoquiera que en el TNF-BP se demostró también un efecto inhibidor del TNF-\beta, éste (o los polipéptidos afines o modificados) se puede emplear también para la inhibición del efecto del TNF-\beta en el organismo, en una dosificación adecuada, eventualmente en forma modificada con vistas a una mayor afinidad con el TNF-\beta.

El objeto de la invención son por lo tanto otras preparaciones farmacéuticas que contengan una cantidad de
TNF-BP recombinante, o un polipéptido afín que tenga la facultad de fijar el TNF, que inhiba eficazmente el efecto biológico del TNF-\alpha y/o del TNF-\beta

Las preparaciones farmacéuticas se consideran especialmente para la aplicación parenteral en las indicaciones mencionadas en las que aparezca un efecto nocivo de TNF, por ejemplo en forma de liofilizados o soluciones. Éstos contienen TNF-BP o un derivado funcional con eficacia terapéutica en una cantidad terapéuticamente eficaz, eventualmente junto con sustancias adicionales fisiológicamente aceptables tales como estabilizadores, tampones, conservantes,
etc.

La dosificación depende principalmente de la indicación respectiva y de la forma específica de administración, por ejemplo si tiene lugar de forma local o sistémica. El tamaño de las dosis individuales se determina habitualmente sirviéndose de la valoración individual del caso de enfermedad, teniendo en cuenta factores tales como el estado general, la anamnesis, la edad, el peso, el sexo del paciente, etc. Lo esencial para determinar la dosis terapéuticamente eficaz es tener en cuenta la cantidad de TNF vertida, responsable de la enfermedad, así como la cantidad de
TNF-BP endógeno. Por principio se puede suponer que para el tratamiento eficaz de una enfermedad provocada por TNF se necesitará para la cantidad vertida de TNF, por lo menos la misma cantidad molar de TNF-BP, eventualmente un exceso múltiple.

En particular, el problema planteado se ha resuelto en la forma siguiente:

Del TNF-BP altamente depurado se determinaron la secuencia de aminoácidos N-terminal así como las secuencias de aminoácidos de los péptidos obtenidos por la digestión tríptica de la proteína.

Igualmente se determinó el término C mediante digestión de carboxipeptidasa P, derivatización de los aminoácidos disociados y separación cromatográfica.

A partir de las secuencias de péptidos obtenidas por digestión tríptica y con vistas a su empleo en la PCR para la preparación de oligonucleótidos, se seleccionaron por una parte zonas del término N y por otra de un péptido tríptico, de tal manera que la complejidad de los oligonucleótidos mixtos sea lo más reducida posible para la hibridización con ADNc. Basándose en estas dos zonas se prepararon sendos juegos de oligonucleótidos mixtos, donde el derivado de la zona situada en el terminal N se sintetizó de acuerdo con el ARNm, y el derivado del péptido tríptico se sintetizó complementario e inverso con respecto al ARNm. Para facilitar la subsiguiente clonación de un segmento amplificado con PCR, el juego de oligonucleótidos derivados del péptido tríptico se dotó de un punto de restricción BamHI. A continuación se aisló el ADN de \lambda de la biblioteca de ADNc de fibrosarcoma inducido por TNF-\alpha, y a partir de ahí se amplificó mediante PCR una secuencia de TNF-BP. El fragmento obtenido se clonó y secuenció; presenta 158 nucleótidos y entre los dos tramos de secuencia procedentes de los oligonucleótidos cebadores, contiene la secuencia que codifica para el péptido tríptico 20.

Este fragmento de ADN se marcó a continuación radioactivamente y se empleó como sonda para aislar los clones de ADNc de la biblioteca de fibrosarcomas. Para ello se procedió de tal manera que en primer lugar se hibridizaron placas con la sonda, se aislaron fagos de placas hibridizantes y a partir de ahí se obtuvo el ADN de \lambda. Los clones aislados de ADNc se subclonaron y secuenciaron; dos de los clones caracterizados contenían la secuencia que codificaba para TNF-BP.

Esta secuencia representa una parte de la secuencia que codifica para un receptor TNF.

Después de acortar la región 5' no codificante y de introducir un codón de parada después del codón para el aminoácido C-terminal del TNF-BP natural, se insertó el ADNc en un plásmido de expresión adecuado, se transformaron con ello las células eucarióticas y se demostró la expresión de TNF-BP mediante ELISA.

La región 3' que todavía faltaba del receptor TNF se obtuvo, investigando una biblioteca de ADNc de cerebro de rata procedente de la línea de células tumorales de ratas Glia C6 mediante una sonda de TNF-BP, y se aisló todo el ADNc que codificaba para el receptor TNF de ratas.

El tramo situado en 3' de este ADNc, del que se supuso que correspondía a la región 3' que faltaba después del interfaz EcoRI del receptor TNF humano, se empleó como sonda para investigar nuevamente la biblioteca de ADNc HS913T. Así se obtuvo un clon que contiene todo el ADN que codifica para el receptor TNF.

Después de acortar la región 5' no codificante se insertó el ADNc en un plásmido de expresión y se demostró la expresión del receptor TNF humano en células eucarióticas mediante la fijación de TNF marcado radioactivamen-
te.

Mediante un análisis Northerm Blot se confirmó que el ADNc aislado se correspondía casi con el ARNm total TNF-R (la ligera discrepancia viene dada por la falta de una parte de la región 5' que no codifica). De ahí se puede deducir que la proteína expresada es el receptor TNF íntegro.

La invención se ilustra a continuación sirviéndose de los siguientes ensayos previos y ejemplos.

Ensayo previo 1

Preparación de TNF-BP altamente depurado a) Concentración de la orina

200 l de orina de diálisis procedente de pacientes de uremia, conservado en frascos que contenían EDTA (10 g/l), Tris (6 g/l), NaN_{3} (1 g/l) y clorhidrato de benzamidina (1 g/l), y almacenados en frío, se concentraron a 4,2 l, con un contenido de proteína de 567 g, por ultrafiltración, mediante filtro hemocapilar altamente permeable con una membrana de fibra hueca asimétrica (FH 88H, Gambro). La orina concentrada se dializó frente a pH 8 contra 10 mM/l de Tris HCl. Durante este proceso se añadió, igual que en los pasos siguientes (excepto en la cromatografía de fase inversa), 1 mM/l de clorhidrato de benzamidina para contrarrestar la digestión proteolítica. Todas las fases de depuración subsiguientes se realizaron a 4ºC, salvo que se indique otra cosa.

b) Cromatografía de intercambio de iones

Esta fase se realizó cargando columnas DEAE-Sephacel (2,5 x 40 cm) con muestras de orina concentrada y dializada, conteniendo cada una aprox. 75 g de proteína. Se eluyó con 800 ml de un gradiente pH 8 de NaCl /10 mM Tris/ HCl, siendo la concentración de NaCl de 0 a 0,4 M. Las fracciones de siete columnas que contenían el TNF-BP, con un contenido total de proteína de 114 g, se almacenaron a -20ºC.

c) Cromatografía de afinidad

Para preparar la columna de sefarosa TNF se acopló TNFr-\alpha (15 mg) en 0,1 M de NaHCO_{3}, 1 M de NaCl, pH 9 (tampón de acoplamiento), con 1,5 g de sefarosa 4B (Pharmacia) activada con bromuro de cianógeno. La sefarosa se esponjó en 1 mM de HCl y se lavó con el tampón de acoplamiento. Después de añadir TNFr-\alpha se dejó girar la suspensión durante 2 horas a temperatura ambiente. El exceso de grupos CNBr se bloqueó mediante hora y media de rotación con 1M etanolamina, pH 8. La sefarosa TNF se lavó varias veces alternativamente en 1 M de NaCl, 0,1 M de acetato de sodio pH 8 y 1 M NaCl, 0,1 M de ácido bórico pH 4, y a continuación se almacenó en una solución de sal de cocina tamponada con fosfato con 1 mM de clorhidrato de benzamidina. Las fracciones obtenidas de la fase b) se ajustaron a una concentración de 0,2 M NaCl, 10 mM Tris/ HCl, pH 8. La sefarosa TNF se cargó en una columna y se lavó con 0,2 M de NaCl, 10 mM Tris/ HCl pH 8, y las fracciones que contenían TNF-BP, equivalentes aproximadamente a 30 g de proteína, se aplicaron con un caudal de 10 ml/hora y se lavaron abundantemente con 0,2 M de NaCl, 10 mM de Tris HCl, pH 8 hasta que en el eluado no se pudo determinar ya ninguna absorción a 280 nm. A continuación se eluyó el TNF-BP con 0,2 M de glicina/ HCl, pH 2,5.

Se reunieron las fracciones que contenían TNF-BP procedentes de 4 separaciones, y después de añadir polietilenglicol (MG 6000) hasta una concentración final de 10 mg/ml se liofilizaron. La muestra liofilizada se disolvió en agua destilada y se dializó frente a agua destilada. (La muestra dializada (4 ml) se almacenó en estado ultracongelado).

Esta fase de depuración produjo frente a la anterior un nuevo enriquecimiento de aproximadamente 9000 veces. El SDS-PAGE (realizado tal como se describe en el ensayo previo 2) de las fracciones que contenían TNF-BP, mostró la elución de tres componentes principales con unos pesos moleculares de 28.000, 30.000 y 50.000.

d) Cromatografía de fase inversa

Una parte alícuota (1 ml) de las fracciones obtenidas en la fase c), con un añadido de ácido trifluoracético al 0,1%, se aplicó en una columna ProRPC HR 5/10 (Pharmacia), que estaba conectada a un sistema FPLC (Pharmacia). La columna se equilibró con ácido trifuloracético al 0,1%, y se cargó a temperatura ambiente con un gradiente lineal de 15 ml de acetonitrilo al 10% volumen hasta 50% volumen, que contenía 0,1% de ácido tricloracético; el caudal fue de 0,3 ml/min. Se recogieron fracciones de 0,5 ml, y se determinó la absorción a 280 nm así como la actividad de la proteína que fija el TNF-\alpha, sirviéndose del ensayo de fijación de competición, tal como se describe en el ejemplo 1, empleando respectivamente una muestra de 0,01 \mul. El TNF-BP se eluyó como un único ciclo de actividad, correspondiente a un pico de absorción UV agudo.

Esta última fase de depuración dio lugar a un incremento de actividad específica de aproximadamente 29 veces, siendo el incremento total de actividad frente al material de partida (orina de diálisis concentrada) de aproximadamente 1,1 x 10^{6} veces.

El SDS-PAGE de la muestra reducida y no reducida, realizado tal como se describe en el ensayo previo 2, dio lugar a una banda difusa, que indicaba la presencia de un único polipéptido con un peso molecular de aprox. 30.000. La imagen de manifestación difusa de la banda puede deberse a la presencia de una o varias glicosilizaciones heterogéneas y/o de un segundo polipéptido que estuviera presente en pequeña cantidad. La hipótesis de que se pudiera tratar de un polipéptido con el término N determinado en el ensayo previo 3d como secuencia secundaria, que está prolongada en el término N frente a TNF-BP, se confirmó por la secuencia de ADNc, existiendo entre la secuencia de señalización y Asn (Pos. 12) un tramo de 11 aminoácidos, cuya secuencia coincide con la secuencia secundaria N-terminal y que aparentemente se disocia de la proteína procesada.

Ensayo previo 2

SDS-electroforesis en geles de poliacrilamida (SDS-PAGE)

Se efectuó SDA-PAGE según el método de Laemmli (Laemmli, 1970) sobre geles planos de 18 cm de longitud, 16 cm de ancho y 1,5 mm de espesor con 10 bolsas mediante una unidad de electroforesis LKB 2001.

El contenido de proteína de las muestras procedentes de las fases de depuración c) y d) (ensayo previo 1) se determinó mediante ensayo de proteína Bio-Rad, o se calculó a partir de la absorción a 280 nm, para lo cual se asignó a una absorción de 1,0 un contenido de 1 mg de TNF-BP/ ml.

Las muestras, que contenían aprox. 25 \mug de proteína (procedente del ensayo previo 1c), de aprox. 5 \mug (procedente de 1d) en forma reducida (\beta-mercaptoetanol) y no reducida, se aplicaron sobre un gel colector al 3% y un gel de poliacrilamida gradiente lineal del 5 al 20%. La electroforesis se llevó a cabo con 25 mA/gel sin refrigeración. Como marcador del peso molecular (Pharmacia) se empleó fosforilasa B (MG 94 000), albúmina de suero de ternera (MG 67 000), ovoalbúmina (MG 43 000), carboanhidrasa (MG 30 000), inhibidor de triptisina de habas de soja (MG 20 000) y a-lactoalbúmina (MG 14 400). Los geles se tiñeron con Coomassie Blue en ácido acético al 7%/ etanol al 40% y se decoloraron en ácido acético al 7%/ etanol al 25%.

El resultado de la SDS-PAGE mostró TNF-BP como cadena de polipéptidos con un peso molecular de aprox. 30.000.

Ensayo previo 3

a) Preparación de las muestras

15 \mug de la proteína depurada según el ensayo previo 1d) se desalaron mediante HPLC de fase inversa y se siguieron depurando. Para ello se empleó una columna Bakerbond WP C18 (Baker; 4,6 x 250 mm) y ácido trifluoracético al 0,1% en agua (eluyente A) o en acetonitrilo (eluyente B) como fase móvil. El incremento de gradiente fue del 20 al 68% de eluyente B en 24 minutos. La detección se efectuó en paralelo a 214 nm y a 280 nm. La fracción que contenía
TNF-BP se recogió, se secó y se disolvió en 75 \mul de ácido fórmico al 70%, y se empleó directamente para el análisis de la secuencia de aminoácidos.

b) Análisis de la secuencia de aminoácidos

El análisis automático de la secuencia de aminoácidos se realizó mediante un secuenciador de fase líquida Applied Biosystems 477 A mediante la determinación en línea de los derivados de feniltiohidantoína, mediante el Applied Biosystems Analysator, Modelo 120 A PTH. Se obtuvo la siguiente secuencia N-terminal como secuencia principal (aprox. 80% de la cantidad de proteína): Asp-Ser-Val-Xaa-Pro-Gln-Gly-Lys-Tyr-Ile-His-Pro-Gln-.

Al mismo tiempo se determinó la siguiente secuencia secundaria: Leu-(Val)-(Pro)-(His)-Leu-Gly-Xaa-Arg-Glu-. (Los aminoácidos que figuran entre paréntesis no se pudieron identificar unívocamente).

Ensayo previo 4

SDS-PAGE

La preparación de la muestra se realizó como en el ensayo previo 3, con la diferencia de que la cantidad de muestra fue de 10 \mug. La muestra se recibió en 10 \mul de agua y se dividió en 4 porciones. Una de las 4 partes alícuotas se redujo para determinar la pureza mediante SDS-PAGE por el método de Laemmli (24) con DTT (ditiotreitol) y se separó sobre mini-geles (Höfer, 55 x 80 x 0,75 mm, 15%); como marcador de peso molecular se utilizó el que se indica en el ensayo previo 8. La colocación se realizó por el método de Oakley (Oakley et al., 1986). El electroferograma está representado en la figura 9. Muestra una única banda con un peso molecular de aprox. 30.000.

Ejemplo 1 a) Tryptic Peptide Mapping

Aproximadamente 60 \mug de la proteína depurada según el ensayo previo 1d) se desalaron mediante HPLC de fase inversa, y con ello se siguieron depurando. Para ello se empleó una columna Bakerbond WP C18 (Baker; 4,6 x 250 mm) y como fase móvil ácido trifluoracético al 0,1% en agua (eluyente A), o en acetonitrilo (eluyente B). El incremento de gradiente fue del 20 al 68% de eluyente B en 24 minutos. La detección se realizó en paralelo a 214 nm y a 280 nm. La fracción que contenía TNF-BP (tiempo de retención aprox. 13,0 min) se recogió, se secó y se disolvió en 60 \mul de bicarbonato de amonio al 1%.

A esta solución se añadió un 1% w/w, equivalentes a 0,6 \mug de tripsina (Boehringer Mannheim) y se incubó la mezcla de reacción durante 7 horas a 37ºC. A continuación se volvió a añadir nuevamente un 1% de 2/2 de tripsina y se prosiguió la incubación durante la noche.

Para reducir los puentes de disulfuro a continuación se mezcló la preparación de reacción con 60 \mul de urea 6 M y con 12 \mul de ditiotreitol 0,5 M, dejando reposar durante 2 horas a temperatura ambiente.

La separación de los péptidos de disociación trípticos formados se realizó mediante HPLC de fase inversa, empleándose una columna Delta Pak C18 (Waters, 3,9 x 150 mm, diámetro de partículas 5 \mum, diámetro de poros, 100 \ring{A}) a 30ºC, y como fase móvil ácido trifluoracético al 0,1% en agua (eluyente A) o en acetonitrilo (eluyente B). El incremento de gradiente fue del 0 al 55% de eluyente B en 55 minutos, a continuación se mantuvo 55% B durante 15 minutos. El caudal fue de 1 ml/min., la detección se realizó en paralelo a 214 nm (0,5 AUFS) y 280 nm (0,05 AUFSW.

b) Análisis de la secuencia de los péptidos trípticos

Algunos de los péptidos de disociación trípticos de TNF-BP obtenidos según a) se sometieron al análisis automático de la secuencia de aminoácidos. Para ello se recogieron las correspondientes fracciones de la HPLC de fase inversa, se secaron y se disolvieron en 75 \mul de ácido fórmico al 70%. Estas soluciones se emplearon directamente para la secuenciación en un Applied Biosystems 477 A Pulsed Liquid Phase Sequenator. La Tabla 1 contiene los resultados del análisis de secuencia de los péptidos trípticos, donde los aminoácidos que figuran entre paréntesis no se pudieron demostrar con seguridad. La indicación "Xaa" indica que en este punto no se pudo identificar el aminoácido.

En la fracción 8 no se pudo identificar el aminoácido en la posición 6. La secuencia -Xaa-Asn-Ser- para la posición 6-8 hace sospechar que el aminoácido 6 está presente en forma glicosilada.

En la fracción 17 no se pudo identificar tampoco el aminoácido en la posición 6. La secuencia -Xaa-Asn-Ser- (que ya aparece en la fracción 8) para las posiciones 6 a 8 hace sospechar que el aminoácido 6 está presente en forma glicosilada. Los 13 primeros aminoácidos de la fracción 17 son en gran medida idénticos a la fracción 8; la fracción 17 podría ser por lo tanto un péptido formado por disociación tríptica incompleta.

Llama la atención la identidad de la fracción 21 con las posiciones 7 a 14 de la fracción 27. Tanto en la fracción 21 como en la fracción 27, la secuencia se interrumpe súbitamente después del aminoácido asparagina (posición 8 ó 14 respectivamente), a pesar de que aquí no se espera ninguna disociación tríptica. Esto es un indicio de que el aminoácido asparagina (posición 8 en la fracción 21 o posición 14 en la fracción 27) podría ser el aminoácido C-terminal de TNF-BP.

Llama la atención el alto grado de identidad de la secuencia de la fracción 12, que sólo aparece en pequeña cantidad, con la secuencia secundaria del término N que se determinó en el ensayo previo 10. El hecho de que las proteínas de la secuencia principal y de la secuencia secundaria no se pudieran separar en una columna HPLC de fase inversa (ensayo previo 3b) ofreció un indicio de que la proteína con la secuencia secundaria es una forma prolongada de término N del TNF-BP, que por procesamiento ha sido transformada en gran parte en la TNF-\alpha proteína con la secuencia
principal.

TABLA 1 Secuencias de aminoácidos de los péptidos trípticos de TNF-BP analizados

Fracción

\hskip1cm

Secuencia de aminoácido

1

Asp-Ser-Val-Cys-Pro-Gin-Gly-Lys

2

Xaa-Xaa-Leu-Ser-(Cys)-Ser-Lys

3

Asp-Thr-Val-(Cys)-Gly-(Cys)-Arg

4

Glu-Asn-Glu-(Cys)-Val-Ser-(Cys)-Ser-Asn-(Cys)-Lys

5

Glu-Asn-Glu-(Cys)-Val-Ser-(Cys)-(Ser)-Asn-(Cys)-Lys-(Lys)

8

Tyr-Ile-His-Pro-Gin-Xaa-Asn-Ser-Ile-Xaa-Xaa-Xaa-Lys

11

Glu-Cys-Glu-Ser-Gly-Ser-Phe-Thr-Ala-Ser–Glu-Asn-(Asn)-(Lys)

12

Leu-Val-Pro-His-Leu-Gly-Asp-Arg

13

Lys-Glu-Met-Gly-Gln-Val-Glu-Ile-Ser-Ser–(Cys)-Thr-Val-Asp-(Arg)

14/1

Gly-Thr-Tyr-Leu-Tyr-Asn-Asp-Cys-Pro-Gly-Pro-Gly-Gln-

14/II

(Glu)-Met-Gly-Gin-Val-(Glu)-(Ile)-(Ser)-Xaa-Xaa-Xaa-(Val)-(Asp)-

15

Lys-Glu-Met-Gly-Gln-Val-Glu-Ile-Ser-Ser-(Cys)-Thr-Val-Asp-Arg-Asp-Thr-Val-(Cys)-Gly-

17

Tyr-Ile-His-Pro-Gln-Xaa-Asn-Ser-Ile-(Cys)–(Cys)-Thr-Lys-(Cys)-His-Lys-Gly-Xaa-Tyr-

20

Gly-Thr-Tyr-Leu-Tyr-Asn-Asp-Cys-Pro-Gly-Pro-Gly-Gln-Asp-Thr-Xaa-Xaa-Arg

21

Leu-(Cys)-Leu-Pro-Gin-Ile-Glu-Asn

26

Gln-Asn-Thr-Val-(Cys)-Thr-Xaa-(His)-Ala-Gly-Phe-(Phe)-Leu-(Arg)

27

Ser-Leu-Glu-(Cys)-Thr-Lys-Leu-(Cys)-Leu-Pro-Gln-Ile-Glu-Asn

Ejemplo 2 Análisis del término C

Este análisis se realizó según el principio del método descrito en (Hsieng et al., 1988).

Aproximadamente 60 \mug de la proteína depurada según el ensayo previo 2d) se desalaron mediante HPLC de fase inversa, y con ello se siguieron depurando. Para ello se empleó una columna Bakerbond WP C18 (Baker; 4,6 x 250 mm) y como fase móvil ácido trifluoracético al 0,1% en agua (eluyente A) o acetonitrilo (eluyente B). El incremento de gradiente fue del 20 al 68% de eluyente B en 24 minutos. La detección se realizó en paralelo a 214 nm y a 280 nm. La fracción que contenía TNF-BP (tiempo de retención aprox. 13,0 minutos) se recogió, se secó y se disolvió en 120 \mul de acetato sódico 10 mM (ajustado a pH 4 mediante HCl 1 N).

A esta solución se añadieron 6 \mul Brij 35 (10 mg/ml en agua) así como 1,5 \mul de carboxipeptidasa P (0,1 mg/ml en agua), Boehringer Mannheim, Nº 810142). Esto equivale a una relación de pesos entre enzima y proteína de 1 a 400 (Frohman et al., 1988).

Inmediatamente después de añadir la enzima se retiró de la mezcla de reacción una muestra de 20 \mul, interrumpiendo en ella la reacción enzimática azidulando con 2 \mul de ácido trifluoracético concentrado y congelando a -20ºC.

La mezcla de reacción se dejó reposar en el frigorífico (aprox. 8ºC) y se retiraron muestras de 20 \mul cada una al cabo de 10, 20, 60 y 120 minutos. El resto de la mezcla de reacción se dejó otros 120 minutos a temperatura ambiente. Todas las muestras se acidularon inmediatamente después de la retirada mediante la adición de 2 \mul de ácido trifluroacético concentrado y se congelaron a -20ºC, con lo cual se interrumpió la reacción enzimática.

En paralelo a la preparación de muestras descrita con aproximadamente 60 \mug de TNF-BP y en condiciones idénticas se preparó un valor ciego de reactivos al que no se le había añadido proteína.

Después de la última toma de muestras se secaron todas las muestras durante 30 minutos en un Speed Vac Concentrator, se mezclaron con 10 \mul con una solución a base de 2 partes de etanol, 2 partes de agua y 1 parte de trietilamina (= "Redrying solution" del sistema de análisis de aminoácidos Picotag de la Firma Waters), y se volvieron a secar brevemente. A continuación se mezclaron las muestras para la derivatización de los aminoácidos rociados del término C con 20 \mul cada una del "Derivatisation Reagens" (7:1:1:1 = Etanol : agua : trietilamina : fenilisotiocianato; sistema Picotag), se dejaron reposar durante 20 minutos a temperatura ambiente y a continuación se secaron durante 1 hora en un Speed Vac Concentrator.

Para el análisis de los aminoácidos derivatizados se disolvieron las muestras en 100 \mul de "Sample Diluent" (Sistema Picotag de la Firma Waters).

De cada una de estas soluciones se analizaron 50 \mul mediante HPLC de fase inversa (columna, fase móvil y gradiente según instrucciones originales del sistema Picotag de la Firma Waters). Los cromatogramas de las muestras y de los valores ciegos de reactivos se compararon con el cromatograma de una mezcla derivatizada de forma análoga (100 pMol/ aminoácido) de aminoácidos estándar (Firma Beckman).

Tal como se puede ver por los resultados cuantitativos del análisis Picotag de los aminoácidos (Tabla 2), el aminoácido C-terminal de TNF-BP es con gran probabilidad la asparagina. Además de asparagina, después de 240 minutos de tiempo de reacción se pudieron demostrar también ácido glutamínico, y en menor cantidad, isoleucina. No se hallaron, incluso después de 240 minutos de tiempo de reacción, cantidades de otros aminoácidos que estuvieran de manera importante por encima del valor ciego de reactivos. Este resultado (-Ile-Glu-Asn como término C) confirma la sospecha deducida de la secuenciación N terminal de los péptidos trípticos 21 y 27, de los aminoácidos - Ile-Glu-Asn (ejemplo 1b) identificados en estos péptidos de terminal C, representan el término C de TNF-BP.

TABLA 2 Evaluación cuantitativa del análisis de aminoácido Picotag después de la reacción de la carboxipeptidasa P con TNF-BP

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5

Métodos correspondientes a los ejemplos 3 a 7

En los ejemplos siguientes y a menos que se indique expresamente otra cosa se utilizaron métodos estándar de biología molecular, que se pueden ver en los manuales correspondientes o que corresponden a las condiciones recomendadas por los fabricantes. Para simplificar la descripción de los siguientes ejemplos se describen brevemente los métodos o designaciones que se repiten con frecuencia:

"Cortar" o "digerir" el ADN se refiere a la disociación catalítica del ADN mediante endonucleasas de restricción (enzimas de restricción) en estos puntos específicos (puntos de restricción). Las endonucleasas de restricción pueden obtenerse en el comercio y se emplean en las condiciones recomendadas por los fabricantes (tampones, albúmina de suero de ternera (BSA) como proteína portadora, ditiotreita (DTT) como protección contra la oxidación). Las endonucleasas de restricción se designan por una letra mayúscula, generalmente seguida de letras minúsculas y normalmente de una cifra romana. Las letras dependen del microorganismo del cual se había aislado la endonucleasa de restricción correspondiente (por ejemplo: Sma I: Serratia marcescens). Generalmente se corta aproximadamente un microgramo de ADN con una o varias unidades de la enzima, en aproximadamente 20 \mul de solución tampón. Normalmente se emplea un tiempo de incubación de 1 hora a 37ºC, pero puede variar de acuerdo con las normas de utilización del fabricante. Después de cortar se elimina muchas veces el grupo 5' fosfato mediante incubación con fosfatasa alcalina procedente de tripa de ternera (CIP). Esto sirve para evitar una reacción indeseable en el punto específico, en una subsiguiente reacción de ligasa (por ejemplo circularización de un plásmido linealizado sin inserción de un segundo fragmento de ADN). Si no se indica otra cosa, los fragmentos de ADN normalmente no se desfosforilan después de cortar con endonucleasas de restricción. Las condiciones de reacción para la incubación con fosfatasa alcalina se pueden ver por ejemplo en el Manual M13 Cloning and Sequencing (Cloning and Sequencing Handbook, Fa. Amersham, PI/129/83/12). Después de la incubación se retira la proteína mediante extracción con fenol y cloroformo, y se precipita el ADN de la fase acuosa mediante la adición de etanol.

"Aislamiento" de un determinado fragmento de ADN significa la separación de los fragmentos de ADN obtenidos mediante la digestión de restricción, por ejemplo en un gel de agarosa al 1%. Después de la electroforesis y de hacer visible el ADN en luz UV mediante el teñido con bromuro de etidium (EtBr), se localiza el fragmento deseado mediante el marcador de peso molecular aplicado al mismo tiempo, y mediante nueva electroforesis se fija en papel DE 81 (Schleicher und Schüll). El ADN se lava enjuagando con tampón de bajo contenido salino (200 mM NaCl, 20 mM Tris pH = 7,5, 1 mM EDTA), y a continuación se eluye con un tampón de alto contenido salino (1 M NaCl, 20 mM Tris pH = 7,5, 1 mM EDTA). El ADN se precipita mediante la adición de etanol.

"Transformación" significa la introducción de ADN en un organismo, de manera que el ADN se pueda replicar allí integrándolo bien de forma extracromosomal o cromosomal. La transformación de E. coli sigue el método indicado en el Manual M13 Cloning and Sequencing (Cloning and Sequencing Handbook, Fa. Amersham, PI/129/83/12).

"Secuenciado" de un ADN significa la determinación de la secuencia de nucleótidos. Para ello se corta primeramente el ADN que se trata de secuenciar mediante diversas enzimas de restricción, y los fragmentos se introducen en ADN de doble ramal M13 mp8, mp9, mp18 ó mp19 debidamente cortado, o se fragmentan los ADN mediante ultrasonido, se reparan los extremos y se introducen los fragmentos seleccionados por tamaño en ADN M13 mp8 cortado con Sma I, desfoforilizado (Método Shotgun). Después de la transformación de E. coli JM 101 se aísla el ramal individual de ADN a partir de los fagos M13 recombinantes de acuerdo con el manual M13 Cloning and Sequencing (Cloning and Sequencing Handbook, Fa. Amersham, PI/129/83/12) y se secuencia según el método didesoxi (Sanger et al., 1977). Como alternativa al empleo del fragmento Klenow de la polimerasa I ADN E. coli sirve la polimerasa T7-ADN (``Sequenase, Fa. United States Biochemical Corporation). Las reacciones de secuencia se realizan de acuerdo con el manual "Sequenase: Step-by-Step Protocols for DNA Sequencing With Sequenase" (Versión 2.0).

Otro método de secuenciación consiste en clonar los ADN que se trata de secuenciar en un vector que lleva entre otros un origen de replicación de un fago de ramal individual ADN (M13, f1) (por ejemplo Bluescribe o Bluescript M13 de Stratagene). Después de la transformación de E. coli JM101 con la molécula recombinante se pueden infectar los transformandos con un fago auxiliar, por ejemplo M13K07 ó R408 de Promega). Como resultado se obtiene una mezcla de fagos auxiliares y del vector recombinante empaquetado de un solo ramal. La preparación de la plantilla de secuenciado (Template) se realiza de forma análoga al método M13. El plásmido ADN de doble ramal se desnaturalizó de acuerdo con el manual de secuenciación antes indicado, por tratamiento alcalino y se secuenció directa-
mente.

La evaluación de las secuencias se realizó mediante los programas informáticos desarrollados originalmente por R. Staden (Staden et al., 1982) y modificados por Ch. Pieler (Pieler, et al., 1987).

"Ligar" se refiere al proceso de formación de ligamentos de fosfodiéster entre dos extremos de fragmentos de ADN de doble ramal. Generalmente se ligan fragmentos de ADN de 0,02 y 0,2 \mug en 10 \mul con unas 5 unidades de T4-ADN ligasa ("ligasa") en una solución tampón adecuada (Maniatis et al., 1982).

La "preparación" de ADN a partir de transformandos significa el aislamiento del plásmido ADN a partir de bacterias mediante el método alcalino SDS, modificado según Birnboim y Doly, omitiendo la lisozima. Para esto se emplean las bacterias de un cultivo de 1,5 a 50 ml.

Los "oligonucleótidos" son polidesoxinucleótidos cortos que se sintetizan químicamente. Para ello se utilizó el Applied Biosystems Synthesizer Modelo 381A. Los oligonucleótidos se preparan de acuerdo con el modelo 381A User Manual (Applied Biosystems). Los cebadores de secuencia se emplean directamente sin más depuración. Otros oligonucleótidos se depuran hasta una longitud de cadena de 70 mediante el método "OPC" (OPC = Oligonucleotid purification volumn, Applied Biosystems. Product Bulletin, Enero 1988). Los oligonucleótidos más largos se depuran por electroforesis en geles de poliacrilamida (6% acrilamida, 0,15% bisacrilamida, 6 M urea, tampón TBE), y después de eluirlos del gel se desalinizan a través de una columna de sefarosa G-25.

Ejemplo 3 Preparación de sondas de hibridización específicas de TNF-BP

La elección de los oligonucleótidos se tomó con vistas a su utilización para la amplificación de ADNc mediante PCR:

a)

A partir de la secuencia N-terminal de aminoácido de la proteína de fijación TNF (secuencia principal, obtenida del ensayo previo 3 y del ejemplo 1, fracción 1)

Asp-Ser-Val-Cys-Pro-Gln-Gly-Lys-Tyr-Ile-His-Pro-Gln-

se eligió un sector de heptapéptido que permite la más baja complejidad de un oligonucleótido mixto para la hibridización en ADNc: Se trata de los aminoácidos 6 al 12. Para reducir la complejidad del oligonucleótido mixto se prepararon cuatro oligonucleótidos mixtos con una complejidad de 48 cada uno. Los oligonucleótidos se prepararon en el sentido del ARNm, y por lo tanto están orientados hacia el extremo 3' de la secuencia, y son idénticos al ramal no codificante del gen TNF-BP:

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6

7

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b)

A partir de la secuencia de aminoácidos de un péptido tríptico (fracción 11 de la digestión tríptica) de la secuencia de aminoácidos

Glu-Cys-Glu-Ser-Gly-Ser-Phe-Thr-Ala-Ser-(Glu/Cys)-Asn-Asn-Lys \hskip1cm (véase el ejemplo 1)

se eligió un sector de péptido y se sintetizó otro conjunto de oligonucleótidos mixtos:

8

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Los oligonucleótidos se sintetizaron complementarios al ARNm y están por lo tanto orientados hacia el extremo 5' de la secuencia. Para poder clonar eficazmente el fragmento de ADN amplificado a continuación de la PCR se ha previsto también un BamHI-Linker en el extremo 5' de los oligonucleótidos. Si se emplean por ejemplo los oligonucleótidos TNF-BP-#4/5-8 conjuntamente con TNF-BP #3/1-4 para la PCR en todo el ADN de \lambda de una biblioteca, se puede forzar posteriormente con BamHI algún fragmento de ADN que quizá resulte. Los oligonucleótidos compañeros dan lugar a un extremo recto en el término 5', y por lo tanto se puede clonar el fragmento en los puntos SmaI-BamHI de un vector adecuado.

Cada oligonucleótido mixto TNF-BP #r/5 al 8 es una mezcla de 48 oligonucleótidos individuales, y no tiene en cuenta algunos codones, concretamente:

Thr \hskip0,5cm ACG

Ala \hskip0,5cm GCG y GCT

Ser \hskip0,5cm TCG y TCC

Asn \hskip0,5cm AAT

En GCT se tiene en cuenta la posibilidad de que el triplete GCC complementario de GCC (Ala) podría ser eficaz mediante la formación de un puente G-T, y en el caso de TCG (Ser) y AAT (Asn) se aplica lo mismo en cuanto a AGT o TTG respectivamente.

ACG, GCG y TCG son codones sumamente raros (Regla CG) y por lo tanto no se han tenido en cuenta.

Ejemplo 4 Amplificación de una secuencia parcial que codifica para TNF-BP a partir de una biblioteca ADNc a) Aislamiento de ADN de \lambda de una biblioteca ADNc

La preparación de la biblioteca ADNc se efectuó de acuerdo con el método descrito en la patente EP-A1-0293 567 para una biblioteca ADNc placental humana, con la diferencia de que como material de partida se emplearon 10^{9} células de fibrosarcoma, de la línea celular HS 913 T, que habían sido cultivadas bajo estimulación con TNF-\alpha humano (10 ng/ml). En lugar de \lambda gt10 se empleó \lambda gt11 (síntesis de ADNc: Amersham RPN 1256; brazos \lambda gt11 digeridos EcoRI: Promega Biotech; envasado in vitro del ADN ligado: Gigapack Plus, Stratagene).

5 ml del sobrante de fagos de la biblioteca ADNc amplificada de la línea celular HS913T en \lambda gt11 se mezclaron con 0,5 \mug RNase A y 0,5 \mug DNase I y se incubaron durante 1 hora a 37ºC. La mezcla se centrifugó durante 10 minutos a 5000xg, el sobrante se liberó de proteína mediante extracción de fenol y cloroformo, y se precipitó el ADN de la fase acuosa mediante la adición de etanol. El ADN de \lambda se disolvió en tampón TE (10 mM Tris pH = 7,5; 1 mM EDTA).

b) Amplificación PCR de una secuencia TNF-BP procedente de una biblioteca ADNc

Para la aplicación de la PCR (Saiki et al., 1988) al ADN de la biblioteca ADNc HS913T se realizaron 16 reacciones individuales, en las cuales se emplearon en cada caso uno de los 4 oligonucleótidos mixtos EBI-1639, EBI-1640,
EBI-1641, EBI-1642 como primer cebador, y uno de los cuatro oligonucleótidos mixtos EBI-1653, EBI-1654,
EBI-1657, EBI-1658 como segundo cebador. Cada uno de estos oligonucleótidos mixtos contiene 48 oligonucleótidos diferentes de igual longitud.

La amplificación mediante PCR tuvo lugar en 50 \mul de volumen de reacción, que contenían 250 ng ADN de \lambda de la biblioteca ADNc, 50 mM KCl, 10 mM Tris pH = 8,3, 1,5 mM MgCl_{2}, 0,01% de gelatina, 0,2 mM de cada uno de los 4 desoxi-trifosfatonucleósidos (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), 200 pMol de cada uno de los primeros y segundos cebadores, 1,25 unidades Taq polimerasa [Perkin-Elmer Cetus]. Para evitar la evaporación la solución se recubrió con unas gotas de aceite mineral (0,1 ml). La PCR se realizó en un DNA Thermal Cycler (Perkin Elmer Cetus) de la siguiente manera: Las muestras se calentaron durante 5 minutos a 94ºC para desnaturalizar el ADN, y a continuación se sometieron a 40 ciclos de amplificación. Un ciclo se componía de 40 segundos de incubación a 94ºC, 2 minutos de incubación a 55ºC y 3 minutos de incubación a 72ºC. Al final del último ciclo se incubaron las muestras durante otros 7 minutos a 72ºC para asegurarse de que la última prolongación de cebador tiene lugar íntegramente. Después de enfriar a temperatura ambiente se liberan las muestran de proteína mediante fenol y cloroformo y se precipita el ADN con etanol.

Se aplicaron 5 \mul de cada una de las 16 muestras de PCR sobre un gel de agarosa y se determinó la longitud de los fragmentos ADN amplificados después de la separación electroforética. La banda ADN más intensa, un fragmento de 0,16 kb de longitud, se pudo observar en las muestras de PCR que habían sido amplificadas con el oligonucleótido EBI-1653 como primer cebador y uno de los oligonucleótidos EBI-1639, EBI-1640, EBI-1641 ó EBI-1642, como segundo cebador. Dado que la muestra amplificada con la pareja de cebadores EBI-1653, EBI-1642 contenía la mayor cantidad de este fragmento de ADN de 0,16 kb, se seleccionó esta muestra para el ulterior tratamiento.

Ejemplo 5 Clonación y secuenciación de un fragmento de ADN obtenido por amplificación PCR

El producto PCR obtenido de los cebadores EBI-1642 y EBI-1653 se cortó con BamHI y a continuación se separó por tamaño por electroforesis en un gel de agarosa (1,5% NuSieve GTG Agarose plus 1% Seakem GTG Agarose, FMC Corporation). La banda principal, un fragmento de ADN de 0,16 kb de longitud, se electroeluyó del gel y se precipitó con etanol. Este fragmento de ADN se ligó con plásmido pUC18 (Pharmacia) cortado con BamHI/SmaI, y se transformó E. coli JM101 con la mezcla de unión. Los plásmidos preparados según el método de minipreparación se caracterizaron cortándolos con las enzimas de restricción PvuII y EcoRI-BamHI y subsiguiente electroforesis en geles de agarosa. El plásmido pUC18 contiene dos interfaces para PvuII, que flanquean el punto de policlonización en un fragmento de ADN de 0,32 kb. Los insertos de ADN muy cortos en el punto de policlonización del plásmido se pueden hacer visibles más fácilmente en el gel de agarosa después de cortar con PvuII, ya que su longitud se incrementa en 0,32 kb. Cortando con EcoRI y BamHI se puede obtener el fragmento de ADN ligado en el vector de plásmido cortado con BamHI y SmaI, inclusive de algunas parejas de gases de la secuencia de polienlaces. Un clon con el inserto deseado se designó como pTNF-BP3B. El inserto de ADN completo de este clon se secuenció después de subclonar un fragmento EcoRI-BamHI en M13mp18 (Pharmacia) de acuerdo con el método didesoxi modificado mediante Sequenase (United States Biochemical Corporation.

En el análisis del ADN amplificado mediante PCR dio la siguiente secuencia (está reproducido únicamente el ramal que no codifica, encima la secuencia de aminoácido derivada):

9

10

Los primeros 20 y los últimos 29 nucleótidos (que figuran en cursiva) corresponden a las secuencias de los oligonucleótidos cebadores EBI-1642 o al complemento de EBI-1653, respectivamente. Los aminoácidos 38 al 43 confirman la secuencia restante del péptido tríptico 11.

El fragmento de ADN producido mediante PCR contiene además la secuencia del péptido de la fracción 20 de la digestión tríptica (aminoácidos 20 al 34, subrayados). De esta manera queda demostrado que el clon pTNF-BP3B fue derivado de un ADNc que codifica para la proteína de fijación TNF.

Por lo tanto pTNF-BP3B representa una sonda, por ejemplo para investigar bibliotecas de ADNc buscando ADNc TNF-BP.

Ejemplo 6 Aislamiento de clones ADNc TNF-BP

Aproximadamente 720.000 fagos de la biblioteca ADNc HS913T en \lambda gt11 se placaron sobre E. coli Y1088 (\Delta lacU169, pro: Tn5, tonA2, hsdR, supE, supF, metB, trpR, F-, \lambda-, (pMC9)) (aprox. 60.000 fagos por cápsula de Petri de 14,5 cm, LB-Agar: 10 g/l Trypton, 5 g/l extracto de levadura, 5 g/l NaCl, 1,5% agar, placado en Top-agarosa: 10 g/l de Trypton, 8 g/l NaCl, 0,8% (agarosa). De cada placa se prepararon dos pruebas de filtro de nitrocelulosa. Los filtros se sometieron a un lavado previo (16 horas a 65ºC) en:

50 mM \hskip0,8cm Tris/HCl pH = 8,0

1 M NaCl

1 mM EDTA

0,1% SDS

Los filtros se prehibridizaron durante 2 horas a 65ºC en:

6 x \hskip0,3cm SSC (0,9 M NaCl, 0,09 M tri-Na-citrato)

5 x \hskip0,3cm Denhardt's (0,1% Ficoll, 0,1% polivinilpirrolidona, 0,1% BSA (= Albúmina de suero de ternera))

0,1% SDS

Preparación de la sonda marcada radioactivamente

pTNF-BP 3B se cortó doble con BamHI y EcoRI, y se aisló el inserto de aprox. 0,16 kb. 0,6 \mug del inserto en 32 \mul se desnaturalizan a 100ºC y se imprimen cada uno con 60 pMol EBI-1642 y EBI-1653, enfriando a 80ºC durante 10 minutos y enfriando bruscamente en agua helada. Después de añadir

10 \mul \alpha-32p-dCTP (100 \muCi, 3,7 MBq)

5 \mul 10x tampón de cebado (0,1 M Tris/HCl pH = 8,0, 50 mM MgCl_{2})

2 \mul de 1mM de cada dATP, dGTP y dTTP

1 \mul PolIK (fragmento Klenow de la polimerasa I ADN E. coli, 5 unidades)

se incubaron durante 90 minutos a temperatura ambiente. Después de la inactivación por calor (10 minutos a 70ºC) se efectuó la separación de la radioactividad no instalada mediante cromatografía sobre Biogel P6DG (Biorad) en tampón TE (10 mM Tris/HCl pH = 8, 1 mM EDTA). Se instalaron 65 x 10^{6} cpm.

La hibridización de los filtros se efectuó en un volumen total de 80 ml 6 x SSC/ 5X Denhardt's /0,1% SDS más sonda de hibridización desnaturalizada por calor durante 16 horas a 65ºC.

Los filtros se lavaron dos veces durante 30 minutos a temperatura ambiente en 6 x SSC/ 0,01% SDS y una vez durante 45 minutos a temperatura ambiente en 2 x SSC/ 0,01% SDS, y tres veces durante 30 minutos a 65ºC en 2 x SSC/ 0,01% SDS. Los filtros se secaron al aire y a continuación se expusieron en Amersham Hyperfilm durante 16 horas, utilizando una lámina amplificadora, a -70ºC. En total se identificaron 30 placas hibridizantes (\lambda-TNF-BP #
1-30).

Las regiones con las placas a hibridizar se recortaron con la mayor precisión posible, y los fagos se eluyeron en 300 \mul de tampón SM + 30 \mul de cloroformo.

Mediante "limpieza de placas" (placado de aprox. 200 fagos por cápsula de Petri de 9 cm en la segunda pasada, o aprox. 20 fagos por cápsula de Petri de 9 cm en la tercera pasada, pruebas de filtros dobles, preparación, hibridización y lavado tal como se ha descrito en la primera investigación), se aislaron por último 25 fagos hibridizantes (\lambda-TNF-BP
#1-10, 12-24, 29,30).

Representación del ADN de \lambda recombinante de los clones \lambda-TNF-BP #13, 15, 23, 30

Se placaron 2 x 10^{6} fagos sobre E. coli Y1088 en topagarosa (10 g/l Trypton, 8 g/l NaCl, 0,8% agarosa) (cápsula de Petri de 14,5 cm con LB-agarosa (1,5% agarosa, 0,2% glucosa, 10 mM MgSO_{4}, 10 g/l Trypton, 5 g/l extracto de levadura, 5 g/l NaCl)) y se incubaron durante 6 horas a 37ºC. Después de enfriar las placas (30 minutos a 4ºC) se recubrió con 10 ml de \lambda-diluyente (10 mM Tris/ HCl pH = 8,0, 10 mM MgCl_{2}, 0,1 mM EDTA, y se eluyeron durante 16 horas a 4ºC. El sobrenadante se transfirió a tubitos Corex de 5 ml y se centrifugó durante 10 minutos a 15.000 rpm y 4ºC (centrifugadora Beckman J2-21, rotor JA20). El sobrenadante se decantó en tubitos de policarbonato de 10 ml y se centrifugó a 50.000 rpm, 20ºC hasta \omega^{2}t = 3 x 10^{10} (Beckman L8-70, 50 Ti Rotor). El pellet se resuspendió en 0,5 ml de diluyente \lambda y se transfirió a tubitos Eppendorf (1,5 ml). Después de añadir 5 \mug de RNase A y 0,5 \mug de DNaseI y de incubar a 37ºC durante 30 minutos, y añadir 25 \mul de EDTA 0,5 M EDTA, 12,5 \mul Tris 1 M /HCl, pH = 8,0, 6,5 \mul 20% SDS, se procedió a otra incubación a 70ºC durante 30 minutos. El ADN de \lambda se depuró mediante extracción con fenol/cloroformo y se precipitó con etanol. Por último se disolvió el ADN en 100 \mul de tampón TE.

Ejemplo 7 Subclonación y secuenciación del ADNc TNF-BP de los clones 15 y 23

Para caracterizar con mayor detalle los ADNc de los clones \lambdaTNF-BP15 y \lambdaTNF-BP23, que son los que durante la hibridización mostraron las señales más intensas, se recortaron los insertos de ADNc del ADN de \lambda mediante EcoRI, se eluyeron a partir de un gel de agarosa después de la separación electrolítica y se precipitaron con etanol. Los fragmentos de ADN de 1,3 kb (de \lambdaTNF-BP15) y 1,1 kb (de \lambdaTNF-BP23) se ligaron con vector plásmido pT7/T3\alpha-18
(Bethesda Research Laboratories) cortado con E. coli y desfosforizado con fosfatasa alcalina de tripa de ternera, con ligasa ADN T4 y transformados con E. coli JM 101. De colonias particulares de bacterias que después de la selección sobre placas de agarosa con ampicilina y X-gal no mostraron coloración azul se preparó ADN plásmido en un procedimiento de minipreparación, y cortando con EcoRI y HindIII se determinó la presencia y orientación del inserto de ADN. Los plásmidos que contenían el inserto EcoRI de los fagos \lambdaTNF-BP15 o \lambdaTNF-BP23 respectivamente, orientado de tal manera que el extremo correspondiente al extremo 5' del ARNm estuviera orientado hacia el promotor T7, se denominaron pTNF-BP15 o pTNF-BP23 respectivamente. Los insertos EcoRI de \lambdaTNF-BP15 y \lambdaTNF-BP23 también se ligaron con vector M13mp19 cortado y desfosforilado con E. coli y transformados con E. coli JM101. De algunos clones M13 elegidos al azar se prepararon ADNs de ramal singular, y se utilizaron como plantilla para la secuenciación por el método didesoxi.

En los clones M13 que contenían los insertos de ADNc con orientación opuesta, se secuenciaron íntegramente ambos ramales ADN con el cebador de secuenciación universal y con cebadores de oligonucleótidos sintetizados específicamente, que ligan con el inserto de ADNc.

En la figura 1 está representada la secuencia completa de nucleótidos de 1334 bases del inserto de ADNc de
\lambdaTNF-BP15 o pTNF-BP15 respectivamente. Las bases 1-6 y 1328-1334 corresponden a los enlaces EcoRI que se añadieron al ADNc durante la preparación de la biblioteca ADNc. La secuencia de nucleótidos del inserto de ADNc de \lambdaTNF-BP23 se corresponde con la de \lambdaTNF-BP15 (bases 22-1100), flanqueada de enlaces EcoRI.

Igualmente se investigó el clon \lambdaTNF-BP30; su secuencia se corresponde con la de \lambdaTNF-BP15, con la diferencia de que la secuencia presenta una supresión de 74 bp (nucleótidos 764 al 837).

Ejemplo 8 Construcción de los plásmidos de expresión pAD-CMV1 y pAD-CMV2

Con partes de los plásmidos de expresión pCDM8 (Seed y Aruffo 1987, Seed, 1987; Invitrogen), pSV2gptDHFR20 (EP-A1 0321 842) y del plásmido Bluescript SK+ (Short et al., 1988, Stratagene) se construyó un nuevo plásmido que presenta un punto de multiclonación para la inserción orientada de secuencias de ADN heterólogas, y que se puede multiplicar con gran número de copias en E. coli mediante resistencia a la ampicilina. La región intergénica de M13 permite la preparación de plásmido ADN de ramal singular mediante superinfección de las bacterias transformadas por medio de un fago auxiliar (por ejemplo R408 ó M13K07), para facilitar la secuenciación y mutagénesis del plásmido-ADN. El promotor T7 que precede al punto de multiclonación permite la preparación de transcriptos de ARN in vitro. En células de mamíferos tiene lugar la expresión de los genes heterólogos impulsada por el citomegalovirus (CMV) promotor/ intensificador (Boshart et al., 1985). El origen de replicación SV40 permite efectuar, en la línea de células adecuadas (por ejemplo células transformadas SV40 tal como COS-7, líneas de células transformadas adenovirus 293 (ATCC CRL1573) la replicación autónoma del plásmido de expresión en un gran número de copias, y por lo tanto altas velocidades de expresión transitoria. Para la preparación de líneas de células transformadas permanentemente y la subsiguiente amplificación de la cassette de expresión mediante Methotrexat sirve un minigen de hámster modificado (promotor con zona codificante del primer Intrón) para dihidrofolatoreductasa (DHFR) como marcador de
selección.

a) Preparación de las proporciones de vector y de promotor mediante PCR

El plásmido Bluescript SK+ se linealizó mediante HindIII, y se emplearon 5 ng de ADN en una preparación PCR de 100 \mul (tampón de reacción: 50 mM KCl, 10 mM Tris-Cl pH = 8,3, 1,5 mM MgCl_{2}, 0,01% (peso/volumen) de gelatina, 0,2 mM de los cuatro desoxinucleótidos trifosfatos (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), 2,5 unidades de polimerasa Taq por 100 \mul). Como cebadores se emplearon en cada caso 50 pmol de los oligonucleótidos sintéticos, EBI-1786
(5'-GGAATTCAGCCTGAA-TGGCGAATGGG-3'; fija escasamente fuera de la región M13 ori en Bluescript Pos. 475, con independencia de la orientación de M13 ori) y EBI-1729 (5'-CCTCGAGCGTTGCTGGCGTTTTTCC-3'); fija en Bluescript en Pos. 1195 antes de ori, equivale al inicio de la secuencia Bluescript en pCDM8, 6 bases 5' dan lugar a XhoI). Después de 5 minutos de desnaturalización a 94ºC se efectuó la PCR a lo largo de 20 ciclos (40 segundos a 94ºC, 45 segundos a 55ºC, 5 minutos a 72ºC, Perkin Elmer Cetus Thermal Cycler). Los oligonucleótidos flanquean la región intergénica de M13 o el origen de replicación (ori) con el gen situado entre medias para la \beta-lactamasa. Al mismo tiempo se produce en el extremo del origen de replicación un interfaz XhoI y en el otro extremo un interfaz EcoRI. La mezcla de reacción se liberó de proteína mediante extracción con fenol-cloroformo, y se precipitó el ADN con etanol. El ADN obtenido se cortó con XhoI y EcoRI, y después de electroforesis en un gel de agarosa se aisló un fragmento con 2,3 kb.

5 ng del plásmido pCDM8 linealizado mediante SacII se amplificaron mediante PCR en idénticas condiciones a las descritas para Bluescriipt +, con los oligonucleótidos EBI-1733 (5'-GGTCGACATTGATTATTGACTAG-3'; fija en la región promotora CMV (Pos. 1542) de pCDM8, equivale a la Pos. 1 en pAD-CMV, punto SalI para la clonación) y EBI-1734 (5'-GGAATTCCCTAG-GAATACAGCGG-3'; fija en polioma origen de 3'SV40 región polyA en pCDM8 (Pos. 3590)). Los oligonucleótidos fijan al comienzo de la secuencia promotora intensifica/CMV y generan un interfaz SalI (EBI-1733) o fijan al final de la posición de poli-adenilización SV40, y generan un interfaz EcoRI (EBI-1734). El producto PCR se cortó con SalI y EcoRI, y de un gel de agarosa se aisló un fragmento de ADN de 1,8 kb.

Los dos productos PCR se ligaron con ligasa ADN T4, se transformaron con el producto de ligazón E. coli HB101 obtenido y se amplificó y preparó plásmido ADN siguiendo métodos estándar. El plásmido de la composición deseada (véase la figura 3) se denominó pCMV-M13.

El origen de replicación SV40 (SV40 ori) se aisló del plásmido pSV2gptDHFR20 (Patente EP-A1 0321842). Para ello se cortó dos veces este plásmido con HindIII y PvuII, y los extremos del ADN se dejaron romos mediante el subsiguiente tratamiento con el fragmento grande de la polimerasa ADN E. coli (enzima de Klenow) en presencia de los cuatro desoxinucleótidotrifosfatos. Un fragmento de ADN de 0,36 kb obtenido de esta manera se aisló a partir de un gel de agarosa y se ligó en CMV-M13 linealizado mediante EcoRI. Un plásmido, obtenido después de la transformación de E. coli HB101 con el SV40 ori en la misma orientación que el gen \beta-lactamasa y el promotor CMV, se denominó pCMV-SV40. La estructura de este plásmido está representado en la figura 3.

b) Mutagénesis del gen DHFR

Para la preparación de un plásmido de expresión con un punto de clonación múltiple polifacético se retiraron del minigen DHFR y mediante mutagénesis dirigida dos interfaces de enzima de restricción, y por supresión tres interfaces de enzima de restricción. Para ello se clonó en el punto BglII del plásmido pUC219 (IBI) un fragmento BglII de 1,7 kb del plásmido pSV2gptDHFR20, que contiene toda la región codificante del gen DHFR de hámster, obteniéndose el plásmido pUCDHFR. Células de E. coli JM109 (Stratagene) transformadas mediante pUCDHFR se infectaron con un exceso de aproximadamente 40 veces del fago auxiliar R408 (Stratagene) y se agitaron durante 16 horas a 37ºC en un medio LB. Del sobrenadante de bacterias se aisló plásmido ADN de ramal singular.

La mutagénesis dirigida tuvo lugar en dos pasos sucesivos, empleándose el sistema de mutagénesis in vitro RPN1523 (Amersham). El punto EcoRI que se encuentra al comienzo de Exon 2 se destruyó intercambiando una base de GAATTC a GAGTTC. Este intercambio de bases no da lugar a ninguna modificación de la secuencia de aminoácidos codificada y corresponde además a la secuencia de nucleótidos en el gen DHFR natural de ratón (McGrogan et al., 1985, Mitchell et al., 1986). Para la mutagénesis se empleó un oligonucleótido (orientación antisentido) de secuencia 5'-GTACTTGAACTCGTTCCTG-3' (EBI-1751). Un plásmido con la mutación deseada se preparó tal como se ha descrito anteriormente como ADN de ramal singular, y se eliminó el punto PstI que se encuentra en el primer Intron, mediante mutagénesis con el oligonucleótido EBI-1857 (orientación en sentido contrario,
5'-GGCAAGGGCAGCAGCCGG-3') de CTGCAG en CTGCTG. Las mutaciones se confirmaron mediante secuenciación, y el plásmido obtenido se denominó pUCDHFR-Mut2.

Del plásmido pUCDHFR-Mut2 se aisló el fragmento BglII de 1,7 kb y se ligó en el plásmido pSV2gptDHFR20, doblemente cortado con BglII y BamHI. Tras la transformación de E. coli, amplificación y aislamiento del ADN se obtuvo un plásmido con la composición deseada, que se designó por pSV2gptDHFR-Mut2. Cortando mediante BamHI se eliminó en la región 3' no codificada del gen de DHFR un fragmento de ADN de 0,2 kb siguiente al punto BglII, que contiene además un interfaz KpnI. Anudando los extremos de ADN colgantes, formados con BglII y BamHI, se destruyeron también las secuencias de identificación para estas dos enzimas.

El plásmido pCMV-SV40 se cortó dos veces con EcoRI y BamHI, dejándose a continuación romos los extremos del ADN mediante la enzima Klenow. El ADN se depuró mediante extracción con fenol-cloroformo y precipitación por etanol, a continuación se desfosforiló mediante incubación con fosfatasa alcalina y se aisló el vector ADN de 4,4 kb de longitud de un gel de agarosa.

El plásmido pSV2gptDHFR-Mut2 (figura 4) se cortó dos veces con EcoRI y PstI, y los extremos se dejaron romos mediante incubación durante 20 minutos a 11ºC con 5 unidades de ADN polimerasa T4 (50 mM Tris- HCl, pH = 8,0, 5 mM MgCl_{2}, 5 mM ditiotreita, 0,1 mM de cada uno de los cuatro desoxinucleóticos-trifosfatos, 50 \mug/ml de albúmina de suero de ternera). El fragmento de ADN de 2,4 kb de longitud con el gen DHFR mutado se aisló a partir de un gel de agarosa y se ligó con el pCMV-SV40 preparado en la forma antes descrita. Un plásmido obtenido después de la transformación de E. coli, que contiene el gen DHFR en la misma orientación que el promotor CMV, se denominó pCMV-SV40DHFR.

En el último paso se sustituyó el fragmento "Stuffer" de 0,4 kb después del promotor CMV, que procedía todavía del plásmido de partida pCDM8, por un punto de multiclonación. Para ello se cortó dos veces el plásmido
pCMV-SV40DHFR con HindIII y XbaI, y la parte vectorial se aisló de un gel de agarosa. El punto de multiclonación formado por los dos oligonucleótidos EBI-1823 (5'-AGCTTCTGCAGGTCAGACATCGATGGATCCGGTACCTC
GAGCGGCCGCGAATTCT-3') y EBI-1829 (5'-CTAGAGAATTCGCGGCCGCTCGAGGTACCGGATCCATCGA
TG-TCGACCTGCAGA-3') incluye además de los extremos compatibles para la clonación en HindIII-XbaI, interfaces de restricción para las enzimas PstI, SalI, ClaI, BamHI, KpnI, XhoI, NotI y EcoRI.

Cada 1 \mug de los dos oligonucleótidos se incubó en 20 \mul de tampón de reacción (70 mM Tris-Cl, pH = 7,6, 10
mM MgCl_{2}, 5 mM ditiotreita, 0,1 mM ATP), con 5 unidades de T4 oligonucleotiquinasa durante 1 hora a 37ºC, para fosforilar los extremos 5'. La reacción se paró calentando durante 10 minutos a 70ºC, y se hibridizaron entre sí los oligonucleótidos complementarios, incubando para ello la muestra otros 10 minutos a 56ºC, dejándola enfriar a continuación lentamente hasta la temperatura ambiente. 4 \mul de los oligonucleótidos hibridizados (100 ng) se ligaron con unos 100 ng de vector plásmido, y se transformó E. coli HB101. Un plásmido que se pudo linealizar con las enzimas del punto de multiclonación (excepto NotI) se denominó pAD-CMV1. De los numerosos clones ensayados no se pudo identificar ninguno cuyo plásmido se pudiera cortar con NotI. La secuenciación mostró siempre la supresión de algunas bases dentro de la secuencia de identificación NotI. De la misma manera se preparó con la pareja de oligonucleótidos EBI-1820 (5'-AGCTCTAGAGAATTCGCGGCCGCTCGAGGTACCGGATCCATCGAT
GTCGACCTGCAGAAGCTTG-3') y EBI-1821 (5'-CTAGCAAGCTTCTGCAGGTCGACATCGATGGATCCGGT
ACCTCGAGCGGCCGCGAATTCTCTAG-3') el plásmido de expresión pAD-CMV2, que contiene los interfaces de restricción dentro del punto de multiclonación, en orden inverso. De esta manera se obtuvo el plásmido pAD-CMV2, que se pudo linealizar con todas las enzimas de restricción, incluida NotI.

La secuencia de nucleótidos del plásmido pAD-CMV1 (figura 5) de 6414 bp de un tamaño, está representada en su totalidad en la figura 6.

Los tramos en el plásmido (indicados en la numeración de las bases) corresponden a las siguientes secuencias:

1-21	EBI-1733, comienzo intensificador CMV - promotor (de CDM8)
632-649	Promotor T7
658-713	Punto de multiclonación (HindIII a XbaI de EBI-1823, EBI-1829)
714-1412	SV40 Intron y punto de poli-adenilización (de CDM8)
1413-2310	Región no codificante 5' y promotor del gen de hámster DHFR (de pSV2gptDHFR20)
2311-2396	DHFR de hámster: exon 1
2516	Mutación A a T, destruida punto PstI en DHFR Intron 1
2701-3178	DHFR Exons 2-6 (región codificante)
2707	Mutación A en G destruida punto EcoRI
3272-3273	Supresión entre BglII y BamHI en DHFR 3' región no codificante
3831	Fin gen DHFR (de pSV2gptDHFR20)
3832-4169	SV40 ori (de pSV2gptDHFR20)

4170-4648	M13 ori (de pBluescript SK+)
4780-5640	\beta-lactamasa (región codificante)
6395-6414	EBI-1729, fin de la secuencia del vector pBluescript

La preparación de los plásmidos pAD-CMV1 y pAD-CMV2 está representada en la figura 5.

Ejemplo 9 Construcción del plásmido pADTNF-BP para la expresión de la forma soluble de TNF-BP

Para preparar por vía directa la forma secretada de TNF-BP se intercaló un codón de parada de traslación en el ADNc que codifica para una parte del receptor TNF (véase el ejemplo 7; designado en lo sucesivo como TNF-R
ADNc) después del codón del aminoácido C-terminal del TNF-BP natural (AAT, Asn-172; corresponde a la Pos. 201 en la figura 9). De esta manera se interrumpe en este punto la síntesis de la proteína y permite secretar TNF-BP
directamente en el sobrante celular, sin tener que pasar a través de una subsiguiente reacción, que posiblemente determine la velocidad, de una disociación proteolítica de tramos del receptor TNF situados en sentido hacia el terminal C.

Simultáneamente con la introducción del codón de parada mediante PCR se acortó la región del TNF-R ADNc no codificante 5', para eliminar el codón inicial de traslación de otro marco de lectura abierto (bases 72-203 en la figura 9), que está situado 5' del de TNF-R, e introduciendo en el extremo 5' ó 3' del ADNc un interfaz BamHI o EcoRI.

100 ng de plásmido pTNF-BP15 (véase el ejemplo 7), linealizado mediante XmnI, se amplificaron en cada caso en una preparación de PCR de 100 \mul a lo largo de 10 ciclos mediante 50 pmol de los oligonucleótidos EBI-1986 (sentido, 5'-CAGGATCCGAGTCTCAACCCTCAAC-3') y EBI-1929 (antisentido, 5'-GGGAATTCCTTATCAATTCT
CAATCTGGGGTAGGCACAACTTC-3'; introducción de dos codones de parada y de un punto EcoRI). Las condiciones del ciclo fueron 40 segundos a 94ºC, 45 segundos a 55ºC y 5 minutos a 72ºC. Después del último ciclo se siguió incubando durante otros 7 minutos a 72ºC, y se detuvo la reacción mediante extracción con fenol-cloroformo. El ADN fue precipitado con etanol y a continuación cortado dos veces con BamHI y EcoRI. El fragmento de ADN de 0,75 kb que se formó, se aisló a partir de un gel de agarosa y se clonó en un plásmido Pt7/T3\alpha-19 (BRL) doblemente cortado con BamHI y EcoRI. Uno de los plásmidos obtenidos, del que basándose en la secuenciación del inserto completo se había comprobado que presentaba la secuencia deseada, se denominó pTNF-BP.

El pTNF-BP se cortó con BamHI y EcoRI y el inserto de ADN de 0,75 kb se clonó en el plásmido de expresión pAD-CMV1, cortado con BamHI y EcoRI. Un plásmido obtenido con la composición deseada se denominó
pADTNF-BP (figura 7A).

Ejemplo 10 Construcción del plásmido pADBTNF-BP para la expresión de la forma soluble de TNF-BP

Para otra variante de un plásmido de expresión para la producción de TNF-BP secretado se sustituyó la región 5' no codificada del ADNc TNF-R por la región 5' no codificada del ARNm de \beta-globina humana. El motivo de esto fue la comprobación de que la secuencia de nucleótidos, inmediatamente previa al codón inicial de traslación de la secuencia TNF-R, difiere claramente de la secuencia de consenso hallada para la expresión eficiente de genes eucarióticos (Kozak, 1978), mientras que la región 5' no codificada del ARN de \beta-globina coincide muy bien con esta secuencia de consenso (Lawn et al., 1980). Mediante el oligonucleótido EBI-2452 (5'-CACAGTCGACTTACATTTGCTTCTGACA
CAACTGTGTTCACTAGCAACCTCAAACAGACACCATGGGCCTCTCCACCGTGC-3'), que después de un interfaz de restricción SalI contenía la secuencia auténtica 5' no codificante, correspondiente a la secuencia ARNm de \beta-globina humana, seguida de 20 bases de la región codificante de TNF-BP, se modificó en una PCR la secuencia TNF-R.
100 ng de polipéptido pTNF-BP, linealizado mediante EcoRI, se amplificaron en 100 \mul de preparación de reacción con cada 50 pmol de los oligonucleótidos EBI-2452 y EBI-1922 (antisentido, 5'-GAGGCTGCAATTGAAGC-3'; fija con la secuencia huTNF-R en la Pos. 656), en 20 ciclos PCR (40 segundos a 94ºC, 45 segundos a 55ºC, 90 segundos a 72ºC). Después de la depuración del producto de PCR mediante extracción con fenol-cloroformo y precipitación por etanol se efectuó un doble corte del ADN mediante SalI y BglH, y el fragmento de ADN de 0,51 kb resultante se aisló a partir de un gel de agarosa. La parte correspondiente de la secuencia TNF-R se eliminó del plásmido
pTNF-BP cortando con SalI y BglII, se aisló la parte del plásmido de 3,1 kb de longitud a partir de un gel de agarosa y se ligó con el producto PCR de 0,51 kb de longitud. Después de la transformación de E. coli se secuenciaron siete de los plásmidos obtenidos. Uno de estos plásmidos contenía exactamente la secuencia deseada. Este plásmido se denominó pBTNF-BP.

Todo el inserto SalI-EcoRI de pBTNF-BP se clonó en el plásmido de expresión pAD-CMVl también cortado, y el plásmido obtenido se denominó pADBTNF-BP (figura 7B).

Ejemplo 11 Aislamiento de clones ADNc TNF-R de ratas

Primeramente se preparó un ADNc de cerebro de rata análogo a la biblioteca ADNc HS913T (véase el ejemplo 4) de la línea de células tumorales Glia de ratas C6 (ATCC Nº CCL107) en \lambda-gt11.

600.000 fagos de la biblioteca ADNc de cerebro de rata en \lambda-gt11 se clasificaron por hibridización tal como se describe en el ejemplo 6. Como sonda se empleó el inserto EcoRI depurado de pTNF-BP30 (véase el ejemplo 6). Aproximadamente 100 ng de ADN se marcaron radioactivamente con 1 \mug de Random Hexamer Primer en lugar de los oligonucleótidos específicos, tal como se describe en el ejemplo 6, mediante [\alpha^{-32}P]dCTP. Se instalaron 25 x 10^{6} cpm. La hibridización de los filtros se realizó en las mismas condiciones que en el ejemplo 6. Los filtros se lavaron dos veces durante 30 minutos a temperatura ambiente en 2 x SSC/0,1% SDS y tres veces durante 30 minutos a 65ºC en 2 x SSC/0,1% SDS, y dos veces durante 30 minutos a 65ºC en 0,5 x SSC/0,5% SDS. Los filtros secados al aire se pusieron a continuación en película radiográfica Kodak XAR durante 16 horas empleando una lámina amplificadora a -70ºC. En total se identificaron 10 placas hibridizantes, que se separaron por depuración de placas. Después de tres depuraciones de placa se representaron finalmente tres clones \lambda (\lambda-raTNF-R # 3, 4, 8) y se representaron los fagos ADN tal como se ha descrito.

La longitud de los insertos de ADNc se determinó después de cortar el ADN de \lambda mediante EcoRI y separación en un gel de agarosa con 2,2 kb para los clones raTNF-R3 y raTNF-R8, y 2,1 kb para el clon raTNF-R4. Los insertos EcoRI de los clones \lambda-raTNF-R3 y 8 se clonaron en M13mp19 cortado igualmente, y se determinó la secuencia de ADN con cebadores de secuencia universales y cebadores de oligonucleótidos específicamente sintetizados.

La secuencia completa de nucleótidos raTNF-R8 está representada en la figura 8. Las primeras últimas siete bases corresponden a los enlaces EcoRI, que se habían añadido al preparar la biblioteca de ADNc.

Ejemplo 12 Aislamiento de un clon que contiene todo el ADNc que codifica para el receptor TNF humano

El ADNc completo del TNF-R de ratas facilitó la búsqueda de la parte 3' que aún faltaba del ADNc humano
TNF-R.

Como sonda para la hibridización se empleó el producto PCR de 0,4 kb de longitud de los cebadores EBI-2316 (5'-ATTCGTGCGGCGCCTAG-3'; fija en TNF-R con la segunda base de EcoRI, al que interrumpe TNF-R ADNc) y EBI-2467 (5'-GTCGGTAGCACCAAGGA-3'; fija aprox. 400 bases de poli-A al clon ADNc, corresponde a la Pos. 1775 en raTNF-R), utilizando \lambda-raTNF-R8 como plantilla. Este fragmento de ADN equivale a la región del ADNc TNF-R de ratas, del que se supuso que corresponde al puesto que sigue al EcoRI interno en el TNF-R humano.

2,5 x 10^{6} cpm de la sonda raTNF-R se emplearon para hibridizar 600.000 placas de la biblioteca ADNc HS913T. Las condiciones de hibridización correspondían a las indicadas en el ejemplo 6. Los filtros se lavaron dos veces durante 30 minutos a temperatura ambiente en 2 x SSC/0,1% SDS y dos veces durante 30 minutos a 65ºC en 2 x SSC/0,1% SDS, se secaron al aire y se expusieron en película radiográfica Kodak XAR, utilizando una lámina amplificadora, durante 3 días a -70ºC. Se identificaron 6 placas positivas, y en otras dos rondas se depuraron las placas y se representó el ADN de \lambda (\lambda-TNF-R # 2, 5, 6, 8, 11, 12). Después de cortar el ADN de \lambda mediante EcoRI, todos los clones presentaban una banda de ADN de aproximadamente 0,8 kb de longitud. \lambdaTNF-R2 y 11 contenían además un fragmento EcoRI de 1,3 kb. Los dos insertos EcoRI de \lambdaTNF-R2 se subclonaron en el punto EcoRI del plásmido pUC218 (IBI) y a continuación se secuenciaron. La secuencia del fragmento EcoRI de 1,3 kb correspondía a la del clon ADNc pTNF-BP15, el fragmento EcoRI 0,8 kb corresponde al tramo 3' del ARNm TNF-R y contiene delante de la secuencia de enlaces EcoRI una cola poli-A con 16 restos A. \lambdaTNF-R2 contiene por lo tanto la región íntegra codificante del TNF-R humano, representado en la figura 9.

Ejemplo 13 Construcción de los plásmidos pADTNF-R y pADBTNF-R para la expresión de todo el receptor TNF humano

En primer lugar se construyó, de forma semejante a la descrita en el ejemplo 9 para pTNF-BP o pADTNF-BP, un plásmido en el que se acortó la región 5' no codificada de pTNF-BP15, a diferencia de los plásmidos descritos en el ejemplo 9, pero se mantuvo el extremo 3' de pTNF-BP15. Para ello se amplificó con PCR, en condiciones idénticas a las del ejemplo 9, con el oligonucleótido EBI-1986 y el cebador universal M13 -40 (5'-GTTTTCCCAGTCACGAC-3')
pTNF-BP15. El producto de PCR se cortó dos veces con BamHI y EcoRI y se clonó en el plásmido pT7/T3\alpha-19. Uno de los plásmidos obtenidos se denominó pTNF-BP15B.

pTNF-BP15B se cortó con BamHI y EcoRI, y el inserto de ADN de 1,26 kb se clonó en un plásmido de expresión pAD-CMV1 cortado con BamHI y EcoRI. Un plásmido obtenido de la composición deseada se denominó
pADTNF-BP15.

Este plásmido se linealizó con EcoRI y se clonó en el interfaz del fragmento EcoRI de 0,8 kb, que se había aislado de \lambdaTNF-R2. Después de la transformación de E. coli se comprobaron algunos plásmidos aislados al azar, cortando con diversas enzimas de restricción, para comprobar la orientación correcta del fragmento EcoRI empleado. Un plásmido, designado como pADTNF-R (figura 7C) se investigó con mayor detalle en cuanto a orientación correcta, para lo cual se secuenció el inserto partiendo del extremo 3' del ADNc insertado con el oligonucleótido EBI-2112 (5'-GTCCAATTATGTCACACC-3'), que después del punto de multiclonación fija al plásmido pAD-CMV1 y a sus derivados.

Se construyó otro plásmido de expresión en el que se sustituyó la región 5' no codificada del TNF-R por la de \beta-globina. El plásmido pADBTNF-BP se cortó totalmente con BglII, para eliminar el fragmento BglII de 1,1 kb, los extremos ADN se desfoforilaron a continuación con fosfatasa alcalina procedente de tripa de cordero y se aisló a partir de un gel de agarosa el vector de plásmido (5, 9 kb) con la región 5' no codificada de \beta-globina del gen de \beta-globina y la parte 5' de la región codificante TNF-R. El plásmido pADTNF-R se cortó con BglII, y el fragmento de ADN de 2,5 kb, que contiene el tramo 3' del ADNc TNF-R se aisló a partir de un gel de agarosa hasta la región promotora del siguiente gen DHFR, y se clonó en el vector de plásmido previamente preparado. Un plásmido obtenido después de la transformación de E. coli con el fragmento BglII insertado con orientación correcta, se denominó pADBTNF-R (figura 7D).

Ejemplo 14 Expresión de TNF-BP soluble en líneas celulares eucarióticas a) Ensayo ELISA

En este ejemplo se realizó la determinación de TNF-BP, mediante el ensayo ELISA, en la forma siguiente:

Placas de microtitrado de 96 pocillos, se llenó cada pocillo con con 50 \mul de suero de conejo policlonal diluido 1:3000 (anticuerpos de conejo policlonales, preparados por precipitación de antisuero con sulfato de amonio, concentración final saturación 50%) frente a TNF-BP natural durante 18 horas a 4ºC, se lavaron una vez con Tween-20 al 0,05% en PBS y se bloquearon los puntos de fijación libres con 150-200 \mul de albúmina de suero de ternera al 0,5%, Tween 20 al 0,05% en PBS (PBS/BSS/Tween) durante una hora a temperatura ambiente. Los pocillos se lavaron una vez con Tween 20 al 0,05% en PBS y 50 \mul de sobrenadante de células o bien cantidades conocidas de TNF-BP natural (véanse las Tablas 3 y 4) y 50 \mul de una dilución 1:10.000 de un suero de ratón policlonal frente a TNF-BP, y se incubaron durante dos horas a temperatura ambiente. A continuación se lavaron los pocillos tres veces con Tween-20 al 0,05% en PBS y se añadieron 50 \mul de conjugado de peroxidasa Ig anti-ratón de conejo (Dako P161; 1:5000 en PBS/BSA/Tween), y se siguió incubando durante otras dos horas a temperatura ambiente. Los pocillos se lavaron tres veces con Tween/PBS y se efectuó la reacción de teñido con ortofenildiamina (3 mg/ml) y perborato sódico (1 mg/ml) en 0,067 M de citrato potásico pH 5,0, 100 \mul/pocillo, durante 20 minutos a temperatura ambiente, protegido de la luz. Después de añadir 100 \mul de 4N H_{2}SO_{4} se midió fotométricamente la intensidad de color a una longitud de onda de 492 nm, en un fotómetro de placas de microfilmado.

b) Expresión transitoria de TNF-BP soluble en líneas de células eucarióticas

Aproximadamente 10^{6} células (COS-7) por cápsula de Petri de 80 mm se prepararon 24 horas antes de la transfección en un medio RPMI-1640 con suero de ternera fetal al 10% inactivado por calor, y se incubaron a 37ºC en atmósfera de CO_{2} al 5%. Las células se desprendieron con una paleta de goma de la cápsula de Petri y se separaron por centrifugación a 1200 rpm a temperatura ambiente (Heraeus Minifuge, rotor Ausschwing 3360), se lavaron una vez con 5 ml de un medio exento de suero, se centrifugaron durante 5 minutos a 1200 rpm y se suspendieron en 1 ml de medio, mezclado con 250 \mug/ml de DEAE-dextrano y 10 \mug de plásmido ADN (véase la Tabla 3), depurado mediante doble centrifugación de gradiente de densidad CsCl). Las células se incubaron durante 40 minutos a 37ºC, se lavaron una vez con 5 ml de medio con 10% de suero de ternera y se suspendieron en 5 ml de medio con 100 \mug/ml de cloroquina. Las células se incubaron durante una hora a 37ºC, se lavaron una vez con el medio y se incubaron con 10 ml de medio fresco a 37ºC. Al cabo de 72 horas se cosechó el sobrenadante de células y se empleó para determinar el TNF-BP secretado.

TABLA 3

11

c) Preparación de líneas celulares que produzcan permanentemente TNF-BP

La línea celular de ovario de hámster deficiente en dihidrofolatorreductasa (DHFR) CHO DUKX BII (Urlaub y Chasin, 1980) se transfirió con plásmido pADBTNF-BP mediante precipitación de fosfato cálcico (Current protocols in molecular biology, 1987). Se transfirieron cuatro frascos con un denso cultivo celular (25 cm^{2}, 5 ml de medio de cultivo por frasco) cada uno con 5 \mug de ADN; después de incubar durante cuatro horas a 37ºC se retiró el medio y se sustituyó en cada caso por 5 ml de medio de selección (medio MEM alpha con suero de ternera fetal dializado al 10%). Después de incubar durante la noche se desprendieron las células mediante solución de tripsina; las células procedentes de cada frasco se subdividieron en dos placas de cultivo de tejido de 96 pocillos (100 \mul/pocillo en el medio de selección). A intervalos de aproximadamente una semana se fue añadiendo medio fresco. Al cabo de unas cuatro semanas se pudieron observar clones de células en 79 pocillos. Se comprobó la actividad TNF-BP de los sobrenadantes en ELISA. 37 sobrenadantes mostraron actividad en ELISA. Los resultados de los ensayos ELISA de algunos clones positivos aparecen representados en la Tabla 4.

TABLA 4

12

Ejemplo 15 Análisis ARN (Northern Blot) del receptor TNF humano

Por cada 1 \mug de ARN poli-A+ (aislado a partir de HS913T (fibrosarcoma), placenta y bazo se separaron electroforéticamente en un gel de agarosa vertical al 1,5% (10 mM tampón de fosfato sódico, pH = 7,0, formaldehído 7,0%). Como marcador de tamaño se empleó una escala de quilobases (Bethesda Research Laboratories), marcada mediante una reacción de carga con (\alpha^{-32}P)dCTP y enzima Klenow. El formaldehído se separó del gel aguando y se transfirió el ARN en 20x SSC sobre una membrana de nylon (Genescreen plus, NEN-DuPont). El ARN se fijó covalente sobre la membrana mediante radiación UV (10 segundos). La membrana se prefibridizó durante 2 horas a 65ºC en tampón Church (Church and Gilbert, 1984), (0,5 M fosfato sódico, pH = 7,2, SDS 7%, 1 mM EDTA), y se fibridizó durante 19 horas a 75ºC en tampón Church fresco con sonda 3 x 10^{6} cpm de sonda ADN marcada P-32 (inserto EcoRI de
pTNF-BP30). El filtro se lavó tres veces durante 10 minutos a temperatura ambiente en tampón de lavado (40 mM fosfato sódico, pH = 7,2, SDS 1%), y a continuación cuatro veces durante 30 minutos a 65ºC en tapón de lavado, y se expuso durante 18 horas sobre película radiográfica Kodak XAR, empleando una lámina amplificadora, a -70ºC.

El autorradiograma (figura 10) muestra una banda ARN singular con una longitud de 2,3 kb para el receptor TNF humano en los tejidos analizados por la línea celular HS913T

Ejemplo 16 Expresión del receptor TNF

Para la expresión transitoria se incubaron 5-10 x 10^{7} células COS-7 durante 40 minutos con 10 \mug de ADN plásmido pADTNF-R en una solución que contenía 250 \mug/ml de dextrano DEAE y 50 \mug/ml de cloroquina. Como control se utilizó ADN pADCMV-1. Después de la transfección se lavaron las células y a continuación se cultivaron durante 48 horas. La expresión del receptor TNF se demostró mediante la fijación de ^{125}I-TNF. Para los ensayos de fijación se lavaron las células, se incubaron durante 1 hora a 4ºC con 10 ng de ^{125}I-TNF (radioactividad específica 38.000 cpm/ng) con o sin un exceso de 200 veces de TNF sin marcar, se lavaron y se midió la radioactividad fijada a las células mediante un contador Gamma. La fijación específica en la muestra de control fue de 2062 cpm, y de 6150 cpm en las muestras transformadas con el ADN receptor TNF (los valores están expresados como cpm medios fijados; se ha tenido en cuenta la desviación estándar determinada a partir de ensayos paralelos. El fondo no específico en presencia de TNF sin marcar se ha restado de los valores).

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Claims (38)

1. Procedimiento para la preparación de un ADN, que comprende la amplificación de un ADN, que codifica para un polipéptido que tiene la facultad de fijar TNF, que comprende el polipéptido una secuencia de aminoácidos con la fórmula

13

o un fragmento funcional o una modificación del mismo, con la facultad de fijar TNF.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque el polipéptido es una secuencia de aminoácidos con la fórmula

14

o un fragmento funcional o una modificación del mismo, con la facultad de fijar TNF.

3. Procedimiento según la reivindicación 2, caracterizado porque el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos con la fórmula

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15

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o un fragmento funcional o una modificación del mismo con la facultad de fijar TNF.

4. Procedimiento según la reivindicación 3, caracterizado porque el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos con la fórmula

16

o un fragmento funcional o una modificación del mismo con la facultad de fijar TNF.

5. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos con la fórmula

17

o un fragmento funcional o una modificación del mismo con la facultad de fijar TNF.

6. Procedimiento según la reivindicación 5, caracterizado porque el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos con la fórmula

18

o un fragmento funcional o una modificación del mismo con la facultad de fijar TNF.

7. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque la secuencia de aminoácidos del polipéptido está modificada en uno o varios puntos de glicosilización.

8. Procedimiento según la reivindicación 1, donde el ADN codifica para una proteína secretable que fija TNF, caracterizado porque el ADN es una secuencia de ácido nucleico con la fórmula

19

o un fragmento funcional o una variante de una modificación de esta secuencia de ácido nucleico, que codifica para un polipéptido con la facultad de fijar TNF, donde R^{2} representa un ADN que codifica para un (poli)péptido disociable in vivo.

9. Procedimiento según la reivindicación 8, donde el ADN codifica para una proteína secretable que fija TNF, caracterizado porque R^{2} representa en su totalidad o en parte un ADN que codifica para una secuencia de señales.

10. Procedimiento según la reivindicación 8, caracterizado porque R^{2} comprende una secuencia de aminoácidos con la fórmula

\hskip1cm CTG GTC CCT CAC CTA GGG GAC AGG GAG AAG AGA

11. Procedimiento según la reivindicación 8, caracterizado porque R^{2} comprende un ácido nucleico con la fórmula

\hskip1cm R^{3} CTG GTC CCT CAC CTA GGG GAC AGG GAG AAG AGA

donde R^{3} representa un ADN que codifica para un péptido de señal.

12. Procedimiento según la reivindicación 11, caracterizado porque R^{3} comprende una secuencia de ácido nucleico con la fórmula

100

13. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque el ADN comprende un ADN con la fórmula

20

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o un fragmento, una variante o una modificación de esta secuencia de ácido nucleico que codifica para un polipéptido con la facultad de fijar TNF.

14. Procedimiento para la preparación de una molécula ADN recombinante, que comprende la amplificación de un ADN, donde la molécula de ADN comprende el ADN que puede obtenerse por un procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 13.

15. Procedimiento según la reivindicación 14, donde la molécula de ADN se puede replicar en células huésped procarióticas o eucarióticas y contiene secuencias de control de expresión, unidas funcionalmente con el ADN que puede obtenerse por un procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 13.

16. Procedimiento según la reivindicación 15, donde la molécula de ADN recombinante se puede replicar en células de mamífero.

17. Procedimiento según la reivindicación 14, caracterizado porque la molécula de ADN recombinante contiene el ADN definido en la reivindicación 9.

18. Procedimiento según la reivindicación 17, caracterizado porque la molécula de ADN recombinante es
pADTNF-BP representada en la figura 7a.

19. Procedimiento según la reivindicación 17, caracterizado porque la molécula de ADN recombinante es
pADBTNF-BP representada en la figura 7b.

20. Procedimiento según la reivindicación 17, caracterizado porque la molécula de ADN recombinante es
pADTNF-R representada en la figura 7c.

21. Procedimiento según la reivindicación 17, caracterizado porque la molécula de ADN recombinante es
pADBTNF-R representada en la figura 7d.

22. Procedimiento para la preparación de una célula huésped, que comprende la transformación de una célula con por lo menos una de las moléculas ADN recombinantes, obtenible por un procedimiento según una de las reivindicaciones 14 a 21, donde las moléculas ADN recombinantes representan una secuencia parcial del ADN que codifica para la proteína que fija TNF.

23. Procedimiento según la reivindicación 22, caracterizado porque la célula huésped es una célula huésped eucariótica, preferentemente una célula COS o una célula CHO.

24. Procedimiento para la preparación de una proteína recombinante que fija TNF o un derivado funcional de la misma, que comprende el cultivo de una célula huésped que puede obtenerse por un procedimiento conforme según la reivindicación 22 y la expresión de la proteína.

25. Procedimiento según la reivindicación 24, que comprende además la fase de aislamiento de la proteína expresada.

26. Procedimiento para la preparación de un polipéptido recombinante, que comprende la expresión de un ADN seleccionado del grupo que codifica para uno de los siguientes polipéptidos:

21

210

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22

27. Procedimiento para la preparación de un polipéptido, caracterizado porque se expresa recombinante una proteína que fija TNF, de la fórmula siguiente:

23

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28. Procedimiento según la reivindicación 27, caracterizado porque el polipéptido comprende el receptor TNF de la fórmula

24

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29. Procedimiento para la investigación de sustancias, caracterizado por emplearse un polipéptido que puede obtenerse según una de las reivindicaciones 26 a 28, para determinar in vitro la interacción de estas sustancias con este polipéptido y/o con TNF-\alpha y/o con TNF-\beta y/o la influencia de estas sustancias sobre el efecto biológico de TNF-\alpha y/o TNF-\beta.

30. Procedimiento para la investigación de sustancias, caracterizado porque se determina la interacción de estas sustancias con el receptor TNF y/o su influencia en el efecto biológico de TNF-\alpha y/o TNF-\beta, con una célula huésped que puede obtenerse según la reivindicación 24.

31. Procedimiento para la preparación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades autoinmunes, caracterizado porque se combina un polipéptido, que puede obtenerse por un procedimiento según una de las reivindicaciones 26 a 28, con sustancias adicionales farmacéuticamente aceptables.

32. Procedimiento para la preparación de un medicamento para el tratamiento de la artritis reumatoide caracterizado porque se combina un polipéptido, que puede obtenerse por un procedimiento según una de las reivindicaciones 26 a 28, con sustancias adicionales farmacéuticamente aceptables.

33. Procedimiento para la preparación de un medicamento para el tratamiento de ARDS (Síndrome de Trastorno Respiratorio Agudo), caracterizado porque se combina un polipéptido, que puede obtenerse por un procedimiento según una de las reivindicaciones 26 a 28, con sustancias adicionales farmacéuticamente aceptables.

34. Procedimiento para la preparación de un medicamento para el tratamiento de la anorexia / caquexia, caracterizado porque se combina un polipéptido, que puede obtenerse por un procedimiento según una de las reivindicaciones 26 a 28, con sustancias adicionales farmacéuticamente aceptables.

35. Procedimiento para la preparación de un medicamento para el tratamiento de GVHR (Reacción injerto versus huésped, rechazo de trasplantes), caracterizado porque se combina un polipéptido, que puede obtenerse por un procedimiento según una de las reivindicaciones 26 a 28, con sustancias adicionales farmacéuticamente aceptables.

36. Procedimiento para la preparación de un medicamento para el tratamiento del estado de shock, caracterizado porque se combina un polipéptido, que puede obtenerse por un procedimiento según una de las reivindicaciones 26 a 28, con sustancias adicionales farmacéuticamente aceptables.

37. Procedimiento para la preparación de un producto de diagnóstico para la determinación de TNF-\alpha y/o TNF-\beta, caracterizado porque se facilita un polipéptido que puede obtenerse por un procedimiento según una de las reivindicaciones 26 a 28, junto con anticuerpos contra TNF.

38. Procedimiento para la preparación de una preparación farmacéutica caracterizado porque se combina un polipéptido que puede obtenerse según procedimiento según una de las reivindicaciones 26 a 28, con sustancias adicionales farmacéuticamente aceptables.