DK172400B1 - Fremgangsmåde til fremstilling af renset minactivin, minactivinkodende DNA-molekyle, rekombinant DNA-molekyle, sammensmeltet gen, vært, reagent til lokalisering og definering af grænserne for tumorer i histologiske prøver, samt anvendelse af det rekombinante DNA-molekyle, minactivinet og peptider deraf - Google Patents

Description

DK 172400 B1

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af renset minactivin, et minactivinkodende DNA-molekyle, et rekombinant DNA-molekyle, et sammensmeltet gen, en vært, en reagent til lokalisering og definering af 5 grænserne for tumorer i histologiske prøver, samt anvendelse af det rekombinante DNA-molekyle, minactivinet og peptider deraf.

Minactivin (PAI-2) er en naturligt -forekommende i n a k -tivator af urokinase-type plasminogenaktivatorer. Denne type 1 o plasminogenaktivator findes i abnormt høje koncentrationer i mange større humane carcinomer, navnlig lunge, tyktarm, bryst og prostata. Plasminogenaktivatorer er serinproteaser, som menes at formidle den proteo lyti ske kaskade involveret i cellulær translokation, migration og invasion. Som sådanne synes de 15 at st§ i forbindelse med vævsdestruktion og -gendannelse og være implicerede i tumorvækst og metastasedannelse. De har evt.· også en betydning i inf l animator i ske reaktioner.

Plasminogenaktivatorer har generelt vist sig at være af to typer: 1) urokinase-type og 2) vævstype. Vævstype-20 plasminogenaktivator findes hovedsageligt i blod og blodkarvægge, hvor det er ansvarligt for aktivering af det fibri-nolytiske forsvarssystem mod thrombosedannelse. Urokinase-' type-plasmi nogenakti vat orer synes-ikke at spille nogen rolle i normale thrombolyti ske processer, men har været impliceret 25 i de patologiske hændelser, der hænger sammen med invasion og vævsdestruktion og især tumormeta sta sedannelse og inflammatoriske reaktioner.

Adskillige inhibitorer, der er specifikke for plasminogenaktivatorer, er beskrevet, og disse omfatter en, der 30 er isoleret fra placenta (Holmberg, L. Biochim. Biophys.

Acta 544, 128-137 (1978)) og en anden (PAI-I), som er fremstillet i dyrkede vaskulære endotheliale celler (Vam Mou-rik, J.A., Lawrence, D.A., Loskutoff, D.J., J. Biol. Chem.

259, 14914-14921 (1984)). Minactivin viste sig at dannes af 35 blodmonocyter og U937 celler og synes at være immunologisk forbundet med den placentale inhibitor. Forbindelsen mellem disse forskellige inhibitorer er for tiden ukendt.

2 DK 172400 B1

Som det er tilfældet med de fleste andre mulige biologisk aktive proteiner, fremstilles minactivin i meget små mængder in vivo, og som sådan er den vanskelig at rense og karakterisere ved konventionelle biokemiske metoder. Efter-5 som der kræves store mængder renset minactivin til yderligere evaluering af dets egenskaber og biologiske effektivitet i kliniske anvendelser, er det ønskeligt at fremstille proteinet under anvendelse af rekombinant DNA-teknikker, d.v.s. ved kloning af minactivingenet i en alternativ vært, såsom bak-10 ferier eller dyreceller. For at klone minactivin er det ønskeligt at rense til homogenitet de små mængder, som kan renses således, af naturligt forekommende minactivin for at fremstille antistoffer, aminosyresekvenser, peptidfragmenter og syntetiske oligonucleotider afledt af det rensede minactivin. 15 Disse reagenter kan anvendes til kloningsprocesser. FORKORTELSER

HPLC - højtryksvæskechromatografi Mr - relativ molekylærmasse MW - molekylvægt 20 p Μ A - 4-phorbol-12-myristat-13-acetat SDS-PAGE - natriumdodecyIsulfatpolyacrylamidgelelektrophorese TFA - trifluoroeddikesyre HPA - human plasminogenaktivator bp - basepar 25 kb - k i loba sepa r PU - Ploug I en første udførelsesform tilvejebringer opfindelsen en DNA-sekvens, der omfatter en første DNA sekvens, der fungerer som en kodningssekvens for aminosyresekvenser af 3Q hele, en del af, analoger, homologer, derivater eller kombinationer deraf af minactivin, en DNA-sekvens, som hybridi-serer til nævnte første DNA-sekvens, en DNA-sekvens relateret ved mutation, omfattende enkle og multiple basesubstitutioner, deletioner, insertioner og inversioner, til nævnte 33 første DNA-sekvens eller hybridiseringssekvens eller en DNA-sekvens, som efter ekspression koder for hele, en del af, analoger, homologer, derivater eller kombinationer deraf af et polypeptid, som er minactivin eller som udviser lignen- 3 DK 172400 B1 de immunologisk eller biologisk aktivitet til minactivin.

En foretrukket DNA sekvens og fragmenter og derivater deraf ifølge den foreliggende opfindelse koder for et polypeptid, der udviser en immunologisk eller biologisk 5 aktivitet af minactivin.

Sådanne DNA-sekvenser kan fremstilles f.eks. ud fra pattedyrsceller ved ekstrahering af det totale DNA derfra og isolering af sekvenserne ved standardteknikker til fremstilling af rekombinante molekyler.

10 Også indenfor opfindelsens rammer ligger en fremgangs måde til udvælgelse af en DNA sekvens, der koder for et polypeptid, som udviser en immunologisk eller biologisk aktivitet af minactivin fra en gruppe DNA sekvenser, hvilken fremgangsmåde består af trinnet: at bestemme hvilke af DNA sek-15 venserne, der hybridiserer til en DNA sekvens, der vides at kode for et polypeptid, som udviser nævnte aktivitet.

Den udvalgte sekvens kan f.eks. være fra naturlige kilder, syntetiske DNA sekvenser, DNA sekvenser fra rekombinante DNA molekyler og DNA sekvenser, som er en kombination 20 deraf.

En foretrukket udførelsesform for opfindelsen tilveje-bringer en fremgangsmåde til fremstilling af en cDNA sekvens som fungerer som en kodnings sekven s for aminosyresekvenser af minactivin, hvilken fremgangsmåde omfatter trinnene: 25 at stimulere celler til produktion af minactivin, at opnå RNA fra disse stimulerede celler, at isolere mRNA derfra, og at fremstille cDNA fra mRNA. Fortrinsvis er cellerne U937 cel ler.

Den mere foretrukne fremgangsmåde til molekylær klo-30 ning af cDNA for minactivin og ekspressionen af proteinet i en rekombinant vært omfatter følgende fremgangsmåder: 1. induktion af en cellestamme til stimuleret minactivin-produktion og ekspression, 2. isolation af mRNA fra den egnede cellestamme, 35 3. in vitro translation af mRNA og immunopræci pi tati on af minactivintranslati onsproduktet ved kompleks formation med urokinase, 4 DK 172400 B1 4. fraktionering af mRNA fra (2) og identifikation af fraktionen, der indeholder minactivin translational aktivitet, 5. konstruktion af cDNA optegnelser fra mRNA fra (2) og (4), 6. kloning af cDNA optegnelserne fra (5) i egnede værter, 5 f.eks. E. coli eller bakteriofage lambda, 7. identifikation af kloner indeholdende minactivingenet ved: a) hybridudvælgelsestranslation under anvendelse af 3), b) hybridi sering til en kemisk syntetiseret DNA sekvens prøve, navnlig en prøve omfattende en syntetisk oligo- 10 nucleotidprøve ifølge opfindelsen, c) diffe renti a l hybridi ser ing under anvendelse af mærket cDNA syntetiseret fra induceret og noninduceret mRNA, d) immunologisk screeening af cDNA ekspressionsoptegnelser under anvendelse af antistoffer rettet mod minactivin 15 eller andre immunologisk relaterede molekyler, e) screening af cDNA ekspressionsoptegnelser for biologisk aktivitet under anvendelse af mærket urokinase eller urokinase og antistoffer til urokinase.

8. ekstension af det klonede gen ved dannelse af cDNA opteg- 2o neiser under anvendelse af oligonuc leotidprimere opnået fra part ie Ile minactivingensekvenser, navnlig oligonucleo-tidsekvenser beskrevet indenfor opfindelsens rammer, 9. bestemmelse af nucleotidsekvensen af minactivingenet, 10. ekspression af minactivingenet i E. coli og refolding 25 til opnåelse af et biologisk aktivt produkt, 11. ekspression af biologisk aktivt rekombinant minactivin ved kloning i alternative værter, f.eks. eukaryotiske celler, 12. rensning af rekombinant minactivin og klinisk vurdering af dets biologiske egenskaber.

30 I en anden udførelsesform tilvejebringer opfindelsen et rekombinant DNA molekyle, som omfatter en første DNA sekvens omfattende en første DNA sekvens, som fungerer som en kodningssekvens for aminosyresekvenser af hele, en del af, analoger, homologer, derivater eller kombinationer deraf af 35 minactivin, en DNA sekvens, som hybridiserer til nævnte første DNA sekvens, en DNA sekvens relateret ved mutation, omfattende enkle eller multiple basesubstitutioner, dele- 5 DK 172400 B1 tioner, insertioner og inversioner, til nævnte første DNA sekvens eller hybridi seringssekvens eller en DNA sekvens, som efter ekspression koder for hele, en del af, analoger, homologer, derivater eller kombinationer deraf af et polypep-5 tid, som er minactivin, eller som udviser lignende immunologisk eller biologisk aktivitet som minactivin.

Foretrukne rekombinante DNA molekyler ifølge opfindelsen omfatter en ekspressionskontrolsekvens, der er operativt bundet til en første DNA sekvens omfattende en første DNA 10 sekvens, som fungerer som en kodningssekvens for aminosyre-sekvenser af hele, en del af, analoger, homologer, derivater eller kombinationer deraf af minactivin, en DNA sekvens, som hybridiserer til nævnte første DNA sekvens, en DNA sekvens relateret ved mutation, omfattende enkle eller multiple base-15 substitutioner, deletioner, insertioner og inversioner, til nævnte første DNA sekvens eller hybridiseringssekvens eller en DNA sekvens, som efter ekspression koder for hele, en del af, analoger, homologer, derivater eller kombinationer deraf af et polypeptid, som er minactivin eller som udviser 20 lignende immunologisk eller biologisk aktivitet til minactivin.

Et foretrukket rekombinant DNA molekyle ifølge opfindelsen er et plasmid, som fungerer som en kodningssekvens for aminosyresekvenser af minactivin.

25 Et foretrukket plastmid ifølge opfindelsen har en første DNA sekvens, der koder for et middel til kontrol af ekspressionen af DNA sekvensen ifølge opfindelsen bundet til DNA sekvensen ifølge opfindelsen.

Opfindelsen tilvejebringer også et sammensmeltet 3q gen omfattende en flyttelig promoter, et translationsstartbindingssted og et gen, der koder for humant minactivin.

Også indenforopfindelsens rammer er en fremgangsmåde til fremstilling af et rekombinant DNA molekyle, hvilken fremgangsmåde omfatter trinnet: i et kloningsvehikel at intro-35 ducere en første DNA sekvens omfattende en første DNA sekvens, der fungerer som en kodningssekvens for aminosyresekvenser af hele, en del af, analoger, homologer, derivater eller kombinationer deraf af minactivin, en DNA sekvens, som hybri- 6 DK 172400 B1 diserer til nævnte første DNA sekvens, en DNA-sekvens relateret ved mutation, omfattende enkle eller multiple basesubstitutioner, deletioner, insertioner og inversioner, til nævnte første DNA sekvens eller hybri di seringssekvens eller 5 en DNA sekvens, som efter ekspression koder forhele, en del af, analoger, homologer, derivater eller kombinationer deraf af et polypeptid, som er minactivin, eller som udviser lignende immunologisk eller biologisk aktivitet til minactivin.

Fortrinsvis omfatter fremgangsmåden også trinnet 10 al introducere en ekspressionskontrolsekvens i kloningsvehiklet.

Opfindelsen omfatter endvidere en fremgangsmåde til fremstilling af et plasmid, som fungerer som en kodningssekvens for ami no syresekven ser af hele, en del af, analoger, 15 homologer, derivater eller kombinationer deraf af minactivin, hvilken fremgangsmåde omfatter kombination af et plasmid med en DNA sekvens, som fungerer som en kodningssekvens for nævnte aminosyresekvenser, og fortrinsvis med en ekspressionskontrolsekvens. DNA sekvensen er fortrinsvis en cDNA-2o sekvens.

I en tredie udførelsesform tilvejebringer opfindelsen en vært translformeret med mindst et rekombinant DNA molekyle, som omfatter en første DNA sekvens omfattende en første DNA sekvens, som fungerer som en kodningssekvens for aminosyre-25 sekvenser af hele, en del af, analoger, homologer, derivater eller kombinationer deraf af minactivin, en DNA sekvens, som hybridiserer til nævnte første DNA sekvens, en DNA sekvens relateret ved mutation, omfattende enkle eller multiple basesubstitutioner, deletioner, insertioner og inversioner, 30 til nævnte første DNA sekvens eller hybridi seringssekvens ellr en DNA sekvens, som efter ekspression koder for hele, en del af, analoger, homologer, derivater eller kombinationer deraf af et polypeptid, som er minactivin eller som udviser lignende immunologisk eller biologisk aktivitet til minactivin.

33 Egnede værter omfatter bakterier, gærarter, andre svampe, mus eller andre animalske værter, planteværter, insektværter og andre eukaryotiske værter, f.eks. pattedyrsceller, 7 DK 172400 B1 indbefattende humane vævsceller. Egnede bakterier omfatter E. coli, Pseudomonas species og Bacillus species.

Der foretrækkes navnlig en mikroorganisme med den genetiske information for biosyntese af minactivin.

5 Også omfattet af opfindeLsen er en fremgangsmåde til transformering af en vært, hvilken fremgangsmåde omfatter trinnet: i en vært at introducere et rekombinant DNA molekyle, som omfatter en første DNA sekvens omfattende en første DNA-sekvens, der fungerer som en kodningssekvens for 10 aminosyresekvenser af hele, en del af, analoger, homologer, derivater eller kombinationer deraf af minactivin, en DNA-sekvens, som hybridiserer til nævnte første DNA sekvens, en DNA sekvens relateret ved mutation, omfattende enkle eller multiple basesubstitutioner, deletioner, insertioner og in-15 versioner, til den første DNA sekvens eller hybridiseringssekvens eller en DNA sekvens, som efter ekspression koder for hele, en del af, analoger, homologer, derivater eller kombinationer deraf af et polypeptid, som er minactivin eller som udviser lignende immunologisk eller biologisk aktivitet 2o til minactivin.

Opfindelsen tilvejebringer også en fremgangsmåde til fremstilling af en mikroorganisme med den genetiske information for biosyntesen af hele, en del af, analoger, homologer, derivater eller kombinationer deraf af minactivin, 25 hvilken fremgangsmåde omfatter transofmat i on af en mikroorganisme med et plasmid eller anden vektor, som fungerer som en kodningssekvens for aminosyresekvenser af hele, en del af, analoger, homologer, derivater eller kombinationer deraf af minactivin.

30 I en fjerde udførelsesform tilvejebringer opfindelsen en fremgangsmåde til fremstilling af peptider afledt af renset minactivin, hvilken fremgangsmåde omfatter rensning af minactivin til homogenitet og opnåelse af aminosyresekvenser, der er unikke for minactivin.

35 En foretrukken udførelsesform for denne fremgangs måde omfatter: a) dyrkning af en cellestamme, der er i stand til at ekspressere minactivin, 8 DK 172400 B1 b) høst af supernatanten, c) koncentration af supernatanten, d) dialysering af supernatanten og centrifugering af dyrk-ningssupernatanten til fjernelse af overskydende celle- 5 affald og protein, som er præcipiteret under dialysen, e) fraktionering af dyrkningssupernatanten chromatografi sk og elektrophoreti sk, f) koncentration af fraktionen med mi na ctivi nakt i vitet, g) analyse af fraktionen indeholdende mi na cti vi naktivitet 10 ti·- påvisning af renhed, h) opnåelse af aminosyresekvenser, der er unikke for minactivin, I en foretrukket form omfatter fremgangsmåden: a) dyrkning af en minactivinproducerende kultur eller cellestamme, 15 b) høst af dyrknings supernatanten og koncentration af dyrkning s s upe rna tant en, c) dialyse af dyrkningssupernatanten og centrifugering af dyrkningssupernatanten til fjernelse af overskydende celleaffald og protein, som er præcipiteret under dialysen, 20 d) fraktionering af dyrkningssupernatanten ved ionbytter-c h roma tog ra f i, e) Samling og koncentrering af eluaterne med den højeste minactivinspecifikke aktivitet, f) fraktionering af de samlede, koncentrerede eluater ved 25 gelfiltrer i ngschromatografi, g) koncentration af eluatet og isoelektrofokusering af eluatet, h) prøvning af fraktionerne isoleret fra den isoelektrofoku-serende gel med antistoffer, der er reaktive med minactivin, til stedbestemmelse af mi nacti vi nbåndet, 3q i) koncentration af fraktionen omfattende minactivinaktiviteten, j) yderligere fraktionering af fraktionen indeholdende minactivinaktiviteten ved delingschromatografi og analysering af den rensede fraktion med minacti vi naktivitet ved gel-elektrophorese, 35 k) opløsning af det rensede minactivin og separering af de resulterende peptider ved delingschromatografi.

I en mere foretrukket form sker dyrkningen af human 9 DK 172400 B1 makrofag-cellestamme U937. Foretrukne dyrkningsbetingelser omfatter dyrkning i vravær af serum og/eller i narvær af en tilstrækkelig mængde af en substans eller substanser, som vil hæmme urok i na seprodukt i on eller inducere væsentlig 5 produktion af minactivin. En egnet substans til dette formål er dexamethason, som fortrinsvis anvendes i en koncentration på 1 M. Kulturen kan også dyrkes i nærvær af PMA.

Et foretrukken kon centrati on s område af PMA i kulturen er 1-300 ng/ml, mere fortrinsvis 10-30 nl/ml.

1 q En foretrukken mængde hæstet dyrknings supernatant er 4-5 liter. Det indledningsvise kon centrati onstrin er fortrinsvis et 10-fold koncentrationstrin. Et egnet apparat til denne koncentration er et Amicon DC2 Hollow Fibre Dialyses/ Concentration enhed forsynet med en 30 000 MW afs kær ings patron. •j 5 Dialysen ifølge trin c) er fortrinsvis med et dia lysat, såsom 50 mM glycin, pH 7,8. Mere specielt bør 50 mM glycin pH 7,8 dialysat anvendes i mindst samme mængde som mængden af den prøve, der skal dialyseres mod nævnte dialysat.

lonbytterchromatografi ifølge trin d) udføres for-2q trinsvis på en phenyl-sepharosesøjle, hvor elueringen fortrinsvis er en trin pH eluering. Mere fortrinsvis bør for pH-trinelueringen ionstyrken af supernatanten indstilles til 2M, og navnlig kan denne være ved tilsætning af fast NaCl, og da bør pH indstilles på 5,5, fortrinsvis med citronsyre. En 25 foretrukket ækvilibrant for phenyl-sepharosesøjlen er en opløsning af 50 mM Na citrat pH 5,5, 2M NaCl og 1 mM EDTA. Søjlen kan eliseres indledningsvis med ækvilibreringsbuffer, derefter med 50 mM Na citrat pH 5,5 indeholdende 0,5 m NaCl og 1 mM EDTA og endelig med 50 mM glycin pH 9,0.

3q Koncentrationen af prøven ifølge trin g) udføres fortrinsvis på en Amicon YM10 membran med et afsluttende koncentratvolumen på 3 ml. Det isoelektrofokuserende trin udføres fortrinsvis med en præparativ fladtryksgel fra Ultrodex indeholde Ampholiner i pH-området 4,5 til 6,0.

25 Mere fortrinsvis elektrofokuseres gelen ved 10°C i 23 timer på et LKB Multiphor isoelektrofokuserende apparat. En foretrukket eluent for proteiner fra den elektrofokuserende gel er 1M glycin indeholdende 1 mM EDTA pH 9,0, mere specielt 10 DK 172400 B1 i en 10 ml mængde. Egnede antistoffer ifølge trin h) omfatter gede antip lacentale inhibitor-antistoffer.

Koncentrationen ifølge trin i) kan udføres på en Amicon YM10 membran.

5 Delingschromatografien ifølge trin j) er fortrinsvis HPLC, mere fortrinsvis udført på en Vydac C-4 revers fasesøjle under anvendelse af Waters højtryksvæskechromatograf.

El ut ionsgrad i enten er fortrinsvis aceonitril i 0,1 procent TFA. Gelelektrophorese ifølge trin j) er fortrinsvis SDS-PAGE. 10 Opløsning af den rensede minactivin ifølge trin k) sker fortrinsvis med endoproteinase LysC. Egnede opløsning sbetingelser omfatter 3-5 g minactivin med 0,1 g endo-proteinase LysC i 20 mM Tris-Cl pH 8,5, 5 M urinstof, ved en mængde på 50 l og 22°C i 8 timer. En egnet form for delings-15 chromatografi er revers fase HPLC, navnlig omfattende en

Synchropak RP-P C C —8 > søjle med en gradient af acetonitril i 0,1 procent TFA.

I en femte udførelsesform tilvejebringer opfindelsen minactivin i i det væsentlige ren form. Fortrinsvis er minac-20 tivinet renset til homogenitet.

I en sjette udførelsesform tilvejebringer opfindelsen renset minactivin, når den fremstilles ved en fremgangsmåde ifølge opfindelsen.

I en syvende udførelsesform tilvejebringer opfin-25 delsen peptider afledt af renset minactivin og peptider, der udviser lignende immunologisk eller biologisk aktivitet til peptiderne.

Foretrukne peptider ifølge opfindelsen omfatter peptider af følgende sekvenser: 30 AQILELPY-GDV-MFLLLP-E ...

GRANFSGMSE-NDLF ...

MAE-EVEVYIPQFKLEE-Y ...

LNIGYIEDLK

IPNLLPEG-V

35 Opfindelsen tilvejebringer også peptider ifølge opfindelsen når de er fremstillet ved en fremgangsmåde ifølge opfindelsen.

I en ottende udførelsesform tilvejebringer opfindel- 11 DK 172400 B1 sen et mikrob i oLog i sk fremstillet peptid, af hvilket hele eller en del indeholder aminosyresekvensen af hele, en del af, analoger, homologer, derivater eller kombinationer deraf afminactivin.

5 Et peptid og fragmenter og derivater deraf, som ud viser en immunologisk eller biologisk aktivitet af minacti-vin, ligger også indenfor opfindelsens rammer.

Det foretrukne peptid eller fragmenter eller derivater deraf er kodet for ved en DNA sekvens, som hybridi-10 serer til en DNA sekvens, der fungerer som en kodningssekvens for aminosyresekvenser af minactivin og udviser den biologiske eller immunologiske aktivitet af minactivin, hvilken aktivitet ødelægges af antisera til minactivin.

Opfindelsen tilvejebringer også en fremgangsmåde 15 til fremstilling af hele, en del af, analoger, homologer, derivater eller kombinationer deraf af uglycosyleret minactivin, hvilken fremgangsmåde omfatter trinnene: at opnå den genetiske information for biosyntesen af minactivin under anvendelse af mRNA fra celler af monocytisk herkomst, at 20 inkorporere det resulterende gen i en mikroorganisme, at udvælge og dyrke mikroorganismen til fremstilling af minacti-vinet, og at indsmle minacti vi net.

Opfindelsen tilvejebringer endvidere en fremgangsmåde til fremstilling af et peptid, der udviser en immunolo-25 gisk eller biologisk aktivitet som minactivin, hvilken fremgangsmåde omfatter trinnene: at dyrke en vært, som er transformeret med et rekombinant DNA molekyle, som omfatter en føste DNA sekvens omfattende en første DNA sekvens, der funge rer som en kodningssekvens for aminosyresekvenser af hele, en 30 del af, analoger, homologer, derivater eller kombinationer deraf af minactivin, en DNA sekvens, som hybridiserer til den første DNA sekvens, en DNA sekvens relateret ved mutation, omfattende enkle eller multiple basesubstituti-ner, deletioner, insertioner og inversioner, til nævnte første DNA-sek-35 vens eller hybridiseringssekvens eller en DNA sekvens, som som efter ekspression koder for hele, en del af, analoger, homologer, derivater eller kombinationer deraf af et poly- 12 DK 172400 B1 peptid, som er minactivin eller som udviser lignende immunologisk eller biologisk aktivitet til minactivin.

Opfindelsen tilvejebringer også en reagent til stedbestemmelse og definering af tumorafgrænsninger i 5 histologiske arter eller in vivo, hvilken reagent omfatter passende market minactivin, navnlig recombinant DNA afledt minactivin, eller fragmenter af minactivin og den dermed forbundne fremgangsmåde til lokalisering og definering af tumorafgransninger i histologiske arter eller in vivo, som 10 omfatter tilførsel eller indgift af passende mærket minactivin eller fragmenter deraf og efterfølgende billeddannelse til bestemmelse af mærkningens koncentrationssted.

Opfindelsen angår endvidere en fremgangsmåde til hæmning af tumorinvasion og behandling af tumorer, omfattend 15 indgift i en patient, der kræver en sådan behandling, af en terapeutisk effektiv mængde minactivin, passende mærket minactivin, framgneter af minactivin eller mærkede fragmenter af minactivin, en fremgangsmåde til behandling af kronisk inflammation, såsom rheumatoid arthritis, omfattende indgift 20 i en patient, der kræver en sådan behandling, af en terapeuæ tisk effektiv mængde minactivin eller fragmenter af minactivin, og en fremagngsmåde til overvågning af kronisk inflammation omfattende detektering af minactivin i prøver af legemsvæsker og væv under anvendelse af antistoffer 25 mod minactivin eller fragmenter af minactivin.

Også omfattet af opfindelsen er antistoffremstillinger mod minactivin omfattende rekombinant minactivin, renset naturligt minactivin og fragmenter Heraf. Opfindelsen tilvejebringer også terapeutiske, diagnostiske eller profylak-30‘ tiske sammensætninger omfattende minactivin, navnlig rekombinant DNA afledt minactivin, fragmenter af minactivin eller antistoffer til minactivin eller fragmenter af minactivin og en farmaceutisk acceptabel non-toxisk bærer eller diluent de rt il.

35 Opfindelsen tilvejebringer endvidere syntetiske o l igonucleotidprøver, hvor prøvernes sekvens omfatter en første nuc leotidsekvens, som efter ekspression koder for amino- 13 DK 172400 B1 syresekvensen af et peptid ifølge opfindelsen, en nucleotid-sekvens, der er ti Istrækkeligr relateret til den første nucleotidsekvens til hybridisering af den første nucleotid-sekvens eller en DNA sekvens relateret ved mutation omfatten-5 de enkle eller multiple base i nserti oner, inversioner, deletioner eller substitutioner til den første nucleotidsekvens.

Liggende indenfor opfindelsens rammer er en fremgangsmåde til fremstilling af de syntetiske oli gonu cleoti ri-prøver, hvilken fremgangsmåde omfatter bestemmelse af amino-10 syresekvensen af peptidfragmenter afledt af renset minactivin og syntetisering af tilsvarende oligonuc l eoti der . I en foretrukket form udføres denne syntese på Applied Biosystems 380A DNA synthesizer.

Opfindelsen tilvejebringer formler omfattende 15 syntetiske o l i gonu cleotidprøver ifølge opfindelsen.

Fortrinsvis er formlerne diagnostiske reagenter.

Opfindelsen tilvejebringer også en fremagngsmåde til detektering af humane carcinomer og inflammatoriske tilstande og modtagelighed derfor, hvilken fremgangsmåde omfat-20 fer anvendelse af en formel omfattende den syntetiske oligonucleotide prøve i et forsøg beregnet til detektering af DNA, der koder for minactivin. MAngel på evne i væv til produktion af minactivin kan relateres til modtageligheden for carcinomer og inflammatoriske tilstande. Detekterede 25 mangler kan behandles ved indgift af renset minactivin i patienten og kan også tjene som markering for væv, der er ramt af carcinomer eller inflammation.

Opfindelsen vil i det følgende blive nærmere forklaret i forbindelse med nogle udførelsesformer og under hen-30 visning til tegningen, hvor fig. 1 er en skitse af minactivinaktivitet, der viser effekten af PMA på minactivi nsekretionen, fig. 2 en gelanalyse af et størrelsesfraktioneret minactivin mRNA præparat, 25 fig. 3 en autoradiograf af immunopræcpiptationsprodukter efter in vitro translation af størrelsesfraktioneret mRNA, der udviser minactivin mRNA i fraktioner centreret u DK 172400 B1 rundt om 18S rRNA standard, fig. 4 en autoradiograf af immunopræcipiterede translationsprodukter, der viser specificiteten af kompleks-dannelse med urokinase under anvendelse af antiuroki-5 naseantistoffer, fig. 5 en autoradiograf af immunopræcipiterede translations-produkter, der udviser specificiteten af kompleksdannelse med urokinase under anvendelse af antiplacen-tale inhibitorantistoffer (autoradiografen viser iden-10 titeten af resultaterne under anvendelse af antipla- centale inhibitorantistoffer med resultater med anti-urokinaseantistoffer), fig. 6 en autoradiograf, der viser identifikationen af minac-ti vintranslat ionsproduktet ved sammenligning af 15 immunopræci pitati onsprodukterne i nærvær og fravær af urokinase under reducerende betingelser, fig. 7 en gel, der viser differentåtionen af urokinasearter med fibrin overla g steknik, fig. 8 et Sephacryl S-200 chromatogram, der viser elutionen 2o af beriget minactivinaktivitet i forhold til total proteinelution, fig. 9 en skitse, der viser differentialelut ionen af minactivinaktivitet fra phenyl-boronat agarose under varierede elutionsbetinge l ser, 25 fig. 10 en chromatograf, der viser elutionen af minactivin-aktiviteten i forhold til totalt protein eluteret fra en chromofokuserende søjle som en funktion af pH af elutionen, fig. 11 en sammenstilling, der viser minactivinaktivitet over \ 3q en gel af proteinfraktionerne isoleret fra en iso- elektrofokuserende gel til påvisning af proteinindhol-det contra minactivinaktivitet, fig. 12a en elut ionsprofil af en immunoaffi nitetssøjle, der viser minactivinaktivitetens elution, 35 fig. 12b en SDS-PAGE gel af minactivin elueret fra immuno-affinitetssøjlen og en Western blot af denne gel.

125 15 DK 172400 B1 fig. 13 en autoradiograf af I -mærket urokinase p§ SDS- PAGE, visende høj- oglavmolekylvægtf ormer og dissoci-ering af høj molekylvægtformer under reducerende betingelser, fig. 14 elueringsprofilet af minactivinaktivitet og protein 5 fra trin pH eluering af phenyl-sepharosesøjlen,

Areluering med 50 mM natriumcitrat, pH 5,5, 1 mM EDTA, 0,5 M nat riumchlorid,

Breluering med 50.mM glycin, pH 9,0. fig. 15 en sammenstilling af minactivinaktivitet over en TO SDS-PAGE gel af proteinfraktionerne isoleret fra en isoelektrisk fokuserende gel til påvisning af proteinindholdet contra minactivinaktivitet, fig. 16fraktionerne fra det isoelektrisk fokuserende eksperiment vist i fig. 15 efter Western overførsel af 15 proteinet pver på nitrocellulose og immunologisk detektering af proteinerne med antipla centa l e inhibitorantistoffer, fig. 17 viser et e l ueringsprof i l fra et højt renset minactivin-præparat fra et Vydac C-4 refers fase højtryk svæske-20 chromatograf-for løb, fig. 18 en SDS-PAGE visende homogent minactivin opnået fra spids 5 i HPLC-forløbet vist i fig. 17, fig. 19 elutionsprofi let af peptider af minactivin elueret fra Synchropak RP-P (C-8) søjle højtryksvæskechroma -25 tograf i-forløb, fig. 20 endocnucleaserestrikti onskortet og DNA-sekvenseringe-strategien af klonerne, der indeholder segmenter af minactivingenet, fig. 21 hybridudvælgelsestran slati on en af minactivin mRNA, 3q fig. 22 konstruktionen af plasm i det pBTA438 indeholdende det tilgrænsende minactivi ngen, fig. 23 viser det totale cDNA af minactivingenet og det afledte aminosyresekvens af mi na ctivinprote i net. De 5 peptider opnået fra aminosyresekvensanalysen er 35 understreget, fig. 24 konstruktionen af mi nactivinekspres s i onsvektorerne DK 172400 B1 16 PBTA444 og pBTA 447, fig. 25 SDS po lyacry Lamidgelelektrpphorese, Western analyse og S35 impulsmærket proteinanalyse af minactivin ekspresseret fra pBTA444 og pBTA447, 5 fig. 26 konstruktionen af hybridproteinekspressionsvektorerne a) pBTA440 og pBTA586, fig. 27 SDS polyacrylamidgelelektrophorese, Western analyse og S35 impulsmærket proteinanalyse af hybridminac-tivinproteiner ekspresseret fra pBTA440 og pBTA586, 10 fig. 28 konstruktionen af pattedyrskloningsvektorer pBTA587, pBTA588 og pBTA590 indeholdende minactivi ngenet, fig. 29 en autoradiograf, der viser ekspressionen af minactivin i dyreceller efterfulgt af immunopræcipita-tionen i nærvær og fravær af urokinase.

1 g Induktion af U937 cellestamme for forøget mi nacti vi nsynte se Minactivin har vist sig at produceres af inducerede humane monocyter, visse makrofager og transformerede celler af monocytisk afstamning, se international patentansøgning W086/01212. Den transformerede cellestamme U937 (ATCC CRL 20 1593) viste sig at producere minactivin, væsentligst i nærvær af dexamethason. Minactivinniveauet, der udskiltes af disse celler under serumfrie betingelser, viste sig kun at være omkring 0,06 procent af det totale protein, der udskiltes af disse celler. Det viste sig, at dette niveau kunne øges med 25 omtrent en størrelsesorden p3 0,4 procent ved tilsætning af 4-phorbol-12-myristat-13-ac etat (PMA). Effekten af PMA på minactivinsektretionen med tiden fulgte en bifaset linie med en indledningsvis forsinkelsesperiode på 6 timer efterfulgt af en lineær stigning i mi na ctivi nakti vitet op til 60 timer 30 se fig. 1. Der observeredes ingen forskelle ved forøgelse af PMA koncentrationen fra 10 nl/ml til 30 ng/ml. Endvidere bestemtes det, at phorbolesterne var tæt forbundet med cellei— ne, eftersom radiomærket PMA kunne detekteres i kun små mængder, mindre end 10 procent, i dyrkningssupernatanterne, 35 selv efter 17 timer.

De følgende eksempler viser foretrukne udførelsesformer for opfindelsen. De bør ikke opfattes som begrænsende DK 172400 Bl 17 for opfindelsens rammer. Med mindre andet er angivet, er alle dele og procenter i forhold til vægt.

EKSEMPEL 1 Cel lekultur 5 Den humane makrofage cellestamme U937 dyrkedes i RPMI 1640 indeholdende 10 procent føtal kalveserum og 1 M dexamethason, enten i T175 kulturflasker eller i en 10 liter Braun gæringsbeholder. Cellerne forefandtes i tætheder p" 1-3 x 10^ celler /ml. Selvom minactivin udskiltes af 10 cellerne under denne vækstfase, overførtes cellerne til serumfrit medium til opnåelse af supernatanter til minacti-vinrensning. Cellerne pelletteredes, vaskedes en gang, resus-penderedes i RPMI 1640 indeholdende 1 M dexamethason og dyrkedes i en periode på 3 dage. Mi nacti vinniveauet, der 15 udskiltes af disse celler under serumfrie betingelser, kunne øges ved tilsætning af en mængde PMA af en omtrentlig størrelsesorden p8 0,4 procent.

Cellerne høstedes og supernatanterne anvendtes i rensnings skemaet som følger.

20 EKSEMPEL 2

Rensning af homogent minactivin a) Koncentration af serumfrie minactivin-supernatanter.

Typisk koncentreredes 4-5 liter dyrknings supernatant 10 gange under anvendelse af en Amicon DC2 Hollow Fiber 25 Di a l ys i s/Con c entrat i on enhed udstyret med en 30 000 MW

afskæringspatron. Koncentratet dialyseredes mod mindst en tilsvarende mængde på 50 mM glycin, pH 7,8, til fjernelse af alle spor af fa rve.

^ b) Centrifugering af mi na cti vinkon c entrat 30 Det dialyserede koncentrat centrifugeredes i en JA10 rotor ved 8000 rpm i 30 min. ved 4°C til pellet rest-celleaffald og protein, som måtte præcipiteres under dialysen. Den klarede supernatant a li quote redes og blev frosset ved -20°C, indtil den krævedes til efterfølgende rensning.

33 c) Phenyl-Sepharose chromatografi med en trin pH eluering Minactivin rensedes yderligere fra en 10-gange koncentreret dyrkningssupernatant opnået fra celler, der var DK 172400 Bl 18 dyrket i fravær af PMA ved trin pH eluering under anvendelse af pheny l-sepharose som følger.

Ionstyrken af supernatanten, 200 ml, 12000 enheder, specifik aktivitet 102 enheder/mg, indstilledes til 2M ved tilsætning af fast NaCl og pH justeredes til 5,5 med citron-5 syre. Denne opløsning tilsattes til en phenyl-sepharosesøjle, 4,4 cm x 5,0 cm, ækvilibreret i 50 mM Na-citrat, pH 5,5, 2M NaCl og 1 mM EDTA og elueredes med den samme buffer, indtil bas i slinieabs orbans en ved 180 nm (A280) vendte tilbage til basislinien. Søjlen elueredes med 50 mM natrium-10 citrat, pH 5,5 indeholdende 0,5 M NaCl og 1 mM EDTA og igen A280 overvåget, indtil absorbansen vendte tilbage til basislinien. Minactivinet elueredes fra søjlen med 50 mM glycin, pH 9,0. Fig. 14 viser elueringsprofilet.

Genvindingen af minactivin ved denne fremgangsmåde 15 var 9553 enheder, som repræsenterer 80 procent af enhederne der var tilført søjlen. Materialet med den højeste specifikke aktivitet opsamledes, 6700 enheder, specifik aktivitet 1343 enheder/mg, og koncentreredes til 3 ml på en Amicon YM10 membran.

20 d) Sephacryl S-200 GeIgennemtrængningschromatografi.

Det opsamlede, koncentrerede minactivin tilførtes til en 2,2 cm x 78 cm søjle Sephacryl S-200 ækvilibreret med 0,1 M natriumborat, pH 9,0. Fraktioner af 5,0 ml opsamledes ved en strømningshastighed p§ 0,46 ml/min. Fig. 8 viser, at 25 minactivin elueredes ved den største proteinspids' endekant. Fraktionerne indeholdende minactivinaktivitet opsamledes, 4480 enheder, specifik aktivitet 1355 enheder/mg, og koncentreredes til 3 ml under anvendelse af en YM10 membran. Kali-l brering af denne søjle med kendte M^ standarder indikerede, 30 at minactivin havde en Mr på 45-48 kD.

e) Isoelektrisk fokusering.

Den koncentrerede minactivinopløsning tilførtes en præparativ fladtryksgel fra Ultrodex indeholdende Ampholiner i pH-omridet 4,5-6,0 og elektrofokuseredes i 23 timer ved 35 10°C på et LKB Multiphor isoelektrisk fokuseringsapparat.

Følgende fuldførelse af forløbet, 30 zoner tværs over længden 19 DK 172400 B1 af gelen udskrabedes og proteinet elueredes fra hver med 10 ml af 1 M glycin indeholdende 1 mM EDTA, pH 9,0. Aliquot-ter af hver fraktion testedes for minactivinaktivitet og elefc-trophoreseredes på 15 procent SDS-polyacry lamidgeler til lokalisering af protein. Fig. 15 illustrerer, at en betydelig 5 mængde protein er fjernet fra fraktionerne, der har minactivin-aktivitet. Under disse omstændigheder blev mi na ctivinfokus'er mellem pH 5 og pH 5,2 og inden for dette område af gelen 15 procent af den totale aktivitet, der var tilført gelen, genvundet.

10 I området for den isoelektrisk fokuserende gel med minactivinaktivitet er faktisk kun to proteinbånd synlige, se fig. 15. Til bestemmelse af, hvilke af disse bånd, der er minactivin, overførtes proteinet på en ækvivalent polyacryl-amidgel til nitrocellulose og prøvedes med antistoffer fra 15 en ged til placental inhibitor. På grund af lignende biologiske egenskaber bedømtes det som sandsynligt, at de to proteiner ville være immunologisk relaterede. Som vist i fig.

16 reagerer proteinbåndet af = 45-48D specifikt med de antiplacenta le inhibitorantistoffer, hvilket antyder, at 20 dette proteinbånd er minactivin. Endvidere stemmer denne observation overens med Mr af 45-48 D bestemt for oprindeligt minactivin på te l gennemtrængeli g heds chromatografi.

f) Højtryksvæskechromatografi

Fraktionerne fra den isoe l ektri ske fokusering oven-25 for, som havde minactivinaktivitet, koncentreredes 10 gange på en Amicon YM10 ultrafiltreringsmembran og fraktioneredes yderligere på en Vydac C-4 revers fasesøjle under anvendelse af en Waters Højtryksvæskechromatograf. Proteinerne elueredes k fra den reverse fasesøjle med en gradient af acetonitril i 3ø 0,1 procent TFA som vist i fig. 17. Hver af absorbans-spid-serne undersøgtes ved SDS-PAGE og spids 5 viste sig at indeholde ren minactivin, se fig. 18.

EKSEMPEL 2A

(a) Gelf iItrering 35 Cellefrie supernatanter behandledes i trinnene (a) og (b) som beskrevet i rensningseksempel 2 ifølge W086/01212 20 DK 172400 B1 og derefter igennem PhenyL-sepharose under anvendelse af en trin pH eluering som beskrevet i rensningseksempel 1 ifølge W086/01212. Fraktionerne med mi na cti vi naktivitet samledes, koncentreredes ved præcipitering med 85 procent mættet ammo-niumsulphat og tilførtes til en 2,2 cm x 80 cm søjle af 5 Sephacryt S-200 ækvilibreret i 0,1 M natriumborat, pH 9,0. Fraktioner af 3,5 ml indsamledes ved en strømningshastighed på 0,46 ml/min. Fig. 8 viser, at minactivin elueredes ved den højeste proteinspids1 endekant og havde en spids specifik aktivitet på 2206 enheder/mg, hvilket repræsenterer en 10 stigning overalt i specifik aktivitet på 31 gange. Under disse betingelser opfører minactivin sig som et molekyle med Stokes radius som Ovalbumin, hvilket antyder en molekyl-størrelse på 45-49 x 10^ dalton.

(b) Phenyl-boronat agarose chromatografi 15 Cellefrie superntanter behandledes gennem trinnene (a) og (b) som beskrevet i rensningeeksempel 2 ifølge W086/01212. En ml af supernatanten gjordes til 10 mM i MgCl^ og pH indstilledes til pH 8,5 med natriumhydroxid.

Denne opløsning tilførtes til en søjle af pheny l-boronat-2o agarose -30 (PBA 30) (0,8 cm x 2,5 cm) ækvilibreret i 50 mM glycin, pH 8,5 indeholdende 10 mM MgClg ved 4°C. Søjlen vaskedes dernæst med 9 ml af den ovennævnte buffer og derefter i serie som følger: a) 10 ml 50 mM glycin, pH 8,5 indeholdende 10 mM EDTA, 25 b) 10 ml 50 mM glycin, pH 8,5 indeholdende 100 mM sorbitol, c) 10 ml 100 mM Tris-HCl, pH 9,5 d) 10 ml 50 mM natriumacetat, pH 5,0.

Fraktioner på 5 ml indsamledes og dialyseredes mod 50 mM glycin, pH 7,8 natten over ved 4°C forud for minacti-2Q vinaktivitet og proteinbestemmelser. Resultaterne vist i fig. 9 viser, at to tydelige akti vitets spidser eluerer fra søjlen under forskellige betingelser. Den første spids, elueret med EDTA, indeholder 35 procent af den totale aktivitet, der påføres søjlen med en stigning i specifik aktivi-2^ tet på 14 gange. Den anden spids repræsenterer 32 procent 21 DK 172400 B1 af den indledningsvise aktivitet med en 4,4 gange stigning i specifik aktivitet.

(c) Chromofokusering

Cellefrie supernatanter behandledes gennem trinnene 5 (a) og (b) som beskrevet i rensningseksempel 1 ifølge W086/01212. 4 ml af denne supernatant dialyseredes mod 25 mM imidazol-HCl buffer, pH 7,4 og tilførtes derefter til en PBE 94 chromofokuseringssøjle, 1 cm x 27 cm, ækvilibreret i ovennævnte buffer. En l.ineær pH gradient etableredes ved 10 tilførsel af 200 ml af en polybuffer pH 4,0 og 4 ml fraktioner indsamledes i 4 ml aliquotter af 1 M Tris-HCl, pH 7,5. Hver 10. fraktion indsamledes, koncentreredes og vaskedes på en Centricon 30 og prøvedes for minacti vi nakt i vitet og proteinkoncentration. Fig. 10 viser, at størsteparten af 15 aktiviteten elueredes npr pH 5. Genvindingen overalt'af aktiviteten var 82 procent, og der var en 2 gange stigning i speci fik aktivitet.

Cd) Isoelektrisk fokusering

Cellefrie supernatanter gehandledes gennem trinnene 20 (a) og (b) som beskrevet i rensningseksempel 2 ifølge W086/01212, og derefter gennem phenylsepharose under anvendelse af en trin pH eluering som beskrevet i rensningseksempel 1 ifølge W086/01212. Fraktionerne med minactivinaktivitet indsamledes, koncentreredes ved præcipi tering med 85 pro-25 cent mættet ammon iumsulphat og dialyseredes natten over mod 50 mM glycin pH 9,0. Denne opløsning tilførtes til en paæparativ fladtryksgel fra Ultrodex indeholdende Ampholiner i pH-området 4,5-6,0 og elektrofokuserede s i 23 timer ved 10°C på et LKB Multiphor isoelektrisk fokuseringsapparat.

3Q Følgende fuldførelse af forløbet, 30 zoner tværs over gelens længde udskrabedes og proteinet elueredes fra hver med 10 ml af 1 M glycin indeholdende 1 mM EDTA, pH 9,0. Aliquotter af hver fraktion prøvedes for minactivinaktivitet og elektropho-reseredes på 15 procent SDS-polyacrylamidgeler til lokalise-35 ring ar protein. Fig. 11 viser, at en betydelig mængde protein er fjernet fra fraktionerne indeholdende minactivinakti-viteten. Under disse betingelser blev genvundet minactivin- 22 DK 172400 B1 fokus'er mellem pH 5 og pH 5,2 og inden for dette omrade af gelen 39 procent af den gelen totalt tilførte aktivitet.

(e) Immunoaffinitetschromatografi

Cellefrie supernatanter behandledes som beskrevet 5 i rensningseksempe l 1. En 4,6 ml aliquot af dette minacti-vinpræparat (2300 enheder, 2,25 mg, specifik aktivitet 1020U/mg, fremstilledes 0,05 M i natriumphosphat, 0,5 i NaCl, 0,01 procent i TritonX-100, 0,1 procent i natrium-azid, 1 idB i EDTA og pH indstilledes til 7,5. Denne opløs 10 ning fortyndedes til 15 ml med ovennævnte buffer og tilsattes til 15 ml Sepharose 4B, til hvilken 10 mg ant iplac enta l inhibitorantistof var kemisk koblet. Slammet rystedes natten over ved 4°C og hældtes i 2,5 cm x 3,1 cm søjler. Ubundet protein fraledtes søjlen, og søjlen vaskedes med buffer, 15 indtil absorbansen ved 280 mn vendte tilbage til basislinien. Søjlen elueredes med 3M KSCN indeholdende 10 mM Tris-Hcl, pH 8,0. Elueringsprof ilet er vist i fig. 12. Fraktionerne elueret ved KSCN koncentreredes 8,5 gange på en Centricon 10, vaskedes med 40 mM glycin, pH 7,8 og analyseredes for 20 minactivi naktivitet og ved SDS-PAGE. Størstedelen af minactivinaktiviteten bandt sig ikke til antistofsøjlen. Imidlertid er en lille mængde mi na ctivi naktivitet, 8,5 enheder, bundet specifikt og elueret med 3M KSCN. Dette indikerer, at under disse betingelser er anti stof søj len overladet med minac-25 tivin. Endvidere taber minactivin over 90 procent af sin aktivitet i nærvær af KSCN over en sammenligningsmæssig periode hvilket antyder, at den lave genvinding af mi na ctivi naktivitet kan skyldes inaktivering af molekylerne i KSCN. SDS-PAGE resultater viser, at langt størstedelen af proteinet eluerer 3q uforsinket fra søjlen. KSCN eluatet indeholder imidlertid et større proteinbånd med en molekylvægt på ca 45 000 som ligner mobekylstørrelsen af minactivin på gelf iltration, se eksempel 2A8a)), fig. 12a. Western analyse af dette minac-tivinpræparat viste en enkelt immunologisk krydsreaktiv art, 35 der migrerede tilfældigt med proteinbåndet, der observeredes, følgende SDS-PAGE, fig. 12b.

Under visse betingelser viser minactivin sig at have 23 DK 172400 B1 en molekyLstørrelse på ca. 60-70000, som detaljeret vist i PCT191-85. Denne uoverensstemmelse kan skyldes ændret bevægelighed på grund af graden af g lycosyler ing af minactivin. EKSEMPEL 3 5 Isolering og sekvens af peptidfragmenter fra minactivin

Minactivin rensedes fra PMA inducerede U937 celler som beskrevet i eksempel 2 ovenfor. Minactivin (3-5 g) opløstes med endoproteinase Lys C (0,1 g) i 20 mM Tris-HCl, pH

8,5 indeholdende 5M urinstof i et endeligt volumen på 10 50 l i 8 timer ved 22°C. De resulterende peptider separe redes ved revers fase højtryksvæskechromatografi på en Synchropak RP-P (C —8) søjle med en gradient af acetonitril i 0,1 procent TFA, fig. 19. Peptiderne indikeret med stjerner sekvenseredes på en Applied Biosystems 470A gasfasesekvenser 15 og sekvenserne er som følger:

Peptid 13: AQILELPY-GDV-MFLLLP-E ...

Peptid 11: GRANFSGMSE-NDLF ...

Peptid 10: MAE-EVEVYIPQFKLEE-Y ...

Peptid 6: LNIGYIEDLK 20 Peptid 9: IPNLLPEG-V EKSEMPEL 4

Molekylær kloning af minactivin. a) Isolering af mRNA

Ud fra fig. 1 kan den optimale transkriptionstid 25 for PMA induceret U937 celler skønnes til at være mellem 15 og 25 timer. Derfor inkuberddes en 4 liter serumfri kultur af U937 celler med en celletæthed på 1,2 x 10^ celler/ml i 19 timer i nærvær af PMA., cellerne høstedes og blev lyn-x frosset i flydende nitrogen indtil videre brug. Ikke-PMA- 3g stimulerede U937 celler fra tre dages serumfrie kulturer bibeholdtes til mRNA isolering. Humane blodmonocyter fremstillet som beskrevet i international patentansøgning W086/01212 dyrkedes i 3 dage in vitro og anvendtes også som en mRNA kilde.

35 Totalt RNA fra hver af ovennævnte kilder ekstrahere- des med en modifikation af Guanidin-HCl-fremgangsmåden. Celle-pellett'en homogenli seredes i 20 mængder pr. gram vægt af 24 DK 172400 B1 bufferen indeholdende 4M guan idin-i sothiocyanat, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM EDTA, 0,5 procent Sarkosyl, 0,1 M 2-mercaptoethanol i en blender ved lav hastighed i tre minutter ved 4°C. Suspensionen centrifugeredes i 10 minutter 5 tilfjernelse af affald. Nucleinsyrer præcipiteredes fra supernatanten ved tilsætning af eddikesyre til 25 mM og 0,75 mængder kold ethanol og inkuberedes natten over ved -20°C. Suspensionen centrifugeredes igen i 30 minutter ved -10°C, og pellet'en opløstes i buffer indeholdende 7,5 M 10 guanidin HCl, 20 mM natriumacetat pH 5,0, 1 mM dithiothrei-tol ved 20 procent af den oprindelige mængde. Efter centrifugering til fjernelse af uopløst materiale repræcipiteredes RNA med 0,55 mængder kold ethanol ved -20°C i 1-3 timer.

RNA blev genvundet ved centrifugering, genopløst i guani-15 din HCl bufferen og repræc i piteret. Det sidste trin gentoges tre gange. Efter den sidste præcipitation opløstes pellet'en i 20 mM EDTA, pH 7,0 og ekstraheredes med en tilsvarende mængde chloroform: butanol (4:1). RNA præcipiteredes dernæst fra den vandige fase ved tilsætning af natriumacetat, pH 5,0 20 til 0,3M og to mængder kold ethanol ved -20°C natten over.

RNA blev genvundet ved centf i fugering og behandlet med 100 mg/ml proteinase K i 20 mM HEPES, pH 7,4, 0,5 procent natriumdodecylsu l fat i 4 timer ved 50°C til fjernelse af alt refctprotein. RNA genvandtes dernæst ved præcipitering i 25 nærvær af 0,2 M natriumacetat, pH 5,0 og to mængder ethanol ved -20°C. Efter fjernelse ved centrifugering fjernedes enhver rest-DNA ved præcipitering af RNA i nærvær af 3M natriumacetat, pH 6,0, natten over ved 4°C. RNA genvandtes , ved centrifugering og præcipiteredes i nærvær af 0,25N 2o natriumchlorid og to mængder ethanol. RNA genvandtes igen ved centrifugering. PolyA+Mrna isoleredes ved to adsorp-tionscykler og eluering fra oligo (dT)-ce11ulo se.

Poly A+mRNA berigedes 10 til 20 gange for minacti-vin mRNA ved sucrose dens itetsgradientcent rifugering.

25 Prøven anbragtes i lag pS en 15 til 34 procent (w/w) sucrose-gradient og centrifugeredes i en Beckman SW41 rotor ved 33 000 rpm i 16 timer ved 4°C. Fig. 2 viser en gelanalyse 25 DK 172400 B1 under denaturer i ngsbelt inge l se r af det størrelsesf raktionere-de mRNA præparat. Minactivin mRNA detekteredes i disse fraktioner/ fraktioner 16 og 17/ centreret rundt om 18S ribosomal RNA standard som bestemt ved in vitro translation og immu-5 nopræci pi tati on - fremgangsmåden beskrevet nedenfor - som vist i f i g. 3.

b) Identifikation af minactivintranslationsproduktet

Hinactivin mRNA identificeredes ved in vitro translation i et cellefrit ret i cu locyt-lysatsystem efterfulgt af 10 immunopræci pi tati on af minactivintranslationsproduktet under anvendelse af dets naturlige substrat/ urokinase.

Kan in-reticu1ocy11 ysat, der er kommercielt tilgængelig fra Amersham/ anvendtes primært ifølge fabrikantens instruktioner med tilsætning af kalvelever tRNA (Boehringer/ 15 Mannheim) i en koncentration på 100 ng/ml. ^S-methi on in ' fra Amersham tilsattes ved en koncentration på 2mCi/ml til at tillade detektering af translationsprodukterne ved autoradiografi. Poly A+mRNA fremstillet som beskrevet ovenfor translateredes ved en koncentration på 50 mg/ml i 90 minut-20 ter ved 30°C. 25 mikroliter af translationsblandingen anvendtes til hver immunopræc ipitati on. Efter inkubering og fjernelse af vasket suspension af hele Staphylococcus aureus celler (Pansorbin/ Calbiochem) til minimering af nonspecifik binding/ inkuberedes prøven med 50 mPU urokinase (Calbiochem) 25 i 90 minutter ved stuetemperatur. Dette trin tillader kompleks dannelse mellem minactivi ntranslationsproduktet og u rok i na -sen. Komplekset fjernedes fra opløsningen ved tilsætning af 1-2 l anti-urokinaseanti serum (Green Cross Corp.)/

^ etler antistoffer mod placental inhibitor og inkuberedes 30 ved stuetemperatur i 30 minutter og natten over ved 4°C

og præcipiteredes derefter ved tilsætning af 25 l vasket Pansorbin. Efter centrifugering vaskedes minactivin-urokinase-antistof-Pansorbin-pellet'en/ splittedes ved kogning i nærvær af 2 procent SDS og 2-mercaptoethanol/ og produkterne 35 analyseredes ved gelelektrophorese efterfulgt af autoradiografi .

Immunopræcipitering af ^S-mærkede translationspro- 26 DK 172400 B1 dukterne med antistoffer mod urokinase gav urokinase-specifik translationsprodukter med Mrs af 60 000 og 79 000. Disse proteinbånd repræsenterer specifikke komplekser af minactivin med urokinase som: 5 1) de forefindes ikke i nærvær af urokinase eller mRNA, 2) de præcipiterer ikke i fravær af antistof, og 3) de konkurrerer med umærket renset minactivin og placental inhibitor (Calbiochem) præparater til urokinasebinding, se f i g. 4.

10 Det immunipræcipiterede produkt viste sig at repræ sentere 0,05 procent af det totale protein syntetiseret fra mRNA opnået fra PMA inducerede U937 celler. Ingen immuno-præc i pitat ionsprodukter kunne detekteres fra mRNA opnået fra non-inducerrede U—937 celler, formentlig på grund af 15 formindskede niveauer af minactivin mRNA i dette præparat.

Immunopræci pitati on af urok i na se-mi na ctivintranslat ionsprodukterne under anvendelse af antistoffer til placental inhibitor gav identiske resultater. Adskillige anti-placentale inhibitor antistofpræparater præcipiterede 20 de distinkte urok inase-mi na cti vintrans lat i onsprodukt-komplekser ved 69 000 og 79 000 MW Cfig. 5).

En sammenligning af de immunopræcipiterede produkter, der opnåedes i nærvær og fravær af urokinase, tillader direkte identifikation af mi na ctivintranslat i onsproduktet 25 som vist i fig. 6. Det findes som et tydeligt bånd ved en

Mr på 43 000. Denne molekylvægt synes at være en smule mindre end den, der observeres for det oprindelige protein, muligvis på grund af g l ycosyleri ngen . I nærvær af urokinase for-; svinder dette bånd, og det karakteristiske urokinase-30 mi na cti vintranslationsprodukt detekteres ved 60 mmm Mr· Det yderligere proteinbånd ved 79 til 80 000 Mr, der tidligere observeredes, synes at repræsentere en non-reduceret form af kopplekset, eftersom prøverne analyseredes under delvist reducerede betingelser.

35 Endvidere viste det sig, at kompleksdannelsen med minactivi ntranslationsproduktet afhang af nærværet af den lavmolekylære vægtform af urokinase, ΗΡΑ 33. Rene præpa- 27 DK 172400 B1 rater af HPA 52 og HPA 33 opnåedes (CaIbiochem) og bevistes at være hovedsagelig en eller anden art ved fibrin overlag/ se fig. 7. Herudover tilsattes plasminogen/plasmin til HPA 33 til omdannelse af eventuelle restspor af HPA 52 5 i præparatet til den lavmolekylære vægtform. Det tydelige urokinase-minactivintranslationsproduktkompleks ved 69 000 MW fremkom kun, når urokinasepræparaterne, der anvendtes, indeholdt HPA 33. Forklaringen på dette resultat er ukendt. Tilsætning af trasylol til lysatblandingen til hæmning af 10 mulig proteolyse havde ingen effekt på dette resultat.

Sammenfattende giver in vitro translation af mRNA fra U937 celler klart et biologisk aktivt mi na cti vintran s la-tionsprodukt af ca. 43 000, som let kan identificeres ved dannelsen af dens kompleks med urokinase, som giver en 15 karakteristik på 69 000.

c) Konstruktion af komplementære DNA optegnelser.

cDNA optegnelser konstrueredes fra totalt poly a+mRNA eller sucrose tæthedsgradientfraktioneret mRNA under anvendelse af et antal etablerede fremgangsmåder. For eksem-2o pel blev den første komplementære DNA-streng generelt syntetiseret ud fra mRNA under anvendelse af pri meriniti eret revers transcriptase. Anden streng syntetiseredes derefter f.eks. ved (1) konventionel hårnålesnoningsprimet DNA-syntese med anvendelse af DNA polymerase eller revers 25 transcriptase, (2) RNase H-DNA polymerase I - formidlet anden streng syntese eller (3) 5*-afstuttet priming-frem-gangsmåde. Efter behandling med S1 nuclease om ønsket methy-leres DNA og der dannes stumpe ender ved standardmetoder for opfyldning, f.eks. DNA polymerase, Klenow fragmentet, 30 eller T4-polymerase. Derefter kan cDNA'er klones ved sammenføjning af disse til egnede plasmider, f.eks. pBR322, pUC eller pUR systemer, eller bakteri ofage, f.eks. lambda gt 11, vektorer v.h.a. komplementære homopolymere ender eller cohesive ender frembragt ved syntetiske bindérsegmenter, der 35 indeholder egnede restriktionssteder, under anvendelse af standardprocedurer, og påfølgende transformering af en egnet vært.

28 DK 172400 B1 EKSEMPEL 5

En foretrukket fremgangsmåde til konstruktion af cDNA optegnelser er som følger. cDNA syntetiseredes fra 6 g total poly A+mRNA under anvendelse af Moloney murin leukæmi virus revers transcriptase (BRL,200U/ g mRNA) i 5 nærvær af 50 mM Tris HCl, 75 mM KCl, 10 mM DTT, 3 mM MGCL, 1 mM hver af dATP, dCTP, dGTP og dTTP, 10 g/ml 01 i go(dT) 2_ηg og 100 g/ml BSA. Et 200 l reakti on svolumen inkuberedes ved 37°C i 40 minutter. Anden streng syntetiseredes ved hårnå lesløjfe-pri met syntese under anvendelse af' 10 Klenow-fragmentet af DNA polymerase I. Reaktionen opvarmedes ved 70°C i 10 minutter til separate DNA/RNA duplexer, fortyndedes til to gange volumenet og Klenow tilsatte til 325U/ml i nærvær af 10 Ci af dATP (1800 Ci/mmol). Reaktionen tillodes at inkubere i 1 time ved 15°C. Efter phenol: 15 chloroform (1:1) ekstraktion og ethanol præcipi tat ion opløstes DNA og hårnålesløjfen fjereedes ved behandling med 80 enheder S1 nuclease (P/L Biochemicals) i nærvær af 0,2 M NaCl, 50 mM natriumacetat pH 4,5, 1 mM ZnSO^ og 0,5 procent glycerol og præcipiteredes som beskrevet tidligere.

20 Det dobbeltstrengede cDNA methy leredes dernæst med 20 euneder EcoR1 Methylase (Biolabs) i nærvær af 100 mM Tris-HCl pH 8,0, 10 mM EDTA og 80 M S-adenosylmetn i on in.

DNA repareredes ved tilsætning af 2,5 U T4 DNA polymerase i nærvær af 33 mM Tris acetat pH 8,0, 66 mM kaliumacetat, 25 10 mM magnesiumacetat, 0,5 mM dithi othreitol, 0,1 mg/ml BSA og 0,5 mM hver af dATP, dCTP, dGTP og dTTP i 1 time ved 37°C, efterfulgt af tilsætning af T4 po lynuc l eotidki na se (20U) og 0,1 mM ATP, efterfølgende pheno l: ch loroform (1:1) x ekstraktion og et hano l præc ipi tati on, Eco R1 bindere tilsattes 3g til det genopløste DNA (2 g bindere/1 g cDNA) under anvendelse af T4 DNA ligase (IBI, 1,20/ g, DNA). Reaktionen udførtes på en koncentreret cDNA opløsning (167 g/ml) ved 26°C i 4 timer. Efter behandling med EcoR1 separeredes de frie bindere fra cDNA ved chromatografi på Biogel A150M.

35 Fraktioner med cDNA af gennemsnitlig længde større end 1 000 b.p. samledes og cDNA koncentreredes og præcipiteredes 29 DK 172400 B1 ved tilsætning af to mængder ethanol. Resultatet af cDNA var 2,5 g.

cDNA optegnelser frembragtes i bade lambda gt 11 og gt 10. cDNA (100 ng) ligeredes til EcoR1 - kløvet, phospha-5 taseret lambda gt 11 (1 g) ved en DNA koncentration på 220 g/ml ved 4°C i 16 timer. DNA sammenpakkedes ved anvendelse af forberedte pakningspræparater fra VEctor Cloning Systems. Fager forstærkedes ved adsorption til E. coli stamme Y1088 og screenedes i Y1090. Lambda gt 11 10 optegnelsen indeholdt ca. 8 x 10^ rekombinanter pr. g cDNA (94 procent af de totale fager). Proportionen af rekombinanter som indeholdt cDNA molekyler bestemes ved screening op- 32 tegenelsen med cDNA syntetiseret i nærvær af alpha( p)-dATP. Rundt regnet 90 procent hvide plader hybridi seredes med denne 15 prøve.

For optegnelsen frembragt i lambda gt 10 ligeredes cDNA, 200 ng, til EcoR1, kløvet, phosphataseret lanbda gt 10 (1 g), ved en DNA koncentration på 240 g/ml ved 25°C i 4 timer. DNA pakkedes som ovenfor under anvendelse af E.coli 20 stamme C600 nfl.

Lanbda gt 10 optegnelsen indeholdt ca. 7,5 x 10^ rekombinanter pr. g cDNA. Proportioonen rekombinanter som indeholdt cDNA molekyler bestemes ved screening af optegnelsen med radiomærket cDNA. Mere end 90 procent plader hybridi-25 seredes ved denne prøve.

EKSEMPEL 6

Identifikation af kloner indeholdende minactivi n-genet.

Klonet/k Ionerne indeholdende genet, der koder minactivin, kan identificeres med prøverne beskrevet i 30 de følgende eksempler under anvendelse af etablerede teknikker. EKSEMPEL 6a

Hybrid - udvæ l gelsestranslati on cDNA kloner med sekvenser, der er komplementære til minactivin mRNA, kan identificeres ved hybridisationsudvæl-35 gelse. Det klonede DNA er denatureret, immobili seret til en fast matrix, såsom nitrocellulose, og hybridiseret til præparater af total mRNA. RNA/DNA duplex opvarmes til frigivelse 30 DK 172400 B1 af mRNA, som derefter translateret i det in vitro kanin-reticulocyt-lysatcellefrie system som beskrevet ovenfor. Translationsproduktet kan derefter identificeres som beske-vet i eksempel 4b.

5 EKSEMPEL 6b DNA prøver komplementære til mi na ctivi ngensekvensen.

Under anvendelse af aminosyresekvensen opn§et for peptider af minactivin som beskrevet i eksempel 3, kan oligo-nucleotidsekvenser, som kunne kode for aminosyresekvensen, TO forudsiges og oligonucleotidprøver syntetiseres med konventionel etableret teknologi.

Under anvendelse af disse sekvensdata syntetiseredes et antal oligonucleotidprøver under anvendelse af Applied Biosystems 380A DNA synthesizer. Sekvenserne af disse oligo-15 nucleotider var som følger: <C> <A> CT) (G) (A>

1. TT(G) AA(C) TG(A> ACI AT(G) TA

(T) 20 (A> (A) (G) (T) (G) (C)

2. TA<T) AC(C) TC<T> AC(T) TC

<C> (C) (A) (A) 25 (G) (A) (T) (G>

3. TC<T) A(G>I AT(C) TG(C) GC

(C) <T> (T) (T) <T)

4. TTG AA(O TGI ACI ATG TAI AC(C) TCI ACTC) TC

30 <T> 5. (T) (A) <C> <A)

TC(C> TCI AT(G) TA(A) CCI AT<G) TT

(G> 35 <T) (T) <C> <G)(C)

6. AAI TT(A) GCI C(T)(A> CC

(G) (G)

40 7. ATA TGT TTC CTC GAG CTT GAA CTG AGG GAT GTA CAC CTC GAC TTC GCT CTC

TGC CAT

8. TTC ATC AGG CAA CAG GAG GAA CAT GCT CAC ATC TCC GGC GTA AGG GAG TTC CAG GAT CTT CAT TTT

45 9. CTC CTC CAG CTT GAA CTG GGG GAT GTA GAC CTC CAC CTC

(A) (G) (C)

10. CTT GAA CTG (G)GG <A)AT GTA (G)AC CTC CAC CTC

31 DK 172400 B1

Denspeci f ikke oLigonucLeotidprøve kan være radiomærket og derefter anvendt til screening af cDNA optegnelser ve in situ hybridisering af bakteriekolonier eller bakteriofage plader med standardteknikker til identificering af kloner med 5 hele eller en del af mi na cti vi ngenet.

EKSEMPEL 6c

Immunologisk screening

Klonerne kan screenes med standardprocedurer med antistoffer, som krydsreagerer med det oprindelige minacti-10 vinprotein.

Antistoffer til minactivin fremstilles ved standardmetoder, f.eks. immuniseres hver kanin med 10 til 100 g renset minactivin i nærvær af et egnet hjælpestof, såsom Freund's complete eller montanid. Efter en ekstraindgift 15 af en tilsvarende mængde ca. fire uger senere kan opnås kaninserum, som kan prøves for antistoffer til minactivin. EKSEMPEL 6d

Screening for biologisk aktivitet

Kloner med minacti vi ngenet kan testes eller scree-20 nes for minacti vi naktivi tet under anvendelse af enten radiomærket urokinase eller urokinase og antistoffer til urokinase. Dette kan gennemføres ved anvendelse af standardteknikker til immunologisk screening. Urokinase og antistoffer til urokinase kan opnås kommercielt. Radiomærket urokinase kan 25 fremstilles som beskrevet nedenfor.

Kommercielt opnået urokinase (Calbiochem) affinitetsrensedes ved chromatografi på p-aminobenzamidinsepharose ifølge offentliggjorte protokoller (Holmberg, L., Bladh, B., Astedt, B. Biochim. Biophys. Acta 445, 215-222 (1976), og 30^ Goldfarb, R.H., Quigley, J.P. Biochemistry 19, 5453-5471 (1980)). 75 Ploug-enheder af den rensede urokinase iodinere- des ved konjugation med N-succ ini mi dyl 3-(4-hydroxy, 5-125 (K )iodophenyl)proprionat ifølge Bolton Hunters procedure.

1 25 I -mærket urokinase separeredes fra den frie mærkning ved 35 chromatografi på Sephadex G-25M ækvilibreret i 0,1M natrium- phosphat, pH 7,0, 0,4M nat riumchlorid, 0,1 procent Triton X100 og 1 procent bærer bovinserumalbumin.

125

Analyse af I mærket urokinasepræparat ved SDS- 32 DK 172400 B1 polyamidgelelektrophorese under ikke-reducerende betingelser viste nærværet af de karakteristiske høje (Μρ 55 000) og lave (Mr 33 000) molekylvægtformer for urokinase, se fig. 13. Under reducerende betingelser adskilles den høje molekylvægt-5 form i sine karakteristiske 33 000 og 22 000 Mr underenheder. Iodinering af uroki nasepræparatet resulterede i et tab på 10 til 15 procent plasminogenaktivatoraktivitet som målt ved prøvning af Coleman and Green (Ann. N.Y. Acad. S c i.

370, 617 (1981)), man havde ingen effekt på minacti vinhæm-10 ning af enzymet. Pletprøver med forskellige opløsninger af minactivin anbragtes på nitrocellulosepapir, inkuberedes natten over med radiomærket urokinase, vaskedes, tørredes og autoradiograferedes, viste, at den radiomærkede urokinase kunne detektere minacti vi nbundet til en fast fase ved en 15 følsomhed på 10 mU eller ca. 0,1 ng minactivin.

EKSEMPEL 7

Identifkation af minacti vingenet.

Den foretrukne fremgangsmåde til identifkation af mi na cti vi ngen et er som følger: Efter syntese rensedes 20 oligonucleotidprøverne 7-10 beskrevet i eksempel 6b ved polyacrylamidgelelektrophorese og mærkedes med polynucleo- tidkinase (IBI, lU/pmol DNA) og gamma- ^P-ATP og rensedes ved ionbytterchromatografi under standardprocedurer.

Lambda gt 10 optegnelsen som beskrevet i eksempel 5 25 screenedes ved in situ hybridisering ifølge standardeksperi- mentalprocedurer. Hybridiseringsbetingelserne instilledes til tilladelse af specifik binding med minimum baggrund og bestemtes til at være som følger:

Prøver 7 og 8: 3 timer ved 50°C i 6 x SSC, 5 x Den- 3o hardt's, 0,1 procent SDS, 20 g/ml tRNA efter præhybridi- sering i 1 time ved 42°C i 6xSSC, 5xDenhardt's 0,5 procent SDS, 0,2 mg/ml opskåret kalvethymus DNA.

• Prøver 9 og 10: 16 timer ved 37°C i 10x Denhardt's, 5xSSC, 0,05t natriumpyrophosphat.

32 35 P-mærket oligonucleotidprøver af specifik aktivitet g større end 10 cpm/ g anvendtes ved ca. 0,5 pmol/ml. Filtrene vaskedes i 0,5X eller 2xSSC indeholdende 0,1 procent SDS ved stigende temperaturer til forøgelse af stringensen for 33 DK 172400 B1 udvælgelse af positive kloner.

Plader, der giver positive signaler, valgtes ud, gen-screenedes og den fage DNA rensedes under standardprocedurer, se f.eks. Maniatis et al, Molecular Cloning 1982.

5 To rekombinante bakteriofage kloner MIN1D og MIN611 med sekvenser, som opnåedes krydshybrodiseret tit hinanden, med EcoRI-bundet cONA indsatser på 2100 henholdsvis 1060 basepar. Disse indsatser underklonedes til plasmid pUC18 til dannelse af plasmider pBTA440 og pBTA441 respektivt og 10 kortlagdes ved restriktionsenxymanalyse som vist i fig. 20. Southern blot-analyse af klon MIN1D lokaliserede bindingsregionen af oligonucteotidprøverne 7 og 8 inden for et 320 basepar Xbal-Ncol restritionsfragment som vist i fig. 20.

Hybridudvælgelsestranslation.

15 Renset pBTA 440 immobili seredes på nitrocellulose filtre ved en koncentration på 20 g pr. 3 mm x 3 mm filter ifølge proceduren beskrevet af Maniatis et al (Molecular Cloning 1982). Efter vaskning inkuberedes hvert filter med 50 g totalt mRNA og hybri di seredes i 3 timer ved 50°C. Ef-20 ter grundig vaskning elueredes det specifikt hybridiser3de mRNA ved kogning og translateredes dernæst in vitro med et kommercielt tilgængeligt kanin-reticulocytlysatpræparat fra Arne rsham.

Som vist i fig. 21 vistes det hybridi se rede mRNA 25 at kode speicifikt for et translationsprodukt af M^ 43000 ved gelelektrophorese, karakteristisk for minactivintransla-tionsproduktet beskrevet i eksempel 4b. Endvidere forsvandt dette bånd i nærvær af urokinase, og det karakteristiske urokinaseminactivinkompleks detekteredes ved 69 000 Mr· 3() DNA sekvensanalyse.

Restriktionsfragmenter af pBTA440 subklonedes til enkeltkædede fage vektorer M13mp9, M13mp18 og M13mp19 og DNA sekvensen af den 2 100 bp, der var indsat, bestemtes med Sanger kædeterminationsmetoden. Undersøgelse af DNA-35 sekvensen indikerede, at 2100 bp insatsen ikke indeholdt hele kodningssekvensen af minactivingenet.

34 DK 172400 B1

Primerekstension.

Til opnåelse af resten af DNA sekvensen, der koder den N-terminale region af minactivin, konstrueredes en anden cDNA optegnelse med primerekstension. Optegnelsen fremstille-5 des ved priming af 5 microgram polyA+mRNA med oligonucleo-tid 5' TCC CAG TAA ATA ATT CCC TGT GGA TGC ATT 3', der er komplementært til de tidligere sekvenserede mucleotider 391 til 420. EcoRI-bundet cDNA insatser klonedes derefter i lambda gt10 under anvendelse af standardteknikker.

3 4 10 Omkring 5/3 x 10 af de 7,2 x 10 opnåede kloner screenedes med en andet oligonucleotid 5' GCC TGC AAA ATC GCA TCA GGA TAA CTA CC 3' (komplementært til nucleotider 310-335). Af de opnåede 100 positive kloner rensedes de 15 og klonen (klon 13) med den søtrste cDNA indsats (430 bp) 15 subklonedes til plasmid pUC18 til frembringelse af plasmid pl)Cl8 til dannelse af plasmid pBTA442. DNA sekvensen af PBTA442 bestemtes som beskrevet ovenfor, se også fig. 20.

Kodningssekvensen af mi nacti vi ngenet indeholdt i pBTA440 og pBTA443, et plastmid indeholdende den 430 bp 2o 5' minacti vi nsekvens i pUC18 i modsat orientering til pBTA442, blev gjort sammenhængende ved rekombinering af visse DNA restriktionsfragmenter til dannelse af pBTA438 som vist i fig. 22. E. coli K-12, stamme JM 109 indeholdende pBTA 438 er deponeret hos American Type Culture Collection, 12301 25 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA, den 11. februar 1987 under deponeringsnummer ATCC 53585.

Den komplette cDNA sekvens af minacti vingenet og den deducerede aminosyresekvens af mi nacti vinproteinet er givet i fig. 23. Det komplette ttanslationsprodukt omfatter 3d 415 aminosyrer (Mr46 543). Genet koder de fem peptider opnået fra aminosyresekvensanalysen fra oprindeligt minactivin som vist i fig. 23.

DNA sekvensanalysen afslører, at minactivin er medlem af ser inproteaseinhi bitor-superfamili en (kendt som 35 serpiner), omend specifikke for urokinasetype-plasminogen-aktivatorer.

EKSEMPEL 8

Ekspression af biologisk aktivt minactivin 35 DK 172400 B1 Højniveauekspression af det biologisk aktive molekyle er opnået f.eks. ved integration af cDNA med fuld længde/ der forefindes i pBTA438 i forskellige vektorer/ som kan styre syntesen af proteinet i forskellige værter, såsom bakterier 5 eller eukaryotiske celler, såsom pattedyrscel ler, der er transfereret eller transformeret med vektoren. Vektoren indeholder fortrinsvis en nucleotidsekven s, der er i stand til at kontrollere ekspression af den nucleotidsekvens, der koder for minactivin. Denne anden nucleotidsekvens kan f.eks.

10 omfatte en promoter sekvens, polyadenylati on ssekvenser eller mocueltidsekvenser, som tillader proteinet at ekspresseres som et hybridmolekyle, der er sammensmeltet med et andet protein.

EKSEMPEL 9 15 Bakteriel ekspression af minactivin

Det generelle mål er frembringelsen af en ekspressionsvektor eller k loningsvehike l , der er replikabel i E.coli, som indeholder en DNA sekvens, som koder for ekspressionen af minactivin.

20 Minactivin kan ekspresseres i dets oprindelige form eller som et hybridmolekyle sammensmeltet med et andet protein. Disse konstruktioner er vist i fig. 24 og 26.

En serie af plastmidkonstruktioner anvendte lambda P^ ekspressionsvektorerne pLK57 og pLK58 (Botterman et al, 25 Gene 37, 229-239, 1985, til at ekspressere oprindeligt eller næsten oprindeligt (N-terminalt aminosyremodificeret) minactivin.

Som vist i fig. 24 opløstes plasmid pBTA438 med EcoRI og Dral og et 1610bp EcoRI-Dral restriktionsfragment i.

30 isoleredes fra en agarosegel. Dette fragment ligeredes med T4 ligase til vektor pLK57 som var blevet opløst med EcoRI og EcoRV. Det afledte plasmid pBTA444 indeholder lambda pL promoteren, der kontrollerer ekspressionen af det oprindelige minactivin.

35 Ekspres s i on svektor en pBTA444 anvendtes til transfor mering af E.coli 1-12 stamme N4830, se Joyce et al, PNAS 80, 1830-1834, 1983, som indeholder den termolabile cl repressor af lambda. Celler transformeret med pBTA444 dyrkedes natten 36 DK 172400 B1 over i et MEB metium, se Mott et al PNAS 82, 88-92, 1985, med 100 g/ml ampicillin ved 28°C. Cellerne fortyndedes i MEB medium, dyrkedes ved 28°C til en OD^qq af 1/0, når forvarmet, 65°, MEB medium tilsattes i en tilsvarende mængde 5 til ækvi l ibrering af temperaturen til 42°. Efter 4 timers vækst ved 42°C høstedes cellerne og membran- og opløselige proteinfraktioner frembragtes ved resuspendering af vaskede celler Cefter -70°C frysning og optøning) i 200 af 20 procent sucrose 30 mM tris-HCl pH 8,1 og mg/ml lysozymopløsning 10 efterfulgt af tilsætning af 3 ml 3M EDTA, pH 7,3. Celleeks-traktet klaredes ved kort sonificering og membran- og uopløselige proteiner pelletteredes ved centrifugering <27000 x g) i 60 minutter. De opløselige proteiner præcipi-terde ved tilsætning af tri chloroeddikesyre, 105 procent 15 w/v til supernatanten og pellet'en opløstes i vand. De pelletterede membraner opløstes også i vand. Prøver af disse fraktioner for begge uinducerede, 28°C og inducerede, 42°C eller analyseredes ved SDS-polyacry lamidgele l ektrophorese og immunologisk detektion af minactivin ved western trans-20 fer med antiserum mod human placental inhibitor. Som vist i fig. 25 er et minactivinproteinbånd, Mr 40-50K, visualiseret ved western transfer under anvendelse af antistoffer ti human placental inhibitor og kanin anti-gede IgG koblet til alkalin phosphatase (Sigma) er til stede i både de induce-25 rede, 42°C, opløselige og membranfraktioner.

En alternativ fremagngsmåde til fremstilling af oprindeligt minactivin er også vist i fig. 24. Plasmid ΡΒΤΑ442 opløstes med XhoII og en 243bp XhoII restriktionsfragment rensedes fra en agarosegel. Dette fragment ligeredes 3(j med T4 ligase til vektor pLK58 opløst med Bg1II. Det afledte plasmid pBTA445 opløstes med PvuII og Smal og et 2800 bp fragment rensedes og ligeredes med T4 ligase til et renset 1320 bp PvuII-Dral restriktionsfragment fra pBTA438. Det afledte plasmid pBTA446 lineari seredes med Bg1II og ligeredes 35 til et syntetisk dobbeltkædet 26 mer oligonuc l eotid indeholdende et bakterielt ribosombindingssted og de initiale nucleotider af det oprindelige minacti vingen, der tilveje-bringer plasmid pBTA447. Når pBTA447 transformeres i en egnet 37 DK 172400 B1 vært, såsom N4830, induceret og analyseret som beskrevet ovenfor/ frembringes igen minactivin som vist i fig. 25.

I begge tilfalde/ for pBTA444 og pBTA447-indeholdende celler, var minactivin til stede i både de inducerede, 42°C, opløseli-5 ge og membranfraktioner.

Til opgørelse af den biologiske aktivitet af minactivin produceret i E coli N4830, inkuberedes opløselige og membranfraktioner i 90 minutter med høj- og lavmoleky Ivægt-former af urokinase som beskrevet i eksempel 4. Prøver pra-10 cipiteredes med acetone, resuspenderedes i vand og førtes til en reducerende SDS-polyacrylamidgel. Minactivin og minac-tivinurokinasekomplekser visualiseredes ved western transfer som beskrevet ovenfor. Som vist i fig. 25 indeholder minactivin i den opløselige fraktion fra induceret E.coli N4830 15 pBTA447 komplekser med urokinase under standardprøvebetingelser. Dette indikerer, at minactivin fremstillet ud fra disse bakterielle celler opretholder biologisk aktivitet.

To eksempler på en fremgangsmåde til produktion af et protein, som er sammensmeltningen af hele eller en del af 20 en proteinkodningssekvens og hele eller en del af en minactivin kodn i ngsse k vens følger. Som vist i fig. 26 opløstes plasmidet pBTA440 med Sspl og Dral og et 1110bp fragment isoleredes fra en agarosegel. Dette fragment ligeredes til vektoren pBTA449 opløst med EcoRV, der frembringer pBTA450.

25 pBTA450 opløstes derefter med Aval og et renset 2800 bp fragment ligeredes til plasmidet pLK57 opløst med Aval til dannelse af plasmid pBTA586. Dette danner del af minac-ti vinkodningssekvensen under kontrollen af lambda P^ promoteren og sammensmeltes til kodning s sekvens en afde første 80 amino- l 30 syrer af traTgenet, af hvilke de første tyve danner en signalsekvens, som resulterer i sammensmeltningen, der forekommer i den ydre membran af E.coli. Denne s ignalsekvens kløves fra under transport til den ydre membran, som er det normale sade for traT proteinet.

35 Når plasmid pBTA586 er transformeret til en egnet vart, såsom N4830, og induceret med temperaturskift som ovenfor, sker traT-minactivinsammensmeltningsproteinet i den 38 DK 172400 B1 ydre membran som vist i fig. 27.

Et andet eksempel på en fremgangsmåde til fremstilling af en sammensmeltning er vist i fig. 26. I plasmid pBTA440 sammems,eltes minacti vinkodningssekven sen i en ramme med en 5 del af beta-galac tos i dasegenet, der findes på plasmid PUC18.

Når plasmid pBTA440 er transformeret til en egnet vært, såsom JM101 eller enhver E.coli-stamme, somindeholder laclq-genet og induceret ved tilsætning af isopropyl-thio-10 beta-D-galactopyranosid (endelig koncentration 1 mM), kan minactivi nproduktionen detekteres som beskrevet ovenfor, se fig. 27.

EKSEMPEL 10

Ekspression af rekombinant minactivin i eukaryotiske celler.

15 Et fragment af pBTA438 indeholdende hele kodnings regionen af minactivin, indsattes i en serie vektorer, der er i staBd til stabil integration og ekspression af eukaryotiske gener i pattedyrsceller. Disse omfattede 1) pKC3 afledt af pKO-neo, Van Doren, Hanahan, D., Gluzman, Y., J.Virol.

20 50 606-614 (1984)), hvori minactivin cDNA-sekvensen er anbragt under kontrol af SV40 tidlig promoter; 2) pSipNeoSV(X)1 (Cepko-C -L., Roberts, B.E., Mulligan, R.C., Cell 37 1053-1062 (1984)), et Molony Murin Leukæmi-virus-afledt retroviralt spolesystem, hvori minactivi ngenet er anbragt nedstrøms for 25 den retrovirale LTR promoter og udvælgelse er baseret på det nye gen, som konfererer kanamycinresistens i prokaryotier og G418 resistens i eukaryoter; og 3) pMSG (kommercielt tilgængelig fra Pharmacia), hvori reguleret ekspression af minactivin er opnået ved anvendelse af en dexa-30' methason inducibel promoter indeholdt i muse-brysttumorvi rus (MMTV) 5 ’ -LTR.

Konstruktionen af disse tre vektorer er vist i fig.

28 og detaljerne er som følger. Kodningsregionen af mi na c t i -vi ngenet var isoleret fra pBTA438 som en 1610 bp EcoRI-Dral 35 fragment og indsat i de følgende vektorer som beskrevet nedenfor.

1610bp EcoRI-Dral fragmentet ligeredes til pKC3 som var opløst med EcoRI og Smal og derefter transformeret til E.coli C600 gamma. Det resulterende plasmid betegnedes pBTA587.

39 DK 172400 B1 I den andenkonstruktion blev 1610bp EcoRI-Dral fragmentet gjort glatendet ved brug af Klenow fragmentet af DNA polymerase I, ligeret til Smal bindingsstedet af pMSG og transformeret til en egnet E-coli K-12 vært. Kolonier inde- 5 holdende mi na cti vingenet i pMSG detekteredes ved 32 kolonihybndi sering med det P-mærkede oligonucleotid 29 »er, der tidligere er beskrevet i eksempel 7, komplementært til nucleotider 310-335. Det resulterende plasmid betegnedes pBT A588.

10 I den tredie konstruktion ligeredes den glatendede

EcoRI/Dral fragment beskrevet ovenfor til pUC7, som var opløst med Hindi/ der giver konstruktionen betegnet med pBTA589. Eftersom Hindi bindingsstedet i pUC7 er flankeret af BamHI bindingssteder, tillod dette minactivin-15 genet at isoleres fra følgende BamHI opløsning og ligeres til BamHI bindingsstedet af pZIPNeo SV(X) 1. Følgende transformation i en egnet E.coli K-12 vært, kolonier indeholdende minactivingenet detekteredes ved kolo-n i hybridi sering som beskrevet ovenfor. Det resulterende plas-20 mid betegnedes pBTA590.

Transfektion af eukaryotiske celler .

Alle plasmider transfekteredes til eukaryotiske celler ved ca l c iumphosphatmetoden. Ca. 1-2 x 10^ celler således i en T25 flaske i 5 ml Dulbecco modificeret Eagle medium suppleret 25 med 10 procent (v/v) føtal kalveserum, 3-6 mM glutamin 200 mM 45lU/ml penicillin og 45 mg/ml streptomycin (komplet medium). Ca 1 til 5 g CsCl gradient renset DNA præcipi-teredes med calc iumphosphat og tilsattes til cellerne.

Efter 4 timer behandledes cellerne til et glycerol-chok 30 09 dyrkedes i komplet medium i 3 dage. Kultursupernatanten fjernedes til måling af transient ekspression. Cellerne trypsiniseredes og deltes derpå 1/3 i T75 flasker med komplet medium indeholdende den egnede antibiotiske udvælgelse, se nedenfor. Cellerne vaskedes hver 6. til 7. dag med det samme 35 medium og transfektanter opsamledes ved 14 til 28 dage og dyrkedes individuelt, indtil flydende vækst var opnået.

Betingelserne for transfektion for hver af pBTA587, PBTA588 og pBTA590 var som følger: 40 DK 172400 B1 pBTA587. Eftersom pKC3 ikke indeholder en udvælgelig markør, co-transfekteredes pBTA587 med pZIPNeo SV(X)1 ved et molært forhold på 7,5:1, pBTA587:pZIPNeo SV(X)1. Transfektanter udvalgtes med komplet medium indeholdende 0,4 mg/ml G418.

5 Transfektioner udførtes i COS celler.

pBTA588. Eftersom pMSG indeholder e.coli xanthin-guanin-phosphoribosyIt ransferase (gpt) genet ekspresseret fra SV40 tidlige promotere, udvalgtes stabilt transfekterede celler i HAT medium indeholdende hypoxanthin, aminopterin 10 og mycophenolsyre. Transfekti oner udførtes med NIH3T3 celler. pBTS590. Transfektanter udvalgtes med komplet medium indeholdende 0,4 mg/ml G418. Transfektioner udførtes i NIH3T3 celler.

Analyse af ekspression af rekombinant minactivin i eukaryotiske 15 cel ler.

Efter transfektion detkteres transient ekspression f rekombinant minactivin ved dyrkning af cellerne i nærvær af ^S-methionin og specifik immunopræcipitation af det rekom-binante radiomærkede minactivin med antistoffer til placen-20 tale inhibitor, i det væsentlige ifølge fremgangsmåden beskrevet i eksempel 4b. For eksempel fjernedes supernatanten efter 48 timer efter transfektion af pBTA587 i COS celler, og cellerne dyrkedes i nærvær af 1 ml methi on i n-fri EMEM (flydende), suppleret med ^S-methionin fra Amersham.

25 Efter immunopræcipitation med 50 g gede ant ip la eenta l inhibitorantistoffer og 200 l vasked Pansorbin analyseredes komplekserne ved SDS-polyac ry l am idgele l ektrophorese (reducerende betingelser) og visualiseredes ved autoradiografi som vist i fig. 29. Rekombinant minactivin detekteres som et bånd 30 af Mr 45-48 000, som ikke observeres i den tilsvarende kontrol transfektion indeholdende vektoren pKC3 alene. Når urokinase, 15 Plough-enheder, Calbiochem, tilsættes til super-natanten før immunopræcipitation, forsvinger dette bånd, som er karakteristisk for biologisk aktivt minactivin. Et bånd 35 observeres ved Mr 69 000, som er indikativt for minactivin-urokinasekomplekset, men som sløres noget af et nonspecifikt proteinbånd ved samme position. Noget af den rekombinante minactivin forekommer at være proteolytisk beskåret efter tilsætning af urokinasepræparatet som bevist af det detekterede M 35-37 000 bånd.

Γ 41 DK 172400 B1

At det producerede rekombinante minactivin var biolotisk aktivt, bestemes ved dyrkning af cellerne i fravær 5 af serum i 4 timer og kvantitering af inhibitionen af uroki-naseaktiviteten ved kolorimetrisk prøvning, i det væsentlige som beskrevet i eksempel 1. Et inhibitionsniveau detektere-des, som svarer til ca. 1 enhed/ml mi na cti vi nakt i vitet på ovennævnte baggrund.

10 EKSEMPEL 11

Rensning og genvinding af biologisk akt ivtprotein

Efter etablering af betingelser for ekspressionen af minactivin i E.coli ved høje niveauer høstes cellerne, der huser det plasmid, der koder minactivintenet, ved et sent 15 tidspunkt i forløbet. En mængde af pakkede celler suspenderes i to mængder lysebuffer, 0,1 M natriumphosphat, pH 7,0 indeholdende 1 nM EDTA og 1 mM phenyImethyIsulphony Iflourid, og lyseres ved tre passager gennem en Fransk Presse ved 15.000 psi. Suspensionen centrifugeres ved 23.000 xg i 20 20 minutter og pelletten resuspenderes i to mængder lysebuffer indeholdende 5 procent Triton X-100. Suspensionen centrifugeres igen ved 23.000 xg i 20 minutter og pellet'en suspenderes i tre mængder 0,1 ΙΊ Tris-Cl, pH 8,0 indeholdende 8 M urinstif og 0,1 Μ OTT. Opløsningen skylles med nitrogen og 25 inkuberes i et forseglet rør ved 37°C i 2 timer. Efter inku-bering sankes pH af opløsningen til ca. pH 3,5 ved tilsætning af 50 l af iseddikesyre for hver ml opløsning. Suspensionen klares ved centrifugering som ovenfor og supernatan-ten tilført til en Sephadex G-75 søjle (3,2 cm x 90 cm) 30 ækvilibreres i 0,1 M eddikesyre. Fraktionerne indeholdende minactivin lokaliseres ved SDS-PAGE. Fraktionerne indeholdende minactivin samles og dialyseres mod 10 mM Tris-Cl, pH 8,0 indeholdende 8M Urinstof og 0,1 mM DTT ved stuetemperatur i 16 timer. Den analyserede opløsning tilføres derefter 35 til DEAE-Sephadex søjle, 2,2 cm x 25 cm, ækvilibreret i ovennævnte buffer og søjlen vaskes til eluering af ubundet materiale. Minactivinet elueres derefter fra søjlen med en lineær 42 DK 172400 B1 gradient af natriumchLorid fra 0 til 0,5 M i den samme buffer. Fraktionerne indeholdende minactivin identificeres ved SOS-PAGE og dialyseres ekstensivt mod destilleret vand. Proteinet, som pricpiteres under denne proces, genvindes ved 5 lyophili sering. Oet lyophili serede protein genopløses i 0,1 procent trifluoroeddikesyre og tilføres en Vydac C-4 revers fasesøjle forbundet med en Waters Højtryksvæske-chromatograf. Den rene minactivin elueres fra søjlen med en lineær gradient af acetonitril fra 0 til 80 procent i 0,1 10 procent tri f luoroeddi kesyre. ^22$ sP^c*sen svarende til minactivin identificeres ved SOS-PAGE, fraktionerne indsamles og lyophili seres.

Den'lyophi liserede, rensede minactivin opløses i 0,1 M tris-Cl, pH 8,0 indeholdende 8M urinstof i en koncen-15 tration på 10 mg/ml og fortyndes til 10 gm/ml til 0,1 M

Tris CL, pH 8,0 indeholdende 1 mM reduceret glutathion og 0,1 mM oxideret glutathion. GenfoIdningsreaktionen tillades at fortsatte ved stuetemperatur i 24 timer og derefter koncentreres opløsningen og diafiltreres mod 0,1 M natriumphosphat 20 pH 7,0 på en Amicon omrørt celle under anvendelse af en YM10 membran. Den resulterende opløsning indeholdende aktivt minactivin afprøves med prøven beskrevet ovenfor, eksempel 1.

Genvindingen af biologisk aktivt minactivin udskilt ved høje niveauer fra pattedyrsceller omfatter de samme 25 procedurer som beskrevet i eksempel 2 for rensning af det oprindelige minactivin fra U937 celler. Dette involverer indledningsvis en ti gange koncentration af cellefri supernatant med en Amicon DC-2 hilfi berkone entrator udstyret med en 30 000 dalton afskæringspatron. Koncentratet dialyseres 30 derefter mod mindst et tilsvarende volumen p§ 50 mM glycin, pH 7,8, til fjernelse af alle spor af farve. Det dialyserede koncentrat centrifugeres i en JA10 rotor ved 8000 rpm i 30 minutter ved 4°C for pelletrest, celleaffald og protein der måtte have præcipiteret under dialysen. Den klarede super-35 natant aliquotteres og fryses ved -20°C til den kræves til ydirkxgixt efterfølgende rensning.

43 DK 172400 B1

Minactivin renses yderligere fra to gange koncentreret kultursupernatant ved trin pH eluering med Phenyl-Sepharose som følger.

Ionstyrken af supernatanten indstilles til 2M 5 ved tilsætning af fast NaCl og pH justeres til 5,5 med

citronsyre. Denne opløsning tilføres til en phenyl-sepharose søjle 4,4 cm x 5,o cm ækvilibreret i 50 mM Na citrat, pH

5,5, 2 M NaCl og 1 mM EDTA og elueres med den samme buffer indtil basis linieabsorbansen ved 280 nm (A280) er vendt 10 tilbage til basislinien. Minactivinet elueres dernæst fra søjlen med 50 mM glycin, pH 9,0. Fraktioner med den højeste specifikke aktivitet minactivin samles og koncentreres på en Amicon YM10 membran.

Den samlede, koncentrerede minactivin tilføres der-15 næst til en 2,2 cm x 78 cm søjle af Sephacryl S-200 ækvilibreret med 0,1M natriumborat, pH 9,0. Fraktioner af 5,0 ml samles ved en strømningshastighed på 0,46 ml/min.

Fraktionerne indeholdende mi na ctivi nakti vi tet samledes og koncentreredes til 3 ml med en YM10 membran. Kalibrering af 20 denne shøje med kendt Mp standarder indikerer, at minactivin har en Mr på 45-48 kD.

Den koncentrerede mi na cti vi nopløsning tilføres til en præparativ fladtryksgel af Ultrodex indeholdende Ampholiner i pH-området 4,5-6,0 og elektroflkuseres i 23 25 timer ved 10°C på en LKB Multiphor isoelektrofokuserings-apparat. Efter fuldførelse af forløbet, 30 zoner tværs over længden af gelen afskrabes og proteinet elueres fra hver med 10 ml 1M glycin indeholdende 1 mM EDYA, PH 9,0. ALiquotter af hver fraktion prøvedes for minacti vi naktivitet og elek-30 trophoreseredes på 15 procent SDS-polyacrylamidgeler til lokalisering af protein. Under disse betingelser fokuserer minactivin mellem pH 5 og pH 5,2 og renses i høj grad.

Dette materiale koncentreres igen på en Amicon YM10 membran og lagres ved -20°C i 50 mM glycin, pH 9,0, indeholdende 35 1 mM EDTA og 50 procent glycerol.

INDUSTRIEL ANVENDELSE

Som en specifik inaktivator af urokinasetype-plasmi- 44 DK 172400 B1 nogenaktivatorer har minactivin en rækkevidde for mulig industriel anvendelse som klinisk reagent for dianose og mulig behandling af forskellige humane carc i norner og inflammatoriske tilstande.

5 Studier af celletransformation in vitro ved tumor vira, se Ossowski, et al, J. Exp. Med. 137, 112, 1973, og ved kemisk carc inogener, se Sisskin et al, Int. J. Cancer, 26, 331, 1980, viser begge, at plasminogenaktivatorsekret i on er den mest vedholdende tidlige biokemiske hændelse i for-10 bindelse med transformation. Endvidere har cellestammers evn til metastase in vivo vist sig at korrelere med deres evne til at ekspressere plasminogenaktivator, se Wang et al,

Cancer Research 40, 288, 1980. Det er også velkendt, at tumorceller af adskillige af de mest almindelige humane 15 cancertyper, f.eks. carcinomer i lunge, bryst, prostata og tyktarm, producerer høje niveauer af urokinasetype plasminogenakti vator, se Duffe, M.J., O'Grady, P.Eur.J.Clin.

Oncol. 20(5)577-582, 1984.

Vore tidligere studier, se Stephens, R.S. et al., 20 Blood 66, 333-337, 1985, vedrørende sygdomme i tyktarmslimhinden og tilstande, som disponerer herfor, e.v.s. adenomatøse polypper, polyposis coli og inflammatoriske tilstande i tyktarmen, såsom Crohns sygdom og ulcerativ colitis, har vist, at human tyktarms can certyper producerer 25 signifikant større mængder af urokinasetype-plasminogenak-tivator end den, der fremkommer i det tilgrænsende, ikke-involverede væv. Minactivin viste sig at være i stand til at binde sig til og hæmme denne tumor-associerede plasminogen-aktivator, se Stephens et al, Blood 66, 333-337, #985.

30 Således følger det, at minactivin har industriel anvendelse som en reagent til identifikation og definition af tumorer både in vivo og i histologiske arter. Til påvisning af tumorer in vivo skal minactivin mærkes med en egnet isotop, såsom Technetium-99m, se Richardson, V.J., Brit.J. Cander 35 40, 35, 1979, eller iodin-131, se Begent, R.H.J. Lancet, 2.oktober 1982. Efter indgift af minactivinpræparatet kan lokaliteten og grænserne for tumoren bestemmes ved kendte •ψ.

45 DK 172400 B1 rad ioisotop-metoder, såsom gamma-kamerapåvisning. Således frembyder minactivin en følsom metode til muliggørelse af identifikation af små metastatiske cancere, især sådanne, som opstår efter kirurgisk indgreb- I analysen af histoke- 5 miske arter kan minactivin eller dets antistof mærkes med en 131 isotop, såsom en I eller konjugeres til et egnet enzym eller anden kemisk reagent. Efter kontakt med en histologisk art, såsom et biopsisnit, vil minactivin binde sig til den tumortype plasminogenaktivator ved dennes sekretionssted, 10 og vil derved identificere tumorgrænserne og muligt den metastatiske tilstand af tumoren. Udover dets diagnostiske anvendelser er minactivin også tænkt til brug i den direkte behandling af tumorer. Som en specifik inhibitor af det enzym, der er impliceret i den proces, ved hvilken tumorer 15 invaderer omgivende væv, se Dano, K. et al, Adv in Cancer Res. 44, 139, 1985, kan opnås regulering og især hæmning af tumorvæk st og metastaser. Endvidere kan minactivin anvendes som med ikamentafg i velse s sy stem til afgivelse af lecitin eller toxiner direkte til voksende tumorer. Det 20 forstås, at dette system kan tilbyde mange fordele i forbindelse med specifik og særdeles effektivt tumorici-dale egenskaber.

Andre biologiske processer, i hvilke urokinase-type plasmi nogenaktivatorer er impliceret, involverer 25 sådanne fysiske hændelser, der er associeret med invasion og vævsdestruktion, såsom kroniske inflammatoriske betingelser omfattende rheumatoid arthritis. Eftersom minactivin er en del af det naturlige værtssvar pi vævsødelæggelse, vil det vise sig anvendeligt til overvågning af en sygdoms 30 stade, navnlig under den foreskrevne behandling. Mærkede antistoffer eller DNA prøver afledt af minactivin har industriel anvendelse som diagnostiske reagenter til overvågning af mi na ctivinni veauer i blodplasma, i makrofager af vævsbiopsier og i synovi alvæske til korrelationer med syge tilstande.

35 På lignende vis anføres minactivin i sig selv også at have en terapeutisk virkning, når det indgives in vivo, til at lindre sådanne tilstande.

Claims (16)

1. Fremgangsmåde til fremstilling af renset minactivin med aminosyresekvensekvensen i fig. 23 og fragmenter heraf 5 med samme immunologiske og biologiske virkning, kendetegnet ved, at den omfatter: a) dyrkning af en minactivinproducerende cellelinie; b) indhøstning af den minactivinholdige supernatant og koncentrering af kultursupernatanten ved brug af en hulfiber- 10 dialyse/opkoncentreringsenhed med en filtreringsindsats med passende membranporestørrelse; c) fraktionering af supernatanten ved hydrofob kromatografi på en phenyl-"Sepharose"-kolonne og/eller ionbytterkro-matografi, hvor elueringen ved ionbytterkromatografien er en 15 trinvis pH-eluering; d) fraktionering af det minactivinholdige produkt ved gelfiltreringskromatografi; e) isoelektrofokusering af det minactivinholdige eluat, probering af isoelektrofokuseringsfraktionerne med antistof- 20 fer for lokalisering af minactivinbåndet og eluering af proteinerne fra gelen med 1 M glycin indeholdende 1 mM EDTA ph 9,0, og/eller f) fraktionering af den fraktion, der indeholder minacti-vinaktivitet, ved hjælp af HPCL-fordelingskromatografi.

2. CTA AAC ATT GGA TAC ATA GAA GAC CTA AAG GCT CAG ATT CTA GAA Leu Asn Ile Gly Tyr Ile Glu Asp Leu Lys Ala Gin Ile Leu Glu 814 CTC CCA TAT GCT GGA GAT GTT AGC ATG TTC TTG TTG CTT CCA GAT Leu Pro Tyr Ala Gly Asp Val Ser Met Phe Leu Leu Leu Pro Asp 2 5 859 GAA ATT GCC GAT GTG TCC ACT GGC TTG GAG CTG CTG GAA AGT GAA Glu Ile Ala Asp Val Ser Thr Gly Leu Glu Leu Leu Glu Ser Glu 904 ATA ACC TAT GAC AAA CTC AAC AAG TGG ACC AGC AAA GAC AAA ATG 30 Ile Thr Tyr Asp Lys Leu Asn Lys Trp Thr Ser Lys Asp Lys Met 949 GCT GAA GAT GAA GTT GAG GTA TAC ATA CCC CAG TTC AAA TTA GAA Ala Glu Asp Glu Val Glu Val Tyr Ile Pro Gin Phe Lys Leu Glu 35 994 GAG CAT TAT GAA CTC AGA TCC ATT CTG AGA AGC ATG GGC ATG GAG Glu His Tyr Glu Leu Arg Ser Ile Leu Arg Ser Met Gly Met Glu 1039 DK 172400 B1 GAC GCC TTC AAC AAG GGA CGG GCC AAT TTC TCA GGG ATG TCG GAG Asp Ala Phe Asn Lys Gly Arg Ala Asn Phe Ser Gly Het Ser Glu 1084

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved at kulturen er en makrofagcelleliniekultur.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved at kulturen dyrkes under fravær af serum og/eller i nærvær af en tilstrækkelig mængde af et stof eller stoffer, 30 som vil inhibere urokinaseproduktion eller inducere konstitu-tiv produktion af minactivin, hvilket stof fortrinsvis er dexamethason.

4. Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 1-3, kendetegnet ved at kulturen dyrkes i nærvær af PMA.

5 AGG AAT GAC CTG TTT CTT TCT GAA GTG TTC CAC CAA GCC ATG GTG Arg Asn Asp Leu Phe Leu Ser Glu Val Phe His Gin Ala Met Val 1129 GAT GTG AAT GAG GAG GGC ACT GAA GCA GCC GCT GGC ACA GGA GGT Asp Val Asn Glu Glu Gly Thr Glu Ala Ala Ala Gly Thr Gly Gly 10 1174 GTT ATG ACA GGG AGA ACT GGA CAT GGA GGC CCA CAG TTT GTG GCA Val Met Thr Gly Arg Thr Gly His Gly Gly Pro Gin Phe Val Ala 1219 GAT CAT CCT TTT CTT TTT CTT ATT ATG CAT AAG ATA ACC AAC TGC

5 AGA AAA AAG ATT AAT TCC TGG GTC AAG ACT CAA ACC AAA GGC AAA Arg Lys Lys Ile Asn Ser Trp Val Lys Thr Gin Thr Lys Gly Lys 589 ATC CCA AAC TTG TTA CCT GAA GGT TCT GTA GAT GGG GAT ACC AGG Ile Pro Asn Leu Leu Pro Glu Gly Ser Val Asp Gly Asp Thr Arg 10 634 ATG GTC CTG GTG AAT GCT GTC TAC TTC AAA GGA AAG TGG AAA ACT Met Val Leu Val Asn Ala Val Tyr Phe Lys Gly Lys Trp Lys Thr 679 CCA TTT GAG AAG AAA CTA AAT GGG CTT TAT CCT TTC CGT GTA AAC 15 Pro Phe Glu Lys Lys Leu Asn Gly Leu Tyr Pro Phe Arg Val Asn 724 TCG GCT CAG CGC ACA CCT GTA CAG ATG ATG TAC TTG CGT GAA AAG Ser Ala Gin Arg Thr Pro Val Gin Met Met Tyr Leu Arg Glu Lys 769

5. Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 1-4, ken detegnet ved at det rensede minactivin digereres med endoproteinase LysC. DK 172400 B1

6. Fremgangsmåde ifølge krav 5, kendetegnet ved at de resulterende peptider separeres ved hjælp af HPLC.

7. DNA-molekyle som koder for minactivin, kendetegnet ved at det omfatter DNA-sekvensen: 5 1 GTCAGACAGCAACTCAGAGAATAACCAGAGAACAACCAGATTGAAACA 49 ATG GAG GAT CTT TGT GTG GCA AAC ACA CTC TTT GCC CTC AAT TTA Met GIu Asp Leu Cys Val Ala Asn Thr Leu Phe Ala Leu Asn Leu 10 94 TTC AAG CAT CTG GCA AAA GCA AGC CCC ACC CAG AAC CTC TTC CTC Phe Lys His Leu Ala Lys Ala Ser Pro Thr Gin Asn Leu Phe Leu 139 TCC CCA TGG AGC ATC TCG TCC ACC ATG GCC ATG GTC TAC ATG GGC %

8. Rekombinant DNA-molekyle, kendetegnet ved 30 at det omfatter et DNA-molekyle ifølge krav 7 og vektor-DNA, hvor vektor-DNA-en fortrinsvis omfatter et plasmid valgt blandt pMSG-, pKC-, pLJ-, pBR322-, pUC- og pUR-systemer, pZIP Neo SV(X), pLK57 og pLK58.

9. Rekombinant DNA-molekyle ifølge krav 8, kende-35 tegnet ved at en ekspressionskontrolsekvens er operativt bundet til DNA-sekvensen, og at denne kontrolsekvens fortrinsvis er valgt fra betagalactosidasegenet af E. coli, trp-operonet, den venstre promoter i bakteriofage λ, den DK 172400 B1 lange endegentagelse af Moloney leukæmivirus, musebrysttumor-virus eller SV40 tidligpromoter.

10. Sammensmeltet gen, kendetegnet ved at det omfatter en flytbar promoter, et sæde for translationsstart 5 og et DNA-molekyle ifølge krav 7.

10 AAAAAAAACCTATCTGAGGACTCTGAAAAGTAAATGGTAGCAGATAGATTTGAGAAGGGA 2149 ACTAGAACTTGAAGCACAATCTATCTGGTGCTCTTTCTTACTTTTGCTTGTTTTCTCCCA 2209 ATCTTCCAGTCTGGATACAAAGGCAGCCCAATTTCTAGAAATGTATACCAGCCATGAAGA 15 2269 GATAAAGCTCCAAGAGGAGATTTCTCTTTCTGGTATAAGGTATGTGTGJGTATATGGGGG 2329 GCGATAAGGTTGGGAGTGTGAGGAATACAGAGTCGGAGAAATCCATTATTTCCACCCTCT 2389

20 CTCTTGCCATTGCAACCAGAC, en variant af DNA-sekvensen som koder for aminosyresekvensen som DNA-sekvensen koder for, eller en DNA-sekvens som omfat-25 ter en del af DNA-sekvensen og som koder for en aminosyre- sekvens, der har samme immunologiske og biologiske egenskaber som minactivinet, idet DNA-molekylet fortrinsvis er i hovedsagelig ren form.

11. Vært, kendetegnet ved at den er transformeret med mindst et rekombinant DNA-molekyle ifølge krav 8 eller 9, idet værten fortrinsvis er valgt blandt: bakterier, f.eks. E. coli, Pseudomonas-arter, Bacillus-arter; gær; andre 10 svampe; eukaryote, ikke-differentierende cellelinier, f.eks. insektceller, og humane eller andre pattedyrceller.

12. Vært ifølge krav li, kendetegnet ved at den er den transformerede vært ATCC 53585.

13. Reagent til lokalisering og definering af grænserne 15 for tumorer i histologiske prøver, kendetegnet ved at den omfatter passende mærket homogent minactivin med ami-nosyresekvensen i fig. 23, især homogent minactivin udvundet fra rekombinant DNA, eller et fragment af minactivinet fremstillet i henhold til fremgangsmåden ifølge krav 6.

14. Anvendelse af et rekombinant DNA-molekyle ifølge krav 8 eller 9 for fremstilling af et polypeptid, som udviser ak-tivinets immunologiske eller biologiske aktivitet.

15. Anvendelse af mærket, homogent minactivin fremstillet ifølge krav 1 for lokalisering og definering af grænserne for 25 tumorer i histologiske prøver.

15 Asp His Pro Phe Leu Phe Leo Ile Met His Lys Ile Thr Asn Cys % 1264 ATT TTA TTT TTC GGC AGA TTT TCC TCA CCC TAA AAC TAA GCG TGC Ile Leu Phe Phe Gly Arg Phe Ser Ser Pro ***

20 U09 TGCTTCTGCAAAAGATTTTTGTAGATGAGCTGTGTGCCTCAGAATTGCTATTTCAAATTG 1369 CCAAAAATTTAGAGATGTTTTCTACATATTTCTGCTCTTCTGAACAACTTCTGCTACCCA 1429 . c CTAAATAAAAACACAGAAATAATTAGACAATTGTCTATTATAACATGACAACCCTATTAA 1489 TCATTTGGTCTTCTAAAATGGGATCATGCCCATTTAGATTTTCCTTACTATCAGTTTATT 1549 TTTATAACATTAACTTTTACTTTGTTATTTATTATTTTATATAATGGTGAGTTTTTAAAT 30 1609 TATTGCTCACTGCCTATTTAATGTAGCTAATAAAGTTATAGAAGCAGATGATCTGTTAAT 1669 TTCCTATCTAATAAATGCCTTTAATTGTTCTCATAATGAAGAATAAGTAGGTATCCCTCC 1729

35 ATGCCCTTCTGTAATAAATATCTGGAAAAAACATTAAACAATAGGCAAATATATGTTATG TGCATTTCTAGAAATACATAACACATATATATGTCTGTATCTTATATTCAATTGCAAGTA 1789 1849 DK 172400 B1 TATAATGTCA TAATT T CAAGACCAGCCT GGCCAACA T AGCGAAACCC T ACCT CCAC TAAA 1909 AAT ACAGAAATGAGCCGGGAGTGGTGGCAAAGT GGTGAGCACCTGTGAT CCCAGCCACT G 5 1969 TGGAGGCCGAGGCAGGACAATCACTTGAACCCAGGAGGCGGAGGCTGCAGTGAGCTGAGA 2029 TCGCTCCACTGCACTCCAGCCTGGGCAACAGAGCAAGATTCCATCTCAAAATACATTAAA 2089

15 Ser Pro Trp Ser Ile Ser Ser Thr Met Ala Met Val Tyr Met Gly 184 TCC AGG GGC AGC ACC GAA GAC CAG ATG GCC AAG GTG CTT CAG TTT Ser Arg Gly Ser Thr Glu Asp Gin Met Ala Lys Val Leu Gin Phe 20 229 AAT GAA GTG GGA GCC AAT GCA GTT ACC CCC ATG ACT CCA GAG AAC Asn Glu Val Gly Ala Asn Ala Val Thr Pro Met Thr Pro Glu Asn 274 TTT ACC AGC TGT GGG TTC ATG CAG CAG ATC CAG AAG GGT AGT TAT 25 Phe Thr Ser Cys Gly Phe Met Gin Gin Ile Gin Lys Gly Ser Tyr 319 CCT GAT GCG ATT TTG CAG GCA CAA GCT GCA GAT AAA ATC CAT TCA Pro Asp Ala Ile Leu Gin Ala Gin Ala Ala Asp Lys Ile His Ser 364

30 TCC TTC CGC TCT CTC AGC TCT GCA ATC AAT GCA TCC ACA GGG AAT Ser Phe Arg Ser Leu Ser Ser Ala Ile Asn Ala Ser Thr Gly Asn 409 TAT TTA CTG GAA AGT GTC AAT AAG CTG TTT GGT GAG AAG TCT GCG Tyr Leu Leu Glu Ser Val Asn lys Leu Phe Gly Glu Lys Ser Ala AGC TTC CGG GAA GAA TAT ATT CGA CTC TGT CAG AAA TAT TAC TCC Ser Phe Arg Glu Glu Tyr Ile Arg Leu Cys Gin Lys Tyr Tyr Ser 454 35 499 DK 172400 B1 TCA GAA CCC CAG GCA GTA GAC TTC CTA GAA TGT GCA G AA GAA GCT Ser Glu Pro Gin Ala Val Asp Phe Leu Glu Cys Ala Glu Glu Ala 544

16. Anvendelse af mærkede peptider af minactivin fremstillet ifølge krav 5 for lokalisering og definering af grænserne for tumorer i histologiske prøver.