KR960001820B1 - 재조합 dna 기법에 의해 생성된 민악티빈 - Google Patents

Abstract

내용 없음.

Description

[발명의 명칭]

재조합 DNA 기법에 의해 생성된 민악티빈

[도면의 간단한 설명]

제1도는 민악티빈 분비에 대한 PMA의 효과를 예시하는 민악티빈 활성의 도시도.

제2도는 크기 분별된 민악티빈 mRNA 제제의 겔분석.

제3도는 18S rRNA 표준을 중심으로 한 분율들에서 민악티빈 mRNA를 나타내는 크기 분별된 mRNA의 체외 번역을 따르는 면역침강생성물의 방사선사진.

제4도는 항유로키나항체를 사용하는 유로키나제와의 복합체 형성의 특이성을 나타내는 면역침강된 번역생성물의 방사선사진.

제5도는 항 태반 억제물질 항체를 사용하는 유로키나제와의 복합체 형성의 특이성을 나타내는 면역침강된 번역생성물의 방사선사진(방사선사진은 항 태반 억제물질 항체를 사용하는 결과의 항 유로키나제항체를 사용하는 결과와의 동일성을 나타낸다).

제6도는 환원조건하에 유로키나제의 존재 및 부재하에 면역침강 생성물의 비교에 의한 민악티빈 번역생성물의 확인을 나타내는 방사선사진.

제7도는 피브린 도포법을 사용하는 유로키나제중의 분화를 나타내는 겔의 표현.

제8도는 총 단백질 용리에 대한 강화된 민악티빈 활성의 용리를 나타내는 세파크릴 S-200 크로마토그램.

제9도는 변동된 용리조건하에 페닐-붕산염 아가로오스로부터 민악티빈 활성의 분화용리를 나타내는 도시도.

제10도는 용리 pH의 함수로서 색집중 컬럼으로부터 용리된 총 단백질에 대한 민악티빈 활성의 용리를 나타내는 크로마토그라피.

제11도는 민악티빈 활성에 대한 단백질 함량을 증명하기 위해 등전점 전기영동 겔로부터 단리된 단백질 분율의 겔상의 민악티빈 활성을 나타내는 이중인화.

제12a도는 민악티빈 활성의 용리를 나타내는 면역친화 컬럼의 용리 프로파일.

제12b도는 면역친화 컬럼과 겔의 웨스턴 블롯법으로부터 용리된 민악티빈의 SDS-PAGE 겔의 표현.

제13도는 고 및 저분자량형 및 환원조건하에 고분자량형의 분해를 나타내는 SDS-PAGE상의 I125-표지된 유로키나제의 방사선사진.

제14도는 페닐-세파로오스 컬럼의 단계 pH 용리로부터 민악티빈 활성 및 단백질의 용리프로파일을 나타내며, A : 50mM 시트르산나트륨, pH 5.5, 1mM EDTA, 0.5M 염화나트륨으로의 용리, B : 50mM 글리신, pH 9.0으로의 용리.

제15도는 민악티빈 활성에 대한 단백질 함량을 증명하는 등전점 전기영동 겔로부터 단리된 단백질 분율의 SDS-PAGE 겔상의 민악티빈 활성의 이중인화.

제16도는 니트로셀룰로오스상의 단백질의 웨스턴 이동과 항-태반 억제물질항체로 단백질의 면역학적 검출후 제15도에 나타낸 등전점 전기영동 실험으로부터의 분율의 표현.

제17도는 비닥 C-4 역상 고압액체 크로마토그라피 실행으로부터 고도로 정제된 민악티빈 제제의 용리 프로파일을 나타낸다.

제18도는 제17도에 나타낸 HPLC 실행의 피이크 5로부터 얻은 동종의 민악티빈을 나타내는 SDS-PAGE의 표현.

제19도는 신크로팍 RP-P(C-8) 컬럼 고압액체 크로마토그라피 실행으로부터 용리된 민악티빈의 펩티드의 용리파일을 나타낸다.

제20도는 엔도뉴클레아제 제한지도와 민악티빈 유전자의 단편을 함유하는 클로운의 DNA 서열화 전략을 나타낸다.

제21도는 민악티빈 mRNA의 히브리드(잡종) 선택 번역을 나타낸다.

제22도는 인접한 민악티빈 유전자를 함유하는 플라스미드 pBTA438의 구조를 나타낸다.

제23도는 민악티빈 유전자의 완전한 cDNA 및 민악티빈 단백질의 유도된 아미노산 서열을 나타내는데, 아미노산 서열분석으로부터 얻은 5펩티드에 밑줄이 그어져 있다.

제24도는 민악티빈 발현 벡터 pBTA444 및 pBTA447의 구조를 나타낸다.

제25도는 pBTA444 및 pBTA447로부터 발현된 민악티빈의 SDS 폴리아크릴아미드겔 전기영동, 웨스턴 분석 및 S35 펄스 표지된 단백질 분석을 나타낸다.

제26도는 히드리드 단백질 발현 벡터 a) pBTA440 및 b) pBTA586의 구조를 나타낸다.

제27도는 pBTA440 및 pBTA586으로부터 발현된 히브리드 민악티빈의 SDS 폴리아크릴아미드겔 전기영동, 웨스턴 분석 및 S35 펄스 표지된 단백질 분석을 나타낸다.

제28도는 민악티빈 유전자를 함유하는 포유동물 클로우닝 벡터 pBTA587, pBTA588 및 pBTA590의 구조를 나타낸다.

제29도는 유로키나제의 존재 또는 부재하에 면역침강에 따르는 포유동물 세포에서의 민악티빈의 발현을 나타내는 방사선사진이다.

[발명의 상세한 설명]

[기술분야]

본 발명은 재조합 DNA 기법에 의한 신규한 사람 단백질인 민악티빈의 제조, 우전자의 DNA 서열의 특성화, 재조합 숙주로부터 다량의 생물학적 활성의 민악티빈의 발현 및 정제에 관한 것이다. 본 발명은 또한 생물학적 활성의 천연 민악티빈의 정제와 또한 민악티빈으로부터 유도된 펩티드 및 그들의 아미노산 서열에도 관련된다.

[배경기술]

민악티빈(PAI-2)은 유로키나제-형 플라스미노겐 활성화제의 천연발생 비활성화제이다. 이 형태의 플라스미노겐 활성화제는 많은 대부분의 사람암, 가장 현저하게는 폐, 결장, 유방 및 전립선에서 이상하게 높은 수준으로 발견된다. 플라스미노겐 활성화제는 세포전위, 이동 및 침입에 수반된 단백질분해 캐스케이드를 조정하는 것으로 생각되는 세린 프로테아제이다. 그것만으로, 그들은 조직파괴 및 재설계와 관련됨을 나타내고 종양성장 및 전이에 관련되어 왔다. 그들은 또한 염증반응의 역할을 가질 수 있다.

플라스미노겐 활성화제는 일반적으로 두 형태임이 발견된다. 즉, 1) 유로키나제-형 및 2) 조직-형, 조직-형 플라스미노겐 활성화제는 주로 혈액 및 혈관벽에서 발견되고, 여기서 혈전증에 대한 섬유소용해 방어시스템을 활성화하는 원이 된다.

유로키나제-형 플라스미노겐 활성화제는 정상의 혈전분해 과정에서 역할을 하는 것으로 나타나지 않으나 침입 및 조직파괴 특히, 종양전이 및 염증반응과 관련된 병리학적 사건에 관련되어 왔다.

플라스미노겐 활성화제에 특이성인 몇가지 억제인자가 기재되어 있는데, 태반으로부터 단리된 것과(Holmberg, L. Biochim. Biophys. Acta (

), 128-137(1978)) 배양된 혈관내피 세포에 생성된 또다른 것(PAI-1)을 포함한다(Van Mourik. J.A., Lawrence, D.A., Loskutoff, D.J., J. Biol. Chem.

, 14914-14921(1984)). 민악티빈은 혈단구 및 U937 세포에 의해 생성됨이 발견되었고 태반억제인자에 면역학적으로 관련되는 것으로 보인다. 이들 여러가지 억제인자들간의 관계는 현재 미지상태이다.

대부분의 다른 효능있는 생물학적으로 활성인 단백질의 경우와 같이, 민악티빈은 체내에서 매우 소량으로 생성되며 그것만으로는 종래의 생화학적 시도에 의해 정제하고 특징지우기 어렵다. 그러므로, 다량의 정제된 민악티빈은 임상응용분야에서 그 특성 및 생물학적 효력의 더 이상의 평가를 요하기 때문에, 재조합 DNA 기법을 사용하여, 즉, 민악티빈 유전자를 세균 또는 동물세포와 같은 대체 숙주에 클로운시킴으로써 단백질을 제조하는 것이 바람직하다. 민악티빈을 클로운시키기 위해서는 천연발생 민악티빈의 정제될 수 있는 소량의 동종성으로 정제하여 이 정제된 민악티빈으로부터 유도된 항체, 이미노산 서열, 펩티드 단편 및 합성 올리고뉴클레오티드를 생성하도록 하는 것이 바람직하다. 이들 시약이 클로우닝 전략에 사용된다.

[약호]

HPLC-고압액체 크로마토그라피

Mr-상대분자질량

MW-분자량

PWA-4-포르볼-12-미리스테이트-13-아세테이트

SDS-PAGE-황산도데실나트륨 폴리아크릴아미드겔 전기영동

TFA-트리플루오로아세트산

HPA-사람 플라스미노겐 활성화제

bp-염기쌍

kb-킬로 염기쌍

PU-플로우그

[발명의 개시]

제1구체예에서, 본 발명은 민악티빈 모두, 일부, 동족체, 상동체, 유도체 또는 그들의 조합의 이미노산 서열에 대한 코드서열로서 작용하는 제1DNA 서열, 상기 제1DNA 서열에 교잡하는 DNA 서열, 단일 또는 다수의 염기치환, 삭제, 삽입 및 역위를 포함하는 변이에 의한 상기 제1DNA 서열 또는 교잡서열에 관련된 DNA 서열 또는 민악티빈인 폴리펩티드 또는 민악티빈에 유사한 면역학적 또는 생물학적 활성을 나타내는 폴리펩티드의 모두, 일부, 동족체, 상동체, 유도체 또는 그들의 조합을 발현시 코드하는 DNA 서열로 이루어지는 DNA 서열을 제공한다.

본 발명에 따르는 바람직한 DNA 서열 및 단편 그의 유도체는 민악티빈의 면역학적 또는 생물학적 활성을 나타내는 폴리펩티드를 코드한다.

이러한 DNA 서열은 예를 들면 포유동물로부터 총 DNA를 추출하고 재조합 분자의 제조를 위한 표준법에 의해 서열을 단리시킴으로써 제조될 수 있다.

또는 일군의 DNA 서열로부터 민악티빈의 면역학적 또는 생물학적 활성을 나타내는 폴리펩티드를 코드하는 DNA 서열을 선택하는 방법도 본 발명의 범위내인데 이 방법은 상기 활성을 나타내는 폴리펩티드를 코드하는 것으로 알려진 DNA 서열에 교잡하는 상기 DNA 서열을 구하는 단계로 이루어진다.

예를 들어서 천연공급원으로부터 선택된 서열은 합성 DNA 서열, 재조합 DNA 분자로부터의 DNA 서열 및 그의 조합인 DNA 서열일 수 있다.

본 발명의 바람직한 구체예는 민악티빈의 이미노산 서열을 코드하는 서열로서 작용하는 cDNA 서열의 제조방법을 제공하는데 이 방법은 민악티빈을 생성하는 세포를 자극하는 단계, 상기 자극된 세포로부터 RNA를 얻는 단계 및 상기 mRNA로부터 상기 cDNA를 제조하는 단계들로 이루어진다. 바람직하게는 세포는 U937 세포이다.

재조합 숙주에서 민악티빈에 대한 cDNA의 분자 클로우닝 및 단백질의 발현을 위한 더 바람직한 방법은 다음의 방법들을 포함한다.

1. 자극된 민악티빈 생성 및 발현을 위한 셀라인의 유발.

2. 적당한 셀라인으로부터 mRNA의 단리.

3. mRNA의 시험관내번역 및 유로키나제와의 복합체 형성에 의한 민악티빈 번역생성물의 면역침강.

4. (2)로부터 mRNA의 분별 및 민악티빈 번역활성을 포함하는 분율의 확인.

5. (2) 및 (4)로부터의 mRNA로부터 cDNA 라이브러리의 구축.

6. (5)로부터의 cDNA 라이브러리의 적합한 숙주, 예를 들면, 대장균 또는 박테리오파지 람다로의 클로우닝.

7. 다음에 의한 민악티빈유전자를 포함하는 클로운의 확인 :

a) (3)을 사용하는 잡종-선택 번역.

b) 화학적으로 합성된 DNA 서열프로브, 특히 본 발명에 따르는 합성 올리고뉴클레오티드 프로브로 이루어지는 프로브에의 교잡.

c) 유발 및 비유발된 mRNA로부터 합성된 표지된 cDNA를 사용하는 감별 교잡.

d) 민악티빈 또는 다른 면역학적으로 관련된 분자에 대한 항체를 사용하는 cDNA 발현 라이브러리의 면역학적 스크리닝.

e) 표지된 유로키나제 또는 유로키나제 및 유로키나제에 대한 항체를 사용하는 생물학적 활성에 대한 cDNA 발현 라이브러리의 스크리닝.

8. 부분적인 민악티빈의 유전자 서열로부터 얻은 올리고뉴클레오티드 프라이머, 특히 본 발명의 범위내에서 명시된 올리고뉴클레오티드 서열을 사용하는 발생 cDNA 라이브러리에 의한 클로운된 유전자의 확장.

9. 민악티빈유전자의 뉴클레오티드 서열의 결정.

10. 생물학적 활성 생성물을 얻기 위한 대장균에서의 민악티빈 유전자의 발현 및 재생.

11. 대체숙주, 예를 들면, 진핵세포에 클로운시킴에 의한 생물학적 활성인 재조합 민악티빈의 발현.

12. 재조합 민악티빈의 정제 및 그 생물학적 특성의 임상평가.

제2구체예에서, 본 발명은 민악티빈의 모두, 일부, 동족체, 상동체, 유도체 또는 그들의 조합의 아미노산 서열을 코드하는 서열로서 작용하는 제1DNA 서열로 이루어지는 제1DNA 서열, 상기 제1DNA 서열에 교잡하는 DNA 서열, 단일 또는 다수의 염기치환, 삭제, 삽입 및 역위를 포함하는 변이에 의한 상기 제1DNA 서열 또는 교잡서열 또는 민악티빈인 폴리펩티드 또는 민악티빈에 유사한 면역학적 또는 생물학적 활성을 나타내는 폴리펩티드의 모두, 일부, 동족체, 상동체, 유도체 또는 그들의 조합을 발현시 코드하는 DNA 서열에 관련된 DNA 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 제공한다.

본 발명의 바람직한 재조합 DNA 분자는 민악티빈의 모두, 일부, 동족체, 상동체, 유도체 또는 그들의 조합의 아미노산 서열을 코드하는 서열로서 작용하는 제1DNA 서열로 이루어지는 제1DNA 서열, 상기 제1DNA 서열에 교잡하는 DNA 서열, 단일 또는 다수의 염기치환, 삭제, 삽입 및 역위를 포함하는 변이에 의한 상기 제1DNA 서열 또는 교잡서열 또는 민악티빈인 폴리펩티드 또는 민악티빈에 유사한 면역학적 또는 생물학적 활성을 나타내는 폴리펩티드의 모두, 일부, 동족체, 상동체, 유도체 또는 그들의 조합을 발현시 코드하는 DNA 서열에 관련된 DNA 서열에 활동적으로 연결된 발현제어 서열을 포함한다.

본 발명의 바람직한 재조합 DNA 분자는 민악티빈의 아미노산 서열을 코드하는 서열로서 작용하는 플라스미드이다.

본 발명의 바람직한 플라스미드는 본 발명 DNA 서열에 연결된 본 발명의 DNA 서열의 발현을 제어하는 수단을 코드하는 제1DNA 서열을 갖는다.

본 발명은 또한 이동가능한 프로모터, 변역개시부위 및 사람 민악티빈을 코드하는 유전자로 이루어지는 융합유전자를 제공한다.

재조합 DNA 분자의 제조방법도 본 발명의 범위에 있는데, 이 방법은 민악티빈의 모두, 일부, 동족체, 상동체, 유도체 또는 그들의 조합의 아미노산 서열을 코드하는 서열로서 작용하는 제1DNA 서열로 이루어지는 제1DNA 서열, 상기 제1DNA 서열에 교잡하는 DNA 서열, 단일 또는 다수의 염기치환, 삭제, 삽입 및 역위를 포함하는 변이에 의한 상기 제1DNA 서열 또는 교잡서열 또는 민악티빈인 폴리펩티드 또는 민악티빈에 유사한 면역학적 또는 생물학적 활성을 나타내는 폴리펩티드의 모두, 일부, 동족체, 상동체, 유도체 또는 그들의 조합을 발현시 코드하는 DNA 서열에 관련된 DNA 서열을 클로우닝 비히클에 도입하는 단계로 이루어진다.

바람직하게는 이 방법은 또한 발현제어 서열을 클로우닝 비히클에 도입시키는 단계를 포함한다.

본 발명은 더 나아가서 민악티빈의 모두, 일부, 동족체, 상동체, 유도체 또는 그들의 조합의 아미노산 서열을 코드하는 서열로서 작용하는 플라스미드의 제조방법을 제공하는데, 이 방법은 플라스미드를 상기 아미노산 서열을 코드하는 서열로서 작용하는 DNA 서열, 바람직하게는 발현제어 서열과 조합하는 것으로 이루어진다. DNA 서열은 바람직하게는 cDNA 서열이다.

제3구체예에서, 본 발명은 민악티빈의 모두, 일부, 동족체, 상동체, 유도체 또는 그들의 조합의 아미노산 서열을 코드하는 서열로서 작용하는 제1DNA 서열로 이루어지는 제1DNA 서열, 상기 제1DNA 서열에 교잡하는 DNA 서열, 단일 또는 다수의 염기치환, 삭제, 삽입 및 역위를 포함하는 변이에 의한 상기 제1DNA 서열 또는 교잡서열 또는 민악티빈인 폴리펩티드 또는 민악티빈에 유사한 면역학적 또는 생물학적 활성을 나타내는 폴리펩티드의 모두, 일부, 동족체, 상동체, 유도체 또는 그들의 조합을 발현시 코드하는 DNA 서열에 관련된 DNA 서열을 포함하는 적어도 하나의 재조합 DNA 분자로 형질전환된 숙주를 제공한다.

적합한 숙주는 박테리아, 효모, 다른 진균류, 생쥐 또는 다른 동물숙주, 식물숙주, 곤충숙주 및 다른 진핵숙주 예를 들면, 사람조직 세포를 포함하여 포유동물을 포함한다. 적합한 박테리아는 대장균, 슈도모나스종 및 바실러스종을 포함한다.

민악티빈의 생합성에 대한 유전정보를 갖는 미생물이 바람직하다.

숙주를 형질전환시키는 방법은 본 발명에 포함되는데, 이 방법은 민악티빈의 모두, 일부, 동족체, 상동체, 유도체 또는 그들의 조합의 아미노산 서열을 코드하는 서열로서 작용하는 제1DNA 서열로 이루어지는 제1DNA 서열, 상기 제1DNA 서열에 교잡하는 DNA 서열, 단일 또는 다수의 염기치환, 삭제, 삽입 및 역위를 포함하는 변이에 의한 상기 제1DNA 서열 또는 교잡서열 또는 민악티빈인 폴리펩티드 또는 민악티빈에 유사한 면역학적 또는 생물학적 활성을 나타내는 폴리펩티드의 모두, 일부, 동족체, 상동체, 유도체 또는 그들의 조합을 발현시 코드하는 DNA 서열에 관련된 DNA 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 숙주에 도입시키는 단계로 이루어진다.

본 발명은 또한 민악티빈의 모두, 일부, 동족체, 상동체, 유도체 또는 그들의 조합의 생합성을 위한 유전정보로 미생물을 제조하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 민악티빈의 모두, 일부, 동족체, 상동체, 유도체 또는 그들의 조합의 아미노산 서열을 코드하는 서열로서 작용하는 플라스미드 또는 다른 벡터로 미생물을 형질전환시키는 것으로 이루어진다.

제4구체예에서, 본 발병은 정제된 민악티빈으로부터 유도된 펩티드의 제조방법을 제공하는데, 이 방법은 민악티빈을 동종성으로 정제한 다음 민악티빈에 독특한 아미노산 서열을 얻는 것으로 이루어진다.

이 방법의 바람직한 구체예는 다음으로 이루어진다 :

a) 민악티빈을 발현할 수 있는 셀라인을 배양함;

b) 상징액을 거두어 들임;

c) 상징액을 거두어 들임;

d) 상징액을 투석시킨 다음 상기 배양상징액을 원심분리하여 잔류세포 부스러기와 투석동안에 침전될 수 있는 단백질을 제거시킴;

e) 배양상징액을 크로마토그라피 및 전기영동으로 분별함;

f) 민악티빈 활성을 포함하는 분율을 농축함;

g) 민악티빈 활성을 포함하는 분율을 분석하여 순도를 증명함;

h) 민악티빈에 독특한 아미노산 서열을 얻음.

바람직한 형태에서 이 방법은 다음으로 이루어진다.

a) 민악티빈 생성 컬쳐 또는 셀라인을 배양함;

b) 배양상징액을 거두어들이고 상기 배양상징액을 농축시킴;

c) 배양상징액을 투석한 다음, 상기 배양상징액을 원심분리하여 잔류세포 부스러기와 투석의 동안에 침전될 수 있는 단백질을 제거함;

d) 이온교환 크로마토그라피에 의해 배양상징액을 분별함;

e) 가장 높은 민악티빈 비활성의 용출물을 모으고 농축시킴;

f) 겔 여과 크로마토그라피에 의해 모으고 농축시킴 용출물을 분별함;

g) 용출물을 농축한 다음 상기 용출물을 등전점 전기영동시킴;

h) 등전점 전기영동 겔로부터 단리된 분율을 민악티빈과 반응성인 항체로 프로브시켜 민악티빈 띠를 위치시킴;

i) 민악티빈 활성을 함유하는 분율을 농축시킴;

j) 분배 크로마토그라피에 의해 민악티빈 활성을 함유하는 분율을 더 분별한 다음 민악티빈 활성을 함유하는 정제된 분율을 겔 전기영동에 의해 분석함;

k) 정제된 민악티빈을 소화시키고 결과 펩티드를 분배 크로마토그라피에 의해 분리함.

더 바람직한 형태에서 컬쳐는 사람 대식세포 셀라인 U937의 컬쳐이다. 바람직한 배양조건은 혈청의 부재하에 및/또는 유로키나제 생성을 억제하거나 민악티빈의 구성생성을 유발하게 될 충분한 양의 물질 또는 물질들의 존재하에 배양하는 것울 포함한다. 이 목적에 적합한 물질은 바람직하게는 1μM의 농도에서 사용되는 덱사메타손이다. 컬쳐는 또한 PMA의 존재하에 성장될 수 있다. 컬쳐에서 PMA의 바람직한 농도 범위는 1-300ng/㎖, 더 바람직하게는 10-30ng/㎖이다.

거두어 들인 배양상징액의 바람직한 부피는 4-5리터이다. 초기 농축단계는 바람직하게는 10배 농축단계이다. 이 농축의 적합한 장치는 30,000MW 컷 오프 카트리지가 장치된 아미콘 DG2 홀로우 화이버 투석/농축장치이다.

단계 c)에 따르는 투석은 바람직하게는 pH 7.8의 50mM 글리신과 같은 투석물로 한다. 더 바람직하게는 50mM 글리신 pH 7.8 투석물은 적어도 같은 부피 내지 상기 투석물에 대해 투석되는 샘플의 부피로 사용되어야 한다.

단계 d)에 따르는 이온교환 크로마토그라피는 바람직하게는 페닐-세파로오스 컬럼상에서 수행되고 용리는 바람직하게는 단계 pH 용리이다. 더 바람직하게는 pH 단계 용리에 대해, 상징액의 이온강도는 2M로 조절되어야 하고, 특히 이것은 고체 NaCl의 첨가에 의해서 알 수 있고 그때 pH는 바람직하게는 시트르산으로 5.5로 조절되어야 한다. 페닐-세파로오스 컬럼에 대한 바람직한 평형물질은 50mM 시트르산나트륨 pH 5.5, 2M NaCl 및 1mM EDTA의 용액이다. 컬럼은 초기에는 평형완충액으로 용리된 다음, 0.5M NaCl과 1mM EDTA를 함유하는 50mM 시트르산나트륨 pH 5.5로 용리되고 최종적으로 50mM 글리신 pH 9.0으로 용리될 수 있다.

단계 g)에 따르는 샘플의 농도는 바람직하게는 3㎖의 최종 농축액 부피로 아미콘 YM10 막에서 수행된다. 등전점 전기영동 단계는 바람직하게는 pH 범위 4.5 내지 6.0에서 암포린을 함유하는 울트로덱스의 예비 플랫베드 겔상에 수행된다. 더 바람직하게는 겔은 LKB 멀티포등전점 전기영동 장치상에서 10℃에서 23시간 동안 등전점 전기영동시킨다. 등전점 전기영동 겔로부터 단백질에 대한 바람직한 용리액은 1mM EDTA pH 9.0을 함유하는 1M 글리신, 더 바람직하게는 10㎖ 부피에서이다.

단계 h)에 따르는 적합한 항체는 염소 항-태반 억제물질 항체를 포함한다.

단계 i)에 따르는 농도는 아미콘 YM10 막상에서 수행될 수 있다.

단계 j)에 따르는 분배크로마토그라피는 바람직하게는 HPLC, 가장 바람직하게는 워터스 고압액체 크로마토그라피를 사용하여 비닥 C-4 역상컬럼상에서 수행된다. 용리구배는 바람직하게는 0.1% TFA 중의 아세토니트릴이다. 단계 j)에 따르는 겔 전기영동은 바람직하게는 SDS-PAGE이다.

단계 k)에 따르는 정제된 민악티빈의 소화는 바람직하게는 엔도프로테이나제 LysC로 된다. 적합한 소화조건은 pH 8.5의 20mM 트리스-Cl, 5M 요소중의 0.1㎍ 엔도프로테이나제 LysC로 50㎕ 부피 및 22℃에서 8시간 동안 3-5㎍ 민악티빈을 포함한다.

적합한 형태의 분배크로마토그라피는 특히 0.1% TFA중의 아세토니트릴 구배를 가진 신크로팍 RP-P(C-8) 컬럼을 사용하는 역상 HPLC이다.

제5구체예에서 본 발명은 실질적으로 순수한 형태의 민악티빈을 제공한다. 바람직하게는 상기 민악티빈은 동종성으로 정제된다.

제6구체예에서 본 발명은 본 발명에 따르는 방법에 의해 제조될 때 정제된 민악티빈을 제공한다.

제7구체예에서 본 발명은 정제된 민악티빈으로부터 유도된 펩티드와 상기 펩티드에 유사한 면역학적 또는 생물학적 활성으로 나타내는 펩티드를 제공한다.

본 발명에 따르는 바람직한 펩티드는 다음 서열의 펩티드를 포함한다 :

AQILELPY-GDV-MFLLLP-E…

GRANFSGMSE-NDLF…

MAE-EVEVYIPQFKLEE-Y…

LNIGYIEDLK

IPNLLPEG-V

본 발명은 또한 본 발명에 따르는 방법에 의해 제조될 때 본 발명에 따르는 펩티드를 제공한다.

제8구체예에서, 본 발명은 미생물학적으로 제조된 펩티드를 제공하는데 이들 모두 또는 일부를 민악티빈의 모두, 일부, 동족체, 상동체, 유도체 또는 그들의 조합의 아미노산 서열을 포함한다.

민악티빈의 면역학적 또는 생물학적 활성을 나타내는 펩티드 및 단편 및 그들의 유도체도 또한 본 발명의 범위내이다.

바람직한 펩티드 또는 단편 또는 그들의 유도체는 민악티빈의 아미노산 서열을 코드하는 서열로서 작용하고 민악티빈의 생물학적 또는 면역학적 활성을 나타내는(이 활성은 항혈청에 의해 파괴된다) DNA 서열에 교잡하는 DNA 서열에 의해 코드된다.

본 발명은 또한 비글리코실화 민악티빈의 모두, 일부, 동족체, 상동체, 유도체 또는 그들의 조합의 제조방법을 제공하는데, 이 방법은 단구계통 세포로부터 mRNA를 사용하는 민악티빈의 생합성에 대한 유전정보를 얻는 단계 ; 결과 유전자를 미생물에 함입시키는 단계; 상기 미생물을 선택 및 배양시켜 상기 민악티빈을 생성하는 단계; 그리고 상기 민악티빈을 수집하는 단계로 이루어진다.

본 발명은 또한 민악티빈의 면역학적 또는 생물학적 활성을 나타내는 펩티드의 제조방법을 제공하는데, 이 방법은 다음 단계들로 이루어진다 : 즉, 민악티빈의 모두, 일부, 동족, 상동체, 유도체 또는 그들의 조합의 아미노산 서열을 코드하는 서열로서 작용하는 제1DNA 서열, 상기 제1DNA 서열에 교잡하는 DNA 서열, 단일 또는 다수의 염기치환, 삭제, 삽입 및 역위를 포함하는 변이에 의한 상기 제1DNA 서열 또는 교잡서열 또는 민악티빈인 폴리펩티드 또는 민악티빈에 유사한 면역학적 또는 생물학적 활성을 나타내는 폴리펩티드의 모두, 일부, 동족체, 상동체, 유도체 또는 그들의 조합을 발현시 코드하는 DNA 서열에 관련된 DNA 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자로 형질전환된 숙주를 배양하는 단계로 이루어진다.

본 발명은 또한 조직구조 견본 또는 체내에서 종양의 경계를 위치를 정하고 규정하는 시약을 제공하는데, 이 시약은 적합하게 표지된 민악티빈, 특히 재조합 DNA 유도된 민악티빈 또는 민악티빈의 단편으로 이루어지고, 적합하게 표지된 민악티빈 또는 그의 단편을 적용 또는 투여하고 이어서 표지의 농축부위를 추측하여 구하는 것으로 이루어지는 조직구조견본 또는 체내에서 종양의 경계위치를 정하고 규정하는 관련방법을 제공한다.

본 발명은 더 나아가서 치료를 요하는 환자에 치료학적 유효량의 민악티빈, 적당히 표지된 민악티빈, 민악티빈의 단편 또는 표지된 민악티빈의 단편을 투여하는 것으로 이루어지는 종양침입억제 및 종양치료방법; 치료를 요하는 환자에 치료학적 유효량의 민악티빈 또는 민악티빈의 단편을 투여하는 것으로 이루어지는 류마티스성 관절염과 같은 만성염증의 치료방법 ; 그리고 민악티빈 또는 민악티빈의 단편에 대해 제조된 항체를 사용하는 체액 및 조직의 샘플에서 민악티빈의 검출로 이루어지는 만성염증의 모니터 방법을 제공한다.

재조합 민악티빈, 정제된 천연 민악티빈 및 그의 단편을 포함하는 민악티빈에 대해 제조된 항체제제도 본 발명 내에 포함된다. 본 발명은 또한 민악티빈, 특히 재조합 DNA 유도된 민악티빈, 민악티빈의 단편 또는 민악티빈 또는 민악티빈 단편에 대한 항체 및 제약상 허용되는 비독성담체 또는 그를 위한 희석제로 이루어지는 치료, 진단 또는 예방조성물을 제공한다.

본 발명은 더 나아가서 합성 올리고뉴클레오티드 프로브를 제공하는데, 이 프로브의 서열은 발현시 본 발명에 따르는 펩티드의 아미노산 서열을 코드하는 제1뉴클레오티드 서열, 상기 제1뉴클레오티드 서열에 교잡하는 상기 제1뉴클레오티드 서열에 충분히 관련된 뉴클레오티드 서열 또는 단일 또는 다수의 염기삽입, 역위, 삭제 또는 치환을 포함하는 변이에 의해 상기 제1뉴클레오티드 서열에 관련된 DNA 서열로 이루어진다.

상기 합성 올리고뉴클레오티드 프로브의 제조방법은 본 발명의 범위에 포함되는데 이 방법은 정제된 민악티빈으로부터 유도된 펩티드 단편의 아미노산 서열을 구하고 해당 올리고뉴클레오티드를 합성하는 것으로 이루어진다. 바람직한 형태에서 상기 합성은 어플라이드 바이오시스템스 380A DNA 합성기에서 수행된다.

본 발명은 본 발명에 따르는 합성 올리고뉴클레오티드 프로브로 이루어지는 조제를 제공한다.

바람직하게는 상기 조제는 진단용 시약이다.

본 발명은 또한 사람의 암과 염증상태 및 그에 대한 감수성의 검출법을 제공하는데 이 방법은 민악티빈을 코드하는 DNA 검출을 위해 설계된 측정에서 상기 합성 올리고뉴클레오티드 프로브로 이루어지는 조제를 사용하는 것으로 이루어진다. 민악티빈을 생성하는 조직의 능력의 결핍은 암 및 염증상태에 대한 감수성에 관련될 수 있다. 검출된 결핍은 정제된 민악티빈을 환자에게 투여함으로써 치료될 수 있고 또한 암 및 염증에 걸린 조직에 대한 마아커로서도 제공될 수 있다.

[발명을 실시하기 위한 최선의 형태]

[향상된 민악티빈 합성용 U937 셀라인의 유도]

민악티빈은 유발된 사람 단핵세포, 일정한 대식세포 및 단핵세포계통의 형질전환된 세포에 의해 생성됨이 발견되었다(국제특허출원 WO 86/01212 참조). 형질전환된 셀라인 U937(ATCC CRL 1593)은 덱사메타손의 존재하에 구조적으로 민악티빈을 생성함이 발견되었다. 혈청없는 조건하에 이들 세포에 의해 분비된 민악티빈의 수준은 이들 세포에 의해 분비된 총 단백질의 단지 약 0.06%임이 발견되었다. 이 수준은 4-포르볼-12-미리스테이트-13-아세테이트(PMA)의 첨가로 대략 0.4%까지 10배나 향상될 수 있음이 발견되었다.

시간에 대한 민악티빈 분비에 대한 PMA의 효과는 6시간의 초기 지연기간을 가진 2상 과정을 따르고 이어서 60시간까지 민악티빈 활성의 선형증가를 가져온다(제1도).

10ng/㎖ 내지 30ng/㎖의 PMA 농도증가에 의한 차이는 관찰되지 않았다. 더 나아가서, 방사성 표지된 PMA가 17시간 후에도 백양상징액에 단지 소량(10% 미만) 검출될 수 있기 때문에 포르볼 에스테르는 세포와 견고히 관련되어 있음이 구해졌다.

다음의 실시예는 본 발명의 바람직한 구체예를 예시한다. 그들은 본 발명의 범위를 제한함을 뜻하지 않는다. 달리 언급이 없으면, 모든 부 및 백분열은 중량에 의한 것이다.

[실시예 1]

[세포 배양]

사람 대식세포 셀라인, U937을 T175 배양 플라스크 또는 10리터 브라운 발효기에서 10% 우태아혈청 및 1μM 덱사메타손을 함유하는 RPMI 1640에서 배양하였다. 세포를 1-3×10⁶세포/㎖의 밀도로 유지하였다. 민악티빈은 이 성장상의 동안에 세포에 의해 분비되었으나, 세포는 무혈청배지로 이동되어 민악티빈 정제를 위한 상징액을 얻었다. 세포를 펠릿화하고 1회 세척 및 1μM 덱사메타손을 함유하는 RPMI 1640에 제현탁시키고 3일 동안 배양시켰다. 무혈청 조건하에 이들 세포에 의해 분비된 민악티빈의 수준은 PMA의 첨가로 대략 0.4%까지 10배나 향상될 수 있었다.

다음에 세포를 거둬들이고 다음의 정제계획에 상징액을 사용하였다.

[실시예 2]

[동질성 민악티빈의 정제]

a) 무혈청 민악티빈 상징액의 농축

전형적으로, 배양상징액 4 내지 5리터를 30,000MW 컷오프 카트리지가 설치된 아미콘 DC2 홀로우 화이버 투석/농축장치를 사용하여 10배 농축시켰다. 농축액을 다음에 적어도 동부피의 50mM 글리신, pH 7.8에 대해 투석하고 모든 염료기운을 제거하였다.

b) 민악티빈 농축액의 원심분리

투석한 농축액을 4℃에서 30분간 8000rpm에서 JA10 로터에서 원심분리하여 잔류세포 부스러기와 투석의 동안에 침전될 수 있는 단백질을 팰릿화하였다. 분류된 상징액을 다음에 알리컷으로 하여 후속 정제가 필요할 때까지 -20℃에서 동결시켰다.

c) 단계 pH 용리를 사용하는 페닐-세파로오스 크로마토그라피

민악티빈을 PMA의 부재하에 배양된 세포로부터 얻은 10배 농축된 배양상징액으로부터 다음과 같은 페닐-세파로오스를 사용하는 단계 pH 용리에 의해 정제하였다.

상징액(200㎖; 12000 단위; 비활성 102단위/㎎)의 이온강도를 고체 NaCl의 첨가에 의해 2M로 조절하고 pH를 시트르산으로 5.5로 조절하였다. 이 용액을 50mM 시트르산나트륨, pH 5.5, 2M NaCl 및 1mM EDTA에 평형화시킨 페닐-세파로오스컬럼(4.4㎝×5.0㎝)에 가하고 280nm(A280)에서 기준선흡광도가 기준선으로 돌아올 때까지 완충액으로 용리하였다. 다음에 컬럼을 0.5M NaCl과 1㎖ EDTA를 함유하는 50mM 시트르산나트륨, pH 5.5로 용리시킨 다음 흡광도가 기준선에 돌아올 때까지 다시 A280을 모니터하였다.

다음에 민악티빈을 50mM 글리신, pH 9.0으로 컬럼으로부터 용리하였다. 제14도는 용리프로파일을 나타낸다.

이 방법에 의한 민악티빈의 회수율은 9553 단위이었는데 컬럼에 가해진 단위의 80%를 나타낸다. 최고의 비활성도의 물질을 모으고(6700 단위; 비활성도 1343단위/㎎) 아미콘 YM10막에서 3㎖로 농축시켰다.

d) 세파크릴 S-200 겔투과 크로마토그라피

모으고 농축시킨 민악티빈을 0.1M 붕산나트륨, pH 9.0으로 평형화시킨 세파크릴 S-200의 2.2㎝×78㎝ 컬럼에 가하였다. 5.0㎖의 분율을 0.46㎖/분의 유동속도에서 수집하였다. 제8도는 민악티빈이 주단백질 피이크의 꼬리부분에서 용리되었음을 나타낸다. 민악티빈 활성을 함유하는 분율을 모으고(4480 단위; 비활성도 1355단위/㎎) YM 10막을 사용하여 3㎖로 농축시켰다. 이 컬럼을 공지의 Mr 표준으로 결정한 것은 민악티빈이 45-48kD의 Mr을 가짐을 가리켰다.

e) 등전점 전기영동

농축된 민악티빈 용액을 pH 범위 4.5-6.0에서 암포라인을 함유하는 울트로덱스의 예비 플랫 베드겔에 가하고 LKB 멀티포 등전점 전기영동장치에서 10℃에서 23시간 동안 전기영동하였다. 실행완결에 이어서, 겔의 길이를 가로질러 30지대를 긁어내고 1mM EDTA, pH 9.0을 함유하는 1M 글리신 10㎖로 각각으로부터 단백질을 용리하였다. 각 분율의 알리컷을 민악티빈 활성도를 측정하고 단백질의 위치를 정하기 위해 15% SDS-폴리아크릴아미드 겔상에서 전기영동시켰다. 제15도는 충분한 양의 단백질이 민악티빈 활성을 함유하는 분율로부터 제거되었음을 예시한다. 이들 조건하에, 민악티빈은 pH 5와 pH 5.2 사이에 집중되고 겔의 이 영역 내에서 겔에 가해진 총 활성도의 15%가 회수되었다.

사실상, 민악티빈을 함유하는 등전점 전기영동겔의 영역에서 단지 무단백질 띠를 볼 수 있다(제15도). 이들 띠 중 어느 것이 민악티빈인지 결정하기 위해 평형 폴리아크릴아미드 겔상의 단백질을 니트로셀룰로오스로 이동하고 염소에서 태반 억제물질에 만들어진 항체로 프로브시켰다. 유사한 생물학적 특성에 기인하여 두 단백질이 면역학적으로 관련되는 것으로 생각되었다. 제16도에 나타낸 바와 같이 Mr=45-48kD의 단백질 띠가 항-태반 억제물질과 반응하는데 이 단백질 띠는 민악티빈임을 제안하고 있다. 더 나아가서, 이 관찰은 겔투과 크로마토그라피상의 천연 민악티빈에 대해 구한 45-48kD의 Mr과 일치한다.

f) 고압액체 크로마토그라피

민악티빈 활성을 함유한 위의 등전점 전기영동으로부터의 분율은 아미콘 YM10초여과 막상에서 10배 농축시키고 워터스 고압액체 크로마토그라피를 사용하는 비닥 C-4 역상 컬럼상에서 더 분별시켰다. 제17도에 나타낸 바와 같이 0.1% TFA에서 아세토니트릴의 구배를 사용하여 역상 컬럼으로부터 용리하였다. 흡광 피이크의 각각을 SDS-PAGE에 의해 조사하였고 피이크 5가 순수한 민악티빈을 함유하는 것으로 발견되었다(제18도).

[실시예 2A]

(a) 겔여과

무세포상징액을 WO 86/01212의 정제실시예 2에 기술된 바와같이 단계(a) 및 (b)를 통하여 처리한 다음 WO 86/01212의 정제실시예에 기술된 바와 같이 단계 pH 용리를 사용하여 페닐-세파로오스를 통하여 처리하였다. 민악티빈 활성을 함유하는 분율을 모으고 85% 포화 황산암모늄으로 침전시켜 농축하고 0.1M 붕산나트륨, pH 9.0에 평형시킨 세파크릴 S-200의 2.2㎝×80㎝ 컬럼에 가하였다. 3.5㎖의 분율을 0.46㎖/분의 유동속도에서 수집하였다. 제8도는 민악티빈이 주단백질 피이크의 꼬리부분에서 용리되고 31배의 비활성도의 전면적인 증가를 나타내는 2206단위/㎖의 피이크 활성도를 가졌다. 이들 조건하에 민악티빈은 오브알부민에 유사한 스토우크반경을 가진 분자로서 작용하여 45-49×10³달톤의 분자크기를 제안한다.

(b) 페닐-보로네이트 아가로오스 크로마토그라피

무세포상징액을 WO 86/01212의 정제실시예 2에 기술된 바와같이 단계(a) 및 (b)를 통하여 처리하였다. 상징액 1㎖를 MgCl₂중의 10mM로 만든 다음 pH를 수산화나트륨으로 pH 8.5로 조절하였다. 이 용액을 4℃에서 10mM MgCl₂를 함유하는 pH 8.5의 50mM 글리신에 평형화시킨 페닐-보로네이트 아가로스-30(PBA 30)(0.8㎝×2.5㎝)의 컬럼에 가하였다. 다음에 컬럼을 위의 완충액 9㎖로 세척한 다음 다음과 같이 차례로 세척하였다 :

a) 10mM EDTA를 함유하는 pH 8.5의 50mM 글리신 10㎖

b) 100mM 소르비톨을 함유하는 pH 8.5의 50mM 글리신 10㎖

c) pH 8.5의 100mM 트리스-HCl 10㎖

d) pH 5.0의 50mM 아세트산나트륨 10㎖

5㎖의 분율을 수집하고 민악티빈 활성 및 단백질 결정에 앞서 4℃에서 하룻밤 pH 7.8의 50mM 글리신에 대해 투석하였다. 제9도에 나타낸 결과는 두 별개의 활성도 피이크가 다른 조건하에 컬럼으로부터 용리함을 예시한다. EDTA로 용리된 제1피이크는 14배의 비활성도의 증가로 컬럼상에 부하된 총활성도의 35%를 함유한다. 제2피이크는 비활성도의 4.4배 증가로 초기활성도의 32%를 나타낸다.

(c) 색집중(chromofocussing)

무세포 상징액을 WO 86/01212의 정제실시예 2에 기술된 바와 같이 단계(a)와 (b)를 통하여 처리하였다. 이 상징액 4㎖를 pH 7.4의 25mM 이미다졸-HCl 완충액에 대해 투석한 다음 위의 완충액에 평형시킨 PBE94 색집중컬럼(1㎝×27㎝)에 가하였다. 다음에 선형 pH 구배를 pH 4.0의 폴리완충액 200㎖를 가함으로써 확립하고 4㎖ 분율을 pH 7.5의 1M 트리스·HCl 4㎖ 알리컷에 수집하였다. 모든 10분율을 모으고 농축시키고 센트리콘 30상에서 세척하고 민악티빈 활성도 및 단백질 농도를 측정하였다. 제10도는 활성도의 대부분이 pH 5 근처에서 용리됨을 나타낸다. 활성도의 전면적인 회수율은 82%이었고 비활성도의 2배 증가가 있었다.

(d) 등전점 전기영동

무세포 상징액을 WO 86/01212의 정제실시예 2에 기술된 바와 같이 단계(a)와 (b)를 통하여 처리한 다음 WO 86/01212의 정제실시예 1에 기술된 바와 같이 단계 pH 용리를 사용하여 페닐-세파로오스를 통하여 처리하였다. 민악티빈 활성을 함유하는 분율을 모으고 85% 포화 황산암모늄으로 침전에 의해 농축하고 pH 9.0의 50mM 글리신에 하룻밤 투석하였다. 이 용액을 pH 범위 4.5-6.0의 암포라인을 함유하는 울트로덱스의 예비 플랫베드겔에 가하고 LKB 멀티포 등전점 전기영동장치에서 10℃에서 23시간 동안 전기영동하였다. 실행완결에 이어서, 겔의 길이를 가로질러 30지대를 긁어내고 pH 9.0의 1mM EDTA를 함유하는 1M 글리신 10㎖로 각각으로부터 단백질을 용리하였다. 각 분율의 알리컷을 민악티빈 활성에 대해 측정하고 단백질의 위치를 정하기 위해 15% SDS-폴리아크릴아미드 겔상에서 전기영동시켰다. 제11도는 상당한 양의 단백질이 민악티빈 활성을 함유하는 분율로부터 제거되었음을 예시한다. 이들 조건하에, 민악티빈은 pH 5와 pH 5.2 사이에 집중되었고 겔의 이 범위내에서 겔에 가해진 총활성도의 39%가 회수되었다.

(e) 이뮤노어피니티 크로마토그라피

무세포 상징액을 정제실시예 1에서와 같이 처리하였다. 이 민악티빈제제(2300 단위, 2.25㎎, 비활성도 1020U/㎎)의 4.6㎖ 알리컷을 인산나트륨중의 0.05M, NaCl 중의 0.5M, 트리톤 X-100 중의 0.01%, 아지드화나트륨 중의 0.1%, EDTA 중의 1mM로 만들고 pH를 7.5로 조절하였다. 이 용액을 위의 완충액으로 15㎖로 희석하고, 항-태반 억제물질항체 10㎎이 화학적으로 짝지음된 세파로오스 4B 15㎖에 첨가하였다. 슬러리를 4℃에서 하룻밤 흔든 다음, 2.5㎝×3.1㎝ 컬럼에 부었다. 미결합 단백질을 컬럼으로부터 배수시키고 280nm에서의 흡광도가 기준선에 돌아올 때까지 컬럼을 완충액으로 세척하였다. 다음에 컬럼을 pH 8.0의10M 트리스·HCl을 함유하는 3M KSCN으로 용리하였다. 용리프로파일은 제12도에 나타내었다. KSCN에 의해 용리된 분율은 센트리콘 10상에 8.5배 농축되었고 pH 7.8의 40mM 글리신으로 세척하고 민악티빈 활성도에 대해 SDS-PAGE에 의해 분석하였다. 대부분의 민악티빈 활성도는 항체컬럼에 결합하지 않았다. 그러나, 소량의 민악티빈 활성(8.5단위)은 특이적으로 결합되고 3M KSCN으로 용리된다. 이것은 이들 조건하에 항체 컬럼이 민악티빈으로 과부하됨을 가리킨다. 더 나아가서, 민악티빈은 비교할만한 기간동안에 걸쳐 KSCN의 존재하에 그의 활성도의 90% 이상을 잃는데, 민악티빈 활성도의 낮은 회수율은 KSCN에서 분자의 비활성화에 기인함을 제안한다. SDS-PAGE 결과는 막대한 대부분의 단백질이 컬럼으로부터 지체없이 용리함을 나타낸다.

그러나 KSCN 용출액은 겔여과시 민악티빈의 분자크기에 유사한 분자량 Ca 45000의 주단백질 띠를 포함한다(실시예 2A(a) 참조)(제12a도). 이 민악티빈 제제의 웨스턴 분석은 SDS-PAGE를 따라 관찰된 단백질 띠와 동일하게 이동하는 단일의 면역학적으로 상호반응성 종을 나타내었다(제12b도).

일정한 조건하에서 민악티빈은 대략 60-70,000(PCT 191-85에 상세함)의 분자크기를 갖는 것으로 관찰되었다. 이 불일치는 민악티빈의 글리코실화 정도에 기인하는 변경된 유동성에 기인될 수 있다.

[실시예 3]

[민악티빈으로부터 펩티드 단편의 단리 및 서열]

민악티빈을 위의 실시예 2에 기술한 바와 같이 PMA 유발된 U937 세포로부터 정제하였다. 다음에 민악티빈(3-5㎍)을 22℃에서 8시간 동안 50㎕의 최종 부피에서 5M 요소를 함유하는 pH 8.5의 20mM 트리스-HCl 중의 엔도프로테이나제 LysC(0.1㎍)으로 소화시켰다. 결과된 펩티드를 0.1% TFA 중의 아세토니트릴의 구배를 사용하여 신크로팍 RP-P(C-8)컬럼상에서 역상고압액체 크로마토그라피에 의해 분리하였다(제19도). 별표로 표시한 펩티드를 어플라이드 바이오시스템스 470A 기체상 시퀀서상에서 서열화하였고 서열은 다음과 같다.

펩티드 13 : AQILELPY-GDV-MFLLLP-E…

펩티드 11 : GRANFSGMSE-NDLF…

펩티드 10 : MAE-EVEVYIPQFKLEE-Y…

펩티드 6 : LNIGYIEDLK

펩티드 9 : IPNLLPEG-V

[실시예 4]

[민악티빈의 분자 클로우닝]

a) mRNA의 단리

제1도로부터, PMA 유발된 U937 세포에 대한 전사의 최적시간은 15와 25시간 사이인 것으로 추측할 수 있다. 그러므로, 1.2×10⁶세포/㎖의 세포밀도에서 U937 세포의 4리터 무혈청배지를 PMA의 존재하에 19시간 동안 배양시키고 세포를 수집하고 더이상 사용되기까지 액체질소하에 동결시켰다. 3일 무혈청배지로부터 비-PMA 자극된 U937 세포를 또한 mRNA 단리에 대해 유지시켰다. 국제특허출원 WO 86/01212에 기술된 바와 같이 제조되고 시험관내에서 3일간 배양시킨 사람 혈단구를 mRNA의 공급원으로서 또한 사용하였다.

위의 공급원의 각각으로부터 총 RNA를 구아니딘-HCl법의 수정안에 의해 추출하였다. 세포펠릿을 4M 구아니딘 이소티오시아네이트, 50mM 트리스 HCl, pH 7.5, 10mM EDTA, 0.5% 사르코실, 0.1M 2-메르캅토에탄올을 함유하는 완충액 20부피(그램 중량당)에서 4℃에서 3분간 저속에서 혼합기에 균질화시켰다. 다음에 현탁액을 10분간 원심분리하여 부스러기를 제거하였다. 25mM로 아세트산 및 냉에탄올을 0.75부피의 첨가에 의해 상징액으로부터 핵산으로 침전시키고 -20℃에서 하룻밤 배양시켰다. 현탁액을 -10℃에서 30분간 다시 원심분리하고 펠릿을 7.5M 구아니딘 HCl, 20mM 아세트산나트륨 pH 5.0, 1mM 디티오트레이톨을 함유하는 완충액에 원부피의 20%에서 펠릿을 용해시켰다. 원심분리하여 어떠한 미용해된 물질을 제거한 후, RNA를 -20℃에서 1-3시간 동안 냉에탄올 0.55부피로 재침전시켰다. RNA를 원심분리에 의해 회수하고 구아니딘 HCl 완충액에 재용해시키고 재침전시켰다. 마지막 단계를 3회 반복하였다. 마지막 침전에 이어서 펠릿을 pH 7.0의 20mM EDTA에 용해시키고 동부피의 클로로포름 : 부탄올(4 : 1)로 추출하였다. 다음에 pH 5.0의 아세트산나트륨을 0.3M로 및 냉에탄올 2부피의 첨가에 의해 -20℃에서 하룻밤 수층으로부터 RNA를 침전시켰다. RNA를 원심분리에 의해 회수하고 20mM HEPES, pH 7.4, 0.5% 도데실황산나트륨에서 100㎎/㎖ 프로테나제 K로 50℃에서 4시간 동안 처리하여 잔류단백질을 제거하였다. 다음에 RNA를 0.2 아세트산나트륨, pH 5.0과 에탄올 2부피의 존재하에 -20℃에서 침전에 의해 회수하였다. 원심분리에 의한 회수에 이어서 어떠한 잔류 DNA를 pH 6.0의 3M 아세트산나트륨의 존재하에 4℃에서 하룻밤 RNA의 침전에 의해 제거하였다. RNA를 원심분리에 의해 회수하고 0.25N 염화나트륨과 두 부피의 에탄올의 존재하에 침전시켰다. RNA를 다시 원심분리에 의해 회수하였다. 풀리 A+ mRNA를 다음에 올리고(dT)-셀룰로오스로부터 2회의 흡착 및 용리에 의하여 단리시켰다.

풀리 A+mRNA를 수크로오스 밀도 구배 원심분리에 의해 민악티빈 mRNA에 대해 10 내지 20배 강화시켰다. 샘플을 15 내지 34%(w/w) 수크로오스 구배로 층을 이루고 벡크만 SW41 로터에서 4℃에서 16시간동안 33000rpm에서 원심분리하였다. 제2도는 크기 분별된 mRNA 제제의 변성조건하의 겔분석을 나타낸다. 민악티빈 mRNA는 제3도에 나타낸 바와같이 시험관내 번역 및 면역침강(이하 기술되는 방법)에 의해 구한 바와 같이 18S 리보소말 RNA 표준 주위에 집중된 이들 분율(분율 16 및 17)에서 검출되었다.

b) 민악티빈 번역생성물의 확인

민악티빈 mRNA는 무세포 망상적혈구 용해질 시스템에서 시험관내 번역과 이어서 천연기질인 유로키나제를 이용하는 민악티빈 번역생성물의 면역침강에 의해 확인되었다. 아멀샴으로부터 시중구입되는 토끼 망상적혈구 용해질을 100ng/㎖의 농도에서 송아지간 tRNA(보링저 만하임)를 첨가하여 제조업자의 지시에 따라 주로 사용하였다.

³⁵S-메티오닌(아멀샴)을 2mCi/㎖의 농도에서 첨가하여 방사선사진에 의해 번역생성물의 검출을 허용하도록 하였다. 위와 같이 제조된 풀리 A+mRNA를 30℃에서 90분간 50㎎/㎖의 농도에서 번역하였다. 번역혼합물 25마이크로리터를 각 면역침강에 사용하였다. 비특이성 결합을 최소화하기 위해 전체 스타필로코커스 아우레우스세포(Pansorbin, Calbiochem)의 세척된 현탁액의 배양 및 제거에 따라 샘플을 실온에서 90분간 50mPU의 유로키나제(Calbiochem)로 배양시켰다. 이 단계는 민악티빈 번역생성물과 유로키나제간의 복합체 형성을 허용한다. 복합체를 1-2㎕ 항유로키나제 항혈청(그린 크로스 코오퍼레이션) 또는 태반 억제물질에 대한 항체의 첨가에 의해 용액으로부터 제거하고 실온에서 30분간 및 4℃에서 하룻밤 배양시킨 다음 세척된 판소르빈 25㎕의 첨가에 의해 침전시켰다. 원심분리 후 민악티빈-유로키나제-항체-판소르빈 펠릿을 세척한 후, 2% SDS 및 2-메트캅토에탄올의 존재하에 비등에 의해 붕괴시키고 생성물을 겔전기영동과 이어서 방사선사진에 의해 분석하였다.

유로키나제에 대한 항체로³⁵S-표지된 번역생성물의 면역침강은 69,000 및 79,000의 Mr을 갖는 유로키나제 특이성 번역생성물을 얻었다. 이들 단백질 띠는 민악티빈의 유로키나제와의 특이성 복합체를 나타낸다 : 즉,

1) 그들은 유로키나제 또는 mRNA의 부재하에 존재하지 않고,

2) 그들은 항체의 부재하에 침강하지 않으며, 그리고

3) 그들은 유로키나제 결합을 위해 비표지된 정제된 민악티빈 및 태반억제물질(Calbiochem) 제제와 경쟁한다(제4도).

면역침강된 생성물은 PMA 유발된 U937 세포로부터 얻은 mRNA로부터 합성된 총 단백질의 0.05%를 나타내는 것으로 발견되었다. 추측상 이 제제중의 민악티빈 mRNA의 감소된 수준에 기인하여 비유발된 U937 세포로부터 얻은 mRNA로부터 검출틸 수 있는 면역침강 생성물은 없다.

태반 억제물질에 대한 항체를 사용하는 유로키나제-민악티빈 번역생성물의 면역침강은 동일한 결과를 가져왔다. 몇 항-태반억제물질 항체 제제는 69,000 및 79,000MW에서 독특한 유로키나제-민악티빈 번역생성물 복합체를 침강시켰다(제5도).

유로키나제의 존재 및 부재하에 얻은 면역침강 생성물의 비교는 제6도에 나타낸 바와 같이 민악티빈 번역생성물의 직접확인을 허용한다. 이것은 43000의 Mr에서 뚜렷한 띠로서 나타난다. 이 분자량은 가능하게는 글리코실화로 인하여 천연단백질에 대해 관찰된 것보다 약간 더 작음을 나타낸다. 유로키나제의 존재하에, 이 띠는 사라지고 특징적인 유로키나제-민악티빈 번역생성물이 69000Mr에서 검출된다. 앞서 관찰된 79 내지 80,000Mr에서 추가의 단백질 띠는 샘플이 부분환원된 상태하에 분석되기 때문에 비환원 형태의 복합체를 나타냄을 나타낸다.

더 나아가서, 민악티빈 번역생성물과의 복합체 형성은 저분자량 형태의 유로키나제(HPA 33)의 존재에 달려있음을 발견하였다. HPA 52 및 HPA 33의 순수한 제제가 얻어지고(Calbiochem) 피브린도포에 의해 한 종 또는 다른 종이 지배적임을 입증한다(제7도). 게다가, 플라스미노겐 플라스민을 HPA 33에 첨가하여 제제 중의 어떤 잔류미량의 HPA52를 저분자량 형태로 전환시켰다. 69,000MW에서 독특한 유로키나제-민악티빈 번역생성물 복합체는 사용된 유로키나제 제제가 HPA33을 포함할 때만 나타났다. 이 결과에 대한 설명은 미지이다. 가능한 단백질분해를 억제하기 위해 용해질 혼합물에 트라실롤의 첨가는 이 결과에 영향을 주지 않았다.

요약하면, U937 세포로부터 mRNA의 시험관내 번역은 69000의 특성 Mr을 주는 유로키나제와의 복합체의 형성에 의래 쉽게 확인될 수 있는 Mr 대략 43,000의 생물학적 활성의 민악티빈 번역생성물을 명백히 얻는다.

c) 상보적 DNA 라이브러리의 구축

라이브러리는 다양한 확립된 방법을 사용하여 총 폴리 A⁺mRNA 또는 수크로오스 밀도구배 분별된 mRNA로부터 구축되었다. 예를 들면, 제1스트랜드 상보적 DNA는 프라이머 개시된 역전사효소를 사용하여 mRNA로부터 일반적으로 합성되었다. 제2스트랜드는 다음에 예를 들면, (1) DNA 폴리머라제 또는 역전사효소를 사용하여 종래의 헤어핀루프 프라임드 DNA 합성 ; (2) RNase H-DNA 폴리머라제 I-중재 제 2스트랜드 합성 또는 (3) 5'-꼬리 프라임법에 의해 합성되었다. S1 뉴클레아제로 처리후(필요하다면), DNA를 휠링인 표준법, 예를 들면 DNA 폴리머라제, 레노우단편, 또는 T4-폴리머라제를 사용하여 발생된 단부를 메틸화 및 무디게 한다. 이어서, cDNA는 표준과정을 사용하여 적당한 제한부위를 함유하는 합성결합제 단편으로 조장된 상보적 단일중합체 꼬리 또는 점착성 단부를 통하여 적합한 플라스미드(예를 들면 pBR322,pUC 또는 pUR 시스템) 또는 박테리오파지(예를 들면 람다 gt11) 벡터에 그들을 결합시킴으로써 클로운될 수 있다.

[실시예 5]

cDNA 라이브러리를 구축하는 바람직한 방법은 다음과 같다 : 즉, cDNA는 50mM 트리스 HCl, 75mM KCl, 10mM DTT, 3mM MgCl, 각각 1mM dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP, 10㎍/㎖ 올리고(dT) 12-18 및 100㎍/㎖ BSA의 존재하에 몰로니 쥐 백혈병 바이러스 역전사효소(RBL, 200U/㎍ mRNA)를 사용하여 총 폴리 A⁺mRNA 6㎍으로부터 합성하였다. 200㎕ 반응 부피를 37℃분간 배양시켰다. 제2스트랜드는 DNA 폴리머라제 I의 레노우단편을 사용하여 헤어핀 루프 프라임드 합성에 의해 합성되었다. 반응은 70℃에서 10분간 가열하여 DNA/RNA 이중사를 분리하고 희석하여 부피를 2배로 하고 10μCi의 dATP(1800Ci/mmole)의 존재하에 325U/㎖에 레노우 첨가하였다. 반응을 15℃에서 1시간 동안 배양하도륵 두었다. 페놀 : 클로로포름(1 : 1) 추출 및 에탄올침전에 이어서 DNA를 용해시키고 0.2M NaCl, 50mM 아세트산나트륨 pH 4.5, 1mM ZnSO₄및 0.5% 글리세롤의 존재하에 S1 뉴클레아제(P/L 바이오케미칼스) 80단위로 처리함으로써 헤어핀 루프를 제거하고 앞서 기술한 바와 같이 침전시켰다.

다음에 이중 스트랜드 cDNA를 100mM 트리스-HCl pH 8.0, 10mM EDTA 및 80μM S-아데노실 메티오닌의 존재하에 EcoRI 메틸라제(Biolabs) 20단위를 사용하여 메틸화시켰다.

DNA는 33mM 트리스 아세테이트 pH 8.0, 66mM 아세트산 칼륨, 10mM 아세트산마그네슘, 0.5mM 디티오트레이톨, 0.1㎎/㎖ BSA 및 각각 0.5mM dATP, dCTP, dCTP, dGTP 및 dTTP의 존재하에 37℃에서 1시간 동안 2.5U의 T4 DNA 폴리머라제의 첨가와 이어서 T4 폴리뉴클레오티드키나제(20U)와 0.1mM ATP의 첨가에 의해 수복하었다. 페놀 : 클로로포름(1 : 1) 추출 및 에탄올침전에 이어서 EcoRI 결합제를 T4 DNA 리가제(IBI : 1.2U/㎍, DNA)를 사용하여 재용해된 DNA(2㎍ 결합제/1㎍ cDNA)에 첨가하였다. 반응을 26℃에서 4시간 동안, 농축된 cDNA 용액(167㎍/㎖)애서 수행하였다. EcoRI으로 처리후, 유리결합제를 바이오겔 A150M 상에서 크로마토그라피에 의해 cDNA로부터 분리시켰다. 1000b.p. 보다 더 큰 평균길이의 cDNA를 포함하는 분율을 모으고 cDNA를 농축시키고 두 부피의 에탄올의 첨가에 의해 침전시켰다. cDNA의 수율은 2.6㎍이었다.

cDNA 라이브러리는 람다 gt11 및 gt10 둘다에서 제조되었다. cDNA(100ng)을 220㎍/㎖의 DNA 농도에서 4℃에서 16시간 동안 EcoRI-절단된, 포스파타제 처리된 람다 gt11(1㎍)에 연결시켰다. DNA를 벡터클로우닝시스템으로부터 제조된 패키지 제제를 사용하여 패키지시켰다. 파지를 대장균 균주 Y1088에 흡착에 의해 증폭시키고 Y1090에서 스크린하였다. 람다 gt11 라이브러리는 ㎍ cDNA 당 대략 8×106 재조합체를 포함하였다(총 파지의 94%). cDNA 분자를 함유한 재조합체의 비율은 α[³²P]-dATP의 존재하에 합성된 cDNA로 라이브러리를 스크리닝시킴으로써 구하였다. 백색 플라아크의 약 90%가 이 프로브로 교잡되었다.

람다 gt10에서 제조된 라이브러리에 대해, cDNA(200ng)을 240㎍/㎖의 DNA 농도에서 25℃에서 4시간 동안 EcoRI 절단된, 포스파타제 처리된 람다 gt10(1㎍)에 연결시켰다. DNA를 대장균 균주 c600(

)을 사용하여 위와 같이 패키지시켰다.

람다 gt10 이브러리는 ㎍ cDNA 당 대략 7.5×10⁶재조합체를 포함하였다. cDNA분자를 포함한 재조합체의 비율은 방사성표지된 cDNA로 라이브러리를 스크리닝함으로써 구하였다. 플라아크의 90% 이상이 이 프로브로 교잡되었다.

[실시예 6]

[민악티빈 유전자를 함유하는 클로운의 확인]

민악티빈을 코드하는 유전자를 함유하는 클로운은 확립된 기법을 사용하여 다음의 실시예에서 기재된 프로브로 확인될 수 있다.

[실시예 6a]

[허브리드-선택번역]

민악티빈 mRNA에 상보적인 서열을 함유하는 cDNA 클로운은 교잡선택에 의해 확인될 수 있다. 클로운된 DNA는 변성되고 니트로셀룰로오스와 같은 고체 매트릭스에 고정되며 총 mRNA의 제제에 교잡된다. RNA/DNA 이중사는 가열되어 mRNA를 방출하는데 이것은 다음에 상기한 바와같이 시험관내 토끼 망상 적혈구 용해질 무세포 시스템에서 번역된다. 다음에 번역생성물은 실시예 4b에 기술된 바와 같이 확인될 수 있다.

[실시예 6b]

[민악티빈 유전자 서열에 상보적인 DNA 프로브]

실시예 3에 기술된 바와 같이 민악티빈의 펩티드에 대해 얻은 아미노산 서열을 사용하여 아미노산 서열을 코드하는 올리고뉴클레오티드 서열을 예측할 수 있고 올리고뉴클레오티드 프로브는 종래의 확립된 기법을 사웅하여 합성될 수 있다.

이 서열데이타를 사용하여, 많은 올리고뉴클레오티드 프로브를 어플라이드 바이오시스템스 380A DNA 합성기를 사용하여 합성하였다. 이들 올리고뉴클레오티드의 서열은 다음과 같다 :

특이성 올리고 뉴클레오티드 프로브는 방사성표지된 다음 표준기법을 사용하여 세균집락 또는 박테리오파지의 인시류 교잡에 의해 cDNA 라이브러리를 스크린하는데 사용될 수 있어 민악티빈 유전자의 모두 또는 일부를 함유하는 클로운을 확인할 수 있다.

[실시예 6c]

[면역학적 스크리닝]

클로운은 천연의 민악티빈 단백질과 상호반응하는 항체로 표준방법을 사용하여 스크린될 수 있다.

민악티빈에 대한 항체는 표준방법에 의해 제조되는데, 예를 들면, 각 토끼를 프로인트 컬플릿 또는 몬타나이드와 같은 적합한 보조액의 존재하에 10 내지 100㎍의 정제된 민악티빈으로 면역시킨다. 대략 4주후 등량의 부우스트에 이어서 민악티빈에 대한 항체를 측정할 수 있는 토끼형청이 얻어질 수 있다.

[실시예 6d]

[생물학적 활성에 대한 스크리닝]

민악티빈 유전자를 함유하는 클로운은 방사상표지된 유로키나제나 아니면 유로키나제 및 유로키나제에 대한 항체를 사용하여 민악티빈의 활성에 대해 시험 또는 스크린될 수 있다. 이것은 면역학적 스크리닝의 표준기법을 사용하여 달성될 것이다. 유로키나제 및 유로키나제에 대한 항체는 시중에서 얻어질 수 있다. 방사성 표지된 유로키나제는 아래에 기술된 바와 같이 제조될 수 있다.

시중에서 얻은 유로키나제(Calbiochem)는 공개된 프로토롤[Holmberg. L., Bladh. B., Astedt, B. Biochim. Biophys. Acta

, 215-222 (1976) 및 Goldfarb. R. H., Quigley, J.P.Biochemistryp

, 5463-5471 (1980)]에 따라 p-아미노벤즈아미딘 세파로오스상에서 크로마토그라피에 의해 어피니티 정제하였다. 정제된 유로키나제의 75플로우그 단위를 볼톤 헌터방법에 따라 N-숙시니미딜 3-(4-히드록시, 5-[I¹²⁵]요오도페닐)프로프리오네이트와의 콘쥬게이션에 의해 요오드화시켰다. I¹²⁵-표지된 유로키나제를 0.1M 인산나트륨, pH 7.0, 0.4M 염화나트륨, 0.1% 트리톤 X100 및 1% 답체 소혈청알부민에서 평형화시킨 세파텍스 G-25M에서 크로마토그라피에 의해 표지안된 것으로부터 분리시켰다.

비-환원조건하에 SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동에 의한 I¹²⁵-표지된 유로키나제 제제의 분석은 특징적인 고(Mr 55000) 및 저(Mr 33000) 분자량 형태의 유로키나제의 존재를 나타내었다(제13도). 환원조건하에, 고분자량 형태는 그의 특징적인 33000 및 22000Mr 아단위로 분해된다. 유로키나제 제제의 요오드화는 크울맨 및 그린[Ann. N. Y. Acad. Sci.

, 617 (1981)]의 측정에 의해 측정된 바와 같이 10 내지 15% 플라스미노겐 활성화제 활성의 손신을 가져왔으나 효소의 민악티빈 억제에는 영향을 미치지 않는다. 여러 희석액의 민악티빈을 니트로셀룰로오스 페이퍼에 스포트하고, 방사성 표지된 유로키나제로 하룻밤 배양시키고, 세척, 건조 및 방사선사진을 찍은 도트 블록측정은 10mU의 감도 또는 대략 0.1ng 민악티빈에서 고체상에 결합된 민악티빈을 검출할 수 있음을 나타내었다.

[실시예 7]

[민악티빈 유전자의 확인]

민악티빈 유전자를 확인하는 바람직한 방법은 다음과 같다. 합성에 이어서 실시예 6b에 기술된 올리고뉴클레오티드 프로브 7-10을 폴리아크릴아미드겔 전기영동에 의해 정제하고 폴리뉴클레오티드 키나제 (IBI, IU/pmole DNA) 및 감마-³²P-ATP로 표지하고 표준방법을 사용하여 이온교환 크로마토그라피에 의해 정제하였다.

실시예 5에 기술된 바와 같이 람다 gt 10라이브러리는 표준실험방법에 따라 인시류 교잡에 의해 스크린되었다. 교잡조건은 최저 바탕치와 특이성 결합을 허용하도록 조절하고 다음과 같이 되도록 구하였다.

프로브 7 및 8 : 6×SSC, 5×Denhardt's, 0.5% SDS, 0.2㎎/㎖ 털깎은 송아지흉선 DNA에서 42℃에서 1시간 동안 사전 교잡에 이어서 6×SSC, 5×Denhardt's, 0.1% SDS, 20㎍/㎖ tRNA에서 50℃에서 3시간.

프로브 9 및 10 : 10×Denhardt's, 5×SSC, 0.05% 피로인산나트륨에서 37℃에서 16시간.

10⁸cpm/㎍ 보다 더 큰 비활성의³²P-표지된 올리고뉴클레오티드 프로브를 대략 0.5pmole/㎖에서 사용하였다. 필터를 양성 클로운의 선택에 대한 염중성을 높이기 위해 증가하는 온도에서 0.1% SDS를 함유하는 0.5X 또는 2×SSC에서 세척하였다.

양성신호를 제공하는 플라아크를 집어내고 재스크린하여 표준방법을 사용하여 파지 DNA를 정제하였다(예를 들면 만니아리스의, 분자클로우닝 1982).

서로 상호교잡하는 서열을 포함하는 두 재조합 박테리오 파지 크로운 MINID 및 MIN611는 각각 2100 및 1060 염기쌍의 EcoRI-연결된 cDNA 삽입물로 얻어졌다. 이들 삽입물은 플라스미드 pUC18에 아클로운시켜 각각 플라스미드 pBTA440 및 pBTA441을 조장하고 제20도에 나타낸 바와 같이 제한효소분석에 의해 지도를 그렸다. 클로운 MINID의 사우든 블롯분석은 제20도에 예시된 바와 같이 320염기쌍

I-

I 제한단편내에 올리고뉴클레오티트 프로브 7 및 8의 결합영역을 위치시켰다. 민악티빈을 코드하는 유전자를 함유하는 이들 클로운은 히브리드-선택번역 및 DNA 서열분석에 의해 입증되었다.

[히브리드 선택번역]

정제된 pBTA440을 만니아티스의(분자클로우닝 1982)에 의해 기술된 방법에 따라 3㎜×3㎜ 필터당 20㎍의 농도에서 니트로셀룰로오스 필터상에서 고정시켰다. 세척후, 각 필터를 총 mRNA 50㎍으로 배양하고 50℃에서 3시간 동안 교잡시켰다. 충분한 세척후, 특이적으로 교잡된 mRNA를 비등에 의해 용리시킨 다음 시중 토끼 망상 적혈구 용해질제제(아멀샴)를 사용하여 시험관내에서 번역하였다.

제21도에 예시한 바와 같이, 교잡된 mRNA는 실시예 4b에 기술된 민악티빈 번역생성물의 특징인 겔 전기영동에 의해 Mr 43000의 번역생성물을 특이적으로 코드함을 나타내었다. 더 나아가서, 유로키나제의 존재하에, 이 띠는 사라지고 특징적인 유로키나제-민악티빈 복합체가 6900Mr에서 검출되었다.

[DNA 서열분석]

pBTA 440의 제한단편은 단일 스트랜드 파지 벡터 M13mp9, M13mp18 및 M13mp19에 아클로운시키고 2,100bp 삽입된 것의 DNA는 생거(Sanger) 사슬종결법을 사용하여 구하였다. DNA 서열의 조사는 2,100bp 삽입물이 민악티빈 유전자의 전체 코드서열을 포함하지 않음을 가리켰다.

[프라이머 연장]

민악티빈의 N-말단여역을 코드하는 DNA 서열의 잔류기를 얻기 위해 제2cDNA 라이브러리를 프라이머 연장을 사용하여 구축하였다. 라이브러리는 앞서 서열된 뉴클레오티드 391 내지 420에 상보적인 올리고 뉴클레오티드 5' TTC CAG TAA ATA ATT CCC TGT GGA TGC ATT 3'를 갖는 폴리 A⁺mRNA 5마이크로그램을 프라임함으로써 제조되었다. EcoR I-연결된 cDNA 삽입물은 표준기법을 사용하여 람다 gt10에서 이어서 클로운되었다.

얻어진 7.2×10⁴클로운 중 대략 5.3×10³이 제2의 뉴클레오티드 5' GCC TGC AAA ATC GCT TCA GGA TAA CTA CC 3'(뉴클레오티드 310-335에 상보적임)로 스크린되었다. 얻어진 100개의 양성 클로운 중 15개가 정제되고 가장 큰 cDNA 삽입물(430bp)을 가진 클로운(클로운 13)이 플라스미드 pUC18에 아클로운되어 플라스미드 pBTA442를 조장하였다. pBTA442의 DNA 서열은 상기한 바와 같이 구하였다(또한 제20도 참조).

pBTA440과 pBTA443에 포함된 민악티빈유전자의 코드서열인 pBTA442에 반대배향으로 pUC1에 430bp 5' 민악티빈 서열을 함유하는 플라스미드는 제22도에 나타낸 바와 같이 pBTA438을 조장하기 위한 일정한 DNA 제한단편을 재조합함으로써 인접하게 만들어졌다. pBTA438을 함유하는

K-12, 균주 JM 109는 수납번호 ATCC 53585 하에 1987년 2월 11일에 미합중국 메릴랜드 20852 록빌 파크런 드라이브 12301에 있는 어메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 기탁되었다(수리번호 KTCT 8297P 하에 1987년 11월 13일에 한국과학기술원(KAIST)에 기탁되었다).

민악티빈 유전자의 완전한 cDNA 서열 및 민악티빈 단백질의 유도된 아미노산 서열을 제23도에 제공하였다. 완전 번역생성물은 415 아미노산으로 구성된다(Mr 46, 543). 유전자는 제23도에 예시한 바와같이 천연 민악티빈의 아미노산 서열분석으로부터 얻은 5펩티드를 코드한다.

DNA 서열분석은 민악티빈이 유로키나제형 플라스미노겐 활성화제에 특이성이지만 세린프로테아제 억제물질 수퍼훼밀리의 맴버(세르핀으로 알려짐) 임을 나타낸다.

[실시예 8]

[생물학적으로 활성의 민악티빈의 발현]

생물학적 활성분자의 고수분발현은 예를들면 pBTA438에 존재하는 전길이 cDNA의 각종 벡터로의 통합에 의해 얻어지는데, 이것은 세균 또는 진핵세포(벡터로 형질전환된 포유동물세포와 같은 것)와 같은 다양한 숙주에서 단백질의 합성을 명할 수 있다. 벡터는 바람직하게는 민악티빈을 코드하는 뉴클레오티드 서열의 발현을 제어할 수 있는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 이 제2의 뉴클레오티드 서열은 예로써 프로모터서열, 폴리아데닐화서열, 또는 단백질이 또다른 단백질과 융합된 잡종분자로서 발현되도록 허용하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.

[실시예 9]

[민악티빈의 박테리아 발현]

일반적인 접근법은 발현벡터 또는 민악티빈의 발현을 코드하는 DNA 서열을 함유하는 대장균에서 복제가능한 클로우닝 비히클의 제조이다.

민악티빈은 천연형태로 발현될 수 있고 또는 또 다른 단백질에 융합된 잡종분자로서 발현될 수 있다. 이들 구조는 제24도와 제26도에 나타내었다.

천연의 또는 거의 천연의(N-말단 아미노산 변성된) 민악티빈을 발현하기 위해 일련의 플라스미드 구조물은 람다 PL 발현벡터 pLK57 및 pLK58(보터만외, Gene

; 229-239, 1985)를 사용하였다.

제24도에 나타낸 바와같이, 플라스미드 pBTA438은

R I 및

I로 소화되었고 1610bp

R I-

I 제한단편은 아가로오스겔로부터 단리되었다. 이 단편은

I 및

V로 소화된 벡터 pLK57에 T4 리가제로 연결되었다. 유도체 플라스미드 pBTA444는 천연 민악티빈의 발현을 제어하는 람다 PL 프로모터를 포함한다.

발현벡터 pBTA444는 람다의 열분안정성 cI 리프레서를 포함하는 대장균 K-12 균주 N4830(조이스외, PANS 80, 1830-1834, 1983)를 형질전환하는데 사용되었다. pBTA444로 형질전환된 세포는 28℃에서 10㎍/㎖ 암피실린으로 MEB 배지(Mott외 PNAS82, 88-92, 1985)에서 하룻밤 성장시켰다. 세포를 MED 배지로 희석하고, 42℃로 온도를 평형화하기 위해 같은 부피로 미리 가온된(65℃) MEB 배지를 가했을 때 28℃에서 1.0의 OD₆₀₀으로 성장되었다. 42℃에서 4시간 성장에 이어서, 세포를 모으로 20% 수크로오스 30mM 트리스-HCl pH8.1 200μ와 ㎎/㎖ 라이소자임 용액에 세척된 세포를(-70℃ 동결 및 해동후) 재현탁시키고 이어서 3M EDTA pH 7.3 3㎖의 첨가에 의해 막 및 용해성 단백질분율을 제조하였다. 세포추출물을 간단한 음파처리에 의해 분류하고 막 및 불용성 단백질을 원심분리(27,000×g, 60분)에 의해 펠릿화 하였다. 용해성단백질을 상징액에 삼염화아세트산(105w/v)의 첨가에 의해 침전시키고 펠릿은 물에 용해되었다. 펠릿화막을 또한 물에 용해시켰다. 비유발(28℃) 및 유발(42℃) 세포 둘다에 대한 이들 분율의 샘플을 SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동 및 사람 태반 억제물질에 대한 항혈청을 사용하여 웨스턴이동에 의해 민악티빈의 면역학적 검출에 의해 분석하였다. 제25도에 나타낸 바와같이, 민악티빈 단백질 띠(Mr 40-50K)가 사람 태반 억제물질에 대한 항체를 사용하여 웨스턴 이동에 의해 보여지고 알카리성 포스파타제(시그마)에 짝지음된 토끼 항-염소 IgG가 유발된(42℃) 용해성 및 막 분율 둘다에 존재한다.

천연 민악티빈의 또다른 제조방법을 또한 제24도에 나타내었다. 플라스미드 pBTA442를

로 소화시키고 243bp

제한단편을 아가로오스겔로부터 정제하였다. 이 단편을

로 소화된 벡터 pLK58에 T4 리가제로 연결시켰다. 유도체 플라스미드 pBTA445는

와

으로 소화시키고 2800bp 단편을 정제 및 pBTA438로부터의 정제된 1320bp

-

제한단편에 T4 리가제로 연결시켰다. 유도체 플라스미드 pBTA446을

로 선형화하고 세균성 리보소옴 결합부위와 플라스미드 pBTA447을 조장하는 천연 민악티빈 유전자의 초기 뉴클레오티드를 함유하는 합성 이중스트랜드 26mer 올리고뉴클레오티드에 연결시켰다. pBTA447을 상기와 같이 유도 및 분석된 N4830과 같은 적당한 숙주에 형질전환시킬 때 민악티빈은 다시 제25도에 나타낸 바와같이 생성된다. 두 경우에, pBTA444 및 pBTA447 함유세포에 대해 민악티빈은 유발된(42℃) 용해성 및 막 분율 둘다에 존재하였다.

대장균 N4830에 생성된 민악티빈의 생물학적 활성을 평가하기 위해, 용해성 및 막분율을 실시예 4에 기재된 바와같이 고분자량 및 저분자량 형태의 유로키나제로 90분간 배양시켰다. 다음에 샘플을 아세톤으로 침전시키고 물에 재현탁시키고 환원 SDS-폴리아크릴 아미드겔상에 적용시켰다. 민악티빈 및 민악티빈-유로키나제 복합체는 상기한 바와같이 웨스턴 이동에 의해 볼 수 있다. 제15도에 나타낸 바와같이, pBTA447을 함유하는 유발된 대장균 N4830으로부터의 용해성 분율중의 민악티빈은 표준 측정조건하에서 유로키나제와 복합체를 형성한다. 이것은 이들 세균성세포로부터 생성된 민악티빈이 생물학적 활성을 보유함을 가리킨다.

한 단백질 코드서열의 모두 또는 일부 및 민악티빈 코드서열의 모두 또는 일부인 단백질의 제조방법의 두 실시예를 다음에 제공한다. 제26도에 나타낸 바와 같이, 플라스미드 pBTA440을

및

로 소화시키고 110bp 단편을 아가로오스겔로부터 단리시켰다. 이 단편은 pBTA450을 조장하는 EcoRV로 소화된 벡터 pBTA449에 연결되었다. 다음에 pBTA450을

로 소화시키고 플라스미드 pLK57에 연결된 정제된 2800bp 단편은 플라스미드 pBTA586을 조장하는

으로 소화되었다. 이것은 민악티빈 코드서열의 일부를 람다 P1 프로모터의 제어하에 두고 traT 유전자의 처음 80아미노산의 코드서열에 융합시키는데 이중 처음 20은 대장균의 외막에 나타나는 융합을 가져오는 신호서열을 구성한다. 이 신호서열은 외막에 운송하는 동안 절단되는데 이것은 traT 단백질의 정상위치이다.

플라스미드 pBTA586을 N4830과 같은 적당한 숙주에 형질전환시키고 위와같이 온도이동을 유발시킬 때 TraT-민악티빈 융합단백질은 제27도에 나타낸 바와같이 외막에 나타난다.

융합 제조방법의 제2실시예를 제26도에 나타내었다. 플라스미드 pBTA440에서, 민악티빈 코드서열은 플라스미드 pUC18상에 존재하는 β-갈락토시다제의 일부와 프레임에서 융합된다.

플라스미드 pBTA440을 JM101과 같은 적당한 숙주 또는 lacI_q유전자를 함유하는 어떠한 대장균 균주에 형질전환시키고 이소프로필-티오-β-D-갈락토피라노시드(최종농도 1mM)의 첨가에 의해 유발시킬때 민악티빈 생성은 상기와 같이 검출될 수 있다(제27도).

[실시예 10]

[진핵세포에서 재조합 민악티빈의 발현]

민악티빈의 전 코드영역을 함유하는 pBTA438의 단편은 포유동물 세포에서 안정한 통합 및 진핵세포 유전자의 발현을 할 수 있는 일련의 벡터에 삽입되었다.

이들은 1) 민악티빈 cDNA 서열이 SV4O 초기 프로모터의 제어하에 놓이는 pKC3(pKO-neo, Van Doren, Hanahan. D., Giuzman. Y., J. Virol.

606-614 (1984)) ; 2) 민악티빈 유전자가 레트로바이러스 LTR 프로모터로부터 이래에 놓이고 선택은 원핵생물에서 가나마이신내성 및 진핵생물에서 G418 내성을 초래하는 네오유전자에 기초하는 몰로니 쥐 백혈병 바이러스 유도된 레트로바이러스 셔틀 시스템인 pZipNeoSV(X) 1(Cepko, C.L., Roberts, B.E., Mulligan, R.C., Cell

1053-1062 (1984)) ; 3) 민악티빈의 조정된 발현이 쥐유암-바이러스(MMTV) 5'-LTR 내에 함유된 덱사메타손 유도성 프로모터를 이용함으로써 달성되는 pMSG(pharmacia로부터 시중구입됨)을 포함한다.

이들 세 벡터의 구조는 제28도에 나타나 있고 상세한 것은 다음과 같다. 민악티빈 유전자의 코드영역은 1610bp

-

단편으로서 pBTA438로부터 단리되고 이하 기술된 바와같이 다음의 벡터에 삽입되었다.

1610bp

-

단편은

와

로 소화된 pCK3에 연결되었고 다음에 대장균 C600γ로 형질전환되었다. 결과 플라스미드는 pBTA587로 지칭되었다.

제2구조에서 1610bp

-

단편은 DNA 폴리머라제 I의 레노우단편을 사용하여 프러시 말단되게 하고, pMSG의

부위에 연결되고 적합한 대장균 K-12 숙주에 형질전환되었다. pMSG의 민악티빈 유전자를 함유하는 집락은 실시예 7에 앞서 기술된(뉴클레오티드 310-335에 상보적인³²P-표지된 올리고뉴클로에티드(29mer)를 사용하여 집락교잡에 의해 검출되었다. 결과 플라스미드는 pBTA588로 지칭되었다.

제3구조에서, 상기한 플러시 말단된

/

단편은 pBTA589로 지칭된 구조를 주는

로 소화된 pUC7에 연결되었다. pUC7의

부위가

부위에 의해 접해있기 때문에, 이것은 민악티빈 유전자가

소화에 이어서 단리되고 pZINeo SV(X)의 1의

부위에 연결되도록 하였다.

적합한 대장균 K-12 숙주로의 형질전환에 이어서 민악티빈 유전자를 함유하는 집락은 상기한 바와같이 집락교잡에 의해 검출되었다. 결과 플라스미드는 pBTA590으로 지칭되었다.

[진핵세포의 형질전환]

모든 플라스미드가 인산칼슘법에 의해 진핵포로 형질전환되었다. 대략 1-2×10⁵세포를 10%(v/v) 우태아혈청, 3.6mM 글루타민 200mM, 45IU/㎖ 페니실린 및 45㎎/㎖ 스트렙토마이신(완전배지)로 보충된 Dulbecco 수정된 Eagle 배지 5㎖에 T25 플라스크에 파종하였다. 대략 1 내지 5㎍의 CsCl 구배 정제된 DNA을 인산칼슘으로 치전시키고 세포에 첨가하였다. 4시간 후, 세포를 글리세롤 쇼크로 처리하고 완전배지에서 3일간 배양시켰다. 다음에 배양상징액을 일시발현의 측정을 위해 제거하였다. 다음에 세포를 트립신 처리하고 적당한 항생제 선택(이하 참조)을 포함하는 완전배지를 가진 T75 플라스크에 1/3으로 분할하였다. 세포를 같은 배지로 매 6 내지 7일 마다 세척하고 형질전환체를 14 내지 28일에 집어내고 집밀적 성장이 달성될 때까지 개별 배양시켰다.

pBTA587, pBTA588 및 pBTA590 각각에 형질전환의 조건은 다음과 같았다 :

, pKC3가 선택적인 마아커를 포함하지 않기 때문에 pBTA587은 pBTA587 : pZIPNeo SV(X) 17.5 : 1의 몰비에서 pZIPNeo SV(X) 1과 상호 형질전환되었다. 형질전환체는 0.4㎎/㎖ G418을 함유하는 완전배지로 선택되었다. 형질전환은 COS 세포에서 수행되었다.

. pMSG가 SV40 초기 프로모터로부터 발현된 대장균 크산틴-구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제(get) 유전자를 함유하기 때문에 형질전환된 세포는 히포크산틴, 아미노프테린 및 미코페놀산을 함유하는 HAT 배지에서 선택되었다. 형질전환은 NIH3T3 세포를 사용하여 수행되었다.

. 형질전환체는 0.4㎎/㎖ G418을 함유하는 완전배지를 사용하여 선택되었다.

[진핵세포에서 재조합 민악티빈의 발현의 분석]

형질전환에 이어서, 재조합 민악티빈의 일시적 발현은³⁵S-메티오닌의 존재하에 세포를 배양함으로써와 실시예 4b에 기술된 방법에 따라 필수적으로 태반억제 물질에 대한 항체를 사용하는 재조합 방사성 표지된 민악티빈의 특이성 면역침강에 의해 검출된다. 예를 들면, pBTA587의 COS 세포로의 형질전환 48시간후, 상징액을 제거하고³⁵S-메티오닌(아멀샴) 보충된, 메티오닌 없는 EMEM(Flow)의 존재하에 세포를 배양하였다.

50㎍ 염소 항-태반억제물질 항체 및 20㎕ 세척된 판소르빈과 면역침강에 이어서 복합체를 SDS-폴리아크릴 아미드겔 전기영동(환원조건)에 의해 분석하고 제29도에 나타낸 바와같이 방사선사전에 의해 시각화하였다. 재조합 민악티빈은 Mr 45-48,000의 띠로서 검출되는데, 이것은 벡터(pKC3)만을 함유하는 해당 제어 형질전환에서 관찰되지 않는다. 유로키나제(15플라우 유니트, 캘바이오켐)를 면역침강에 앞서 상직액에 첨가할 때, 생물학적으로 활성인 민악티빈에 특징적인 이 띠는 사라진다. 민악티빈 유로키나제 복합체를 가리는 Mr 69,000에서 띠가 관찰되었으나, 같은 위치에서 비특이성 단백질 띠에 의해 다소 불명료하다. 어떤 재조합 민악티빈은 검출된 Mr 35-37,000 띠로 증명되는 바와같이 유로키나제 제제의 첨가에 이어 원핵적으로 니크되었음을 또한 나타내었다.

생성된 재조합 민악티빈이 생물학적으로 활성임은 혈청의 부재하에 세포를 배양하고 실시예 1에 기술된 바와같이 필수적으로 비색측정에 의해 유로키나제 활성의 억제를 정량화함으로써 결정되었다. 억제의 수준을 검출한 바 바탕치위 대략 1단위/㎖ 민악티빈 활성에 해당하였다.

[실시예 11]

[생물학적 활성의 단백질의 정제 및 회수]

높은 수준으로 대장균에 민악티빈의 발현을 위한 조건의 확립에 이어서 민악티빈을 코드하는 플라스미드를 보호하는 세포를 후반 로그상에서 거둬들인다. 패킹된 세포한 부피를 용균완충액(1mM EDTA와 1mM 페닐메틸술포닐 플루오라이드를 함유하는 pH 7.0의 0.1M 인산나트륨) 2부피에 현탁시키고 15,000psi에서 프렌치 프레스를 통하여 3회 통과에 의하여 용해시킨다. 현탁액을 23,000×g에서 20분간 원심분리하고 펠릿을 5% 트리톤 X-100을 함유하는 용균완충액 2부피에 재현탁시킨다. 현탁액을 다시 23,000×g에서 20분간 원심분리하고 펠릿을 8M 요소 및 0.1M DTT를 함유하는 pH8.0의 0.1M 트리스-Cl 3부피에 현탁시킨다. 용액에 질소를 분출시키고 밀봉튜브에서 37℃에서 2시간 동안 배양시킨다. 배양에 이어서 용액을 pH를 용액 매 ㎖에 대해 빙초산 50㎕의 첨가에 의해 대략 pH 3.5로 낮춘다. 현탁액을 위와 같이 원심분리에 의해 분류하고 상징액을 0.1M 아세트산에 평형시킨 세파덱스 G-75컬럼(3.2㎝×90㎝)에 가하였다.

민악티빈을 함유하는 분율을 SDS-PAGE에 위치시킨다. 민악티빈을 함유하는 분율을 모으고 실온에서 16시간 동안 8M 요소 및 0.1mM DTT를 함유하는 pH8.0의 10mM 트리스-Cl에 대해 투석하였다. 다음에 분석된 용액을 위의 완충액에 평형화한 DEAE-세파덱스 컬럼 (2.2㎝×25㎝)에 적용시키고 컬럴을 미결합물질을 용리하기 위해 세척하였다.

다음에 민악티빈을 같은 완충액에서 0 내지 0.5M의 염화나트륨 선형구배를 사용하여 컬럼으로부터 용리한다. 민악티빈을 함유하는 분율을 SDS-PAGE에 의해 확인하고 증류수에 대해 광범위하게 투석한다. 이 과정의 동안에 침전하는 단백질은 동결건조에 의해 회수된다. 동결건조된 단백질을 0.1% 삼플루오로아세트산에 재용해시키고 워터스 고압액체 크로마토그라피에 부착된 바닥 C-4 역상컬럼에 가한다. 0.1% 삼플루오로 아세트산중의 아세토니트릴 0 내지 80%의 선형구배를 사용하여 컬럼으로부터 순수한 민악티빈을 용리시킨다. 민악티빈에 해당하는 A22O 피이크는 SDS-PAGE에 의해 확인되고 분율을 모으고 동결건조시킨다.

동결건조된 정제된 민악티빈을 10㎎/㎖의 농도에서 8M 요소를 함유하는 pH 8.0의 0.1M 트리스-Cl에 용해시키고, 1mM 환원된 글루타티온 및 0.1mM 산화된 글루타티온을 함유하는 pH 8.0의 0.1M 트리스 Cl에 10μ gm/㎖로 희석한다. 재생반응을 실온에서 24시간 동안 진행하도록 둔 다음 용액을 농축시키고 YM10 막을 사용하여 아미콘 교반된 세포상에 pH 7.0의 0.1M 인산나트륨에 대해 투석여과한다. 활성의 민악티빈을 함유하는 결과용액을 상기한 측정을 사용하여 측정한다(실시예 1).

포유동물 세포로부터 고수준으로 분비된 생물학적으로 활성의 민악티빈의 회수는 U937 세포로부터 천연 민악티빈의 정제에 대해 실시예 2에 기술된 바와 같은 방법을 사용한다. 이것은 초기에 30,000달톤 컷오프 카트리지가 장치된 아미콘 DC-2 홀로우 화이버 농축기를 사용하여 무세포 상징액의 10배 농축을 수반한다. 다음에 농축액을 적어도 동부피의 50mM 글리신, pH 7.8에 대해 투석하여 모든 염료잔재를 제거한다. 투석된 농축액을 4℃에서 8000rpm에서 30분간 JA10 로터에서 원심분리하여 잔류세포 부스러기와 투석의 동안에 침전될 수 있는 단백질을 펠릿화한다. 분류된 상징액을 다음에 알리컷으로 하고 후속정제를 요할때까지 -20℃에서 동결시킨다.

민악티빈을 또한 다음과 같이 페닐-세파로오스를 사용하여 단계 pH용리에 의해 10배 농축된 배양상징액으로부터 정제한다.

상징액의 이온강도는 교체 NaCl의 첨가에 의해 2M 조절하고 pH를 시트르산으로 5.5로 조절한다. 이 용액을 pH 5.5의 50mM 시트르산나트륨, 2M NaCl 1mM EDTA에 평형화한 페닐-세파로오스 컬럼(4.4㎝×5.0㎝)에 적용하고 280nm에서 기준선 흡광도(A280)가 기준선에 돌아올 때까지 같은 완충액으로 용리한다. 다음에 민악티빈을 pH 9.0의 5mM 글리신으로 컬럼으로부터 용리한다. 최고 비활성도의 민악티빈을 함유하는 분율을 모으고 아미콘 YM10 막에서 농축시킨다.

모으고 농축된 민악티빈을 다음에 pH 9.0의 0.1M 붕산나트륨으로 평형화시킨 세파크릴 S-200의 2.2㎝×78㎝ 컬럼에 가한다. 5.0㎖의 분율을 0.46㎖/분의 흐름속에서 수집한다. 민악티빈활성을 포함하는 분율을 모으고 YM10막을 사용하여 3㎖로 농축시킨다. 이 컬럼의 공지의 Mr 표준으로 검정한바, 민악티빈은 45-48kD의 Mr을 가짐을 가리킨다.

농축된 민악티빈 용액을 pH범위 4.5-6.0에서 암폴린을 함유하는 울트로덱스의 예비플랫 베드겔에 적용하고 LKB 멀티포 등전점 전기영동장치상에서 10℃에서 23시간 동안 등전점전기 영동하였다. 실행의 완결에 이어서, 겔의 길이를 가로지르는 30지대를 긁어내고 단백질을 pH 9.0의 1mM EDTA를 함유하는 1M 글리신 10㎖로 각각으로부터 용리한다. 각 분율의 알리컷을 민악티빈 활성에 대해 측정하고 15% SDS-폴리 아크릴아미드겔에서 전기영동하여 단백질을 위시킨다. 이들 조건하에 민악티빈은 pH 5와 pH 5.2 사이에 집중하고 고도로 정제된다. 이 물질을 다시 아미콘 YM10 막에서 농축시키고 1mM EDTA와 50% 글리세롤을 함유하는 pH 9.0의 50mM 글리신 중에 -20℃에서 보관하였다.

[산업상 이용성]

유로키나제-형 플라스미노겐 활성화제의 특이성 비활성화제로서, 민악티빈은 다양한 사람의 악성종양과 염증상태의 진단과 가능한 치료방법을 위한 임상시약으로서의 잠재적인 산업상 이용성의 범위를 갖는다. 조양바이러스에 의한 시험관에서의 세포형질전환(Ossowski,

. J. Exp. Med.

, 112, 1973)과 화학적 발암물질에 의한 시험관에서의 세포형질전환(Sisskin,

. Int. J. Cancer,

, 331, 1980)에 대한 연구는 둘 다 플라스미노겐 활성화제 분비가 형질전환과 관련된 초기의 생화학 사건과 가장 일치한다는 것을 나타낸다. 더불어, 셀 라인이 체내에서 전이하는 능력은 그의 플라스미노겐 활성화제를 발현하는 능력과도 상호관련이 있음이 발견되었다(Wang

. Cancer Research

, 288, 1980). 또한 가장 널리 보급된 여러가지 사람암, 즉, 폐, 유방, 전립선 및 결장의 악성종양의 종양세포는 유로키나제-형 플라스미노겐 활성화제를 높은 수준으로 생성한다는 것이 널리 확인되었다(Duffy, M. J., O'Grady, P. Eur. J. Clin. Oncol. 20(5)577-582, 1984).

결장점막의 악성종양과 악성종양의 소인이 되는 상태, 즉, 선종성, 용종, 다발결장폴립 및 크론병과 궤양성 대장염 같은 결장의 염증상태에 대한 이전의 연구(Stephene, R. S.

. Blood

, 333-337, 1985)는 사람결장암이 인접한 비관련 조직에서 발생하는 것보다 상당히 더 많은 양의 유로키나제-형 플라스미노겐 활성화제를 생성한다는 것을 증명하였다.

민악티빈은 플라스미노겐 활성화제와 관련된 이 종양에 결합하여 그것을 억제할 수 있음이 발견되었다(Stephens et al. Blood 66, 333-337, 1985). 이로써, 민악티빈은 체내와 조직구조 견본 모두에서 종양을 확인하고 결정하는 시약으로서의 산업상 이용성을 갖게 된다. 체내의 종양을 나타내기 위하여 민악티빈은 테크네튬-99m(Richardson, V.J. Brit.J. Cancer

, 35, 1979) 또는 요오드 -131(Begent, R.H.J. Lancet, Oct. 2, 1982) 같은 적당한 동위원소로 표지되기도 한다. 제조된 민악티빈의 투여에 따르는 종양의 위치 및 경제는 감마-카메라 이메이징 같은 공지된 방사성 동위원소 방법으로 결정되기도 한다. 이로써, 민악티빈은 작은 전이성 암, 특별히 외과적 개입후에 일어나는 그의 확인을 가능하게 하는 민감한 방법을 제공한다. 조직화학적 견본의 분석에 있어서, 민악티빈 또는 그의 항체는 I¹³¹과 같은 동위원소로 표지되거나, 또는 적당한 효소 또는 다른 화학적 시약과 결합한다. 생검절편과 같은 조직구조 견본과 접촉시에 민악티빈은 종양형 플라스미노겐 활성화제와 그것의 분비장소에서 결합할 것이며, 그로써 종양의 경계와 종양의 잠재적인 전이상태를 확인하게 된다. 진단상의 이용과 더불어 민악티빈은 또한 종양의의 직접적인 치료에도 이용성이 있음을 나타낸다. 종양이 주변의 조직을 침입하는 방법에 내포된 효소의 특이성 억제자로서(Dano, K.

., Adv. in Cancer Res. 44, 139 1985), 종양성장의 조절과 특히, 억제 및 전이가 이루어질 수 있다.

더불어, 민악티빈을 성장하는 종양에 직접 렉틴 또는 독소를 주는 약 전달계로서 사용될 수 있다. 이 계는 특히 대단히 효능있는 투머르시딘 능력에 의해서 많은 이점을 제공할 수 있음이 인정될 것이다.

유로키나제-형 플라스미노겐 활성화제가 내포하는 다른 생물학적 방법은 류마티스성 관절염을 포함하는 만성염중 상태와 같은 침입 및 조직파괴와 관련된 생리학적 사건을 포함한다. 민악티빈이 조직파괴에 대응하는 천연숙주의 일부이기 때문에, 이것은 특히 규정된 치료기간 동안 질병의 상태를 모니터하기 위한 유용한 마아커임이 증명될 것이다. 민악티빈으로부터 유도된 표지된 항체 또는 DNA 프로브는 혈청, 조직생검의 대식세포 및 활액에서 질병상태와 상호관련된 민악티빈 수준을 모니터하기 위한 진단시약으로서의 산업상 이용성을 갖는다. 유사하게, 민악티빈 자체는 또한 그러한 상태를 개선하기 위해 체내에 투여될때 치료효과를 가짐을 나타내었다.

Claims (46)

1. 민악티빈, 또는 민악티빈에 유사한 면역학적 또는 생물학적 활성을 나타내는 민악티빈의 일부 또는 상동체를 암호화하는 cDNA 서열의 제조방법에 있어서, 진핵 세포로부터 RNA를 얻음; 그로부터 mRNA의 단리; 상기 mRNA 서열에 상보적인 이중 스트랜드 DNA 서열의 합성; 재조합 클로우닝 벡터를 만들기 위한 상기 DNA서열의 자동적 복제 클로우닝 벡터로의 삽입; 재조합 클로우닝 벡터로 숙주세포 형질 전환; 민약티빈, 또는 민악터빈과 유사한 면역학적 또는 생물학적 활성을 나타내는 민악티빈의 일부 또는 상동체를 코드하는 삽입된 DNA 서열이 있는 형질전환된 숙주세포의 선택; 그리고 상기 형질전환된 세포의 클로우닝 벡터내에 포함된 삽입 DNA 서열의 확인으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 제조방법.
2. 민악티빈 또는 민악티빈과 유사한 면역학적 또는 생물학적 활성을 나타내는 민악티빈의 일부 또는 상동체를 암호화하는 cDNA 서열의 제조방법에 있어서, (a) 적당한 셀라인으로부터 mRNA의 단리, (b) mRNA로부터의 cDNA 라이브러리의 구축, (c) (b)로부터 적합한 숙주, 예를 들어, 대장균 또는 박테리오파지 람다로의 cDNA 라이브러리의 클로우닝 및 (d) 민약티빈, 또는 민약티빈과 유사한 면역학적 또는 생물학적 활성을 나타내는 민악티빈의 일부 또는 상동체를 암호화하는 cDNA를 포함하는 클로운의 확인으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
3. 제2항에 있어서, 클로운은 : (a) 잡종선택 번역; (b) DNA 프로브, 특히 본 발명에 따르는 합성 올리고뉴클레오티드 프로브로 이루어지는 프로브에의 교잡; (c) 유발 및 비유발된 mRNA로부터 합성된 표지된 cDNA를 사용하는 감별교잡; (d) 민악티빈 또는 다른 면역학적으로 관련된 분자에 대한 항체를 사용하는 cDNA 발현 라이브러리의 면역학적 스크리닝; 및/또는 (e) 표지된 유로키나제 및 유로키나제에 대한 항체를 사용하는 생물학적 활성에 대한 cDNA 발현 라이브러리의 스크리닝으로 확인되는 것을 특징으로 하는 방법.
4. 제2항에 있어서, 클로운된 유전자의 확장으로 더 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
5. 민악티빈, 또는 민악티빈과 유사한 면역학적 또는 생물학적 활성을 나타내는 민악티빈의 일부 또는 상동체를 암호화하는 cDNA 서열의 제조방법에 있어서, A. 자극된 민악티빈 생성 및 발현을 위한 셀라인의 유발; B. 적당한 셀라인으로부터 mRNA의 단리; C. mRNA의 시험관내 번역 및 유로키나제와의 복합체 형성에 의한 민악티빈 번역생성물의 면역침강; D. (B)로부터 mRNA의 분별 및 민악티빈 번역활성을 포함하는 분율의 확인; E. (B)와 (D)로부터의 mRNA로부터 cDNA 라이브러리의 구축; F. (E)로부터의 cDNA 라이브러리의 적합한 숙주, 예를 들면, 대장균 또는 박테리오파지 람다로의 클로우닝; G. 다음에 의한 민악티빈 유전자를 포함하는 클로운의 확인 : (a) (C)를 사용하는 잡종선택 번역; (b) DNA 프로브, 특히 본 발명에 따르는 합성 올리고뉴클레오티드 프로브로 이루어지는 프로브에의 교잡. (c) 유발 및 비유발된 mRNA로부터 합성된 표지된 cDNA를 사용하는 감별교잡; (d) 민악티빈 또는 다른 면역학적으로 관련된 분자에 대한 항체를 사용하는 cDNA 발현 라이브러리의 면역학적 스크리닝; 및/또는 (e) 표지된 유로키나제 및 유로키나제에 대한 항체를 사용하는 생물학적 활성에 대한 cDNA 발현 라이브러리의 스크리닝; H. 부분적인 민악티빈 유전자 서열로부터 얻은 올리고뉴클레오티드 프라이머, 특히 본 발명의 범위내에 명시된 올리고뉴클레오티드 서열을 사용하는 발생 cDNA 라이브러리에 의한 클로운의 유전자의 확장; I. 민악티빈 유전자의 뉴클레오티드 서열의 결정; J. 대장균에서의 민악티빈 유전자의 발현; K. 대체숙주, 예를 들면, 진핵 세포로의 클로우닝에 의한 생물학적으로 활성인 재조합 민악티빈의 발현; 및/또는 L. 재조합 민악티빈의 정제 및 그 생물학적 특성의 임상평가로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
6. 민악티빈, 또는 민악티빈과 유사한 면역학적 또는 생물학적 활성을 나타내는 민악티빈의 일부 또는 상동체를 암호화하는 재조합 DNA 분자의 제조방법에 있어서, 제27항에 따르는 방법에 따라 제조된 cDNA의 벡터 DNA로의 삽입으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
7. 제32항에 있어서, 벡터 DNA로의 발현제어 서열의 삽입으로 더 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
8. 제32항에 따라 제조된 재조합 DNA 분자를 숙주에 삽입하는 것으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 숙주를 형질전환하는 방법.
9. 민악티빈 또는 그의 상동체를 동종성으로 정제하는 방법에 있어서, a) 민악티빈 생성 컬쳐 또는 셀라인을 배양함; b) 민악티빈을 포함하는 상징액을 거둬들이고 상기 배양상징액을 농축시킴; c) 상징액을 소수성 및/또는 이온교환 크로마토그라피로 분별함; d) 겔여과 크로마토그라피로 민악티빈 함유 제제를 분별함; e) 민악티빈을 포함하는 용출물을 등전점 전기영동함; 및/또는 f) 민악티빈 활성을 포함하는 분율을 분배 크로마토그라피로 분별함으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
10. 제9항에 있어서, 걸쳐는 대식세포 셀라인인 것을 특징으로 하는 방법.
11. 제9항에 있어서, 걸쳐는 혈청의 부재하에 및/또는 유로키나제 생성을 억제하거나 민악티빈의 구성생성을 유발하게 될 물질 또는 물질들의 충분한 양의 존재하에 배양되는 것을 특징으로 하는 방법.
12. 제11항에 있어서, 물질은 덱사메타손인 것을 특징으로 하는 방법.
13. 제9항에 있어서, 걸쳐는 PMA의 존재하에 성장하는 것을 특징으로 하는 방법.
14. 제9항에 있어서, 단계(b)에서 배양 상징액의 농축은 적합한 막 기공크기의 여과 카트리지가 장치된 홀로우 화이버 투석/농축장치를 사용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
15. 제9항에 있어서, 단계(c)의 소수성 크로마토그라피는 페닐-세파로스 컬럼상에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
16. 제15항에 있어서, 페닐-세파로스 크로마토그라피는 pH단계 용리에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
17. 제9항에 있어서, 단백질은 1mM EDTA(pH 9.0)을 포함하는 1M 글리신으로 등전점 전기영동 겔로부터 용리되는 것을 특징으로 하는 방법.
18. 제9항에 있어서, 등전점 전기영동 분율은 항체와 프로브를 이루어 민악티빈띠의 위치를 결정하는 것을 특징으로 하는 방법.
19. 제9항에 있어서, 단계(f)의 분배 크로마토그라피는 HPLC인 것을 특징으로 하는 방법.
20. 비글리코실화 민악티빈의 제조방법에 있어서, 단구계통 세로부터의 mRNA를 사용하는 상기 민악티빈의 생합성을 위한 유전정보를 얻고; 결과 유전자를 미생물에 함입시키고; 상기 미생물을 선택 및 배양시켜 상기 민악티빈을 생성하고; 그리고 상기 민악티빈을 수집하는 것으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
21. 민악티빈, 또는 민악티빈과 유사한 면역학적 또는 생물학적 활성을 나타내는 민악티빈의 일부 또는 상동체의 제조방법에 있어서, 민악티빈, 또는 민악티빈과 유사한 면역학적 또는 생물학적 활성을 나타내는 민악티빈의 일부 또는 상동체를 암호화하는 DNA서열을 포함하는 재조합 DNA분자로 형질전환된 숙주를 배양하고; 발현된 민악티빈, 또는 민악티빈과 유사한 면역학적 또는 생물학적 활성을 나타내는 민악티빈의 일부 또는 상동체를 수집하는 것으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
22. 조직구조 견본에서 종양의 경계를 위치를 결정하고 규정하는 방법에 있어서, 적합하게 표지된 민악티빈 또는 그의 표지된 단편을 적용하는 표지의 농축부위를 추측하여 구하는 것으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
23. 민악티빈 또는 민악티빈 단편에 대해 제조된 항체를 사용하여 인체액 또는 조직샘플에서 민악티빈의 검출로 이루어지는 만성염증의 모니터 방법.
24. 제3항에 있어서, 클로운된 유전자의 확장으로 더 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
25. 제1항에 있어서, 상기 cDNA는 서열 :

    

    

    

    또는 그들의 단편을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
26. 제2항 내지 4항 및 24항 중 어느 하나에 있어서, 상기 cDNA는 서열 :

    

    

    

    또는 그들의 단편을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
27. 제5항에 있어서, 상기 cDNA는 서열 :

    

    

    

    또는 그들의 단편을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
28. 제6항에 있어서, 벡터 DNA는 pMSG, pKC, pLJ, pBR 322, pUC 또는 pUR 시스템, pZIP 네오 SV(X), pLK57 또는 pLK58로부터 선택된 플라스미드로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
29. 제7항에 있어서, 벡터 DNA로의 발현제어 서열은 대장균의 β-갈락토시다제 유전자,

    

    오페론, 박테리오파지 람다의 좌측 프로모터, 몰로니 백혈병 바이러스의 긴말단 반복부위, 생쥐 유방종양 바이러스 또는 SV40 초기 프로모터로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
30. 제8항에 있어서, 숙주는 박테리아, 예를 들면 대장균, 슈도모나스종, 바실러스종; 효모; 다른 곰팡이; 생쥐; 다른 동물숙주; 식물숙주; 그리고 진행생물의 조직세포, 예를 들면 곤충세포와 사람 또는 다른 포유동물의 세포로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
31. 민악티빈, 또는 민악티빈과 유사한 면역학적 또는 생물학적 활성을 나타내는 민악티빈의 일부 또는 상동체를 암호화하는 재조합 DNA 분자의 제조방법에 있어서, 제2항 내지 4항 및 24항 중 어느 하나에 따르는 방법에 따라 제조된 cDNA의 벡터 DNA로의 삽입으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
32. 제31항에 있어서, 벡터 DNA는 pMSG, pKC, pLJ, pBR 322, pUC 또는 pUR 시스템, pZIP 네오 SV(X), pLK57 또는 pLK58로부터 선택한 플라스미드로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
33. 제31항에 있어서, 벡터 DNA로의 발현제어 서열의 삽입으로 더 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
34. 제33항에 있어서, 벡터 DNA로의 발현제어 서열은 대장균의 β-갈락토시다제 유전자,

    

    오페론, 박테리오파지 람다의 좌측 프로모터, 몰로니 백혈병 바이러스의 긴말단 반복부위, 생쥐 유방종양 바이러스 또는 SV40 초기 프로모터로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
35. 제31항에 따라 제조된 재조합 DNA 분자를 숙주에 삽입하는 것으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 숙주를 형질전환하는 방법.
36. 제35항에 있어서, 숙주는 박테리아, 예를 들면 대장균, 슈도모나스종, 바실러스종; 효모; 다른 곰팡이; 생쥐; 다른 동물숙주; 식물숙주; 그리고 진핵생물의 조직세포, 예를 들면 곤충세포와 사람 또는 다른 포유동물의 세포로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
37. 민악티빈, 또는 민악티빈과 유사한 면역학적 또는 생물학적 활성을 나타내는 민악티빈의 일부 또는 상동체를 암호화하는 재조합 DNA분자의 제조방법에 있어서, 제5항에 따르는 방법에 따라 제조된 cDNA의 벡터 DNA로의 삽입으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
38. 제37항에 있어서, 벡터 DNA는 pMSG, pKC, pLJ, pBR 322, pUC 또는 pUR 시스템, pZIP 네오 SV(X), pLX57 또는 pLK58로부터 선택한 플라스미드로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
39. 제37항에 있어서, 벡터 DNA로의 발현제어 서열의 삽입으로 더 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
40. 제39항에 있어서, 벡터 DNA로의 발현제어 서열은 대장균의 β-갈락토시다제 유전자, trp 오페론, 박테리오파지 람다의 좌측 프로모터, 몰로니 백혈병 바이러스의 긴말단 반복부위, 생쥐 유방종양 바이러스 또는 SV40 초기 프로모터로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
41. 제37항에 따라 제조된 재조합 DNA 분자를 숙주에 삽입하는 것으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 숙주를 형질전환하는 방법.
42. 제41항에 있어서, 숙주는 박테리아, 예를 들면 대장균, 슈도모나스종, 바실러스종; 효모; 다른 곰팡이; 생쥐; 다른 동물숙주; 식물숙주; 그리고 진행생물의 조기세포, 예를 들면 곤충세포와 사람 또는 다른 포유동물의 세포로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
43. 민악티빈의 펩티드 또는 민악티빈의 상동체의 펩티드를 제조하는 방법에 있어서, 제9항에 따라 동종성으로 정제된 민악티빈 또는 민악티빈의 상동체를 프로테아제로 소화시키는 것으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
44. 제43항에 있어서, 프로테아제는 엔도프로테이나제 LysC로 소화되는 것을 특징으로 하는 방법.
45. 제43항에 있어서, 펩티드는 HPLC에 의해 분리되는 것을 특징으로 하는 방법.
46. 제43항에 있어서, 펩티드는 제23도에 예시된 아미노산 서열의 일부를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.

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