JPS63503354A - ミンアクチビンをコードするｄｎａ分子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 組換え生成物 孜五分団 本発明は、組換えＤＮＡ技術による新規ヒトたん白質ミンアクチビンの産生、遺 伝子のＤＮＡ配列の特性決定、ならびに組換え宿主からの大量の生物活性ミンア クチビンの発現および精製に関するものである。又本発明は、在来の生物活性ミ ンアクチビンの精製ならびにミンアクチビン由来のペプチドおよびそのアミノ酸 配列に関するものである。

宜員孜貨 ミンアクチビン（ＦＡＩ−２）はウロキナーゼ型プラスミノーゲン賦活剤の天然 不活性化剤である。この種のプラスミノーゲン賦活剤は多くの主要なヒトの癌、 特に肺癌、結腸癌、乳癌および前立腺癌の中に異常に高レベルで見出される。プ ラスミノーゲン賦活剤は、細胞転座、移動および侵入を供なうたん自分解系を仲 介すると考えられるセリンプロプアーゼである。従２つてこれらは組織破壊およ び再構築に関与するものであると考えられ、そして腫瘍の生長および転移に関連 を有するものであった。又これらは炎症反応にあずかる役割を有するものである 。

プラスミノーゲン賦活剤は一最に２つの型に分けられることが知られている。そ の１つは（１）ウロキナーゼ型であり、第２は（２）組織型である。組織型プラ スミノーゲン賦活剤は血液および血管壁中に、および血栓症に対するフィブリン 溶解防御系を賦活機能を有する組織中に主として見られる。ウロキナーゼ型プラ スミノーゲン賦活剤は通常の血栓溶解工程において作用効果を奏する様には思え ないが、侵襲や組織破壊、特に腫瘍転移や炎症反応に関連した病原性異変に関与 するものであった。

プラスミノーゲン賦活剤に特異的ないくつかの禁止剤が知られており、その１つ は胎盤から単離されたもの（Ｈｏｌｅｎｂｅｒｇ、Ｌ　ｓの「Ｂｉｏｃｈｉｍ、 Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｊ　Ａｃｔａ　５旦、１２８−１３７（１９７８））であり 、もう１つは培養血管内皮細胞中に産生されるＦＡＩ−１（Ｖａｎ　Ｍｏｕｒｉ ｋ＋Ｊ、Ａ、　、　Ｌａｗｒｅｎｃｅ、　Ｄ、Ａ、およびＬｏｓｋｕｔｏｆｆ、 Ｄ、Ｊ、のｒ　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｏ＋、　Ｊ２５９．１４９１４−１４９２ Ｈ１９８４））である。ミンアクチビンは血液単球およびＵ９３７細胞により産 生されるものであることが知られており、そして免疫的に胎盤禁止剤に関連して いると考えられている。

これら種りの禁止剤の間の関係については現在のところ知られていない。

はとんど大部分の生物学的に活性なたん白質がそうである様に、ミンアクチビン は生体内では非常に少量しか産生されず、そしてそれ自体通常の生物化学的方法 では精製したりまた特性決定するのが困難である。従ってその性質や臨床応用に おける生物学的効能等を更に評価するために大量の精製ミンアクチビンが必要と されるので、組換えＤＮＡ技術を使用して、すなわち、ミンアクチビン遺伝子を 代替宿主例えば細菌や動物細胞中でクローニングすることにより、該たん白質を 製造することが望まれている。ミンアクチビンをクローニングするためには、精 製ミンアクチビン由来の抗体、アミノ酸配列、ペプチド断片および合成オリゴヌ クレオチドの生成のために精製した天然ミンアクチビンの少量を均一となるまで 精製することが望ましい。試薬はクローニング工程において使用されるものであ る。

啓」ｕｌえ肌 ＋１ＰＬｃ　：高速クロマトグラフィーＨｒ：相対分子質量 り讐　：分子量 ＰＭＡ：４−ホルボール−】２−ミリステート−１３−アセテート５Ｏ５−ＰＡ ＧＥ　ニドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動 ＴＦＡ　：　）リフルオロ酢酸 ＨＰＡ　：ヒトプラスミノーゲン賦活剤ｂｐ：塩基対（ベースベア） ｋｂ：キロ塩基対（キロベースペア） ＰＬＩ　：　Ｐｌｏｕｇ 光皿■皿丞 第１の態様として、本発明は、ミンアクチビンの全部、１部、類縁体、相同体、 誘導体又はそれらの組合わせのアミン酸配列をコードする配列としての作用を有 する第１４７）ＤＮＡ配列、該第１の１）ＮＡ配列とハイブリダイズするＤＮＡ 配列、単一の又は複数の塩基置換、除去、挿入および転位を含めての変異により 該第１のＤＮＡ配列又はハイブリダイズする配列と関連したＤＮＡ配列、又はミ ンアクチビンであるか又はミンアクチピンと同様な免疫的又は生物学的活性を示 すポリペプチドの全部、１部、類縁体、相同体、誘導体又はそれらの組合わせを 発現の際にコードするＤＮＡ配列から成るＤＮＡ配列を提供するものである。

本発明において好ましいＤＮＡ配列および断片およびその誘導体はミンアクチビ ンの免疫的および生物学的活性を示すポリペプチドをコードするものである。

その様なりＮＡ配列は、例えば哺乳動物の細胞から、全１）ＮＡを抽出しそして 組換え分子の製造の際の標準の技術を使用してその配列を単離することにより作 ることが出来る。

又、ＤＮＡ配列の群から、ミンアクチビンの免疫的又は生物学的活性を示すポリ ペプチドをコードするＤＮＡ配列を選択する方法であって、該ＤＮＡ配列の内の どれが該活性を示すポリペプチドをコードすることが知られているＤＮＡ配列と ハイブリダイズするかを決定する工程を含んで成る方法も本発明の範囲内に含ま れるものである。

その選択された配列は、例えば天然源、合成［ＩＮＡＮＡ配列換えＤＮＡ分子か らのＤＮＡ配列およびこれらの組合わせであるＤＮＡ配列由来のものであって良 い。

好ましい態様として本発明は、ミンアクチビンのアミノ酸配列をコードする配列 としての作用を有するｃＤＮＡ配列の製造方法であって、細胞を刺激してミンア クチビンを生成させ、該刺激細胞からＩ’ｌＮＡを得て、そして１ｍＲＮＡから 該ｃＤＮＡを生成する工程を含んで成る方法を提供するものである。該細胞は好 ましくはＵ　９３７細胞である。

ミンアクチビンのｃＤＮＡを分子クローニングしそして組換え宿主中でたん白質 を発現させる方法であって、より好ましし１方法は下記の工程から成るものであ る。

（１）刺激によるミンアクチビンの産生および発現のための細胞系の誘発。

（２）適当な細胞系からのｍＲＮＡの単離。

（３）生体内でのｍＲＮＡの翻訳と、ウロキナーゼとの錯体形成によるミンアク チビン翻訳生成物の免疫沈降。

（４）　（２）からのｍＲＮＡ０分画とミンアクチビン翻訳活性を有する両分の 同定。

（５）　（２）および（４）からのｍＲＮＡからのｃＤＮＡライブラリーの構築 。

（６）　（５）からのｃＤＮＡライブラリーの適当な宿主、例えばＥ、コリ（Ｅ 、ｃｏｌｉ）又はバタテリオファージλ中へのクローニング。

（７）　（ａ）　（３）を採用するハイブリッドの選択翻訳、（ｂ）化学的に合 成したＤＮＡ配列プローブ、特に本発明の合成オリコヌクレオチドプロープから 成るプローブへのハイブリダイゼーション、 （ｃ）誘導又は未誘導ｍＲＮＡから合成した標識ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａを使用しての合 成ハイブリダイゼーション、 （ｄ）　ミンアクチビン又は他の免疫関連分子に対する抗体を使用してのｃＤＮ Ａ発現ライブラリーの免疫的スクリーニング、又は （ｅ）標識ウロキナーゼ又はウロキナーゼおよびウロキナーゼに対する抗体を使 用しての生物学的活性に対するｃＤＮＡ発現ライブラリーのスクリーニング、 によるミンアクチビン遺伝子含有クローンの同定。

（８）　ミンアクチビン遺伝子の部分配列、特に本発明範囲内のオリゴヌクレオ ド配列から得られたオリゴヌクレオチドプライマーを使用してｃＤＮＡライブラ リーを生成することによるクローン化遺伝子の拡張。

（９）　ミンアクチビン遺伝子のヌクレオチド配列の決定。

０■　Ｅ、コリ中でのミンアクチビン遺伝子の発現と生物活性を得るための複製 。

００　代替宿主、例えば真核生物細胞中へのクローニングによる生物活性組換え ミンアクチビンの発現。

０２）組換えミンアクチビンの精製とその生物学的性質の臨床評価。

第２の態様として、本発明は、ミンアクチビンの全部、１部、類縁体、相同体、 誘導体又はそれらの組合わせのアミノ酸配列をコードする配列としての作用を有 する第１のＤＮＡ配列、該第１のＤＮＡ配列とハイブリダイズする　ＤＮＡ配列 、単一の又は複数の塩基置換、除去、挿入および転位を含めての変異により該第 １のＤＮＡ配列又はハイブリダイズする配列と関連したＤＮＡ配列、又はミンア クチビンであるか又はミンアクチピンと同様な免疫的又は生物学的活性を示すポ リペプチドの全部、１部、類縁体、相同体、誘導体又はそれらの組合わせを発現 の際にコードするＤＮＡ配列から成る第１のＤＮＡ配列を含有する組換えＤＮＡ 分子提供するものである。

本発明による好ましい組換えＤＮＡ分子はミンアクチビンの全部、１部、類縁体 、相同体、誘導体又はそれらの組合わせのアミノ酸配列をコードする配列として の作用を有する第１のＤＮＡ配列、該第１のＤＮＡ配列とハイブリダイズする　 ＤＮＡ配列、単一の又は複数の塩基置換、除去、挿入および転位を含めての変異 により該第１のＤＮＡ配列又はハイブリダイズする配列と関連したＤＮＡ配列、 又はミンアクチビンであるか又はミンアクチピンと同様な免疫的又は生物学的活 性を示すポリペプチドの全部、１部、類縁体、相同体、誘導体又はそれらの組合 わせを発現の際にコードするＤＮＡ配列から成る第１のＤＮＡ配列を有効に結合 している発現制御配列を含有するものである。

又本発明の好ましい組換えＤＮＡ分子は、ミンアクチビンのアミノ酸配列をコー ドする配列としての作用を有するプラスミドである。

本発明の好ましいプラスミドは、本発明のＤＮＡ配列に結合した本発明のＤＮＡ 配列の制御発現の手段をコードする第１のＤＮＡ配列を有するものである。

本発明は又、可動プロモーター、翻訳開始部位およびヒトミンアクチビンをコー ドする遺伝子から成る融合遺伝子を提供するものである。

又、ミンアクチビンの全部、１部、類縁体、相同体、誘導体又はそれらの組合わ せのアミノ酸配列をコードする配列としての作用を有する第１のＤＮＡ配列、該 第１のＤＮＡ配列とハイブリダイズするＤＮＡ配列、単一の又は複数の塩基置換 、除去、挿入および転位を含めての変異により該第１のＤＮＡ配列又はハイブリ ダイズする配列と関連したＤＮＡ配列、又はミンアクチビンであるか又はミンア クチピンと同様な免疫的又は生物学的活性を示すポリペプチドの全部、１部、類 縁体、相同体、誘導体又はそれらの組合わせを発現の際にコードするＤＮＡ配列 から成る第１のＤＮＡ配列をクローニング媒体中へ導入する工程を含んで成る、 組換えＤＮＡ分子の製造方法も本発明の範囲内である。

好ましくは該方法は更に該クローニング媒体へ発現制御配列を導入する工程を含 んで成るものである。

更に又本発明はミンアクチビンの全部、１部、類縁体、相同体、誘導体又はこれ らの組合わせのアミノ酸配列をコードする配列としての作用を有するプラスミド の製造方法であって、ある種のプラスミドと該アミノ酸配列をコードする配列と しての作用を有するＤＮＡ配列とそして好ましくは発現は制御配列とを組合わせ ることから成る製造方法を提供するものである。このＤＮＡ配列は好ましくはｃ ＤＮＡ配列である。

第３の態様として、本発明は、ミンアクチビンの全部、１部、類縁体、相同体、 誘導体又はそれらの組合わせのアミノ酸配列をコードする配列としての作用を有 する第１のＤＮＡ配列、該第１のＤＮＡ配列とハイブリダイズするＤＮＡ配列、 単一の又は複数の塩基置換、除去、挿入および転位を含めての変異により該第１ のＤＮＡ配列又はハイブリダイズする配列と関連したＤＮＡ配列、又はミンアク チビンであるか又はミンアクチピンと同様な免疫的又は生物学的活性を示すポリ ペプチドの全部、１部、類縁体、相同体、誘導体又はそれらの組合わせを発現の 際にコードするＤＮＡ配列から成る第１のＤＮＡ配列を含有する少なくとも１個 の適当な宿主としては細菌、酵母、その他の真菌、マウス、その他の動物宿主、 植物宿主、昆虫宿主およびその他の真核生物宿主、例えばヒトを含めての哺乳動 物の組繊細胞が挙げられる。

適当な細菌としてはＥ、コリ、プソイドモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種お よびバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種が挙げられる。特に好ましいのはミンアク チビンの生合成の遺伝情報を有する微生物である。

又、ミンアクチビンの全部、１部、類縁体、相同体、誘導体又はそれらの組合わ せのアミノ酸配列をコードする配列としての作用を有する第１のＤＮＡ配列、該 第１のＤＮＡ配列と７１イプリダイズするＤＮＡ配列、単一の又は複数の塩基置 換、除去、挿入および転位を含めての変異により該第１のＤＮＡ配列又はハイブ リダイズする配列と関連したＤＮＡ配列、又はミンアクチビンであるか又はミン アクチピンと同様な免疫的又は生物学的活性を示すポリペプチドの全部、１部、 類縁体、相同体、誘導体又はそれらの組合わせを発現の際にコードするＤＮＡ配 列から成る第１のＤＮＡ配列を含有する組換えＤＮＡ分子を宿主中へ導入する工 程を含んで成る、宿主の形質転換方法も本発明の範囲内である。

又本発明は、ミンアクチビンの全部、１部、類縁体、相同体、誘導体又はその組 合わせを生合成する遺伝情報を有する微生物の製造方法であって、ミンアクチビ ンの全部、１部、類縁体、相同体、誘導体又はその組合わせのアミノ酸配列をコ ードする配列としての作用を有するプラスミド又はその他のベクターである種の 微生物を形質転換することから成る製造方法を提供するものである。

第４の態様として本発明は、ミンアクチビンを均質になるまで精製し次いでミン アクチビン特有のアミノ酸配列を得ることから成る、精製ミンアクチビン由来の ペプチドの製造方法を提供するものである。

この方法の好ましい態様は下記の工程から成るものである。

（ａ）　ミンアクチビン発現可能な細胞系の培養。

（ｂ）上ずみ液の採取。

（ｃ）上ずみ液の濃縮。

（ｄ）上ずみ液を透析し、次いで該培養上ずみ液を遠心分離して透析中に沈でん することのある残留細胞細砕物およびたん白質を除去すること。

（ｅ）クロマトグラフィーおよび電気泳動による培養上ずみの分画。

（ｆ）　ミンアクチビン活性含有画分の濃縮。

（ｇ）純度確認のためのミンアクチビン活性含有画分の分析。

（ｈ）　ミンアクチビン特有のアミノ酸配列の入手。

そしてこの方法の特に好ましい態様は下記の工程から成るものである。

（ａ）　ミンアクチビン生成培養物又は細胞系の培養。

（ｂ）培養上ずみ液の採取および該培養上ずみ液の濃縮。

（ｃ）培養上ずみ液を透析し、次いで該培養上ずみ液を遠心分離して透析中に沈 でんすることのある残留細胞細砕物およびり。

ん白質を除去すること。

（ｄ）イオン交換クロマトグラフィーによる培養上ずみ液の分画。

（ｅ）最高ミンチクチビン特異性活性を有する溶離液の採取と濃縮。

（ｆ）ゲルろ過クロマトグラフィーによる、採取濃縮した溶離液の分画。

（ｇ）溶離液の濃縮と次いで該溶離液の等電集光。

（ｈ）等電集光ゲルが単離された画分とミンアクチビンに反応性のある抗体との ブロービングによるミンアクチビン帯の確認。

（ｉ）　ミンアクチビン活性含有画分の濃縮。

（ｊ）更に分配クロマトグラフィーによる、ミンアクチビン活性含有画分の分画 と、次いでゲル電気泳動による、精製されたミンアクチビン活性含有画分の分析 。

（ｋ）精製ミンアクチビンの消化と、分配クロマトグラフィーによる、得られた ペプチドの分離。

更に好ましい態様としては、ヒトマクロファージ細胞系を培養に使用することで ある。好ましい培養条件としては、血清の不在下にそして（または）ウロキナー ゼ生成を禁止しあるいはミンアクチビンの構成的産生を誘発する様な１種又は複 数種の物質の充分量の存在下に培養を行うことである。この目的に適当な物質と しては、デキサメタシンであり、これは好ましくは１μＨの濃度で使用される。

又、ＰＭＡの存在下に培養物を生育させても良い。培養物中のＰ）’ＩＡの好ま しい濃度範囲は１〜３００ｎｇ／雌、より好ましくば１０〜３０ｎｇ／ｍｌであ る。

採取培養上ずみ液の体積は好ましくは４〜５Ｉ！、である。最初の濃縮工程は好 ましくは１０倍に濃縮する工程である。この濃縮に適当な装置は、３０．ＯＯＯ ＭＷ分離カートリッジを備えたアミコン（静１ｃｏｎ）　ＤＣ２中空繊維透析／ 濃縮装置である。

工程（ｃ）の透析は好ましくは５０ｍＭグリシンの様な透析剤でｐＨ７，８で行 う。より好ましくは、その５０ｍＭグリシン（ｐＨ７，８）透析剤を、咳透４斤 剤に対して透析すべきサンプルの体積と少なくとも同体積使用して行うのが良い 。

工程（ｄ）のイオン交換クロマトグラフィーは好ましくはフェニル−セファロー スカラム上で行い、そして溶離は好ましくは段階的ＰＩ（溶離により行う。より 好ましくはそのｐＨ段階的溶離のために、上ずみ液のイオン強度を２Ｆに調節し ておくべきであり（特にこれは固体ＮａＣ１の添加により行えば良い）、そして 次いでこのｐＨを好ましくはくえん酸により５．５に調節すべきである。

フェニル−セファロースカラムの好ましい平衡系は、５０１１１Ｍ＜７Ｌん酸ナ トリウム（ｐＨ５，５）、２Ｍ　ＮａＣ１および１　ｍＭ　ＥＤＴＡである。

このカラムは最初平衡緩衝液で、次いで０．５Ｍ　ＮａＣ１とｂｎＭ　ＥＤＴＡ を含有する５０ｍＭ　＜えん酸ナトリウム（ｐＨ５，５）で、そして最後に５０ ＋＋＋Ｍグリシン（ｐＨ９，０）で溶離すれば良い。

工程（ｄ）におけるサンプルの濃縮は好ましくはアミコンＹＭＩＯ膜上で行ない 、最終濃縮物体積を３戚とする。等電集光工程は好ましくはｐＨ４，５〜６．０ の範囲内でアムフォリン（Ａｍｐｈｏｌｉｎｅ）含有ウルトロデックス（υ１ｔ ｒｏｄｅｘ）の予備平床ゲル上で行う。そしてより好ましくは、２０ゲルをＬＫ Ｂマルチホール（Ｍｕｌｔｉｐｈｏｒ）等電集光装置上で１０°Ｃで２３時間電 気集光する。この電気集光ゲルからのたん白質用の好ましい溶離剤はＩｎ＋Ｍ　 ＥＤＴＡ含有ＩＭグリシンであり、そしてより好ましくはこれを１０！ｎ１体積 使用する。工程（ｂ）の適当な抗体としてはヤギ抗胎盤禁止剤抗体が挙げられる 。

工程（ｉ）の濃縮はアミコンＹＭＩＯＩＩＱ」二で行なえば良い。

工程（ｊ）の分配クロマトグラフィーは好ましくはＩＩＰＬｃであり、そしてよ り好ましくはウォーターズ社の高速液体クロマトグラフィーを使用してヴイダッ ク（Ｖｙｄａｃ）　Ｃ−４逆相カラム上で行う。

溶離傾斜は好ましくは０．１ＺＴＦＡ中のアセトニトリルである。工程（ｊ）の ゲル電気泳動は好ましくは５ＤＳ−ＰＡＧＥである。

工程（ｋ）の精製ミンアクチビンの消化は好ましくはエンドブロティナーゼＬｙ ｓＣで行う。適当な消化条件としては、５０μｌの体積において、３〜５μｇの ミンアクチビンを２Ｏｎ＋Ｍ　）リス−ＨＣＩ（ｐＨ８，５）および５Ｍ尿素中 の０．１　μｇのエンドプロテイナーゼＬｙｓ（：で、２２°Ｃで８時間消化を 行う方法である。分配クロマトグラフィーの適当な形態としては、特に０．１１ ＴＦＡ中のアセトニトリルの溶離傾斜によるシンクロバック（Ｓｙｎｃｈｒｏｐ ａｋ）ＲＰ−Ｐ（Ｃ−８）カラムを使用した逆相ＨＰＬＣが挙げられる。

第５の態様として本発明は実質的に純粋な形のミンアクチビンを提供するもので ある。好まし′くは該ミンアクチビンは均質な形にまで精製されているものであ る。

第６の態様として本発明は、本発明方法により製造した場合の精製ミンアクチビ ンを提供するものである。

第７の態様として本発明は精製ミンアクチビンから得たペプチドならびに該ペプ チドと同様の免疫的又は生物学的活性を有するペプチドを提供するものである。

本発明による好ましいペプチドとしては次の配列を有するペプチドが挙げられる 。

ＡＱＩＬＥＬＰＹ−ＧＤＶ−ＭＰＬＬＬＰ−Ｅ、、。

ＧＲＡＮＦＳＧＭＳＥ−ＮＤＬＦ、　、　。

？ＩＡＥ−ＥＶＥＶＹＩＰＱＦＫＬＥＥ−Ｙ、、。

ＬＮＩＧＹＩＥＤＬＫ ＩＰＮＬＬＰＥＧ−ν 本発明は又、本発明方法により製造した場合の１本発明のペプチドを提供するも のである。

第８の態様として本発明は、その全部又は１部が、ミンアクチビンの全部、１部 、類縁体、相同体、誘導体又はこれらの組合わせのアミノ酸配列を含有する、微 生物学的に生成したペプチドを提供するものである。

ミンアクチビンの免疫的又は生物学的活性を有するペプチドならびにその断片お よび誘導体も又本発明の範囲内である。

好ましいペプチドあるいはその断片又は誘導体は、ミンアクチビンのアミノ酸配 列をコードする配列としての作用を存しそしてミンアクチビンの生物学的又は免 疫的活性（この活性はミンアクチビンに対する抗血清により消滅する）を有する ＤＮＡ配列とハイブリダイズするＤＮＡ配列をコードするもの士ある。

本発明は又、非グリコジル化ミンアクチビンの全部、１部、類縁体、相同体、誘 導体又はそれらの組合わせの製造方法であって、単球血統の細胞からのｍＲＮＡ を使用してミンアクチビンの生合成の遺伝情報を得ること、こうして得られた遺 伝子を微生物中に導入すること、該微生物を選択培養して該ミンアクチビンを生 成すること、および該ミンアクチビンを採取することから成る工程を含有して成 る製造方法を提供するものである。

更に又本発明は、ミンアクチビンの免疫的又は生物学的活性を有するペプチドの 製造方法であって、ミンアクチビンの全部、１部、類縁体、相同体、誘導体又は それらの組合わせのアミノ酸配列をコードする配列としての作用を有する第１の ＤＮＡ配列、該第１のＤＮＡ配列とハイブリダイズするＤＮＡ配列、単一の又は 複数の塩基置換、除去、挿入および転位を含めての変異により該第１のＤＮＡ配 列又はハイブリダイズする配列と関連したＤＮＡ配列、又はミンアクチビンであ るか又はミンアクチピンと同様な免疫的又は生物学的活性を示すポリペプチドの 全部、１部、類縁体、相同体、誘導体又はそれらの組合わせを発現の際にコード するＤＮＡ配列から成る第１のＤＮＡ配列を含有する組換えＤＮＡ分子で形質転 換した宿主を培養する工程を含んで成る製造方法を提供するものである。

更に又本発明は、組織学的検体中の又は生体中の腫瘍の境界を確認決定するため の試薬であって、適当に標識したミンアクチビン、特に組換えＤＮＡ由来由来ミ ンチクチビンミンアクチビンの断片を含有して成る試薬、ならびに組織学的検体 中の又は生体中の腫瘍の境界を確認決定するためのこれに関連した方法であって 、適当に標識したミンアクチビン又はその断片を適用又は投与し、次いでこれを 造影して該標識体の濃度部位を測定することから成る方法を提供するものである 。

更に又本発明は、処理の必要な患者に治療有効量のミンアクチビン、適当に標識 したミンアクチビン、ミンアクチビンの断片又はミンアクチビンの標識した断片 を投与することから成る、腫瘍の侵襲を禁止しそして腫瘍を処置する方法、およ び処置の必要な患者に治療有効量のミンアクチビン又はミンアクチビンの断片を 投与することから成る、リウマチ性関節炎の様な慢性炎症を処置する方法、およ びミンアクチビン又はミンアクチビンの断片に対して作成した抗体を使用して体 液および体組織のサンプル中のミンアクチビンを検出することから成る、慢性炎 症を診断する方法を提供するものである。

そして又、組換えミンアクチビン、精製天然ミンアクチビンおよびそれらの断片 を含めてのミンアクチビンに対して作成した抗体製剤も本発明の範囲内である。

又本発明は、ミンアクチビン、特に組換えＤＮＡ由来由来ミンチクチビンンアク チビンの断片又はミンアクチビン又はミンアクチビンの断片に対する抗体と、そ の薬理的に許容し得る非毒性担体又は希釈剤とから成る、治療用、診断用又は予 防用組成物を提供するものである。

更に又本発明は、発現の際に本発明のペプチドのアミノ酸配列をコードする第１ のヌクレオチド配列、該第１のヌクレオチド配列と充分に関連していて該第１の ヌクレオチド配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列、又は単一の又は複数 の塩基置換、除去、挿入および転位を含めての変異により該第１のヌクレオチド 配列と関連したＤＮＡ配列から成る配列を有する合成オリゴヌクレオチドプロー ブを提供するものである。

又、精製ミンアクチビン由来のペプチド断片のアミノ酸配列を決定し、そして相 当するオリゴヌクレオチドを合成することから成る、前記合成オリゴヌクレオチ ドプローブの生成方法も本発明の範囲内である。

又本発明は、本発明の合成オリゴヌクレオチドプローブから成る製剤構成物を提 供するものである。

該製剤構成物は好ましくは診断用反応剤である。

更に又本発明は、ヒトの癌および炎症状態およびそれに対する感染程度を検出す る方法であって、ミンアクチビンをコードするＤＮＡの検出のための分析におい て前記の合成オリゴヌクレオチドプローブを含む製剤構成物を使用することから 成る検出方法を提供するものである。組織におけるミンアクチビン生成能の不足 は癌および炎症状態に対する感染程度と関連していることが多い。該生成能欠陥 は患者に精製ミンアクチビンを投与することにより処置可能であり、またこれは 癌および炎症によって侵された組織に対するマーカーとして意味を有するもので もある。

２訓ｐ１０ＩＬ亀肌 Ｌｌはミンアクチビン活性をプロットした回であって、ミンアクチビン分泌にお けるＰ？Ｉ＾の作用を示すものである。

ｍはサイズ分画したミンアクチビンｍＲＮＡ製剤のゲル分析クチビンｍＲＮＡを 示すサイズ分画されたｍＲＮＡの生体外翻訳の後に免疫沈降した生成物のオート ラジオグラフィ〜を表わす。

１［、は、抗ウロキナーゼ抗体を使用してのウロキナーゼとの複合体形成の特異 性を示す免疫沈降翻訳生成物のオートラジオグラフィーを表わす。

１１回は、抗胎盤禁止荊抗体を使用してのウロキナーゼとの複合体形成の特異性 を示す免疫沈降翻訳生成物のオートラジオグラフィーを表わす。（オートラジオ グラムは、抗胎盤禁止剤抗体を使用した場合の結果と、抗ウロキナーゼ抗体を使 用した場合の結果とが同じであることを示している。

ｆｉ、還元条件下でのウロキナーゼの存在又は不在下における免疫沈降生成物の 比較によってミンアクチビン翻訳生成物を固定するオートラジオグラフィーを表 わす。

員１皿は、フィブリン被覆技術を使用してのウロキナーゼ種の識別を示すゲルを 表わす。

ｍは、全たん自溶出物に関して、富化ミンアクチビン活性体の溶出を示すセファ クリルＳ−２００クロマトグラムである。

ｍは溶離条件を変化させた場合のフェニル−ボロネートアガロースからのミンア クチビン活性の別々の溶出状態を示すものである。

筆■皿は溶離ｐＨの関数としての着色集光カラムから溶出した全たん白質に関す るミンアクチビン活性体の溶出を示すクロマトグラムである。

第１１図はたん白質含有量対ミンアクチビン活性を示す、等電集光ゲルから単離 したたん自画分のゲル上のミンアクチビン活性のスーパーインポジションを表わ すものである。

星ｕと皿はミンアクチビン活性溶出を示す、免疫アフィニティカラムの溶出プロ フィールである。

第肥し皿は免疫アフィニティカラムから溶出したミンアクチビンの５ＯＳ−ＰＡ ＧＥゲルおよびこのゲルのウェスタンプロットを表わす。

ｍは高分子量形および低分子量形および還元条件下の高分子量形の解離を表わす ５ＤＳ−ＰＡＧＥ上の１１２５−標識ウロキナーゼのオートラジオグラフである 。

ｍはフェニル−セファ０−ス力ラムの段階ｐＨ溶離からのミンアクチビン活性お よびたん白質の溶出プロフィルを示すものであり、ここでＡは５０ｍＭ　＜えん 酸ナトリウム、ＩｍＭ　ＥＤＴＡおよび０．５Ｍ塩化ナトリウムでの溶離を、そ してＢは５０ｍ１グリシン（ｐＨ９，０）での溶離を表わす。

星旦園はたん白質含量対ミンアクチビン活性を示す、等電集光ゲルから単離した たん自画分の５Ｏ３−ＰＡＧＥゲル上のミンアクチビン活性のスーパーインポジ ションを表わすものである。

第川辺はたん白質のニトロセルロース上へのウェスタン転移後の第１５図の等電 集光実験からの両分および抗胎盤禁止剤抗体でのたん白質の免疫学的検出を示す ものである。

箪ｕ皿はグイダックＣ−４逆相高速液体クロマトグラフィー操作からの高度に精 製したミンアクチビン製剤の溶出プロフィルを示すものである。

呈■旦は第１７図のＨＰＬＣ操作のビーク５から得た均質ミンアクチビンの５Ｄ Ｓ−ＰＡＧＥを示すものである。

凪旦区はシンクロパックＲＰ−Ｐ（Ｃ−８）カラム高速クロマトグラフィー操作 から溶出したミンアクチビンのペプチドの溶出プロフィルである。

ｍはミンアクチビン遺伝子の分節を含有するクローンのエンドヌクレアーゼ制限 地図およびＤＮＡ配列決定法を示すものｆｆｉは連続したミンアクチビン遺伝子 を含有するプラスミドｐＢＴＡ４３Ｂの構築を示すものである。

ｍはミンアクチビン遺伝子の全ｃＤＮＡおよびミンアクチビンたん白の演鐸した アミノ酸配列を示す。ここにアミノ酸配列分析から得られた５個のペプチドに下 線を付した。

箪ｎはミンアクチビン発現べ久クーｐＢＴＡ４４４およびｐＢＴＡ４４７の構築 を示すものである。

クリルアミドゲル電気泳動、ウェスタン分析およびＳ３５パルス標識たん白質分 析を示すものである。

ｍはハイブリッドたん白発現ベクター（ａ）　ｐＢＴＡ４４０および（ｂ）　ｐ ＢＴＡ５８６の構築を示すものである。

ｍはｐＢＴＡ４４０およびｐＢＴＡ５８６から発現したハイブリッドミンアクチ ビンたん白質のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動、ウェスタン分析および ５ｆｆ５パルス標識たん白質分析を示すものである。

蒸泄皿はミンアクチビン遺伝子を含有する哺乳動物のクローニングヘクターｐＢ ＴＡ５８７　、ｐＢＴＡ５８８およびｐＢＴＡ５９０　ノ構築を示すものである 。

星皿区はウロキナーゼの存在下又は不在下での免疫沈陣後の哺乳動物細胞中のミ ンアクチビンの発現を示すオートラジオグラフである。

Ｈを−　するだめの最　のノ能 ヒミンアクチビンＡ　のＵ９３７　胞二〇−ミンアクチビンは誘導ヒト単球、あ る種のマクロファージおよび単球血統の形質転換細胞により生成されることが知 られている。（国際特許出願第一０８６）０１２１２号参照。）形質転換細胞系 Ｕ９３７（ＡＴＣＣＣＲＬ１５９３）はデキサメタシンの存在下に構成的にミン アクチビンを生成することが見出された。無血清条件下においてこれらの細胞に より分泌されるミンアクチビンのレベルはこれらの細胞の分泌する全たん白質量 のわずかに０．０６χにすぎないものであることが知られていた。又、このレベ ルは４−ホルボール−１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）の添加に より約０．４χ程度増加し得ることが知られていた。ＰＭＡのミンアクチビン分 泌に対する経時効果は２相推移系をとるものであり、最初の６時間は低く、次い で６０時間まではミンアクチビン活性は直線的に増加した（第１図）。又、ＰＭ Ａ濃度をＬｏｎｇ／ｄから３０ｎ　ｇ　／　ｕｄｌへ増加しても何らの相異も観 察されなかった。更に又、１７時間後でさえも放射標識したＰＭＡは培養上ずみ 液中にほんの少量（１０％未満）しか検出されなかったので、ホルボールエステ ルは細胞をしっかりと結合していたと断定された。

下記の実施例は本発明の好ましｌ）態様を開示するものである。

しかしこれらは本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。又 特記しない限り部および％は重量部および重量％である。

実施班上 豊凶１喪 ヒトマクロファージ細胞系Ｕ９３７を、Ｔ１７５培養フラスコ中で又は１０Ｉｌ のプラウム（Ｂｒａｕｎ）　Ｎ酵器中で、１０％ウシ胎児血清および１μｉデキ サメタシン含有ＲＰＭ１１６４０中で培養した。細胞は１〜３Ｘ１０’個／　ｍ ｌの密度に保持した。この生長相中に細胞によってミンアクチビンが分泌される けれども、細胞を無血清培地に移してミンアクチビン精製用に上ずみ液を取った 。細胞をペレット化し、１度洗浄し、１μｈデキサメタシン含有のＲＰＭ１１６ ４０中に再けん濁し、そして３日間培養した。無血清条件下にこれら細胞により 分泌されたミンアクチビンのレベルは、ＰＭＡの添加により約０．４χ程度増加 した。

次いで細胞を採取し上ずみ液を以下に記載する精製工程に使用した。

実施例２ 力Ｉ］じグ１色土ｙンの精製 （ａ）無血パ　ミンチクチビン上ずみ液のゝ縮典型的なものとして、４〜５２の 培養上ずみ液を、３０．　ＯＯＯＭＷ分離カートリッジを備えたアミコンＤＣ２ 中空繊維透析／濃縮装置を使用して１０倍に濃縮した。次いでこの濃縮物を少な くとも等量の５０ｍＭグリシン（ｐＨ７，８）に対して透析して全痕跡量の色素 を除去した。

（ｂ）　ミンアクチビンゝ−白　の′心ゝ透析した濃縮物をＪＡｌｏ−ローター 中で８０００ｒｐｎ＋で３０分間４℃で遠心分離して、残留細胞細砕物と透析中 に沈でんしたと思われるたん白質とをペレット化した。次いでこの透明にした上 ずみ液をアリクオツドに作成しそして次の精製工程に使用するまで一２０°Ｃで 凍結しておく。

ＰＭＡを添加しないで培養した細胞から得られた培養上ずみ液を１０倍に濃縮し たものから、下記の様なフェニル−セファロースを使用しての段階的ｐ　Ｈ’Ｒ ＬＭ法により更にミンアクチビンを精製した。

上ずみ液（２００ｍｌ、１２０００単位、特異活性１０２単位／■）のイオン強 度を、固体ＮａＣ１の添加により２Ｍに調節し、又そのｐＨをくえん酸により５ ．５に調整した。この溶液を、５０ｍＭ、＜えん酸ナトリウム（ｐＨ５，５）、 ２Ｍ　ＮａＣｌおよび１ｍＭ　ＥＤＴＡで平衡化したフェニル−セファロースカ ラム（４，４ｃｍ　Ｘ　５．Ｏｃｍ）中に装入し、そして２８０ｎｍ　（Ａ２８ ０）における基線吸光度が基線にもどるまで同じ緩衝液で溶出した。次いでカラ ムを０．５Ｍ　ＮａＣ１と１ｍＭ　ＥＤＴＡを含有する５０ｍＭ　＜えん酸ナト リウム（ｐＨ５，５）で溶出してそして再度吸光度が基線にもどるまでＡ２８０ を観察した。次にミンアクチビンを５０ｍＭグリシン（ｐＨ９，０）でカラムか ら？８出した。第１４図はこの溶離プロフィルを示すものである。

この方法によるミンアクチビンの回収量は９５５３単位であって、これはカラム に装入した単位の８０％に相当する。最高特異活性を有する物質を集め（６７０ ０単位、特異活性１３４３単位／■）、そしてアミコンＹＭＩＯ膜上で濃縮して ３ｄとした。

（ｄ）セファクリルＳ−２００ゲル゛・クロマトグラフィーこうして集めて濃縮 したミンアクチビンを、０．１旧よう酸ナトリウム（ｐ）１９．０）で平衡化し たセファクリルＳ−２００の２．２ｃｍＸ７ＢΩカラム中に装入した。５．０　 ｄの両分を流速０．４６ｄ／分で集めた。第８図はミンアクチビンが主たん白質 ピークの尾端部に溶出したことを示している。ミンアクチビン活性を有する両分 を集め（４４８０単位、特異活性１３５５単位／ｍｇ）　、そしてＹＭＩＯ膜を 使用して３ｄにまで濃縮した。公知のＭｒ標準体でのこのカラムの検量によれば 、ミンアクチビンが４５〜４８ＫＤのＭｒを有していることが明らかとなった。

（ｅ）等里策人 濃縮ミンアクチビン溶液を、ｐＨ値範囲４．５〜６．０のアムフオリン含有つル トロデックスの予備平床ゲルに装填し、ＬＫＢマルチホール等電集光装置上で２ ３時間１０°Ｃで電気集光した。この操作の終了後に、ゲルの長さ方向を横断す る３０ゾーンをかき出して、そして１ｍＭ　ＥＤＴＡ　（ｐＨ９，０）を含有す る１Ｍグリシン１０Ｉｎ１を使用してそれぞれからたん白質を溶離した。各両分 のアリクオツドをミンアクチビン活性について分析し、１５％５ＤＳ−ポリアク リルアミドゲル上で電気泳動してたん白質を確認した。第１５図はミンアクチビ ン活性を有する両分から著量のたん白質が分離された事を示している。これらの 状況から、ミンアクチビンはｐＨ５〜ｐＨ５，２の間で等電集光し、そしてこの ゲルの領域内においては該ゲルに装填したミンアクチビン全活性の１５％が回収 された。

事実、ミンアクチビン活性を有する等電集光ゲルの領域内において、２つのたん 白質バンドだけが可視となって表れている（第１５図）＃これらのバンドの内ど ちらがミンアクチビンであるか決定するために、等量のアクリルアミドゲル上の たん白質をニトロセルロース上に移しそしてヤギにおける胎盤禁止剤に対して作 った抗体でブロービングした。同じ様な生物学的性質を持っているので、２つの 両たん白質は免疫的に関連がある様に考えられた。第１６図に示す様に、Ｍｒ　 ＝　４５〜４８ｋＤのたん白質バンドは抗胎盤禁止剤抗体と特異的に交叉反応し 、従ってこのたん白質がミンアクチビンであることを示している。更に又、この 観察はゲル透過クロマトグラフィー上の在来ミンアクチビンを決定した４５〜４ ８ｋＤのＭｒと一致している。

（ｆ）　ＭｆＬ′　クロマトグラフィーミンアクチビン活性を有している上記等 電集光による両分をアミコンＹ？１１０限外ろ過膜上で１０倍に濃縮し、そして 更にウォーターズ社の高速クロマトグラフィーを使用してヴイダックＣ−４逆相 カラム上で分画した。たん白質を、第１７図に示した様に、０．１ｘＴＦＡ中の アセトニトリルの溶離傾斜を使用して逆相カラムから？８出した。各吸光度ピー クを５ＤＳ−ＰＡＧＥにより調べ、そして第５ピークが純粋ミンアクチビンを含 有していることがわかった（第１８図）。

次崖■ハ （ａ）ｙ四五通 細胞を含有しない上ずみ液を、ＷＯ３６１０１２１２の精製実施例２に記載の工 程（ａ）および（ｂ）に従って処理し、次いで、ＷＯ３６１０１２１２の精製実 施例１に記載の段階的ｐＨｍ離法を使用してのフェニル−セファロースを通して 処理した。ミンアクチビン活性を有する両分を集め、８５％飽和硫酸アンモニウ ムでの沈降により濃縮し、そしてＯ，ＩＰはう酸ナトリウム（ｐＨ９，０）で平 衡化したセファクリルＳ−２００の２．２　ｃｍＸ８０ｃｍカラム中に装入した 。３．５ｍＲＯ画分を０．４６ｄ／分の流速で集めた。第８図は、ミンアクチビ ンが主たん白質ピークの尾端部に溶出し、そして２２０６単位／■のピーク特異 活性を有していた事を示している。尚この活性は特異活性の３１倍の全増加量に 相当する。この様な状況から、ミンアクチビンはストークス半径について分子と してオバルブミンと同様な挙動を示すものであり、４５〜４９Ｘ１０３ダルトン の分子量を有するものであると考えられる。

（ｂ）フェニルーボロネートヱ支三二人２０マドグラフ仁細胞を含有しない上ず み液を、　ｈｏ８６１０１２１２の精製実施例２に記載の工程（ａ）および（ｂ ）に従って処理した。この上ずみ液の１ｍｌをＭｇＣ１２９１０ｍＭとし、そし て次いで水酸化ナトリウムでｐＨを８．５に調節した。この溶液を、１０ｍＭ　 ＭｇＣｌ□を含有する５０ｎ？グリシン（ｐ）１８．５）で平衡化したフェニル −ボロネートアガロース−３０（ＰＢＡ３０）のカラム（０，８ｃｍＸ２．５　 ｃｍ）中に４°Ｃで装入した。

次いでこのカラムを上記の緩衝液９ｄで洗浄しそして次いで下記の溶液で順次洗 浄した。

（ａ）　１０ｍＭ　ＥＤＴＡ含有の５０ｍＭグリシン（ｐ）１８．５）の１０ｍ １゜（ｂ）　１００ｍＭソルビトール含有の５０＋ａＭグリシン（ｐＨ８，５） の１０ｍ２゜（ｃ）　１００ｍＭ　）リス−ＨＣｌ　（ｐＨ８，５）の１０戚。

（ｄ）　５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５，０）の１０ｍ１゜５ｄの両分を集め 、そしてミンアクチビン活性およびたん白質決定の前に、４　’Ｃで１晩、ｐＨ ７，８で５０ｍＭグリシンに対して透析した。第９図に示した結果から、別の条 件下でカラムから２つの明確な活性ピークが溶出していることがわかる。第１の ピークはＥＤＴＡで溶出したものであり、１４倍の特異活性の増加を以って、カ ラムに装填した全活性の３５％を含有するものである。

第２のピークは、特異活性の４．４倍の増加を以って、当初の活性の３２％を表 わしている。

（ｃ）　Ｎ負釆人 細胞を含有しない上ずみ液を、ＷＯ３６１０１２１２の精製実施例２に記載の工 程（ａ）および（ｂ）に従って処理した。この上ずみ液の４ｄを２５１１ＩＭイ ミゾダールー〇ＣＩ緩衝液（ｐＨ７，４）に対して透析し、次いで該緩衝液で平 衡化したＰＢ２９４着色集光カラム（１ｃｍＸ２７ＣＩ１１）に装入した。次い でｐＨ４，０のポリ緩衝液２００　ｄの使用により直線ｐＨ傾斜を確立し、そし て４ｄの両分を集めて１Ｍトリス−ＨＣｌ　（ｐＨ７，５）の４ｄのアリフォラ １−とじた。各１０個の両分を集め、濃縮しそしてセントリコン（ｃｅｎ　ｔｒ 　１ｃｏｎ）　３０上で洗浄してミンアクチビン活性とたん白質濃度を分析した 。第１０図は大部分の活性がｐｌ（５の近くで溶出し、たことを示している。活 性の全回収率は８２％であり１．特異活性の２倍の増加があった。

（ｄ）等地−剰光 細胞を含有し７ない上ずみ渣を、ＷＯ３６１０１２１２の精製実施例２に記載の 工程（ａ）および（ｂ）に従って処理し、次いでＷＯ３６１０１２１２の精製実 施例１に記載の段階的ｐＨ溶離法を使用してのフェニル−セファロースを通して 処理した。ミンアクチビン活性を有する画分を集め、８５％飽和硫酸アンモニウ ムでの沈降により濃縮し、そして５０ｍＦ′ｌグリシン（ｐＨ９，０）に対しで ｌ晩透析した。この？’４　？Ｆ１．を、ｐＨ値範囲４，５・〜６．０のアムフ ォリン含有つルトロデックスの予０１平床ゲルに装填し、ｉ、、Ｋ　Ｂマルチホ ール等電集光装置上で２３時間１０°Ｃで電気集光した。この操作の終了後に、 ゲルの長さ方向を横断する３０ゾーンをかき出して、そして１ｍＭ　ＥＤＴＡ（ ｐ）１９．０）を含有する１？Ｉグリシン１０ｄを使用してそれぞれからたん白 質を溶離した。各両分のアリクオツドをミンアクチビン活性について分析し、１ ５％５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動してたん白質を［ｉＵした。

第１１図はミンアクチビン活性を有する両分から著量のたん白質が分離された事 を示している。

これらの状況から、ミンアクチビンはｐ）＋５〜ｐ）１５．２の間で等電集光し 、そしてこのゲルの領域内においては該ゲルに装填したミンアクチビン全活性の ３９％が回収された。

（ｅ）免筏ｌフッ三ｌコ＝クロマトグラフィー細胞を含有しない上ずみ液を精製 実施例１の様にして処理した。このミンアクチビン製剤（２３００単位、２．２ ５■、特異活性１０２０　Ｕ　／　ｒｎｇ　）の４．６−のアリクオツドをりん 酸ナトリウム中０．０５Ｍ　、ＮａＣｌ中０．５、トリトンＸ−１００中０．０ １χ、アジ化ナトリウム中０．１χ、ＥＤＴＡ中１ｍＭとし、そしてｐ＋＋を７ ．５に調節した。この溶液を上記緩衝液で１５滅に希釈し、ぞして抗胎盤禁止剤 抗体１０■を化学的に結合したセファロース４Ｂの１５雄に加えた。このスラリ ーを４°Ｃで１晩振とうし、次いで２．５　ｃ＋ｎＸ３．１　ｃｍｌのカラム中 に注ぎ入れた。未結合たん白質がカラムから排出され、そしてこのカラムを、２ ８０ｍｍにおける吸光度が基準線に戻るまで緩衝液で洗浄した。次いでカラムを 、１０ｍＭ　）リス−〇ＣＩ　（ｐＨ８，０）を含有する３Ｍ　Ｘ５ＣＮで溶出 した６溶出プロフイールを第１２図に示した。ＫＳＣＨにより溶出した画分をセ ントリコン（Ｃｅｎ　ｔｒ　１ｃｏｎ）１０上で８．５倍に濃縮し、４０ｍＭグ リシン（ｐＨ７，８）で洗浄し、そして５ＯＳ−ＰＡＧＥによりミンアクチビン 活性を分析した。大部分のミンアクヂビン活性は抗体カラムと結合していなかっ た。しかしながら、少量のミンアクチビン活性（８，５単位）は特異的に結合し ており、３Ｍ　ＫＳＣＮにより溶出する。この事は、これらの条件下で抗体カラ ムはミンアクチビンを超過担持しているという事を意味するものである。更に又 、ミンアクチビンはかなりの時間の間にＫＳＣＮの存在下にその活性の９０％以 上を失活するが、これはミンアクチビン活性の回収率が低いことはＫＳＣＨ中に おける分子の失活が原因であるを示すものである。５ＩＩＳ−ＰＡＧＥの結果は ほとんど大部分のたん白質溶出物がカラムから阻害されることなく溶出したこと を示している。しかしながらＫＳＣＮ溶離剤は、ゲルろ過におけるミンアクチビ ンの分子サイズと同様（実施例２Ａ　（ａ）参照）の約４５．０００の分子量の 多くのたん白質バンドを含有している（第１２ａ図）、このミンアクチビン製剤 のウェスタン分析によれば、単一の免疫交差反応種が５Ｏ３−ＰＡＧＥに続いて 観察されたたん白質バンドと同一の移動をすることが明らかとなった（第１２ｂ 図）。

ある条件下ではミンアクチビンは約６０．０００〜７０．０００の分子サイズを 有することが観察されている（ＰＣＴ１９１−８５に詳しく記載されている）。

この矛盾は、ミンアクチビンのグリコジル化度による可動性の変化に起因するも のであると考えられる。

災施炎主 ミンアクチビンからのペプチド　片の　と配ド上記実施例２の様にして、ＰＭＡ 誘発Ｕ９３７細胞からミンアクチビンを精製した。次いでこのミンアクチビン（ ３〜５μｇ）を、５Ｍ尿素を含有する２０ｍＭトリス−ＨＣｌ　（ｐＨ８，５） 中のエンドプロティナーゼＬｙｓＣ（０，１μｇ）の最終体積５０μ！で、８時 間２２°Ｃで消化した。

得られたペプチドを、０．１ｘＴＦＡ中のアセトニトリルの溶離傾斜を使用して シンクロバックＲＰ−Ｐ（（ニー８）カラム上の逆相高速液体クロマトグラフィ ーにより分離した（第１９図）。星印を付したペプチドをアプライドバイオシス テム（Ａｐρｌ１ｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）４７０Ａ気相シークエンサーによ りシーフェンシング（配列決定）し、そしてその配列は下記の通りである。

ペプ−ｆ−）’　１３　：　ＡＱＩＬＥＬＰＹ−ＧＤＶ−ＭＦＬｌ、ＬＰ−Ｅ、 、。

ペプチド　１１　：　ＧＲＡＮＦＳＧＭＳＥ−ＮＤＬＦ、、。

ペプチド　１０　：　ＭＡＥ−ＥＶＥＶＹＩＰＱＦＫＬＥＥ−Ｙ、、。

ペプチド　６　：　ＬＮＩＧＹＩＥＤＬＫペプチド　９　：　ＩＰＮＬＬＰＥＧ −Ｖ実１建先 ミンアクチビンの　子クローニング （ａ）　ｍＲＮＡの単離 第１図より、ＰＭＡ誘発Ｕ９３７細胞の最適転写時間は１５〜２５時間の間であ ると考えるのが妥当である。従って、Ｕ９３７細胞の細胞密度１．２　Ｘｌ０６ 個／ｄの４！無血清培養液をＰＭＡの存在下に１９時間培養し、細胞を採取し、 そして次に使用するまでの間液体窒素中ですばやく凍結させた。ＰＭＡでの刺激 を与えていないＵ９３７細胞を３日間無血清培養したものも同様にｍＲＮＡ単離 のために保持した。国際特許出願第ＷＯ３９１０１２１２号の記載の様にして作 りそして対外で（試験管内的に）３日間培養したヒト血液単球も又ｍＲＮＡ源と して使用した。

上記の原料のそれぞれから、グアニジン−１１Ｃ１法の変法により全ＲＮＡを抽 出した。細胞ペレットを、４Ｍグアニジンイソチオシアネート、５０ｍＭ　トリ ス−ＨＣｌ　（ｐＨ７，５）、１０ｍＭ　ＥＤＴＡ　、　０．５χサルコシル（ Ｓａｒｋｏｓｙｌ）、および０．１Ｍ　２−メルカプトエタノールを含有する緩 衝液の２０倍体積（１ｇ重量につき）中で、撹拌器中で４°Ｃで３分間ゆっくり とした速度で均質化（ホモジナイズ）した。次いでけん濁液を１０分間遠心分離 して細砕物を除去した。

酢酸を２５ｏ＋Ｍまでと、冷エタノールを０．７５５体積加えることによって上 ずみ液から核酸を沈でんさせ、そして−２０°Ｃで１晩培養した。再びけん濁液 を３０分間−１０°Ｃで遠心分離し、そしてベレットを７．５ｈグアニジン−） １ｃＩ、２０ｍＭ酢酸ナトリウム（’ｐＨ５，０）および１ｍＭジチオスレイト ールを含有する緩衝液中にもとの体積の２０％となる様に溶解した。遠心分離し て未溶解物質を除去した後に、０．５５５体積の冷エタノールを加えて一２０° Ｃで１〜３時間するとＲＮＡが沈でんした。このＲＮＡを遠心分離により回収し 、グアニジン−ＨＣｌ緩衝液中に再溶解しそして沈でんさせた。この最後の工程 は３回くり返し行なった。最終法でんの後に、ペレットを２０ｍＭ　ＥＤＴＡ　 （ｐＨ７，０）中に溶解し、そして等体積のクロロホルム：ブタノール（４：１ ）で抽出した。次いでＲＮＡを、酢酸ナトリウム（ｐＨ５，０，０，３Ｍまで） と２体積倍の冷エタノールを加えて一２０°Ｃに１晩保つことにより、水相から 沈でんさせた。このＲＮＡを遠心分離により回収し、２Ｏｎ＋Ｍ　ＨＥＰＥＳ　 （ｐＨ７，４）および０．５χドデシル硫酸ナトリウム中の１００■／ｄのプロ ティナーゼにで５０″Ｃで４時間処理して残留たん白質がある場合にはこれを除 去した。次いで０．２月酢酸ナトリウム（ｐＨ５，０）および２体積倍のエタノ ールの存在下に一２０°ＣでＲＮＡを沈でんにより回収した。遠心分離による回 収の後で、３Ｆ′Ｉ酢酸ナトリウム（ｐＨ６，０）の存在下に４°Ｃで１晩ＲＮ Ａを沈でんさせることにより残留ＤＮＡがある場合にはこれを除去した。ＲＮＡ を遠心分離により回収し、そして０．２５Ｎ塩化ナトリウムおよび２体積倍のエ タノールの存在下に沈でんさせた。このＲＮＡを再度遠心分離により回収した。

次いで吸着およびオリゴ（ｄＴ）−セルロースからの溶出を２サイクル行なって ポリＡ″ｍＲＮＡを単離した。

このポリＡ″ｍＲＮＡを、しょ糖密度こう配遠心分離により１０〜２０倍のミン アクチビンｍＲＮＡに濃縮した。このサンプルを１５〜３４％（−八）しょ糖こ う配上に層状におき、そしてインクマン５Ｗ４１０−ター中で３３．ＯＯＯｒｐ ｍ　、４°Ｃで１６時間遠心分離した。第２図はサイプ分画したｍＲＮＡ製剤の 変性条件下におけるゲル分析を示すものである。第３図に示す様に、ミンアクチ ビンｍＲＮＡは、試験管内翻訳および免疫沈降法（後記する）により決定された １８Ｓリボゾ一ムＲＮＡ標準体の回りに集中した両分（画分１６および１７）中 に検出された。

（ｂ）　ミンアクチビン　訳注゛物の臼ミンアクチビンｍＲＮＡは、細胞を含有 しない網状赤血球溶解産物系中での試験管内翻訳およびそれに続く、その天然物 質ウロキナーゼを利用したミンアクチビン翻訳生成物の免疫沈降により同定した 。

アマージャム社（Ａｍｅｒｓｈａｍ）から市販のウサギ網状赤血球溶解産物を、 最初にメーカーの指示通りに、ウシ肝臓ｔＲＮＡ　（Ｂｏｅｈｒｉ−ｎｇｅｒ　 Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を１１００ｎ／ｍの濃度で加えて使用した。３５５−メチオ ニン（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を２ｍＣ１／ｄの濃度で加えて、オートラジオグラフ ィーにより翻訳生成物を検出できるようにした。上記の様にして作成したポリＡ ″ｍＲＮＡを５０■／ｄの濃度で９０分間３０°Ｃで翻訳した。２５μ２の翻訳 生成物を各免疫沈降に使用した。培養しそして全スタフィロコツ力スオーレウス （Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ）細胞（Ｐａｎｓｏｒｂｉｎ、　 Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）の洗浄けん濁液を除去して非特異結合を最少にした後で 、このサンプルを５Ｏｎ＋ＰＶのウロキナーゼ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）で室温 で９０分間培養した。この工程によりミレアクチビン翻訳生成物とウロキナーゼ との間の錯体が生成する。この錯体を、１〜２μ、！の抗ウロキナーゼ抗血清（ ミドリ十字社）又は胎盤禁止剤に対する抗体を加えることにより溶液から取り出 し、３０分間室温で、次いで１晩４°Ｃで培養し、ソシて次に２５μｌの洗浄パ ンソルビン（Ｐａｎｓｏｒｂｉｎ）を加えることにより沈でんさせた。遠心分離 後、ミンアクチビンーウロキナーゼー抗体−パルソルビンベレットを洗浄し、２ ％ＳＤＳおよび２−メルカプトメタノールの存在下に沸謄させることにより粉砕 し、そしてこの生成物をゲル電気泳動、次いでオートラジオグラフィーにより分 析した。

ウロキナーゼに対する抗体での３５３−標識翻訳生成物の免疫沈降により６９， ０００および７９．０００のＭｒｓを有するウロキナーゼ特異性翻訳生成物が得 られた。これらのたん白質バンドは、次の様なことからミンアクチピンとウロキ ナーゼとの特異的錯体を表わしている。

（１）ウロキナーゼ又はｍＲＮＡの不在下では表われない。

（２）抗体の不在下では沈でんしない。

（３）　ウロキナーゼ結合について未標識の精製ミンアクチビンおよび胎盤禁止 剤（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）製剤と競合する（第４図）。

免疫沈降生成物は、ＤＮＡ誘発Ｕ９３７細胞から得られたｍＹＶＮＡから合成し た全たん白質の０゜０５χを表わすものであることが見出された。非誘発Ｕ９３ ７細胞から得たｍ　ＲＮ　Ａからは免疫沈降生成物は全く検出されなかった。こ れはこの場合はミンアクチビンｍＲＮＡの１７ベルが低いことが原因となってい ると考えられる。

胎盤禁止剤に対する抗体を使用してのウロキナーゼーミンアクチビン翻訳生成物 の免疫沈降によっても同様の結果が得られた。いくつかの抗胎盤禁止剤抗体製剤 は、６９，０００および７９，０００？ＩＷにおいてはっきりとウロキナーゼー ミンアクチビン翻訳生成物錯体を沈でんさせた（第５図）。

第６図に示す様に、ウロキナーゼの存在下および不在下に得られた免疫沈降生成 物を比較することにより、ミンアクチビン翻訳生成物の直接同定が可能である。

これは４３，０００のＭｒにおいて明白なバンドとして表われる。この分子量は 在来たん白質の場合に観察されるものよりいく分生ない様に思えるが、これはグ リコジル化に起因するものであると考えられる。ウロキナーゼの存在下では、こ のバンドは消失しており、６９．　ＯＯＯＭｒＯ所に特有のウロキナーゼーミン アクチビン翻訳生成物が検出される。

先に観察された７９，０００〜８０．０００Ｍｒにおける別のたん白質バンドは 、サンプルが部分的に還元条件下で分析されたので、錯体の非還元型を表わすも のであると考えられる。

更に又、ミンアクチビン翻訳生成物との錯体形成は、ウロキナーゼの低分子量形 （ＨＰＡ３３）の存在に依存するものであることがわかった。ＨＰＡ５２とＨＰ Ａ３３の純粋製剤を入手しくＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ）。

これは全く１つの種であり、ずなわぢ１方は他方にブイプリン被覆をしたもので あることが明らかとなった（第７図）。尚、プラスミノーゲン／プラスミンを１ （ＰＡ３３に加えるとこの製剤中に残留する痕跡量の１１　Ｐ　Ａ　５２は低分 量形に変わった。６９．０００）’ＩＷにおけるはっきりとしたウロキナーゼー ミンアクチビン翻訳生成物錯体は、使用したウロキナーゼ製剤が肝Ａ３３を含有 していた場合にのみ表われた。この結果の説明は明らかではない。可能なたん自 分解を禁止するために溶解産物混合物にトラシロールを加えてもこの結果には何 ら影響はなかった。

要するに、Ｕ９３７細胞からのｍＲＮＡの試験管内翻訳により肝が約４３．００ ０の生物学的に活性なミンアクチビン翻訳生成物が生成することが明らかであり 、このことはウロキナーゼとの錯体を形成し、これが６９．０００の特有のＭｒ を有することがら容易に同定す色々な公知方法により、全ポリＡ”　ｍＲＮＡ又 はしょ糖密度こう配分画ｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを構築した。１例と して、第１鎮相補ＤＮＡを一般的な方法によりプライマー開始逆転写酵素を使用 してｍ　ＲＮ　Ａから合成した。次いで第２鎖を、例えば、（１）ＤＮＡポリメ ラーゼ又は逆転写酵素を使用しての通常のへヤービンループプライマーによる１ ）ＮＡの合成、又は（２）ＲＮアーゼ）ｌ−Ｉ］１１Ａポリメラーゼ１のメジエ ータ−作用による第２鎖合成、又は（３）　５　’　−末端をプライマーとして 開始する方法により合成した。

Ｓ１ヌクレアーゼでの処理（必要の場合に）の後に、ＤＮＡをメチル化し、そし て通常の例えばＤＮＡポリメラーゼ、クレノー断片又はＴ４ポリメラーゼの導入 による方法を使用して平滑端を生成させた。次いでｃ　Ｄ　１１　Ａを、これを 適当な切断部位を含有する合成リンカ−分節で創製した相補ポモポリマー末端又 は付着端を介し適当なプラスミド（例えば、ｐＢＲ３２２、ｐｔｌｃ又はｐｌＪ Ｒ系）又はバクテリオファージ（例えばλｇｔｌｌ）と通常の方法により結合さ せ、そして次いで適当な宿主に形質転換させることによりクローニングすること が出来る。

λ庭斑旦 ｃＤＮＡライブラリーを構築する好ましい方法は次の通りである。

５０ｍＭ　トリス−）１ｃＩ、７５ｍＦＩＫＣＩ、１０＋Ｊ　ＤＴＴ、　３ｍ！ ’Ｉ　ＭｇＣｌ、各１ｍＭのｄＡＴＰ、　ｄＣＴＰ、　ｃｌＧＴＰおよびｄＴＴ Ｐ、　１０μｇ／ｍｆオリゴ（ｄＴ）　Ｉｚ　〜＋　ｅおよび１００μｇ／ｌｎ ｌ　ＢＳＡの存在下に、モロニーネズミ白血病ウィルス逆転写酵素（ＢＲＬ、　 ２００Ｕ／　ｔｌｇ　ｍＲＮＡ）を使用して全ポリＡ″ｍＲＮＡ０：）　６　μ ｇからｃＤＮＡを合成した。反応物の２００１Ｉｊ２を４０分間３７°Ｃで培養 した。ＤＮＡポリメラーゼ■のクレノー断片を使用してのへヤービンルーブプラ イマーによる合成により第２鎖を合成した。反応は７０°Ｃに加熱して１０分間 行なってＤＮＡ／ＲＮＡ　２重体を分離し、２倍に希釈し、そして１０μＣ１（ ７）ｄＡＴＰ（１８００Ｃｉ／ｍｍｏ＋）　（Ｄ存在下にクレノーを３２５Ｕ／ ｄに加えた。反応は１５°Ｃで１時間培養する様に続けた。フェノール：クロロ ホルム（１：１）抽出とエタノール沈でんの後で、ＤＮＡを溶解し、そして０． ２Ｍ　ＮａＣｌ、５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４，５）、１ｍＭ　ＺｎＳ０ｇ および０．５χグリセロールの存在下に８０単位の３１ヌクレアーゼ（Ｐ／Ｌ　 Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）での処理によってヘヤーピンループを除去し、そし て上記した様にして沈でんさせた。

次いで１００ｍＭ　）リス−ＨＣｌ　（ｐｔ４８．０）、１０ｎ＋Ｍ　ＥＤＴＡ および８０μｈＳ−アデノシルメチオニンの存在下に、２０単位のＥｃｏＲ１メ チラーゼ（Ｂｉｏｉａｂｓ）を使用して２本領ｃＩＩＮＡをメチル化した。３３ ｍ１ｌ　）リス−酢酸（ｐＨ８，０）、６６ｍＭ酢酸カリウム、１００１Ｍ酢酸 マグネシウム、０．５ｍＭジチオスレイトール、’　０．１　ｍｇ／　ｍｌ　Ｂ ＳＡおよび各０．５ｍＭのｃｌＡＴＰ、　ｄＣＴＰ、、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ （７）存在下ニ２．５Ｖ（７）Ｔ４　ＤＮＡポリメラーゼを１時間に３７°Ｃで 加え、次いでＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（２０Ｖ）および０．１ａ＋Ｍ　Ａ ＴＰを加え′ることによりＤＮＡを修復した。

フェノール：クロロホルム（１：　１）抽出およびエタノール沈７’ンノ後に、 Ｔ４ＤＮＡＩＪガーゼ（ＩＢＩ：１．２Ｖ／μｇ、ＤＮＡ）を使用してＥｃｏＲ ｌ　リンカ−を再溶解したＤＮＡ　Ｃ３Ｉｇ　リンカ−／１μｇ　ＤＮＡ）に加 えた。反応を濃縮ｃＤＮＡ溶液（１６７μｇ／ｄ）上で２６°Ｃで４時間行った 。ＥＣ０ＲＩで処理した後に、バイオゲルＡ１５０？上でのクロマトグラフィー によりｃＤＮＡから遊離のリンカ−を分離した。平均長が１，０ＯＯｂ、ｐ、よ り大きいｃＤＮＡを含有する両分を集め、ｃＤＮＡを濃縮し、そして２体積倍の エタノールを加えて沈でんさせた。

ｃＤＮＡの収量は２．５μｇであった。

ｃＤＮＡライブラリーをλｇｔｌｌおよびｇｔｌｏの両方の中で作成した。

ｃＤＮＡ　（１００ｎｇ）を、ＥｃｏＲ１切断したフオスファターセ処理シタλ ｇｔｌｌ（ｌμｇ）２２０　ａｇｅｄのＩＩＮＡ濃度で、４°Ｃで１６時間ライ ゲートした。このＤＮＡをＶｅｃｔｏｒ　Ｃｌｃｎｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社製 の既製の包装製剤で包装した。Ｅ、コリＹ１０８８株に吸着させてファージを増 幅させ、そしてＹ１０９０中でスクリーニングした。λｇｔｌｌライブラリーは ｃＤＮ八１へｇ当たり約８×１０ｂの組換え体（全ファージの９４％）を含有し ていた。ｃＤＮＡ分子を含有する組換え体の割合は、このライブラリーをα（３ ２ｐ　）　−ｄＡｒｐの存在下に合成したｃＤＮＡでスクリーニングすることに より決定した。約９０％の白色プラークがこのプローブとハイブリダイズした。

λｇｔｌＯ中で作成したライブラリー用に、ｃＤＮＡ　（２００ｎｇ）をＥｃｏ Ｒ１切断したフォスファターゼが処理したλｇｔｌＯ（１μｇ）と、２４０μｇ ／ｒｎｌのＤＮＡ濃度で、２５°Ｃで４時間ライゲーションした。このＤＮＡを 、Ｅ、コリＣ６００ｈｆ１株を使用して上記の様にして包装した。

λｇｔｌｏライブラリーはｃＤＮＡ　Ｉμｇ当り約７．５　ＸＩＯ’個の組換え 体を含有していた。ｃＤＮＡ分子を含有する組換え体の割合は、このライブラリ を放射線標識したｃＤＮＡでスクリーニングすることにより決定した。９０％よ り多くのプラークがこのプローブとハイブリダイズした。

叉範±旦 ミンアクチビン遺伝子を含有するクローンの同ミンアクチビンをコードする遺伝 子を含有するクローンは従来技術を使用して下記の実施例中に記載のプローブを 使用して同定することが出来る。

叉五勇鎖 ハイブリッド゛　翻テ ミンアクチビンｍＲＮＡに相補的な配列を含有するｃＤＮＡクローンはハイブリ ダイゼーション選択により同定することが出来る・。

クローン化ＤＮＡを変成し、ニトロセルロースの様な固体マトリックスに固定し 、そして全ｍＲＮＡの製剤とハイブリダイズする。

１’ｌＮＡ／ＤＮＡ　２重体を加熱してｍＲＮＡを放出し、次いでこれを上記し た様な試験管内ウサギ網状赤血球溶解産物の無細胞系に翻訳する。この翻訳生成 物を次いで実施例４ｂに記載の様にして同定する。

実１引胆 一夫Ｓ乙二４３（ラヒ与−ンｊ１云　配置に　・なりＮＡ）゛ローフ′実施例３ に記載のミンアクチビンのペプチド用に得られるアミノ酸配列を使用して、次い でそのアミノ酸配列をコードすると考えられるオリゴヌクレオチド配列を予測す ることが出来、そして従来技術を使用してオリゴヌクレオチドプローブを合成す ることが出来る。

この配列データを使用して、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　３８０Ａ 　ＤＮＡ合成装置によりたくさんのオリゴヌクレオチドプローブを合成した。こ れらオリゴヌクレオチドの配列は次の通りである。

９、ＣＴＣＣＴＣＣＡＧ　ＣＴＴ　ＧＡＡ　ＣＴＧ　ＧＧＧ　ＧＡＴ　ＧＴＡ　 ＧＡＣＣＴＣＣＡＧ　ＣＴＣ特異的オリゴヌクレオチドプローブを放射線標識し 、次いで常法を使用して細菌コロニー又はバクテリオファージプラークのその場 でのハイブリダイゼーションによりｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングする ことにこれを使用し、それによりミンアクチビン遺伝子の全部又は１部を含有す るクローンを同定することが出来る。

災血桝鈷 疫　・スクリーニング 在来ミンアクチビンたん白質と交差反応する抗体を使用して常法によりクローン をスクリーニングすることが出来る。

ミンアクチビンに対する抗体は常法により作成する。例えば、ウサギをそれぞれ 、例えばフロイントの完全アジュバント又はモンタナイドの様な適当なアジュバ ントの存在下に、１０〜１００μｇの精製ミンアクチビンで免疫付与する。約４ 週間後に同量のブースター付与をした後に、ウサギの血清を採り、これをミンア クチビンに対する抗体用に分析すれば良い。

叉旌炭餅 生　・２　についてのスクリーニング ミンアクチビン遺伝子含有クローンは、放射線標識したウロキナーゼ又はウロキ ナーゼのいずれかおよびウロキナーゼに対する抗体を使用してミンアクチビン活 性を試験又はスクリーニングすることが出来る。これは免疫学的スクリーニング の常法技術を使用して行うことが出来る。ウロキナーゼおよびウロキナーゼに対 する抗体は市販のものを人手すれば良い。放射線標識したウロキナーゼは以下に 述べた様にして作成出来る。

市販のウロキナーゼ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を、文献記載の方法（Ｈｏｌｍｂ ｅｒｇ、　Ｌ、　＋　Ｂｌａｄｈ、　Ｂ、およびＡｓｔｅｄｔ、Ｂ、のｒＢｉｏ ｃｈｉｍ、Ｂｉｏｐｈ−ｙｓ、　Ｊ　、Ａｃｔａ　４４５．２１５〜２２２（１ ９７６）、およびＧｏｌｄｆａｒｂ、　Ｒ，Ｈ，およびＱｕｉｇｌｅｙ、　Ｊ、 Ｐ、のｒＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙＪ　、１９．５４６３〜５４７１（１９８０ ））により、ｐ−アミノベンズアミジンセファロース上のクロマトグラフイーに よりアフィニティー精製した。７５プロー（ｐｌｏｕｇ）単位の精製ウロキナー ゼを、Ｂｏｌｔｏｎ　）Ｉｕｎｔｅｒ法により、Ｎ−スクシンイミジル３−（４ −ヒドロキシ　５　（ＩＩ２５）ヨードフェニル）プロピオン酸エステルとの結 合によりよう素化した。この１１２′−標識したウロキナーゼを、０．１とりん 酸ナトリウム（ｐＨ７，０）、０．４Ｍ塩化ナトリウム、０．１！）リドンＸ１ ００および１！担体ウシ血清アルブミンで平衡化したセファデックスＧ−２５Ｍ 上のクロマトグラフィーにより遊離標識剤から分離した。

非還元条件下においてＳＯ３−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によりこの１１ ２５−標識ウロキナーゼ製剤を分析すると、ウロキナーゼの特有の高分子形（Ｍ ｒ５５．０００）および低分子形（Ｍｒ３３．０００）の存在が明らかとなった （第１３図）。還元条件下では高分子量形はその特有の３３．０００および２２ ．０００Ｍｒサブユニットに解離する。

ウロキナーゼ製剤をよう素化することにより、ＣｏｌｅｍａｎおよびＧｒｅｅｎ の分析法（Ａｎｎ、　Ｎ、Ｙ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　、　３７０．６１７　（１ ９８１））により測定したところ、１０〜１５％プラスミノーゲン賦活剤活性の 損失があったが、しかしこれは酵素のミンアクチビン禁止効果には何ら影響がな かった。ミンアクチビンを種りの濃度に希釈したものをニトロセルロース紙上に 点状塗布し、放射線標識したウロキナーゼと一緒に１晩培養し、洗浄し、乾燥し 、そしてオートラジオグラフィーに付すことから成る点プロット分析の結果、１ ０ｎ＋Ｈの感度で、すなわち約０．１ｎｇのミンアクチビンが固相に結合してい る状態で放射線標識ウロキナーゼがミンアクチビンを検出することが出来ること が明らかとなった。

尖施拠１ ミンアクチビン゛伝　のｉ５月 ミンアクチビン遺伝子を同定する好ましい方法は次の通りである。合成後に、実 施例６ｂに記載のオリゴヌクレオチドプローブ７〜１０をボアクリルアミドゲル 電気泳動により精製し、ポリヌクレオチドキナーゼ（ＩＢＩ　ＩＶ／ｐｍｏｌ　 ＤＮＡ）およびｒ　−”Ｐ−ＡＴＰで［ｉし、そして常法によるイオン交換クロ マトグラフィーにより精製した。

実施例５に記載のλｇｔｌＯライブラリーを、常法によりその場でのハイブリダ イゼーションによりスクリーニングした。ハイブリダイゼーションの条件は背景 体との特異結合が最少となる様に調節し、そして下記の様になるように決定した 。

プローブ７および８　：　６　Ｘ５ＳＣ、５ＸＤｅｎｈａｒｄｔ’　ｓ　、　０ ．５χＳＤＳ。

および０．２　ｍｇ／ｍｌ切断ウシ胸腺ＤＮＡ中で４２°Ｃで１時間予備ハイブ リダイゼーションした後に、６　Ｘ５ＳＣ、５ＸＤｅｎｈａｒｄｔ’　ｓ　。

０．１Ｘ　ＳＯ５および２０ｐｇｌｒｄ　ｔＲＮＡ中”ｉｌ’５０”ｃテ３時間 処理。

プローブ９および１０　：　１０ＸＤｅｎｈａｒｄｔ’　ｓ　、　５　Ｘ５ＳＣ 、および０．０５χピロりん酸ナトリウム中で３７゛Ｃで１６時間処理。

］、Ｑ８ｃｐｍ／μｇより大きな特異活性を有する３２ｐ−標識オリゴヌクレオ チドプローブを約０．５ｐＩＩｌｏｌ／ｒｆ使用した。陽性クローンの選択性を 高めるために、フィルターを０．１χＳＤＳ含有の０．５×又は２ｘｓｓｃ中で 上昇温度で洗浄した。

陽性シグナルのプラークを採り上げ、再スクリーニングし、そしてファージＤＮ Ａを常法により精製した。（例えばＭａｎｉａｔｉｓ等のｒＭｏｌｅｃｕｌａｒ 　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｊ　（１９８２）参照。）互いに交差ハイブリダイズは、配 列を含有する、それぞれ２１００および１０６０の塩基対のＥｃｏＲＩ−リンカ −結合ｃＤＮＡインザートを持つ、２つの組換えバタテリオファージクローンＭ ＩＮＩＤおよびＭＴＮ６１１が得られた。

これらインサートをそれぞれフ′ラスミドｐＢＴへ４４０およびｐＢＴ４４１を 創製するプラスミドｐＶｃ１８にサブクローニングし、そして第２０図に示す様 な制限酵素分析による制限酵素切断地図を作成した。クローン［ＮＩＤのサザー ンブロソト分析により、第２０図に示した様に３２０塩基対ＸｂａＩ−Ｎｃｏｌ 制限断片内にオリゴヌクレオチドプローブ７および８の結合領域があるのを確認 した。

これらのクローンがミンアクチビンをコードする遺伝子を含有していたことは、 ハイブリッド選択翻訳およびＤＮＡ配列分析により確認された。

ＬＡ１県しムＬ進択■訳 Ｍａｎｉａｔｉｓ等の方法（’Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｊ　（１ ９８２））により、３鵬×３ｆｆｌＩＴｌのフィルター１枚につき２０ｐｇの濃 度で精製ｐＢＴ八４４０をニトロセルロースフィルター上に固定した。洗浄後、 各フィルターを５０ｐｇの全ｍＲＮＡで培養し、そして５０°Ｃで３時間ハイブ リダイズした。充分に洗浄後、沸とうにより特異的にハイブリダイズしたｍＲＮ Ａを溶出し、そして次いで市販のウサギ網状赤血球溶解産物製剤（静ｅｒｓｈａ ｍ）を使用して試験管内で翻訳した。

第２１図に示す様に、ハイブリダイズしたｍＲＮＡは、ゲル電気泳動によりＭｒ ４３，０００の翻訳生成物を特異的にコードすることが明らかとなった。尚ミン アクチビン翻訳生成物の特性は実施例４ｂに記載した。更に又、ウロキナーゼの 存在下では、このバンドは消失し、そして特有のウロキナーゼーミンアクチビン 複合体が６９．０００Ｍｒに検出された。

貼り筐Ａ光択 ｐＢＴＡ４４０の制限断片を一木鎖ファージベクターＭ１３ｍｐ９、Ｍ１３ｍｐ １８およびＭ１３ｍｐ１９にサブクローニングし、そして挿入された２、　１０ ０ｂｐのＤＮＡ配列をＳａｎｇｅｒの連鎖終息法により決定した。そのＤＮＡ配 列を調べたところ、２．１００ｂｐインサートはミンアクチビン遺伝子の全コー ド配列を含有していることがわかった。

プライマー拡張 ミンアクチビンのＮ末端領域をコードするＤＮＡ配列の残りを得るために、プラ イマー拡張により第２のｃＤＮＡライブラリーを構築した。このライブラリーは 、先のヌクレオチド配列３９１〜４２０に相補的なオリゴヌクレオチド ５　’　ＴＴＣＣＡＧ　ＴＡＡ　ＡＴＡ　ＡＴＴ　ＣＣＣＴＧＴ　ＧＧＡ　ＴＧ ＣＡＴＴ３’　テボリ　ｒｍＲＮＡの５μｇをプライミングすることにより作成 した。引き続ＱＥｃｏＲＩ−リンカー含有ｃＤＮＡインサートを常法によりλｇ ｔｌＯ中にクローニングした。

得られた７、２　ＸＩＯ’個のクローンの内の約５．３　ＸＩＯ”個のクローン を第２のオリゴヌクレオチド ５　’　ＧＣＣＴＧＣＡＡＡ　ＡＴＣＧＣＡ　ＴＣＡ　ＧＧＡ　ＴＡＡ　ＧＴＡ 　ＣＣ３’（これはヌクレオチド３１０〜３２５に対して相補的）でスクリーニ ングした。得られた１００個の陽性クローンの内の１５個を精製し、そして最大 のｃＤＮＡインサート（４３０ｂｐ）を有するクローン（クローン１３）をプラ イスミドｐＢＴＡ４４２を創製するプラスミドｐＶｃ１８にサブクローニングし た。ｐＢＴＡ４４２のＤＮＡ配列は上記の様にして決定した（同様に第２０図参 照）。

ｐＢＴＡ４４０およびｐＢＴＡ４４３中に含有されるミンアクチビン遺伝子のコ ード配列（これはｐＢＴ＾４４２に対して反対側に配向したｐＶｃ１Ｂ中の４３ ０ｂｐ５’−ミンアクチビン配列を含有するプラスミドである）を、第２２図に 示す様にある種のＤＮＡ制限断片と結合させて隣接させてｐＢＴＡ４３８を創製 した。ｐＢＴＡ４３８を含有するＥ、コリに一１２株ＪＭ１０９は１９８７年１ １月１１日で八ｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏ ｎ　（１２３０１Ｐａｒｋｌａｗｎ　Ｄｒｉｖｅ、Ｒｏｃｋｏｉｌｌｅ、Ｍａｒ ｙｌａｎｄ　２０８５２＋米国）に寄記し、寄託番号ＡＴＣＣ５３５８５を受け た。ミンアクチビン遺伝子の全ｃＤＮＡ配列およびこれから演鐸したミンアクチ ビンたん白のアミノ酸配列を第２３図に示した。全翻訳生成物は４１５個のアミ ノ酸（Ｍｒ　４６．５４３）から成っている。この遺伝子は、第２３図に示した 様に在来ミンアクチビンのアミノ酸配列分析から得られた５個のペプチドをコー ドしている。

このＤＮＡ配列の分析の結果、ミンアクチビンはウロキナーゼ型プラスミノーゲ ン賦活剤に特異的であるにもかかわらず、セリンプロテアーゼ禁止剤上材の一員 （セルピンとして知られている）であることが明らかとなった。

実施±１ 生　々的にゞ　なミンアクチビンの 例えばｐＢＴＡ４３８中に存在する全長ｃＤＮＡを、細菌や真核動物細胞（例え ばベクターでトランスフェクトされたか又は形質転換された哺乳動物細胞）の様 な種々の宿主中でたん白質の合成を司どることのできる種々のベクター中に同化 統合することにより、生物学的に活性な分子の高レベルでの発現が可能である。

ここでベクターとしては、ミンアクチビンをコードするヌクレオチド配列の発現 を制御し得るヌクレオチド配列を含有するものが好ましい。この第２のヌクレオ チド配列は、１例として、プロモーター配列、ポリアデニル化配列、又はたん白 質を別のたん白質に融合したハイブリッド分子として発現させる様な作用を有す るヌクレオチド配列を含有していても良い。

ス崖且エ ミンアクチビンの細　による この工程のまず最初は、Ｅ、コリ中で複製可能な、そしてミンアクチビンの発現 をコードするＤＮＡ配列を含有する発現ベクター又はクローニング媒体を作成す ることである。

ミンアクチビンはその在来型として、あるいは別のたん白質と融合したハイブリ ッド分子として発現可能である。これらの構築方法は第２４図および第２６図に 示した。

１種のプラスミド構築には、在来の又は在来に近い（Ｎ−末端アミノ酸変成した ）ミンアクチビンを発現する。λＰＬ発現ベクターｐＬＫ５７およびｐＬＫ５８ （Ｂｏｔｔｅｒｍａｎ等のｒＧｅｎｅｊ、３７；２２９〜２３９．　（１９８５ ））を使用した。

第１４図に示す様に、プラスミドｐＢＴＡ４３８をＥｃｏＲＩおよびＤｒａ　１ で消化し、そして１６１０ｂＰのＥｃｏＲＩ　−Ｄｒａ　ｎ制限断片をアガロー スゲルから単離した。この断片をＴ４リガーゼで、ＥｃｏＲＩおよびＥｃｏＲＶ で消化したベクターｐｌＪ５７にライゲージジンした。この誘導体プラスミドｐ ＢＴＡ４４４は在来ミンアクチビンの発現を制御するλＰＬプロモーターを含有 している。

発現ベクターｐＢＴＡ４４４を使用して、ラムダの熱可変ｃｌリプレッサーを含 有するＥ、コリに一１２株Ｎ４８３０　（Ｊｏｙｃｅ等のｒＰＮＡＳ　８０　Ｊ 　。

１８３０〜１８３４．　（１９８３））を形質転換した。こうしてｐＢＴＡ４４ ４で形質転換した細胞を、１００μｇ／ｄのアンピシリンを添加したＭＥＢ培地 （１１ｏｔｔ等のｒＰＮＡＳ　８２　Ｊ　、８８〜９２．　（１９８５））中で ２８°Ｃで１晩生育させた。細胞をＭＥＢ培地中で希釈し、そして予熱（６５° Ｃ）　したＷＥＢ培地と等量刑えて温度を４２°Ｃに平衡とした時に００．。。

が１．０となるまで２８°Ｃで生育させた。４２゛Ｃで４時間更に生育させた後 に、細胞を採取し、そして洗浄細胞（−７０°Ｃにて凍結後に解凍した後に）を ２０％しょ糖、３０Ｉｌ１ＭトリスーＨＣｌ　（ｐＨ８，１）および■／　ｍｌ リゾチーム溶液の２００μ中に再けん濁させ更に３ＭＥＤＩＡ　（ｐｔ＋７．３ ）の３ｒｄを加えることにより、膜および可溶たん白両分を作成した。細胞抽出 物は簡単な音波処理により清澄にし、そして膜および不溶たん自分は遠心分離（ ２７、０００ｘｇ　、　６０分間）によりベレット化した。上ずみ液にトリクロ ル酢酸（１０％ｗ／ｖ）を加えることにより可溶たん自分を沈でんさせ、このベ レットを水中に溶解した。ベレット化した膜も同様に水中に溶解した。未誘発（ ２８”Ｃ）のおよび誘発処理（４２°Ｃ）　した細胞の両方のこれら画分のサン プルをＳＯ３−ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびヒト胎盤禁止剤に対する 抗血清を使用してのウェスタン転移によるミンアクチビンの免疫的検出により分 析した。第２５図に示す様に、ヒト胎盤禁止剤に対する抗体およびアルカリホス ファターゼ（Ｓｉｇｍａ）と結合したウサギ抗ヤギＩｇＧを使用してのウェスタ ン転移により可視化されたミンアクチビンたん白バンド（Ｍｒ　４０〜５０Ｋ） が、誘発処理した（４２°Ｃ）可溶画分および膜画分の両方に存在している。

在来ミンアクチビンを作成する別法を第２４図に示した。プラスミドｐＢＴＡ４ ４２をｘｈｏ　Ｉ［で消化し、そして２４３ｂｐ　ｘｈｏ　ｎ制限断片をアガロ ースゲルから精製した。この断片をＴ４リガーゼで、ｈ辷１１で消化したベクタ ーｐＬＫ５８にライゲーションした。この誘導体プラスミドｐＢＴＡ４４５をＰ ｖｕ　ＩＩおよびＳｍａ　Ｉで消化し、そして２８００ｂｐ断片を精製し、そし てＴ４リガーゼでρＢＴＡ４３Ｅｌからの精製１３２０ｂｐ　Ｐｖｕ　ＩＩ　− Ｄｒａ　ｎ制限断片にライゲーションした。この誘導体プラスミドｐＢＴＡ４４ ６を１■で線状開裂し、そして細菌リボゾーム結合部位と在来ミンアクチビン遺 伝子の開始ヌクレオチドを含有する合成２本鎖２６量体オリゴヌクレオチドとラ イゲーションしてプラスミドｐＢＴＡ４４７を創製した。ｐＢＴＡ４４７を前記 の様にして適当な宿主、例えばＮ４８３０中へ形質転換し、誘発処理しそして分 析すると、第２５図に示す様に再度ミンアクチビンが生成されている。それぞれ ｐＢＴＡ４４４およびｐＢＴＡ４４７を含有する細胞の両方の場合に、ミンアク チビンは誘発処理した（４２”Ｃ）可溶性画分および膜画分の両方に存在してい た。

Ｅ、コリＮ４８３０により産生されたミンアクチビンの生物学的活性を評価する ために、可溶性画分および膜画分を、実施例４の記載の様にして、高分子量形お よび低分子量形のウロキナーゼを使用して９０分間培養した。次いでサンプルを アセントで沈でんさせ、水中に再けん濁し、そして還元５ＤＳ−ポリアクリルア ミドゲル上で処理した。ミンアクチビンおよびミンアクチビンーウロキナーゼ複 合体を前記した様なウェスタン転移により可視化した。第２５図に示す様に、標 準分析条件下において、ウロキナーゼとのｐＢＴＡ４４７複合体を含有する誘発 Ｅ、ココリ４８３０からの可溶画分中にミンアクチビンが存在している。この事 はこれらの細菌細胞から生成したミンアクチビンが生物学的活性を保有している ことを意味するものである。

一方のたん白質コード配列の全部又は１部とミンアクチビンコード配列の全部又 は１部との融合たん白質を製造する方法の２つの例を次に記載する。第２６図に 示す様に、プラスミドｐＢＴＡ４４０を鉢几およびＤＬｌで消化し、そして１１ １０ｂｐ断片をアガロースゲルから単離した。この断片を、ＥｃｏＲＶで消化し たベクターｐＢＴＡ４４９にライゲーションしてｐＢＴＡ４５０を創製した。次 いでｐＢＴＡ４５０を鮮１で消化し、そして精製した２８００ｂｐ断片を、展で 消化したプラスミドｐＬＫ５７にライゲーションしてプラスミドｐＢＴＡ５８６ を創製した。これはλＰＬプロモーターの制御下にミンアクチビンコード配列の 部分と成るものであり、そしてｔｒａＴ遺伝子の最初の８０個のアミノ酸コード 配列と融合する。その８０個のアミノ酸の内の最初の２０個はＥ、コリの外膜中 に表われる融合体となるシグナル配列を構成している。このシグナル配列はｔｒ ａＴたん白質の通常の存在位置である外股への輸送中に開裂する。

上記した様にプラスミドｐＢＴＡ５８６を適当な宿主、例えばＮ４８３０中に形 質転換しそして温度シフトにより誘発処理をすると、ＴｒａＴ−ミンアクチビン 融合たん白質が、第２７図に示した様に外股に表われる。

融合体製造法の第２の例は第２６図に示した。プラスミドｐＢＴＡ４４０中にお いて、ミンアクチビンコード配列は、プラスミドｐＶｃ１８上に存在するβ−ガ ラクトシダーゼ遺伝子の部分と枠内融合する。

プラスミドｐＢＴＡ４４０を適当な宿主１．例メばＪ旧ＯＩ、叉けｌａｃ＋’遺 伝子を含有するＥ、コリ株中に形質転換し、そしてイソプロピル−チオーβ−Ｄ −ガラクト・ピ・〉ノシド（最終濃度１ｍＭ）の添加により誘発処理すると、前 記Ｌ７た様にしてミン゛アクチビン産生が検出できる（第２７図）。

実施炭則 直訴１１１１呼配山弐組狽えミンＵ尤１（−７９発−里ミンアクチビンの全コー ド領域を含有するｐＢＴＡ４３８の断片を、哺乳動物細胞中において真核遺伝子 の安定的な同化、発現が可能な一連のベクター中に挿入した。これらは、（１） ミンアクチビンｃＤＮＡ配列がＳＶ４０初期プロモーターの制御下にあるｐＫＣ ３（ｐＫＯ−ｎｅｏ由来、Ｖａｎ　Ｄｏｒｅｎ＋！（ａｎａｈａｎ、Ｄ＋および ＧｌｕｚｌｌＩｌａｎ、Ｙ、のｒ　Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、　Ｊ５０．６０６〜６１４ （１９８４））；　（２）ミンアクチビン遺伝子がレトロウィルスのＬＴＲプロ モーターの下流にあり、そして原核生物にカナマイシン耐性を付与し、真核生物 に６４１８耐性を付与するネオ遺伝子に基づいて選択が行なわれる、七ロ二−ネ ズミ白血病ウィルス由来レトロウィルスシャトル系のｐＺｉｐＮｅｏＳＶ（Ｘ） １（Ｃｅｐｋｏ、Ｃ，Ｌ、。

Ｒｏｂｅｒｔｓ、Ｂ、Ｅ、およびＭｕｌｌｉｇａｎ、Ｒ，Ｃ，のｒ　Ｃｅ１ｌ　 」、　３７．１．０５３〜１０６２（１９８４））　；および（３）マウス乳腫 瘍つイ）Ｉｉス（ＭＭＴＶ）　５　’　−ＬＴＲ中に含有されるデキサメタシン 誘発性プロモーターの利用によりミンアクチビンの規則的発現が達成可能なｐＭ ＳＧ　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社から市販され入手可能）である。

これら３つのベクターの構築を第２８図に示し、尚その詳細は下記の通りである 。ミンアクチビン遺伝子のコード領域を１６１０ｂｐＥｃｏＲＩ−ＤｒａＴ断片 としてｐＢＴＡ４３８から単離し、そして下記の様にして下記のベクター中に挿 入した。

１６１０ｂｐ　匡姐Ｉ−紅旦断片と、ｋ牝Ｉζ壇ｌで消化したｐＫＣａ中にライ ゲーションし、そして次いでＥ、コリＣ６００ｒ中に形質転換した。こうして生 成したプラスミドをｐＢＴＡ５８７　と命名した。

第２の構築工程において、この１６１０　ｂｐ　ＥｃｏＲＩ−Ｄｒａｌ断片をＤ ＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片を使用して平滑末端化し、ｐＭｓＧの皿部忙 中にライゲーションし、そして適当なＥ、コリに一１２宿主中に形質転換した。

ｐＭＳＧ中のミンアクチビン遺伝子を含有するコロニーを、先に実施例７に記載 した３Ｚｐ−標識オリゴヌクレオチド（２９量体）（オリゴヌクレオチド３１０ 〜３３５に相補性を有する）を使用してのコロニーハイブリダイゼーションによ り検出した。こうして出来たプラスミドをｐＢＴＡ５８８と命名した。

第３の構築工程において、上記の平滑末端化したＥｃｏＲＩ／ＤｒａＴ断片を、 Ｈ４ｎｃＩＩで消化したｐＶＣＶ中にライゲーションして、ｐＢＴＡ５８９と命 名したプラスミドを構築した。ｐＶＣ７中のＨ４ｎｃＩ［部位はＢａｎ　８１部 位の側面にあるので、これは搬器消化の後にミンアクチビン遺伝子を単離させ、 そしてｐＺＴＰＮｅｏ　５Ｖ（Ｘ）１のＢａｎ　ＨＩ部位中にライゲーションさ せる作用を奏した。適当なＥ、コリに一１２宿主中への形質転換の次に、ミンア クチビンを含有するコロニーを前記した様なコロニーハイブリダイゼーション法 により検出した。この結果生成したプラスミドをｐＢＴＡ５９０と命名した。

臭挟坦賂のトランんス庄久λジー４ 全部のプラスミドをりん酸カルシウム法により真核細胞中にトランスフェクショ ンした。約１〜２Ｘ１０’個の細胞を、Ｔ２５フラスコ中で、１０％（ν／ν） ウシ胎児血清、３．６１Ｍグルタミン、２００ｍＭ　４５１Ｖ／　ｒｄペニシリ ンおよび４５■／滅ストレプトマイシンを補填したダルベコ変性イーグル培地（ 完全培地）の５ｄ中に植種した。約１〜５μｇのＣｓＣｌ傾斜精製ＤＮＡをりん 酸カルシウムで沈でんさせ、そして細胞に加えた。４時間後に、細胞をグリセリ ンショックで処理し、次いで３日間完全培地中で培養した。次いで培養上ずみ液 を過渡発現測定用に取り出した。次に細胞をトリプシン化して１／３づつに分け て、適当な選択抗生物質（下記参照）を含有する完全培地の入ったＴ７５フラス コ中に入れた。この細胞は毎６〜７日間毎に同じ培地で洗浄し、トランスフェク トした生成物を１４〜２８日目に取り出し、そして合流生長となるまで個々に培 養した。

各ｐＢＴＡ５８７　、ｐＢＴＡ５８８およびｐＢＴＡ５９０のトランスフェクシ ョンの条件は下記の通りであった。

ｌ旦巽Ｌ：　ｐＫＣ３は適当なマーカーを含有していないので、ｐＢＴＡ５８７ はｐＺＩＰＮｅｏ　Ｓν（Ｘ）１と、ｐＢＴＡ５８７：ｐＺＩＰＮｅｏ　５Ｖ（ Ｘ）１のモル比　７．５：１の割合で共トランスフェクトした。トランスフェク ト体を０．４■／ｄのＧ４１８を含有する完全培地で選択した。トランスフェク ションはＣＯ３細胞中で行なった。

枦３ＴＡ５）移−：　ｐＭＳＧはＳＶ４０初期プロモーターから発現したＥ、コ リキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｇｐｔ）遺伝子を 含有しているので、ピポキサンチン、アミノプテリンおよびミコフェノール酸を 含有５する）ＩＡＴ培地中で、安定にトランスフェクトした細胞を選択した。ト ランスフェクションはＭＩＨ３Ｔ３細胞を使用して行なった。

Ｊ：　）ランスフエクト体は０．４■／ｄの６４１８を含有する完全培地を使用 して選択した。トランスフェクションはＭＩＨ３Ｔ３細胞中で行なった。

核　胞　の組　えミンアクチビンの　のゝトランスフェクションの後に、細胞を ３Ｓ３−メチオニンの存在下に培養しそして、主として実施例４ｂに記載の方法 に従って胎盤禁止剤に対する抗体を使用してその放射線標識したミンアクチビン 糾換体を特異的に免疫沈降させることによって、ミンアクチビン組換体の過渡発 現を検出する。例えば、ｐＢＴＡ５°８７のＣＯ５細胞中へのトランスフェクシ ョン後４８時間してから、上ずみ液を除き、そして細胞を、３５５−メチオニン （Ａｍｅｒｓｈａｍ）を添加して、但し通常のメチオニンを含有しないＥＭＥＭ 　（Ｆ　ｌ　ｏｗ）のｌｄの存在下に培養した。これを５０μｇのヤギ抗胎盤禁 止荊抗体と２００μｉの洗浄パンソルビンで免疫沈降させた後、複合体をＳＯ３ −ポリアクリルアミドゲル電気泳動（還元条件）により分析し、そして第２９図 に示す様にオートラジオグラフィーにより可視化した。組換えミンアクチビンは Ｍｒ　４５，０００〜４８．０００のバンドとして検出されるが、ベクター（ｐ Ｋｃ３）だけを含有する相当するコントロールトランスフェクション体において これは検出されない。免疫沈降の前に上ずみ液にウロキナーゼ（１５１０一単位 、Ｃａ１ｂ＋ｏｃｈｅｍ）を加えると、このバンドは消失し、これは生物活性ミ ンアクチビンに特有のものである。ミンアクチビンウロキナーゼ複合体を表わす バ・ンドがＭｒ　６９，０００に観察されるが、これは同位置の非特異的たん白 バンドにより幾分不明瞭となっている。又、ある種の組換えミンアクチビンはウ ロキナーゼ製剤の添加後にたん自分解により分解したと考えられる。尚これはＭ ｒ　３５．０００〜３７．０００バンドの検出により明らかにされていることで ある。

生成した組換えミンアクチビンが生物学的に活性であるということは、細胞を４ 時間血清不在下に培養し、そして実質的に実施例１１に記載の様にして比色分析 することによりウロキナーゼ活性の阻害程度を定量することにより決定された。

この際阻害程度レベルを検出し、これは背景上の約１単位／ｄのミンアクチビン 活性に相当するものであった。

ミンアクチビン遺伝子を含有するトランスフェクト体も又、実施例６の記載の様 にして、又はＢａｋｅｒの方法に従って作成した放射線標識ウロキナーゼを使用 してミンアクチビン活性を分析することが出来る。組換えミンアクチピンとウロ キナーゼとの間に複合体を生成する様に、培養上ずみ液を放射線標識ウロキナー ゼと共に培養する。次いでこの複合体を、ウロキナーゼに対して作成したウサギ 抗体（ミドリ十字社′）の添加により溶液から分離し、そして洗浄パンソルビン 又は免疫ビーズに共有結合した抗ウサギ抗体（Ｂｉｏｒａｄ）の添加により沈で ルさせる。遠心分離後、ミンアクチビンーウロキナーゼー抗体ベレットを洗浄し 、２％ＳＯＳでの沸とうにより細砕し、そして生成物をゲル電気泳動、次いでオ ートラジオグラフィーにより分析した。トランスフェクトした細胞により生成し た生物活性組換えミンアクチビンの存在は、ウロキナーゼの分子量のＭｒ　５５ ，０００　（又は３３．０００）からミンアクチビンーウロキナーゼ複合体の生 成に特有な、より高いＭｒ　（６９，０００〜９２．０００）へのシフトにより 立証されている。

実３ｊｊ汁Ｕ 生　活　たん白　の精＋ｌおよびロ Ｅ、コリ中で高レベルでミンアクチビンを発現する条件を確立したら、次に、ミ ンアクチビン遺伝子をコードするプラスミドを有する細胞を遅くとも対数期に採 取する。パックした細胞の１体積を、２体積のリーシス緩衝液（１ｍＭ　ＥＤＴ Ａおよび１ｍＭぶつ化フェニルメチルスルホニルを含有したＯ、　１Ｍりん酸ナ トリウム（ｐＨ７，０））中にけん濁させ、そして１５．０００ｐｓｉでフレン チプレスの中を３回通過させることにより細胞溶解させる。このけん濁液を２３ ．０００ｘｇで２０分間遠心分離し、そしてペレットを５％トリトンＸ−１００ を含有するり−シス緩衝液の２体積倍中に再けん濁させる。このけん濁液を再度 ２３．０００ｘｇで２０分間遠心分離し、そしてベレットを８ｈ尿素および０． １ＭＤＴＴを含有する０、１Ｍ）リス−ＨＣｌ　（ｐＨ８，０）の３体積倍中に けん濁させる。溶液を窒素でフラッシングし、そして密封管中で３７℃で２時間 培養する。培養後に、溶液のｐＨを、該溶液の各ＩＩｄ！につき５０μｌの氷酢 酸を加えて約ｐＨ３，５に低下させる。このけん濁液を上記した様な遠心分離に よって清澄にし、そして上ずみ液をＯ，Ｒ酢酸で平衡化したセファデンクスＧ− ７５カラム（３，２ｃｍ　Ｘ９０ａｎ）中に袋中する。ミンアクチビンを含有す る両分は５ＤＳ−ＰＡＧＥにより所在確認する。ミンアクチビンを含有する両分 を集めそして８Ｈ尿素および０．１ｍＭＤＴＴを含有する１０ｍＭ　）リス−〇 ＣＩ　（ｐｌ（８，０）に対して、室温で１６時間透析する。次いで透析溶液と 前記の緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ−セファデックスカラム（２，２ｃｍ　Ｘ　 ２５ｃｍ）中に装入し、そしてカラムを洗浄して未結合物質を溶出する。次いで 、同緩衝液中の０〜０．５Ｍの塩化ナトリウムの線状傾斜を使用してカラムから ミンアクチビンを溶出する。ミンアクチビンを含有する画分は５Ｏ５−ＰＡＧＥ により同定し、そして広範囲にわたって蒸留水に対して透析する。この工程中に 沈でんしたたん白質を凍結乾燥により回収する。この凍結乾燥したたん白質を０ ．１Ｘトリフルオロ酢酸中に再溶解し、そしてウォーターズ社の高速クロマトグ ラフィーにとり付けたグイダックＣ−４逆相カラム中に装入する。

０．１χトリフルオロ酢酸中の０〜８０％おアセトニトリルの線状傾斜を使用し て、このカラムから純粋なミンアクチビンを溶出する。ミンアクチビンに相当す るＡ２□。ピークを５ＯＳ−ＰＡＧＥにより同定し、その両分を集めて凍結乾燥 する。

凍結乾燥し精製したミンアクチビンを８Ｍ尿素を含有する０、］、］Ｍトリスー ＨＣｌ（ｐ）１８．０）中に、１０ｍｇ／ｍｆｌの濃度で溶解させ、そして１１ 還元グルタチオンおよび０．１ｍＭ酸化グルタチオンを含有する０、１Ｍ　）リ ス−ＨＣｌ　（ｐＨ８，０）中でｌｏμｇ／ｍｌに希釈する。再反応を室温で２ ４時間行ない、次いで溶液を濃縮し、そしてＹＭＩＯ膜を使用してアミコン撹拌 細胞上でＯ，ＩＭりん酸ナトリウム（ｐｉ（７，０）に対して透析ろ過する。活 性ミンアクチビンを含有する得られた溶液を、前記した分析法（実施例１）を使 用して分析する。

哺乳動物細胞から高レベルで分泌した生物活性ミンアクチビンの回収には、実施 例２に記載したＵ９３７細胞からの在来ミンアクチビンの精製と同様の方法を利 用すれば良い。この方法ではまず最初に、３０．０００ダルトン分離カートリッ ジを備えたアミコンＤＣ−２中空繊維濃縮装置を使用して細胞を含有しない上ず み液を１０倍に濃縮する。次いでこの濃縮物を、少な（とも等体積の５０１１ｏ Ｍグリシン（ｐＨ７，８）に対して透析して全痕跡量の色素を除去する。この透 析濃縮物を８，０００ｒｐｍで３０分間、４°ＣでＪＡＩＯローター中で遠心分 離して、残留細胞細砕物と透析中に沈でんすることのあるたん白質とをベレット 化する。次いで清澄となった上ずみ液をアリクオツドに分けこれを次の精製工程 で使用するまで一２０°Ｃに凍結しておく。

下記の様にしてフェニル−セファロースを使用したｐＨ段階溶翻により、１０倍 濃縮培養上ずみ液からミンアクチビンを更に精製する。

上ずみ液のイオン強度を固体ＮａＣ１の添加により２磨こ調節し、そしてｐｎ値 をくえん酸で５．５に調節する。この溶液を、５０＋ｎＭ　（えん酸すｌ・リウ ム（ｐｌ＋５．５）、２Ｍ　ＮａＣ］およびＬＭ　ＥＤＴＡで平衡化したフェニ ル−セファロースカラム（４，４ｃｍ’Ｘ５．Ｏｃｍ）に装入し、そして２８０ ｎｍ　（Ａ２８０）におりＪる基線吸光度が基線にもどるまで同じ緩衝液で溶出 する。次にミンアクチビンを５０ｍＭグリシン＜ｐ）Ｉ９．０）でカラムから溶 出する。最高特異活性ミンアクチビンを含有する両分を集め、アミコンＹＭＩＯ 膜上で濃縮する。

こうして集めて濃縮したミンアクチビンを次いで０．１１１はう酸すトリウム（ ｐＨ９，０）で平衡化した七フアクリルＳ−２００の２．２　ｃｍＸ７Ｓｃｍカ ラム中に装入する。　５．Ｏｍｌの画分を流速０．４６１１Ｊｌ／分で集める。

ミンアクチビン活性を有する画分を集め、そしてＹＭＩＯ膜を使用して３ｍｌに まで濃縮する。公知のＭｒ標準体でのこのカラムの検量によれば、ミンアクチビ ンが４５〜４８ＫＤのＭｒを有していることが明らかである。

濃縮ミンアクチビン溶液を、ｐＨ値範囲４．５〜６．０のアノフォリン含有ウル トロデックスの予備平床ゲルに装填し、ＬＫＢマルチホール等電集光装置上で２ ３時間１０°Ｃで電気集光する。この操作の終了後に、ゲルの長さ方向を横断す る３０ゾーンをかき出して、そして１ｍＭ　ＥＤＴＡ　（ｐＨ９，０）を含有す る１Ｍグリシン１０威ヲ使用してそれぞれからたん白質を溶離する。各両分のア リクオツドをミンアクチビン活性について分析し、１５％５ＤＳ−ポリアクリル アミドゲル上で電気泳動してたん白質を確認する。これらの状況から、ミンアク チビンはｐＨ５〜ｐＨ５，２の間で集光して著しく精製される。この物質を再度 アミコンＹＭＩＯ膜上で濃縮し、そしてｂｎＭ　ＥＤＴＡおよび５０％グリセリ ン含有の５０ｍＭグリシンＣｐＨ９，０）中に−２０”Ｃで保存する。

荀】４４す限隼可能且 ウロキナーゼ型プラスミノーゲン賦活剤の特異的失活剤として、ミンアクチビン は色々なヒトの癌や炎症状態の診断や可能な処置のためのＨｎ床用薬剤としての 有効な産業上の利用可能性の範囲を有するものである。

腫瘍ウィルスによる生体外の細胞形質転換の研究（Ｏｓｓｏｗｓｋｉ等のｒ　Ｊ 、Ｅｘｐ、ｍｅｄ、　」、　１３７．１１２．１．９７３）および化学発癌物質 による当該研究（Ｓｉｓｓｋｉｎ等の’Ｉｎｔ、Ｊ、ＣａｎｃｅｒＪ、２６，３ ３１．．１９８０）によれば、プラスミノーゲン賦活剤分泌は形質転換に関連し た量も首尾一貫した初期の生化学現象であるとされている。更に又、生体内で転 移する細胞系の能力は、プラスミノーゲンを発現するそれらの能力と関連してい ることが見出された（Ｗａｎｇ等のｒＣａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｊ　遮 ２８８．１９８０）　、又、最も一般的なヒトの癌、例えば肺癌、乳癌、前立腺 癌および結腸癌のいくつかの腫瘍細胞は高レベルのウロキナーゼ形プラスミノー ゲン賦活剤を産生ずることは良く知られたところである（Ｄｕｆｆｙ、Ｍ、Ｔ。

および０　’　Ｇｒａｄｙ、Ｐ、の’Ｅｕｒ、Ｊ、Ｃｌ１ｎ、０ｎｃｏ１．　Ｊ 　、２０（５）、５７７〜５８２１（１９８４）。

本発明者らによる、結腸粘膜における悪性腫瘍や悪性腫瘍となる徴候状態、例え ば腺腫様ポリープ、結腸ポリープおよびクローン病や潰瘍外大結腸炎の様な結腸 の炎症状態に関するこれまでの研究（Ｓｔｅｐｈｅｎｓ、　Ｒ，Ｓ、等。ｒＢｌ ｏｏｄ　Ｊ　、６６．３３３〜３３７．１９８５）によれば、ヒト結腸癌は、隣 接する平常組織に比べて著しく大量のウロキナーゼ形プラスミノーゲン賦活剤を 生成することがわかった。そして又、ミンアクチビンはこの腫瘍関連プラスミノ ーゲン賦活剤と結合しこれを阻害する作用のあることが見出された（Ｓｔｅｐｈ ｅｎｓ等のｒＢＩｏｏｄ　Ｊ　、６６．３３３〜３３７．１９８５）　、この様 に、これら従来の研究は、ミンアクチビンが生体内的にも又組織学的検体用にも 腫瘍の同定と確認のための反応剤として産業上利用可能であることを裏付けよう というものである。生体内で腫瘍を造影するには、ミンアクチビンを適当な放射 性同位体、例えばテクネチウム−９９ｍ（Ｒｊｃｈａｒｄｓｏｎ＋ν、Ｊ、のｒ 　Ｂｒｉ　ｔ、　Ｊ。

ＣａｎｃｅｒＪ、４０，３５．１９７９）又はよう素−１３１（Ｂｅｇｅｎｔ、 Ｒ，Ｈ，のｒＪ、Ｌａｎ−ｃｅｔ、　Ｊ　、１９８２年１０月２０）で標識すれ ば良い。ミンアクチビン製剤を投与した後に、腫瘍の位置と境界を公知の放射性 同位体法、例えばガンマ線カメラ造影法により測定することが出来る。

このようにミンアクチビンは、特に外科的要因に起因する様な小さな転移癌の同 定が出来る様な高感度な方法可能とするものである。組織化学用検体の分析にお いて、ミンアクチビン又はその抗体は１１３１の様な同位体で標識するが、又は 適当な酵素又は他の化学反応剤と接合することが出来る。組織学用検体、例えば バイオプシー片を接触させると、ミンアクチビンは腫瘍型プラスミノーゲン賦活 剤とその分泌部位において結合し、これにより腫瘍境界および潜在的な腫瘍の転 移状態を同定し得るものと考えられる。その診断用途に加えて、ミンアクチビン は又腫瘍の直接処置の用途としても利用可能である。腫瘍が周囲組織を侵襲する プロセスに関与する酵素の特異的禁止剤として（Ｄａｎｏ、に、等のｒＡｄｕ、 ｉｎ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　Ｊ　、４４，１３９．１９８５）　、腫瘍生長 および転移を規制し、そして特にそれらを禁止することが出来る。更に又、ミン アクチビンはレクチン又はトキシンを直接に生長している腫瘍に送り届ける、薬 剤デリバリ−系としても使用することが出来る。このデソバリー系は、特異的な そして特に効果的な抗＋ｎｉ能を有するものとして多大な利益をもたらすもので あるということが理解出来よう。

ウロキナーゼ型プラスミノーゲン賦活剤の関与する他の生物学的プロセスとして は、例えばリウマチ性関節炎の様な慢性炎症状態の様な、侵襲および組織破壊に 関連した生理学的現象がある。ミンアクチビンは組織破壊に対する自然宿主応答 の１部であるので、特に処方通りの治療を行っている間の病気の状態を観察（モ ニタリング）するためのマーカーとして有用であると考えられる。標識抗体やミ ンアクチビン由来のＤＮＡプローブは、病気の状態と関連して血しょう中の又は １ｔＪｌ織バイオプシーのマクロファージ中の又は滑液中のミンアクチビンレベ ルをモニタリングする診断剤として産業上の利用可能性を有している。

同様に、ミンアクチビン自身も又病気の状態を回復するために住体内に投与した 時に治療効果を有するものであることが確認されている。

第　２　図 Ｍｒ　Ｘ　１０００ 第　３　図 鉛６図 ジトイｊｌｘ１０°゛７＝：ゴ二 フＬＳルＪパ０え一ト　７カ゛０−ス　り０−２）フーフフイ−第１０図 日 区 Ｌ税１フィニー：ｉ：づカラムの：、分把つ′０フイ１し区 一２ｏｏｔ＜　− ５１＝Ｋ　−−一一 図 囚 区 囚 第１８　図 ベ　区 第　２１　図 ２２閤　ごゾ丁２今し′ノいＬＬ） Ｅ−ＥｃｏＲＩ、、Ｐ−Ｐｓｆｌ　第２２図詐−ミノ了り千しノ功ツム３−　ｅ ｌ　ｐ、ア○ｔ”９−第２４図 第２５図 区 ＳＤＳ−ＰＡＣＴＥ 国際調査報告 レー、ｔ、、、、−、、帥、、、、、、、、、、、ＰＣＴ／ＡＵ８７１０○０６ ８１ｈ＋ｎ＋ｕ＋゛ａ″ｓｌ＾””””′ＩＮ’ＰＣＴ／ＡＵ８７１０Ｏ０６８ ＡＩ＋１１ＥＸＴｏＴＨＥＩＮＴＥＲ）ＩＡＴＩＯＮＡＬＳＥＡＲＣ）ＩＲＥＰ ＯＲＴＯＮＩＮＴＥＲ）ＪＡＴＩＯＮＡＬ　ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮ　１１０． 　ＰＣＴ／Ａｌｌ　８７１０００６８：１頁の続き ■Ｉｎｔ、Ｃ１，’　識別記号　庁内整理番号優先権主張　［相］１９８岬５月 ２２日［相］オーストラリア（ＡＵ）■ＰＨ’６０３３［相］１９８岬９月１８ 日［相］オーストラリア（ＡＵ）［株］ＰＨ８１０００１９８岬１１月２１日［ 相］オーストラリア（ＡＵ）■ＰＨ９１０４発　明　者　クラーク、ミツシェル ・アリソ　オーストラリア国ン　ウィンチ、キング・ 発　明　者　デヴイン、ピータ−・レオナー　オーストラリア国ド　ウ°イル、 オスガソー 発　明　者　ゴス、ネイル・ハワード　オーストラリア国ンガ、キャンベル・ 発　明　者　レアーバック、フィリップ・ラ　オーストラリア国ルフ　ンガ、フ イオナ・ア 特表昭６３−５０３３５４　（３０） ニュー・サウス・ウェールズ　２０６＼グリーン・ウィリアム・ストリート　１ ５ ニュー・サウス・ウェールズ　２１１１、グラーズープ・口−ド　５４ 二ニーφサウス・ウェールズ　２０７６Ｘ　ワール−・ドライブ　１１８ ニュー・サウス・ウェールズ　２０７＆、ワール−どヴエニュ−５

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ミンアクチビンの全部、１部、類縁体、相同体、誘導体又はそれらの組合わ せのアミノ酸配列をコードする配列としての作用を有する第１のＤＮＡ配列、天 然、合成又は半合成源を含めてのあらゆる原料源由来の、該第１のＤＮＡ配列と ハイプリダイズするＤＮＡ配列、単一の又は複数の塩基置換、除去、挿入および 転位を含めての変異により該第１のＤＮＡ配列又はハイプリダイズする配列と関 連したＤＮＡ配列、又はミンアクチビンであるか又はミンアクチビンと同様な免 疫的又は生物学的活性を示すポリペプチドの全部、１部、類縁体、相同体、誘導 体又はそれらの組合わせを発現の際にコードするＤＮＡ配列から成るＤＮＡ配列 。 ２．実質的に純粋な形である、請求の範囲第１項に記載のＤＮＡ配列。 ３．下記のＤＮＡ配列又はその断片。 【配列があります】４．ミンアクチビンの全部、１部、類縁体、相同体、誘導体 又はそれらの組合わせのアミノ酸配列をコードする配列としての作用を有する第 １のＤＮＡ配列、、該第１の配列とハイブリダイズするＤＮＡ配列、単一の又は 複数の塩基置換、除去、挿入および転位を含めての変異により該第１のＤＮＡ配 列又はハイブリダイズする配列と関連したＤＮＡ配列、又はミンアクチビンであ るか又はミンアクチビンと同様な免疫的又は生物学的活性を示すポリペプチドの 全部、１部、類縁体、相同体、誘導体又はそれらの組合わせを発現の際にコード するＤＮＡ配列；およびベクタ−ＤＮＡから成る組換えＤＮＡ分子。 ５．ベクターＤＮＡが、ｐＭＳＧ、ｐＫＣ、ｐＬＪ、ｐＢＲ３２２、ｐＶＣ又は ｐＶＲ系；ｐＺＩＰＮｅｏＳＶ（Ｘ）；ｐＬＫ５７又はｐＬＸ５８から選択した プラスミドから成るものである、請求の範囲第４項に記載の組換えＤＮＡ分子。 ６．発現制御配列がＤＮＡ配列に有効に結合している、請求の範囲第４又は５項 に記載の組換えＤＮＡ分子。 ７．該発現制御配列が、Ｅ．コリのβ−ガラクトシダーゼ遺伝子、ｔｒｐオベロ ン、バクテリオファージλの左側ブロモ−ター、モロニー白血病ウイルスの長末 端反復位、マウス乳癌ウイルス又はＳＶ４０初期プロモーターから選択したもの である、請求の範囲第６項に記載の組換えＤＮＡ分子。 ８．可動プロモーター、翻訳開始部位およびミンアクチビンコード遺伝子から成 る融合遺伝子。 ９．請求の範囲第４〜７項のいずれかに記載の少なくとも１個の組換えＤＮＡ分 子で形質転換した宿主。 １０．細菌例えばＥ．コリ、ブリイドモナス種、バチルス種；酵母；他の真菌類 ；マウス；他の動物宿主；植物宿主；および真核組織細胞、例えば昆虫細胞、お よびヒト又は他の哺乳動物細胞から選択したものである、請求の範囲第９項に記 載の形質転換宿主。 １１．約３５ＫＤないし約６０ＫＤの間の分子量のポリペプチドから成る様に精 製されたミンアクチビン。 １２．オバルブミンの様なストークス半径を有するポリペプチドから成る様に精 製されたミンアクチビン。 １３．抗胎盤禁止剤と交差反応するポリペプチドから成る様に精製されたミンア クチビン。 １４．実質的に純粋な形のミンアクチピン。 １５．均質に精製された場合の、請求の範囲第１１〜１４項のいずれかに記載の ミンアクチビン。 １６．第２３図に記載のアミノ酸配列の全部、１部、類縁体、相同体、誘導体又 はこれらの組合わせから成るポリペプチド。 １７．精製ミンアクチビン由来のポリペプチド、および該精製ミンアクチビン由 来のポリペプチドと同様の免疫的又は生物学的活性を示すポリペプチド １８．請求の範囲第３５〜４９項のいずれかに記載の方法により製造された場合 の、請求の範囲第１６又は１７項に記載のポリペプチド。 １９．微生物から生成されたポリペプチドであって、その全部又は１部がミンア クチビンのアミノ酸配列を含有するものであるポリペプチド。 ２０．ミンアクチビンの免疫的又は生物学的活性を示す、ポリペプチド又はその 断片又は誘導体。 ２１．ミンアクチビンのアミノ酸配列をコードする配列としての作用を有するＤ ＮＡ配列とハイプリダイズし、しかもミンアクチピンに対する抗血清によって破 壊される、ミンアクチビンの生物学的又は免疫的活性を有するＤＮＡ配列をコー ドする、請求の範囲第１１〜２０項のいずれかに記載のポリペプチド。 ２２．適当に標識したミンアクチビン、特に組換えＤＮＡ由来ミンアクチビン、 又はミンアクチビンの断片から成る、組織学的検体又は生体内の腫瘍の境界の所 在確認および決定用の反応剤。 ２３．組換えミンアクチビンおよびミンアクチビンの断片を含めてのミンアクチ ビン、又はミンアクチビン又はミンアクチビンの断片に対する抗体およびその薬 理的に許容される担体又は希釈剤から成る、治療用、診断用又は予防用組成物。 ２４．翻訳および発現時に請求の範囲第１１〜２１項のいずれかに記載のポリペ プチドのアミノ酸配列をコードする第１のヌクレオチド配列、該第１のヌクレオ チド配列とハイブリダイズする様に該第１のヌクレオチド配列と充分に関連して いるヌクレオチド配列、又は単一又は複数の塩基挿入、転位、除去又は置換を含 めての変異により該第１のヌクレオチド配列と関連した配列から成る配列を有す る合成オリゴヌクレオチドプローブ。 ２５．請求の範囲２４に記載の合成オリゴヌクレオチドプローブから成る組成物 。 ２６．組換えミンアクチビン、精製天然ミンアクチビンおよびその断片を含有し てなる、ミンアクチビンに対して作成した抗体製剤。 ２７．ミンアクチビンのアミノ酸配列のコード配列としての作用を有するｃＤＮ Ａ配列の作成方法であって、真核細胞からＲＮＡを採り出し、それからｍＲＮＡ を単離し、該ｍＲＮＡ配列に相補的な２木鎖ＤＮＡ配列を合成し、該ＤＮＡ配列 を自己複製クローニングベクター中へ挿入して組換えクローニングベクターを作 成し、このクローニングベクターで宿主細胞を形質転換し、挿入されたＤＮＡ配 列がミンアクチビンの全部、１部、類縁体、相同体、誘導体又はそれらの組合わ せをコードする組換え宿主細胞を選択し、そして該形質転換宿主細胞のクローニ ングベクター中に含まれる挿入ＤＮＡ配列を同定することから成る、前記方法。 ２８．ミンアクチビン又はミンアクチビンの生物学的又は免疫的活性を有する分 子をコードするｃＤＮＡを作成し、そして該分子を組換え宿主中で発現させる方 法であって、（ａ）適当な細胞系からのｍＲＮＡの単離、（ｂ）そのｍＲＮＡか らのｃＤＮＡライブラリーの構築、（ｃ）（ｂ）からのｃＤＮＡライブラリーの 適当な宿主、例えばＥ．コリ又はバクテリオファージλ中でのクローニング、お よび（ｄ）ミンアクチビン遺伝子の全部、１部、類縁体、相同体、誘導体又はそ の組合わせを含有するクローニング同定、から成る工程を含んで成る前記方法。 ２９．クローンを、 （ａ）ハイブリッド選択翻訳、 （ｂ）化学的に合成したＤＮＡ配列プローブ、特に本発明の合成オリゴヌクレオ チドプローブから成るプローブヘのハイブリダイゼーション、 （ｃ）誘発又は未誘発ｍＲＮＡから合成した標識ｃＤＮＡを使用しての分化ハイ ブリダイゼーション、 （ｄ）ミンアクチビン又は他の免疫関連分子に対する抗体を使用してのｃＤＮＡ 発現ライブラリーの免疫スクリーニング、および（または） （ｅ）標識ウロキナーゼ又はウロキナーゼおよびウロキナーゼに対する抗体を使 用してのｃＤＮＡ発現ライブラリーの生物学的活性についてのスクリーニング、 により同定する、請求の範囲第２８項に記載の方法。 ３０．更にクローニングした遺伝子の拡張工程を含んで成る、請求の範囲第２８ 又は２９項に記載の方法。 ３１．ミンアクチビン又はミンアクチビンの生物学的又は免疫的活性を有する分 子をコードするｃＤＮＡを作成し、そして該分子を組換え宿主中げ発現させる方 法であって、（Ａ）ミンアクチビン生成および発現の刺激のための細胞系の誘発 、 （Ｂ）適当な細胞系からのｍＲＮＡの単離、（Ｃ）ｍＲＮＡの生体外翻訳および ウロキナーゼとの複合体形成によるミンアクチビン翻訳生成物の免疫沈降、（Ｄ ）（Ｂ）からのｍＲＮＡの分画およびミンアクチビン翻訳活性を有する画分の同 定、 （Ｅ）（Ｂ）および（Ｄ）からのｍＲＮＡからのｃＤＮＡライブラリーの構築、 （Ｆ）（Ｅ）からのｃＤＮＡライブラリーの適当な宿主、例えばＥ．コリ又はバ クテリオファージλ中へのクローニング、（Ｇ）（ａ）（Ｃ）を使用してのハイ ブリッド選択翻訳、（ｂ）化学的に合成したＤＮＡ配列プローブ、特に本発明の 合成オリゴヌクレオチドプローブから成るプローブヘのハイブリダイゼーション 、 （ｃ）誘発又は未誘発ｍＲＮＡから合成した標識ｃＤＮＡを使用しての分化ハイ ブリダイゼーション、 （ｄ）ミンアクチビン又は他の免疫関連分子に対する抗体を使用してのｃＤＮＡ 発現ライブラリーの免疫スクリーニング、および（または） （ｅ）標識ウロキナーゼ又はウロキナーゼおよびウロキナーゼに対する抗体を使 用してのｃＤＮＡ発現ライブラリーの生物学的活性についてのスクリーニング、 によるミンアクチビン遺伝子含有クローンの同定、（Ｈ）ミンアクチビン遺伝子 の部分配列、特に本発明の範囲内に開示されたオリゴヌクレオチド配列から得ら れたオリゴヌクレオチドプライマーを使用してのｃＤＮＡライブラリー作成によ るクローニングした遺伝子の拡張、 （Ｉ）ミンアクチビン遺伝子のヌクレオチド配列の決定、（Ｊ）Ｅ．コリ中での ミンアクチビン遺伝子の発現、（Ｋ）代替宿主、例えば真核細胞中でのクローニ ングによる生物学的に活性な組換えミンアクチビンの発現、および（又は）（Ｌ ）組換えミンアクチビン精製およびその生物学的性質の臨床評価、 から成る工程を含有して成る、前記方法。 ３２．ベクターＤＮＡと、請求の範囲第１〜３項のいずれかに記載のＤＮＡ配列 とを組合わせることから成る、請求の範囲第４〜７項のいずれかに記載の組換え ＤＮＡ分子の製造方法。 ３３．ベクターＤＮＡに更に発現制御配列を挿入する工程を含有して成る、請求 の範囲第３２項に記載の方法３４．請求の範囲第４〜７項のいずれかに記載の組 換えＤＮＡ分子を宿主中へ導入することから成る、宿主を形質転換する方法。 ３５．ミンアクチビンを均質となるまで精製し、次いでミンァクチビンに特有の アミノ酸配列を得ることから成る、精製ミンアクチビン由来のペプチドの製造方 法。 ３６．ミンアクチビンを均質となるまで精製し、次いでミンアクチビンに特有の アミノ酸配列を得ることから成る、精製ミンアクチビン由来のペプチドの製造方 法であって、（ａ）ミンアクチビン発現可能な細胞系を培養し、（ｂ）上ずみ液 を採取し、 （ｃ）培養上ずみ液をクロマトグラフィー又は電気泳動により分画し、 （ｄ）ミンアクチビン活性含有画分を分析し、そして（又は）（ｅ）ミンアクチ ビンに特有なアミノ酸配列を得る、ことから成る、前記方法。 ３７．（ａ）ミンアクチビンを生成する培養物又は細胞系を培養し、（ｂ）ミン アクチビン含有上ずみ液を採取し、そして該培養上ずみ液を濃縮し、 （ｃ）この上ずみ液を疏水性および（又は）イオン交換クロマトグラフィーによ り分画し、 （ｄ）ミンアクチビン含有成分をゲルろ過クロマトグラフィーにより分画し、 （ｅ）ミンアクチビン含有溶出物を等電集光し、そして（又は）（ｆ）分配クロ マトグラフィーによりミンアクチビン活性含有画分を分画する、 ことから成る、請求の範囲第３６項に記載の方法。 ３８．培養物がマクロファージ細胞系である、請求の範囲第３６又は３７項に記 載の方法。 ３９．血清の不在下に、そして（又は）ウロキナーゼ生成を禁止しあるいはミン アクチビンの構成的生成を誘発する様な１種又は複数種の物質の充分な量の存在 下に培養物を培養する、請求の範囲第３６〜３８項のいずれかに記載の方法。 ４０．該物質がデキサメタゾンである、請求の範囲第３９項に記載の方法。 ４１．培養物をＰＭＡの存在下に生育させる、請求の範囲第３６〜４０項のいず れかに記載の方法。 ４２．適当な膜孔サイズのろ過カートリッジを備えた中空繊維透析／濃縮装置を 使用して最初の濃縮工程を行う、請求の範囲第３６〜４１項のいずれかに記載の 方法。 ４３．疏水性および（又は）イオン交換クロマトグラフィーをフェニル−セファ ロースカラム上で行う、請求の範囲第３６〜４２項のいずれかに記載の方法。 ４４．溶出が段階的ｐＨ溶出である、請求の範囲第４３項に記載の方法。 ４５．１ｍＭ　ＥＤＴＡ（ｐＨ９．０）を含有する１Ｍグリシンでの等電集光ゲ ルからたん白質を溶出する、請求の範囲第３６〜４４項のいずれかに記載の方法 。 ４６．等電集光画分を抗体でブロービングしてミンアクチビンバンドを確認する 、請求の範囲第３６〜４５項のいずれかに記載の方法。 ４７．分配クロマトグラフィー工程がＨＰＬＣである、請求の範囲第３６〜４６ 項のいずれかに記載の方法。 ４８．精製ミンアクチビンをエンドブロティナーゼＬｙｓＣで消化する、請求の 範囲第３６〜４７項のいずれかに記載の方法。 ４９．生成したペプチドをＨＰＬＣにより分離する、請求の範囲第３６〜４８項 のいずれかに記載の方法。 ５０．非グリコシル化ミンアクチビンの製造方法であって、単球血統の細胞から のｍＲＮＡを使用してミンアクチビンの生合成の遺伝情報を得ること、こうして 得られた遺伝子を微生物中に導入すること、該微生物を選択培養して該ミンアク チビンを生成すること、および該ミンアクチビンを採取することから成る工程を 含有して成る前記方法。 ５１．ヒトミンアクチビンの免疫的又は生物学的活性を有するポリペプチドの製 造方法であって、ヒトミンアクチビンのアミノ酸配列をコードする配列としての 作用を有する第１のＤＮＡ配列、又は該ＤＮＡとハイブリダイズし、そして天然 合成又は半合成源を含めてのあらゆる原料源由来のＤＮＡ配列、又は単一の又は 複数の塩基置換、除去、挿入および転位を含めての変異により該第１のＤＮＡ配 列と関連したＤＮＡ配列、および前記のＤＮＡ配列およびインサートのいずれか のコドンの発現の際にコードされるポリペプチドと同様の免疫的又は生物学的活 性を有するポリペプチドを発現の際にコードするコドンの配列から成るＤＮＡ配 列を含有する組換えＤＮＡ分子で形質転換した宿主を培養し、そして該ポリペプ チドを採取することから成る前記方法。 ５２．精製ミンアクチビン由来のペプチド断片のアミノ酸配列を決定し、そして 相当するオリゴヌクレオチドを合成することから成る、請求の範囲２４項に記載 の合成オリゴヌクレオチドプローブの作成方法。 ５３．適当に標識したミンアクチビン又はその断片を付与又は投与し、そして次 いで造影して標識体の濃度部位を測定することから成る、組織学的検体中の又は 生体内中の腫瘍の境界を確認決定する方法。 ５４．腫瘍による侵襲を阻止し、腫瘍を治療し、又はリウマチ性関節炎の様な慢 性炎症を治療する方法であって、上記の様な治療を必要とする患者に治療有効量 のミンアクチビン、適当に標識したミンアクチビン、ミンアクチビンの断片又は ミンアクチビンの標識断片を投与することから成る、前記方法。 ５５．ミンアクチビン又はミンアクチビンの断片に対して作成した抗体を使用し てヒト体液又は組織中のミンアクチビンを検出することから成る、慢性炎症をモ ニターする方法。 ５６．ミンアクチビンをコードするＤＮＡの検出用の分析工程に請求の範囲第２ ３項に記載の組成物を使用することから成る、ヒトの癌および炎症の状態又はそ の前徴兆候を検出する方法。