FI103892B - Rekombinantti-DNA-molekyyli, joka koodaa polypeptidiä/proteiinia, jolla on oleellisesti vaskulaaristen antikoaguloivien proteiinien biologiset ominaisuudet sekä niiden valmistus - Google Patents

Description

103892

Rekombinantti-DNA-molekyyli, joka koodaa polypeptidiä/proteii-nia, jolla on oleellisesti vaskulaaristen antikoaguloivien proteiinien biologiset ominaisuudet sekä niiden valmistus Rekombinant-DNA-molekyl, som kodar protein med väsentligen vaskuära antikoagulerande proteiners biologiska egenskaper samt deras framställning

Esillä olevan keksinnön kohteena ovat rekombinantti-DNA-mole-kyylit, näiden valmistusmenetelmät sekä näiden käyttö.

Useimmissa imettäväisissä on proteiineja, joilla on veden hyytymistä estäviä ominaisuuksia. Nämä proteiinit voidaan jakaa kolmeen ryhmään, jolloin jaon perustana ovat erilaiset vaikutusmekanismit .

1. Proteiinit, jotka muodostavat hyytymisfaktorin kanssa kompleksin ja tekevät näin hyytymisfaktorin tehottomaksi. Näihin kuuluvat seuraavat proteiinit: a) Antitrombiini-III (Thorm.Res.5, 439-452 (1974)) b) a1-proteaasin inhibiittori (Ann. Rev. Biochem. 52, 655-709 (1983)) c) a 2-makroglobuliini (Ann. Rev. Biochem. 52., 655-709 (1983)) d) Cl-inhibiittori (Biochemistry 20, 2738-2743 (1981)) * e) Neksiini-proteaasi (i. Biol. Chem. 258, 10439-10444, (1983)).

2. Proteiinit, jotka pilkkovat hyytymisfaktorin proteolyytti- * sesti hajalle ja näin inaktivoivat hyytymisfaktorin. Tähän . mennessä tämän laatuisia proteiineja on kuvattu vain yksi, proteiini C (J. Biol. Chem. 251. 355-363, 1976)).

3. Proteiinit, jotka irrottavat ja/tai hydrolysoivat negatiivisesti varautuneet fosfolipidit, jolloin fosfolipi-distä riippuvat veren hyytymismekanismin reaktiot estyvät. Tähän mennessä on kuvattu vain fosfolipaaseja, 103892 jotka on eristetty erilaisista käärmeenmyrkkylajeista (Eur. J. Biochem. 112, 25-32 1980)).

Viime vuosina on intensiivisesti tutkittu vaiheittain tapahtuvaa hyytymissysteemiä. Tällä ymmärretään erilaisten toisiinsa liittyneiden, proteolyyttisten reaktioiden itsevah-vistuvaa monivaiheista systeemiä, jossa yksi entsyymi muuttaa yhden tsymogeenin aktiiviseen muotoon (vrt. Jackson C.M., Nemerson Y. , Ann, Rev. Biochem. 4J9, 765-811, (1980)). Fosfoli-pidien ja muiden kofaktoreiden, kuten faktorin V ja fak- cl torin VIII läsnäolo lisää ratkaisevalla tavalla tämän d reaktion nopeutta. Esikoaguloitumisreaktioita säätelevät in vivo erilaiset inhibitiomekanismit, jotka estävät räjähdysmäisen tromboottisen vaurion hyytymiskaskadin vähäisen aktivoitumisen jälkeen.

Hyytymisenvastaiset mekanismit voidaan jakaa seuraavasti (Rosenberg, R.D., Rosenberg, J.S., J. Clin. Invest.74, 1-6 (1984)): 1. Seriini-proteaasi-faktori X ja trombiini inaktivoituvat

CL

sitoutuessaan antitrombiiniin III tai antitrombiini/ hepariini-kompleksiin. Tällä tavoin voidaan estää sekä ptrotrombiinin aktivoituminen että fibriinin muodostuminen. Anti-trombiinin III lisäksi on olemassa vielä muita erilaisia plasma-proteaasi-inhibiittoreita, kuten esimerkiksi c^-makroglobuliini ja antitrypsiini, joiden vaikutus on ajasta riippuvainen.

2. Proteiini C:n johti toisen hyytymisen estomkanismin : löytämiseen. Jos proteiini C on jo aktivoitunut, se toimii antikoagulanttina selektiivisesti proteolysoi-malla proteiinikofaktorit faktori V ja VIII , jotka ä a inaktivoivat protrombinaasin ja faktorin X muuntavan entsyymin.

3 103892 3. Plasmiini lohkaisee monomeeristä fibriiniä 1, joka on fibrinogeeniin kohdistuvan trombiinin vaikutuksen tuote, mikä estää liukenemattoman fibriinin muodostumisen (Nossel, H.L., Nature, 291, 165-167 (1981)).

Edellä mainituista, hyytymistapahtumaan osallistuvista kehon omista proteiineista käytetään tällä hetkellä kliinisesti vain antitrombiinia III. Huomattavaksi haitaksi on kuitenkin osoittautunut tätä proteiinia käytettäessä esiintyvä lisääntynyt verenvuototaipumus.

Kaikki tähän mennessä antikoagulantteina käytetyt aineet, olivatpa ne kehon omia tai luonteeltaan synteettisiä, tekevät jollain tavoin hyytymisfaktorit tehottomiksi ja aiheuttavat siten sivuvaikutuksia, jotka voivat vaikuttaa haitallisesti hyytymistapahtumaan.

Yllättäen on nyt voitu näiden proteiinien lisäksi eristää muita kehon omia aineita, joilla tosin on halutut veren hyytymistä ehkäisevät ominaisuudet määrätyissä olosuhteissa, mutta jotka tällöin eivät kuitenkaan lisää verenvuotovaa-raa. Suurissa verenvuodoissa nämä proteiinit menettävät veren hyytymistä ehkäisevät ominaisuutensa eikä niiden käyttö siten häiritse tällaisissa tapauksissa eloonjäämiselle välttämättömiä hyytymistapahtumia. Koska ne ensimmäisen kerran eristettiin voimakkaasti verisuonittuneista kudoksista, niille annettiin nimeksi "vascular anticoagulating proteins", VAC.

Voimakkaasti verisuonittuneista kudoksista, kuten napanuoran verisuonista ja istukasta eristettyjen proteiinien mole- 3 3 3 kyylipainot ovat n. 70x10 , n. 60x10 , n. 34x10 ja n.

3 32x10 , joista aineet, joiden molekyylipainot ovat 34 vastaa-vasti 32x10 , muodostuvat yhdestä ainoasta polypeptidiket-justa. Näiden proteiinien täsmällinen biokemiallinen karakterisointi sekä niiden eristäminen ja puhdistaminen on esitetty patenttijulkaisussa EP-A-0 181 465, 21.5.1986.

« 103892

Proteiinit, joilla on VAC-aktiivisuus, ovat luonnonmukaisia verenhyytymisaineita, jotka osallistuvat verenhyytymiskaska-diin kahdessa kohdassa.

Ensimmäisen kerran ne inhiboivat faktorien IXa ja Villa katalysoiman faktorin X aktivoitumisen faktoriksi Xa. Toisen kerran ne ehkäisevät faktorien Xa ja Va välittämän protrombiinin lohkeamisen trombiiniksi. Kummallekin aktivoitumisvaiheelle on yhteistä, että ne tarvitsevat kalsium-ioneja ja fosfolipidejä. VAC-proteiinit voivat ilmeisestikin olla myös vuorovaikutuksessa fosfolipidien kanssa ja tämän sitomisen avulla salvat hyytymisfaktoreiden aktivoimisvaiheen.

Näiden proteiinien ominaisuudet tekevät nämä mielenkiintoisiksi, farmakologisesti äärimmäisen arvokkaiksi tehoaineiksi.

Jotta niitä kuitenkin olisi käytettävissä riittäviä määriä ja erittäin puhtaana, niiden valmistuksen on kuitenkin tapahduttava jotain muuta tietä kuin puhdistamalla proteiinit luonnonmukaisesta kudoksesta. Tähän ovat käytettävissä geenitekniset menetelmät.

Esillä olevan keksinnön tavoitteena oli siten valmistaa geeniteknisesti proteiineja, joilla on VAC-aktiivisuus. Keksinnön tuntomerkit ilmenevät jäljempänä esitettävistä patenttivaatimuksista .

Yllä esitettyyn tavoitteeseen päästiin siten, että voimakkaasti verisuonittuneesta kudoksesta eristettyjen ja pitkälle puhdistettujen proteiinien (EPÄ 0 181 465), joilla on VAC-aktiivisuus, osien aminohapposekvenssi selvitettiin, näiden sekvenssien avulla valmistettiin synteettisiä DNA-koettimia ja näiden avulla etsittiin sopivat cDNA-kirjastot. Sen jälkeen, kun oli eristetty koettimien kanssa hybridisoituvat cDNA:t, niiden sekvenssit määritetty ja sopivalla tavalla manipuloitu, nämä cDNA:t ekspressoitiin sopivissa isäntäsysteemeissä, esimerkiksi bakteereissa, hiivoissa tai nisäkässoluissa.

5 103892

Yksi puhdistetuista proteiineista pilkottiin entsymaattisesti trypsiinillä. Muodostuneet peptidit erotettiin ja valitut fragmentit sekvenssoitiin. N-pään sekvenssiä ei kuitenkaan voitu analysoida suoraan, koska ensimmäinen aminohappo oli ilmeisesti blokattu.

*

Tiedot sekvensseistä on annettu kuviossa 0.1.

Sopivat DNA-koettimet voidaan periaatteessa valmistaa kolmea tietä. Jos proteiinista tunnetaan pitkähkö pala, noin 30 aminohapon pituinen tai suurempi, on mahdollista muodostaa todennäköisin sekvenssi vastaavalle mRNA-palalle käyttämällä apuna nisäkkäillä mieluimmin käytettyä kodonia. Huonoimmassa tapauksessa tällainen koetin on noin 66-prosent-tisesti homologinen todellisen sekvenssin kanssa. Juuri tästä syystä koettimen on oltava suhteellisen pitkä, jotta se voisi hybridisoitua ei-stringenteissä olosuhteissa.

Toinen mahdollisuus on syntetisoida kaikki ajateltavissa olevat oligonukleotidien muunnelmat lyhyelle peptidipalalle, jonka pituus on noin 6-7 aminohappoa. Kun tällaisia kompleksisia seoksia käytetään cDNA-kirjastojen etsimisessä, voidaan eristää suhteellisen paljon "valepositiivisesti" reagoivia klooneja. Lisäksi hybridisoitumissignaali voi olla ·_ erittäin heikko, koska ainoa täydellisesti yhteensopiva oligonukleotidi muodostaa vain vähäisen osan koko seoksesta.

Kolmannessa tiessä ei tosin vältetä oligonukleotidikoetti-men luotettavuutta, vaan valitsemalla erityinen nukleosidi-trifosfaatti (ITP) pidetään huoli siitä, että kaikki koet-. . timen molekyylit voivat sitoutua etsittyihin (tai myös "vääriin") cDNA-molekyyleihin. Siten syntetisoitiin inosii-nitrifosfaattia käyttämällä trypsiinipeptidiin /P30/I/ sopivia, 23 emästä paitkiä oligonukleotidejä.

Edellä jo mainittiin, että VAC-proteiineja voidaan eristää 6 103892 voimakkaasti verisuonittuneista kudoksista. Valitut kudokset ovat napanuoran verisuonia tai istukka. Koska lisäksi tiedetään, että päinvastoin kuin muissa eristyiskudoksissa, istukassa ekspressoituvat lähes kaikki geenit, edellä mainittujen DNA-koettimien avulla etsittiin istukasta peräisin olevasta cDNA-kirjastosta, joka sinänsä tunnetulla tavalla oli valmistettu istukkakudoksesta, VAC-proteiineja koodaa-via cDNA-molekyylejä.

Jotta cDNA-kirjastosta voitaisiin etsiä VAC-proteiineja koodaavat cDNA:t, syntetisoitiin kaksi trypsiinipeptidiä P16/II vastaavaa sekvenssiä ja yksi Staph A peptidiä P20/I/6 vastaava oligonukleotidi (kuvio 1). Nämä oligonukleotidit ovat kussakin tapauksessa seos kaikista varianteista, jotka ottavat huomioon vastaavan mRNA:n kaikki koodausmahdolli-suudet. EBI-386:lla, jonka ketjun pituus on 20 nukleotidiä, on 512 variaatiota ja se sopii Staph-A peptidiin P20/I/6. Jotta trypsiinipeptidin P16/II oligonukleotidillä voitaisiin variaatiot pitää pienempänä, syntetisoitiin kaksi oligonukleotidiä (20-meeri): EBI-387: 128 variaatiota, EBI-388: 64 variaatiota.

Lisäksi syntetisoitiin trypsiini-VAC-peptidiin P30/I sopien kaksi oligonukleotidiä käyttämällä "Wobble"-asemissa emäksenä desoksi-inosiinia (kuvio 2): EBI-118 ja EBI-119. Tämän substituution ovat kuvanneet E. Ohtsuka et ai., J. Biol.

Chem. 260/5 (1985). sovit 2605-2608, sekä Y. Takahashi et ai., Proc. Nat. Acad. Sei. (1985) sivut 1931-1935. Ino-siini muodostaa hyvin parin sytosiinin kanssa ja häiritsee tuskin lainkaan kaksoiskierukan muodostumista, kun kumppa-neiksi on tarjolla muita nukleotidejä.

Sen jälkeen, kun kukin näistä oligonukleotideistä oli tunnetulla tavalla leimattu radioaktiivisesti, näille hybridisoi-tiin faagimaljojen vedokset tunnetuilla menetelmillä.

. Oligonukleotidien EBI-386, -387 ja -388 kanssa tapahtuvasta 103892 hybridisoinnista saatiin faagit lainbda-Pll/3, lambda-P6/5, lambda-P6/6. Hybridisointi oligonukleotidien EBI-118 ja -119 kanssa johti faageihin Iambda-Nrl5, Iambda-Nrl9 ja Iambda-Nr22.

Faageista eristetyt DNA:t pilkottiin EcoRI:lla ja muodostuneet fragmentit eristettiin. Kloonien lambda-Pll/3, lambda-P6/5 ja lambda-P6/6 cDNA-inserttien koot olivat noin 1300 -noin 1400 bp. Sekvenssianalyysi osoitti, että kaikki kolme kloonia olivat peräisin yhdestä ja samasta mRNA:sta. mRNA:n 5'-päätä ei kuitenkaan ollut cDNA-molekyyleissä. Faagien Imbda-Nrl5, Iambda-Nrl9 ja Iambda-Nr22 inserttien pituudet olivat noin 1600, 1100 ja 1000 bp. Sekvenssianalyysin perusteella voidaan cDNA:n olettaa olevan lähes täydellinen.

Alempien faagiryhmien lambdapPll/3, lambad-P6/5 ja lambda-P6/6 sekä Iambda-Nrl5, Iambda-Nrl9 ja Iambda-Nr22 cDNA:t ovat sekvenssianalyysin perusteella peräisin kahdesta erilaisesta mRNArsta. Kloonien lambda-Pll/3, lambda-P6/5 ja lambda-P6/6 EcoRI-insertit eristettiin ja liitettiin EcoRI:lla pilkottuun Bluescribe M13+-vektoriin (Vector Cloning Systems, 3770 Tansy Street, San Diego, CA 92121, USA). Saaduille klooneille annettiin nimiksi pP6/5, pP6/6 ja pPll/3.

♦ *

Kolmen kloonin Iambda-Nrl5, Iambda-Nrl9 ja Iambdra-Nr22 EcoRI-insertit eristettiin ja liitettiin EcoRItlla pilkottuun Bluescribe Ml3 -vektoriin. Saaduille klooneille annettiin nimiksi pRH201, pRH202 ja pRH203.

cDNA-kloonia saatiin lisää siten, että ihmisistukan lambda-gtlO-kirjasto etsittiin vielä kerran, tällä kertaa käyttämällä koewttimena pPll/3:n radioaktiivisesti leimattua EcoRI-inserttiä.

Positiivisesti reagoivia klooneja saatiin yhteensä 69 8 103892 (lambda-VACl - lambda-VAC69).

12 näistä klooneista preparoitiin edellä kuvatulla tavalla pienessä mitassa, cDNA-insertit vapautettiin EcoRI:11a ja eristettiin. Tällöin osoittautui, että lambda-VAClO-kloonin insertti sisältää koko VAC-proteiinia koodaavan lukukehyksen. VAC-alfa:aa ja VAC-beta:aa koodaavien cDNA-molekyylien karakterisoimiseksi suoritettiin Northernblot-koe, sekvenssianalyysit ja genomin Southernbot-analyysi.

Tulos on esitetty kuviossa 3. pPll/3-kloonin cDNA hybridi-soituu noin 1700 emäksen suuruiseen mRNA:an ("VAC-alfa") ja pRH 203-kloonin cDNA noin 2200 emäksen suuruiseen mRNA:an ("VAC-beta").

Koska ensiksikin käytetty radioaktiivisuusmäärä että mRNA-määrä jälkeä kohti olivat suurin piirtein yhtä suuret ja toiseksi, koska genomi-täplän hybridisointi samassa liuoksessa antoi kummallakin cDNA:11a intensiteetiltään yhteä suuret vyöhykkeet (kts. jäljempänä), on pääteltävissä, että lyhyempää mRNA:ta ("VAC-alfa") on istukassa suurempia määriä kuin pidempää ("VAC-beta") mRNArta.

VAC-alfa cDNA:n sekvenssianalyysiä varten sekvenssoitiin ·. täydellisesti pP6/5, pP6/6- ja pPll/3-kloonien cDNA sekä lambda-VACl - -12-kloonien cDNA osittain. Tulos on annettu kuviossa 4. Yhteensä sekvenssoitiin 1465 emästä. cDNA:11a on pitkä, avoin lukukehys, joka voi koodata 320 aminohappoa.

Jos dNA-sekvenssi käännetään aminohapposekvenssiksi, niin trypsiinifragmenttien kaikki sekvenssoidut peptidit tässä sekvenssissä voidaan laittaa alekkain (kuvio 5). Nämä cDNA:t ovat tällöin cDNA-molekyyleja, joiden vastaava mRNA koodaa VAC-proteiinia. Koska toisen eristetyn cDNA:n sekvenssit koodaavat samankaltaista, mutta VAC-proteiinista eroavaa proteiinia, käytetään tässä yhteydessä nimitystä VAC-alfa.

« « 9 103892

Ennen ensimmäistä ATG-kodonia (emäkset 35-37) on samassa lukukehyksessä pysäytyskodoni. Emäkset 30 - 38 täyttävät melko hyvin Kozak'in säännön (M. Kozak, Nature 308 (1984), s. 241-246), joka antaa translaation aloituskodonin läheisyydessä konsensussekvenssiksi CC(A/G)CCAUGG, jota tässä vataa sekvenssi TCGCTATGG. 3'-translatoimaton alue on 471 emästä pitkä. 15 emästä ennen poly-A-palan alkua on poly-adenylointisekvenssi AATAAA (N.J.Proudfoot et ai., Nature 263 (1976), s. 211-214). Jos mRNA:n poly-A-palalle lasketaan ketjunpituudeksi 150 - 200 emästä, mRNA:n kokonaispituus on cDNA-sekvenssiin pohjautuen 1600-1650 emästä. Koska Northern Blot-kokeessa määritetty arvo oli korkeampi, 5'-translatoimattomassa alueessa ei ole mitään täydellistä cDNA:ta.

Vastoin kaikkia muita cDNA-klooneja on kloonin pP6/5-cDNA:ssa paikassa 100 A:n asemesta C. Täten muuttuisi tripletti98-100 (22. kodoni) GAA:sta GACrksi ja koodaisi aminohappoa Asp Glu:n asemesta. Tähän poikkeamaan voi olla useita syitä: a) käänteistranskriptaasia rakentanut mukaan väärän nukleotidin, b) kysymys on kahden alleelisen, tässä kohdassa erilaisen geenin transkriptistä tai c) kysymys on kahdesta ei-alleelisesta geenistä, jotka ovat tässä kohdassa ewrilai-set.

Pitkä, avoin lukukehys koodaa 320 aminohapon proteiinia, josta Met-1 todennäköisesti lohkeaa pois ja jossa seuraava alaniini on blokattu aminoryhmässä, mahdollisesti asyloi-malla. Laskettu molekyylipaino on 35.896 D, mikä on korkeampi kuin SDS-PAGE:11a mitattu arvo. Varauksellisten aminohappojen (Asp, Glu, Lys, Arg, His) osuus, 30,6 % (98/320), on tosin keskimääräistä korkeampi verrattuna keskimääräiseen arvoon 25,1 %. Tämä selittäisi proteiinin muuttuneen kulkeutumisen SDS-PAGE:ssa. Voimakkaasti varautuneista aminohapoista on enemmän happamia aminohappoja (Asp ja Glu), 54, verrattuna emäksisiin (Lys ja Arg), 41. Tämä selittää VAC- alfa-proteiini happamen, isoelektrisen pisteen (pl=4,4 - 10 103892 4,8). VAC-alfa sisältää vain yhden kysteiiniä koodaan triple-tin (aminohappopaikka 316); mukana ei ole yhtään tyypillistä N-glykolysaatiokohtaa (Asn-XXX-Ser/THr).

Aminohapposekvenssin rakenneanalyysin (Pustell, J. et ai., Nucleic Acids Res. 10 (1982) s. 4765-4782, modifioitu) perusteella 67 aminohappoa pitkä sekvenssi toistuu neljä kertaa (kuvio 6). Näitä kutsutaan jäljempänä "toistoiksi".

Tässä sekvenssissä on säilynyt 7 aminohappoa (10,4 %) kaikissa neljässä toistossa, 15 aminohappoa (22,4 %) esiintyy 4 toistossa kolmesta, ja 28 paikkaa (41,8 %) sisältää kulloinkin kaksi saman aminohapon toistoa.

Vertailu julkaistujen kirjallisuustietojen kanssa 8M.J.

GEisow, FEBS Letters 203 (1986), s. 99-103, M.J. Geisow et ai., TIBS 11 (1986), s. 420-423) osoitti yllättäen, että VAC-alfa kuuluu näin Ca++:sta riippuvien fosfolipidejä sitovien proteiinien suurempaan ryhmään. On kuvattu konsensus-sekvenssi (LYs-Gly-fob-Gly-Thr-Asp-Glu-var-var-Leu-Ile-fil-Ile-Leu-Ala-fob-Arg; fob=hydrfobi, fil=hydrofiili, var=muuttuva), joka ottaa osaa Ca++:n sitomiseen (M.J.Geisow et ai., Nature 320 (1986), s. 636-638). Tämä sekvenssi on keksinnön mukaisten proteiinien jokaisessa neljässä toistuvassa 67 aminohappoa pitkässä alasekvenssissä (kuvio 6).

• ·

Silmiinpistävää on myös jokaisen toiston päässä oleva 6 aminohapon pituinen pala, joka muodostuu lähes yksinomaan hydrofobisista aminohapoista ("oooooo” kuviossa 6).

Kloonien Nrl5, Nrl9 ja Nr22 sekvenssianalyysi antaa 1940 bp pituisen VAC-beta cDNA:n, joka muutuu poly-A-palaksi (kuvio 7). Polyadenylaatiosignaali AATAAA on 16 emästä ennen poly-A-palaa. Tämä konsensussekvenssi esiintyy tosin jo nukleotidipaikoissa 1704-1709. Sitä, miksi tätä sekvenssiä ei käytetä polyadenylaatiosignaalina, ei tiedetä.

. Lisäksi tarvittava sekvenssi AATAAA-sekvenssin 3'-puolella u 103892 YGTGTTYY (Gill A. et al., Nature 312 (1984), s. 473-474) esiintyy vasta suhteellisen kaukana (TGTGTTAT, paikat 1735-1742); tämä mahdollisesti selittää syyn siihen, että tätä ensimmäistä polyadenylaatiosekvensseiä ei hyväksytä.

cDNA sisältää pitkän, avoimen lukukehyksen, joka ulottuu cDNA:sta alusta paikkaan 1087. Se kykenisi koodaamaan 362 aminohappoa. Analogiasyistä VAC-alfa-proteiiniin nähden ja johtuen siitä seikasta, että myös VAC-proteiinin puhdistuksessa saadaan 34.000 D proteiini (kts. E.P.A. 181.465), oletettiin translaation aloituskohdaksi ensimmäinen metioniin-kodoni (ATG, paikat 107-109). Kozak'in sääntö ei ole tässä yhtä hyvin täytetty kuin VAC-alfan tapauksessa (AAGAGATGG paikoissa 102-110). Saadun proteiinin (VAC-beta) pituus on 327 aminohappoa. Siinä on 4 kysteiiniryhmää (aminohappo-paikat 161, 206, 250 ja 293) ja yksi potentiaalinen N-glykolysaatiokohta (Asn-Lys-Ser, aminohappopaikat 225-227). Laskettu molekyylipaino on 36.837 (kuvio 9). Myös VAC-beta:ssa on keskimääräistä enemmän varautuneita ryhmiä: 97/327 (29,6 %), jolloin happamia aminohappoja (Asp+Glu: 49) on enemmän kuin emäksisiä (Lys+Arg: 42); tämä selittää SDS-PAGE:lla saadun alhaisemman molekyylipainon.

Myös VAC-betassa toistuu 67 aminohapon pituinen sekvenssi ;· sisäisesti (kuvio 8). Tässä sekvenssissä on säilynyt 7 aminohappoa (10,4 %) kaikissa neljässä toistossa, 17 aminohappoa (25,4 &%) esiintyy neljästä toistosta kolmessa ja 25 paikassa (37,7 %) on kulloinkin kaksi saman aminohapon . toistoa. Myös VAC-beta sopii hyvin yhteen 17 aminohapon pituisen konsensussekvenssin kanssa. VAC-alfaa koskevat . tiedot sopivat myös analogisesti VAC-betalle. Tällä alueella voitiin pistemutaatioiden avulla yrittää muuttaa proteiinien biologista aktiivisuutta. Keksinnön mukaisella mutaatiolla korvataan esimerkiksi täydellisesti tai osittain säilyneen alueen 17 aminohappoa koodaava alue.

12 103892

Proteiineja verrattaessa voidaan todeta, että silmiinpistävin proteiinien välinen ero on N-terminaalisissa peptideissä. Keksinnön mukaisilla modifikaatioilla vaihdetaan siten vastavuoroisesti nämä N-terminaaliset peptidit. Nämä modifioidut proteiinit voidaan valmistaa siten, että sinänsä tunnetulla tavalla valmistetaan näitä N-terminaalisia peptidejä koodaavat DNA-molekyylit, esimerkiksi oligonukleotidi-synteesin avulla ja liitetään "muuhun DNA:an", joka koodaa jäljelle jääviä toistoja ja linkkeripaloja. Näillä DNA-molekyyleillä varustetut ekspressiovektorit voidaan ekspres-soida tunnetulla tavalla sopivissa isäntäorganismeissa; ekspressoitunut proteiini eristetään ja puhdistetaan.

Ihmisistukan kromosomaalisen DNA:n analyysi Southern-mene-telmällä antaa monimutkaisen kuvan. DNA pilkottiin EcoRI-, Hindlll-, BamHI- ja PstI-entsyymeillä. Nitroselluloosalle siirretty DNA hybridisoitiin sekä VAC-alfa DNA:n (pPll/3) että VAC-beta DNA:n (pRH203) kanssa. Vaikka suodattimet pestiin stringenteissä olosuhteissa, pilkottaessa saatiin suhteellisen useita vyöhykkeitä (kuvio 10). Kummankin Blot-kuvion vertaaminen osoitti, että VAC-alfa- ja -beta cDNA:n ristireaktio on pikemminkin mahdoton näissä olosuhteissa. Usean vyöhykkeen esiintyminen selittyy joko VAC-alfa-VAC-beta-geenin kanssa samankaltaisten geenien olemassaolosta tai kysymys on kulloinkin geenistä, jonka monta ja/tai pitkää intronia katkaisee.

Kuviossa 11 on uudelleen verrattu VAC-alfan ja VAC-betan aminohapposekvenssejä. Toistuvat rakenteet ovat järjestäytyneet samalla tavoin kummassakin proteiinissa. Myös yhdys-• peptidit ovat yhtä pitkät lukuunottamatta toisen ja kolman nen toiston välisiä. VAC-alfalla on tähän yhdyspeptidiin jätettävä aukko, jotta molemmat sekvenssit saataisiin sopimaan toisiinsa optimaalisesti. Kummankin proteiinin N-terminaalinen peptidi on eripituinen, VAC-alfalla 19 aminohappoa ja VAC-betalla 25 aminohappoa. Tällä peptidillä 13 103892 on myös alhaisin homologisuus. Molemmat proteiinit ovat identtisiä aminohappopaikoissa 176 - 320, mikä vastaa 55,0 % homologisuusastetta.

* Tässä kohtaa verrattakoon myös VAC-alfa- ja -beta cDNA:n molekyylien nukleotidisekvenssejä. Jos verrataan kahta * geeniä ja niiden tuotteita keskenään, havaitaan DNA (=RNA) - tasolla suurempi homologia kuin aminohappotasolla, mikä on selitettävissä sillä, että nukleiinihapossa riittää uuden aminohapon koodaamiseen jo yksi muutos emästripletissä

Kuviossa 12 on verrattu uudelleen VAC-alfa- ja VAC-beta cDNA-molekyylien koodaavia alueita. DNA-molekyyleillä on yllättäen vain 54,2 % homologisuusaste, so. hieman pienempi kuin molemmilla proteiineilla.

Kuviossa 13 on annettu kummankin proteiinin hydrofiilisyys-profiilit. Tällöin käytettiin Hopp'in ja Wood'in algoritmiä (T.P.Hopp et ai., Proc.Natl.Acad.Sci. 78 (1981) s. 3824-3828). Mainitut neljä toistoaluetta on osoitettu vaaka-viivoilla, joiden alla olevassa sekvenssissä on yhdyspepti-dit kehystetty. Toisen ja kolmannen toiston välinen yhdys-peptidi on yllättäen erityisen hydrofiilinen. Tässä peptidissä on sekä VAC-alfalla että VAC-betalla arginiini samassa paikassa. Siten olisi mahdollista, että spesifisyydeltään • ♦ trypsiinimäinen proteaasi vaikuttaa ensisijaisesti tähän arginiiniin. Molekyylin täytyisi tällöin hajota kahteen suurin piirtein yhtä suureen puoliskoon. Jo tällaisella "puolimolekyylillä" voitaisiin ajatella olevan biologinen, esimerkiksi antikoaguloiva vaikutus. Sen lisäksi, että proteiini voidaan kohdistetusti pilkkoa esimerkiksi spesifisyydeltään trypsiinimäisellä proteaasilla, voidaan nämä puolimolekyylit tai hieman modifioidut puolimolekyylit osoittaa monilla eri tavoin. Siten on mahdollista liittää näitä puolimolekyylejä koodaavat DNA-molekyylit, jotka voidaan valmistaa sinänsä tunnetuilla menetelmillä, sopiviin ekspressiovektoreihin niin, että ekspression kontrolli- 14 103892 sekvenssit säätelevät näitä DNA-molekyylejä. Viljelemällä näillä vektoreilla transformoituja isäntäorganismeja voidaan puolimolekyylit ekspressoida, eristää ja puhdistaa.

Vähän modifioituja puolimolekyylejä saadaan esimerkiksi liittämällä mukaan katkaisukohtia, jotka antavat täydelliselle proteiinille määrättyjen proteaasien edellyttämän spesifisyyden. Siten voidaan valmistaa esimerkiksi proteiini, jossa on katkaisukohta, jolla on faktori xa-mainen spesifisyys siten, että palaan, joka koodaa toisen ja kolmannen toistorakenteen välistä linkkerisekvenssiä, liitetään oligonukleotidi, joka koodaa faktori-Xa-proteaasin tunnistamis- tetrapeptidiä. Näin saadaan ensin täydellinen proteiini, jolla on mahdollisesti muuttuneita ominaisuuksia, esimerkiksi muuttunut stabiilisuus proteolyyttistä vaikutusta vastaan, ja joka toisaalta sisältää erittäin spesifisen katkaisukohdan faktori X -proteaasille. Tällä tavoin voidaan a valmistaa kohdistetusti kaksi puolimolekyyliä ja käyttää terapeuttisesti.

Proteiineja, joilla on VAC-aktiivisuus, koodaavan DNA:n kohdemutaation avulla voidaan valmistaa lisäksi proteiineja, jotka kestävät paremmin proteolyyttistä hyökkäystä. Proteiinien stabiilisuutta voidaan mahdollisesti parantaa vaihtamalla VAC-alfalle j a VAC-betalle yhteinen, toisen ja kolmannen toistorakenteen välinen arginiini, esimerkiksi histi-diiniin. Myös, kun kohdistetusti korvataan muut arginiinit ja lysiinit histidiinillä, mahdollisesti korvaamalla vastaavat kodonit, päästään proteiineihin, joita trypsiini voi vaikeammin hydrolysoida. Nämä pistemutaatiot eivät oleelli-. sesti vaikuta proteiinien/polypeptidien biologisiin, esi merkiksi antikoaguloiviin ominaisuuksiin, mutta toisaalta ne kuitenkin muuttavat, esimerkiksi parantavat proteiinien stabiilisuutta, so. muuttavat proteiinien puoliintumis-aikaa.

is 103892

Monissa tapauksissa, esimerkiksi proteiinien ekspression kannalta, on edullista kytkeä valmiin, halutun proteiinin tai polypeptidin eteen signaalisekvenssi tai myös isäntä-organismille ominainen proteiinisekvenssi niin, että ekspression tuotteena syntyy fuusioproteiinia. Signaalipeptidiä koodaava signaalisekvenssi voi olla mikrobiperäinen tai se voi olla peräisin nisäkässoluista; signaalipeptidi on parhaiten homologinen isäntäorganismin kanssa. Jotta nämä tuotteet voitaisiin muuntaa halutuksi puhtaaksi proteiiniksi, tarvitaan signaali-/fuusio-osan ja valmiin proteiinin väliin spesifinen katkaisukohta. Tähän kohtaan voidaan tätä tarkoitusta varten liitää esimerkiksi edellä kuvatulla tavalla oligonukleotidi, joka koodaa faktori-Xa-proteaasin tunnis-tamis-tetrapeptidiä. Tällä tavoin voidaan ekspressoitu fuusioproteiini kohdistetusti lohkaista faktori-Xa-proteaa-sin avulla. Saadaan valmis proteiini.

Jos kohdistetusti korvataan metioniinia koodaavat kodonit aminohappopaikkaa 1 lukuunottamatta kodoneilla, jotka koodaavat leusiinia, isoleusiinia tai valiinia, voidaan mahdollisesti saatu ei-valmis tai fuusioproteiini muuntaa valmiiksi proteiiniksi BrCN-lohkaisun avulla. Jos osoittautuisi, että tällä tavoin modifioiduilla proteiineilla olisi yhtä hyvät tai mahdollisesti paremmat biologiset ominaisuudet, .. niin tämä olisi eräs mahdollinen tie parantaa saantoa ja mahdollisesti myös eräs menetelmä valmistaa proteiineja, joilla on paremmat ominaisuudet kuin luonnonmukaisilla VAC-proteiineilla.

Toisena pistemutaationa mainittakoon yhden, mahdollisesti useamman kysteiinin kohdistettu vaihtaminen seriinillä tai valiinilla vaihtamalla vastaavat kodonit. Jos tämä vaihtaminen ei vaikuta haitallisesti biologiseen aktiivisuuteen, voitaisiin tällä tavoin parantaa proteiinien eristämistä ja/tai saantoa. Myöskään proteiinien ominaisuuksien parantaminen ei ole poissuljettu. Vielä toinen mahdollinen mutaatio on keksinnön mukaisia proteiineja koodaavien 16 103892 DNA-molekyylien erilaisten täydellisten tai osittaisten sekvenssien yhdistäminen, millä tavoin voidaan saada hybri-diproteiineja, joilla on vaskulaarisia antikoaguloivia ominaisuuksia. Kaikki näillä tai samantapaisilla mutaatiolla saatavissa olevat proteiinit, näitä koodaavat DNA:t, näiden valmistaminen ja käyttö ovat myös esillä olevan keksinnön kohteena.

Kuviosta 13 voidaan edelleen havaita, että ei VAC-alfalla eikä VAC-betalla ole pidempää, hydrofobista aluetta, joka sallisi joko proteiinien erittymisen membraanin läpi tai näiden varastoitumisen membraaniin. Sen vuoksi voidaan olettaa, että VAC-alfa ja VAC-beta ovat solunsisäisiä proteiineja.

Wallner et ai (Nature 320 (1986), s. 77-81) on kuvannut ihmis-lipokortiini I:n rakenteen, Saris et ai (Cell 46 (1986), s. 201-212) ja Huang et ai. (Cell 46 (1986), s. 191-199) hiiren tai ihmisen kalpaktiini I:n, josta käytetään myös nimitystä lipokortiini II, rakenteen. Myös nämä proteiinit kuuluvat Ca :sta riippuvien fosfolipidejä sitovien proteiinien luokkaan. Niiden rakenne voidaan kuvata analogisesti VAC-alfa- ja -betan kanssa (kuvio 14). VAC-alfan ja VAC-betan väliset homologiat ovat kuitenkin selvempiä kuin VAC-proteiinien ja lipokortiinien: VAC-alfa - VAC-beta : 55,0 % VAC-alfa - lipokortiini I : 41,9 % VAC-alfa - lipokortiini II : 43,8 % VAC-beta - lipokortiini I : 41,7 % VAC-brta - lipokortiini II : 44,6 %

Sen vuoksi voidaan olettaa, että myös lipokortiineilla on analogisen rakenteensa vuoksi antikoaguloivia vaikutuksia, jotta niitä siten voidaan käyttää antikoagulantteina. Edelleen voidaan olettaa, että tämä on Ca++:sta riippuvien fosfolipidejä sitovien proteiinien luokan yleisominaisuus.

103892 17

Analogisten rakenteiden perusteella voidaan selittää myös se, että antikoaguloivan vaikutuksen lisäksi keksinnön mukaan saaduilla proteiineilla on myös jo tunnettujen Ca++:sta riippuvien fosfolipidejä sitovien proteiinien ominaisuuksia. Tässä yhteydessä mainittakoon esimerkkinä lipokortiinin tulehdustenvas-taiset ominaisuudet. Keksinnön mukaan saaduilla proteiineilla voitiin osoittaa myös näille proteiineille ominainen, fosfoli-paasia inhiboiva vaikutus.

Keksinnön mukaan saatuja proteiineja voidaan myös käyttää tulehdustenvastaisina aineina sekä kaikkien lipokortiinille ominaisten indikaatioiden, kuten esimerkiksi reumaattisten sairauksien hoidossa. Myös tätä käyttötarkoitusta varten voidaan luonnonmukaisia proteiineja vastaavia keksinnön mukaisia proteiineja muuttaa jo mainituilla tavailla ja myös parantaa niiden ominaisuuksia.

Kun verrataan VAC-alfa-, VAC-beta-, lipokortiini I ja lipo-kortiini II-proteiineja, todetaan, että proteiinien välillä silmiinpistävin ero on N-terminaalisissa peptideissä, erityisesti toisaalta VAC-proteiinien ja toisaalta lipokortiinien välillä. Eräässä keksinnön mukaisessa modifikaatiossa vaihdetaan siten nämä N-terminaaliset peptidit keskenään. Näitä modifioituja proteiineja voidaan valmistaa siten, että sinänsä tunnetulla tavalla valmistetaan näitä N-terminaalisia peptidejä koodaavia DNA-molekyylejä, esimerkiksi oligonukleotidisyn-teesin avulla, ja liitetään "muuhun-DNA:aa", joka koodaa jäljellä olevia toistoja ja linkkeripaloja. Näillä DNA-molekyy-leillä varustetut ekspressiovektorit voidaan saada ekspressoi-maan tunnetulla tavalla sopivissa isäntäorganismeissa; eks-. pressoitunut proteiini eristetään ja puhdistetaan.

Ca++:sta riippuvien fosfolipidejä sitovien proteiinien useat jäsenet sitoutuvat puhdistettuihin eritysvesikkeleihin tai solurungon muihin ainesosiin (kts. R.H.Kretsinger ia 103892 et ai., Nature 320 (1986), s. 573 yhteenvetoa varten. Erittyessä nämä vesikkelit kapseloituvat irti solujen Golgi-laitteesta, kulkeutuvat solumembraaniin ja fuusioituvat sen kanssa. Tällöin vesikkelien sisältö vapautuu soluista. Analogisesti ärsytyksen ja lihaksen supistumisen kytkeytymisen kanssa on ehdotettu (W.W.Douglas, Br.J. Pharmac.

34 (1968), 451), että myös ärsytys ja erittyminen ovat kytkeytyneet Ca++:n kautta. Tällöin voisi Ca++:sta riippuvilla fosfolipidejä sitovilla proteiineilla olla tärkeä osuus. Jokaisen toiston säilyneessä, 17 aminohappoa pitkässä alueessa on VAC-alfalla 5-6 hydroksyyliryhmiä sisältävää aminohappoa (Asp, Glu, Thr, Ser), kulloinkin näistä kolme identtisissä paikoissa. VAC-betalla on kussakin toistossa neljä näitä aminohappoja. Vaikkakin millään näistä proteiineista ei ole kalmoduliinissa, troponiini C:ssa, S-100:ss ja parvalbumiinissa havaittua EF-Hand-rakennetta (R.H Kretsinger et ai., CRC Crit. Rev.Biochem. 8 (1980), pll9), joka näissä molekyyleissä vastaa Ca :n sitoutumisesta, voidaan tämän osapalan säilymisestä jokaisessa toistossa päätellä, että tämä alue vastaa Ca++:n sitoutumisesta.

Tällä alueella suoritettujen pistemutaatioiden avulla voitaisiin yrittää muuttaa proteiinien biologista aktiivisuutta.

Keksinnön mukaisilla mutaatioilla korvataan esimerkiksi täydellisesti tai osittain säilyneen alueen 17 aminohappoa • · * koodaava alue: a. VAC-proteiineissa alueilla, jotka koodaavat lipokorti- nien vastaavia aminohappoja, b. VAC-alfassa alueilla, jotka koodaavat VAC-betan vastaavia aminohappoja ja päinvastoin, c. lipokortiini I:ssa alueilla, jotka koodaavat lipokor- « .· tiini II:n vastaavia aminohappoja ja päinvastoin, d. lipokortiineissa alueilla, jotka koodaavat VAC-proteii-nia vastaavia aminohappoja tai e. muissa polypeptideissä/proteiineissa alueilla, jotka koodaavat kulloinkin muiden polypeptidien kautta proteiinien vastaisia aminohappoja, 103892 19 siten, että vastaavat näitä aminohappoja koodaavat alueet vaihdetaan.

Edellä mainitun analogisen rakenteen vuoksi voidaan lisäksi odottaa, että proteiineilla, joissa näitä analogioita esiintyy, on sekä tulehdustenvastainen että koaguloitumista ehkäisevä vaikutus ja että näitä sen vuoksi voidaan vastaavasti käyttää terapeuttisesti ja/tai profylaktisesti.

Esillä olevan keksinnön mukaan saatuja polypeptidejä voidaan näin käyttää tulehdustenvastaisina aineina, antireumaattisina aineina, lipokortiineja koskevissa indikaatioissa, polyppeti-dien/proteiinien, joilla on toistoalueita, käyttö verenhyytymistä ehkäisevinä aineina, trombiineja ehkäisevinä aineina, tulehduksenvastaisina aineina, antireumaattisina aineina, lipokortiinien käyttö verenhyytymistä ehkäisevinä aineina, trombiineja ehkäisevinä aineina ja VAC-proteiineja koskevissa indikaatioissa, nimenomaan lukuunottamatta osittain esillä olevassa hakemuksessa kuvattujen proteiinien, joissa on tällaisia toistoalueita, tunnettuja käyttöjä.

Esillä olevan keksinnön kohteena ovat myös DNA-molekyylit, jotka koodaavat polypeptidiä/proteiinia, jossa on toistoalueita, DNA-molekyylit, jotka koodaavat jotakin toistoaluetta, DNA-molekyylit, joille on tunnusomaista, että täydellisiä toistoja koodaavat alueet ovat järjestyneet toisella tavoin, näiden koodaavat proteiinit, näiden valmistaminen ja käyttö.

Esillä olevan keksinnön kohteena ovat myös kaikki näillä tai samantapaisilla mutaatioilla saatavissa olevat proteiinit, näitä koodaavat DNA:t, näiden valmistaminen ja käyttö, 20 . 10 3 8 9 2 nimenomaan lukuunottamatta tunnettuja, osittain käsillä olevassa hakemuksessa kuvattuja proteiineja, näitä koodaavia DNA-molekyylejä, näiden tunnettua valmistamista ja käyttöä.

Käsillä olevan keksinnön kohteena ovat myös alkuperältään ei-humaanit DNA-molekyylit, näiden koodaamat proteiinit, näiden valmistaminen ja käyttö, jotka voidaan valmistaa jollakin, käsillä olevan keksinnön kanssa analogisella tavalla.

Keksinnön kohteena eivät ole vain geenisekvenssit, jotka koodaavat spesifisesti keksinnön mukaisia proteiineja, vaan myös modifikaatiot, jotka voidaan helposti ja rutiinimaisesti saada mutatoimalla, hajottamalla, transpositioi-malla tai addition avulla. Mukaan sisältyy myös jokainen sekvenssi, joka koodaa keksinnön mukaisia proteiineja (so. joilla on tässä yhteydessä kuvattu biologinen aktiivisuus-spektri) ja joka on mainituista johdettu; alan ammattimiehet kykenevät johtamaan koodaavien alueiden DNA-sek-venssejä. Samoin mukaan kuuluu jokainen sekvenssi, joka koodaa polypeptidiä, jolla on keksinnön mukaisten proteiinien aktiivisuusspektri, ja joka hybridisoituu mainittujen sekvenssien (tai niiden osien) kanssa stringenteissä olosuhteissa (esimerkiksi olosuhteissa, jotka selektoivat yli 85 %, mieluummin yli 90 % homologian).

Hybridisoinnit suoritetaan 65°C;ssa 6xSSC/5x Denhardt'in liuos/0,1 % SDS-seoksessa. Stringettiysaste määrätään pesu-vaiheessa. DNA-sekvenssien, joiden homologia on noin 85 % tai enemmän, selektoimiseen sopivia olosuhteita ovat siten 0,2xSSC/0,01 % SDS/65°C ja DNA-sekvenssien, joiden homologia on noin 90 % tai enemmän, selektoimiseen sopivat olosuhteet ovat 0,lx SSC/0,01 % SDS 65°C.

Keksinnön kohteena ovat edelleen ekspressiovektorit, jotka sisältävät VAC-proteiinia koodaavan DNA-sekvenssin, jota ekspression kontrollisekvenssi säätelee siten, että 2i 103892 tällä ekspressiovektorilla transformoiduissa isäntäsoluissa ekspressoituu polypeptidi, jolla on VAC-aktiivisuus.

Käsillä olevan keksinnön ekspressiovektorit valmistetaan esimerkiksi siten, että vektori-DNA-molekyyliin, joka sisältää ekspression kontrollisekvenssin, liitetään VAC-proteiinia koodaava DNA-sekvenssi siten, että ekspression kontrolli-sekvenssi säätelee mainittua DNA-sekvenssiä.

Sopivan vektorin valinta riippuu transformointiin käytetyistä isäntäsoluista. Sopivia isäntiä ovat esimerkiksi mikro-organismit, kuten hiiva, esimerkiksi Saccharomyces cerevisiae, ja erityisesti bakteerikannat, joilla ei ole käytettävissä mitään restriktio- tai modifiointientsyymiä, ennen kaikkea seuraavat kannat: Escherichia coli, esim.

E.coli X1776, E.coli HB101, E.coli W3110, E.coli HB101/LM1035, E.coli JA22K30) tai E.coli K12-kanta 294, Bacillus subtilis, Bacillus stearothermophilus, Pseudomonas, Haemophilus,

Streptococcus ja muut, edelleen korkeampien organismien solut, erityisesti kasvatetut ihmis- tai eläinsolulinjat.

Hyvänä pidettyjä isäntäsoluja ovat E.coli'n kaikki kannat, erityisesti E.coli HB101, E.coli JM101 ja E.coli W3110.

Periaatteessa sopivia ovat kaikki vektorit, jotka replikoivat ja ekspressoivat keksinnön mukaiset heterologiset, VAC-proteiinia koodaavat DNA-sekvenssit valitussa isännässä.

Esimerkkejä vektoreista, jotka sopivat VAC-geenin ekspres-soimiseen E.coli-kannassa, ovat bakteriofaagit, esimerkiksi λ-bakteerifaagin johdokset, tai plasmidit, kuten erityisesti plasmidi colEl ja sen johdokset, esimerkiksi . pMB9, pSF2124, pBR317 tai pBR322. Käsillä olevan keksinnön mukaiset suositellut vektorit ovat peräisin plasmidista pBR322. Sopivat vektorit sisältävät täydellisen replikonin ja markkeerausgeenin, joka mahdollistaa ekspressioplasmi-deilla transformoitujen mikro-organismien selektoinnin ja identifioinnin fenotyyppisen tunnusmerkin avulla. Sopi- 103892 vat markkeeraukset antavat mikro-organismille esimerkiksi vastustuskyvyn raskasmetalleja, antibiootteja ja vastaavia vastaan. Käsillä olevan keksinnön mukaiset, hyvänä pidetyt vektorit sisältävät lisäksi replikoni- ja markkeerausgeeni- alueiden lisäksi tunnistamissekvenssit restriktioendonuk- leaaseille niin, että näihin kohtiin voidaan liitää VAC:in aminohapposekvenssiä koodaava DNA-sekvenssi ja mahdollisesti ekspression kontrollisekvenssi. Eräs hyvänä pidetty vektori, plasmidi pBR322, sisältää ehjän replikonin, tetrasykliinille

ja ampisilliinille vastustuskyvyn antavat markkeerausgeenit R R

(tet ja amp ) ja joukon vain kerran esiintyviä tunnista- missekvenssejä restriktioendonukleaaseille, esimerkiksi

R R

entsyymeille: PstI (pilkkoo amp -geenissä, tet -geeni pysyy

D

ehjänä), BamHI, Hindlll, Sali (kaikki pilkkovat tt -geenissä, p amp -geeni pysyy ehjänä), NruI ja EcoRI.

VAC:in ekspression säätelyyn voidaan käyttää useita ekspression kontrollisekvenssejä. Erityisesti käytetään transformoitavien isäntäsolujen voimakkaasti ekspressoituvien geenien ekspressoinnin kontrollisekvenssejä. Siinä tapauksessa, että hybridivektori on pBR322 ja isäntäorganismi on E.coli, sopivia ovat esimerkiksi laktoosioperonin, tryptofaaniope-ronin arabinoosioperonin ja vastavien, β-laktamaasigeenin, faagi AN-geenin tai faagi fd-kerrosproteiinigeenin ja muiden ekspression kontrollisekvenssit (jotka sisältävät mm. promoottorin ja ribosomaaliset sitoutumiskohdat). Koska β-laktamaasigeenin (β-lac-geeni) promoottori on jo plasmi-dissa pBR322, muut ekspression kontrollisekvenssit on vietävä plasmidiin. Suositeltu ekspression kontrollisekvenssi käsillä olevassa keksinnössä on tryptofaanioperonin (trp po) . kyseiset sekvenssit sekä Serratia marcescens-bakteerista • että E.coli-bakteerista ja alkalisen fosfataasi-promootto- rin tai sen hybridin kyseinen sekvenssi. Näiden erityisen käyttökelpoisten promoottoreiden lisäksi on kehitetty ja käytetty hyödyksi myös muita mikrobipromoottoreita. Keksinnön mukaisten proteiinien geenisekvenssiä voidaan käyttää esimerkiksi bakteerifaagin λ (PL) Leftward-promoottorin 23 1 0 3 8 9 2 kontrollin alaisena. Tämä promoottori on erityisen tehokas ohjattavissa oleva promoottori. Ohjauksen mahdollistaa λ-repressori, josta tunnetaan viereiset restriktiokatkaisu-kohdat. Vektoriin, joka sisältää proteiini-geeni-sekvenssin, voidaan liitää tämän depressori-geenin lämpötilaherkkä alleeli. Jos lämpötila nostetaan 42°C:een, repressori inak-tivoituu ja promoottori aktivoituu. Tätä systeemiä käyttämällä on mahdollista muodostaa kloonipankki, jossa proteii-ni-geeni-sekvenssi sijaitsee ribosomin sitoutumiskohdan läheisyydessä vaihtelevilla etäisyyksillä lambda-PL-pro-moottorista. Nämä kloonit voidaan tämän jälkeen tutkia ja niistä voidaan valita saannoiltaan korkeimmat.

Keksinnön mukaisia proteiineja koodaavan sekvenssin ekspres-sointi ja translatointi voi tapahtua myös muiden säätely-systeemeiden, joita voidaan pitää "homologisina" organismin kanssa sen transformoimattomassa muodossa, kontrollin alaisena. Siten sisältää esimerkiksi laktoosista riippuvan E.colin kromosomaalinen DNA laktoosi- tai Lac-operonin, joka beta-galaktosidaasi-entsyymiä erittämällä mahdollistaa laktoosin pilkkomisen.

Lac-kontrollielementit voidaan saada bakteerifaagista lambda-plac5, joka infektoi E.coli-bakteeria. Faagin Lac-operoni .· voidaan saada transduktion avulla samoista bakteerilajeista.

Säätelysysteemit, joita voidaan käyttää keksinnön mukaisessa menetelmässä, voivat olla peräisin myös organismille ominaisesta plasmidi-DNA:sta. Lac-promoottori-operaattori-systeemi voidaan indusoida IPTG:lla.

Yhtä hyvin voidaan käyttää myös muita promoottori-operaat-tori-systeemeitä tai niiden osia: esimerkiksi kolisiini E^-operaattori, galaktoosi-operaattori, ksyloosi-A-operaat-tori, tac-promoottori jne.

24 1 0 3 8 9 2

Prokaryoottien lisäksi voidaan käyttää myös eukaryoottisia mikro-organismeja, kuten hiivaviljelmiä. Eukaryoottisista mikro-organismeista käytetään useimmiten Saccharomyces cerevisiae-hiivaa, vaikkakin yleensä on saatavissa joukko muitakin lajeja.

Hiivassa replikoimiseen ja ekspressoimiseen sopivat vektorit sisältävät hiivan replikaation aloituskohdan ja selektiivisen geneettisen markkerin hiivalle. Hybridivektorit, jotka sisältävät hiivan replikaation aloituskohdan, esimerkiksi kromosomaalisen autonomisesti replikoituvan segmentin (ars), jäävät transformoinnin jälkeen hiivasolun sisälle ekstra-kromosomaalisesti ja ne voivat mitoosissa replikoitua autonomisesti. Saccharomyces-hiivassa ekspressoimiseen käytetään esimerkiksi plasmidia YRp7 (Stinchcomb et ai. natur 282, 39 (1979); Kingasman et ai., Gene 1_, 141 (1979); Tschumper et ai., Gene 1(3, 157 (1980)) ja plasmidia YEpl3 (Bwach et ai., Gene j3, 121-133 ( 1979)). Plasmidi YRp7 sisältää TRPl-geenin, joka toimii selektointimarkkerina hiivamutan-tille, joka ei kykene kasvamaan tryptofaania sisältämättömässä alustassa; esimerkiksi ATCC n:o 44076.

TRPl-vaurion läsnäolo hiiva-isännän genomin ominaisuutena toimii tällöin tehokkana transformoinnin osoituskeinona, ; kun viljellään ilman tryptofaania. Aivan sama koskee plasmidia YEpl3, joka sisältää hiivageenin LEU 2, jota voidaan käyttää LEU-2-minus-mutantin täydentämiseen.

Auksotrofisten hiivamutanttien tapauksessa muita sopivia markkeerausgeenejä hiivalle ovat yleensä geenit, jotka täydentävät vikoja isännässä. Vastaavat geenit pitävät huolen prototrofiästä auksotrofisessa hiivamutantissa, esimerkiksi URA3- ja HIS3-geeni. Hiiva-hybridivektorit sisältävät mieluummin myös replikaation aloituskohdan ja markkeerausgeenin bakteeri-isännälle, erityisesti E.coli1 lie, joiden avulla hybridivektorien ja niiden esivaiheiden ra-.* kentaminen ja kloonaaminen bakteeri-isännässä voi tapahtua.

25 103852

Muita hiivassa ekspressoimiseen sopivia ekspression kontrol-lisekvenssejä ovat PH03- tai PH05-geenin kyseiset sekvenssit, edelleen glykolyyttiseen hajottamiseen osallistuvat promoottorit, esimerkiksi PGK- ja GAPDH-promoottorit.

Muut hiivavektoreille sopivat promoottorisekvenssit sisältävät seuraavien entsyymien geenien 5'-viereisen alueen: ADH I (Ammerer G., Methods of Enzymology 101, 192-201 (1983)), 3-fosfoglyseraatti-kinaasi (Hitzeman et ai., J. Biol. Chem.

255, 2073 (1980)) tai muut glykolyyttiset entsyymit (Kawasaki ja Fraenkel, BBRC 108, 1107-1112 (1982)), kuten enolaasi, glyseriinialdehydi-3-fosfaatti-dehydrogenaasi, heksokinaasi, pyruvaati-dekarboksylaasi, fosfofruktokinaasi, glukoosi- 6-fosfaatti-isomeraasi, fosfoglukoosi-isomeraasi ja gluko-kinaasi. Sopivien ekspressioplasmidien rakentamisessa voidaan käyttää näihin geeneihin liittyviä terminaatiosekvenssejä myös ekspressiovektorissa ekspressoitavan sekvenssin 3'-päässä, jotta mahdollistettaisiin polyadenylointi ja mRNA:n päättyminen.

Muita promoottoreita, joilla lisäksi on etuna kasvuolosuhteiden kontrolloima transkriptio, ovat seuraavien geenien promoottorialueet: alkoholi-dehydrogenaasi-2, isosytokromi C, hapan fosfataasi, hajottavat entsyymit, jotka liittyvät 1' ' typpimetaboliaan, edellä mainittu glyseriinialdehydi-3- fosfaatti-dehydrogenaasi ja entsyymit, jotka vastaavat maltoosin ja galaktoosin jatkokäsittelystä. Promoottoreita, joita säätelevät hiivan Mating Typ Locus, esimerkiksi geenien BARI, MFal, STE2, STE3, STE5 promoottoreita, voidaan käyttää lämpötilasäädetyissä systeemeissä käyttämällä lämpötilasta riippuvia sir-mutaatjoita. (Rhine Ph.D. Thesis, Unviersity of Oregon, Eugene, Oregon (1979), Herskowitz ja Oshima,

The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, osa I, 181-209 (1981), Cold Spring Harbor Laboratory). Nämä mutaatiot vaikuttavat hiivan lepäävien Mating-Typ-kasettien ekspressioon ja siten epäsuorasti Mating-Typ-alisteisiin .* promoottoreihin. Yleisesti sanoen voidaan kuitenkin käyttää 26 103892 jokaista plasmidivektoria, joka sisältää hiivaan sopivan promoottorin ja originääriset replikointi- ja terminaatio-sekvenssit. Siten voidaan käyttää myös hybridivektoreita, jotka sisältävät hiivan 2u-plasmidi-DNA:lie homologisia sekvenssejä. Tällaiset hybridivektorit liittyvät rekombi-nantion avulla solujen sisällä jo oleviin 2u-plasmideihin tai replikoituvat autonomisesti. 2u-sekvenssit sopivat erityisesti plasmideille, joiden transformaatiotiheys on suuri, ja ne mahdollistavat suuren kopioluvun.

Mikro-organismien lisäksi sopivia isäntäorganismeja ovat myös monisoluisten organismien soluviljelmät. Periaatteessa voidaan käyttää jokaista tällaista soluviljelmää, riippumatta siitä, onko se peräisin selkärangallisen tai selkärangattoman eläimen soluviljelmästä. Suurin mielenkiinto kohdistuu kuitenkin selkärangallisten eläinten soluihin, ja viime vuosina on selkärangallisten eläinten solujen kasvattaminen viljelmässä (kudosviljelmä) tullut rutiinimenetelmäksi (Tissue Culture, Academic Press, Kruse ja Patterson, toim. (1973)). Tällaisista hyödyllisistä isäntäsolulinjoista ovat esimerkkejä VERO- ja HeLa-solut, CHO-solut ja WI38, BHK, COS-7 ja MDCK-solulinjat. Näille soluille tarkoitetut ekspressiovektorit sisältävät tavallisesti (tarvittaessa) replikaation aloituskohdan, promoottorin, joka sijaitsee ennen ekspressoitavaa geeniä, sekä kaikki tarvittavat ribo- * somien sitoutumiskohdat, RNA:n katkaisukohdat, polyadenylaa-tiokohdat ja transkriptionaaliset terminaatiosekvenssit.

Nisäkässoluissa käytettäessä ovat ekspressiovektoreiden kontrollifunktiot useimmiten peräisin virusmateriaalista. Tavallisesti käytetyt promoottorit ovat esimerkiksi peräisin « * Polyoma-, Adenovirus 2-viruksesta ja erityisen usein SV 40 (Simian Virus 40)-viruksesta. SV 40:n varhais- ja myöhäis-promoottorit ovat erityisen hyödyllisiä, koska molemmat voidaan saada helposti viruksesta fragmenttina, joka lisäksi sisältää myös SV 40:n viraalisen replikaatiokohdan. (Fiers . et ai., Nature 273, 113 (1978)). Lisäksi voidaan käyttää 27 103892 pienempiä tai suurempia SV 40:n fragmentteja edellyttäen, että ne sisältävät lähes 250 bp pitkän sekvenssin, joka ulottuu Hindlll-katkaisukohdasta Bgll-katkaisukohtaan asti viruksen replikaation aloituskohdassa. Lisäksi on myös mahdollista ja usein suositeltavaa käyttää promoottori-tai kontrollisekvenssejä, jotka tavallisesti liittyvät haluttuihin geenisekvensseihin, edellyttäen, että nämä kontrollisekvenssit sopivat yhteen isäntäsolun systeemien kanssa.

Replikaation aloituskohta voidaan saada joko vastaavan vektorirakenteen avulla, millä mukaan rakennetaan heksogee-ninen aloituskohta, esimerkiksi SV 40:sta tai muista virus-lähteistä (esim. Polyoma, Adeno, VSV, PBV jne.) tai se voidaan saada isäntäsolun kromosomaalisten replikaatiomeka-nismien avulla. Jos vektori integroidaan isäntäsolun kromosomiin, viimeksi mainittu toimenpide on useimmiten riittävä.

Keksintö koskee erityisesti replikaatioon ja fenotyyppiseen selektoimiseen sopivia ekspressiovektoreita, jotka sisältävät ekspression kontrollisekvenssin ja VACtin aminohapposekvenssiä koodaavan DNA-sekvenssin, jolloin mainittu DNA-sekvenssi on yhdessä transkription aloitussignaalin ja -päättymissignaalin sekä translaation aloitussignaalin ja -pysäytyssignaalin kanssa järjestetty mainittuun ekspres-sioplasmidiin mainitun ekspression kontrollisekvenssin sääteilyn alaisuuteen siten, että VAC ekspressoituu mainitulla ekspressioplasmidilla transformoidussa isäntäsolussa.

Jotta päästäisiin tehokkaaseen ekspressioon, täytyy VAC-geenin sijaita oikein (olla •'faasissa") ekspression kontrol-lisekvenssiin nähden. Ekspression kontrollisekvenssi on edullista liitää mRNA:n pääosan aloituskohdan ja geenin koodaussekvenssin, joka luonnonmukaisesti on liittynyt ekspression kontrollisekvenssiin (esimerkiksi β-lac-pro-moottoria käytettäessä β-lac-koodaussekvenssi), ATG:n 28 1 0 3 8 9 2 väliin yhdessä VAC-geenin kanssa, joka mieluummin tuo mukanaan oman translaation aloitussignaalinsa (ATG) ja translaation pysäytyssignaalin (esimerkiksi TAG). Tällä tavoin taataan tehokas transkriptio ja translaatio.

Esimerkiksi vektori, erityisesti pBR322, joka on pilkottu restriktioendonukleaasilla, mahdollisesti näin muodostuneen linearisoidun vektorin modifioinnin jälkeen, liitetään vastaavilla restriktiopäillä varustettuun ekspression kontrol-lisekvenssiin. Ekspression kontrollisekvenssi sisältää 3'-päässä (translaation suunnassa) restriktioendonukleaa-sin tunnistamissekvenssin, jolloin ekspression kontrolli-sekvenssin jo sisältävä vektori voidaan pilkkoa mainitulla restriktioentsyymillä ja voidaan käyttää sopivilla pälliä varustettua VAC-geeniä. Tällöin syntyy seos kahdesta hybri-diplamsidista, jotka sisältävät geenin oikeassa tai väärässä suunnassa. Ekspression kontrollisekvenssin jo sisältävä vektori on edullista pilkkoa vektorin DNA:n sisällä vielä toisella restriktioendonukleaasilla ja laittaa syntynyt vektorifragmentti oikeilla päillä varustettuun VAC-gee-niin. Kaikki toimenpiteet vektorilla suoritetaan mieluummin siten, että ei vaikuteta haitallisesti replikoinnin eikä ainakaan markkeerausgeenin toimintaan.

Käsillä olevan keksinnön eräässä hyvänä pidetyssä suoritusmuodossa pilkotaan pBR322:sta saatu vektori, joka sisältää ekspression kontrollisekvenssin, erityisesti tryptofaani-opero (trp po)-tyyppisen sekvenssin, jossa on 3'-päässä (mRNArn pääosan aloituskohdan ja ensimmäisen ATG:n välissä) tunnistamissekvenssi mieluummin kohesiivisia päitä muodos-: tavalle restriktioendonukleaasille, esimerkiksi EcoRI:lle, mainitulla restriktioendonukleaasilla. Tämä pilkotaan vektorin DNA-osassa toisella restriktioendonukleaasilla, joka muodostuu tasapäisiä tai mieluummin kohesiivisia päitä, esimerkiksi BamHI:lla, minkä jälkeen näin linearisoitu vektori liitetään vastaavat päät omaavaan VAC-DNA:an (esimerkiksi , . EcoRI-pään kanssa ennen ATG-aloituskodonia ja BamHI-pään 29 103892 kanssa translaation pysäytyskodonin jälkeen). Liittäminen tapahtuu tunnetulla tavalla muodostamalla parit komplement-tisten (kohesiivisten) päiden välille ja ligatoimalla, esimerkiksi T^-DNA-ligaasin avulla.

Keksinnön mukaisia DNA-sekvenssejä voidaan hyvin ekspressoida myös ekspressioplasmidissa pER103 (E. Rastl-Dworkin et ai., Gene 21, 237-248 (1983) ja EP-A-0.-115-613 - tallennettu 20.12.1983 DSM-kokoelmaan numerolla DSM 2773), plasmidissa parpER33 (EP-A-0.115-613) tai plasmidissa pRHIOO, sillä nämä vektorit sisältävät kaikki sääteilyelementit, jotka johtavat kloonattujen geenien korkeaan ekspressiomäärään. Keksinnön mukaisesti käytetään synteettiselle proteiinigee-nille ekspressiovektorina pRHIOO-plasmidia, joka sisältää säädeltävän tryptofaanipromoottorin Serratia marcescens-bakteerista ja keinotekoisen ribosomien sitoutumiskohdan. Ekspressioplasmidin pRHIOO valmistamista varten linearisoi-tiin plasmidi pER103 (Eva Dworkin-Rastl et ai., Gene 21 (1983) 237-248, EP-A-0.115-613) restriktioendonukleaasilla Hindlll ja liitettiin oligonukleotidisekvenssi 5 - AGCTTAAAGATGAGCTCATCTTTA 3·.

2I ATTTCTACTCGAGTAGAAATTCGA 5 mRNA-tietä genomi-DNA:sta tai synteettisesti saatu, vastaa-: villa (erityisesti EcoRI- ja BamHI-)-päillä varustettu VAC-DNA voidaan ennen ekspressioplasmidin tuomista kloonata myös vektoriin, esimerkiksi pBR322-plasmidiin, jotta voitaisiin saada suurempia määriä VAC-DNA:ta, esimerkiksi sekvenssianalyysiä varten. Hybridiplasmidin sisältävä klooni eris-. tetään esimerkiksi VAC-DNA-spesifisen, radioaktiivisesti i leimatun oligonukleotidi-koettimen (kts. edellä) avulla.

VAC-DNA karakterisoidaan esimerkiksi Maxam'in ja Gilbert'in menetelmällä (11).

Toisessa keksinnön suoritusmuodossa syntetisoidaan VAC-DNA-paloja. Keksinnön kohteena on myös menetelmä valmistaa 30 1 0 3 8 9 2 transformoituja isäntäsoluja, jolle menetelmälle on tunnusomaista, että isäntäsolu transformoidaan ekspressiovekto-rilla, joka sisältää ekspression kontrollisekvenssin sääte-lemän, VAC:in aminohapposekvenssiä koodaavan DNA-sekvenssin.

Sopivia isäntäsoluja ovat esimerkiksi edellä mainitut mikro-organismit, kuten Saccharomyces cerevisiae, Bacillus subtilis:n ja erityisesti Escherichia coli'n kannat. Transformointi keksinnön mukaisella ekspressioplasmidilla tapahtuu esimerkiksi kirjallisuudessa kuvatulla tavalla: S. cerevisiae (12), B.subtilis (13) ja E.coli (14). Transformoidut isäntä-solut eristetään edullisesti selektiivisestä ravintoalustasta, johon lisätään biosidia, jota vastaan ekspressioplas-midissa oleva markkeerausgeeni antaa vastustuskyvyn- Kun, kuten on suositeltavaa, ekspressioplasmidit sisältävät

D

amp -geenin, lisätään ravintoalustaan siten ampisilliinia. Solut, jotka eivät sisällä ekspressioplasmidia, kuolevat tällaisessa alustassa.

Keksinnön kohteena ovat myös mainittua tietä saatavissa olevat transformoidut isäntäsolut.

Transformoituja isäntäsoluja voidaan käyttää VAC-aktii-visuuden omaavien yhdisteiden valmistamiseen. Tämän yhdisteen valmistusmenetelmälle on tunnusomaista, että viljellään transformoituja isäntäsoluja ja tuote vapautetaan isäntäsoluista ja eristetään.

Keksinnön kohteena on sen vuoksi ennen kaikkea menetelmä valmistaa VAC-aktiivisuuden omaavia yhdisteitä ja näiden yhdisteiden suoloja, tunnettu siitä, että ekspressioplas-’ midilla, joka sisältää ekspression kontrollisekvenssin säätelemän, VAC:in aminohapposekvenssiä koodaavan DNA-sekvenssin, transformoituja isäntäsoluja viljellään nestemäisessä ravintoalustassa, joka sisältää assimiloituvia hiili- ja typpilähteitä, ja tuote vapautetaan isäntäsoluista . ja eristetään ja tarvittaessa lisätään menetelmän mukaisesti 3i 103892 saatuun tuotteeseen disulfidisidosten katkaisemiseen sopivaa pelkistintä ja saatu pelkistetty polypeptidi mahdollisesti käsitellään disulfidisidosten uudelleenliittämiseen sopivalla hapettimella ja haluttaessa muunnetaan saatu VAC-yhdiste toiseksi VAC-yhdisteeksi, erotetaan menetelmän mukaisesti saatu VAC-aktiivisuutta omaavien yhdisteiden seos yksittäisiksi komponenteiksi ja/tai haluttaessa muunnetaan saatu suola polypeptidiksi ja saatu polypeptidi tämän vastaavaksi suolaksi.

Käsillä olevan keksinnön kohteena on erityisesti menetelmä valmistaa VAC-yhdiste.

Keksinnön mukaisten transformoitujen isäntäsolujen viljely tapahtuu sinänsä tunnetulla tavalla. Keksinnön mukaisesti transformoitujen isäntämikro-organismien viljelemiseen voidaan siten käyttää erilaisia hiililähteitä. Esimerkiksi hyvänä pidettyjä hiililähteitä ovat assimiloituvat hiilihydraatit, kuten glukoosi, maltoosi, manniitti tai laktoosi, tai asetaatti, joita voidaan käyttää joko yksinään tai sopivina seoksina. Sopivia typpilähteitä ovat esimerkiksi aminohapot, kuten Casaminohapot, peptidit ja proteiinit ja niiden hajoamistuotteet, kuten tryptoni, peptoni tai lihauute; edelleen voidaan käyttää hiivauutetta, mallas-·. uutetta ja myös ammoniumsuoloja, esimerkiksi ammoniumklo- ridia, -sulfaattia tai -nitraattia, joita voidaan käyttää joko yksinään tai sopivissa seoksissa. Myös käyttökelpoisia epäorgaanisia suoloja ovat esimerkiksi natriumin, kaliumin, magnesiumin ja kalsiumin sulfaatit, kloridit, fosfaatit ja karbonaatit.

Alusta sisältää lisäksi esimerkiksi kasvua edistäviä aineita, kuten hivenalkuaineita, esimerkiksi rautaa, sinkkiä, mangaania ja vastaavia, ja parhaiten aineita, jotka saavat aikaan selektiopaineen ja jotka estävät niiden solujen kasvun, jotka ovat menettäneet ekspressioplasmidin. Alustaan lisä 32 1 0 3 8 9 2 tään siten esimerkiksi ampisilliinia, kun ekspressioplasmidi sisältää amp -geenin. Antibioottisesti vaikuttavien aineiden tällainen lisääminen vaikuttaa myös siten, että kontaminoi-vat, antibiooteille herkät mikro-organismit kuolevat.

Kasvatusolosuhteet, kuten lämpötila, alustan pH-arvo ja fermentaation aika valitaan niin, että saadaan maksimaalinen VAC-tiitteri. E.coli- tai hiiva-kantaa kasvatetaan siten mieluummin aerobisissa olosuhteissa pinnanalaisviljelmänä ravistelemalla tai sekoittamalla noin 20 - 40°C lämpötilassa, parhaiten noin 30°C:ssa ja pH-arvossa 4-9, (parhaiten noin 30°C:ssa ja pH-arvossa 4-9), parhaiten pH-arvossa 7, 4 - 20 tunnin, parhaiten 8-12 tunnin aikana. Ekspressio-tuote kerääntyy tällöin solunsisäisesti.

Kun solutiheys on saavuttanut riittävän arvon, kasvatus lopetetaan ja tarvittaessa tuote vapautetaan mikro-organismin soluista. Tätä tarkoitusta varten solut hajotetaan, esimerkiksi käsittelemällä detergentillä, kuten SDSrlla tai tritonilla tai lysotsyymillä tai vastaavalla tavalla vaikuttavalla entsyymillä. Solujen hajottamiseen voidaan käyttää vaihtoehtoisesti tai lisäksi mekaanisia voimia, kuten leikkausvoimia (esimerkiksi X-prassi, Ranskan prässi, Dyno-Mill) tai ravistelua lasihelmien tai alumiinioksidin kanssa tai vuorottelevaa pakastamista, esiemrkiksi nestemäisessä typessä, ja sulattamista, esimerkiksi 30 - 40°C:een, sekä ultraääntä. Saatu seos, joka sisältää proteiinia, nukleiinihappoja ja muita solun ainesosia, rikastetaan sentrifugoinnin jälkeen sinänsä tunnetulla tavalla proteiinien suhteen. Siten erotetaan esimerkiksi suurin osa muista kuin proteiinikomponenteista käsittelemällä polyetyleeni-imiinillä, minkä jälkeen proteiinit, mukaanlukien VAC-yhdisteet, seostetaan esimerkiksi kyllästämällä liuos ammoniumsulfaatilla tai muilla suoloilla. Muissa puhdistusvai-heissa käytetään esimerkiksi kromatograafisiä menetelmiä, kuten ioninvaihtokromatografiaa, HPLC-kromatografiaa kään-• teisfaasi-HPLC-kromatografiaa ja vastaavia. Tämän jälkeen 103892 seoksen komponentit erotetaan dialysoimalla, varauksen perusteella geeli- tai kantajattoman elektroforeesin avulla, molekyylikoon perusteella sopivan Sephadex-pylvään avulla, affiniteettikromatografiän avulla, esimerkiksi käyttämällä vasta-aineita, erityisesti monoklonaalisia vasta-aineita, tai käyttämällä affiniteettikromatografiässä sopivaan kantajaan kytkettyä trombiinia tai muilla, erityisesti kirjaalli-suudesta tunnetuilla menetelmillä.

Ekspressoitujen VAC-yhdisteiden eristäminen käsittää esimerkiksi seuraavat vaiheet. Solujen eristäminen viljelyliuok-sesta sentrifugoimalla; raakauutteen valmistaminen (hajot-tmalla, esimerkiksi käsittelemällä lyysaavalla entsyymillä ja/tai vuorotellen pakastamalla ja jälleen sulattamalla; liukenemattomien ainesosien erottaminen sentrifugoimalla; DNA:n saostaminen polyetyleeni-imiinilisäyksen avulla; proteiinien saostaminen ammoniumsulfaatilla; liukoisen sakan affiniteettikromatografia monoklonaalinen anti-VAC-vasta-aine-pylväässä; Näin saadun liuoksen suolanpoisto dialyysin avulla tai kromatograafisesti Sephadex G25:lla tai Sephadex G10:lla.

Muihin puhdistusvaiheisiin kuuluvat geelisuodatus Sephadex G50:lla (tai G75:lla) ja käänteisfaasi-HPLC. Suolat poistetaan jälleen Sephadex G25:lla.

VAC-aktiivisuuden osoittamiseen voidaan käyttää testiä anti-VAC-vasta-aineilla (esimerkiksi kaniineista/hiiristä saatavat tai hybridomasoluista saatavat monoklonaaliset vasta-aineet) tai voidaan käyttää patenttijulkaisussa EPÄ 0 181 465 kuvattuja testejä.

«

Edellä jo mainittiin, että alkalisen fosfataasin promoottori sopii erityisen hyvin keksinnön mukaisten proteiinien ekspressoimiseen. E.coli'sta saatu geeni alkaliselle fosfa-taasille (PhoA) on voimakkaan säätelyn alainen. Fosfaatin t 34 103892 läsnäollessa geeni kytkeytyy täysin pois ja geenin ekspres-soituminen tapahtuu, kun fosfaattia on mukana alustassa.

H. Shuttleworth et ai., Nucleic Acids Res. 14 (1986), s.

8689 sekä C.N.Chang et ai., Gene 44 (1986), s. 121-125 ovat kuvanneet tämän geenin nukleotidisekvenssin. Sopivan ekspressiovektorin rakentamista varten koottiin useista oligonukleotideistä PhoA-geenin promoottorialue ja liitettiin EcoRI-Clal:11a pilkottuun pAT153-plasmidiin (Amersham). Ribosomaalisen sitoutumisekohdan eteen liitettiin Xhol-kohta. Alkuperäinen EcoRI-kohta tuhoutuu synteettistä DNA-fragmenttia liitettäessä. Ribosomaalisen sitoutumiskohdan i jälkeen laitettiin translaation aloitus-ATG, jonka G on Sacl (=SstI)-kohdan ensimmäinen nukleotidi. Ekspressio-vektori voidaan linearisoida katkaisemalla Sacl:11a tässä kohdassa ja 3'-ylite voidaan muuntaa suoraksi pääksi käsittelemällä DNA-polymeraasi I - Klenow'in fragmentilla dGTP:n läsnäollessa. Näin voidaan liitää jokainen mielivaltainen geeni tähän kohtaan. Oikeaa ekspressointia varten on sen alittava koodaavan alueen ensimmäisellä emäksellä.

pAT-osan HindIII-SalI-fragmentti poistettiin ja korvattiin alkalisen fosfataasin transkription terminaattorilla. Alkuperäinen Sali-kohta tuhottiin. Tätä varten se laitettiin jälleen ennen terminaattoria yhdessä myös pAT153:sta dele-toidun BamHI-kohdan kanssa. Synteettisesti valmistetun DNA:n sekvenssi on esitetty kuviossa 15. Saadulle vektorille annettiin nimeksi pRH284T.

VAC-alfan ekspressoimiseksi sopivan vektorin valmistamista varten liitettiin vektoriin pRH284T VAC-alfaa koodaava DNA-molekyyli. Tätä varten pilkottiin esimerkiksi cDNA-klooni pP6/5 BglII:lla ja Pstl:lla ja eristettiin 980 bp pitkä fragmentti, joka koodaa pääosaa ja sisältää noin 200 bp 3'-translatoimattoman alueen. Oligonukleotidien avulla korvattiin koodaavan alueen puuttuvat 5'-pää. Tämä tehtiin kahden samanaikaisen mutaation (GGC -> GGT, . Gly-7 ja ACT -> ACC, Thr-8 avulla liittämällä Kpnl-katkaisu- 35 1 0 3 8 9 2 kohta VAC-cDNA:an.

Oligonukleotidit näyttivät seuraavilta: IEBI-678 IIEBI-677 5' GCACAGGTTCTCAGAGGTACCGTGACTGACTTCCCTGGATTTGATGAGCGGGCT CGTGTCCAAGAGTCTCCATGGCACTGACTGAAGGGACCTAAACTACTCGCCCGA | EBI-680||

GATGCAGAAACTCTTCGGAAGGCTATGAAAGGCTTGGGCACAGATGAGGAGAGC

CTACGTCTTTGAGAAGCCTTCCGATACTTTCCGAACCCGTGTCTACTCCTCTCG

EBI-

||EBI-682 I

ATCCTGACTCTGTTGACATCCCGAAGTAATGCTCAGCGCCAGGAAATCTCTGCA 3 TAGGACTGAGACAACTGTAGGGCTTCATTACGAGTCGCGGTCCTTTAGAG 5' 579|| EBI-681| Näin valmistetulle vektorille annettiin nimeksi pRH291 (kuvio 16).

VAC-beta-ekspressoimiseen käytettiin ekspressiovektorina mieluummin plasmidia pER103 (E.Rastl-Dworkin et ai.,

Gene 21 (1983), 237-248). Vektori linearisoitiin Hindlll:lla. 5'-ylipitkä pää täytettiin osittain dATP:lla ja DNA-polymeraasi I/Klenow'in fragmentilla ja jäljelle jäänyt yksittäinen juoste pilkottiin Sl-nukleaasilla. Vektori pilkottiin BamHIrlla ja suuri fragmentti eristettiin (kuvio 17). VAC-betaa koodaavat DNA-molekyyli liitettiin näin esivalmistettuun vektoriin. Tätä varten eristettiin esimerkiksi kloonista pRH203 440 bp pitkä Maelll-BamHI-fragmentti, joka sisältää kodonit 13 - 157. Puutuva 5'-pää täydennettiin oligonukleotideillä: 36 1 0 3 8 9 2 5· CCATGGCTTGGTGGAAAGCTTGGATCGAACAGGAAGGT 3· 3' GGTACCGAACCACCTTTCGAACCTAGCTTGTCCTTCCACAGTG 5' EBI-306 Tällöin käytettiin E.coli'lle optimaalista kodonia (esim.

R.Grantham et al., Nucleic Acids Res. 8 (1980), 1893-1912). Tällä kodonien vaihdolla saatiin uuus Hindlll-kohta kodoneihin 5-7. BamHI:lla pilkkomisen jälkeen liitettiin 5'-terminaalinen VAC-fragmentti jo valmistettuun pER103-vektoriin. Syntyneelle vektorille annettiin nimeksi PRH211. VAC-betaa koodaavan alueen täydentämistä varten eristettiin kloonista pRH201 1230 bp pitkä BamHI - Sphl-fragmentti. ^xasmidista pRH211 poistettiin noin 200 bp pitkä pBR322-pala BamHI - Sphl ja korvattiin vastaavalla VAC-cDNA-palalla. Saatiin vektori pRH212. EcoRI-BamHI-fragmentti, joka sisälsi Trp-promototorin (S.marcescens), ribosomaalisen sitoutumiskohdan ja VAC-beta-geenin synteettisesti valmistetun alun, tutkittiin sekvenssoimalla. Plas-midikoodattu VAC-beta osoitettiin maksisolusysteemissä (A.Sancar et ai., J. Bacteriol. 137 (1979), s. 692-693.).

VAC-betan ekspressoimisen kannalta on erityisen suositeltavaa rakentaa ekspressiovektori lähtemällä pRH284T:sta.

Tätä varten liitettiin sopivalla tavalla ekspressiovekto-riin VAC-betaa koodaava insertti. Tämän insertin lähtömateriaalina voi toimia esimerkiksi vektori pRH212:

Ekspressiovektori pRH284T linearisoitiin Sacl:lla ja 3'-ylipitkät päät muunnettiin tylpiksi päiksi DNA-poly-meraasi I/Klenow'in fragmentilla ja dGTP:lla. Vektori pilkottiin Sällillä ja suuri fragmentti eristettiin.

Eristettiin kloonin pRH212 Hindlll-Sall-insertti. Oligo-nukleotidipari 5' GCTTGGTGGAA 3’ EB1-684 3’ CGAACCACCTTTCGA 5’ EBI-685 37 103892 liitettiin VAC-beta-inserttiin ja jo valmistettuun pRH284T-vektoriin. E.coli HB101 transformoitiin ligaasiliuoksella. Saadulle kloonille annettiin nimeksi pRH292 (kuvio 18).

Koska ekspressiovektoreissa pRH291 (VAC-alfa) ja pRH292 (VAC-beta) on deletoitu tetrasykliiniresistenttiysgeeni promoottorista Sali-kohtaan asti, nämä vektorit eivät voi antaa resistenttiyttä tetrasykliiniä vastaan. Tetra-sykliinille resistentit ekspressiovektorit saadaan esimerkiksi rakentamalla kuviossa 36 esitetyn kaavion mukaisesti. VAC-alfa ja VAC-beta cDNA:lla on kulloinkin 3'-translatoi-mattomalla alueella SphI-kohta. Vektorin beta-laktamaasi-geenissä on yksi Pvul-kohta. Kummatkin tunnistamissek-venssit ovat singuläärisiä. Sen vuoksi voidaan Pvul:lla ja SpHI:11a pilkkomalla vapauttaa kummastakin ekspressio-vektorista osa beta-laktamaasi-geenistä, phoA-promoottori ja VAC-alfa tai -betan koko koodaava osa sekä jonkin verran 3'-translatoimatona cDNA:ta. Toisaalta plasmidista PAT153 voidaan pilkkomalla Pvul:lla ja EcoRI:lla vapauttaa loput beta-laktamaasigeenistä, replikaation alkukohta ja koko tetrasykliiniresistenttiysgeeni, mukaanlukien promoottori. Jos Sphl- tai EcoRI-päät tehdään suoriksi entsymaattisen käsittelyn avulla, saadaan yhteensopivat päät. Jos nyt liitetään vektori-fragmentin ja VAC-alfa tai VAC-beta cDNA:n sisältävä fragmentti, syntyy ekspressio-vektoreita, jotka sisältävät täydellisen tetrasykliinin: pGN25 (VAC-alfa), pGN26 (VAC-beta).

Kompetentit isäntäorganismit, esimerkiksi E.coli, erityisen mielellään e.coli HB101, transformoitiin näin valmistetuilla ekspressiovektoreilla ja viljeltiin sopivissa alustoissa.

Seuraavassa on annettu VAC-alfan ja VAC-betan ekspressoi-miseen hyvin sopiva alsuta komponentteineen.

38 103892 0,2 - 2,0 g/1 (NH4)2HP04 0,1 - 1,5 g/1 K2HP04.3H20 0,1 - 5 g/1 KC1 0,1 - -10 g/1 NaCl 0 - 5 g/1 NH4C1 0,1 - 5 g/1 MgS04.7H20 0,001 - 0,1 g/1 CaCl2 1 50 mg/1 CaCl2 0,5 - 100 mg/1 (NH4)2Fe/(S04)2.6H20 0,1 - 5 mg/1 AlCl3.6H20 0,1 - 10 mg/1 CoCl2.6H20 0,2 - 5 mg/1 KCr(SC>4 ) 2.12H20 0,1 - 5 mg/1 CuS04.5H20 0,05 - 1 mg/1 H3B03 0,1 - 5 mg/1 MnS04.H20 0,1 - 5 mg/1 NiSC>4.6H20 0,1 - 5 mg/1 Na2Mo04<2H20 0,1 - 5 mg/1 >nSC>4.7H20 10 - 30 g/1 Kaseiinihydrolysaatti (Merck Art. φ 2238) 0 - 100 g/1 kaseiinihydrolysaatti (Sigma C9386) 0,10 - 1 mg/1 kysteiini 0 10 g/1 hiivauute (Difco) 0 2 g/1 sitruunahappo 0 - 50 g/1 glukoosi (alussa) 5 - 50 g/1 glukoosi (ravintolisäys fermentaation aikana)

Erityisen sopiva on koostumukseltaan seuraava alusta:

Alusta: 1) Esikasvatus • 10 g/1 tryptoni 5 g/1 hiivauute 4 g/1 glukoosi 9 g/1 Na2HP04<2H20 1 g/1 NH4C1 39 1 0 3 8 9 2 1 g/1 KC1 1 ml/1 1M MgS04.7H20 100 mg/1 ampisilliini alku-pH = 7,2 2) Pääkasvatus 0,68 g/1 (NH4)2HP04 0,62 g/1 K2HP04.3H20 2,33 g/1 KC1 0,5 g/1 NaCl 0,53 g/1 NH4C1 1,23 g/1 MgS04.7H20 0,011 g/1 CaCl2 10 mg/1 tiamiini.HC1 3,92 mg/1 (NH4)2Fe(S04)2.6H20 0,72 mg/1 A1C13.6H20 0,71 mg/1 CoCl2.6H20 1,5 mg/1 KCr(S04)2.12H20 0,75 mg/1 CuS04.5H20 0,19 mg/1 H-jBO-j 0,51 mg/1 MnS04«H20 0,79 mg/1 NiS04.6H20 0,73 mg/1 Na2Mo04.2H20 0,86 mg/1 ZnS04.7H20 21 g/1 kaseiinihydrolysaatti (Merck ARt. φ 2238) 25 g/1 kaseiinihydrolysaatti (Sigma C9386) 100 mg/1 kysteiini 2 g/1 hiivauute 1 g/1 sitruunahappo 11 g/1 glukoosi.H20 (alussa tai lisättäessä) « 40 103892

Fermentoitia varten siirrostettiin esikasvatusalusta esimerkiksi E.coli'lla, joka oli transformoitu vastaavalla ekspressiovektorilla, ja inkuboitiin sekoittaen ja happea johtaen. Osa tästä esiviljelmästä siirrettiin sen jälkeen pääkasvatusliuosta sisältävään fermenttoriin ja kasvatettiin sekoittaen ja ilmastaen. Fermentaation aikana seurattiin glukoosin konsentraatiota ja hapen osapainetta ja näitä vastaavasti optimoitiin. Noin 20 tunnin fermentoinnin jälkeen panos jäähdytettiin, ravintoalusta erotettiin biomassasta ja pakastettiin.

Ekspressoitunut proteiini osoitettiin esimerkiksi Western Blot-menetelmällä. Tulos on annettu kuviossa 19.

"+fosfaatti" on kontrolli ilman ekspressoitumista, "-fosfaatti" osoittaa VAC-afla (Klon HB101/prH291) tai VAC-beta (klooni HB101/pRH292)-proteiinin ekspression alkalisen fosfataasin promoottorin kontrollin alaisena.

Sekä VAC-alfa että VAC-beta-proteiini voidaan tunnistaa jo värjätystä geelistä. Muodostunut VAC-proteiinien määrä on yllättäen vähintään 20 mg/l/ODgQ0nm b^teeri-viljelmää.

Western Blot-kuvassa näkyy selvästi värjääntyneet VAC-alfa-. vyöhykkeet. Lisäksi voidaan havaita alle 30 kD alueella muutamia molekyylipainoltaan alhaisempia proteiineja, jotka ovat mahdollisesti syntyneet VAC-alfa-proteiinin N- ja/tai C-pään proteolyyttisen lohkeamisen kautta.

Lisäksi on silmäänpistävää alle 20 kD alueella antiseerumilla tunnistettu proteiini, joka saattaisi olla VAC-alf a-proteiinin proteolyysin kautta syntynyt puolimole-kyyli. Yllättäen tunnistettiin myös VAC-beta anti-VAC-antiseerumin avulla. Koska tämä vyöhyke värjäytyy oleellisesti vaikeammin kuin VAC-alfa-vyöhyke ja koska kuitenkin VAC-beta-vyöhykkeen intensiteetti Coomassie Blau-värjä-tyssä geelissä vastaa VAC-alfan intensiteettiä, tästä .* on pääteltävissä, että VAC-beta-proteiinin tunnistaminen 41 103892 anti-VAC-antiseerumin avulla tapahtuu oleellisesti huonommin kuin VAC-alfa-proteiinilla.

Ilmentyneen proteiinin eristämistä ja puhdistamista varten suspendoitiin pakastettu biomassa sopivaan lyysauspusku-riin. Sen jälkeen solut hajotettiin mekaanisesti, esimerkiksi Manton-Gaulin-puristimen avulla. Ei-proteiiniainesten saostamisaineen, kuten polyetyleeni-imiinin lisäämisen jälkeen poistettiin kiinteät ainekset esimerkiksi sentri-fugoimalla. Proteiinit saostettiin, mieluummin ammonium-sulfaattiuuton avulla, sakka liuotettiin, saostusaine poistettiin ja liuos kirkastettiin, minkä jälkeen saatu uute käsiteltiin erilaisissa kromatograafisissä puhdistus-vaiheissa. Proteiinien saostamisen asemesta voidaan puhdis-tamaton VAC-uute puhdistaa myös kromatograafisen esipuhdis-tuksen avulla niin pitkälle, että tämän jälkeen se voidaan viedä puhdistussykliin. Sopivaksi pylväsmateriaaliksi esipuhdistukseen on osoittautunut esimerkiksi Si02, mutta sopivia ovat myös muut aineet, joilla on samankaltaisia ominaisuuksia. Keksinnön mukaisesti käytetty aine oli Grace-yhtiön Silica Catalyst, Carrier, Grade 953 W.

Eräs keksinnön mukaisten proteiinien puhdistamiseen sopiva kromatograafinen puhdistussykli muodostui esimerkiksi DEAE-Fast-Flow-Sepharose-kromatografiästä, Sephacryl S-200 High Resolution-kromatografiästä ja Q-Sepharose-Fast-Flow-kromatografiästä. Näin saatujen keksinnön mukaisten proteiinien puhtaus määritettiin SDS-PAGE:n, Western Blot-menetelmän, geelipermeaatio-HPLCzn, käänteis-HPLC:n ja isoelektrisen fokusoinnin avulla.

«

Kaikissa kasvatus-, eristämis- ja puhdistusvaiheissa noudatettavat parametrit, kuten lämpötila, määräsuhteet, yksittäisten vaiheiden järjestys, pH-arvot, erikoisreagens-sit jne. ovat parhaiten ammattimiehen tuntemia. Jäljempänä annettuja esimerkkejä voidaan haluttaessa muuttaa sopivilla, . ammattimiehen tuntemilla tavoilla.

42 103892

Erityisen tärkeä kysymys on, onko geeniteknisillä menetelmillä valmistettu VAC-proteiini, josta jäljempänä käytetään lyhyesti nimitystä r-VAC, identtinen luonnonmateriaalista saatavan, jäljempänä VAC:ksi kutsutun VAC-proteiinin (kts. EPÄ 0 181 465) kanssa; identtinen sekä rakenteeltaan että myös biologisilta ominaisuuksiltaan.

Tähän kysymykseen vastaamiseksi käytettiin seuraavia menetelmiä:

1. Geelipermeaatio-HPLC

2. Kaänteisfaasi-HPLC

3. N-terminaalinen sekvenssointi 4. Trypsiinipeptidien kartta 5. SDS-geelielektroforessi 6. Western Blot 7. Isoelektrinen fokusointi

Geelipermeaatio-HPLC:n perusteella on VAC:in molekyyli-paino 34.000 ja r-VAC:in 33.000, joita on pidettävä yhtä suurina menetelmän tarkkuuden sisällä. Huomattakoon, että käytetty kolonni tarkkaan ottaen ei erottele molekyy-lipainon vaan molekyylin koon perusteella.

Käänteis-HPLC:ssa eluoituivat molemmat proteiinit noin * 29 minuutin retentioajalla.

r-VAC:in N-terminaalinen sekvenssointi sopii 100-prosent-tisesti yhteen oletetun sekvenssin kanssa aminohappoon 39 asti. Yllättäen ei voitu osoittaa N-terminaalista metioniinia, joka lisäksi usein esiintyy geeniteknisesti * valmistetuissa proteiineissa. Kuten oli odotettavissakin, oli r-VAC:in N-pää blokkaamaton.

Verrattaessa trypsiinillä aiheutettua fragmentoitumista saatiin käytännöllisesti katsoen identtiset peptidikuviot.

« 43 1 0 3 8 9 2

Myös, kun kumpaakin proteiinia verrattiin SDS-PAGE'n avulla, niiden käyttäytymiset olivat käytännöllisesti katsoen samanlaiset. Kummatkin sisältävät dimeerisiä muotoja, jotka ovat ilmeisesti sitoutuneet disulfidisiltojen kautta ja jotka voidaan pelkistää ditiotreitolilla.

Myös Western Blot-menetelmällä suoritettu immunologinen vertailu vahvisti kummankin proteiinin identtisyyden.

Isoelektrisen pisteen määrityksessä todettava 0,1 pH-yksikön ero r-VAC:lla voidaan selittää vapaan N-pään avulla.

r-VAC:in biologisen aktiivisuuden tutkimusta varten suoritettiin erilaisia koagulointitestejä ja tuloksia verrattiin tuloksiin, jotka oli saatu käyttämällä luonnonmateriaalista peräisin olevaa VAC:ta. Kaikki suoritetut testit, modifioitu protrombiiniaika-testi, kuten myös trombiini-testi ja faktorin X muodostuminen kudosfaktorilla aktivoidussa plasmassa todistivat yksiselitteisesti, että r-VAC:lla on biologinen aktiivisuus ja että tämä ei eroa luonnonmateriaalista saadun VAC:in aktiivisuudesta.

VAC-β:n cDNArsta johdettu aminohapposekvenssi on 54-prosent-tisesti homologinen VAC-a:n kanssa. Tästä havainnosta johtuen verrattiin VAC-β:n biologista aktiivisuutta VAC-a:n aktiivisuuteen.

1. VAC-α:n ja VAC-β:n vaikutus protrombinaasi-aktiivisuuteen: Kuvio 47 osoittaa, että kummallakinproteiinilla VAC-a VAC-β on samanlainen inhibitiovaikutus prtrombinaasi-aktiivisuuteen, mikä antaa olettaa koaguloitumisen inhibitiomekanismien olevan samanlaisia.

2. Fosfolipaasia inhiboiva aktiivisuus: edellä jo mainittiin, että VAC-α primäärirakenteensa perusteella ja VAC-β «« 103892 voidaan sijoittaa ameksiiniperheeseen, Gusow, M.J. (1987) Febsletters 203, 99-103). Eräät tämän perheen jäsenet, esimerkiksi kapaktiini I ja II ovat osoittautuneet fosfoli-paasin inhibiittoreiksi. Niiden aktiivisuus perustuu kalsiumista riippuvaan sitoutumiseen fosfolipidiin, minkä johdosta ne estävät fosfolipaasin vaikuttamsta substraattiinsa (Davidson et ai. (1987) J. Biol. Chem. 262, 1698-1705.

Koska VAC-α ja VAC-β sitoutuvat kalsiumista riippuvalla tavalla fosfolipideihin, tutkittiin, onko näillä kummallakin proteiinilla mahdollisesti myös antifosfolipaasi-aktiivi-suus. Tähän käytettiin testimenetelmää, joka suoritettiin ^H-öljyhapolla leimatulla E.coli'lla.

Kuviot 48 ja 49 osoittavat, että sekä VAC-α että VAC-β inhiboivat fosfolipaasi A2-aktiivisuutta. Lisäksi molemmat proteiinit ovat valituissa olosuhteissa yhtä aktiivisia.

Noin 65 mM VAC-a:lla tai VAC-β:11a havaittiin 50 % inhibitio. Kun substraatin konsentraatio pienennettiin puoleen, VACrin ID^Q-arvo aleni puoleen. Tämä viittaa siihen, että VAC vaikuttaa substraattitasolla. VAC on siten todennäköisesti fosfolipidimembraaneissa ja inhiboi tätä kautta fosfolipaasin aktiivisuutta.

Kalpaktiini I sitoutuu fosfolipidin membraaneihin Ca++:in mikromoolipitoisuudessa (Drust, D.S. & Cremitz, C.E.

(1988) Nature 331, 88-91). Sen vuoksi tutkittiin, kykeneekö VAC inhiboimaan fosfolipaasi-aktiivisuuden alhaisissa kalsiumkonsentraatioissa. Koska haiman fosfolipaasi A- + + ^ • oli inaktiivinen alle 50 mM Ca -konsentraatioissa, tämä oli alhaisin käytetty konsentraatio. Kuviot 50 ja 51 osoittavat VAC:11a indusoidun fosfolipaasiaktiviisuuden inhibition riippuvuuden kalsiumista. Sekä VAC-a että VAC-β inhiboivat aktiivisuutta kaikissa Ca++-konsentraatioissa. VAC-a:n ja VAC-β:n inhibiittori-aktiivisuuksien välillä . näkyy kuitenkin funktionaalinen ero. Alhaisimmassa Ca 45 1 0 3 8 9 2 konsentraatiossa VAC-β oli merkittävästi aktiviisempi kuin VAC-α. Tämä saattoi viitata siihen, että VAC-β tarvitsee vähemmän Ca++-ioneja membraanin sitotumiseen.

Keksinnön mukaisesti saatavat VAC-proteiinit voidaan sinänsä tunnetulla tavalla muuntaa muiksi VAC-proteiineiksi (peptideiksi).

Tutkimukset ovat osoittaneet, että disulfidisilloilla ei ole merkitystä luonnonmukaisen VAC:in hyytymistä ehkäisevälle aktiivisuudelle. Isäntäsolujen valinnasta riippuen ei voida sulkea pois mahdollisuutta, että primäärisen translaatiotuotteen kysteiiniryhmät liittyvät disulfidisil-toja muodostaen tavalla, joka eroaa luonnonmukaisesta tapahtumasta. Mahdollista on, että tuotteen muodostuva "väärä" tertiäärirakenne johtaa arvokkaiden farmakologisten ominaisuuksien, erityisesti hyytymistä ehkäisevän aktiivisuuden, pienenmiseen tai jopa häviämiseen, mahdollisesti kuitenkin myös paranemiseen, mikä todetaan edellä mainituilla VAC-määrityksillä. Tällaisessa tapauksessa on myös mahdollista pilkkoa disulfidisidokset sopivalla pelkistimellä ja liittää disulfidisidokset uudelleen käsittelemällä pelkistetty polypeptidi sopivalla hapetti-mella. Muodostuneen tuotteen VAC-aktiivisuuden perusteella voidaan todeta, ovatko valitut olosuhteet (pelkistin • * · ja/tai hapetin) nostaneet biologista aktiivisuutta halutulla tavalla tai onko olosuhteita muutettava tunnetulla tavalla.

Disulfidisiltojen katkaismiseen sopivia pelkistimiä ovat esimerkiksi tioliyhdisteet, kuten tiofenoli, 4-nitrotio-fenoli, 1,4-butaaniditioli ja erityisesti 1,4-ditiotreiitti.

•

Pelkistämienn suoritetaan edullisesti vesi-alkalisessa mediumissa, esimerkiksi alkalimetallihydroksidin, esimerkiksi natriumhdyroksidin, alkalimetallikarbonaatin, esimerkiksi natriumkarbonaatin, tai orgaanisen emäksen, erityisesti trialempialkyyliamiinin, esimerkiksi trietyyliamiinin, 103892 46 laimennetussa vesiliuoksessa huoneen lämpötilassa.

Hapettimia, jotka sopivat disulfidisidosten uudelleenliit-tämiseen pelkistetyissä polypeptideissä, ovat esimerkiksi ilman happi, jota johdetaan polypeptidin vesiliuoksen läpi, jossa on mukana mahdollisesti katalyyttinen määrä siirtymämetallisuolaa, esimerkiksi rauta-(III)-sulfaattia, rauta-(III)-kloridia tai kupari-(II)-sulfaattia; jodi, myös kaliumjodidi-adduktina KJ^, jota käytetään mieluummin alkoholi-, esimerkiksi metanoli-, tai vesi-alkoholi-, esimerkiksi vesi-metanolipitoisessa liuoksessa; kaliumheksa-ysanoferraatti-(III) vesiliuoksessa; 1,2-dijodietaani tai atsodikarboksyylihappodimetyyliesteri tai -dietyyli-esteri, jotka saatetaan reagoimaan vedessä tai vedestä ja veden kanssa sekoittuvasta alkoholista, esimerkiksi metanolista, muodostuvassa seoksessa. Hapettaminen suoritetaan erityisesti huoneen lämpötilassa.

Reagenssit, erityisesti hapettimen tai pelkistimen suolat ja niiden tuotteet, erotetaan halutusta VAC-yhdisteestä sinänsä tunnetuilla menetelmillä, esimerkiksi molekyyli-painosuodatuksen avulla, esimerkiksi Sephadex- tai Biogel-geelillä.

Keksinnön mukaisesti saatava, VAC-aktiivisuutta omaavien yhdisteiden seos voidaan erottaa sinänsä tunnetulla tavalla yksittäisiksi komponenteiksi. Sopivia erotusmenetelmiä ovat esimerkiksi kromatograafiset menetelmät, esimerkiksi adsorptiokromatografia, ioninvaihtokromatografia, HPLC tai käänteisfaasi-HPLC, edelleen kertova jakaminen tai elektroforeettiset menetelmät, esimerkiksi elektroforeesi selluloosa-asetaatilla tai geelielektroforeesi, erityisesti polyakryyliamidi-geelielektroforeesi ("PAGE").

Keksinnön mukaisesti valmistettavat yhdisteet voivat olla vapaiden muotojen lisäksi myös suoloina, erityisesti 47 1 0 3 8 9 2 farmaseuttisesti hyväksyttävinä suoloinaan. Koska se sisältää useita aminohapporyhmiä, joissa on vapaita aminoryh-miä, voivat keksinnön mukaiset yhdisteet olla esimerkiksi happoadditiosuoloina. Happoadditiosuoloina tulevat kysymykseen erityisesti fysiologisesti sopivat suolat tavanomaisten, terapeuttisesti käyttökelpoisten happojen kanssa; epäorgaanisista hapoista mainittakoon halogeenivetyhapot, kuten kloorivetyhappo, mutta myös rikkihappo ja fosfori- tai pyrofosforihappo; sopivia orgaanisia happoja ovat ensisijassa sulfonihapot, kuten bentseeni- tai p-tolueenisulfonihappo tai alempi alkaanisulfonihapot, kuten metaanisulfonihappo, sekä karboksyylihapot, kuten etikkahapot, maitohappo, palmitiini- ja steariinihappo, omenahappo, viinihappo, askorbiinihappo ja sitruunahappo. Koska VAC-yhdisteet sisältävät myös aminohapporyhmiä, joissa on vapaita karboksyy-liryhmiä, ne voivat esiintyä myös metallisuoloina, erityisesti alkalimetalli- tai maa-alkalimetallisuolana, esimerkiksi natrium-, kalsium- tai magnesiumsuolana, tai myös ammonium-suolana, joka on peräisin ammoniakista tai fysiologisesti sopivasta, orgaanisesta typpipitoisesta emäksestä. Koska ne lisäksi kuitenkin sisältävät samalla vapaita karboksyy-liryhmiä ja vapaita aminoryhmiä, ne voivat esiintyä myös sisäisinä suoloina.

Keksinnön mukaiset yhdisteet saadaan toimintatavasta riippuen vapaassa muodossa, happoadditiosuoloina tai suoloina emästen kanssa. Vapaat yhdisteet voidaan saada happoadditiosuoloista ja suoloista emästen kanssa tavalliseen tapaan, esimerkiksi säätämällä pH-arvo isoelektriseen pisteeseen. Vapaista yhdisteistä voidaan taas saada terapeuttisesti hyväksyttäviä happoadditiosuoloja tai suoloja • / emästen kanssa saattamalla nämä reagoimaan happojen tai emästen kanssa, esimerkiksi sellaisten kanssa, jotka muodostavat mainittuja suoloja, ja haihduttamalla tai lyofilisoimalla.

Vasta-aineiden kyvyllä sitoa spesifisiä antigeenejä on kehon » 48 1 0 3 8 9 2 ulkopuolella käytännössä käyttöä antigeenien kvalitatiivisessa ja kvantitatiivisessa määrittämisessä (immunomääritys) ja puhdistamisessa (immunoaffiniteettikromatografia). Immunisoitujen eläinten seerumi sisältää tavallisesti lukuisia erilaisia vasta-aineita, jotka reagoivat vastaavan antigeenin kanssa eri sitotumiskohdissa, joissa on erilainen affiniteetti, ja tämän lisäksi myös vasta-aineita muita antigeenejä vastaan, jotka heijastavat yksilön aikaisempia kokemuksia. Antigeenien määrittämiseen ja puhdistamiseen tarkoitettu vasta-aineiden menestyksellinen käyttö edellyttää suurta spesifisyyttä ja toistettavuutta.

Nämä vaatimukset täyttäviin homogeenisiin vasta-aineisiin voidaan päästä Kähler'in ja Milstein'in (17) kuvaamalla hybridoma-tekniikalla. Tekniikka muodostuu periaatteessa siitä, että immunisoitujen eläinten, esimerkiksi pernasta saadut vasta-aineita erittävät B-lymfosyytit fuusioidaan kasvainsolujen kanssa. Muodostuneissa hybridomasoluissa yhtyy kyky lisääntyä rajattomasti jakaantumisen kautta kykyyn muodostaa ja erittää tyypiltään yhtenäistä vasta-ainetta. Kasvattamalla selektiivisessä alustassa, jossa fuusioimattomat kasvainsolut kuolevat ja jossa kuitenkin hybridomasolut lisääntyvät, ja sopivasti manipuloimalla voidaan saada klooneja, so. solupopulaatioita, jotka ovat peräisin yksittäisistä hybridomasoluista ja jotka « · < • ovat geneettisesti identtisiä. Näitä klooneja kasvatetaan ja eristetään solujen tuottamat monoklonaaliset vasta-aineet.

Esillä olevan keksinnön kohteena ovat VAC:in vastaiset monoklonaaliset vasta-aineet, näitä vasta-aineita tuottavat '· hybridomasolut ja näiden valmistusmentelmä. Parhaina pidetään hybridomasolulinjoja ja näiden erittämiä monoklonaa-lisia vasta-aineita, jotka reagoivat spesifisesti VAC:in kanssa. Monoklonaalisten anti-VAC-α- ja anti-VAC-g-vasta-aineiden valmistusmenetelmälle on tunnusomaista, että hiiret immunisoidaan VAC:lla, tällä tavoin immunisoitujen 49 103892 eläinten B-lymfosyyttejä fuusioidaan myeloomasolujen kanssa, muodostuneen hybridomasolut kloonataan, minkä jälkeen viljellään in vitro tai injisoimalla hiiriin ja vasta-aineet eristetään viljelmistä.

Keksinnön kohteena ovat edelleen immuno-affiniteetti-kromatografiapylväät ja immunomäärityksiin tarkoitetut, näitä vasta-aineita sisältävät testikitit.

Keksinnön mukaisessa menetelmässä immunisoidaan hiiret, esimerkiksi Balb/c-hiiret, sinänsä tunnetulla tavalla.

Eräässä hyvänä pidetyssä suoritusmuodossa VAC:ta injisoi-daan noin kerran viikossa tai myös pidemmin väliajoin useamman viikon aikana, esimerkiksi 5-12 viikon aikana, kunnes vasta-aineita tuottavia B-lymfosyyttejä on muodostunut riittävä määrä.

Käytetyn VAC:in immunogeenisyyden nostamiseksi kytkettiin se voimakkaasti immunogeeniseen kantajaan, kuten esimerkiksi heterologiseen albumiiniin tai KLH:hon (keyhole limpet hemocyanin). Mieluummin käytetään erilaisia VAC/KLH-prepa-raatetja, jolloin erään immunisointiohjelman mukaisesti immunisoidaan niin kauan, että vasta-aineita tuottavia soluja on muodostunut riittävästi, esimerkiksi noin 40 ;· viikkoon asti. Immunisoitujen hiirten B-lymfosyyttejä sisältävät elimet, esimerkiksi pernasolut, poistetaan ja fuusioidaan sellaisten myeloomasolujen kanssa, jotka mutaation vuoksi eivät kasva selektiivisessä viljelyalustassa. Tällaiset myeloomasolut ovat tunnettuja. Näitä soluja ovat esimerkiksi X63-Ag8, X63-Ag8.6.5.3, MPC-11, NSl-Ag4/l, MOPC-21 NS/1 tai SP 2/0. Eräässä hyvänä pidetyssä suoritusmuodossa fuusioidaan immunisoitujen hiirten perna-soluja solulinjan X63-Ag8.6.5.3 myeloomasolujen kanssa.

Fuusio suoritetaan sinänsä tunnetuilla menetelmillä sekoittamalla B-lymfosyyttejä, kun näihin on lisätty solujen .· fyysiointiainetta, kuten polyetyleeniglykolia, Sendai- 50 1 0 3 8 9 2 viruksia, kalsiumkloridia tai lysolesitiiniä. Fuusiointi suoritetaan parhaiten polyetyleeniglykolin, esimerkiksi polyetyleeniglykolin, jonka molekyylipaino on välillä 1000 ja 4000, läsnäollessa. Fuusion jälkeen viljellään muodostuneita hybridejä sinänsä tunnetulla menetelmällä selektiivisessä viljelyalustassa, jota on täydennetty hypoksantiinilla, aminopteriinillä ja tyminiilillä (HAT-alsuta). Fuusioimattomat myeloomasolut eivät voi kasvaa tässä alustassa, jolloin ne kuolevat, kuten myös normaalit lymfosyytit.

Hybridomasiljelmien supernatanteista voidaan spesifisten vasta-aineiden pitoisuus tutkia sinänsä tunnetuilla menetelmillä, esimerkiksi RIArlla, ELISA:11a tai agglutinoimalla. Tällöin todetaan yllättäen, että kuvatulla menetelmällä saadut hybridomasolut voivat erittää VACrlle spesifisiä vasta-aineita. Hybridomasolut, jotka tuottavat spesifisyydeltään halutunlaisia vasta-aineita, valitaan kloonaamalla erilaisten hybridomasolujen fuusioimalla syntyneestä seoksesta. Tähän käytetään sinänsä tunnettua menetelmää, josta käytetään nimitystä rajalaimennus "limiting dilution", käyttämällä viljelmiä, jotka on saatu yksittäisistä kasvavista soluista.

.. Massatuotantoa varten viljellään hybridoma-soluklooneja, jotka tuottavat spesifisyydeltään halutunlaisia vasta-aineita, joko sinänsä tunnetuissa alustoissa in vitro tai injisoidaan lisääntymistä varten hiiriin. Eräässä hyvänä pidetyssä suoritusmuodossa injisoidaan hybridomasolut pristaanilla esikäsiteltyihin hiiriin, askiittineste kerätään talteen ja tästä eristetään vasta-aineet saostamalla ammoniumsulfaattiliuoksella.

Näiden hybridomasolujen avulla saatuja VAC-spesifisiä vasta-aineita voidaan käyttää sinänsä tunnetulla tavalla immunoaffiniteettikromatografia-pylväiden valmistamiseen.

. Eräässä hyvänä pidetyssä keksinnön suoritusmuodossa 51 103892 lisätään sopivaan kantajamateriaaliin (suspendoitu puskuriliuokseen) vasta-aineliuosta, minkä jälkeen sitoutumattomat osat pestään pois ja kantajamateriaalin vapaat kohdat blokataan. Hybridomasolujen avulla saatuja VAC-spesifisiä vasta-aineita voidaan käyttää sinänsä tunnetulla tavalla testikittien valmistamiseen. Nämä testikitit voivat perustua erilaisiin menetelmiin, esimerkiksi radioimmuno-määri-tykseen, lateksi-agglutinointiin, puikkotesteihin, kilpailevaan tai kerros-radioimmuno-määritykseen, entsyymi-immunomääritykseen, immuno-fluoresenssiin tai immunokemial-lisiin entsyymi-testeihin. Tällaiset kitit voivat sisältää alkuperältään erilaisten, tavanomaisten vasta-aineiden lisäksi vasta-aine-konjugaatteja entsyymien tai fluoresens- sikantajien kanssa, VAC voi tätä varten olla leimattu 125 radioaktiivisilla isotoopeilla, kuten J :11a tai konju-goitu entsyymien kanssa, esimerkiksi piparjuuriperoksidaa-sin tai alkalisen fosfataasin kanssa, edelleen entsyymi-substraatteja, sopivia puskureita, geelejä, lateksia, polystyreeniä tai muita täytemateriaaleja ja kantajia.

Esillä olevan keksinnön mukaisesti saatavilla tunnetuilla proteiineilla (peptideillä) on arvokkaita farmakologisia ominaisuuksia ja niitä voidaan käyttää profylaktisesti tai erityisesti terapeuttisesti.

'1 Keksinnön mukaisia uusia VAC-yhdisteitä voidaan sen vuoksi käyttää luonnonmukaisen VAC:in kanssa analogisesti trom-boosin ja tromboembolian profylaksiaan, mukaanlukien leikkauksen jälkeisen tromboosin profylaksiaan, akuutin shokin hoitoon (esimerkiksi septisessä tai polytraumaattisessa shokissa), käyttökoagulopatian hoitoon, hemodialyysissä, ' : verenerottamisessa, veren säilyttämisessä ja kehon ulkopuo lisessa verenkierrossa.

Keksinnön kohteena ovat myös farmaseuttiset seokset, jotka sisältävät vähintään yhtä keksinnön mukaista yhdistettä tai niiden farmaseuttisesti hyväksyttävää suolaa, mahdolli- 52 103892 sesti yhdessä farmaseuttisesti hyväksyttävän kantajan ja/tai apuaineen kanssa. Näitä seoksia voidaan käyttää erityisesti edellä mainituissa indikaatioissa, kun niitä annetaan esimerkiksi parenteraalisesti, kuten intravenöösisti, intrakutaanisti, subkutaanisti tai intramuskulaarisesti, tai paikallisesti.

Keksinnön kohteena on myös keksinnön mukaisten uusien yhdisteiden ja näitä sisältävien farmseuttisten seosten käyttö ihmis- ja eläinkehon profylaktisessa ja terpaeut-tisessa hoidossa, erityisesti edellä annetuissa sairausku-vissa, ensisijassa veren hyytymisen estämiseen ihmis-tai eläinkehon sisällä ja ulkopuolella.

annostus riippuu ensi sijassa kyseisestä antamismuodosta ja hoidon tai ennakkohoidon tarkoituksesta. Yksittäisan-noksen suuruus sekä antamissuunitelma voidaan määrätä parhaiten arvioimalla tapauksittain kyseinen sairaus: ammattimiehet ovat perehtyneet täysin tätä varten tarvittaviin menetelmiin, joilla kyseiset veritekijät määritetään. Normaalitapauksessa on inhisoinnissa keksinnön mukaisten yhdisteiden terapeuttisesti tehokas määrä annosalueella noin 0,005 - noin 0,1 mg/painokilo. Alue on mieluummin noin 0,01 - noin 0,05 mg/painokilo. Antaminen tapahtuu injisoimalla intravenöösisti, lihaksensisäisesti tai subkutaa- « · ' nisti. Parenteraaliseen antamiseen tarkoitetut farmaseutti set preparaatit sisältävät vastaavasti yksittäisannosmuodossa ja applikointitavasta riippuen annosta kohti noin 0,4 -noin 7,5 mg keksinnön mukaista yhdistettä. Tehoaineen lisäksi nämä farmaseuttiset seokset sisältävät tavallisesti myös puskuria, esimerkiksi fosfaattipuskuria, jonka pH- .· arvon tulee olla välillä noin 3,5 ja 7, ja edelleen natrium- kloridia, manniittia tai sorbiittia isotonisuuden säätämistä varten. Ne voivat olla pakkaskuivatussa tai liukoisessa muodossa, jolloin liuokset voivat sisältää bakteereidenvas-taisesti vaikuttavaa säilytysainetta, esimerkiksi 0,2 -0,3 % 4-hydroksibentsoehappometyyliesteriä tai -etyyli- 53 103892 esteriä. Paikalliseen käyttöön tarkoitettu preparaatti voi olla vesiliuos, pesuneste tai geeli, öljyliuos tai -suspensio tai rasvapitoinen tai erityisesti emulsiovoide. Vesiliuoksen muodossa oleva preparaatti saadaan esimerkiksi siten, että keksinnön mukainen tehoaine tai sen terapeuttisesti hyväksyttävä suola liuotetaan vesipitoiseen puskuriliuokseen, jonka pH on 4 - 6,5, ja haluttaessa lisätään muuta tehoainetta, esimerkiksi tulehduksia estävää ainetta ja/tai polymeeristä kiinnitysainetta, esimerkiksi polyvinyylipyrrolidonia, ja/tai säilytysainetta. Tehoaineen konsentraatio on noin 0,1 - noin 1,5 mg, parhaiten 0,25 - 1,0 mg 10 ml:ssa liuosta tai 10 g:ssa geeliä.

Tooppiseen antamiseen tarkoitettu öljymäinen applikointi-muoto saadaan esimerkiksi suspendoimalla keksinnön mukaista tehoainetta tai sen terapeuttisesti hyväksyttävää suolaa öljyyn, mahdollisesti lisäämällä turvotusaineita, kuten alumiinistearaattia, ja/tai rajapinta-aktiivisia aineita (tensidejä), joiden HLB-arvo ("hydrophilic-lipophilic-balance") on alle 10, kuten moniarvoisten alkoholien rasva-happomonoesteriä, esimerkiksi glyseriinimonostearaattia, sorbitaanimonolauraattia, sorbitaanimonostearaattia tai sorbitaanimono-oleaattia. Rasvapitoinen voide saadaan esimerkiksi suspendoimalla keksinnön mukaista tehoainetta tai sen suolaa siveltävään rasvapohjaan, mahdollisesti · lisäämällä tensidiä, jonka HLB-arvo on alle 10. Emulsiovoi de saadaan hiertämällä keksinnön mukaisen tehoaineen tai sen suolan vesiliuos pehmeään, siveltävään rasvapohjaan lisäämällä tensidiä, jonka HLB-arvo on alle 10. Kaikki nämä tooppiset applikointimuodot voivat sisältää myös säilytysaineita. Tehoaineen konsentraatio on 0,1 - 1,5 mg, parhaiten 0,25 - 1,0 mg noin 10 g:ssa perusmassaa.

Edellä kuvattujen ja niiden kanssa analogisten farmaseuttisten seosten lisäksi, jotka on tarkoitettu suoraan lääketieteelliseen käyttöön ihmisen tai nisäkkään kehossa, esillä oelvan keksinnön kohteena ovat myös farmaseuttiset 54 103892 seokset ja preparaatit, jotka on tarkoitettu ihmisen tai nisäkkään elävän kehon ulkopuoliseen lääkekäyttöön. Tällaisia seoksia ja preparaatteja käytetään ensisijassa veren hyytymistä estävänä lisäaineena vereen, johon kehon ulkopuolella kohdistuu kierrättäminen tai käsittely (esimerkiksi kehon ulkopuolinen kierto tai dialyysi keinomunuaisissa), säilyttäminen tai modifiointi (esimerkiksi veren erottaminen). Tällaiset preparaatit, kuten varastoliuokset tai myös yksittäisannoksen muodossa olevat valmisteet ovat koostumukseltaan samankaltaiset kuin edellä kuvatut injisointipre-paraatit; tarkoituksenmukaista on kuitenkin sovittaa tehoaineen määrä tai konsentraatio käsiteltävän veren tilavuuteen. Kulloinkin kyseeseen tulevasta käyttötarkoituksesta riippuen sopiva annos on noin 0,01 - noin 1,0 mg tehoainetta/litra verta, jolloin yläraja voidaan vielä vaaratta ylittää.

Keksinnön kohteena ovat erityisesti mukana olevissa esimerkeissä kuvatut, VAC-proteiineja koodaavat DNA-molekyylit, näitä DNA-molekyylejä sisältävät ekspressioplasmidit, näillä ekspressioplasmideilla transformoidut mikro-organismit, VAC-proteiinien vastaiset monoklonaaliset vasta-aineet, näitä vasta-aineita tuottavat hybridomasolut ja immunomääri-tyksiin tarkoitetut, näitä vasta-aineita sisältävät testikitit, esimerkeissä kuvatut näiden valmistusmenetelmät ja esimerkeissä kuvatut menetelmät, joilla valmistetaan VAC-aktiivisuutta ·' omaavia proteiineja/polypeptidejä transformoitujen mikro- organismien avulla, sekä esimerkeissä kuvatut uudet VAC-yhdisteet.

Kun käsillä olevassa hakemuksessa puhutaan vaskulaarisista antikoaguloivista proteiineista tai lyhyemmässä muodossa VAC-proteiineista, niin tällä tarkoitetaan polypeptidejä/ proteiineja, joilla on oleellisesti ominaisuudet, jotka ovat ominaisia ensi kerran patenttijulkaisussa EPÄ 181 465 kuvatuille proteiineille. Nämä ominaisuudet voidaan todeta ja vahvistaa tässä julkaisussa annetuilla testi- ja karak-terisointimenetelmillä (VAC-aktiivisuus).

55 1 0 3 8 9 2 Tämän määritelmän alaisuuteen lukeutuvat myös polypeptidit/ proteiinit, jotka ovat yhdistelmiä, kuten esimerkiksi dimeerit, primeerit tai tetrameerit, myös silloin, kun näillä yhdsitelmämuodossa ei sinänsä ole biologista aktiivisuutta tai aktiivisuus on rajoitettu, edellyttäen, että nämä muuntuvat in vivo tai in vitro vähintään yhdeksi aktiiviseksi komponentiksi.

Jos käsillä olevan keksinnön puitteissa saadaan polypep-tidejä/proteiineja, joilla ei sinänsä ole biologista aktiivisuutta tai aktiivisuus on vain rajoitettu, esimerkiksi fuusioproteiineja tai nk. "pro-drugs"-polypeptidejä/pro-teiineja, jotka ammattimiehelle sinänsä tunnetulla tavlala ovat muunnettavissa aktiivisiksi komponenteiksi, esimerkiksi in vitro tai in vivo prosessoinnin kautta, tai polypeptide jä/proteiineja, joiden aktiivisuus ilmenee vasta in vivo, niin myös nämä on käsitettävä vaskulaarisiin antikoaguloiviin, lyhyemmin sanottuna VAC-proteiineihin kuuluviksi ja siten käsillä olevan keksinnön kohteiksi.

"yhdisteillä, jotka omaavat VAC-aktiivisuuden" tarkoitetaan myös sellaisia, mainittujen transformoitujen isäntäsolujen ekspressoimia polypeptidejä, joilla on VAC-vaikutus ja positiivinen reaktio anti-VAC-vasta-aineiden kanssa ja joilla on VACrin primäärirakenne tai tästä johdettavissa oleva rakenne. VAC-yhdisteillä, joilla on VAC-proteiinien primäärirakenteesta johdettu rakenne, tarkoitetaan modifioituja VAC-yhdisteitä, jolloin modifiointi johtaa VAC:in primäärirakenteen lyhenemiseen, toistorakenteiden uudelleenjärjestäytymiseen tai modifiointiin, joka muuttaa stabiilisuut-ta tai aktiivisuutta.

VAC-DNA/geeni tarkoittaa käsillä olevassa keksinnössä DNA-molekyylejä, jotka koodaavat edellä määriteltyjä VAC-proteiinej a.

Seuraavat esimerkit ja piirustukset havainnollistavat 56 103892 keksintöä sitä millään tavalla rajoittamatta.

Seuraavien esimerkkien yksinkertaistamiseksi on seuraavasa lyhyesti kuvattu usein toistuvia menetelmiä.

Plasmideista käytetään pientä kirjainta "p", jota seuraa isot kirjaimet ja numerot. Lähtöplasmidit ovat kaupallisia tai saatavissa julkisesti ilman rajoituksia. Niitä voidaan myös rakentaa tällaisista plasmideista julkaistujen menetelmien avulla.

DNA:n "katkaiseminen" tai "pilkkominen" tarkoittaa DNA:n katalyyttistä katkaisemista restriktioendonukleaasien (restriktioentsyymit) avulla, jotka vaikuttavat näiden spesifisiin kohtiin, nk. restriktiokohtiin. Restriktioendo-nukleaaseja on saatavissa kaupallisesti ja niitä käytetään valmistajien suosittelemissa olosuhteissa (puskuri, kantajaproteiinina naudanseerumialbumiini (BSA), hapettumisen suoja-aineena ditiotreiitti (DTT)).

Restriktioendonukleaaseista käytetään suuria kirjaimia, joita useimmiten seuraa pieniä kirjaimia ja tavallisesti roomalainen numero. Kirjaimet riippuvat mikro-organismista, josta kyseinen restriktioendonukleaasi on eristetty (esimerkiksi: Sma I: Serratia marcescens). Tavallisesti pilkotaan .· noin 1 pg DNA: ta yhdellä tai useammalla entsyymiyksiköllä noin 20 :ssa puskuriliuosta. Tavallisesti käytetään 1 tunnin inkubointiaikaa 37°C:ssa, mutta tätä voidaan muuttaa valmistajan käyttöohjeiden mukaan. Pilkkomisen jälkeen poistetaan usein 5'-fosfaattiryhmä inkuboimalla vasikansuolesta saadulla alkalisella fosfataasilla (CIP). Tällä estetään ei-toivottu spesifisen kohdan reaktio seuraa-vassa ligaasireaktiossa (esimerkiksi kehän muodostaminen linearisoidusta plasmidista insertoimatta toista DNA-fragmenttia). Ellei toisin ole mainittu, ei DNA-fragmentteja tavallisesti defosforyloida restriktioendonukleaaseilla pilkkomisen jälkeen. Reaktio-olosuhteet inkuboimiselle 57 103892 alkalisen fosfataasin kanssa on saatavissa esimerkiksi käsikirjasta: (Cloning and Sequencing handbook, Amersham, PI/129/83/12). Inkuboinnin jälkeen proteiini poistetaan uuttamalla fenolilla ja kloroformilla ja DNA saostetaan vesifaasista etanolia lisäämällä.

Määrätyn DNA-fragmentin "eristäminen" tarkoittaa pilkotun DNA:n erottamista esimerkiksi 1-prosenttisella agaroosigee-lillä. Elektroforeesin jälkeen ja sen jälkeen, kun DNA on tehty näkyväksi UV-valossa värjäämällä etidiumbromidilla (EtBr) paikallistetaan haluttu fragmentti mukana seuraavan molekyylipainon markkerin avulla ja sidotaan uuden elektroforeesin avulla DE 81-paperiin (Schleicher und Schuell).

DNA pestään huuhtelemalla vähäsuolaisella puskurilla (200 mM NAcl, 20 mM Tris pH=7,5, 1 mM EDTA) ja tämän jälkeen eluoidaan runsassuolaisella puskurilla (1 M NaCl, 20 mM Tris pH=7,5, 1 mM EDTA). DNA saostetaan lisäämällä etanolia.

"Southern-analyysi" on jokainen menetelmä, jonka avulla määrätyn DNA-fragmentin läsnäolo DNA-seoksessa voidaan osoittaa hybridisoimalla tunnetun, leimatun oligonukleotidi-koettimen tai leimatun DNA-fragmentin kanssa. Southern-analyysi tarkoittaa seuraavassa, ellei toisin ole määritelty, DNA-seoksen erottamista 1-prosenttisella agaroosi-geeiillä, denaturointia ja siirtoa mikroselluloosasuodat-: timille (Schleicher und Schuell, BA 85) menetelmällä: E. Southern, J. MOI. Biol. 98 (1978), ss. 503-517, ja hybridisointia R. Hauptmann*in et ai.-artikkelissa Nucleic Acids Res. 13 (1985), sivut 4739-4749.

"Transformointi" tarkoittaa DNA:n vientiä organismiin ' , niin, että DNA voidaan siellä replikoida, joko kromosomin ulkopuolisena tai kromosomiin kuuluvana osana. E.coli'n transformointi tapahtuu menetelmällä, joka on anenttu julkaisussa: (Cloning and Sequencing Handbook, FA Amersham, PI/129/83/12) .

58 1 0 3 8 52 DNA:n "sekvenssointi" tarkoittaa nukleotidisekvenssin analyysiä DNA:ssa. Tätä varten DNA pilkotaan eri restrik-tioentsyymeillä ja fragmentit viedään vastaavaan pilkottuun M13 mp8, mp9, mpl8 tai mpl9 kaksisäikeiseen DNA:an, tai DNA viedään ultraäänen avulla, tämän jälkeen päät korjaamalla ja koon perusteella valitsemalla Sma I-pilkottuihin, defosforyloituihin Ml3 mp8 DNA-molekyyleihin (Shotgun-menetelmä). E.coli JM 101:n transformoinnin jälkeen eristetään yksisäikeinen DNA rekombinanttien M13 faageista M13 Cloning ad Sequencing-käsikirjän mukaisesti (Cloning and Sequiencing Handbook, Amersham, PI/129/83/12) ja sekvens-soidaan Sanger'in dideoksimenetelmällä (F. Sanger et ai.,

Proc. natl. Acad. Sei. 74 (1977), sivut 5463-5467). Sekvenssien arviointi tapahtuu alkuaan R. Staden'in kehittämän (R. Staden Nucleic acids Res. 10 (1982), sivut 4731-4751) ja Ch. Pieler'in modifioiman (c. Pieler 1987, väitöskirja, Wienin Yliopisto) tietokoneohjelman avulla.

"Ligatointi" tarkoittaa tapahtumaa, jossa muodostetaan fosfodiesterisidoksia kaksisäikeisten DNA-fragmenttien kahden pään välille. Tavallisesti ligatoidaan välillä 0,02 ja 0,2 ug DNA-fragmentteja 10 ul:ssa noin 5 yksiköllä T4-DNA-ligaasia ("ligaasi") sopivassa puskuriliuoksessa (T.Maniatis et ai., Molecular cloning, 1982, s. 474).

DNA:n "valmistaminen" transformanteista tarkoittaa plasmidi-DNA:n eristämistä bakteereista alkalisen SDS-menetelmän avulla, jota on modifioitu Birnboim'in ja Doly’n mukaisesti (T. Maniatis et ai., Molecular cloning, 1982, sivut 368-369) jättämällä pois lysotsyymi. Käytetyt bakteerit ovat tällöin peräisin 1,5 - 50 ml:sta viljelmää.

"Oligonukleotidit" ovat lyhyitä polydesoksinukleotideja, jotka syntetisoidaan kemiallisesti. Tähän käytettiin Applied Biosystems Synthesizer Modell 381A-laitetta. Oligonukleotidit jatkokäsiteltiin Modell 381A User Manual (Applied Biosystems) ohjeiden mukaisesti ja puhdistettiin polyakryyliamidigeeli-‘ elektroforeesin avulla (PAGE).

59 103892 "Fosforylointi" tarkoittaa ATP:n gamnia-fosf aattiryhmän entsymaattista siirtämistä nukleiinihapon, useimmiten oligonukleotidin vapaaseen 5'-OH-ryhmään. 10 ulissa liuosta fosforyloidaan 100 pikomooliin asti oligonukleotidiä 10 yksikön kansa T 4-poly-nukleotidikinaasia 30 minuutin ajan 37°C:ssa, kun mukana on 100 pikomoolia ATPrta sopivassa puskuriliuoksessa (70 mM Tris, pH=7,6, 10 mM MgC^, 5 mM DTT). Reaktio pysäytetään useimmiten kuumentamalla 10 minuuttia 100°C:ssa.

Seuraavassa on lyhyesti selitetty eräitä käytettyjä lyhennyksiä: bp: Emäspari BSA: Naudanseerumialbumiini DTT: Ditiotreiitti EDTA: Etyleenidinitrilotetraetikkahappo, dinatrium- suola SDS: Natriumdodekyylisulfaatti

Tris: Tris(hydroksimetyyli)-aminometaani

Denhardt: 0,02 % Ficoll, 0,02 % polyvinyylipyrrolidoni

0,02 % BSA

LB: 10 g/1 tryptoni, 5 g/1 hiivauute, 5 g/1

NaCl lx SSC: 150 mM NaCl, 15 mM tri-natriumsitraatti, pH=7

TE: 10 mM Tris pH=8,0, 1 mM EDTA

Kuvaluettelo: 0.1: trypsiinifragmentit istukka-VAC:sta

0.2: Istukka-VAC:sta saatujen trypsiinipeptidien HPLC

0.3: Napanuora-VAC:sta saatujen trypsiinipeptidien HPLC

0.4: Istukka- ja napanuora-VAC:in geelipermeaatio-HPLC

0.5: Istukka-VAC:in käänteisfaasi-HPLC

0.6: Istukka-VAC:in SDS-geelielektroforeesi 1: Seulonta-oligonukleotidit EBI-386, -387 ja -388 60 1 0 3 8 9 2 2: Seuionta-oligonukleotidit EBI-118 ja EBI-119 3: Northern Blot-analyysi VAC-alfa ja VAC-beta cDNA:lla 4: VAC-alfa cDNA-sekvenssi 5: Peptidisekvenssien sijoittaminen VAC-alfa cDNA:sta johdettuun aminohapposekvenssiin 6: Useamman kerran toistuva alasekvenssi VAC-alfa- proteiinissa 7: VAC-beta cDNA-sekvenssi 8: Useamman kerran toistuva alasekvenssi VAC-beta- proteiinissa 9: VAC-alfan ja VAC-betan aminohappokoostumus 10: Genominen Southern Blot-analyysi VAC-alfa ja VAC-beta cDNA:11a 11: VAC-alfa ja VAC-beta aminohappovertailu 12: VAC-alfa ja -beta cDNA-molekyylien välinen nukleotidi- vertailu 13: VAC-alfan ja VAC-betan hydrofiilisyyskäyrä 14: VAC-alfan, VAC-betan, lipokortiini I:n ja lipokor- tiini II:n vertailu 15: Promoottori- ja terminaattoriosien sekvenssi pRH284:ssa 16: pRH291:n rakentaminen 17: pRH212:n rakentaminen 18: pRH292:n rakentaminen 19: Ekspressoitujen proteiiien SDS-geelielektroforeesi a) Coomassie Blau-värjätty proteiinigeeli b) Western Blot

Selitykset: M = Molekyylipainon markkerit +fosfaatti = VAC:in ekspressio inhiboitunut -fosfaatti = VAC:in ekspressio (pho-promoottorin indusoima) 20: VAC-alfan puhdistaminen; Coomassie Blau-värjätty SDS-geelielektroforeesi-geeli 1: puhdistamaton uute 2: ammoniumsulfaattipelletti (liuotettu ja dialvsoi-tu) 12)5 ug DEAE-FF-sefaroosi-jakeet 1-11 i 3: VAC-pooli DEAE-FF-sefaroosi-kromatografiän jälkeen ex 103892 4: VAC-pooli Sephacryl-S 200 HR-kromatografian jälkeen 5: puhdistettu VAC Q-Sepharose-FF-kromatografian jälkeen 6: puhdistettu, luonnonmukainen VAC ihmisen istukasta 7: molekyylipainon markkerit (farmasia: 94kD, 67kD, 43kD, 30kD, 20kD ja 14kD) 21: Puhdistetun r-VAC-a:n Sephacryl S-200 HR-kromatografia 22: Puhdistetun r-VAC-a:n Q-Sepharose-FF-kromatografia

23: Luonnonmukaisen VAC:in geelipermeaatio-HPLC

24: Rekombinantti VAC-a:n geelipermeaatio-HPLC

25: Luonnonmukaisen VAC:in käänteisfaasi-HPLC

26: Rekombinantti-VAC-a:n käänteisfaasi-HPLC

27: Luonnonmukaisesta VAC:sta saatujen trypsiinifragmenttien

HPLC

28: Rekombinantti-VAC-a:sta saatujen trypsiinifragmenttien

HPLC

29: Luonnonmukaisen ja rekombinantin VAC-a:n välisen vertailun SDS-geeli DTT:n läsnäollessa tai ilman sitä 30: Rekombinantti-VAC-α:n SDS-geeli DTT:n läsnäollessa tai ilman sitä 31: Luonnonmukaisen VAC:in ja rekombinantti-VAC-α:n

Western Blot-analyysi 32: -Luonnonmukaisen VAC:in ja rekombinantti-VAC-α:n isoelektrinen fokusointi 33: Modifioitu protrombiiniaika-testi käyttämällä luonnonmukaista VAC-proteiinia ja rekombinantti-VAC-proteiinia 34: Trombiiniaika-testi luonnonmukaisella ja rekombinan- tilliä VAC:lla 35: Luonnonmukaisen ja rekombinantti-VAC:in aiheuttama faktorin Xa muodostuminen plasmassa 36: VAC:in sitoutuminen fosfolipidi-kaksoikerroksiin 37: pGN25:n ja pGN26:n rakentaminen 38: Rekombinantti-VAC-β:n puhdistaminen; Coomassie Blau- värjätty SDS-geelielektroforeesi-geeli 103892 39: Rekombinantti-VAC-β:n puhdistaminen; in process- koettimet

40: Rekombinantti-VAC-β:n geelipermeaatio-HPLC

41: Rekombinantti-VAC-β:n käänteisfaasi-HPLC

42: Rekombinantti-VAC-β:n käänteisfaasi-HPLC inkuboinnin jälkeen 43: Rekombinantti-VAC-β:n aminohappoanalyysi 44: Rekombinantti-VAC-β:n N-terminaalinen sekvenssointi 45: Rekombinantti-VAC-β:n SDS-geeli DTT:n läsnäollessa tai ilman sitä 46: Rekombinantti-VAC-β:n isoelektrinen fokusointi 47: VAC-a:n ja VAC-3:n vaikutus protrombinaasi-aktivii- suuteen. Protrombiinin aktivoituminen mitattiin kuvatulla tavalla, kun mukana oli eri määriä VAC-a ( o ) tai VAC- β (Δ ) .

48: VAC-α:n vaikutus fosfolipaasi A2_aktiviisuuteen.

Fosfolipaasi A2~aktiivisuus määritettiin kuvatulla tavalla. VAC-α:n indusoima inhibitio mitattiin joko 13,2 nm fosfolipidillä (avoin ympyrä) tai 6,6 um fosfolipidillä (täytetty ympyrä).

49: VAC-3:n vaikutus fosfolipaasi ^-aktiivisuuteen.

Inhibitio-% määritettiin kuvatulla tavalla. Inhibitio mitattiin joko 13,2 um fosfolipidillä (avoin ympyrä) tai 6,6 um fosfolipidillä (täytetty ympyrä).

50: Ca++:n vaikutus VAC-α:n indusoimaan fosfolipaasi- aktiivisuuden inhibitioon. Inhibitio mitattiin seuraavissa konsentraatioissa: 6,6 um fosfolipdii ja 1 mM (avoin ympyrä) 0,5 mM (täytetty ympyrä), aa 0,1 mM (avoin neliö) tai 0,05 mM Ca'* (täytetty neliö).

51: Ca++:n vaiktuus VAC-3:n indusoimaan fosfolipaasi- aktiivisuuden inhibitioon. Inhibitio määritettiin seuraavissa konsentraatioissa: 6,6 um fosfolipidiä 1 mM (avoin ympyrä), 0,5 mM (täytetty ympyrä), 0,1 mM (avoin neliö) tai 0,05 mM Ca++ (täytetty neliö).

• 63 103892

Esimerkki O

Napanuoran verisuonista ja/tai istukasta eristetty ja puhdistetu materiaali puhdistettiin käänteisfaasi-HPLC:n avulla.

Stationäärifaasi: Bakerbond WR-RP 18, 4,6x250 mm, 5 um partikkelit, 300 A huokoset Liikkuva faasi A: 0,1 % trifluorietikkahappo vedessä, pH 2,2

Liikkuva faasi B: 0,1 % trifluorietikkahappo asetoninitriilissä Gradientti: 20-68% B 24 minuutissa

Virtaus: 1 ml/min.

Delektointi: uV, 214 nm Tämän puhdistusvaiheen jälkeen pilkottiin trypsiinillä kumpikin materiaali, joka kulloinkin oli ainut, jonka molekyylipaino oli 32.000.

Reaktion olosuhteet: 30 ug VAC istukasta ja 135 ui 0,15 M NH4HC03, pH 8,0 + 2 % w/w trypsiini (Worthington) . 6 tuntia 37°C:ssa + 2 % w/w trypsiini (Worthington), yön yli 37°C:ssa 30 ug VAC napanuorasta ja 100 ui 1 % NH4HC03, pH 8,0 . + 2 % w/w trypsiini (Worthington) « 6 tuntia 37°C:ssa + 2 % w/w trypsiini (Worthington), yön yli 37°C:ssa

Saadut kappaleet erotettiin HPLC:n avulla ja sekvenssoitiin Applied Biosystems-yhtiön kaasufaasisekvenssointilaitteella, 64 103892 tyyppi 470A, ohjelma 02 RPTH.

HPLC-erotuksen olosuhteet:

Stationääri faasi: uBondapak C18, 3,8x300 mm, 10 u partikkelit

Liikkuva faasi A: 0,1 % trifluorietikkahappo vedessä, pH 2,2

Liikkuva faasi B: 0,1 % trifluorietikkahappo aseto- nitriilissä

Gradientti: 0-55 % B 55 minuutissa

Virtaus: 1 ml/min.

Delektointi: UV, 214 nm (ylempi jälki) 280 nm (alempi jälki)

Trypsiinillä pilkkomisen jälkeen pilkottiin käänteisfaasi-HPLCslla puhdistettu materiaali myös BrCN:lla. Myös nämä pilkkomispeptidit sekvenssoitiin ja verrattiin trypsiini-käsittelystä saatujen peptidien arvoihin.

Pilkkominen BrCN:lla 111 ug RP-HPLC:lla puhdistettua VAC-proteiinia liuotettiin 111 ui:aan 70-prosenttista muurahaishappoa. Liuos sisälsi jo 250-kertaisen mooliylimäärän BrCN:a (90 ug). Inkubointi suoritettiin pimeässä 17 tunnin aikana huoneen lämpötilassa. Seos täytettiin 100 ui HPLC-erotukseen.

HPLC-kolonni: uBondapak C 18

Liikkuva faasi A: 0,1 % trifluorietikkahappo vedessä

Liikkuva faasi B: 0,1 % trifluorietikkahappo asetonit- riilissä

Gradientti: 0 - 70 % B 70 minuutissa

Virtaus: 1 ml/min.

Detektointi: UV, 214 ja 280 nm 65 103892 Näin saatujen tulosten vertailu sekä analyysi geelipermeaa-tio-HPLC:n ja SDS-geelielektroforeesin avulla vahvistavat istukasta saadun VAC-proteiinin ja napanuorasta saadun VAC-proteiinin identtisyyden.

Geelipermeaatio-HPLC:

Stationääri faasi: Waters 1-125, 7,8x600 mm, 10 um partikkelit

Liikkuva faasi: 0,5M Na2S04, 0,02 M

Na2P04, pH 7,0, 25 % propyleeniglykoli, 0,04 % Tween 20 Virtaus: 0,5 ml/min.

Detektointi: UV, 214 nm SDS-geelielektroforeesi SDS-geeli: 15 %

Geelin..vahvuys: 0,7 mm

Elektroforeesin olosuhteet: 20 mA/levy, 2-3 tunnin ajoaika Värjäys: Coomassie Blue

Koettimet: 8 ug VAC napanuorasta tai 7 ug VAC istukasta . Esimerkki 1

Ihmisistukan cDNA-kirjaston valmistaminen a) Kokonais-RNA:n eristäminen istukasta • ^ GT 5 M guanidinium-tiosyanaatti, 50 mM tris pH=7,4, 25 mM EDTA. Ennen käyttöä lisätään 8 % (v/v) bet-merkaptoetanolia. 20 ml GT:a jäähdytetään 5 -10 minuuttia ennen käyttöä jäillä, jolloin GT ei saa saostua.

66 103892

GH: 6 M guanidinium-hydrokloridi, 25 mM EDTA, 10 mM

beta merkaptoetanoli, pH=7,0. Jäähdytetään jäissä.

1 g syväpakastettua ja mekaanisesti jauhettua istukkaa 20 ml:ssa GT-seosta (0°C) sekoitetaan 20 sekuntia maksimaalisella nopeudella polytronin kanssa (Brinkmann). Määritetään homgenaatin tilavuus, kaadetaan 0,3 tilavuusosaan etanolia -(20°C), sekoitetaan ja sentrifugoidaan heti k/min. 5 minuutin ajan -10°C:ssa. (Beckman JA 21 sentri-fuugi, JS13.1 roottori). Mahdollinen proteiinikalvo sekä supernatantti poistetaan. Pellettiin lisätään 10 ml jääkylmää GH-seosta ja homogenisoidaan 10 sekuntia polytronilla. Suspensiota sentrifugoidaan 5 minuuttia -10°C:ssa ja 12000 k/min. Supernatantti siirretään steriiliin Corex-putkeen, pelletti heitetään pois. Supernatantti lisätään 0,025 tilavuusosaa 1 M etikkahappoa ja 0,75 tilavuusosaa kylmää etanolia (~20°C) ja sekoitetaan hyvin. Inkuboidaan noin 2 tuntia -20°C:ssa, minkä jälkeen sentrifugoidaan 10 minuuttia 6000 k/min. -20°C:ssa (JA20 roottori). Proteiinikalvo ja supernatantti poistetaan huolellisesti. Pellettiin lisätään 2 ml GH-seosta (0°C), pelletti suspendoidaan uudelleen ja suspensio siirretään 15 ml:n Corex-putkeen.

Vanha Corex-putki huuhdellaan vielä 8 ml:11a GH-seosta, liuos yhdistetään 2 ml:n kanssa. Tärkeää on, että koko pelletti on suspendoitu ja mahdollisesti käsitelty lievällä ultraäänikäsittelyllä. Lisätään 0,025 voi 1 M etikkahappoa ja 0,5 voi kylmää etanolia (-70°C) ja inkuboidaan noin 2 tuntia -20°C:ssa. Sentrifugointi (6000 k/min., 10 min., JA20 roottori), liuottaminen ja seostaminen toistetaan kaksi kertaa, jolloin GH-kokonaismäärä puolitetaan 5 ml:ksi. Viimeisen sentrifugoinnin jälkeen ei liuoksen päällä saa enää näkyä lainkaan proteiinikalvoa, muutoin tämä puhdistus-vaihe on poistettava. Pellettiä vorteksoidaan 2 minuuttia veden (0°C) kanssa, joka on käsitelty 5 ml:11a dietyyli-pyrokarbonaattia. Kirkas liuos dekantoidaan, mahdollisesti jäljelle jääneeseen pellettijäämään lisätään vielä kerran vettä ja vorteksoidaan, kunnes liuos on kirkas.

67 1 0 3 8 9 2

Lisätään 0,1 voi 3 M Na-asetaattia (pH=5,8), 2,5 voi etanolia ja inkuboidaan 1 tunti -70°C:ssa ja RNA erotetaan sentrifugoimalla 10 minuuttia 6000 k/min. 4°C:ssa. Liuottaminen ja saostaminen toistetaan vielä kerran. RNA säilytetään lopuksi etanolissa.

b) poly-A^-RNA:n eristäminen 0,5 mg oligo dT-selluloosaa (Collaborative Research, tyyppi 3, sitomiskapasiteetti: 5 mg poly-A+-RNA/g suspendoidaan sitomispuskuriin (200 mM NaCl, 0,2 % SDS, 10 mM Tris, pH=7,4, 1 mM EDTA). 1 ml tätä suspensiota pakataan pylvääseen ja pestään peräkkäin 10 ml:11a vettä, 10 ml:11a 0,1 N NaOH-liuosta, 10 ml:11a vettä ja lopuksi 10 ml:11a sitomis-puskuria. Kokonais-RNA pelletoidaan alkalisesta liuoksesta sentrifugoimalla (10 min., 6000 k/min., JA20 roottori).

Noin 10 mg RNA:ta liuotetaan 4,5 ml:aan vettä. Lisätään 50 yul 2 % SDS:a, minkä jälkeen liuosta kuumennetaan 3 minuuttia 70°C:ssa ja jäähdytetään välittömästi jäillä. Lisätään: 50 y.1 IM Tris (pH=7,4), 10 jal 0,5 M EDTA ja 200 jul 5 M NaCl, minkä jälkeen liuos viedään välittömästi pylvääseen. Pylväästä tippuva liuos viedään uudelleen pylvääseen. Tämä toimenpide toistetaan yhteensä kolme kertaa. Tämän jälkeen pylväs pestään 30 ml:11a sitomispus-. kuria. Sitoutunut RNA eluoidaan 5 ml:11a 0,2 % SDS:a.

Pylväs pestään 10 ml:11a vettä, 10 ml:11a 0,1 N NaOH-liuosta ja 10 ml: 11a vettä ja tasapainotetaan 10 ml: 11a sitomispuskuria. RNA-liuosta kuumennetaan vielä 3 minuuttia 70°C:ssa, jäähytetään nopeasti jäillä, lisätään: 50 ^il 1 M Tris pH=7,4, 10 μΐ 0,5 M EDTA ja 200 μΐ 5 M NaCl, . ja viedään pylvääseen. Läpikulkeva liuos viedään yhteensä kolme kertaa oligo-dT-pylvääseen. Pesun jälkeen RNA eluoidaan 30 ml:11a 0,2 % SDS:a.

RNA saostetaan lisäämällä 0,1 voi 3M Na-asetaattia, pH=5,6, ja 2,5 voi etanolia ja inkuboimalla -20°C:ssa (16 tuntia).

68 1 0 3 8 9 2 RNA erotetaan sentrifugoimalla (10.000 k/min,, 15 min., JA-20 roottori) ja liuotetaan veteen 1 ug/ul konsentraatioon.

c) Lambda-qtlO cDNA-kirjaston rakentaminen cDNA:n synteesi, sisäisten EcoRI-kohtien metylointi, EcoRI-linkkereiden laittaminen, jälkipilkkominen EcoRI:lla, lyhyiden DNA-fragmenttien erottaminen, liittäminen lambda-gTlO-haarojen kanssa ja ligitoidun DNA:n pakkaaminen in vitro suoritettiin Amersham'in cDNA-synteesisysteemillä RPN 1256) sekä cDNA:n kloonaussysteemillä lambda-gtlO (Amersham, RPN 1257). Mukana olleita työohjeita noudatettiin tarkkaan. Lähtemällä noin 3 ug:sta mRNA:ta saatiin g ' lopulta noin 0,5x10 lambada-gtlO rekombinanttifaagia.

Esimerkki 2 cDNA:n eristäminen a) Lambda-gtlO-kirjaston etsiminen oligonukleotideilla

Jotta cDNA-kirjastosta voitaisiin etsiä VAC-proteiinia koodaavat cDNA:t, syntetisoitiin kaksi trypsiinipeptidin P16/II sekvenssejä vastaavaa oligonukleotidiä ja yksi Staph-A-peptidi P20/I/6 vastaava oligonukleotidi (kuvio 1). Nämä nukleotidit ovat kulloinkin seos kaikista muunnelmista, jotka ottavat huomioon vastaavan mRNA:n kaikki koodausmahdollisuudet. EBI-386:11a, jonka ketjun pituus on 20 nukleotidiä, on 512 variaatiota ja se sopii Staph-A-pep-. tidiin P20/I/6. Jotta trypsiinipeptidin P16/II oligonukleo-tidillä voitaisiin variaatiot pitää vähäisempinä, synte-.* tisoitiin kaksi oligonukleotidiä (20-meriä): EBI-387: 128 variaatiota, EBI-388: 64 variaatiota.

Lisäksi syntetisoitiin trypsiini-VAC-peptidiin P30/I sopien kaksi oligonukleotidiä käyttämällä "Wobble"-asemissa emäksenä desoksi-inosiinia (kuvio 2): EBI-118 ja EBI-119.

69 103892 Tätä substituutiota ovat kuvanneet· E. Ohtsuka et ai., J. Biol. Chem. 260/5 (1985), ss. 2605-2608, sekä Y. Takashi et ai., Proc. nat. Acad. Sei. (1985) sivut 1931-1935.

Inosiini muodostaa hyvin parin sytosiinin kanssa, mutta häiritsee tuskin lainkaan kaksoiskierukan muodostumista, kun kumppaneiksi on tarjolla muita nukleotidejä.

Kulloinkin fosforyloitiin 60 pikomoolia kutakin oligonukleo-tidiä 60 pikomoolia Ua (AmeshalOi PB 218,

5000 ci/mmol) 30 ulissa liuosta käyttämällä 20 yksikköä T4 polynukleotidikinaasia. Liuos sisälsi: 70 mM Tris pH

7,5, 10 mM MgCl2 ja 5 mM DTT ja inkubointiaika oli 30 minuuttia. Reaktio pysäytetiin lisäämällä 30 mM EDTA:a ja kuumentamalla 5 minuuttia 70°C:ssa. Leimattu oligonukleotidi erotettiin sitoutumattomasta radioaktiivisuudesta pylväskromato-graafisesti Biogel P6DG:lla (Biorad). Oligonukleotidiä kohti sisään meni välillä 70 ja 110x10® cpm fosfori-32:a.

Kulloinkin 15 pikomoolia EBI-118 ja EBI-119 fosforyloitiin 32 90 jilrssa lisäämällä 45 pikomoolia gamma- P-ATP:a (Amersham, PB 218, >5000 Ci/mMol) käyttämällä 10 yksikköä T^-polynuk-leotidikinaasia, minkä jälkeen puhdistettiin P6DG:lla.

Sisään meni yhteensä 70x10® cpm fosfori-32:a.

E. coli C600 bakteereiden infektoimiseen käytettiin ihmis- istukan cDNA-kirjaston (lambda-gtl0-faagi) rekombinanttifaa- 6 geja noin 1,2x10 pfu-yksikköä (Plaque forming units).

13,5 cm petrimaljaa kohti maljattiin noin 50.000 faagia (LB, 10 mM MgSO^, 15 g/1 Bacto-Agar). Sen jälkeen, kun plakit olivat kasvaneet lähes yhtenäiseksi, valmistettiin ,· jokaisesta maljasta kaksi vedosta nitroselluloosasuodatti- mille (Schleicher und Schuell, BA 85) (T. Maniatis et ai.. Molecular Cloning, 1982, ss. 320-321). Suodattimia käsiteltiin 3x20 minuuttia TE:ssa 100°C:ssa ja tämän jälkeen pesetiin yön yli 65°C:ssa: 103892 70

Pesuliuos: 50 mM Tris pH=8 1 M NaCl 1 mM EDTA 0,1 % SDS

Sen jälkeen suodattimet esihybridisoitiin 4 tuntia 49°:ssa:

Esihybridisointiliuos:

6 x SSC

5 x Denhardt 0,1 % SDS

1 mM Na-pyrofosfaatti 50 mM NaH2P04 pH=6,5

100 um ATP

80 ug/ml denaturoitu sillinsperma-DNA

Hybridisointi suoritettiin samassa liuoksessa käyttämällä sama määrä leimattuja oligonukleotidejä. maljojen 1 -6 kaksoivedokset hybridisoitiin 49°C:ssa 16 tunnin ajan EBI-386:n kanssa ja maljojen 7-12 kaksoivedokset EBI-387:n ja EBI-388:n kanssa. Maljojen 13 - 24 vedokset hybridisi-tiin 37°C:ssa 16 tunnin ajan EBI-118:n ja EBI-119:n kanssa. Tapahtuneen hybridisoinnin jälkeen suodattimet huuhdeltiin kaksi kertaa 6x SSC / 0,01 % SDS:11a, pestiin 2 x 30 minuuttia huoneen lämpötilassa 6x SSC / 0,01 % SDS:11a ja 3 x 20 minuuttia samassa liuoksessa 49°C:ssa tai 37°C:ssa.

Ilmassa kuivaamisen jälkeen suodattimet valotettiin Kodak X-Omat 3-filmillä -70°C:ssa käyttämällä vahvistinfoliota.

Lambda-faagit, jotka molemmilla suodattimilla olivat hybri-‘ disoituneet oligonukleotidin kanssa, puhdistettin homo geenisuuteen asti käyttämällä samaa hybridisointiprotokol-laa.

EBI-386:n, -387:n ja -388:n kanssa suoritetusta hybridi-soinnista saatiin faagit lambada-Pll/3, lambda-P6/5, i « 71 103892 lambda-P6/6. Hybridisointi EBI-118:N ja -119:n kanssa tuotti faagit Iambda-Nrl5, Iambda-Nrl9 ja Iambda-Nr22.

b) cDNA-insertin eristäminen g E.coli C 600 infektoitiin 2,5 x 10 pfu (Plaque forming units)-faagilla ja maljattiin 6 ml:n kanssa tpagaroosia (0,7 % agaroosi, 10 mM MgSO^, LB) 13,5 cm agarmaljoille (LB, 10 mM MgSC>4, 1,5 % agaroosi, 0,2 % glukoosi). 5 1/2 tunnin jälkeen inkuboinnin jälkeen 37°C:ssa olivat plakit yhtenäisiä. Maljoja jäähdytettiin 30 minuuttia 4°C:ssa ja agaroosi päällystettiin 10 ml:11a lambda-laimenninta (10 mM Tris, pH=8, 10 mM MgSO^, 0,1 mMEDTA). Faageja eluoitiin yön yli 4°C:ssa varovasti ravistelemalla. Päällä oleva faagisuspensio (noin 8 ml) siirrettiin Corex-putkeen

ja sentrifugoitiin 10 minuuttia 15.000 k/min. (4°C, JA

21 sentrifuugi). Supernatantti dekantoitiin polykarbonaat- tiputkeen ja sentrifugoitiin 50.000 k/min. (20°C, L70

Beckman-sentrifuugi, 20°C, 50 Ti roottori), kunnes 2 10

omega t = 3x10 (noin 23 minuuttia). Sueprnatantin poistamisen jälkeen suspendoitiin pelletoidut faagit uudelleen 0,5 ml-.aan lambda-laimenninta ja siirrettiin eppendorf-putkeen. Suspensiosta poistettiin suspendoitumattomat hiukkaset sentrifugoimalla hetken aikaa ja supernatantti laitettiin uuteen putkeen. Lisättiin 10 μg/ml RNaseA

ja 1 pg/ml DNase I-entsyymejä, minkä jälkeen inkuboitiin / _ 30 minuuttia 37°C:ssa. Lisättiin: 25 mM EDTA, 25 mM Tris, pH=8, 0,2 % SDS, minkä jälkeen inkuboitiin 30 minuuttia 70°C:ssa. Seuraavaksi lisättiin 1 voi fenoli/kloroformia (1:1) ja proteiinit uutettiin kääntelemällä putkea ympäri. Sentrifugoitiin 2 minuuttia ja Eppendorf-sentrifuugissa, • minkä jälkeen vesifaasi uutettiin 1 voi kloroformilla (vain kääntelemällä, ei vorteksoimalla). Faasit erotettiin sentrifugoimalla, minkä jälkeen supernatanttiin lisättiin 1/20 voi 3 M Na-asetaattia ja 1 ml etanolia. Faagi-DNA saostui tällöin lankamaisena. Inkuboitiin 5 minuuttia 72 1 0 3 8 9 2 0°C:ssa, minkä jälkeen DNA erotettiin sentrifugoimalla (10 minuuttia). Pelletti pestiin kerran 70-prosenttisella etanolilla, kuivattiin ja liuotettiin yön yli 50 μΐ-.ssa TE-seosta (4°C).

DNA:t pilkottiin EcoRIrlla ja syntyneet fragmentit erotettiin 1-prosenttisella agaroosigeelillä. Lambda-Pll/3, lambda-P6/5 ja lambda-P6/6-kloonien cDNA-inserttien koot olivat noin 1300 - 1400 bp. Sekvenssianalyysi osoitti, että kaikki kolme kloonia olivat peräisin yhdestä ja samasta mRNA:sta. cDNA-paloissa ei kuitenkaan ollut mRNA:n 5'-päätä. Lambada-Nrl5, Iambda-Nrl9 ja lambda-Nr22-faagien inserttien pituudet olivat noin 1600, 1100 ja 1000 bp. Sekvenssianalyysin perusteella voitiin cDNA:n olettaa olevan lähes täydellinen. Kummankin faagiryhmän lambdaPll/3, lambda-P6/5 ja lambda-P6/6 sekä lambda-NR15, lambda-NR19 ja Iambda-Nr22 cDNA:t ovat peräisin kahdesta eri mRNA:sta, kuten seuraava sekvenssi-analyysi osoitti.

Kolmen lambda-Pll/3, lambda-P6/5 ja lambda-P6/6-kloonin EcoRI-insertit eristettiin ja liitettiin EcoRI-pilkottuihin Bluescribe M13+-vektoreihin (Vector Cloning Systems, 3770 Tansy Street, san Diego, A 92121, USA). Saaduille klooneille annettiin nimeksi pP6/5, pP6/6 ja pPll/3.

*. Kolmen Iambda-Nrl5, Iambda-Nrl9 ja lambda-Nr22-kloonin

EcoRI-insertit eristettiin ja liitettiin EcoRI-pilkottuihin Bluescribe Ml3+-vektoreihin. Saaduille klooneille annettiin nimeksi pRH201, pRH202 ja pRH203.

c) Muita VAC-cDNA-klooneja

Jotta voitaisiin saada muita cDNA-klooneja, tutkittiin vielä kerran ihmisistukan lambda-gtlO-kirjasto, tällä kertaa käyttämällä koettimina pPll/3:n EcoRI-inserttiä.

73 103892 Tämä DNA-fragmentti leimattiin radioaktiivisesti Nick-translatoimalla (T.Maniatis, Molecular Cloning, 1982, ss. 109-112, mitään DNase I-entsyymia ei käytetty). Kahdeksalla maljalla tutkittiin yhteensä 4x10^ faagia. Nitroselluloosasuo-dattimet käsiteltiin artikkelissa: T.Maniatis, Molecular Cloning, 1982, ss. 320-321, kuvatulla tavalla. Hybridisointi-liuos sisälsi: 6xSSC, 5x Denhardt'in liuos, 0,1 % SDS sekä 20xl06 cpm pPll/3. Hybridisointi kesti 16 tuntia 65°C:ssa. Tämän jälkeen suodattimet pestiin 3x10 minuuttia huoneen lämpötilassa 6xSSC/0,01 % SDS-seoksella ja 3x45 minuuttia 65°C:ssa 0,2xSSC-seoksella. Positiivisesti reagoivia klooneja saatiin yhteensä 69 (lambda-VACl -lambda-VAC69).

12 näistä klooneista preparoitiin edellä kuvatulla tavalla pienessä mitassa, cDNA-insertit vapautettiin Eco Rl :11a ja erotettiin 1-prosenttisella agaroosigeelillä. Tällöin osoittautui, että lambda-VAClO-kloonin insertti sisälsi koko VAC-proteiinia koodaavan lukukehyksen.

Esimerkki 3 VAC-alfaa ja VAC-betaa koodaavien cDNA.-idien karakterisointi a) Northern Blot-koe 2 ug poly-A+ RNA:ta lisättiin 5 ui vettä, 16 ui formamidia, 6 ui formaldehydiä ja 3 μΐ 0,1 M natriumhydroksidia, liuosta inkuboitiin 10 minuuttia 68°C:ssa ja tämän jälkeen jäähdytettiin jäissä. Lisättiin 5 ui väriliuosta (kulloinkin * 0,4 % bromifenolisinistä ja ksyleenisyanolia 50-prosent- tisessa glyseriinissä, 1 mM EDTA), minkä jälkeen RNA erotettiin formamidi-agaroOsigeelillä (1,5 % agaroosi, 10 mM Na-fosfaatti pH=7,6, 1 mM EDTA, 5 mM Na-asetaatti, 6 % formaldehydi, elektroforeesi 100 V, 3 tuntia, ajopuskuri . sama kuin geelipuskuri, ilman formaldehydiä). Vertailukoh- 74 103892 tana oli mukana kokonais-RNA. Nämä jäljet erotettiin elektroforeesin avulla ja värjättiin EtBr:lla, jotta voitaisiin määrittää 28 ja 8 S rNA:n asemat. Loput geelistä pestiin kaksi kertaa 10 minuutin ajan lOxSSC-liuoksessa ja RNA siirrettiin 10xSSC:lla nitroselluloosasuodattimelle. Suodatin pestiin 2xSSC:lla, kuivattiin ja paistettiin kaksi tuntia tyhjössä 80°C:ssa. Kulloinkin leimattiin radioaktiivisesti 1 ug pPll/3:a ja pRH203:a Multiprime DNA-leimaussysteemillä (Amersham, RPN 1601). Nitrosellu-loosasuodatin esihybridisoitiin 2 tunnin ajan 65°C:ssa 6xSSC/5x Denhardt'in liuos/0,1 % SDS-seoksessa. Kulloinkin hybridisoitiin yksi jälki 180x10^ cpm pPll/3:n tai pRH203:n kanssa (16 tuntia 65°C). Suodattimet pestiin kaksi kertaa 30 minuuttia huoneen lämpötilassa 6xSSC/0,01 % SDS-seoksella ja kaksi kertaa 30 minuuttia 65°C:ssa 0,2xSSC/0,01 % SDS-seoksella, kuivattiin ja valotettiin Kodak X-Omat S-filmillä käyttämällä vahvistusfoliota.

Tulos on esitetty kuviossa 3. pPll/3-kloonin cDNA hybridi-soituu noin 1700 emäksen suuruiseen mRNA:an ("VAC-alfa"), ja pRH203-kloonin cDNA noin 2200 emäksen suuruiseen mRNA:an ("VAC-beta").

Koska ensiksikin käytetty radioaktiivisuusmäärä sekä mRNA-määrä jälkeä kohti olivat suurin piirtein yhtä suuret * ja toiseksi, koska genomi-Blot'in hybridisointi samassa liuoksessa antoi kummallakin cDNA:11a intensiteetiltään yhtä suuret vyöhykkeet (kts. jäljempänä), voidaan päätellä, että lyhyempää mRNA-lajia ("VAC-alfa") on istukassa suurempi määrä kuin pidempää ("VAC-beta") mRNA-lajia.

* b) VAC-alfa-cDNA:n sekvenssianalyysi

Kloonien pP6/5, pP6/6 ja pPll/3 cDNA:t sekvenssoitiin totaalisesti sekä lambda-VACl - -12-kloonien cDNA:t osittain. Tulos on esiettty kuviossa 4. Yhteensä sekvenssoitiin 1465 emästä. cDNA:11a on pitkä, avoin lukukehys, joka * voi koodata 320 aminohappoa. Jos DNA-sekvenssi käännetään 75 1 0 3 8 9 2 aminohapposekvenssiksi, voidaan kaikki sekvenssoidut peptidit tässä sekvenssissä laittaa alekkain (kuvio 5).

Nämä cDNA:t ovat siten cDNA-molekyylejä, joiden vastaavat mRNA:t koodaavat VAC-proteiinia. Koska toisen eristetyn cDNA:n sekvenssit (kts. jäljempänä) koodaavat samankaltaista, mutta VAC-proteiinista eroavaa proteiinia, käytetään tässä yhteydessä nimitystä VAC-alfa.

Ennen ensimmäistä ATG-kodonia (emäkset 35-37) on samassa lukukehyksessä pysäytyskodoni. Emäkset 30 - 38 täyttävät melko hyvin Kozakregel'in säännön (M. Kozak, Nature 308 (1984), s. 241-246), joka antaa translaation aloituskodonin läheisyydessä konsenssussekvenssiksi CC(A/G)CCAUGG, jota vastaava sekvenssi on tässä TCGCTATGG. 3'-translatoimaton alue on 471 emästä pitkä. 15 emästä ennen poly-A-palan alkua on polyadenylointisekvenssi AATAAA (N.J. Proudfoot et ai., Nature 263 (1976), s. 211-214). Jos mRNA:n poly-A-palan ketjunpituudeksi lasketaan 150 - 200 emästä, on mRNA:n kokonaispituus cDNA-sekvenssinä 1600 - 1650 emästä.

Koska Northern Blot-kokeessa määritetty arvo oli korkeampi, 5'-translatoimaton alue ei ole täydellisesti mukana missään cDNA:ssa.

Vastoin kaikkia muita cDNA-klooneja on kloonin pP6/5 cDNA:ssa paikassa 100 A:n asemesta C. Tämä muuttaisi .* tripletin 98-100 (22. kodoni) GAAista GAC:ksi, jolloin tripletti koodaisi aminohappoa Asp Glu:n asemesta. Tähän poikkeamaan voi olla useita syitä: a) käänteistranskriptaasi rakensi väärän nukleotidin, b) kysymys on kahden alleellisen, tässä kohdassa erilaisen geenin transkriptista tai c) kyseessä on kaksi ei-alleellista geeniä, jotka eroavat toisistaan tässä paikassa.

Pitkä, avoin lukukehys koodaa 320 aminohapon proteiinia, josta Met-1 todennäköisesti lohkeaa pois ja jossa seuraava alaniini blokataan aminoryhmässä, mahdollisesti asyloimalla. Laskettu molekyylipaino on 35.896 D, mikä on suurempi 76 103892 kuin SDS-PAGE:lla saatu arvo. Varautuneiden aminohappojen (Asp, Glu, Lys, Arg, His) osuus 30,6 % (98/320) on tosin keskimääräistä korkeampi verrattuna keskimääräiseen arvoon 25,1 %. Tämä selvittäisi proteiinin muuttuneen kulkeutumisen SDS-PAGE:ssa. Voimakkaasti varautuneista aminohapoista on suurempi osa, 54, happamia aminohappoja Asp ja Glu) emäksisiin aminohappoihin (Lys ja Arg), 41, verrattuna.

Tämä selittää VAC-alfa-proteiinin happamen, isoelektrisen pisteen (pl=4,4 - 4,8). VAC-alfassa on vain yksi kysteiiniä koodaava cripletti (aminohapon paikka 316); mukana ei ole tyypillistä N-glykolysoitumiskohtaa (Asn-XX-Ser/Thr). Aminohapposekvenssin rakenneanalyysin (Pustell, J et ai., Nucleic Acids Res. 10 (1982) s. 4765-4782, modifioitu) perusteella 67 aminohapon pituinen sekvenssi toistuu neljä kertaa (kuvio 6). Jäljempänä tästä käytetään nimitystä "toistot". Tässä sekvenssissä on 7 aminohappoa (10,4 %) säilynyt kaikissa neljässä toistossa, 15 aminohappoa (22,4 %) esiintyy neljästä toistosta kolmessa 28 paikassa (41,8 %) sisältää kulloinkin kaksi toistoa saman aminohapon.

Vertailu julkaistuihin kirjallisuustietoihin (M.J. Geisow, FEBS Letters 203 (1986), s. 99-103, M.J. Geisow et ai., TIBS 11 (1986), s. 420-423) osoitti yllättäen, että VAC-alfa täten kuuluu Ca++:sta riippuvien fosfolipidejä sitovien proteiinien suurempaan ryhmään. On kuvatttu konsenssus-sekvenssi (Lys-Gly-fob-Gly-Thr-Asp-Glu-var-var-leu-Ile-fil-Ile-Leu-Ala-fob-Arg; fob=hydrofobi, fil=hydrofiili, var=muuttuva), joka saattaisi ottaa osaa Ca++:n sitomiseen (M.J.Geisow et ai., Nature 320 (1986), s. 636-638). Tämä sekvenssi on keksinnön mukaisten proteiinien jokaisessa neljässä toistuvassa 67 aminohapon pituisessa alasekvenssissä ·. (kuvio 6). Silmiinpistävä on myös jokaisen toiston päässä oleva 6 aminohapon pituinen pala, joka muodostuu lähes yksinomaan hydrofobisista aminohapoista ("oooooo" kuviossa 6) .

77 103892 c) VAC-beta cDNA:n sekvenssianalyysi

Kloonien Nrl5, Nrl9 ja Nr22 VAC-beta cDNA-sekvenssin pituus on 1940 bp ja sekvenssi muuttuu poly-A-palaksi (kuvio 7). Polyadenylointisignaali AATAAA on 16 emästä ennen poly-A-palaa. Tämä konsensussekvenssi on tosin jo nukleotidipaikoissa 1704 - 1709. Minkä vuoksi tätä sekvenssiä ei käytetä polyadenylointisignaalina, ei tiedetä. Lisäksi tarvittava sekvenssi AATAAA-sekvenssin 3'-puolella, YGTGTTYY (Gill A. et ai.. Nature 312 (1984), s. 473-474) esiintyy vasta suhteellisen kaukana (TGTGTTAT, paikat 1735-1742); mahdollisesti tämä on selitys sille, että tätä ensimmäistä polyadenylaatiosekvenssiä ei hyväksytä.

cDNA sisältää pitkän, avoimen lukukehyksen, joka ulottuu cDNA:n alusta paikkaan 1087. Se pystyisi koodaamaan 362 aminohappoa. Analogisyistä VAC-alfan kanssa ja johtuen siitä seikasta, että VAC:n puhdistuksessa saadaan 34.000 D proteiini (kts. E.P.A. 181.465), oletettiin ensimmäinen metioniinikodoni (ATG, paikat 107-109) translaation aloitus-kohdaksi. Kozakregel'in sääntö ei ole tässä yhtä hyvin täytetty kuin VAC-alfalla (AAGAGATGG paikoissa 102-110).

Saadun proteiinin (VAC-beta) pituus olisi 327 aminohappoa. Siinä on 4 kysteiiniryhmää (aminohappopaikat 161, 206, 250 ja 293) ja yksi potentiaalinen N-glykolysaatiokohta (Asn-Lys-Ser, aminohappopaikat 225-227). Laskettu molekyy-lipaino on 36.837 (kuvio 9). Myös VAC-betassa on keskkmää-räistä enemmän varautuneita ryhmiä: 97/327 (29,6 %), jolloin happamia aminohappoja (Asp+Glu: 49) on enemmän kuin emäksisiä (Lys+Arg 42); tämä selittää SDS-PAGE:lla ; saadun alhaisemman molekyylipainon.

Myös VAC-betassa toistuu 67 aminohapon pituinen sekvenssi (kuvio 8). Tämän sekvenssin sisällä on säilynyt 7 aminohappoa (10,4 %) kaikissa neljässä toistossa. 17 aminohappoa (25,4 %) esiintyy neljästä toistosta kolmessa ja 25 paikassa (37,7 %) on kulloinkin kaksi saman aminohapon toistoa.

78 103892

Myös VAC-beta sopii hyvin yhteen 17 aminohapon pituisen konsensussekvenssin kanssa. VAC-alfaa koskevat tiedot sopivat analogisesti myös VAC-betalle.

d) Genomin Southernblot-analyysi

Ihmisistukan kromosomaalisen DNA:n analyysi Southern-menetelmällä antaa monimutkaisen kuvan. DNA pilkottiin EcoRIt, Hindlll-, BamHI- ja Pstl-entsyymeillä. Nitrosel-luloosalla transformoitu DNA hybridisoitiin sekä VAC-alfa DNA:n (pPll/3) että VAC-beta DNA:n (pRH203) kanssa. Suodattimet pestiin stringenteissä olosuhteissa (kts. kohta a)), so. 0,2xSSC-liuoksella ja 65°C:ssa. Tästä huolimatta saatiin jokaisessa hajotuksessa suhteellisen useita vyöhykkeitä (kuvio 10). Kummankin Blot-kuvion vertailu osoittaa, että VAC-alfa ja -beta cDNA:n risti-reaktio on näissä olosuhteissa mahdotontakin. Vyöhykkeiden suuren määrän selityksenä on joko VAC-alfa tai VAC-betageenin kanssa kulloinkin samankaltaisten geenien olemassaolo, tai kysymys on kulloinkin geenistä, jonka moni ja/tai pitkä introni katkaisee.

Esimerkki 4 ,· Proteiinianalyysit

Kuviossa 11 on jälleen verrattu VAC-alfan aminohapposekvenssejä VAC-betaan. Toistuvat rakenteet voidaan järjestää kummassakin proteiinissa samalla tavoin. Myös sitoutumispep-tidit ovat yhtä pitkät lukuunottamatta toisen ja kolmannen . toiston välisiä. Tähän sitomispeptidiin on VAC-alfalle jätetty aukko, jotta olisi mahdollista sovittaa optimaalisesti kummatkin sekvenssit. Kummankin proteiinin N-terminaalinen peptidi on eripituinen, VAC-alfalla 19 aminohappoa ja VAC-betalla 25 aminohappoa. Tällä peptidillä on myös alhaisin homologia. Kummatkin proteiinit ovat identtisiä aminohappopaikoissa 176 - 320, mikä 79 103892 vastaa 55,0 % homologisuusastetta.

Tässä kohdassa verrattakoon myös VAC-alfa- ja -beta cDNA-molekyylien nukleotidisekvenssejä. Jos verrataan keskenään kahta geeniä ja niiden tuotteita, havaitaan DNA (=RNA)-tasoilla suurempi homologia kuin aminohappo-tasolla, minkä selittää se seikka, että nukleiinihapossa riittää uuden aminohapon koodaamiseen jo yksi muutos emästripletissä.

Kuviossa 12 on jälleen verrattu VAC-alfa ja VAC-beta cDNA-molekyylien koodaavia alueita. DNA-molekyyleillä on yllättäen vain 54,2 % homologisuusaste, so. hieman pienempi kuin kummallakin proteiinilla.

Kuviossa 13 on annettu kummankin proteiinin hydrofiili-syysprofiilit. Tällöin käytettiin Hopp'in ja Wood'in algoritmiä (t.P.Hopp et ai., Proc.Natl.Acad.Sei. 78 (1981) s. 3824-3828). Neljä toistoaluetta on osoitettu vaakaviivoilla, joiden alapuolella annetussa sekvenssissä on yhdyspeptidit kehystetty. Tällöin pistää silmään, että toisen ja kolmannen toiston sidospeptidi on erityisen hydrofiilinen. Tässä peptidissä on sekä VAC-alfalla että VAC-betalla arginiini identtisessä kohdassa. Siten olisi mahdollista, että spesifisyydeltää trypsiinimäinen proteaasi vaikuttaa ensisijaisesti tähän arginiiniin. Tällöin molekyylin täytyisi hajota kahteen suurin piirtein yhtä suureen puoliskoon. Ajateltavissa on, että jo tällaisella "puolimolekyylillä" on biologinen, esimerkiksi antikoaguloiva vaikutus. Toisaalta voisi ehkä tämän arginiinin vaihtaminen esimerkiksi histidiiniin antaa VAC-proteiineille paremman stabiilisuuden.

Kuviosta 13 voidaan edelleen havaita, että ei VAC-alfalla eikä VAC-betalla ole pidempää, hydrofobista aluetta, joka joko sallisi proteiinien erittymisen ; membraanin läpi tai niiden varastoitumisen membraaniin.

80 1 0 3 8 9 2

Sen vuoksi voidaan olettaa, että VAC-alfa ja VAC-beta ovat solunsisäisiä proteiineja.

Wallner et ai (Nature 320 (1986, s. 77-81) on kuvannut ihmis-lipokortiinin I rakenteen, Saris et ai. (Cell 46 (1986), s. 201-212) ja Huang et ai. (Cell 46 (1986), s. 191-199) hiiren tai ihmisen kalpaktiini I:n, josta käytetään myös nimitystä lipokortiini II, rakenteen.

Nämä proteiinit kuuluvat myös Ca++:sta riippuvien fosfolipidejä sitovien proteiinien luokkaan. Niiden rakenne voidaan kuvata analogisesti VAC-alfa ja -beta-proteiinien kanssa (kuvio 14). VAC-alfan ja VAC-betan väliset homologiat ovat kuitenkin selvempiä kuin VAC-proteiinien ja lipokortiinin: VAC-alfa - VAC-beta : 55,0 % VAC-alfa - lipokortiini I : 41,9 % VAC-alfa - lipokortiini II : 43,8 % VAC-beta - lipokortiini I : 41,7 % VAC-beta - lipokortiini II : 44,6 %

Sen vuoksi on oletettavissa, että myös lipokortiineilla on analogisen rakenteensa vuoksi antikoaguloivia ominaisuuksia, ja että niitä voidaan sen vuoksi käyttää antikoa-gulantteina. Eedelleen voidaan olettaa, että tämä on • Ca++:sta riippuvien fosfolipidejä sitovien proteiinien luokan yleisominaisuus.

Monet Ca++:sta riippuvien fosfolipidisideproteiinien jäsenet sitoutuvat puhdistettuihin eritysvesikkeleihin tai muihin solurungon komponentteihin (kts. R.H.Kretsinger • et ai., Nature 320 (1986), s. 573 koostumuksen osalta). Erittymisessä vesikkelit kapseloituvat irti solujen Golgi-laitteesta, kulkevat solumembraanille ja fuusioituvat sen kanssa. Tällöin vesikkelin sisältö vapautuu soluista. Lihasten supistumisen stimuloinnin kytkeytymisen kanssa analogisesti on ehdotettu (W.W.Douglas, Br.J.Pharmac.

81 103892 34 (1968), 451), että myös ärsyke ja erittyminen on kytkeytynyt CA++:n kautta. Tällöin voisi Ca++:sta riippuvilla fosfolipidejä sitovilla proteiineilla olla tärkeä osuus. VAC-alfalla on jokaisen toiston säilyneessä, 17 aminohapon pituisessa alueessa 5-6 hydroksyyliryhmä-pitoista aminohappoa (Asp, Glu, Thr, Ser), joista kulloinkin kolme on identtisessä paikassa. VAC-betalla on jokaisessa toistossa näitä aminohappoja neljä. Vaikkakaan näillä ei ole proteiineja, joilla on kalmoduliinilla, troponiini C:lla, S-100:lla ja parvalbumiinilla havaittua EF-Hand-rakennetta (R.H.Kretsinger et ai., CRC Crit.

Rev. Biochem. 8 (1980), s.119), jotka näissä molekyyleissä vastaavat Ca++:n sitomisesta, voidaan tämän osakappaleen säilymisestä jokaisessa toistossa vetää se johtopäätös, että tämä alue vastaa Ca++:n sitomisesta.

Tällä alueella tapahtuvien pistemutaatioiden avulla yritettiin muuttaa VAC-proteiinien biologista aktiivisuutta.

Esimerkki 5 VAC-alfan ekspressio E.coli'ssa a) pRH284T: Ekspressiovektori, jossa on alkalinen fosfa-taasireseptor ja terminaattori E. coli'n geeni alkaliselle fosfataasille (PhoA) on voimakkaan säätelyn alainen. Fosfaatin läsnäollessa geeni kytkeytyy täysin pois ja geeni ekspressoituu, kun alustassa on fosfaattia. H. Shuttleworth et ai.,

Nucleic Acids Res. 14 (1986), s. 8689 sekä C.N.Chang et ai., Gene 44 (1986), s. 121-125 ovat kuvanneet tämän geenin nukleotidisekvenssin.

PhoA-geenin promoottorialue koottiin useasta oligo-nukleotidistä ja laitettiin EcoRI-Clal-pilkottuun plasmidiin pAT153. Xhol-kohta laitettiin ennen ribosomaa- 82 1 0 3 8 9 2 lista sitoutumiskohtaa. Alkuperäinen EcoRI-kohta tuhoutuu synteettisen DNA-fragmentin ligatoinnissa. Ribosomaalisen sitoutumiskohdan jälkeen laitettiin translaation aloitus-ATG, jonka G on Sacl (=SstI)-kohdan ensimmäinen nukleotidi. Ekspressiovektori voidaan linearisoida tässä kohdassa katkaisemalla Sacl:11a ja 3' ylipitkä pää voidaan muuntaa tylpäksi pääksi käsittelemällä DNA-polymeraasi I - Klenow'in fragmentilla dGTP:n läsnäollessa. Tällä tavoin voidaan jokainen mielivaltainen geeni liittää tähän kohtaan.

Oikeaa ekspressiota varten sen on alettava koodaavan alueen ensimmäisellä emäksellä.

pAT-osan HindIII-SalI-fragmentti poistettiin ja korvattiin alkalisen fosfataasin transkription terminaattorilla. Alkuperäinen Sali-kohta tuhottiin. Tätä varten se laitettiin uudelleen ennen terminaattoria yhdessä myös pAT153:sta deletoidun BamHI-kohdan kanssa. Synteettisesti valmistetun DNA:n sekvenssi on kuvattu kuviossa 15.

b) Ekspressioklooni pRH291 cDNA-klooni pP6/5 pilkottiin BglII:lla ja Pstl:lla ja eristettiin 980 bp pitkä fragmentti, joka koodaa pääosaa ja sisältää noin 200 bp 3' translatoimattoman alueen. Koodaavan alueen puuttuva 5'-pää korvattiin oligonukleo-: tidien avulla. Tällöin liitettiin kahden mutaation avulla (GGC -> GGT, Gly-7 ja ACT -> ACC, Thr-8) samanaikaisesti Kpnl-katkaisukohta VAC-cDNA:an. Nämä oligonukleotidit näyttivät seuraavilta: 83 103892 IEBI-678 ||EBI-677 5' GCACAGGTTCTCAGAGGTACCGTGACTGACTTCCCTGGATTTGATGAGCGGGCT 3 * \ » * CGTGTCCAAGAGTCTCCATGGCACTGACTGAAGGGACCTAAACTACTCGCCCGA | EBI-680||

GATGCAGAAACTCTTCGGAAGGCTAIGAAAQGCTTGGGCACAGATGAGGAGAGC

CTACGTCTTTGAGAAGCCTTCCGATACTTTCCGAACCCGTGTCTACTCCTCTCG

EBI- | |EBI-682 | ATCCTGACTCTGTTGACATCCCGAAGTAATGCTCAGCGCCAGGAAATCTCTGCA 3' TAGGACTGAGACAACTGTAGGGCTTCATTACGAGTCGCGGTCCTTTAGAG 5' 679 j | EBI-6811

Oligonukelotidi EBI-680, -677, -678 ja -682 fosforyloitiin 5'-päässä. Oligonukleotideja EBI-678 ja -680, EBI-677 ja -679 sekä EBI-682 ja -681 kuumennettiin parittain 100°C:ssa ja jäähdytettiin hitaasti (kulloinkin 100 pikomoolia 20 yul:ssa). Kaksisäikeiset oligonukleotidit yhdistettiin ja ligatoitiin. pRH284T linearisoitiin SacI:11a, 3'-ylipitkä pää lyhennettiin tylpäksi pääksi käsittelemällä DNA-polyme-raasi I/Klenow'in fragmentilla dGTP:n läsnäollessa ja jälki pilkottiin BamHI:lla. 15 jil:ssa liuosta ligatoitiin 30 ng vektoria, 200 ng cDNA:ta ja 250 nanomoolia oligo-' : nukleotidejä. Kompetentit E.coli HBlOl-solut transformoitiin ligaasijuoksulla. Saadulle kloonille annettiin nimeksi pRH291 (kuvio 16).

Esimerkki 6 • VAC-betan ekspressio E.coli'ssa a) Ekspressioklooni pRH212

Ekspressiovektorina käytettiin plasmidia pER103 (E. Rastl-Dworkin et ai., Gene 21 (1983), 237-248). Vektori lineari- 84 103892 soitiin HindIII:lla. 5'-ylipitkä pää täytettiin osittain dATP:lla ja DNA-polymeraasi I/Klenow'in fragmentilla ja jäljelle jäänyt yksisäikeinen osa pilkottiin Sl-nukleaa-silla. Vektori pilkottiin BamHI:lla ja suuri fragmentti eristettiin (kuvio 17). Kloonista pRH203 eristettiin 440 bp pitkä MaeIII-BamHI-fragmentti, joka sisältää kodonit 13 - 157. Puuttuva 5'-pää täydennettiin oligonukleoti-deillä: EB1-307 5· CCATGGCTTGGTGGAAAGCTTGGATCGAACAGGAAGGT 3' 3· GGTACCGAACCACCTTTCGAACCTAGCTTGTCCTTCCACAGTG 5' EBI-306 Tällöin käytettiin E.coli'lle optimaalista kodonia 8esim.

R.Grantham et ai., Nucleic Acids Res. 8 (1980), 1893-1912). Tämä kodonin vaihto johti uuteen Hindlll-kohtaan kodonissa 5-7. Oligonukleoitidi EBI-306 fosforyloitiin, hybridisoitiin EBI-307:n kanssa ja ligatoitiin VAC-beta-fragmentin kanssa. BamHIrlla pilkkomisen jälkeen ligatoitiin 5'terminaalinen VAC-fragmentti valmistettuun pER103-vektoriin. Muodostuneelle kloonille annettiin nimeksi pRH211. VAC-betaa koodaavan alueen täydentämistä varten eristettiin kloonista pRH201 1230 bp pitkä BamHI-SphI-fragmentti. Plasmidista pRH201 poistettiin noin 200 bp pitkä pBR322-pala BamHI-Sphl ja korvattiin vastaavalla VAC-cDNA-osalla. Saatiin klooni pRH212. EcoRI-BamHI-fragmentti, joka sisältää Trp-promoottorin (S.marcescens), ribosomaalisen sitoutumis-. kohan ja synteettisesti valmistetun VAC-beta-geenin alun, tutkittiin sekvenssoimalla.

b) VAC-betan ekspressointi (pRH212)

Plasmidikoodattu VAC-beta osoitettiin maksisolusysteemissä (A.Sancar et ai., J. Bacteriol. 137 (1979), s. 692-693).

85 1 0 3 8 9 2 E.coli CSR603 (F~, thr-1, leuB6, proA2, phr-1, recAl, argE3, thi-1, uvrA6, ara-14, lacYl, galK2, xyl-5, mtl-1, gyrA98 (nalA98), rpsL31, tsx-33, lambda , supE44) transformoitiin pRH212:lla ja kasvatettiin 37°C:ssa tiheyteen OD500 ast^·· 20 ml viljelmää avoimessa petrimaljassa säteily-tettiin 50 cm etäisyydeltä 5 sekunnin ajan UV-termisidlam-pulla (15W) ja tämän jälkeen inkuboitiin vielä 1 tunti. Viljeämään lisättiin 100 ug D-sykloseriiniä. 16 tunnin jälkeen bakteerit erotettiin sentrifugoimalla, pestiin kaksi kertaa Hershey'n suolaliuoksella (5,4 g/1 NaCl, 3.0 g/1 KC1, 1,1 g/1 NH4C1, 15 mg/1 CaCl2x2H20, 0,2 g/1 MgCl2x6H20, 0,2 mg/1 FeCl2x6H20, 87 mg/1 KH2P04, 12,1 g/1 Tris pH=7,4), suspendoitiin uudelleen 5 ml:aan Hershey'n alustaa (100 ml kohti Hershey'n suolat: 2,0 ml 20 % glukoosi, 0,5 ml 2 % treoniini, 1,0 ml 1 % leusiini, 1.0 ml 2 % prliini, 1,0 ml 2 % arginiini, 0,1 ml 0,1 % tiamiini-HC1 ja inkuboitiin 2 tuntia 20 ug/ml indoliakryy- lihapon kanssa. Plasmidikoodatut proteiinit leimattiin 35 radioaktiivisesti lisäämällä 5 uCi/ml S-metioniinia ja inkuboimalla edelleen 37°C:ssa (1 tunti). Bakteerit erotettiin sentrifugoimalla ja otettiin 200 ui:aan SDS-koetinpuskuria (Lämmli-Gel System, esim. L.G.Davies et ai., Methods in Molecular Biology (1986) s. 306-310). Leimatut tuotteet erotettiin 15-prosenttisella .· akryyliamidigeelillä. Geeli kuivattiin ja valotettiin

Kodax X-Omat S-filmillä. Referenssinä mukana kulki puhdistettua VAC-alfa-proteiinia. Näkyväksiteko tapahtui värjäämällä. VAC-alfa kulki hieman nopeammin kuin pRH212-koodaattu VAC-beta, mikä oli odotettavissa myös molekyyli-painon perusteella. VAC-betan ekspressiota voidaan myös stimuloida lisäämällä indoliakryylihappo-induktoria (kuvio 18).

c) Ekspressioklooni PRH292

Ekspressiovektori pRH284T linearisoitiin Saclrlla ja 3'-ylipitkät päät muunnettiin tylpiksi päiksi DNA- 86 1 0 3 8 9 2 polymeraasi I/Klenow'in fragmentilla ja dGTP:lla. Vektori pilkottiin Sali:11a ja eristettiin suuri fragmentti.

Kloonin pRH212 Hindlll-Sall-insertti eristettiin. 0,2 pikomoolia oligonukleotidiparia 5’ GCTTGGTGGAA 3' EB1-684 3' CGAACCACCTTTCGA 5’ EBI-685 ligatoitiin 0,2 pikomoolin kanssa VAC-beta-inserttiä ja 0,015 pikomoolin kanssa valmistettua pRH284T-vektoria. E.coli HB101 transformoitiin ligaasiliuoksella. Saadulle kloonille annettiin nimeksi pRH292 (kuvio 18).

Esimerkki 7 VAC-alfan ja VAC-betan ekspression osoittaminen E.colissa a) Kloonien HB101/pRH291 ja HB101/pRH292 kasvattaminen

Alustat: 1) Esiviljelmä 10 g/1 Tryptoni 5 g/1 Hiivauute 4 g/1 Glukoosi 9 g/1 Na2HP04.2H20 1 g/1 KC1 1 ml/1 IM MgS04.7H20 100 mg/1 Ampisilliini

Alku-pH =7,2 2) Pääviljelmä 0,68 g/1 (NH4)2HP04 0,62 g/1 K2HP04.3H20 2,33 g/1 KC1 « 103892 0,5 g/1 NaCl 0,53 g/1 NH4C1 1,23 g/1 MgS04.7H20 0,011 g/1 CaCl2 10 mg/1 Tiamiini.HCl 3,92 mg/1 (NH4)2Fe(S04)2.6H20 0,72 mg/1 A1C13.6H20 0,71 mg/1 CoC12.6H20 1,5 mg/1 KCr(S04)2.12H20 0,75 mg/1 CuS04.5H20 0,19 mg/1 H^BO^ 0,51 mg/1 MnS04.H20 0,79 mg/1 NiS04.6H20 0,73 mg/1 Na2Mo04.2H20 0,86 mg/1 ZnS04.7H20 21 g/1 Kaseiinihydrolysaatti (Merck Art.^ 2238) 25 g/1 Kaseiinihydrolysaatti (Sigma C9386) 100 mg/1 Kysteiini 2 g/1 Hiivauute 1 g/1 Si t ruunahappo 11 g/1 Glukoosi.H20 (alussa tai syöttö) 700 ml esiviljelyalustaa siirrostettiin ekspressiokloo-nilla ja inkuboitiin 12 - 15 tuntia 37°C:ssa samalla ·* sekoittaen 1000 k/min. (=kierrosta minuutissa, magneetti- sauva) ja syöttämällä happea 5 vvm (=vol/vol/min.), ilmastussintteri). Tätä esiviljelmää siirrettiin 600 ml fermenttoriin, joka sisälsi 12 1 pääviljelyalustaa. Pääviljelmää fermentoitiin seuraavissa olosuhteissa: Sekoitussysteemi: Lapasekoitin 1000 k/min.

Ilmastus: 1,0 vvm

Lämpötila: 28°C

pH: 6,5 (säätö 25 % NH3:lla)

Fermentaation aikana mitattiin glukoosin konsentraatio.

Sen laskiessa alle 5 g/1 syötettiin ravintoon.lisää « 88 1 0 3 8 9 2 10 g/1 glukoosia. Kaikki muut ravinteen lisäsyötöt 10 g/1 asti suoritettiin glukoosin konsentraation laskiessa fermenttorissa 10 g/1. Jos hapen osapaine laski noin 0,05 ilmakehään, nostettiin fermenttorinpaien 0,3 bariin. 20 tunnin kuluttua jäähdytettiin 15°C:een, biomassa erotettiin ravintoalustasta CEPA-sentrifuugin avulla ja pakkaskuivattiin -70°C:ssa.

b) VAC-alfa- ja VAC-beta-rekombinanttiproteiinien osoittaminen :

Liuokset:

Koetinpuskuri:

125 mM Tris pH=6,8 4 % SDS

10 % Merkaptoetanoli 10 % Glyseriini 0,02 % Bromifenolisini

Akryyliamidigeeli

Kokoamisgeeli: Erotusgeeli: 3 'i Akryyliamidi 13,5 % Akryyliamidi 0,1 % Bisakryyliamidi 0,45 % Bisakryyliamidi ·. 125 mM Tris pH?6,8 375 mM Tris pH=8,8

0,1 % SOS 0,1 % SDS

Aj opuskuri: 14,4 g/1 Glysiini 3,025 g/1 Tris

5 ml 20 % SDS

89 103892

Proteiinigeelin värjäysliuos: Värinpoistoliuos: 0,1 % Coomassieblau 5 % Metanoli 50 % Metanoli 10 % Etikkahappo 10 % Etikkahappo

Glyseriiniliuos: 7 % Etikkahappo 2 % Glyseriini siirtopuskurit: lOx siirtopuskuri: lx siirtopuskuri; 24,2 g/1 Tris 100 ml/1 lOx siirtopuskuri 112,6 g/1 glysiini 200 ml/1 metanoli 1 ml/1 Empigen

Blokkausliuos: PBS: 1 % Tween 20 8 g/1 NaCl 1 % BSA (naudanseerumialr .

burniini 0,2 g/1 KC1 10 % vasikansikiöseerumi (GIBCO) PB:ssa 1,15 g/1 Na2P04 0,2 g/1 KH2P04 0,1 g/1 MgCl2 0,7 g/1 CaCl2

Alkalinen fosfataasi-puskuri 100 mM Tris pH=9,5 100 mM NaCl 5 mM MgCl2

Fermentaation loppu määritettiin liemen optisen tiheyden avulla ja liemestä otettiin näyte. Bakteerit pelletoitiin Eppendorf-sentrifuugissa, suspendoitiin uudelleen koetin- »o 103892 puskuriin ODgoOnm (°Ρ^ΐηθη tiheys) konsentratioon ja denaturoitiin 5 minuuttia 100°C:ssa. Liukenematon osa pelletoi-tiin sentrifugoimalla Eppendorf-sentrifuugissa. 5 ul:n erät laitettiin akryyliamidigeelille. Referenssinä olivat ekspressiokloonit, joita koko ajan oli kasvatettu suuress fosfaattikonsentraatiossa (0,08 mM fosfaatti). Alkalinen fosfataasi-promoottori ei aktivoidu näissä olosuhteissa.

Proteiinit erotettiin 6,5 V/cm jännitteellä (kokoamisgeeli) tai 13 V/cm jännitteellä (erotusgeeli) molekyylipainon perusteella, kunnes bromifenolisini-väriaine oli saavuttanut geelin pään. Puolet geelistä värjättiin Coomassieblau-värillä. Tätä varten geeliä liikuteltiin 30 minuuttia väriliuoksessa ja tämän jälkeen käsiteltiin tunnin ajan värinpoistoliuoksessa. Ylimääräisen värin poistamista parannettiin upottamalla värinpoistoliuokseen aktiivihiilellä täytetty dialyysiletku. Geeliä käsiteltiin sen jälkeen 30 minuuttia glyseriiniliuoksessa ja kuivattiin geelikuivaajan avulla.

Geelin toisen puoliskon proteiinit siirrettiin nitrosel-luloosasuodattimelle. Tätä varten kohdistettiin Sandwich Whatman 3MW Papier-Gel-Nitrozellulose (Schleicher-Schuell, BA85)-Whatman 3MM-paperiin Biorad-siirtolaitteessa lx siirtopuskurissa kahden tunnin ajan 150 V jännite (virran-voimakkuus 1000 mA) samalla jäähdyttäen. Nitroselluloosa-suodatin käsiteltiin yli yön huoneen lämpötilassa 50 ml:ssa blokkausliuosta. Suodatinta inkuboitiin 3 tuntia 5 ml blokkausliuos/1:1000 laimennettu kaniini-anti-VAC-antiseerumi-seoksessa ja tämän jälkeen pestiin 30 minuuttia juoksevassa vedessä sekä kolme kertaa 15 minuuttia PBS/1 % Tween 20 (Merck-Schuchardt Φ 822184)-seoksessa.

Suodatinta inkuboitiin 3 tuntia huoneen lämpötilassa 20 ml-.ssa blokkausliuosta, joka sisälsi anti-kaniini IgG (Fc) alkalifosfataasi-konjugaatin (Promega-ProtoBlot Immunoscreening System) 1:2000 laimennosta. Se pestiin edellä kuvatulla tavalla juoksevassa vedessä ja PBS/1 % 91 103892

Tween 20-seoksessa· Sitoutunut vasta-aine-alkalinen fosfataasi-konjugaatti osoitettiin värireaktion avulla (Promega-ProtoBlot Immunoscreening System). 66 ui NBT:a (50 mg/ml nitro-blue-tetratsolium 70-prosenttisessa dimetyyliformamidissa) ja 33 μΐ BCIP:a (50 mg/ml 5-bromi-4-kloori-3-indolyyli-fosfaatti dimetyyliformamidissa) liuotettiin 10 ml:aan alkalinen-fosfataasi-puskuria. Nitroselluloosasuodatinta inkuboitiin tässä liuoksesas värin kehittymiseen asti ja sen jälkeen pestiin 30 minuuttia juoksevassa vedessä. Suodatin kuivattiin ja suljettiin kuumentamalla muovifolioon.

Tulos on annettu kuviossa 19. "+fosfaatti" on kontrolli ilman ekspressiota, "-fosfaatti" tarkoittaa VAC-alfa (klooni HB101/pRH291) tai VAC-beta (klooni HB101/pRH292) proteiinin ekspressiota alkalisen fosfataasin promoottorin kontrollin alaisena. Sekä VAC-alfa että VAC-beta-proteiini voidaan tunnistaa jo värjätystä geelistä. VAC-proteiinien muodostunut määrä on yllättäen vähintään 20 mg/l/=D600nm bakteeriviljelmää.

Westernblot-kuvassa näkyy selvästi värjääntyneet VAC-alfa-vyöhykkeet. Lisäksi alle 30 kD alueella on havaittavissa muutamia molekyylipainoltaan alhaisempia proteiineja, jotka ovat mahdollisesti syntyneet VAC-alfa-proteiinin N- ja/tai C-pään proteolyyttisen pilkkoutumisen kautta. Silmiinpistävä on lisäksi antiseerumin tunnistama proteiini alle 20 kD alueella. Tämä saattaa mahdollisesti esittää proteolyysin kautta syntynyttä VAC-alfa-proteiinin puoli-molekyyliä. Anti-VAC-antiseerumilla tunnistettiin yllättäen myös VAC-beta. Koska tämä vyöhyke värjäytyy oleellisesti heikommin kuin VAC-alfa-vyöhyke ja koska toisaalta kuitenkin VAC-beta-vyöhykkeen intensiteetti Coomassie Balu-värjätyssä geelissä vastaa VAC-alfaa, tästä voidaan päätellä, että anti-VAC-antiseerumi tunnistaa VAC-beta- roteiinin oleellisesti huonommin kuin VAC-alfa-proteiinin.

92 1 0 3 8 9 2

Esimerkki 8

Rekombinantti-VAC-alfan puhdistaminen Lähtömateriaali: E.coli HB101/pRH 291.

Solut oli sentrifugoitu ja pakastettu - 70°C:ssa.

a) Solujen homogenisointi ja uuttaminen 103,5 g pakastettua solukakkua suspendoitiin 500 ml:aan jääkylmää lyysauspuskuria (100 mM Tris/HCl, 50 mM EDTA ja 200 mM NaCl, pH 7,5) ja käsiteltiin kokkareiden hajottamiseksi ultra-turraksilla (5 lyhyttä impulssia). Tämän jälkeen suspensio vietiin kolme kertaa Manton-Gaulin-puristimen läpi 420 kg/cm^ paineessa. Lopuksi puristin huuhdeltiin 300 ml:11a lyysauspuskuria. Homogenisoituun suspensioon lisättiin hitaasti 5-prosenttista PEI-liuosta (polyetyleeni-imiini, molekyylipaino 30.000-40.000), joka oli säädetty 5 N suolahapolla pH-arvoon 8, kunnes PEI:n loppukonsentraatio oli 0,5 %. Sekoitettiin 30 minuuttia jäähauteessa, minkä jälkeen liuos kirkastettiin 60 minuutin aikana 4°C:ssa 9.000 g voimalla käyttämällä Beckmann J2-21 sentrifuugia (raakauute).

b) Fraktiointi ammoniumsulfaatilla:

Sekoitettuun raakauutteeseen lisättiin kiinteää ammonium-sulfaattia 30 % kyllästämiseen asti 8176 g/1). Tämän jälkeen sakka poistettiin yön aikana kylmähuoneessa. Kirkkaaseen supernatanttiin lisättiin 65 % kyllästämiseen asti kiinteää ammoniumsulfaattia (235 g/1 supernatanttia) ja sekoitettiin 2 tuntia. Tämän jälkeen sakka koottiin sentrifugoimalla 10.000 g 30 minuuttia 4°C:ssa. Sakka liuotettiin 500 ml:aan 20 mM Tris/HCl + 50 mM NaCl, pH 7,4, puskuria ja dialysoitiin samaa puskuria vasten niin kauan, että kaikki ammoniumsulfaatti oli poistunut 93 103892 (bariumsulfaattia ei enää muodostunut, kun dialysaattiin lisättiin bariumkloridia).

c) DEAE-SEPHAROSE FAST FLOW-kromatografia

Dialysaatti kirkastettiin sentrifugoimalla ja vietiin 160 ml DEAE-FF-Sepharose-pylvääseen (Pharmacia), joka oli tasapainoitettu 20 mM Tris/HCl + 50 mM NaCl pH 7,4-pusku-rilla. Heti, kun eluaatin saavutti puskuritason, ajettiin gradientti 50 - 500 mM NaCl 20 mM Tris/HCl pH 7,4-puskurissa (lineaarista gradienttia yhteensä 10 pylvään tilavuutta). Eluaattia kontrolloitiin OD280nm:lla ja analysoitiin SDS-PAGE ja Western Blot-menetelmillä käyttämällä istukka-VAC:in vastaista kaniini-antiseerumia, joka oli valmistettu patenttijulkaisussa 0 181 465 nauta-VAC:in yhteydessä kuvatulla tavalla, ja alkaliseen fosfataasiin kytkettyä sian anti-kaniini-IgG:ta. VAC-pitoiset jakeet kerättiin yhteen, jolloin hylättiin muutama jae pääpiikin lopussa. VAC-pooli väkevöitiin käyttämällä AMICON-ultrasuodatuskennoa ja PM 10-tyyppistä ultrasuodatinta.

d) Sephacryl S-200 "High Resolution"-kromatografia

Pharmacia K 26/100-pylväs (500 ml) täytettiin Sephacryl S-200 HR {Pharmacia)-geelillä ja tasapainotettiin 20 mM bis-Tris/HCl + 100 mM NaCl pH 6,3-puskurilla läpivirtaus-nopeudella 15 - 20 ml/tunti. Kolonniin vietiin 6-15 ml erät väkevöityä DEAE-FF-Sepharose-poolia (yhteensä 87,4 ml) ja tämän jälkeen bis-Tris-puskuria (s.o.).

Eluaattia valvottiin OD 280 nm-arvolla. VAC:ia esittävä ·' piikki oli viimeinen UV-profiilin selvästi havaittava piikki, mikä voitiin osoittaa näytteiden SDS-PAGE- ja Western Blot-menetelmillä. Kaikkien kokeiden poolit kerättiin ja yhdistettiin (yhteensä 7) ja dialysoitiin 20 mM bis-Tris/HCl pH 6,3-puskuria vasten.

94 1 0 3 8 9 2 e) q-SEPHAROSE-FAST-FLOW-kromatografia 40 ml Q-Sepharose-Fast-Flow (Pharmacia) kolonni (K 16/20) kytkettiin FPLC-systeemiin (Pharmacia) ja tasapainoitettiin bis-Tris/HCl pH 6,3-puskurilla. Dialysoitu VAC-pooli vietiin kolonniin ja pestiin niin kauan 20 mM bis-Tris-puskuriila, kunnes eluaatin °D2gQnm oli jälleen saavuttanut puskuritason. Eluointiin käytettiin NaCl-gradienttia 20 mM bis-Tris/HCl pH 6,3-puskurissa: 0-105 ml·) Nad 1 pylvään tilavuudessa (40 ml) 105-245 mM NaCl 20 pylvään tilavuudessa (800 ml) 245-350 mM NaCl 2 pylvään tilavuudessa (80 ml) VAC voitiin tunnistaa UV-profiilin viimeisessä selvässä piikissä, joka eluoitui noin 0,14 M NaCl-kohdassa. Puhtaus määritettiin SDS-PAGE-, Western Blot-, käänteis-HPLC-menetelmillä ja fokusoimalla isoelektrisesti. VAC-poolia säilytettiin -20°C:ssa.

Esimerkki 9

Rekombi.nantti-VAC-a:n ja luonnonmukaisen VAC-a:n vertailu ... Käytetyt menetelmät:

a) Geelipermeaatio-HPLC

b) Käänteisfaasi-HPLC

c) N-terminaalinen sekvenssointi d) Trypsiinipeptidi-kartta e) SDS-geelielektroforeesi f) Western Blot g) Isoelektrinen fokusointi

Vertailuun käytettiin toisaalta luonnonmukaista VAC-proteiinia ja toisaalta rekombinantti-VAC-alfaa. Seuraa-vassa on kuvattu koeolosuhteita yksittäisillä analyysi- « 95 1C3652 menetelmillä .

a) Geelipermeaatio-HPLC

Kolonni: Waters protein Pak I 125, 2 x (7,8 x 300 mm), hiukkasten halkaisija 10 um Eluointiaine: 0,5 M Na2SO^, 0,02 M Naf^PO^, pH 7,0, 0,04 % Tween 20, 25 % propyleeniglykoli

Virtaus: 0,5 ml/min.

Detektointi: UV-absorptio, 214 nm

Luonnonmukaisen ja rekombinantti-VAC-alfan kromatogram-meissa on VAC-monomeerin pääpiikki molekyylipainon 34.000 tai 33.000 kohdalla. Lisäksi mukana on kulloinkin pieni määrä VAC:in aikaisemmin eluoituvaa dimeeriä. Molekyyli-painoasteikko kalibroitiin neljällä standardiproteiinilla. Kolonnit erottuivat täsmällisesti ottaen molekyylikoon perusteella eikä molekyylipainon perusteella.

b) Käänteisfaasi-HPLC

Kolonni: Bakerbond WP C^, 4,6 x 250, hiukkasten halkaisija 5 um, huokoshalkaisija 30 mm

Eluointiaine A: 0,1-prosenttinen trifluorietikkahappo vedessä

Eluointiaine B: 0,1-prosenttinen trifluorietikkahappo asetonitriilissä

Gradientti: 20 % B 2 min, 20 - 68 % B 24 minuutissa, 68 % B 10 min, 68 - 20 % B 1 minuutissa Virtaus: 1,0 ml/min

Detektointi: UV-absorptio, 214 nm ja 280 nm 96 103892

Luonnonmukaisen ja rekombinantti-VAC-proteiinien kromato-grammeissa on VAC:lla noin 29 minuutin retentioaika.

Tämän lisäksi läsnäolevat erittäin pienet piikit ovat vain osittain VAC-koettimen epäpuhtauksia. Kaikki BW:lla (Blindwet) merkityt piikit ovat peräisin kolonnista.

c) N-terminaalinen sekvenssointi

Sekvenssointi suoritettiin rekombinantti- VAC-alfalla, josta suolat oli poistettu käänteisfaasi-HPLC:11a. Sekvenssointi suoritettiin Applied Biosystems-yhtiön kaasufaasi-sekvenssointilaitteella (malli 470A), joka oli varustettu 40APTH-ohjelmalla. Koetin liuotettiin 50 ui:aan 70-prosenttista muurahaishappoa. Sekvenssointilaitteeseen lisättiin 2 x 25 jul. Kun lähtömäärä oli 2,3 nanomoolia, voitiin sekvenssoida 39 aminohappoa. Tulos sopi 100-prosenttisesti yhteen odotetun sekvenssin kanssa (luonnonmukaisesta proteiinista ja cDNA:sta). Muiuta N-terminaa-lista metioniinia ei voitu osoittaa (< 1 %). Rekombinantti-VAC-alfalla on N-pää vapaana eikä blokattuna, kuten luonnonmukaisella VACrlla.

d) Trypsiinipeptidi-kartta •y Verrattiin luonnonmukaista VAC-proteiinia ja rekombinantti- VAC-alfaa. Kummallakin näytteellä poistettiin VAC-proteii-nista suolat käänteisfaasi-HPLC:11a, kuivattiin ja liuotettiin 0,1-prosenttiseen ammoniumvetykarbonaattiin. Pilkkomista varten lisättiin 4 paino-% trypsiiniä (Worthington, TPCK-käsittely, liuotetaan kulloinkin 1 mg/ml veteen) ·_ ja 6 tunnin inkuboinnin jälkeen 37°C:ssa lisätään uudelleen 4 paino-% trypsiiniä. Inkuboidaan edelleen yön yli, minkä jälkeen muodostuneet peptidit erotetaan käänteisfaasi-HPLC :11a. Mukaanliitetyt kromatogrammit (214 nm ja 280 nm) osoittavat peptidikuvioiden olevan käytännöllisesti katsoen identtiset.

97 103892

Kolonni: Waters μΒοηάραΙζ C^, 3,8 x 300 mm, hiukkasten halkaisija 10 urn huokoshalkaisija 10 nm

Eluon tiaine A: 0,1-prosenttinen trifluorietikkahappo vedessä

Eluointiaine B: 0,1-prosenttinen trifluorietikkahappo asetonitriilissä

Gradientti: 0 - 55 % B 55 minuutissa, 55 % B 15 min, 55 - 0 % B 1 minuutissa

Virtaus: 1,0 1/min

Detektointi: UV-absorptio, 214 nm ja 280 nm e) SDS-geelielektroforeesi SDS-gcelielektroforeesi suoritettiin suurimmalta osalta U.K. Laemmli'n alkuperäisjulkaisun mukaisesti (Nature 227, 680-685 (1979)). Hopeavärjäys suoritettiin Oakley'n menetelmällä (Anal. Biochem. 105, 361-363 (1980)). Ensimmäisessä geelissä on verrattu luonnonmukaista ja rekombinantti-VAC-alfaa. Dimeerisen VAC:in pitoisuus kvantitatisoitiin skannaamalla laser-tiheysmittarilla. Se oli 2 % luonnonmukaisella ja 4 % rekombinantti-VACrlla. Toisessa geelissä on esitetty rekombinantti-VAC-alfa vietynä kolonnin yhdessä DTT:n (ditiotreitoli, pelkistin) kanssa tai ilman sitä. Siitä on nähtävissä, että SDS-stabiili dimeeri . on ilmeisestikin sitoutunut disulfidisiltojen kanssa, « * jotka voidaan pelkistää DTT:11a.

98 1 0 3 8 9 2

Reaqenssien kantaliuokset 15 % ammonium-persulfaatti-liuos (APS) 150 mg ammonium-persulfaattia liuotetaan 1 ml:aan tislattua vettä.

30 % akryyliamidi + 0,8 % bisakryyliamidi Akryyliamidi Bis-akryyliamidi Täytetään vedellä 15 g 0,4 g 50 ml 30 g 0,8 g 100 ml 45 g 1,2 g 150 ml

Akryyliamidi liuotetaan vastaavaan tilavuuteen vettä ja suodatetaan ennen käyttöä.

Erotusgeeli-puskuri 1,5 M Tris-HCl, 0,4 % SDS (natrium-dodekyylisulfaatti), pH 8,8, 18,16 g Tris + 0,4 g SDS, joka säädettiin väkevällä suolahapolla pH-arvoon 8,8 ja täytettiin tislatulla vedellä 100 mlrksi.

Pinoqeeli/-puskuri 0,5 M Tris-HCl, 0,4 % SDS, pH 6,8 6.04 g Tris + 0,4 g SDS, säädetään väk. HCLrlla pH-arvoon 6,8 ja täytetään tislatulla vedellä 100 ml:ksi.

Ajopuskuri

Noin 3,5 litrraan tislattua vettä liuotetaan: 25 mM Tris, 192 mM glysiini, 0,1 % SDS, 0,005 % Na-atsidi pH

8.5 12 g Tris + 57,6 g glysiini + 4 g SDS + 0,2 g natriumatsidi, säädetään pH arvoon 8,5 ja täytetään 4,0 litraksi. Uuden ajopuskurin jhtokykyä on suositeltavaa verrata edellisiin panoksiin.

99 1 0 3 8 9 2 0,05 % Coomassie-Blue-väriäysliuos 0,55 g Coomassie Brillant Blue R 850-väriainetta liuotetaan 500 ml:aan metanolia, sekoitetaan 30 minuuttia ja suodatetaan. Tähän lisätään 100 ml jääetikkaa ja 500 ml tislattua vettä.

Värinpoistoliuos a) Värinpoisto käsin Värinpoistoliuos vastaa väriliuosta ilman väriainetta: 500 ml metanoli + 500 ml tislattu vesi + 100 ml jääetikka b) Elektroforeettinen värinpoisto 7,5-prosenttisessa etikkahapossa 4 x SDS-lisäyspuskuri (säilyy noin 1 kuukauden) Värikonsentraatti: Bromifenolisininen 50 mg

Glyseriini 0,5 ml

Vesi 8tisl.) 10 ml:aan

Liuosta voidaan säilyttää noin 3 kuukautta.

Lisäyspuskuri: Värikonsentraatti 0,4 ml SDS 0,8 g : Glyseriini 4 g

Vesi (tisl.) 10 ml:aan 1 x SDS-lisäyspuskuri 4 x SDS-lisäyspuskuri laimennetaan tislatulla vedellä 1:4.

loo 103892

Oakley'n nopeavärjäys Reaqenssit Värinpoistoaine: Etanoli _ .200 ml

Etikkahappo (kons.) 62,5 ml Tisl. vesi 1000 ml:aan 10 % glutardialdehydi-liuos: 25 % glutardialdehydi-liuos 20 ml tai 40 ml

Tisl. vesi 50 ml:aan tai 100 ml:aan

Liuosta on säilytettävä jääkaapissa.

0,1 N ammoniakkipitoinen hopealiuos:

Valmistetaan vasta juuri ennen käyttöä 0,1 N hopeanitraatti (16,9 g/1) 23 ml 46 ml 25 % Ammoniakkiliuos 0,95 ml 1,9 ml 0,36 % natriumhydroksidi (1,8 g/0,5 1) 10,5 ml 21 ml

Tisl. vesi 50 ml 100 ml

Kehitysliuos:

Valmistetaan välittömästi ennen käyttöä 0,5 % sitruunahappo (1,25 g/250 ml) 5 ml

Tisl. vesi 1 1 37 % formaldehydi 1 ml . Värinpoistoliuos (valokuvakiinnite):

Kodak-kiinnite (Photolabor) laimennetaan tislatulla vedellä (1:4). Laimennusta voidaan käyttää useita kertoja, mutta värinpoiston kestoaika kasvaa usean käytön jälkeen.

101 103892 2 % glyseriini-liuos: 23 g glyseriiniä (87 %) 1 litrassa tislattua vettä

Oakley'n hopeaväriäyksen suorittaminen

Suoritetun elektroforeesin jälkeen geeli leimattiin yhdessä kulmassa ja sen jälkeen suoritettiin seuraavat värjäysvaiheet tärytyslaitteessa: - 30 minuuttia värinpoisto-hauteessa - 30 minuuttia 20 % glutardialdehydi-liuoksessa (50 ml) - 30 minuuttia juoksevassa vedessä tai yli yön noin 2 litrassa vettä - 10 minuuttia ammoniakkipitoisessa hopealiuoksessa (50 ml) 3 minuuttia juoksevassa vedessä - noin 5 minuuttia kehitinliuoksessa

Kehittymistä ei lopetettu minkään tarkan ajan jälkeen, vaan sen jälkeen, kun vyöhykkeet olivat värjäytyneet riittävästi ja viimeisintään, kun tausta alkoi värjääntyä. Kehitys lopetettiin pitämällä - 30 minuuttia geeliä vedessä (altaassa tai juoksevan veden alla) ·* Kehittyminen jatkui vielä silloinkin, kun geeli oli jo vedessä! (Diffuusioaika). Geelin värinpoistoa tarvittiin vain silloin, kun tausta oli voimakkaasti värjääntynyt! - noin 5-10 minuuttia Kodak-kiinnitteessä, kunnes vyöhykkeiden ja taustan välille oli saavutettu optimaalinen ' kontrasti. Huomio! Värin poistumista tapahtui vielä senkin jälkeen, kun reaktio oli välittömästi pysäytetty juoksevassa vedessä (difuusioaika).

- 30 minuuttia 2-prosenttisessa glyseriiniliuoksessa 102 103892 Tämän jälkeen geeli voitiin kuivata suodatinpaperilla tunnin ajan 80°C:ssa.

f ) W^tern Blot VAC:in immunologinen näyttö tapahtui käyttämällä kaniinin anti VAC-seerumia (laimennus 1:1000) ja sian anti-kaniini-IgG:ta (laimennus 1:500), joka oli konjugoitu alkalisen fosfataasin kanssa. Alkalisen fosfataasin entsyymiaktiivisuuden osoittamista varten käytettiin BCIP (5-bromi-4-kloori-3-indolyyli-fosfaatti) ja NBT (Nitro Blue Tetrazolium)-substraatteja. Proteiinien vertailuvärjäys nitroselluloo-salla suoritettiin käyttämällä amidomustaa.

Western-siirto puolikuivassa menetelmässä 1. Materiaalit:

Puolikuiva Electroblotter (Sartorius) SM 175 56; siirrettävän geelin kokonainen suodatinpaperi; geelin kokoinen nitroselluloosa-membraani (huokoskoko 45 μπ\) ; 2. Reaqenssit Anodipuskuri 1: pH 10,4 0,3 M Tris 3,63 g/80 ml 20 % Metanoli 20 ml

Anodipuskuri 2: pH 10,4 25 mM Tris 0,3 g/80 ml 20 % Metanoli 20 ml

Katodipuskuri: pH 9,4 25 mM Tris 0,3 g/80 ml 40 mM t-aminokapronihappo 0,52 g/80 ml (MP 131,3) 20 % Metanoli 20 ml 103 103892

Amide,nusta-proteiini-värjäysaine 0,5 % (w/v) amidomusta 0,5 g 40 mlrssa 50 % Iletanoli 50 ml 10 % Etikkahappo 10 ml Värinpoistoliuos

Metanoli - Vesiu - Etikkahappo 5 5 1 PBS (fosfaattipuskuroitu suolaliuos) lOx konsentraatti PJL l *2 136 mM Natriumkloridi 80 g 26 mM Kaliumkloridi 2 g 80 mM di-natriumvetyfosfaatti 11,3 g (80 mH di-natriumvetyfosfaatti . 12Η2<3 28,7 g) 14 mM kalium-divetyfosfaatti 2 g täytetään tislatulla vedellä 1 litraan laimennetaan ennen käyttöä 1/10!!!

Blokkauspuskuri:

1 % BSA

0,1 -i, Tween 20 lx PBS:ssa

Pesupuskuri:

1 x PBS

1 x PBS +0,1 % Tween 20 1 X PBS

Väripuskuri alkalinen fosfaatti-värjäykseen; . / pH 9,9 100 mM Tris 1,22 g 100 mM Natriumkloridi 0,58 g 5 mM Magnesiumkloridi. 61^0 0,10 g täytetään tislatulla vedellä 100 ml:aan 10“ 103892 ΝΒΤ (Nitro-Blue Tetratsolium)-liuos 50 mg NBT (Sigma N-6876)/ml 70 % dimetyyliformamidi BCIP (5-bromi-4-kloori-3-indolyyli-fosfaatti)-liuos 50 mg BCIP (Sigma B-8503)/ml 100 % dimetyyliformamidissa Värjäysaine alkaliselle fosfataasille Värjäyspuskuri 10 ml BCIP 0,033 ml NBT 0,065 ml

Vasta-ainereagenssit:

Alkalisen fosfataasin kanssa konjugoitu kaniinin anti VAC-seerumi.

3. Siirron suoritus

Siirtäminen suoritettiin 60 minuutin aikana virralla 2 0,8 mA/geeiipinnan cm .

4. Proteiinien osoittaminen nitroselluloosamembraanilla 4.1 Proteiinivärjäys amidomustalla

Nitroselluloosamembraanin proteiinivärjäykseen tarkoitettu osa leikattiin irti ja asetettiin 5 minuutiksi amidomusta-värjäysliuokseen. Tämän jälkeen kaadettiin useampia kertoja käytettävissä oleva värjäysliuos pois ja ylimääräi-: nen värjäysliuos huuhdeltiin vedellä nitroselluloosa- mcmbraanista.

4.2 Immunologinen näyttä 4.2.1 Nitroselluloosamembraanin blokkaus 105 103892

Ennen immunologista osoittamista blokattiin nitroselluloo-samembraani vähintään 60 minuutin ajan (tai yli yön) 1 % BSA:1la lxPBS:ssa, jossa oli 0,1 % Tween 20.

4.2.2 Entsyymileimattujen vasta-aineiden osoittaminen

Blokkauksen jälkeen inkuboitiin nitroselluloosamembraania 60 minuuttia kaniinin anti-VAC-seerumin kanssa (sopivassa laimennuksessa blokkausaineen kanssa).

Tämän jälkeen pestiin kolme kertaa: lx PBS, PBS 0,1 % Tween'11a, 20,lx PBS. Seuraavaksi membraania inkuboitiin sian anti-kaniini-IgG:n kanssa, joka oli konjugoitu alkalisen fosfataasin kanssa (myös sopivassa laimennuksessa blokkausaineen kanssa 60 minuutin aikana). Tämän jälkeen pestiin uudelleen 3x PBS:11a edellä kuvatulla tavalla.

4.2.3 Siirteen entsymaattinen värjäys

Nitroselluloosamembraani laitettiin värjäysaineeseen (minigeeliin riittää 10 ml) ja liikuteltiin hitaasti ravistelulaitteessa, kunnes vyöhykkeet olivat värjäytyneet riittävästi. Värjäys lopetettiin pesemällä värjäysaine pois vedellä, minkä jälkeen nitroselluloosamembraani kuivattiin ilmassa.

5, Western-siirteen arviointi

Siirteen immunologisesti/entsymaattisesti osoitettuja vyöhykkeitä verrattiin siirteen proteiinivärjäyksen vyöhykkeisiin ja SDS-elektroforeesin vastaavan vyöhykekuvion kanssa ja sovitettiin keskenään.

7. Isoelektrinen fokusointi

Rekombinantti- VAC-alfan isoelektrinen piste (pl) on 106 1 0 3 8 9 2 4,9, joka on 0,1 pH-yksikköä korkeampi kuin luonnonmukaisella VAC:11a. (4,8).

Polyakryyliamidigeeli-kisoelektrinen fokusointi (PAGIF tai IEF)

Materiaalit ja reaqenssit

Isoelektriseen fokusointiin tarkoitetut polyakryyliamidi-geelilevyt polymeroidaan folioiden päällä. (LKB-"PAGplate", SERVA - "Servalyt Precotes")

Elektrodiliuokset kyseisille pH-alueille: pH 3,5-9,5 (LKB-PAGplate)

Anodiliuos: 1 M fosforihappo Katodiliuos: 1 M natriumhydroksidi pH 5,5-8,5 (LKB-PAGplate)

Anodiliuos: 0,4 M HEPES (jossa Na-atsidia)

Katodiliuos: 0,1 M NaOH

pH 4,0-6,5 (LKB-PAGplate)

Anodiliuos: 0,5 M fosforihappo + 0,1 M

glutamiinihappo • Katodiliuos: 0,1 M beta-alaniini (Na-atsidia) pH 3,5-9,5 (SERVALYT-PRECOTES)

Anodiliuos: 25 mM asparagiinihappo + 25 mM

glutamiinihappo

Katodiliuos: 2 M etyleenidiamiini + 25 mM arginiiniemäs ! + 37,5 mM lysiiniemäs Jäähdytysaine: paloöljy (SERVA)

Kiinniteliuos: 10 % trikloorietikkahappo (TCA) 5 % sulfosalisyylihappo 0,05 % Coomassie Blue-väriliuos 107 103892 Värinpoistoliuos: 500 ml metanoli + 500 ml vesi + 100 ml jääetikka

Koettimet:

Koettimien on oltava vähäsuolaisia tai vieläkin mieluummin suolattomia. Korkeammat auolakonsentraatiot on ennen isoelektristä fokusointia dialysoitava noin 5 - 10 mM puskuria tai vettä vasten. NaCl-pitoisuus voi kuitenkin olla 100 mM asti ilman, että ajorintamat häiriintyvät.

IEF-geelin kiinnittäminen ennen proteiinien värjäämistä

Geeli asetettiin noin 20 minuutiksi kiinniteliuokseen sitä kuitenkaan tällöin ravistelematta! (Se irtosi tällöin helposti irti foliosta). Tämän jälkeen pestiin 5 minuuttia.

IEF-geelien proteiinivärjäys Coomassie Blue-värillä

Kiinnitetyt geelit laitettiin noin 2 tunniksi värjäysliuok-seen ja niitä liuoteltiin tällöin vain erittäin varovasti.

IEF-geelien värinpoisto Värjäyksen jälkeen huuhdeltiin ylimääräinen värjäysliuos pois vedellä ja geelistä poistettiin väri vaihtamalla värinpoistoliuos usein. Riittävän värinpoiston jälkeen geeli pestiin uudelleen, kunnes värinpoistoliuos oli peseytynyt pois.

IEF-geelien kuivaaminen '1 Geelit laitettiin kostean, vettäläpäisevän läpinäkyvän kalvon tai dialyysimembraanin päälle vettäläpäisemätön puoli ylöspäin ja kuivattiin yksi tunti 80°C:ssa.

Esimerkki 10 108 1 0 3 8 9 2

Rekombinantti-VAC:in biologinen aktiivisuus A. Modifioitu protrombiiniaika-testi (kts. EPÄ 0 181 465)

Sitraattipitoista, verihiutaleita sisältämätöntä plasmaa (PFP) sekoitettiin 2 minuuttia 37°C:ssa, kun mukana oli tai ei ollut rekombinantti-VAC:ta (r-VAC) tai luonnonmukaista VAC:ta. Inkuboinnin jälkeen lisättiin aivokudos-faktorin ja Ca++:n liuos. Tarkkailtiin hybriinin muodostumista ja rekisteröitiin optisesti hyytymisaika. Tulokset on annettu kuviossa 33. Ne vahvistavat, että r-VAC ja VAC inhiboivat fibriinin muodostumista annoksesta riippuvalla tavalla. r-VAC:in ja VAC:in spesifiset aktiivisuudet ovat samaa suuruusluokkaa.

B. Trombiiniaika-testi (kts. EPÄ 01 181 465)

Sitraattipitoistas PFP-plasmaa sekoitettiin 2 minuuttia 37°C:ssa, kun mukana oli tai ei ollut r-VAC:ta tai VAC:ta. Inkuboinnin jälkeen lisättiin trombiinia ja Ca++:a. Fibriinin muodostumista tarkkailtiin optisesti. Ei r-VAC eikä myöskään VAC inhiboinut trombiinin inudsoimaa fibriinin muodostumista, kuten on kuviosta 34 nähtävissä.

Siten sekä r-VAC että VAC ehkäisevät trombiinin muodostumista, mutta ei kuitenkaan trombiinin vaikutusta.

C. Faktori Xa:n muodostuminen kudosfaktorilla aktivoidussa plasmassa (kts. EPÄ 0 181 465)

Sitraattipitoista PFP-plasmaa sekoitettiin 2 minuuttia 37°C:ssa, kun mukana oli tai ei ollut r-VAC:ta tai VAC:ta. Tämän jälkeen PFP-plasmaa lisättiin "aivokudosfaktorin" ja Ca++:n liuos hyytymisen käynnistämiseksi. Määrättyinä ajankohtina otettiin näytteet ja laimennettiin puskurilla 1000-kertaisesti. 10 jul tätä liuosta lisättiin 40 yul:aan 109 103892 seosta, joka sisälsi protrombinaasi-kompleksin seuraavat komponentit.

0,6 nM faktori Va 50 μΜ fosfolipidi (80 % dioleoyyli-fosfatidyylikoliini/ 20 % dioleoyyli-fosfatidyyliseriini) 1,0 μΜ protrombiini

Kahden minuutin reaktioajan jälkeen arvioitiin aktivoituneen protrombiinin osuus amidolyyttisen aktiivisuuden avulla käyttämällä kromogeenista substraattia S 2238.

Näin mitattu amidolyyttisen aktiivisuuden määrä on suoraan verrannollinen aktiivisen faktori X :n määrään PFP- cl plasmassa.

Protrombiinin aktivoitumiseen ei voitu havaita mitään vaikutusta, kun laimennettiin 1000-kertaisesti VAC:in länsäollessa PFP-plasmassa.

Kuviossa 35 on esitetty tyypillinen faktori X :n muodostu- ä miskäyrä ja r-VAC:in ja VAC:in vaikutukset. Näiden tulosten avulla voidaanpäätellä, että r-VAC inhiboi VAC:in lailla kudosfaktorin indusoimaa faktori X:n aktivoitumista plasmassa annoksesta riippuvalla tavalla.

Tulokset osoittavat edelleen, että r-VAC ja VAC eivät kumpikaan inaktivoi faktoria X suoraan ajasta riippuvalla

Ci tavalla. Tämä voidaan päätellä käyrän muodosta. Sen jälkeen, kun maksimi on saavutettu, alkaa aktiivisen faktorin X määrä PFPissa laskea noudattaen 1. pseudokerta- cl luvun kinetiikkaa. Tämä lasku johtuu todennökäisesti antitrombiini III:n aiheuttamasta faktorinpa inaktivoi-tumisesta. 1. pseudokertaluvun näistä arvoista laskettu nopeusvakio oli noin 0,25 min ^ eikä se muuttunut, kun r-VAC:ta ja VAC:ta ei ollut mukana.

110 103892 Nämä arvot todistavat yksiselitteisesti, että r-VAC:lla on VAC-aktiivisuutta. Vaikka r-VAC:in spesifinen aktiivisuus on tässä hyytymistestissä identtinen VAC:in aktiivisuuden kanssa ja vaikka r-VAC ei suoraan inaktivoi faktoria X ja trombiinia, tutkittiin vielä lisäksi r-VAC:in cl sitoutumista fosfolipideihin, jotta voitaisiin osoittaa ilman epäilyksiä VAC-aktiivisuuden kuuluvan r-VAC:lie.

r-VAC:in ja VAC:in sitoutuminen fosfolipidikaksoiskerrok-seen, joka muodostuu dioleoyylifosfatidyylikoliinista ja dioleoyylifosfatidyyliseriinistä (80%/20%), määritettiin käyttämällä automaattista Ellipsometer-laitetta.

Cuypers et ai. on kuvannut tämän menetelmän julkaisussa: J. Biol. Chem. i58 (1983), 2426-2431.

Tämän tutkimuksen eräs tyypillinen tulos on esitetty kuviossa 36. Sekä r-VAC:11a että VAC:lla on identtiset sitoutumiskinetiikat kaksoiskerrokseen, kun niitä lisättiin 1 μς VAC-konsentraatiossa tämän kaksoiskerroksen ml kohti. Sitoutuminen tapahtuu Ca++:n läsnäollessa ja on reversiibeli, kuten voitiin osoittaa EDTA-lisäyksen avulla.

Yhteenvetona voidaan todeta, että r-VAC on biologisesti • aktiivinen eikä eroa luonnonmukaisesta VAC:sta.

Esimerkki 11

Tetrasykliini-resistenttien VAC-alfa- ja VAC-beta-ekspressiovektoreiden (pGN25, pGN26) rakentaminen 1 μς pATl53:a 50 μΐιεεβ liuosta pilkottiin EcoRI:lla. Entsyymiaktiivisuus tuhottiin kuumentamalla 70°C:een ja ylipitkät päät tasattiin fill in-reaktiossa lisäämällä DNA-polymeraasi I/Klenow'in fragmenttia (PolIK) (5 yksikköä) ja neljä desoksiribonukleosiditrifosfaattia 111 103892 (kunkin loppukonsentraatio 20 jiM) . PolIK-aktiivisuus tuhottiin kuumentamalla 70°C:een, minkä jälkeen DNA saostettiin etanolilla. Linearisoitu DNA pilkottiin 50 piissä Pvul:lla. Sen jälkeen pRH291 tai pRH29a linea-risoitiin Sphl:lla ja 3'-ylipitkät päät hajotettiin PolIKin 3'-eksonukleolyyttisen aktiivisuuden avulla dGTP:n läsnäollessa. DNA:n saostamisen jälkeen tämä pilkottiin Pvul:lla. Kaikista kolmesta pilkkomisesta saadut fragmentit erotettiin agaroosigeelillä ja vastaavat fragmentit eluoitiin (pAT153: 3032 bp, pRH291: 1987 bp, pRH292: 2607 bp). 50 ng:aan pAT153-fragmenttia lisättiin 50 ng pRH291- tai pRH292-fragmenttia ja linearisoitiin 10 ulissa. 100 ul:aan kompetentteja E.coli HB201-bakteereja lisättiin 5 ui ligaasiliuosta ja transformoitiin. Selek-tointi suoritettiin LB-agarilla, joka sisälsi 100 ug/ml ampisilliinia. Syntyneistä klooneista siveltiin muutama LB-agarille, jossa oli 12,5 pg/ml tetrasykliiniä. Tällä kasvavia klooneja käytettiin plasmidi-DNA:n valmistamiseen. Minipreparoimalla valmistettu plasmidi-DNA pilkottiin eri restriktioentsyymeillä ja tällä tavoin tutkittiin rakenteen oikeellisuus. Kulloinkin valittiin yksi klooni ja tälle annettiin nimeksi pGN25 (VAC-alfa) tai pGN26 (VAC-beta). E.coli HB101/pGN25 tai HB101/pGN26 fermentoitiin esimerkissä 7 kuvatulla tavalla, jolloin tällä kertaa ampisilliinin asemesta käytettiin esiviljelmässä 5 mg/1 tetrasykliiniä. Pääfermentaation aikana otettiin näytteitä ja nämä tutkittiin 15 % akryyliamidi/0,1 % SDS-geelillä Lämmli'n mukaisesti. E.coli HBl01/pRH291:n tai HB101/pRH292:r fermentaatioiden välillä ei havaittu mitään eroa. Fermen-taation työmassasta eristettiin VAC-alfa ja VAC-beta. Myöskään proteiinianalyysillä ei saatu mitään eroa vastaavien rekombinanttiproteiinien välille, jotka oli saatu kloonien HB101/pRH291 ja HB101/pRH292 fermentaatioista.

« 112 103892

Esimerkki 12

Rekombinantti-VAC-B:n puhdistaminen Lähtömateriaali: E.coli HB101/pRH292.

Solut sentrifugoitiin ja pakastettiin -70°C:ssa.

a) solujen homogenisointi ja uuttaminen 100 g pakastettua solukakkua suspendoitiin 500 ml:aan jääkylmää lyysauspuskuria (100 mM Tris/HCl, 50 mM EDTA ja 200 mM NaCl, pH 7,5) ja kokkareet hajotettiin käsittelemällä Ultra-Turrax-sekoittimella (5 lyhyttä impulssia).

Tämän jälkeen suspensio johdettiin kolme kertaa Manton- 2

Gaulin-puristimen läpi 480 kg/cm paineessa. Lopuksi puristin huuhdeltiin 300 ml:11a lyysauspuskuria. Homogenisoituun suspensioon lisättiin hitaasti 5-prosenttinen PEI-liuos (polyetyleeni-imiini, molekyylipaino 30.000-40.000), joka oli säädetty 5 N suolahapolla pH-arvoon 8, kunnes PEI:n loppukonsentraatioksi saatiin 0,5 %.

Liuosta sekoitettiin 30 minuuttia jäähauteessa, minkä jälkeen se kirkastettiin sentrifugoimalla 60 minuutin ajan 4°C:ssa 9.000 g voimalla käyttämällä Beckmann J2-21 sentrifuugia (raakauute).

b) Kromatografia silikalla

Silica Catalyst Carrier, Grade 953W (Grace GmbH, Worms, BRD) kirkastettiin tislatussa vedessä ja sillä täytettiin kromatografiapylväs, jonka halkaisija oli 5 cm ja korkeus 20 cm. Lys-puskurilla suoritetun tasapainoittamisen jälkeen raakauute laitettiin pylvääseen ja pestiin 3 litralla Lys-puskuria. VAC-0 eluoitiin tetraetyyliammonium-kloridin lineaarisella gradientilla Lys-puskurissa (0-1 M 200 ml.-ssa puskuria). Eluaatin jakeista kontrolloitiin VAC-0 SDS-PAGE: 11a käyttämällä referenssiainetta. VAC-β- 113 103892 pitoiset jakeet yhdistettiin.

c) DEAE-SEPHAROSE FAST FLOW-kromatografia

Yhdistetyt silikajakeet dialysoitiin 20 mM Tris/HCl pH 8,4-puskuria ja laitettiin 175 ml DEAE-FF-Sepharose-pylvääseen (26 x 330 mm, Pharmacia), joka oli tasapainoi-tettu 20 mM Tris/HCl pH 8,4-puskurilla. Pylväs pestiin 500 ml:lla puskuriliuosta ja VAC-β eluoitiin 0-500 mM NaCl-gradientilla 875 ml:ssa puskuriliuosta (5 pylvään tilavuutta). Eluaatti kontrolloitiin aallonpituudella 280 nm ja analysoitiin SDS-PAGE:lla käyttämällä referenssi-ainetta. VAC-3-pitoiset jakeet koottiin ja väkevöitiin käyttämällä AMICON ultrasuodatuskennoa ja PM 10-tyyppistä ultrasuodatinta.

d) Sephacryl S-200 "High Resolution"-kromatografia

Pharmacia K 26/100-pylväs (500 ml) täytettiin Sephacryl S-200 HR (Pharmacia) geelillä ja tasapainoitettiin 20 mM Bis-Tris/HCl + 100 mM NaCl pH 8,4-puskurilla virtaus-noepuden ollessa 120 ml tunnissa. Väkevöidyn DEAE-FF-Sepharose-poolin 4 ml erät laitettiin pylvääseen ja pelkistettiin virtausno+eudella 60-80 ml/tunti. Eluaatti pestiin aallonpituudella 280 nm. VAC-β edustava piikki oli UV-profiilin ainoa piikki. Se otettiin talteen, jolloin heitettiin pois myös UV-profiilissa havaittavat suurimolekyyliset epäpuhtaudet. Puhdistettu VAC-β analysoitiin SDS-PAGE:11a ja säilytettiin -20°C:ssa.

114 103892

Taulukko: Rekombinantti-VAC-β: n puhdistaminen Lähtömateriaali: 100 g pakastettua solukakkua X )

Tilavuus (ml) mg proteiini/ml— yht,, mg RAAKAUUTE 810 16,1 13,040 SILIKAN LÄPIVIRTAUS 2270 0,35 795 VAC-beta SILIKA-POOLI 380 5,0 1.900 VAC-beta DEAE-FF-POOLI 120 2,6 312 DEAE-FF-POOLI- KONSENTRAATTI 4 58 232 VAC-beta SEPHACRYL- POOLI 33,5 2,2 74 X )

Proteiini määritettiin BIO-RAD-proteiinin määritysmenetelmällä (standardi: nauranseerumialbumiini)

Esimerkki 13 VAC-betan analytiikka ja karakterisointi

Yksittäisten puhdistusvaiheiden välissä käytettiin In Process-kontrollina SDS-geelielektroforeesia. Tämän analyysin yksityiskohtainen suoritustapa oli sama kuinloppu-kontrolleissa, joiden yhteydessä se on myös kuvattu. Esimerkissä 12 (VAC-betan puhdistaminen) on annettu puhdistamisen aikana saatu SDS-geelisarja.

Loppukontrolleina ja puhdistetun proteiinin karakterisointiin käytettiin seuraavia menetelmiä:

a) Geelipermeaatio-HPLC

b) Käänteisfaasi-HPLC

c) Aminohappoanalyysi d) N-terminaalinen sekvenssointi ·,' e) SDS-geelielektroforeesi f) Isoelektrinen fokusointi 103892 lit)

a) Geelipermeaatio-HPLC

Kolonni: Waters, Protein Pak I 125, 2 x (7,8 x 300 mm), hiukkasten halkaisija 10 |um, huoneen lämpötila

Eluointiaine: 0,5 M Na2SO^, 0,02 M Na^ PO^, pH 7,0, 0,04 % Tween 20, 25 % propyleeniglykoli

Virtausnopeus: 0,5 ml/min.

Detektointi: UV-absorptio, 214 nm, 0,5 AUFS

Puhdistetun VAC-betan kromatogrammissa (kuvio 40) on VAC-beta-monomeerien pääpiikki molekyylipainon 29.000 kohdalla, minkä lisäksi on osoitettavissa pieni määrä dimeeristä VAC-betaa (molekyylipaino noin 50.000). Nämä molekyylipainon arvot ovat suhteellisen paljon oletetun arvon (molekyylipaino 37.000) alapuolella, mikä johtuu todennäköisesti siitä, että käytetty geelipermeaatio-kolonni erottaa molekyylikoon tai molekyylin muodon perusteella eikä molekyylipainon perusteella.

b) Käänteisfaasi-HPLC

Kolonni: Bakerbond WP C^, 4,6 x 250 mm, hiukkasten halkaisija 5 um, huokosten halkaisija 30 nm, huoneen lämpötila

Eluointiaine A: 0,1 % trifluorietikkahappo vedessä ,·. Eluointiaine B: 0,1 % trifluorietikkahappo asetonitriilissä

Gradientti: 20 % B 2 min, 20 - 68 % B 24 minuutissa 68 % B 10 min, 68 - 20 % B 1 minuutissa

Virtausnopeus: 1 ml/min.

Detektointi: UV-absorptio, 214 nm, 0,5 AUFS

Kromatogrammi (kuvio 41) saadaan suoraan viimeisen puh- us 103892 distusvaiheen eluaatista. Siinä näkyy pääasiallisesti hapettuneen VAC-betan piikki (2 disulfidisiltaa, tR= 26,6 min). Sen lisäksi on osoitettavissa noin 9 % pelkistettyä VAC-G (t = 27,4 min) sekä muutama pienempi muiden epäpuhtauksien piikki. Kromatogrammi (kuvio 42) esittää samaa VAC-beta-näytettä 2 tunnin inkuboinnin jälkeen (3 M urea, 0,05 M ditiotreitoli). Proteiini on pääasiallisesti pelkistetyssä muodossa (rR= 27,4 min).

c) Aminohappoanalyysi

Puhdistetusta VAC-betasta poistettiin suolat käänteisfaasi-HPLC:lla (menetelmä, kts. jäljempänä b). VAC-betan pääpiikki kerättiin hydrolyysiputkeen ja kuivattiin.

Hydrolyysi suoritettiin 6 N suolahapolla (jossa 1 % fenolia) kaasufaasissa (110°C, 22 tuntia).

Aminohapot määritettiin aminohappoanalysaattorilla (tyyppi 6300, Beckman) deivatisoimalla jälkikolonnissa ninhydrii-nillä.

VAC-beta-näytteen aminohappoanalyysin (kuvio 43) kokonais-poikkeama teoreettisesta koostumuksesta on 6,56 %.

d) N-terminaalinen sekvenssointi

Puhdistetusta VAC-betasta poistettiin suolat käänteisfaasi-HPLC:lla (menetelmä: kts. jäljempänä b). VAC-betan pääpiikki otettiin talteen ja kuivattiin.

Jäännös liuotettiin 75 jahaan 0,1-prosenttista trifluori-etikkahappoa ja käytettiin suoraan sekvenssointiin.

Sekvenssointi suoritettiin Applied Biosystems (malli 470 A9) kaasufaasisekvenssointilaitteella, joka oli varustettu Programm 39apth-ohjelmalla.

117 103892

Noin 1 nM suuruisella lähtömäärällä voitiin sekvenssoida 39. aminohappoon asti. Yhteensopivuus odotetun sekvenssin kanssa oli 100-prosenttinen. N-terminaalinen metioniini lohkeaa ilmeisesti 100-prosenttisesti. (kuvio 44) ’ e) SDS-geelielektroforeesi SDS-geelielektroforeesit.suoritettiin pääosiltaan U.K.

Lämmli'n alkuperäisjulkaisun mukaisesti. In Process-kontrollia varten lisättiin VAC-beta-näytteisiin ditiotreito-lia ennen geelille laittamista ja kiehautettiin. Loppukontrol-lit suoritettiin sekä pelkistävissä että ei-pelkistävissä olosuhteissa. Geelit värjättiin Coomassie Blue-värillä.

Kuviossa 45 on annettu VAC-beta-näytteiden SDS-geeli.

Rata 1 ja 10: Molekyylipainon markkerit

Rata 2 ja 3: VAC-betan In Process-näytteet DTT:n (ditio-treitoli) ja ilman sitä

Rata 4 ja 6: 10 μg pelkistämätöntä VAC-betaa Rata 5 ja 7: 10 ug DTT:11a pelkistettyä VAC-betaa Rata 8 ja 9: 1 jug pelkistämätöntä VAC-betaa

Ilman pelkistintä oleva VAC-beta voidaan osoittaa kaksois-vyöhykkeenä. Voimakkaampi alempi vyöhyke molekyylipainossa noin 36.000 on hapettunut muoto, ylempi vyöhyke molekyyli-painossa noin 38.000 on VAC-betan pelkistynyt muoto.

Molempien muotojen määrien jakaantuminen on helpommin nähtävissä radoilta 8 ja 9.

Kun pelksitimenä lisätään DTT:a, voidaan sen vuoksi havaita vain ylempi vyöhyke (kts. rata 3, 5 ja 7). Koska radat 4-7 ovat liian paljon kuormitettuja, VAC-beta-vyöhykkeiden lisäksi voidaan nähdä muutama muiden epäpuhtauksien vyöhyke.

f) Isoelektrinen fokusointi värjäys suoritettiin Coomassie Blue-värillä.

118 103892

Pitkälle puhdistetun VAC-3:n isoelektrinen fokusointi (kuvio 46) (3.3.1988/51) osoittaa, että viimeisestä puhdis-tusvaiheesta (rata 2 ja 3) saadulla VAC-3:lla on kaksi päävyöhykettä pH-arvossa 5,35 tai 5,45. VAC-B:n isoelektrinen piste (pl) on siten selvästi emäksisempi kuin VAC-a:n (pl=4,9), mikä vstaa odotuksia, koska VAC-β sisältää vähemmän happamia aminohappoja. Ditiotreitolilla suoritetun pelkistämisen jälkeen (rata 4 ja 5) on päävyöhyke voimakkaasti kerääntynyt kohtaan pH 5,45. Tämä esittää ilmeisestikin VAC-g:n pelkistettyä muotoa.

Esimerkki 14 VAC-a:n ja VAC-&:n biologiset aktiivisuudet 1. VAC-α:n ja VAC-β:n vaikutus protrombinaasi-aktiivisuuteen.

Protrombinaasi-kompleksi konstituoitiin uudelleen puhdistetuista naudan hyytymisfaktoreista ja fosfolipideistä.

Sen kosotumus oli: 0,3 nM faktori Xa, 0,6 nM faktori Va, 1 juM protrombiini, 2 μΜ f osf olipidivesikkelit (25 % dioleoyyli-fosfatidyyliseriini, 75 % dioleoyyli-fosfa-tidyylikoliini) ja 3 mM CaC^.

' Protrombiinin aktivoituminen mitattiin seuraavasti: Fakotria

Xa, Va, fosfolipidejä, Ca++:a ja eri määriä VAC:ta inkuboi-tiin 2 minuuttia 37°C:ssa. Protrombiinin aktivointi aloitettiin tämän lisäyksen avulla. Eri aikoina otettiin seuraavaan puskuriin seoksesta näytteet: 50 mM Tris/HCl, 175 mM NaCl, 0,5 mg/ml BSA, 20 mM EDTA ja 0,23 mM S2238.

• Amidolyyttistä aktiivisuutta seurattiin aallonpituudella 405 nm. Aktivoidun protrombiinin määrä määritettiin sen jälkeen standardikäyrästä, joka oli muodostettu tunnetuilla trombiinimäärillä. Tulos on annettu kuviossa 47. 1 119 103892 2. VAC:in fosfolipaasia inhiboiva aktiivisuus E.coli leimattiin metabolisesti ^H-öljyhapolla ja jatkokäsi- teltiin kuvatulla tavalla (Davidson, F.F. et ai. (1987) J. Biol. Chem. 262, 1690-1705). E.coli-membraanipreparaatti sisälsi 198 uM fosfolipidiä, jonka spesifinen aktiivisuus 4 oli 1,2 x 10 cpm/nanomooli fosfolipidiä. Tätä membraani-preparaattia käytettiin fosfolipaasin substraattina määritysmenetelmässä, joka suoritettiin seuraavasti: huoneen lämpötilassa inkuboitiin 103 μΐ 0,1 M Tris/HCl, pH 8,0, puskuria, joka sisälsi eri määrät VAC-proteiinia ja Ca++-ionia, ja 10 μΐ E.coli-membraaneja. hetkellä 0 lisättiin 10 ^ul 0,1 M Tris/HCl, pH 8,0, puskuria, joka sisälsi 2 ng naudanhaiman fosfolipaasia A2. Kahden minuutin kuluttua reaktio pysäytettiin lisäämällä 50 ^ul 2N suolahappoa ja 50 μΐ 0,1 M Tris/HCl pH 8,0-puskuria, joka sisälsi 100 ng/ml BSA:a. Seosta sentrifugoitiin 5 minuuttia 14.000 kierrosta minuutissa. Vapautuneen ^H-öljyhapon määrä määritettiin supernatantin tuikelaskennan avulla. Fosfolipaasi A2~aktiivisuuden inhibitioprosentti laskettiin seuraavasti: 10 0 '1 - [ (c p m , -cpm., .)/(cpm , -cpm., )]1100% pla+vac r blank r pla 1 blanp Tällöin cpmpla+VAC, cpmpla ja cpn»blank tarkoittaa sitä cpm-määrää, joka mitattiin seosten supernatanteissa, jotka sisälsivät joko fosfolipaasia A2 ja VAC:ta, fosfolipaasia A2 tai VAC:ta. Tulokset on annettu kuvioissa 48, 49, 50 ja 51.

Esimerkki 15 VAC-α:n vastaisten monoklonaalisten vasta-aineiden valmistaminen 1. VAC-α:n kytkeminen KLH ("keyhole limpet")-hemosyaniini (-hemosyaniiniin) 120 103892 VAC-α kytkettiin seuraavalla tavalla kovalenttisesti "keyhole limpet"-hemosyaniiniin (KLH; SIGMA chemical company, St. Louis, USA, katalogi-numero H-2133).

1.1 VAC-a/KLH-preparaatti 1: 0,51 mg VAC-α liuotettiin 1,5 ml:aan isotonista fosfaatti-puskuroitua natriumkloridi-liuosta, pH 7,2, (seuraa-vassa käytetty lyhennystä "PGS") ja sekoitettiin 0,12 ml:n kanssa KLH-liuosta (8 mg/ml PGS:ssa). Lisättiin 0,017 ml 25-prosenttista glutardialdehydiliuosta ja seosta inkuboitiin 45 minuuttia huoneen lämpötilassa.

Tämän jälkeen dialysoitiin yön yli 1 litraa vasten PGS-liuosta. Tämän liuoksen erät säilytettiin -20°C:ssa.

1.2. VAC-a/KLH-preparaatti 2: 2,54 mg VAC-α liuotettiin 2 ml:aan 0,1 M kaliumfosfaatti-puskuria, pH 7,0 ja sekoitettiin 0,3 ml:n kanssa KLH-liuosta (kts. 1.1). Lisättiin 0,023 ml 25-prosenttista glutardialdehydiliuosta ja seosta inkuboitiin 45 minuuttia huoneen lämpötilassa. Tämän jälkeen dialysoitiin yön yli 1 litraa vasten PGS-liuosta (kts. 1.1). Tämän liuoksen erät säilytettiin -20°C:ssa.

2. Immunisointi • · 10 viikon vanha Balb/c-naarashiiri immunisoitiin seuraavasti : 121 103892

Immunisointi Päivä VAC-a/KLH-preparaatti Apuaine 1 li (0.-15 kompletti 2 24 1 (0,15 ml) inkompletti 3 49 1 (0,15 ml) inkompletti 4 188 2 (0,1 ml) inkompletti 5 225 2 (0.1 ml) inkompletti 6 258 2 (0,1 ml) inkompletti 7 265 2 (0.1 ml) inkompletti 3 271 2 (Ojl ml) inkompletti 9 272 2 (0.1 ml) inkompletti 10 273 2 (0r1 ml) ei

Viimeistä lukuunottamatta kaikki immunisoinnit suoritettiin injisoimalla intraperitoneaalisesti emulsiota, jossa oli yhtä suuret tilavuudet antigeeni-liuosta ja Freund'in apuainetta.

3. Solujen fuusiointi ja hybridoman valitseminen

Peritoneaaliset solut saatiin Balb/c-hiiristä huuhtelemalla steriilillä sakkaroosiliuoksella (110 g/1 deionisoidussa vedessä), solut kerättiin sentrifugoimalla ja suspendoitiin 4 noin 3,5 x 10 solua/ml solutiheydellä RPMI 1640 (Roswell T Park Memorial Institute 1640)-alustaan, jossa oli natrium- pensilliiniä G (100 yksikköä/ml) ja streptomysiiniä (50 yksikköä/ml) (jäljempänä käytetään nimitystä "viljely-alusta" ja 10 % vasikansikiöseerumia. 0,1 ml:n erät pipetoitiin kudosviljelylevyjen kaivoihin (96 kaivoa levyä kohti); levyjä inkuboitiin yön yli.

Päivän kuluttua viimeisestä immunisoinnista hiiri aneste-tisoitiin eetterillä ja tapettiin. Perna poistettiin aseptisesti ja pernasolut saatiin raastamalla varovasti teräsristikolla. Solut suspendoitiin 10 ml:aan viljely-alustaa ja kerättiin sentrifugoimalla.

« * 122 103892 P3x63Ag8, 653 hiiren myeloomasoluja (Kerney et ai., J. Immunol. 123, 1548, 1979) kasvatettiin stationäärisessä suspensioviljelmässä viljelyalustassa, jossa oli 10 % vasikansikiöseerumia. Sentrifugoimalla otettiin talteen 8 noin 10 solua. Myeloomasolut lisättiin pernasoluihin; solujen sekapopulaatio kerättiin uudelleen talteen sentrifu- goimalla ja suspendoitiin 3 mlraan steriiliä liuosta, joka sisälsi 40 % polyetyleeniglykolia 4000 (Merck,

Darmstadt BRD, kataloginumero 9727) viljelyalustassa.

Suspensiota ravisteltiin varovasti 1,5 minuuttia huoneen lämpötilassa ja sen jälkeen annettiin seistä 1 minuutti.

Mukaan tiputettiin 3 ml viljelyalustaa 1,5 minuutin aikana samalla koko ajan ravistellen, minkä jälkeen suspension annettiin seistä minuutin verran. Tämän jälkeen lisättiin mukaan vielä 6 ml viljelyalustaa 1,5 minuutin aikana samalla ravistellen ja annettiin seistä 1 minuutti.

Seuraavaksi suspensio laimennettiin 3 minuutin aikana lisäämällä tipottain ja samalla ravistellen 12 ml viljely- alustaa, jossa oli 10 % vasikansikiöseerumia, minkä jälkeen annettiin seistä 15 minuuttia huoneen lämpötilassa.

Solut kerättiin sentrifugoimalla ja suspendoitiin 150 ml:aan viljelyalustaa, joka sisälsi 20 % vasikansikiösee- -5 . . -4 rumia, tymidiiniä (1,6 x 10 M), hypoksantnnia (10 M) -7 .

ja aminopteriiniä (4 x 10 ) (jäljempänä käytetään nimitystä "HAT-alusta"). Kulloinkin 0,1 ml tätä suspensiota pipetoi-tiin soluviljelylevyn kaivoihin, joihin oli laitettu edellisenä päivänä peritoneaalisia soluja (kts. edellä); levyjä inkuboitiin 3 päivää. Lisättiin 0,075 ml HAT-alustaa, minkä jälkeen viljelmiä inkuboitiin vielä 8 päivää. Kaikkien soluviljelmien inkuboinnin suoritettiin 37°C:ssa vesihöyryllä kyllästetyssä, 5 % hiilidioksidia sisältävässä ilmakehässä.

3. VAC-α:n vastaisia vasta-aineita tuottavien hybridomien seulonta

Seulonta suoritettiin entsyymillä immunotestin avulla.

123 103892

Entsyymi-immuunitestiin sopivan mikrotiitteri-levyn kaivot päällystettiin VAC-a:lla (0,005 mg/ml 0,1 M natriumkarbonaatti-puskurissa pH 9,6; yön yli 2-8°C:ssa tai 1 tunti 37°C:ssa). Liuos poistettiin ja levyt pestiin kerran deionisoidulla vedellä. Vapaat proteiinien sitoutumiskohdat blokattiin naudanseerumi-albumiinin liuoksella (5 u/ml isotonisessa fosfaatti-puskuroidussa keittosuola-liuoksessa, pH 7,2 /PGS/) tunnin aikana huoneen lämpötilassa, minkä jälkeen pestiin kerran vedellä. Jokaiseen kaivoon lisättiin 0,1 ml hybridoma-supernatanttia ja inkuboitiin 2-3 tuntia huoneen lämpötilassa. Tämän jälkeen supernatantit poistettiin ja kaivot pestiin kolme kertaa vedellä.

Lisättiin 0,05 ml liuosta, joka sisälsi hiiren immunoglobu-liinin vastaisia, piparjuuriperoksidaasin kanssa konjugoituja kaniinin vasta-aineita (Dakopatts, Kööpenhamina, Tanska, kataloginumero P161; 1:2000 PGSrssa) ja jossa oli 5 mg/ml naudanseerumialbumiinia, ja inkuboitiin 3 tuntia huoneen lämpötilassa, minkä jälkeen pestiin kolme kertaa vedellä. Lisättiin 0,1 ml juuri valmistettua seosta, joka sisälsi yhtä suuret tilavuudet orto-fenyleenidiamiinin (8,65 mg/ml 0,1 M kaliumsitraatissa, pH 5), natriumperboraat-tia (3,75 mg/ml 0,1 M kaliumsitraatissa, pH 5) ja vettä. Inkuboitiin 30 minuuttia huoneen lämpötilassa, minkä jälkeen lsiättiin 0,1 ml 4 N rikkihappoa. Liuoksen optinen tiheys määritettiin mikrotiitterilevyille tarkoitetulla monikanavaisella fotometrillä aallonpituudella 492 nm. Negatiivisina kontrolleina käytettiin soluviljelyalustaa, joka sisälsi 20 % vasikansikiöseerumia, ja positiivisina kontrolleina immunisoidun hiiren seerumien (laimennettu PGS:ssa 5 mg/ml naudanseerumialbumiinilla). Kaikkien • # hybridomaviljelmien viljelysupernatantit testattiin kahdessa toisistaan riippumattomassa testissä 11 tai 13 päivää solujen fuusioinnin jälkeen. Kummassakin testissä positiivisen signaalin antaneet viljelmät tutkittiin toisessa seulontatestissä, jossa käytettiin sekä päällystämättömiä että VAC-a:lla päällystettyjä.testilevyjä. Päällystetyillä levyillä saatiin kahdella viljelmällä 124 103892 toistuvasti positiivisia tuloksia, mutta ei päällystämättömillä levyillä. Tulokset on koottu seuraavaan taulukkoon: Näyte Optinen tiheys, 492 nm

Koe 1 Koe 2 päällystetty päällystetty päällystämätön päällystämätön

Hiiren seerumi 1:100 0,291 0,152 1,735 0,475

Hybridoma VAA-8 1,061 0,102 1,169 0,108

Hybridoma VAA-9 0,552 0,187 0,387 0,109

Negatiiviset kontrollit 0,032 0,031 0,071 0,055

Esimerkki 16:

Ekspressiovektoreiden pRH281/n ja pRH281/nT {n=5,6,7,8,9) valmistaminen

Patenttijulkaisussa EPÄ n:o 186 098 kuvatulla ekspressio-vektorilla pRHIOO on erilaisia haittoja: a) ribosomaalisen sitoutumiskohdan (RBS) ja translaation aloitus-ATG:n välinen etäisyys on vakio eikä optimaalinen

b) RBS:n ja ATG:n välissä on muutama C ja muutama G

c) Serratia marcescens-bakteerin trp-promoottorin -35 alue ei ole optimaalinen verrattuna E.coli'n sekvenssiin (TTGACT TTGACA:n asemesta) d) Promoottorin edellä oleva EcoRI-kohta on tarpeeton.

Syntetisoitiin joukko oligonukleotidejä, joilla on seuraavat sekvenssit: 125 103892 : Trp-l-> :: Trp-3-> AATTGACGCTGATGGCTAAAACATTGTGCAAAAAGAGGGTTGACATTGCC CTGCGACTACCGATTTTGTAACACGTTTTTCTCCCAACTGTAACGG <-Trp-2:: *—>'transkription alku ::Trp-5->

TTCGCGAACCAGTTAACTAGTACACAAGTTCACGGCTCGAGACGGTAAGG

AAGCGCTTGGTCAATTGATCATGTGTTCAAGTGCCGAGCTCTGCCATTCC

<-Trp-4:: ----

RBS

SstI Clal ------EcoRI ---- •

AGGTTTAATATGAGCTCGAATTCAT

TCCAAATTATACTCGAGCTTAAGTAGC

---- --- <-Trp-6:

RBS Translaation aloitus-ATG

: n = S :

Kulloinkin fosforyloitiin 10 yul:ssa 100 pikomoolia oligo-nukleotideja Trp-2, Trp-3, Trp-4 ja Trp-5. Reaktion jälkeen yhdistettiin yhtä suuret moolimäärät (kulloinkin 100 pikomoolia) oligonukelotidejä Trp-1 ja Trp-2, Trp-3 ja Trp-4 sekä Trp-5 ja Trp-6, kuumennettiin 100°C:een ja annettiin hybridisoitua jäähdyttämällä hitaasti. Oligonukleotidiparit yhdistettiin ja ligatoitiin 55 ulissa. pAT153 kaksoispilkottiin EcoRI:11a ja Clal:11a ja suuri vektorifragmentti eristettiin. 50 ng pAT153-. \ fragmenttia ligatoitiin 20 pikomoolin kanssa synteettistä promoottori-DNA:a 20 jil:ssa. Kompetentit E.coli HB101-solut transformoitiin syntyneellä plasmidilla. Syntyneistä pesäkkeistä valittiin muutama, plasmidi-DNA eristettiin ja sekvenssoimalla tutkittiin liitetyn DNA:n alue.

Valittiin yksi plasmidi ja tälle annettiin nimeksi pRH281/5, « 126 103892 jossa 5 tarkoittaa nukleotidien lukumäärää RBS:n ja translaation aloitus-ATG:n välillä.

Tästä ekspressiovektorista lähtemällä korvattiin edellä kuvatulla tavalla XhoI-Sstl-insertti seuraavilla oligonuk-leotidipareilla: a) TCGAGACGGTAAGGAGGTTTAAATATGAGCT Trp-9 CTGCCATTCCTCCAAATTTATAC Trp-10 b) TCGAGACGGTAAGGAGGTTTAAATAATGAGCT Trp-11 CTGCCATTCCTCCAAATTTATTAC Tcp-12 C) TCGAGACGGTAAGGAGGTTTAAAATAATGAGCT Trp-13 CTGCCATTCCTCCAAATTTTATTAC Trp-14 d) TCGAGACGGTAAGGAGGTTTAAAAATAATGAGCT Trp-15 CTGCCATTCCTCCAAATTTTTATTAC Tr p-16

Saaduille ekspressiovektoreille annettiin nimiksi pRH281/6, PRH281/7, PRH281/8 ja pRH281/9.

Näillä uusilla ekspressiovektoreilla on seuraavat ominaisuudet : a) pAT153:n alkuperäinen EcoRI-kohta on tuhottu.

b) Serratia marcescens-promoottorin -35 alue on sovitettu E.coli'n trp-promoottorin vastaavaan alueeseen.

c) Ennen keinotekoista ribosomaalista sitoutumiskohtaa on yksi ainutkertainen Xhol-kohta, joka mahdollistaa toisen RBS:n mukaanlaittamisen.

d) Translaation aloitus-ATG:n G on SstI (=SacI)-kohdan ensimmäinen emäs. Katkaisemalla SstI:11a ja sen jälkeen hajottamalla 3'-ylipitkä pää saadaan tylppä pää, johon ;' voidaan ligatoida mielivaltainen cDNA tai geeni. Jos 127 103892 tämä DNA alkaa translatoitavan alueen ensimmäisellä emäksellä, transkriptio ja translaatio tapahtuvat oikein E.coli'ssa.

e) Tämän Sstl-kohdan 3'-puolella on yksi ainutkertainen EcoRI-, Clal- ja Hindlll-kohta, jota voidaan kätytää ekspressoitavan DNA:n suunnattuun kloonaamiseen. Lisäksi tähän tarkoitukseen voidaan käyttää ainutkertaisia katkai-sukohtia tetrasykliinin resistenttiysgeenissä.

f) Variaation /5 - /9 kautta on mahdollista määrittää RBS:n ja ATG:n optimaalinen etäisyys kyseisellä geenillä.

Plasmidin optimaalista ekspressointia ja stabiilisuutta varten on usein tarpeellista laittaa ekspressoidun geenin taakse transkription terminaattori (R.Gentz et ai.,

Proc.Natl.Acad.Sei.USA 78 (1981), 4936-4940). pRH281/5:n HindIII-SalI-fragmentti leikattiin irti kaksoispilkkomisen avulla. Puuttuva pala korvattiin phoA-transkription terminaattorin (H.Shuttleworth et ai. Nucl.Acids Res.

14 ( 1986) , .8689; C.N.Chang et ai., Gene 44 (1986), 121-125) sisältävällä oligonukleotidiparilla: :EBI-456->

AGCTTGGATCCGTCGACCGCGCCCGGCAGTGAATTTTCGCTGCCGGGTGG

ACCTAGGCAGCTGGCGCGGGCCGTCACTTAAAAGCGACGGCCCACC

-----BamHI ------

Hindlll Sali TTTTTTTGCTGC AAAAAAACGACGAGCT ' ·: <-EBI-459: 128 1 0 3 8 9 2 10 pikomoolia hybridisoitua oligonukleotidiparia ligatoi-tiin 20 ul:ssa liuosta 100 ng kanssa Hindlll-Sall-kaksois-pilkottua pRH281/5-vektoriosaa. E.coli HB101-solujen transformoinnin, muutaman pesäkkeen plasmidi-DNA:n eristämisen ja niiden sekvenssoimalla tapahtuvan todistamisen jälkeen valittiin yksi plasmidi, jolle annettiin nimeksi pRH281/5T.

Edellä kuvatun tavan kanssa analogisesti valmistettiin oligonukleotideja Trp-9 - Trp-16 käyttämällä tästä plasmidista sarja pRH281/6T, pRH281/7T, pRH281/8T ja pRH281/9T.

Esimerkki 17: VAC-alfan mutantit VAC-alfa-DNA:lie suoritettiin seuraavat mutaatiot (aminohappojen ja emästen numeroinnit ovat samat kuin kuviossa 4) : a) VAC-molekyylin pienentäminen: VAC-alfassa on neljä kertaa toistuva 67/68 aminohappoa pitkä sekvenssi, jossa on ainutkertainen N-terminaalinen jatke (kuvio 6). Valmistettiin kolme lyhennettyä muotoa: i) Aminohappojen 2-18 deletointi: Ainutkertaisen N-terminaalisen jatkeen poistaminen, Met-1 on ennen aminohappoa Ala-19.

ii) Kolmannen ja neljännen toiston deletointi: Arg-161-kodoni mutatoitiin pysäytyskodoniin asti.

iii) N-terminaalisen ainutkertaisen jatkeen sekä ensimmäisen ja toisen toistokohdan N-terminaalinen deletointi. Met-1 ·. on ennen aminohappoa Ala-165.

b) VAC-alfan proteolyyttisen hajoamisen mahdollinen hyökkäyskohde on Arg-161. Sen vuoksi tämä aminohappo mutatoitiin: i) Arg-161 aminohappoon Glu-161 • 129 103892 ii) Arg-161 aminohappoon Gln-161.

c) Rakentamalla faktori Xa:n katkaisukohta toisen ja kolmannen toistokohdan väliin voidaan mahdollisesti sitoa VAC-proteiiniin hyytymiskaskadin inhibitiolta välttyvä faktori Xa ja/tai tämä jopa voidaan hajottaa kahteen funktionaaliseen puoliskoon ja näin nostaa VAC-alfan tehokkuutta. Sen vuoksi suoritettiin seuraavat mutaatiot: Asp-168 aminohappoon Glu-168, Glu-169 aminohappoon Gly-169 ja Ala-170 aminohappoon Arg-170. Näin saadaan faktorin Xa tunnistamissekvenssi Ile-Glu-Gly-Arg.

d) Jotta voitaisiin vastata kysymykseen aminohapon kysteiini-316 tärkeydestä biologiselle vaikutukselle ja samalla jotta voitaisiin tutkia sen osuus dimeerin muodostumiseen, mutatoitiin i) Cys-316 aminohappoon Ser-316 ja ii) Cys-316 aminohappoon Val-316.

e) N-terminaalisen jatkeen vaikutusta tutkittiin korvaamalla tämä jatke (Ala-2 - Ala-19) kulloinkin lipokortiinista I, kalpaktiinista I ja VAC-betasta saaduilla N-päillä.

Ensimmäisessä vaiheessa valmistettiin ekspressiovektori ” pGNIO ekspressiovektorista pRH291. Tässä ekspressiovek- torissa on faagilambdan dl RBS pRH291:ssa käytetyn STII-RBS:n asemasta. pRH291 kaksoispilkottiin XhoI:lla ja Kpnl:lla. Suuri fragmentti eristettiin. 40 pikomoolia oligonukleotidiparia EBI-725/EBI-727 hybridisoitiin 6 pl.-ssa seuraavan sekvenssin kanssa:

EBI-7 25 TCGAGTTATCTAAGGAAATACTTACATATGGCACAGGTTCTCAGAGGTAC EBI-7 2 7 CAATAGATTCCTTTATGAATGTATACCGTGTCCAAGAGTCTC

XhoI RBS ATG Kpnl 130 103892 ja tämän jälkeen ligatoitiin 20 ^il:ssa liuosta käyttämällä noin 200 ng pRH291/suurta fragmenttia. Kompetentit E.coli HBlOl-solut transformoitiin. Syntyneistä ampisilliini-resistenteistä klooneista eristettiin muutaman kloonin plasmidit ja tutkittiin uuden DNA-palan sekvenssi. Valittiin yksi klooni ja tälle annettiin nimeksi pGNlO.

Mutageneesireaktion esivalmisteluna eristettiin PvuII-Sphl-fragmentti pGNlO-kloonista. PvuII katkaisee irti phoA:ssa promoottoriosan ja Sphl katkaisee irti transla-toimattomalla alueella VAC-alfa-cDNA:n. VAC-alfa-cDNA:n sisältävä fragmentti puhdistettiin ja kloonattiin M13mpl8:n Smal/SphI-kaksoispilkottuun kaksisäikeiseen muotoon.

E.coli JM101-solujen transformoinnin jälkeen valittiin syntyneistä plakeista yksi ja valmistettiin suuressa mitassa Ml3/VAC-alfan yksijuosteista DNA:ta.

Mutaatioreaktiot suoritettiin "Oligonucleotide-directed in vitro mutagenesis systen" Amersham, koodi RPN.2322)-systeemin avulla noudattamalla tarkkaan mukaanliitettyä ohjetta.

Muodostuneiden mutanttien sekvenssin vahvistamisen jälkeen eristettiin rekombinantti-M13mp8/VAC-alfan faagi-DNA:n vastaava kaksisäikeinen muoto plasmidi-minimipreparaattina. Lukuunottamatta EBI-977:n kanssa tehtyä mutaatiota (Clal-kohta Nt.105-110:aan (tämä DNA kaksoispilkottiin XhoI:lla ja Sphl:11a ja eristettiin VAC-cDNA:n sisältävä fragmentti. 10 jil:ssa liuosta ligatoitiin noin 50 ng tätä fragmenttia ja 50 ng vektorin XhoI-SpHI-kaksoispil-.· kottua pRH281/5-osaa ja syntynyt plasmidi transformoi tiin komponentteihin E.coli HBlOl-soluihin. Muutaman saadun kloonin plasmidit eristettiin ja niistä tutkittiin restriktioentsyymeillä pilkkomalla rakenteen oikeellisuus. Lisäksi fermentoitiin viimeksi valittu pesäke laboratorio-mitassa ja bakteerin proteiinit tutkittiin Westernblot- « 131 103892 analyysillä käyttämällä kaniinin anti-VAC-antiseerumia.

Seuraavassa taulukossa on annettu yhteenveto valmiste-tuissta mutanteista:

Mutatointi- Saatu ekspressio- Uuuden kloonin oligo vektori ominaisuudet EBI-1051 pGN42 Deleetio Ala=2ista amino happoon Arg-18 EBI-964 pGN29 Translaation pysäytys- kohta (deleetio Arg-161:sta aminohappoon Asp-320)

EbI-1105 pGN43 Deleetio Ala-2:sta amino happoon Asp-164 EBI-1103 pGN44 Arg-161 aminohappoon Gln-161 EBI-1104 pGN45 Arg-161 aminohappoon Glu-161 EBI-960 pGN30 Faktori Xa:n katkaisukohta 167 - 170:ssa EBI-961 pGN41 Cys-316 aminohappoon Ser-316 EBI-959 pGN46 Cys-316 aminohappoon Val-316 EBI-977 pGN31 Clal-kohta Nt.105-110

Mutatio-oligojen sekvenssit ovat (5'-->3):

EBI-1051: CCGAAGAGTTTCTGCATCAGCCATATGTAAGTATTTCCTTAG

EBI-964: AATTCCAGCATCAOGGTCTTAGTTAGCCTGAAGGAGAAC

»

EBI-1105: AGCTTCATCAATTCCAGCCATATGTAAGTATTTCC

EBI-1103: AATTCCAGCATCAGGGTCCTGGTTAGCCTGAAGGAGAAC

EBI-1104: AATTCCAGCATCAGGGTCTTCGTTAGCCTGAAGGAGAAC

EBI-960: GCCTGAGCATCTTGTTCAACTTGACGACCTTCAATTCCAGCA

TCAGGGTCTCTG

132 1 0 3 8 9 2

EBI-961: CGTTAGTCATCTTCTCCTGAGAGCAGCAGAAGAGC

EBI- 9 5 9 : CGTTAGTCATCTTCTCCCACGAGCAGCAGAAGAGC

EBI-977: CAACAGAGTCAGGATCGATTCCTCATCTGTGCCC

Annetut sekvenssit ovat komplementtisiä kuvion 4 DNA-sekvenssin kanssa, mikä johtuu VAC-alfa-cDNA:n kloonaamisesta ml3mpl8:aan.

Mutatoitu DNA, jossa oli Clal-kohta Nt.105 - 110, vapautettiin kaksoispilkkomalla EcoRIrlla ja HindIII:lla rekombinantti-M13mpl8:n kaksisäikeisestä muodosta, DNA eristettiin ja kloonattiin EcoRI-Hindlll-kaksoispilkottuun Bluescribe M13+-vektoriin (Stratagene, La Jolla, Kalifornien, USA). Syntyneelle plasmidille annettiin nimeksi pGN31. pGN31 kaksoispilkottiin Clal:lla ja XhoI:11a ja suuri fragmentti eristettiin. Erilaisia oligonukleotidipareja käyttämällä liitettiin lipokortiini I:lle (K.-S. Huang et ai. Cell 46 (1986), 191-199), kalpaktiini I:lie.(lipokortiini II, iK.-S. Huang ete ai. Cell 46 (1986), 191-199) ja VAC-betalle spesifinen N-pää: a) Lipokortiini I-spesifinen N-pää :EBI-972-> : Lipokortiinin alku

TCGAGAGGTTGAGGTGATTTTATGGCAATGGTATCAGAATTCCTCAAGCA CTCCAACTCCACTAAAATACCGTTACCATAGTCTTAAGGAGTTCGT

GGCCTGGTTTATTGAAAATGAAGAGCAGGAATATGTTCAAACTGTGAAGT

CCGGACCAAATAACTTTTACTTCTCGTCCTTATACAAGTTTGACACTTCA

133 103892 ::EBI-977->

CATCCAAAGGTGGTCCCGGATCAGCGGTGAGCCCCTATCCTACCTTCAAT

GTAGGTTTCCACCAGGGCCTAGTCGCCACTCGGGGATAGGATGGAAGTTA <-EBI-988:: : VAC-alfa-jatko

CCATCCTCGGATGCAGAAACTCTTCGGAAGGCTATGAAAGGCTTGGGCAC

ggtaggagcctacgtctttgagaagccttccgatactttccgaacccgtg

AGATGAGGAAT

TCTACTCCTTAGC <-EBI-982: 6 pulissa liuosta fosforyloitiin kulloinkin 1 pikomooli EBI-978:a ja EBI-988:a. Reaktio pysäytettiin kuumentamalla 100°C:een, lisättiin kulloinkin 1 pikomooli EBI:972:a ja EBI-982:a, liuos kuumennettiin vielä kerran 100°C:een ja jäähdytettiin hitaasti. Kummatkin oligonukleotidiparit ligatoitiin keskenään lisäämällä ligaasia. Tämän jälkeen lisättiin noin 1 ^g pGN31 Clal-XhoI-suurta fragmenttia, tilavuus nostettiin 40 piisaan ja ligatoitiin. Kompetenttien E.coli JM101-solujen transformoinnin jälkeen valittiin muutama klooni ja niiden plasmidit muunnettiin yksisäikei-seksi DNA.-ksi Stratagene-yhtiön Bluescribe-prtokollan avulla apufaagin avulla, minkä jälkeen sekvenssoitiin. Oikeista plasmideista valittiin yksi ja tälle annettiin nimeksi pGN32. XhoI:lla ja HindIII:lla (tämä on Sphl-kohdan takana Bluescribe M13+-vektorin multikloonauskoh-dassa) leikattiin insertti irti vektorista ja puhdistettiin. Myös pRH281/5 kaksoispilkottiin XhoI:lla ja HindIII:lla ja eristettiin vektorifragmentti. 20 pulissa liuosta ligatoitiin 200 ng pGN32-inserttiä ja noin 50 ng pRH281/5-osavektoria. DNA transformoitiin E.coli HBlOl-soluihin ja muutaman ampisilliiniresistensin kloonin plasmidi-DNA tutkittiin restriktioentsyymianalyysin avulla rakenteen 134 103892 oikeellisuuden osoittamiseksi. Lisäksi fermentoitiin viimeksi valittua pesäkettä laboratoriomitassa ja bakteerin proteiinit tutkittiin Westernblot-analyysillä käyttämällä kaniinin anti-VAC-antiseerumia. Saadulle lipokortiini i/VAC-alfa-hybridin ekspressioplasmidille annettiin nimeksi pGN35.

b) Kalpaktiini I-spesifinen N-pää: :EBI-990-> Kalpaktiinin alku

TCGAGAGGTTGAGGTGATTTTATGTCTACTGTTCACGAAATCCTGTGCAA

CTCCAACTCCACTAAAATACAGATGACAAGTGCTTTAGGACACGTT

GCTCAGCTTGGAGGGTGATCACTCTACACCCCCAAGTGCATATGGGTCTG

CGAGTCGAACCTCCCACTAGTGAGATGTGGGGGTTCACGTATACCCAGAC

<- ::EBI-1001-> :VAC-alfa-jatko TCAAAGCCTATACTAACTTTGATGCTGAGCGGGATGCAGAAACTCTTCGG AGTTTCGGATATGATTGAAACTACGACTCGCCCTACGTCTTTGAGAAGCC EB1-985::

AAGGCTATGAAAGGCTTGGGCACAGATGAGGAAT

TTCCGATACTTTCCGAACCCGTGTCTACTCCTTAGC

<-EBI-994:

Rekombinantti-Bluescribe M13+ plasmidin pGN33 valmistaminen, sen sekvenssin tutkiminen ja uudelleenkloonaus pRH281/5 ekspressiovektoriin suoritettiin samalla tavoin kuin mitä kuvattiin lipokortiini I-hybridin yhteydessä. Saadulle ekspressioplasmidille (kalpaktiini I/VAC-alfa-hybridi) annettiin nimeksi pGN36.

135 103892 c) VAC-beta-spesifinen N-pää: :EBI-987-> :VAC-betan alku

TCGAGAGGTTGAGGTGATTTTATGGCCTGGTGGAAATCCTGGATTGAACA CTCCAACTCCACTAAAATACCGGACCACCTTTAGGACCTAACTTGT

: VAC-

GGAGGGTGTCACAGTGAAGAGCAGCTCCCACTTCAACCCAGACCCTGATG

CCTCCCACAGTGTCACTTCTCGTCGAGGGTGAAGTTGGGTCTGGGACTAC

Alfa-jatko

CAGAAACTCTTCGGAAGGCTATGAAAGGCTTGGGCACAGATGAGGAAT

GTCTTTGAGAAGCCTTCCGATACTTTCCGAACCCGTGTCTACTCCTTAGC

<-EB 1-989:.

Rekombinantti-BluescribeM13+-plasmidin pGN34 valmistamista varten hybridisoitiin nyt vain oligonukleotidipari (kulloinkin 1 pikomooli 6 μΐ-.εεεί) kuumentamalla ja hitaasti jäähdyttämällä, minkä jälkeen ligatoitiin edellä kuvatulla tavalla XhoI-Clal-kaksoispilkottuun pGN31-vektoriin. Ekspressiovektori pGN37 (VAC-beta/VAC-alfa-hybridi pRH281/5:ssa) valmistettiin edellä kuvatulla tavalla.

136 103892

Patenttivaatimukset 1. Rekombinantti-DNA-molekyyli, joka koodaa polypeptidiä/pro-teiinia, jolla on oleellisesti vaskulaaristen antikoaguloivien proteiinien biologiset ominaisuudet, tunnettu siitä, että sen DNA-sekvenssi on yksi seuraavista

ATG GCA CAG GTT CTC AGA GGC ACT GTG ACT GAC TTC CCT GGA TTT

GAT GAG CGG GCT GAT GCA XXX ACT CTT CGG AAG GCT ATG AAA GGC

TTG GGC ACA GAT GAG GAG AGC ATC CTG ACT CTG TTG ACA TCC CGA

AGT AAT GCT CAG CGC CAG GAA ATC TCT GCA GCT TTT AAG ACT CTG

TTT GGC AGG GAT CTT CTG GAT GAC CTG AAA TCA GAA CTA ACT GGA

AAA TTT GAA AAA TTA ATT GTG GCT CTG ATG AAA CCC TCT CGG CTT

TAT GAT GCT TAT GAA CTG AAA CAT GCC TTG AAG GGA GCT GGA ACA

AAT GAA AAA GTA CTG ACA GAA ATT ATT GCT TCA AGG ACA CCT GAA

GAA CTG AGA GCC ATC AAA CAA GTT TAT GAA GAA GAA TAT GGC TCA

AGC CTG GAA GAT GAC GTG GTG GGG GAC ACT GCA GGG TAC TAC CAG

CGG ATG TTG GTG GTT CTC CTT CAG GCT AAC AGA GAC CCT GAT GCT

GGA ATT GAT GAA GCT CAA GTT GAA CAA GAT GCT CAG GCT TTA TTT

GAC GCT GGA GAA CTT AAA TGG GGG ACA GAT GAA GAA AAG TTT ATC

ACC ATC TTT GGA ACA CGA AGT GTG TCT CAT TTG AGA AAG GTG TTT

GAC AAG TAC ATG ACT ATA TCA GGA TTT CAA ATT GAG GAA ACC ATT

GAC CGC GAG ACT TCT GGC AAT TTA GAG CAA CTA CTC CTT GCT GTT

GTG AAA TCT ATT CGA AGT ATA CCT GCC TAC CTT CGA GAG ACC CTC

TAT TAT GCT ATG AAG GGA GCT GGG ACA GAT GAT CAT ACC CTC ATC

AGA GTC ATG GTT TCC AGG AGT GAG ATT GAT CTG TTT AAC ATC AGG

AAG GAG TTT AGG AAG AAT TTT GCC ACC TCT CTT TAT TCC ATG ATT

AAG GGA GAT ACA TCT GGG GAC TAT AAG AAA GCT CTT CTG CTG CTC

TGT GGA GAA GAT GAC TAA

137 103892 jolloin XXX on GAA tai GAC, joka koodaa polypeptidiä/proteii-nia, jolla on oleellisesti vaskulaaristen antikoaguloivien proteiinien biologiset ominaisuudet; tai

ATG GCC TGG TGG AAA GCC TGG ATT GAA CAG GAG GGT GTC AGA GTG

AAG AGC AGC TCC CAC TTC AAC CCA GAC CCT GAT GCA GAG ACC CTC

TAC AAA GCC ATG AAG GGG ATC GGG ACC AAC GAG CAG GCT ATC ATC

GAT GTG CTC ACC AAG AGA AGC AAC ACG CAG CGG CAG CAG ATC GCC

AAG TCC TTC AAG GCT GAC TTG GGC AAG GAC CTC ACT GAG ACC TTG

AAG TCT GAG CTC AGT GGC AAG TTT GAG AGG CTC ATT GTG GCC CTT

ATG TAT CCG CCA TAC AGA TAC GAA GCC AAG GAG CTG CAT GAC GCC

ATG AAG GGC TTA GGA ACC AAG GAG GGT GTC ATC ATT GAG ATC CTG

GCC TCT CGG ACC AAG AAC CAG CTG CGG GAG ATA ATG AAG GCG TAT

GAG GAA GAC TAT GGG TCC AGC CTG GAG GAG GAC ATC CAA GCA GAC

ACA AGT GGC TAC CTG GAG AGG ATC CTG GTG TGC CTC CTG CAG GGC

AGC AGG GAT GAT GTG AGC AGC TTT GTG GAC CCG GCA CTG GCC CTC

CAA GAC GCA CAG GAT CTG TAT GCG GCA GGC GAG AAG ATT CGT GGG

ACT GAT GAG ATG AAA TTC ATC ACC ATC CTG TGC ACG CGC AGT GCC

ACT CAC CTG CTG AGA GTG TTT GAA GAG TAT GAG AAA ATT GCC AAC

AAG AGC ATT GAG GAC AGC ATC AAG AGT GAG ACC CAT GGC TCA CTG

GAG GAG GCC ATG CTC ACT GTG GTG AAA TGC ACC CAA AAC CTC CAC

AGC TAC TTT GCA GAG AGA CTC TAC TAT GCC ATG AAG GGA GCA GGG

ACG CGT GAT GGG ACC CTG ATA AGA AAC ATC GTT TCA AGG AGC GAG

ATT GAC TTA AAT CTT ATC AAA TGT CAC TTC AAG AAG ATG TAC GGC

AAG ACC CTC AGC AGC ATG ATC ATG GAA GAC ACC ACG GGC GAC TAC

AAG AAC GCC CTG CTG AGC CTG GTG GGC AGC GAC CCC TGA

joka koodaa polypeptidiä/proteiinia, jolla on oleellisesti vaskulaaristen antikoaguloivien proteiinien biologiset ominaisuudet .

2. Rekombinantti-DNA-molekyyli, tunnettu siitä, että se hybridisoituu patenttivaatimuksen 1 mukaisen DNA-molekyylin kanssa olosuhteissa, jotka voivat tunnistaa homologian, joka on yli 85 %, edullisesti yli 90 %, ja koodaa polypeptidiä/pro- 138 103892 teiinia, jolla on oleellisesti vaskulaaristen antikoaguloivien proteiinien biologiset ominaisuudet.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen rekombinantti-DNA-molekyyli, tunnettu siitä, että se on liitetty vektoriin.

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen rekombinantti-DNA-molekyyli, tunnettu siitä, että se on liitetty vektoriin funktionaaliseen yhteyteen ekspression kontrollisekvenssin kanssa, jolloin se voi replikoitua mikro-organismeissa ja nisäkässo-luissa.

5. Patenttivaatimuksen 3 tai 4 mukainen rekombinantti-DNA-molekyyli, tunnettu siitä, että vektori on plasmidi, joka voi replikoitua prokaryooteissa.

6. Isäntäorganismi, tunnettu siitä, että se on proka-ryootti, mieluummin E.coli, transformoitu jonkin patenttivaatimuksen 1-5 mukaisella rekombinantti-DNA-molekyylillä.

7. Menetelmä valmistaa jonkin patenttivaatimuksen 1-5 mukaisia rekombinantti-DNA-molekyylejä, jotka koodaavat polypepti-dejä/proteiineja, joilla on oleellisesti vaskulaaristen antikoaguloivien proteiinien ominaisuudet, tunnettu siitä, että genomisesta DNA-kirjastosta eristetään tätä poly-peptidiä koodaava geeni tai tähän geeniin kuuluvasta mRNA:sta valmistetaan tätä polypeptidiä koodaava DNA käänteistranskrip-taasi-entsyymin avulla tai että tätä polypeptidiä koodaava DNA valmistetaan kemiallisten ja/tai entsymaattisten menetelmien avulla.

8. Menetelmä valmistaa jonkin patenttivaatimuksen 3-5 mukaista rekombinantti-DNA-molekyyliä, tunnettu siitä, että restriktioendonukleaasien avulla pilkottuun vektori- 139 103892 DNA:an liitetään vastaavilla päillä varustettu DNA, joka koodaa polypeptidiä, jolla on oleellisesti vaskulaaristen antikoaguloivien proteiinien ominaisuudet.

9. Menetelmä valmistaa patenttivaatimuksen 4 tai 5 mukaista rekombinantti-DNA-molekyyliä, tunnettu siitä, että restriktioendonukleaasilla pilkottuun vektori-DNA:an, joka sisältää ekspression kontrollisekvenssit, liitetään vastaavilla päillä varustettu DNA, joka koodaa polypeptidiä, jolla on oleellisesti vaskulaaristen antikoaguloivien proteiinien ominaisuudet, siten että liitetty DNA säätelee ekspression kontrol1isekvenssejä.

10. Menetelmä valmistaa patenttivaatimuksen 6 mukaisia transformoituja isäntäorganismeja, tunnettu siitä, että isäntäorganismit transformoidaan jonkin patenttivaatimuksen 1-5 mukaisella vektorilla.

11. Menetelmä valmistaa polypeptidejä, joilla on oleellisesti vaskulaaristen antikoaguloivien proteiinien ominaisuudet, tunnettu siitä, että a. sopiva isäntäorganismi transformoidaan jonkin patenttivaatimuksen 1-5 mukaisen rekombinantti-DNA-molekyylin VAC-pro- ! teiinia koodaavalla geneettisellä informaatiolla, b. informaatio ekspressoidaan VAC-proteiinien tuottamiseksi isäntäorganismissa ja c. VAC-proteiini eristetään.

12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että isäntäorganismi on määritelty patenttivaatimuksen 6 mukaisesti.