KR910000456B1

KR910000456B1 - 인간성장호르몬 유전자를 함유하는 벡터 pBR-HGH

Info

Publication number: KR910000456B1
Application number: KR1019880018189A
Authority: KR
Inventors: 조중명; 이용범; 이태규; 박영우
Original assignee: 주식회사 럭키; 최근선
Priority date: 1988-12-31
Filing date: 1988-12-31
Publication date: 1991-01-25
Also published as: KR900009973A

Abstract

내용 없음.

Description

인간성장호르몬 유전자를 함유하는 벡터 pBR-HGH

제1도는 인간성장호르몬의 cDNA 염기서열 및 아미노산서열을 나타낸 것이고,

제2도는 본 발명에 따른 인간성장호르몬 유전자를 함유하는 벡터 pBR-HGH를 제조하는 과정을 나타낸 것이고,

제3도는 본 발명에 따른 인간성장호르몬 유전자를 함유하는 벡터 pBR-HGH를 도시한 것이다.

본 발명은 인간성장호르몬 유전자를 함유하는 벡터 pBR-HGH에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 대장균을 발현체로 하는 인간성장호르몬 발현 벡터를 제조하는데 가장 효율적으로 사용될 수 있는 인간성장호르몬 유전자를 함유하는 벡터 pBR-HGH에 관한 것이다.

인간성장호르몬(Human Growth Hormone)은 191개의 아미노산기로 구성되는 분자량 약 21,500의 펩타이드 호르몬으로서, 주로 왜소증(倭小症)의 치료에 사용되어 왔다(Robin, M.S., Clim. Endocr., 18, 901(1985)).

종래에는 주로 교통사고나 질병으로 사망한 인간의 뇌하수체로부터 인간성장호르몬을 추출 정제하여 사용하여 왔으나, 그 양이 크게 제한되어 있어서 모든 왜소증 환자에게 공급되지 못하였으며 가격 또한 높아 사용에 많은 어려움이 있었다.

또한, 최근에 사망한 인간의 뇌하수체로부터 추출 정제한 인간성장호르몬을 투여받은 4명의 어린이가 밝혀지지 않은 괴질의 바이러스에 감염되어 사망하고 사고가 발생하는 등 그 사용에 문제점이 있었는 바, 미국식품의 약국(FDA)에서는 상기의 방법과 같이 사망한 인간의 뇌하수체로부터 추출정제한 인간성장호르몬의 사용을 금지시켰다(Science, 234, 22(1986)).

한편, 인간성장호르몬의 다른 제조방법으로서, 화학적 합성이나 조직 배양법 또는 기타 유전자 조합에 의해 미생물 배양법 등이 공지되어 있으나, 이들 방법 역시 수율이 낮을 뿐만 아니라 제조과정의 불합리로 가격이 상승되는 등 많은 문제점을 갖고 있다.

이에 본 발명자들은 상기와 같은 문제를 해결하고자 연구 노력한 결과, 대장균을 발현체로 하여 안전한 인간성장호르몬을 대량 생산하는데 유용하게 사용될 수 있는 인간성장호르몬 발현 벡터를 제조하는데 가장 효율적으로 사용될 수 있는 인간성장호르몬 유전자를 함유하는 벡터를 발명하게 되었다.

즉, 본 발명은 인간성장호르몬 발현 벡터를 제조하는데 유용한 인간성장호르몬 유전자를 함유하는 벡터를 제공하는데 있다.

이하 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명은, 제한효소 Sst I 및 Sal I 부위를 갖는 인간성장호르몬 유전자와 제한효소 Nde I 및 Sst I 부위를 갖는 아미노말단 합성유전자 및 제한효소 Nde I/Sal I으로 절단시킨 대장균 운반체로 구성되어진 것을 특징으로 하는 제한효소 Sst I, Nde I 및 Sal I 부위를 갖는 인간성장호르몬 유전자를 함유하는 벡터 pBR-HGH를 제공하는 것이다.

이와 같은 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.

인간성장호르몬 cDNA 라이브러리를 작성하기 위해, 우선 인간성장호르몬을 분비하는 조직세포인 뇌하수체로부터 Chirgwin et al. (Biochemistry, 18, 5294(1979))의 방법으로 poly(A)⁺RNA를 분리한 후, Okayama, H, ＆ Berg, P. (Mol. Cell Biol. 2 : 161(1982))의 방법으로 이중나선의 cDNA(complementary DNA)를 만든다. 그 다음, 제한효소 EcoR I 부위를 메틸화시키고 EcoR I 링커를 접합시킨 후, 제한효소 EcoR I으로 절단시킨다. 이를 λgt 11에 삽입시켜서, 시험관내에서 페케이징(packaging)시킨 다음, 대장균 Y1088(ATCC 37195)에 형질감염(transfection)시키고 증폭시킨다.

이와 같이 하여 작성된 cDNA 라이브러리에서 인간성장호르몬 cDNA 클론을 검색하기 위해, 공지되어 있는 인간성장호르몬 아미노말단의 8개 아미노산(Liu W.K. et al., Biochem. Biophys. Acta, 93, 428(1964), Li C.H. et al., J. Amer. Chem. Soc. 88, 2050(1966))을 이용하여 Suggs et al. (PNAS 78 : 6613(1981))의 방법으로 혼합된 합성탐침을 제조한 후 Benton, W. D. ＆ Davis, R. W. (Science 196, 180(1977))의 플라그 혼성화(Plague hybridization) 방법으로 인간성장호르몬 cDNA 클론을 선별(screening)한다. 선별된 cDNA 클론을 서던블로팅(Southern Blotting : Southern E. M., J. Mol. Biol., 98, 503(1975))으로 확인하며, 생거의 디데옥시방법(Sanger Dideoxy Method : PNAS 74, 5463(1977))으로 염기서열을 확인한다. 확인된 염기서열을 제1도에 나타내었다.

얻어진 인간성장호르몬 cDNA의 앞부분에는 시그날 펩타이드가 포함되어 있으므로 발현을 위해서는 이를 제거시켜야 한다. 따라서, 본 발명자들은 국부돌연변이(Site-directed mutagenesis) 방법을 이용하여 인간성장호르몬의 16,17,18번째 아미노산인 -Arg-Ala-His- 위치에 제한효소 Sst I 인지서열인 5′-GAGCTC-3′를, 또한 종료코돈 뒷부분에는 제한효소 Sal I 인지서열인 5′-GTCGAC-3′을 삽입시켰다. 즉 상기의 인간성장호르몬 cDNA을 함유하는 람다파아지로부터 EcoR I-Sma I 절편(710bp)을 분리하여 이를 제한효소 EcoR I/Xba I으로 절단시킨 M13mp18(Bio-Rad's Muta-Gene in vitro Mutagenesis Kit) (Xba I 부위는 클레노우 절편(Klenow fragment)를 이용하여 블런트앤드(blunt end)로 만들었음)에 삽입시켜서 배양한 후, 얻어진 단일가닥 DNA를 주형(template)으로 하고 상기 제한효소 Sst I 인지서열을 포함하는 프라이머(primer)와 Sal I 인지서열을 포함하는 프라이버를 이용하여 DNA를 합성하여서 인간성장호르몬 유전자내에 제한효소 Sst I 및 Sal I 부위를 삽입한다.

본 발명의 인간성장호르몬 유전자를 함유하는 벡터로 제조된 인간성장호르몬 발현 벡터는 발현체로서 대장균을 이용하는 바, 상기 제한효소 Sst I 및 Sal I을 갖는 인간성장호르몬 유전자의 제한효소 Sst I 부위 앞부분을 대장균에서 통상적으로 이용되는 코돈 외주로 설계하여야 한다. 따라서 본 발명에서는, 시작 코돈인 ATG 부위와 제한효소 Nco I 부위와 상보적이고 그 반대쪽은 제한효소 Sst I 부위와 상보적이 되도록 고안한 Sco I-Sst I 링커(아미노말단 합성유전자)로서 윗가닥 55mer(5′-T ATG TTC CCA ACC ATC CCA CTG TCT CGT CTG TTC GAC AAC GCT ATG CTG CGA GCT-3′)와 아래가닥 49mer(3′-AC AAG GGT TGG TAG GGT GAC AGA GCA GAC AAG CTG TTG CGA TAC GAC GC-5′)로 구성된 것을 사용한다. 즉, 상기 제한요소 Sst I, Sal I 부위를 갖는 인간성장호르몬 유전자를 함유하고 있는 M13mp18로부터 Sst I-Sal I 절편(530bp)을 분리하여 이를 상기 Nco I-Sal I 링커와 함께 대장균 운반체 pBR322(ATCC31344)의 Nco I/Sst I 절단부위에 삽입시킴으로써 효모 프로모우터-인간성장호르몬 유전자-종료코돈 카세트로 구성된 제한효소 Sst I, Nde I 및 Sal I 부위를 갖는 벡터 pBR-HGH를 얻을 수 있다.

이상과 같은 본 발명의 인간성장호르몬 유전자를 함유하는 벡터 pBR-HGH의 제조과정을 요약하여 제2도에 도시하였으며, 제조된 본 발명의 인간성장호르몬 유전자를 함유하는 벡터 pBR-HGH를 제3도에 도시하였다.

본 출원인은 본 발명의 인간성장호르몬 유전자를 함유하는 벡터 pBR-HGH를 갖는 미생물 Escherichia coli HB101을 한국종균협회에 1988년 12월 27일자 기탁번호 DFCC-10666로 기탁하였다.

이하 본 발명을 실시예에 의거하여 상세히 설명하면 다음과 같다.

[실시예 1]

cDNA 라이브러리 작성 및 인간성장호르몬 유전자의 검색

인간 뇌하수체 2g을 20ml의 조직 구아니딘 용액(4M 구아니딘 이소시아네이트, 50mM Tris-HCl, pH 7.5, 10mM EDTA, 5% 2-메르캅토에탄올)에 혼합시켜 조직균등기로 균등화(homogenize)시켰다. 이 용액을 12℃에서 10,000rpm으로 10분간 원심분리시켜(Beckman JA-13 rotor 이용), 상층액을 모은 후, 1/10배 부피의 20% 사코실을 첨가하고 65℃에서 2분간 가열하였다. 여기에 CsCl을 0.1g/ml의 농도로 첨가시킨 후, 이를 9ml CsCl 쿠션(5.7M CsCl, 0.1mM EDTA) 위에 놓고 25,000rpm으로 16시간 원심분리시켰다(Beckman SW-28 rotor 이용), 침전된 RNA를 4℃에서 5mM EDTA, 0.5% 사코실, 5% 2-메르캅토에탄올 용액 3ml에 용해시킨 후 페놀/클로로포름/이소아밀알코올(25 : 24 : 1, V/V/V)로 추출하고 클로로포름/이소아밀알코올(24 : 1, V/V)로 재추출한 다음, 3M 소듐아세테이트를 1/10배 부피로 첨가하고 2.5배 부피의 에탄올을 첨가하여 원심분리한 뒤, 침전된 RNA를 증류수에 녹였다. 이와 같이 하여 얻어진 전체 RNA를 70℃에서 10분간 가열하고, LiCl의 최종농도가 0.5M이 되도록 한 후, 올리고-di-셀룰로오스 크로마토그라피(Type 3, Collaborative Research, USA)로 폴리(A)⁺RNA를 분리하였다(Aviv. H ＆ Leder P., J. Mol. Biol. 134; 743(1972)).

이렇게 하여 얻어진 폴리(A)⁺RNA 10㎍을 65℃에서 5분간 처리시켜 준 다음, 즉시 얼음조에 놓고 20㎕의 5mM dNTPs와 40㎕의 5×PT 완충용액(5×역전사효소 완충용액 : 0.25M Tris-HCl, pH 8.3, 0.5M KCl, 50mM MgCl₂), 10㎕의 200mM DTT, 20㎕의 0.5mg/ml 올리고(dT_12~18) (Pharmacia Inc., USA), 80㎕의 H₂O, 10㎕(10units)의 RNAsin(Promega Biotech, USA)와 20㎕(20units)의 AMV 역전사효소(Life Science Inc. USA)를 첨가한 후 잘 교반시켜 주어, 42℃에서 90분간 반응시켰다. 여기에 5㎕의 0.5M EDTA(pH 8.0)와 200㎕의 완충페놀을 첨가하여 잘 교반시켜 준 후, 상온에서 10분동안 미량 원심 분리하여 상측액을 얻고, 반응생성물은 1ml의 디에틸에테르로 2회 추출한 다음, 20㎕의 3M 소듐아세테이트와 1ml의 95% 에탄올용액에 첨가하여 cDNA를 침전시켰다.

그런 다음, 얻어진 단선의 cDNA를 이중나선의 cDNA로 합성하기 위해, 상기 단선의 cDNA 침전물에 284㎕의 증류수를 첨가하여 녹인 후, 40㎕의 5mM dNTPs와 80㎕의 5×SS 완충용액, 12㎕의 5mM β-NAD⁺, 2㎕의 3000Ci-mmol[α-³²P]dCTP, 4㎕(4units)의 RNase H, 4㎕(20units)의 E. coli DNA 리가아제 및 10㎕(100units)의 E. coli DNA 폴리머라제 I를 넣고 14℃에서 16시간 반응시켰다. 결과된 반응생성물을 상기와 같은 방법으로 페놀 추출 및 에탄올로 침전시켰다. 얻어진 이중나선 cDNA를 블런트앤드로 만들기 위해, 상기 이중나선의 cDNA 침전물에 42㎕의 증류수를 첨가하고, 5㎕의 5mM dNTPs와 16㎕의 5×TA 완충용액, 1㎕의 5mM β-NAD⁺, 4㎕의 RNase A(2㎍/ml, Boiled), 4㎕(4units)의 RNAse H, 4㎕(20units)의 E. coli DNA 리가아제 및 4㎕(8units)의 T4 DNA 폴리머라제를 첨가하고 37℃에서 45분간 반응시켰다. 결과된 반응생성물을 상기와 같은 방법으로 페놀 추출 및 에탄올로 침전시켰다.

얻어진 cDNA의 EcoR I 부위를 메틸화시키기 위해, 상기 블런트 앤드를 갖는 이중나선의 cDNA 침전을 25㎕의 증류수에 녹이고, 27㎕의 2×메틸라제 완충용액(100mM NaCl, 100mM Tris-HCl, pH 8.0, 1mM EDTA)과 1㎕ 50×SAM(1mg S-아데노실메치오닌을 50×SAM 희석 완충용액(0.14mM 소듐아세테이트, pH 5.2)에 녹인 용액) 및 10㎕(10units)의 EcoR I 메틸라제(Biolabs, USA)를 첨가하여 37℃에서 2시간 반응시켰다. 결과된 반응생성물을 상기와 같은 방법으로 페놀 추출 및 에탄올로 침전시켰다.

그런 다음, 얻어진 메틸화된 cDNA를 2㎕의 1㎍/ml EcoR I 링커(Biolabs, USA)와 800units의 T4 DNA 리가아제(Biolabs, USA)로 4℃에서 하룻동안 반응시켜 cDNA에 링커를 접합시켰다.

EcoR I 링커가 접합된 cDNA를 60units의 EcoR I으로 절단시키고 Sepharose Cl-4B 컬럼을 이용하여 잔여 링커를 제거한 다음, EcoR I 링커가 붙은 cDNA의 절편을 λgt 11의 EcoR I 부위에 클로닝하였다. 이를 시험관내(in vitro)에서 패케징(packaging)하여 (λ in vitro packaging Kit, Amersham Corp., USA) E. coil Y1088(ATCC37195)에 형질감염(transfection) 및 증폭(amplification)시켰다.

이와 같이 제조된 cDNA 라이브러리에서 인간성장호르몬 유전자를 지닌 람다파아지를 선별하기 위해 프라크 하이브리리제이션(plaque hybridization, Benton, W.D. ＆ Davis,. W., Science 196, 180(1977)) 방법을 이용하여 실시하였다. 이때 탐침으로는 유전자 합성기(Applied Biosystems Model 380B, USA)로 인간성장호르몬 아미노말단의 8개 펩타이드(N-Phe-Pro-Thr-Ile-Pro-Leu-Ser-Arg)를 기초로 하여 혼합된-시퀸스 올리고뉴클레오티드 탐침 24mer를 합성하였다. 1차로 선별하여 나온 파아지 플라그를 다시 2차, 3차로 선별하여 인간성장호르몬 유전자를 지닌 파아지를 순수하게 선별하였다. 이와 같이 얻어진 파아지를 배양하여 DNA를 추출한 후, EcoR I으로 절단시켜서, 1% 아가로스 겔 전기영동하고, 서던 블로팅(Southern, E., J. Mol. Biol. 98, 503(1975))으로 확인하였으며, 또한 절편을 M13mp18에 클로닝시켜 생거의 디데옥시 방법(PNAS 74, 5463(1977))으로 인간성장호르몬 전체 유전자의 DNA 염기서열을 확인하였다.

[실시예 2]

인간성장호르몬 유전자내에 Sst I와 Sal I 인지부위 삽입

상기 실시예 1에서 얻어진 인간성장호르몬 cDNA를 함유하는 람다파아지로부터 EcoR I-Sma I 절편(710bp)을 분리하여, 이를 EcoR I/Xba I으로 절단시킨 M13mp18 대장균 CJ 236(Bio-Rad's Huta-Gene in vitro Mutagenesis Kit)에 삽입시킨 후, 이를 배양하였다. 한편 Sst I 인지서열을 포함하는 프라이머 3′-CGA TCA GAC GCT CGA GTA GCA GAC-5′ 및 Sal I 인지서열을 포함하는 프라이머 3′-GAC GGG CCC AGC TGA GGG ACA CTG G-5′를 DNA 합성기(Applied Biosystems Inc. Model 380B, USA)를 이용하여 합성한 후 0.1 A260을 취하여 건조시키고, 카이네이즈 반응조건(50mM Tris, pH 8.0, 10mM MgCl₂, 10mM DTT, 1mM ATP, 폴리뉴클레오타이드 카이네이즈 9units) 하에서 37℃에서 40분간 반응시켜서 인산화시켰다. 상기 배양하여 얻어진 단일가닥 DNA를 주형으로 하여 어닐링조건(20mM Tris, pH 7.5m, 2mM MgCl₂, 50mM NaCl) 하에서 인산화시킨 프라이머를 총 반응액에 10㎕가 되게 혼합시킨 후 70℃의 수조에 넣고 1시간 가량 서서히 식혔다. 여기에 T4 폴리머라제 1unit를 첨가하여 반응조건(500μM 각각 dNTPs, 1mM ATP, 8mM MgCl₂, 30mM Tris-HCl(pH 7.4), 2mM DTT, 50mM NaCl) 하에서 37℃에서 90분간 반응시켰다. 이를 JM101(ATCC33876)에 형질절환시킨 후 생거의 디데옥시방법으로 염기서열을 확인하였다.

[실시예 3]

효모 발현 운반체로의 클로닝

인간성장호르몬 유전자의 Sst I의 앞부분을 효모에서 통상적으로 사용되는 코돈으로 설계한 후, 시작코돈은 ATG 부위가 Nco I 부위와 상보적으로 반대쪽은 Sst I 부위와 상보적이 되도록 고안된 윗가닥 55mer(5′-C ATG TTC CCA ACC ATC CCA CTG TCT CGT CTG TTC GAC AAC GCT ATG CTG CGA GCT-3′와 아래가닥 49mer(3′-AC AAG GGT TGG TAG GGT GAC AGA GCA GAC AAG CTG TTG CGA TAC GAC GC-5′)의 Nco I-Sst I 링커를 합성하였다.

한편, 상기 실시예 2에서 얻어진 인간성장호르몬 유전자를 함유하는 M13mp18으로부터 Sst I-Sal I 절편을 분리하였다. 그 다음, 대장균 운반체 pBR322(ATC C 31344)를 Nco I/Sal I으로 절단시키고, 여기에 상기 Nco I-Sst I 링커와 상기 Sst I-Sal I 절편(530bp)을 삽입시켰다(상기 접합반응 참조). 제한효소 Sst I, Nde I 및 Sal I 부위를 갖는 인간성장호르몬 유전자를 함유하는 벡터 pBR-HGH를 제조하였다.

이상에서 설명한 바와 같이 제한효소 Sst I, Nde I 및 Sal I 부위를 갖는 본 발명의 인간성장호르몬 유전자를 함유하는 벡터 pBR-HGH은 유전공학적인 방법에 따라 인간성장호르몬을 대량 생산하는데 유용하게 사용할 수 있음은 물론, 이렇게 하여 제조된 인간성장호르몬은 바이러스에 감염되는 등의 문제점이 없고, 인간에게 사용하기에 안전한 상태로 얻을 수 있다. 특히, 본 발명의 인간성장호르몬 유전자를 함유하는 벡터 pBR-HGH를 이용함으로써 인간성장호르몬을 대량으로 생산할 수 있게 되어짐에 따라 모든 왜소증 환자뿐 아니라 앞으로는 비만증치료, 노화방지, 근육발달, 화상 및 상처의 치료에서 임상실험할 수 있을 것이다.

Claims

제한효소 Sst I 및 Sal I 부위를 갖는 인간성장호르몬 유전자를 아미노말단 합성유전자 및 제한효소 Nde I/Sal I으로 절단시킨 대장균 운반체로 구성되어진 것임을 특징으로 하는 제한효소 Sst I, Nde I 및 Sal I 부위를 갖는 인간성장호르몬 유전자를 함유하는 벡터 pBR-HGH.
제1항에 있어서, 인간성장호르몬 유전자는 인간성장호르몬의 16,17,18번째인 아미노산 위치에 제한효소 Sst I 부위를 갖도록 하고 카르복시말단 위치에 제한효소 Sal I 부위를 갖도록 제조된 것임을 특징으로 하는 제한효소 Sst I, Nde I 및 Sal I 부위를 갖는 인간성장호르몬 유전자를 함유하는 벡터 pBR-HGH.
제1항에 있어서, 아미노말단 합성유전자는 55mer의 윗가닥(5′-T ATG TTC CCA ACC ACT CCA CTG TCT CGT CTG TTC GAC AAC GCT ATG TTG AGA GCT-3′와 49mer의 아랫가닥(3′-AC AAG GGT TGG TAG GGT GAC AGA GCA GAC AAG CTG TTG CGA TAC GAC GC-5′)로 구성된 것임을 특징으로 하는 제한효소 Sst I, Nde I 및 Sal I 부위를 갖는 인간성장호르몬 유전자를 함유하는 벡터 pBR-HGH.