SU1727533A3 - Способ получени водорастворимой части человеческого рецептора малого сродства F @ - Google Patents

Abstract

Изобретение относитс  к области биотехнологии и медицины, а именно к способам получени  полипептидов, пригодных дл  борьбы с местными и системными аллергическими реакци ми. Сущность изобретени  заключаетс  в разработке способа получени  водорастворимой части человеческого рецептора FcЈ малого сродства (FcЈ R). Способ включает выделение водорастворимой части св зывающего IgE фактора (Fct R) из лимфобластоидных клеток, анализ ее последовательностей при помощи гидролиза, выделение получаемых при этом фрагментов и определение их последовательностей , приготовление двух проб гибридизации, выделение и идентификацию генов, кодирующих человеческий рецептор Рс малого сродства, экспрессию дДНК FcЈR, экспрессию мРНК FcЈ R, получение экспрессионного вектора, содержащего последовательности ДНК, кодирующие водорастворимый фрагмент рецептора FcЈ , экспрессию этого растворимого фрагмента в микроорганизмах или клетках млекопитающих . ё

Description

Изобретение относитс  к биотехнологии и медицине, а именно к способам получени  полипептидов, пригодных дл  борьбы с местными и системными аллергическими реакци ми.

Способ включает следующие операции.

1.Выделение водорастворимой части св зывающего IgE фактооа (Fcj R) из лимфобластоидных клеток.

2.Анализ последовательностей водорастворимой части человеческого рецептора РС малого сродства при помощи гидролиза,, выделение получаемых при этом фрагментов и определение их последовательностей .:

3. Приготовление двух проб гибридизации .

Проба 1: получение трансформирующей  чейки FcЈ +L дополнительной ДНК (далее дДНК) с использованием многостадийной циклической экстракции РНК, кодирующей полипептид (далее мРНК).

Проба 2: получение олигонуклеотидов формулы

тТдл

3 - ТТс ACCTAGTTGAAAc GT-5 А

кодирующих аминокислотную последовательность формулы

Lys-Trp-lfe-Asn-Phe-G fn.

х| Ю v|

сл

CJ

со

ICJ

4.Выделение генов, кодирующих человеческий рецептор FcЈ малого сродства, из матрицы РНК лимфобластоидных клеток, продуцирующих мРНК рецептора Fc , синтез дДНК с последующей идентификацией экспрессионных носителей, содержащих ген, кодирующий рецептор Fc, с использованием двух маркированных проб, содержащих специфичную к клеткам FcЈ R+L дДНК

и олигонуклеотид, общий с геном рецептора FcЈ малого сродства, и репликацией полученного таким образом гена рецептора FcЈ.

5.Экспресси  дДНК FcЈ R.

6.Определение гена, кодирующего че- ловеческий рецептор Fcg , с использованием дДНК, полученной из носителей согласно п. 5.

7.Экспресси  мРНК .

8.Получение вектора содержащего по- следовательности ДНК, кодирующие водорастворимый фрагмент рецептора FC-. , и его 0-гликозилированных производных, а также экспресси  этого растворимого фрагмента в микроорганизмах или клетках мле- копитающих.

Описанные выше операции провод т следующим образом.

1. Выделение и очистка водорастворимой части Fcf R.

Человеческие лимфобластоидные клетки В, например, клетки RPM1-8866, выдел ют на поверхности Fc. R с молекул рной массой приблизительно 46 кд и отдают фрагмент с молекул рной массой приблизи- тельно 25 кд в надосадочную жидкость культуры . В результате проведени  опыта с использованием св занного с энзимом им- муносорбента, выдел ют два моноклональ- ных антитела (далее именуетс  метод эним). Активность Fc R, выдел ема  лим- фобластоидными клетками RPM1 8866, выше в концентрированной надосадочной жидкости культуры, чем в солюбилизиро- ванных поверхностно-активным вещест- вом ПН-40 мембранных рецепторах, хот  дл  получени  FcЈ R используют одинаковое количество, например, 105 клеток/мл. Кроме того, после хроматографии очищенных надосадочных жидкостей на по- лиакрилатном геле с использованием додецилсульфата натри  и элюации из гел  активности Fc R обнаружена активность в област х 45-46 кд и 24-25 кд. При этом концентрированные надосадочные жидкости имеют более высокое содержание активности в области 25 кд. Поэтому в качестве источника рецептора используют бессывороточные надосадочные культу- ральные жидкости.

Очистку FCfR с молекул рной массой примерно 25 кд осуществл ют в колонках, содержащих 10 мг/мл очищенного моно- клонального антитела, св занного с сефа- розными шариками. В результате последовательной адсорбции культураль- ной жидкости на св занной с альбумином сыворотки крупного рогатого скота сефа- розе и на св занной с мышиным иммуноглобулином сефарозе получают 70% первоначальной активности (без улучшени  удельной активности). После предвари- тельной адсорбции рецепторному материалу дают св зыватьс  с сефарозой в течение 4-16 ч, при этом обща  активность продукта элюации уксусной кислотой уменьшаетс , но удельна  активность повышаетс  до 83 ед/мкг и чистота увеличиваетс  в 190 раз. В результате дальнейшей очистки рецептора хроматографией на колонне С-4 с обращенной фазой и использованием линейного градиента 0-65% ацетонитрила и 0,1 % трифторуксусной кислоты удельна  активность повышаетс  до 1630 ед/мкг и чистота рецептора увеличиваетс  в 3710 раз. Однако степень извлечени  составл ет только 33% первоначального материала. Очистке подвергают и солюбилизированную поверхностно-активным веществом мембрану Fee R, но получаема  при этом удельна  активность значительно меньше, чем при использовании культуральной надосадочной жидкости. Степень извлечени  зависит от примен емого дл  элюации буфера , т.е. при осуществлении элюации 2,5%-ной уксусной кислотой с последующей быстрой нейтрализацией выход рецептора можно значительно повышать.

Очистка Fc R с использованием моно- клональных антител в твердой фазе  вл етс  недостаточной дл  получени  чистого рецептора. Поэтому после элюации Fc R подвергают дальнейшей очистке при помощи жидкостной хроматографии с обращенной фазой. При этом свежеэлюированный материал подают на колонку С-4 и подвергают хроматографии с использованием линейного градиента 0-65% ацетонитрила. Fc R элюируетс  ацетонитрилом при концентрации 44-45%.

Активность FcЈ R, получаема  в результате жидкостной хроматографии на колонке С-4, показывает одну полосу, соответствующую материалу с молекул рной массой 25 кд, который про вл ет очень высокуюактив- ность при проведении анализа методом эним. Следует отметить, что полоса 25 кд соответствует меньшему виду Fc, R, который обнаруживаетс  теми же моноклональными антителами после поверхностной иодинации и иммуноосаждени  Fcw R с использованием тех же антител. Предполагаетс , что части с 46 и 25 кд  вл ютс  антигенно идентичными, причем последн   представл ет собой водорастворимую часть Ре,- R,

2. Анализ частичных последовательностей водорастворимой части .

Определ ют последовательность аминокислотных остатков в с использованием трипсина илизилендопептидазы. При обработке трипсином получают 11 фрагментов , а при обработке лизилендопептида- зой - 12 фрагментов. Получались следующие фрагменты:

ш

Met-Glu-Leu-Gln-Val-Ser-Ser-Gly-Phe-Val-(N-KOw eeoU)j

Gly-Glu-Phe-Ile-Trp-Val-Asp-Gly-Ser-His-Val-Asp-Tyr-Ser-Asn- Trp-Ala-Pro-Gly-Glu-Pro-Thr-

Lys-His-Ala-Ser-His-Thr-Gly-Ser-Trp-Ile-Gly-Leu-Arg-Asn-Leu- ь/Г/Ь/ЛУ- LtiS - 20

и Lys - 7rp -jЈ& .jfn - pffg . #Јf 3 . Получение проб гибридизации.

Проба 1 (дДНК, специфична  относительно L-клеток, положительных в отношении Fc R).

Клетки L, имеющие недостаток тими- дин-киназы (далее ТК), например, клетки LtK , подвергают трансфекции высокомолекул рной ДНК из клеток RPM1-8866 и ТК. геном из вируса Герпес-симплекс. После селекции HAT ТК положительные трансформанты обрабатывают биотинированным анти-FCf R антителом (8-30) и FITC-авиди- ном и классифицируют. В результате получают две трансформированные клетками L линии. L-V-8-30 и L-VI-8-30.

РНК получают из клеток L-V-8-30 с использованием гуанидина изотиоцианата и хлорида цези . .ДНК, дополнительную к мРНК из клеток L-V-8-30, синтезируют обратной транскриптазой на олиго/ЬТ/прай- мере.дДНКпутем введени  маркированной альфа- Р-деокси-СТР гибридизируют с 10- кратным избытком поли/А/+-РНК, полученной из клеток LtK. Реакционную смесь нанос т на колонку с оксиапатитом. Не св занную однонитевую дДНК подвергают повторной гибридизации с поли/А/+-РНК, полученной из клеток LtK. Первую нить дДНК, специфичную в отношении трансформантов клеток L, положительных относительно Fc R, используют в качестве пробы дл  обнаружени  гена дл  Fc. R в ламбда-дт-Ю-библиотеке.

Проба 2: синтез смеси олигонуклеоти- дов формулы

5

0

5

0

5

0

5

3- ТТсТАСС TAGTTGAAAGAGT-5 А

Этот огигонуклеотид используют в качестве пробы дл  обнаружени  гена дл  Fc -рецептора .

4. Выделение и идентификаци  сред, содержащих ген, кодирующий человеческий Fc R малого сродства.

мРНК выдел ют из клеток RPM1-8866 путем центрифугировани  в градиенте хлористого цези , экстракции фенолом и осаждени  этанолом. Поли/А/ -РНК выдел ют хроматографией на олиго/оТ/целлюлозе.

Поли/А/+-РНК используют в качестве матрицы дл  получени  дДНК с помощью обратной транскрилтазы и олиго/оТ/прай- мера. После обработки RN азой Н вторую нитку ДНК синтезируют при помощи ДНК полимеразы 1. ДНК модифицируют при помощи Т4-ДНК-полимеразы с тем, чтобы удалить остаток З -выступов из первой нити ДНК и лигируют в EcoRI-линкере. дДНК 1 длиной более 1000 п,о. фракционируют и избыток линкеров удал ют хроматографией на колонке. дДНК клонируют в ДНК л мбда- д110фага по сайту EcoR1 и трансформируют в штамм 0600 hfe Escherichla coli.

Гибридизацией колоний идентифицируют те, которые специфичны в отношении FcЈR. При этом используют указанные выше пробы.

Отбирают 23 из примерно ЗООООС клонов , которые гибридизируютс  с обеими . пробами.

5. Экспресси  дДНК дл  .

Вставку EcoR1, содержащую дДНК дл  FCi R и выделенную из описанного л мбда gtiO клона, лигируют с переваренным EcoR1 плазмидным вектором рСЕМ- 4, обозначенным LE392. Этот вектор содержит два промотора SP6 и Т7 в противоположной друг другу ориентации, дДН К дл  FccR можно сразу же транскрибировать в мРНК. дДНК переваривают ВатН1 и полученную ДНК примен ют в качестве матрицы дл  синтеза мРНК при помощи SP6 РНК-пол- имеразы. Полученную РНК впрыскивают в ооциты Xenopus. После двухдневной инкубации ооциты лизируют и определ ют нали- чие Fc R методом эним с использованием двух анти-FCgR антител 3-5 и 8-30, которые распознают различные эпитопы на FcЈp. В доказательство того, что pFcЈ R-1 содержит всю кодирующую последовательность FcЈR,

51015

Met Glu Glu Gly Gin Туг Ser Glu lie Glu Glu Leu Pro Arg Arg ATG GAG GAA GGT CAA TAT TCA GAG АТС CTT CCC AGG AGG TAG CTC CTT CCA GTT ATA ACT CTC TAG CTC CTC GAA GGG ТСС ТСС

20 2530

Arg Cys Cys Arg Arg Gly Thr Gin lie Val Leu Leu Gly LeuVal

CGG TGT TGC AGG CGT GGG ACT CAG АТС GTG CTG CTG GGG CTGGTG

GCC АСА ACG TCC GCA CCC TGA GTC TAG CAC GAG GAG CCC GAGCAC

35 4045

Thr Ala Ala Leu Trp Ala Gly Leu Leu Thr Leu Leu Leu LeuTrp

ACC GCC GCT CTG TGG GCT GGG CTG CTG ACT CTG CTT CTC CTGTGG

TGG CGG CGA GAG ACC CGA CCC GAG GAG TGA GAG GAA GAG GAGACC

50 5560

His Trp Asp Thr Thr Gin Ser Leu Lys Gin LeuGlu Glu Arg Ala

CAC TGG GAC ACC АСА CAG AGT СТА ААА CAG CTGGAA GAG AGG GCT

GTG ACC CTG TGG TGT GTC TCA GAT TTT GTC GACCTT CTC TCC CGA

657075

Ala Arg Asn Val Ser Gin Val Ser Lys Asn Leu Glu Ser His His GCC CGG AAC GTC TCT CAA GTT TCC AAG AAC TTG GAA AGC CAC CAC CGG GCC TTG CAG AGA GTT CAA AGG TTC TTG AAC CTT TCG GTG GTG

808590

Gly Asp Gin Met Ala Gin Lys Ser Gin Ser Thr Gin lie Ser Gin GGT GAC CAG ATG GCG CAG AAA TCC CAG TCC ACG CAG ATT TCA CAG CCA CTG GTC TAG CGC GTC TTT AGG GTC AGG TGC GTC TAA AGT GTC

95100105

Glu Leu Glu Glu Leu Arg Ala Glu Gin Gin Arg Leu Lys Ser Gin GAA CTG GAG GAA CTT CGA GCT GAA CAG CAG AGA TTG AAA TCT CAG CTT GAC CTC CTT GAA GCT CGA CTT GTC GTC TCT AAC TTT AGA GTC

110115120

Asp Leu Glu Leu Ser Trp Asn Leu Asn Gly Leu Gin Ala Asp Leu GAC TTG GAG CTG TCC TGG AAC CTG AAC GGG CTT CAA GCA GAT CTG CTG AAC CTC GAC AGG ACC TTG GAC TTG CCC GAA GTT CGT СТА GAC

примен ют вектор pDE2, который содержит оба SV40 ранних промотора в противоположной друг другу ориентации,обеспечива- ющий экспрессию дДНК в обоих направлени х. Сегмент ДНК между обоими S40 ранними промоторами удал ют гидролизом эндонуклеазой EcoR1 и замен ют на вставку дДНК pFcЈ R-1/pDE2-FcЈ R-1/. Клетки Cos7 трансфецируют рОЕ2-дДНК FcЈ R. Анализ показывает, что 30% трансфеци- рованных клеток подтверждает, что дДНК кодирует молекулу Fc R.

6. Определение нуклеотидной последовательности дДНК дл  FcЈR.

Полна  нуклеотидна  последовательность и св занна  с ней последовательность аминокислотных остатков представлены ниже. При этом кодирующа  последовательность имеет следующую формулу:

125130135

Ser Ser Phe Lys Ser Gin Glu Leu Asn Glu Arg Asn Glu Ala Ser AGC AGC TTC AAG TCC GAG GAA TTG AAC GAG AGG AAC GAA GCT TCA TCG TCG AAG TTC AGG GTC CTT AAC TTG CTC TCC TTG CTT CGA AGT

140145 150

Asp Leu Leu Glu ArgLeu Arg Glu Glu Val Thr Lys Leu Arg Met

GAT TTG CTG GAA AGACTC CGG GAG GAG GTG АСА AAG СТА AQG ATG

СТА AAC GAG CTT TCTGAG GCC CTC CTC CAC TGT TTC GAT TCC TAG

155160165

Glu Leu Gin Val Ser Ser Gly Phe Val Cys Asn Thr Cys Pro Glu GAG TTG CAG GTG TCC AGC GGC TTT GTG TGC AAC ACG TGC CCT GAA CTC AAC GTC CAC AGG TCG CCG AAA CAC ACG TTG TGC ACG GGA CTT

170175- -180

Lys Trp lie Asn Phe Gin Arg Lys Cys Туг Туг Phe Gly Lys Gly AAG TGG АТС AAT TTC CAA CGG AAG TGC TAG TAG TTC GGC AAG GGC TTC ACC TAG TTA AAG GTT GCC TTC ACG ATG ATG AAG CCG TTC CCG

185190195

Thr Lys Gin Trp Val His Ala Arg Tyr Ala Cys Asp Asp Met Glu ACC AAG CAG TGG GTC CAC GCC CGG TAT GCC TGT GAC GAG ATG GAA TGG TTC GTC ACC CAG GTG CGG GCC ATA CGG АСА CTG CTG TAG CTT

200205210

Gly Gin Leu Val Ser lie His Ser Pro Glu Glu Gin Asp Phe Leu GGG CAG CTG GTC AGC АТС CAC AGC CCG GAG GAG CAG GAC TTC CTG CCC GTC GAC CAG TCG TAG GTG TCG GGC CTC CTC GTC CTG AAG GAC

215220225

Thr Lys His Ala Ser His Thr Gly Ser Trp lie Gly Leu Arg Asn ACC AAG CAT GCC AGC CAC ACC GGC TCC TGG ATT GGC CTT CGG AAC TGG TTC GTA CGG TCG GTG TGG CCG AGG ACC TAA CCG GAA GCC TTG

230235240

Leu Asp Leu Lys Gly Glu Phe lie Trp Val Asp Gly Ser His Val TTG GAC CTG AAG GGA GAG TTT АТС TGG GTG GAT GGG AGC CAT GTG AAC CTG GAC TTC CCT CTC AAA TAG ACC CAC СТА CCC TCG GTA CAC

245250255

Asp Tyr Ser Asn Trp Ala Pro Gly Glu Pro Thr Ser Arg Ser Gin GAC TAC AGC AAC TGG GCT CCA GGG GAG CCC ACC AGC CGG AGC CAG CTG ATG TCG TTG ACC CGA GGT CCC CTC GGG TGG TCG GCC TCG GTC

260 265270

Gly Glu Asp Cys Val Met Met Arg Gly SerGly Arg Trp Asn Asp

GGC GAG GAC TGC GTG ATG ATG CGG GGC TCCGGT CGC TGG AAC GAC

CCG CTC CTG ACG CAC TAC TAC GCC CCG AGGCCA GCG ACC TTG CTG

275280285

Ala Phe Cys Asp,Arg Lys Leu Gly Ala Trp Val Cys Asp Arg Leu GCC TTC TGC GAC CGT AAG CTG GGC GCC TGG GTG TGC GAC CGG CTG CGG AAG ACG CTG GCA TTC GAC CCG CGG ACC CAC ACG CTG GCC GAC

290295300

Ala Thr Cys Thr Pro Pro Ala Ser Glu Gly Ser Ala Glu Ser Met GCC АСА TGC ACG CCG CCA GCC AGC GAA GGT TCC GCG GAG TCC ATG CGG TGT ACG TGC GGC GGT CGG TCG CTT CCA AGG CGC CTC TAC

305310315

Gly Pro Asp Ser Arg Pro Asp Pro Asp Gly Arg Leu Pro Thr Pro GGA CCT GAT TCA AGA CCA GAC CCT GAG GGC CGC CTG CCC ACC CCC CCT GGA СТА ACT TCT GGT CTG GGA CTG CCG GCG GAC GGG TGG GGG

Ser Ala Pro Leu His Ser TCT GCC CCT CTC CAC TCT TGA AGA CGG GGA GAG GTG AGA ACT

Большое количество растворимого с молекул рной массой 25 кд обнаруживаетс  в культуральной надосадочной жидкости клеток RPM1-8866. N-концевой аминокислотный остаток (Met) растворимого Fc,,R находитс  в положении 150. Предыдущий остаток, аргинин, представл ет собой обычную мишень дл  протеаз, подобных трипсину . С-концева  область (150-321) содержит две группы цистеина (160, 163, 174 и 191 и 259, 273, 282 и 288), которые, веро тно, образуют дисульфидные св зи и представл ют собой структуру, устойчивую к воздействию протеолитических энзимов. Поэтому С-концева  область (150-321) соответствует растворимому Fcr R, который представл ет собой продукт протеолитиче- ского расщеплени  св занного с мембраной FcgR.

7. Экспресси  мРНКдл  FccR.

Поли/А/ 1 -РНК получают из клеток различного типа и анализируют на экспрессию

Met ATG TAG

Glu Leu Gin Val Ser Ser Gly Phe Val Cys Asn Thr Cys Pro Glu GAG TTG CAG GTG TCC AGC GGC TTT GTG TGC AAC ACG TGC CCT GAA CTC AAC GTC CAC AGG TCG CCG AAA CAC ACG-TTG TGC ACG GGA CTT

Lys Trp lie Asn Phe Gin Arg Lys Cys Туг Туг Phe Gly Lys Gly AAG TGG АТС AAT TTC CAA CGG AAG TGC TAG TAG TTC GGC AAG GGC TTC ACC TAG TTA AAG GTT GCC TTC ACG ATG ATG AAG CCG TTC CCG

Thr Lys Gin Trp Val His Ala Arg Tyr Ala Cys Asp Asp Met Glu ACC AAG CAG TGG GTC CAC GCC CGG TAT GCC TGT GAC GAC ATG GAA TGG TTC GTC ACC CAG GTG CGG GCC ATA CGG АСА CTG CTG TAG CTT

Gly Gin Leu Val Ser He His Ser Pro Glu Glu Gin Asp Phe Leu GGG CAG CTG GTC AGC АТС CAC AGC CCG GAG GAG CAG GAC TTC CTG CCC GTC GAC CAG TCG TAG GTG TCG GGC CTC CTC GTC CTG AAG GAC

Thr Lys His Ala Ser His Thr Gly Ser Trp He Gly Leu Arg Asn ACC AAG CAT GCC AGC CAC ACC GGC TCC TGG ATT GGC CTT CGG AAC TGG TTC GTA CGG TCG GTG TGG CCG AGG ACC TAA CCG GAA GCC TTG

Leu Asp Leu Lys Gly Glu Phe He Trp Val Asp Gly Ser His Val TTG GAC CTG AAG GGA GAG TTT АТС TGG GTG GAT GGG AGC CAT GTG AAC CTG GAC TTC CCT CTC AAA TAG ACC CAC СТА CCC TCG GTA CAC

мРНК дл  FcЈ R. Основную полосу длиной 1700 оснований обнаруживают в В лимфоб- ластоидных клеточных лини х (RPM1-8866 и RPM1-1788), рге В клеточной линии FL # 8-2 и в двух трансформантах FcЈ R+L клетки, но не в клетках Fc-R, включающих две линии лимфомы, Т клеточной линии (СЕМ) и в трансформантах клетки, которых экспримируют другой В клеточный антиген (CD20). Кроме того, мРН К дл  не обнаруживаетс  в обычных Т клетках, тогда как обычные В клетки экспрессируют такое же количество мРНКдл  РсЈР, что и В лимфоб- ластоидные линии.

8. Получение вектора, содержащего последовательность ДНК, кодирующую водорастворимый фрагмент рецептора .

Водорастворима  часть рецептора содержит по крайней мере следующую последовательность:

Asp Туг Ser Asn Trp Ala Pro Gly Glu Pro Thr Ser Arg Ser Gin GAG TAG AGC AAC TGG GCT CCA GGG GAG CCC ACC AGC CGG AGC GAG CTG ATG TCG TTG ACC CGA GGT CCC CTC GGG TGG TCG GCC TCG GTC

Gly Glu Asp Cys Val Met Met Arg Gly Ser Gly Arg Trp Asn Asp GGC GAG GAG TGC GTG ATG ATG GGG GGC TCC GGT CGC TGG AAC GAG CCG CTC CTG ACG CAC TAG TAG GCC CCG AGG CCA GCG ACC TTG CTG

Ala Phe Cys Asp Arg Lys Leu Gly Ala Trp Val Cys Asp Arg Leu GCG TTC TGC GAG CGT AAG CTG GGC GCC TGG GTG TGC GAG CGG CTG CGG AAG ACG CTG GCA TTC GAG CCG CGG ACC CAC ACG CTG GCC GAG

Ala Thr Cys Thr Pro Pro Ala Ser Glu Gly Ser Ala Glu Ser Met GCC АСА TGC ACG CCG CCA GCC AGC GAA GGT TCC GCG GAG TCC ATG CGG TGT ACG TGC GGC GGT CGG TCG CTT CCA AGG CGC CTC AGG TAG

Gly Pro Asp Ser Arg Pro Asp Pro Asp Gly Arg Leu Pro Thr Pro GGA CCT GAT TCA AGA CCA GAG CCT GAG GGC CGC CTG CCC ACC CCC CCT GGA СТА AGT TCT GGT CTG GGA CTG CCG GCG GAG GGG TGG GGG

Ser Ala Pro Leu His Ser TCT GCC CCT CTC CAC TCT TGA AGA CGG GGA GAS GTG AGA ACT

Включающа  мембрану область не работает в качестве сигнальной последовательности в обычных рекомбинантных процессах . Поэтому дл  выделени  водорастворимого протеина из подход щего хоз ина необходимо применение эукари- отной сигнальной последовательности. Така  сигнальна  последовательность может примен тьс  дополнительно и в положении перед дДНК, кодирующей водорастворимую часть.

Получают новый рекомбинантный водорастворимый фрагмент, имеющий по крайней мере одно место 0-гликозилировани , а также новые плазмиды, содержащие эти последовательности ДНК, и psFc R-1.

Получают последовательность дДНК, в которой дДНК по крайней мере дл  части аминокислот 1-148 франментэ отсутствует , так что имеютс  только последовательность , кодирующа  часть протеина мембраны, и часть, кодирующа  водорастворимый фрагмент дДНК всего рецептора.

Часть последовательности дДНК, кодирующей аминокислоты 1-148, заменена на подход щий фрагмент дДНК, кодирующий эукариотную сигнальную последовательность .

EcoR1 BamH1 вставку дДНКВ5Р-2 длиной 1,2 т.п.о. получают путем переваривани  pBSF-2.38 с помощью Hindlll и ВатШ. Полученный фрагмент, содержащий всю дДНК BSF-2, подвергают перевариванию с помощью Hinfl и З -концы обрабатывают

5

0

5

0

5

0

5

фрагментом Кленова ДНК полимеразы. После переваривани  с помощью Kpnl полученный фрагмент Kpnl-Hinf длиной 110 п.о., содержащий доминантную последовательность BSF-2, клонируют в pGEM4 после переваривани  с помощью Kpnl и Smal. Один из отобранных клонов размножают и обозначают как pBSF2-L8. pBSF2-L8 подвергают перевариванию с помощью ВатН1 и 3 -концы обрабатывают фрагментом Кленова ДНК полимеразы. Переваренную Hindlll и Pstl, дДНК FcЈR клонируют в переваренный ВатН1 и Pstl pBSF2-L8. Один из отобранных клонов размножают и обозначают как .

С целью сравнени  биологической активности протеинов, полученных клонами pFcЈ R-I, рзРс R-1, p ANFcЈ R-1 и pANFcrR-2, плазмиды подвергают линеаризации перевариванием с помощью подход щих энзимов, например, и psFo. R-1 с помощью BamH1, a p A NFc€ R-1 и p A NFcg R-2 - с помощью EcoR1. Полученные фрагменты примен лись в качестве матрицы дл  синтеза мРНК с использованием SP6 РНК полимеразы. Полученные мРНК впрыскивают в ооциты xenopus leavis. После двухдневного инкубировани  активность FC, R в кутуральных надосадочных жидкост х и лизатах ооцитов определ ют методом эним с использованием анти-FcjR антител 3-5 и 8-30, которые распознают два различных эпитопа на FCgR. В лизатах РВ и культуральной надосадочной жидкости

io

ооцитов, в которые впрыскивают транскрипты . pANFcЈR-1 npANFcЈR-2, активность не обнаруживают, тогда как активность FcЈ R определ етс  в надосадоч- ных жидкост х и лизатах PBS после впрыскивани  фрагментов pSFcgR-1.

Водорастворимый фрагмент FcЈ R из ооцитов про вл ет способность к св зыванию иммуноглобулина Е при помощи модифицированного метода эним, заключающегос  в использовании анти-Fc R-ан- тител 3-5, иммуноглобулина Е и человеческого АР-антииммуноглобулина. При этом надосадочна  жидкость ооцитов, в которые впрыскивали мРНК pSFc R-1, инкубируют на покрытых антителом 3-5 пластинах, которые затем последовательно инкубируют с человеческим иммуноглобулином Е и АР-антииммуноглобулином Е. Выделившийс  из ооцитов фрагмент Fc R образует комплекс с иммуноглобулином Е. В качестве контрол  провод т св зывание с нетрансформированной надосадочной жидкостью из ооцитов, буфером и надосадочной жидкостью из клеток RPM1-8866.

Надосадочную жидкость ооцитов подвергают дальнейшему опыту по определению способности к торможению образовани  розеток между фиксированным ох РВС, покрытым человеческим иммуноглобулином Е, и клетками SKW6-CL4, несущими FCg R на своей поверхности.

Последовательность FcЈR экспрессиро- вать под контролем промотора бактериофага Lambda/Pi/.

EBI-496:

5 GAACTGCAGGTGAGCTCTGGTTTCGTTTGCAACACTTGCCCGGAAAAATG

EBI-497:

3 CTTGACGTCCACTCGAGACCAAAGCAAACGTTGTGAACGGGCCTTTTTACCTAG 5

Sau ЗА

с тем, чтобы восстановить соответствующие кодоны формул

GluLeuGlnValSerSerGlyPheVfelCysAsnThrCysProGluLygTrp 5 GAACTGCAGGTGAGCTCTGGTTTCGTTTGCAACACTTGCCCGGAAAAATGЭ

3 CTTGACGTCCACTCGAGACCAAAGCAAACGTTGTGAACGGGCCTTTTTACCTAG 5

ЗаиЗА

16

Чувствительный к температуре аллель этого репрессорного гена может включать вектор, который содержит полную последовательность Рс R. Если температуру повышают до 42°С, то репрессор инактивируетс  и промотор экспримируетс  на своем максимальном уровне.

Могут примен тьс  системы промотор - оператор или их части, например арабиноз- ный оператор, колицин-Еч-оператор, галак- тозный оператор, щелочной фосфатазный оператор, трп-оператор, кисксилозный А- оператор, tac-оператор и другие.

Плазмиду pRH 100 переваривают с по5 мощью Sstl. Затем З -выступы удал ют и линеаризованную плазмиду подвергают де- фосфорилированию. После экстракции фенолом и хлороформом, электрофореза, электроэлюации и осаждени  линеаризо0 ванный вектор лигируют со вставкой, получаемой следующим образом.

Ллазмиду pGEM4-FcЈR, полученную перевариванием EcoRI-вставки плазмиды LE 392 с Hindlll и повторного введени  в

5 pGEM4 длинного фрагмента EcoR1 и Hindlll, переваривают с EcoR1 и Hindlll. Затем выступающие 5 -концы затупл ют с помощью фрагмента Кленова ДНК-полимеразы 1, после чего 5 -фосфатные группы удал ют. После

Q очистки полученный фрагмент гидролизуют Sau ЗА и больший фрагмент выдел ют. Так как в результате этой операции удал ют не только 5 -область, но и нуклеотиды дл  первых Nконцевых аминокислот водорастворимой части, синтезируют два олигодеоксинуклео5 тида формул

17

(без кодона ATG, так как он содержитс  в промоторно-операторно-линкерной системе плазмиды pER 103).

Вставки лигируют с линеаризованным вектором ДНК и трансформируют в E.coli НВ101, отбирают устойчивые к ампициллину колонии. Плазмиды исследуют путем рестрикционного анализа. Плазмиду отбирают и обозначают как рРН 246.

Дополнительно к прокариотам могут примен тьс  дрожжевые культуры.

Гены водорастворимой части человеческого рецептора Fc€R с аминокислотами 150- 321 можно экспрессировать в дрожжах, если примен ть ADH1-промотор вместе с ADH1- терминатором. Дрожжевой экспрессионный вектор можно получать за счет получени :

а)плазмиды, содержащей дрожжевой ADH1-терминатор;

б)плазмиды, содержащей дрожжевой ADHI-промотор и дрожжевой АОШ-терми- натор;

в)плазмиды, содержащей дрожжевой ADHI-промотор, ген, кодирующий дрожжевую доминантную последовательность MF а , мультиклонирующее место и дрожжевой ADH1-терминатор;

г)плазмиды, содержащей ADHI-промотор , последовательность, кодирующего водорастворимую часть человеческого рецептора FC...R малого сродства, и АОН1-терминатор;

д)трансформации полученной плазмид- ной ДНК в дрожжевом векторе.

При этом получают плазмиду, содержащую экспрессионную кассету без доминантной последовательности MFa, и плазмиду, содержащую экспрессионную кассету с доминантной последовательностью MFa.

Операции провод тс  следующим образом .

a) ADH1-терминатор выдел ют из плазмиды plD14. ADHI-терминатор субклониру- ют в плазмиде pUC18 по сайтам Hindlll и

IНазвание

MF I TCGAGCCTCATATCAATGAGATTCCCATCTATTTTCACTGCTGTTTTGTT (50-меР)

КР 2 AGCAGCGAACAAAACAGCAGTGAAAATAGATGGGAATCTCATTGATA fGA GGC (53-Мср)

MF 3 CGCTGCTTCCTCCGCTTTGGCTGCTCCA oTCAACACTACTACTGAAGACG AAACTGCTCAAATTCCAGCT (70 -мер)

72753318

Sphl и получают плазмиду pWS 214S4. По- еле гидролиза pWS 214S4 рестриктазами Sphl и Sail меньший фрагмент выдел ют электрофорезом в агарозном геле. 5Фрагмент, содержащий ADHI-терминатор , подвергают лигированию с векторной ДНК, полученной перевариванием Bluescribe M13 рестриктазами Sail и Sphl с последующей очисткой электрофорезом в 10 агарозном геле.

Лигированную ДНК трансформируют в E.coli IM101 и отбирают колонии, устойчивые к ампициллину. Плазмиду этих колоний обозначают как pRH241. Эта плазмида со- 15 держит имеющий примерно 340 п.о. фрагмент с АОН1-терминатором.

б)АОН1-промотор выдел ютиз плазмиды pY-IDB-HulFN-омега-Т, т.е. плазмиды дл  получени  человеческого интерферона 20 омега 1. Плазмиду переваривают рестрикта- зой Sphl, затем удал ют З -выступ с использованием ДНК полимеразы 1 в присутствии dGTP и повторно гидролизуют рестрикта- зой Xho1. Электрофорезом в агарозном геле 25 выдел ют фрагмент размером 400 п.о. и подвергают его легированию с адапторной парой формулы

ЕВ 1-410: 5 AATTGGAAGGATC 3 ЕВ 1-429: 3 CCTTCCTAG-p5

В липкий конец лигируют с адапторной парой формулы ЕВ 1-418: 5 p-TCGAGCACGTGGTAC 3 ЕВ 1-424: 3 CGTGCAC5

Реакции лигировани  провод т одновременно . После очистки электрофорезом в ага- 35 розном геле ДНК лигируют с ДНК плазмиды pRH241 по сайтам EcoR1 и Крп1 и трансформируют ее в E.coli. Колонии исследуют на наличие плазмиды с правильной конструкцией , которую обозначают как pRH242. до в) Химический синтез пептида MFa осуществл ют с использованием предварительно синтезированных олигонуклеотидов:

Последовательность

30

172753320

MF 4 CAGCTTCAGCTGGAATWGAGCAGTTTCGTCTTCAGTAGTAGTGTTGACT

GGAGCAGCCAAAGCGGAGGA {7О-мвр)

MF 5 GAAGCTGTCATCGGTTACTCTGACTTGGAAGGTGACTTCGACGTTGCT (48 -wet)

MF 6 GCAAAACAGCAACGTCGA.GTCACCTTCCAAGTCAGAGTAACCGATGA (48 -мет)

MF 7 GTTTTCCCATTCTCCAACTCCACTAACAACGGTTTGTTGTTCATTAAC ACTACTATTGCATCGATTGCT (69-иеТ) )

MF 3 CCTTAGCAGCAATCGATGCAATAGTAGTGTTAATGAACAACAAACCGTTG TTAGTGGAGTTGGAGAATG { 69-мер )

MF 9 GCTAAGGAAGAAGGTGTTTCTTTGGACAAGAGGCCTCTGCAGGAATTCT (49-Uej)

MF 10 CTAGAGAATTCCTGCAGAGGCCTCTTC-TCCAAAGAAACACCTTCTT

(46-A/ep)

Олигонуклеотиды MF2 - MF9 подвергают фосфорилированию. После прекращени  реакции путем нагревани  получают следующие смеси: MF1 и MF2; MF3 и MF4; MF5 и MF6; MF7 и MF8; MF9 и MF10. После нагревани  и охлаждени  п ть растворов объедин ют и лигируют. К полученному раствору добавл ют линеаризованную ДНК плазмиды pRH 242, полученную путем переваривани  с помощью Xho1 и ХЬа1 и последующей очистке электрофорезом. Раствор лигируют и трансформируют в E.coli IM101. Плазмиды полученных колоний исследуют путем переваривани  с помощью Xho1 и ХЬа1. При этом те плазмиды, которые содержат вставку длиной примерно 290 п.о. клонируют с М13мр8 с последующим анализом последовательностей. Плазмиду, содержа

ATG GAA TTG CAA GTT ТСС ТСТ ACT TGT CCA GAA AAG TG

CTT AACGTT CAA AGG AGA CCA

АСА GGTCTT TTC ACC TAG ISau3A

щую правильную вставку, отбирают и обозначают как pRH243.

г) Последовательность, кодирующую водорастворимую часть человеческого рецептора FcЈ R малого сродства, выдел ют из плазмиды pGEM4 путем переваривани  с помощью Hindlll и EcoR1 и липкие концы дополн ют с использованием фрагмента Кленова ДНК-полимеразы 1 из E.coli. Большой фрагмент подвергают фефосфорилиро- ванию и очистке, а затем гидролизуют с помощью SauSA. Так как при этом удал етс  не только 5 -область, но и нуклеотиды первых 18 N-концевых аминокислот водорастворимого фрагмента, начина  с аминокислоты 150, синтезируют два олгино- деоксинуклеотида

21172753322

с тем, чтобы восстановить полный ген с ис-пользованием дрожжевого кодона формулы

Met 5 TCGAGCTCATATACA АТС

3 CGAGTATATGT TAG

Xhol

155160165

Glu Leu Gin Val Ser Ser Gly Phe Val Cys Asn Thr Cys Pro Glu GAA TTG CAA GTT TCC TCT. GGT TTC GTT TGT AAC ACT TGT CCA GAA CTT AAC GTT CAA AGG AGA CCA AAG CAA АСА TTG TGA АСА GGT CTT

Trp TG ACC TAG Sau3A

3 5

Полученные олигонуклеотиды ренату- рируют и лигируют с фрагментом SauSA и EcoRf с использованием лигазы Т4 ДНК.

Вставку лигируют ДНК, плазмиды pRH242 по сайтам ХЬа1 и Xho1 и трансформируют в E.coli IM101. Плазмиды полученных колоний исследуют при помощи рестрикционного анализа. Плазмиду, содержащую правильную вставку, отбирают и обозначают как pRH244.

д) Последовательность, кодирующую водорастворимую часть человеческого рецептора Fc R малого сродства, выдел ют из

EBI-430:

5 ATGGAATTGCAAGTTTCCTCTGGTTTC ATG GAA TTG CAA GTT TCC TCT GGT TTC GTT TGT AAC ACT TGT CCA GAA AAG TG

EBI-437:

3 TACCTTAACGTTCAAAGGAGACCAAAG TAG CTT AAC GTT CAA AGG AGA CCA AAG CAA АСА TTG TGA АСА GGT CTT TTC ACC TAG 5

Sau3A

i.

с тем, чтобы восстановить полный ген с ис-пользованием дрожжевого кодона формулы

I

50Met

5 ATG

3 TAG

Glu Leu Gin Val Ser Ser Gly Phe Val Cys Asn Thr Cys Pro Glu GAA TTG CAA GTT TCC TCT GGT TTC GTT TGT AAC ACT TGT CCA GAA CTT AAC GTT CAA AGG AGA CCA AAG CAA АСА TTG TGA АСА GGT CTT

I

плазмиды pGEM4-FCgR путем переваривани  с помощью Hindlll EcoR1 и концы дополн ют с использованием фрагмента Кленова ДНК полимеразы 1 из E.coli. Меньший фрагмент подвергают дефосфорилированию и очистке. Так как Hindlll режет дДНК FcЈR примерно 50 п.о. после первой аминокислоты, вставку подвергают гидролизу с помощью SauSA. Так как при этом удал ют не только 5 -область (в направлении конца), но и нук- леотиды первых 18 N-концевых аминокислот водорастворимого фрагмента, синтезируют два олигонуклеотида формул

Trp TG ЛСС TAG Sau3A

31 5

Олигонуклеотиды ренатурируют, фрагмент SauSA к EcoR1 добавл ют и подвергают лигированию с помощью ДН К лигазы Т4. Полученный фрагмент подвергают очистке путем электрофореза, электроэлюции и эсаждени  известными методами.

Вставку лигируют с ДНК плазмиды pRH243 по сайтам EcoFM, и Stul и трансформируют в E.coli IM101. Полученные колинии исследуют с помощью рестрикционного анализа. Плазмиду, содержащую правильную вставку, отбирают и обозначают как PRH245.

е) Плазмиды pRH244 и pRH245, состо щие из промотора ADH1, доминантного гена MFa (только в случае рРН245), водорастворимого гена FcgR и терминатора ADH1, гидролизуютрестриктазамиШпсЛН и BamHI и лигируют с дрожжевой плазмидой рЮВ207или YEp13.

Плазмиду LE392 или pGEM4 (pFct R-1) переваривают при помощи Hindlll и EcoRL Фрагмент ДНК, начинающийс  с нуклеоти- да 584, клонируют в плазмиду pGEM4, по сайтам Hindlll и EcoRL Один из отобранных клонов размножают и обозначают как pANFc R-1.

Плазмиду LE392 или pGEM4 (pFcЈ R-1) гидролизуют с помощью EcoR1 и получают фрагмент, содержащий дДНК длиной примерно 1,7 т.п.о (Fc-R). Полученный фрагмент частично переваривают с помощью SauSA с тем, чтобы удалить последовательность дДНК, кодирующую цитоплазменный домен , например, дл  аминокислот 1-23, и фрагмента дДНК, начинающего с нуклеоти- да 254, лигируют с 26-мерным линкером формулы

5 -GATCTGAGTCATGGTACCATGACTCA-3 с тем, чтобы восстановить стартовый кодон АТС на б -конце и рестрикциейное место Крп1. Лигированный фрагмент клонируют в плазмиду pGEM4 по сайтам Крп1 и EcoRL Путем гибридизации отбирают клоны, у которых область предположительного цитоп- лазменного домена отсутствует. Один клон отбирают, размножают и обозначают как р A NFCgR-2.

Общие материалы и методы.:

Моноклональные анти-Fc R антитела 3- 5 (yi ) и 8-30 ( /г) получались путем гибри5

дизации P3U1 миеломы с клетками мышиной селезенки, иммунизированными клетками RPM1-8866. Антитело 8-30 рас- , познает эпитоп, смежный с местом св зывани  иммуноглобулина рецептора FcЈ , и может блокировать св зывание иммуноглобулина с лимфобластоидными клетками 8866. Антитело 3-5 распознает другой эпиQ топ на и не может эффективно блокировать св зывание иммуноглобулина с его рецепторами. Эти антитела осаждают в восстанавливающих и невосстанавливающих услови х полипептиды с молекул рной массой 46 кд и 25 кд. Моноклональные антитела очищают путем осаждени  50%-ным насыщенным сульфатом аммони  и последующей гелевой фильтрации с использованием се- фарозы 6В (в случае иммуноглобулина М)

Q или ионнообменной хроматографии с использованием сефадекса (в случае иммуноглобулина С1). Поликлониальный мышиный иммуноглобулин G выдел юттаким же образом .

Предварительно очищенный материал

5 FcЈR подают на колонку, уравновешенную водой, содержащей 0,1% трифторуксусной кислоты, и элюированную линейным градиентом ацетонитрила, содержащего 0,1% трифторуксусной кислоты. При этом ацето0 нитрил примен ют в количестве 0,5 мл/мин с соблюдением линейного градиента от 0 до 65% в течение 60 мин. Элюированный материал замораживают и лиофилизируют перед исследованием на активность методом эним.

5

0

5

0

5

Синтезированные олигодеоксинуклео- тиды очищают путем электрофореза на по- лиакриламидном геле.

П р и м е р А. Получение плазмиды pY- IDB-HulFN-OMeraL

а)Получение дрожжевого промотора ADH1.

8 мкг плазмиды рЁЗЮЗ переваривают с BamHI иХгю1 в500мкл раствора. Промотор длиной около 1450 п.о. отдел ют в 1%-ном агаровом геле и осаждают. Фрагмент суспендируют в 40 мкл ТЕ-буфера (10 мМ трис, 1 мМ этилендиаминотетрауксусной кислоты (далее ЭДТУ), рН 8). Плазмиду рЕЗЮЗ получают за счет введени  в pUC18 переваренной BamHI и Xho1 плазмиды АХ 11 длиной около 1450 п.о.

б)Подготовка вектора рЮВ207.

10 мкг рЮВ207 линеаризуют при помощи BamHL С целью предотвращени  последующего повторного св зывани  удал ют) 5 -концевые фосфатные группы путем обра- ботки фосфатазой кишечника теленка. Линейную форму отдел ют в 1 %-ном агаровом,

25

геле от неразрезанной плазмиды. Полученный вектор ДНК раствор ют в 20 мкл ТЕ-бу- фера.

в)Экспрессионный вектор дл  интерферона типа омега 1.

50 мкл плазмиды pRHW12 линеаризируют при помощи Hindlll, обрабатывают фрагментом Кленова ДНК-полимеразы 1 и очищают путем электрофореза в агаровом геле. Дл  получени  соедин ющихс  с промотором концов к концам линейного pRHW12 присоедин ют линкер Хпо1.

Путем обработки 100 единицами Хпо1 освобождают специфические относительно Xho1 клейкие 5 -выступы, Снабженный Xhol-концами линейный pRHW12 очищают путем электрофореза в агаровом геле, добавл ют 5 мкл промотора (со стадии а), лигируют и осаждают. ДНК суспендируют и режут при помощи ВатН1. ДНК получают очисткой в агаровом геле.

г)Лигирование фрагментов.

Готовый экспрессионный вектор получают лидированием фрагмента ВатНЧ (промотор и ген интерферона типа омега 1) с вектором рЮВ207.

д)Трансформаци .

Клетки E.coli HB101 трансформирукгг путем добавлени  раствора лигированной ДНК и культивируют на LB-агаровых пластинках , содержащих 100 мкг/мл ампициллина . Выбирают 12 из полученных клонов и выдел ют содержащиес  в них плазмиды. После анализа плазмид при помощи ре- стрикционного анализа и электрофореза в агаровом геле отбирают плазмиду, имеющую правильную конструкцию. Ее обозначают как pY-IDB-HulFN-омега 1.

П р и м е р Б. Конструкци  экспрессион- ной плазмиды рРНЮО.

ДНК плазмиды pER103 расщепл ют эн- донуклеазой Hindlll, б -концевые фосфатные остатки удал ют щелочной фосфатазой кишечника теленка (ФТК). ДНК осаждают дабавлением 0,1 об% раствора ЗМ ацетата натри  с рН 5,5 и этанола. Осадок ДНК центрифугируют и промывают 70%-ным раствором этанола.

Синтетические олигонуклеотиды o(AGCTTAAGATGAGCT) и о(САТСТТТА) фос- форилируют Т4-полинуклеотидкиназой (ПНК).

Раствор плазмиды и фосфорилованного олигонуклеотида перемешивают и нагревают до 70°С в течение 5 мин, затем охлаждают до 0°С и добавл ют буфер лигировани  (500 мМ трис, рН 7,5), 100 мМ хлорида магни , 200 мМ дитиотрейтола (ДТТ), 1 мМ у АТР, 500 мкг/мл альбумина сыворотки

72753326

крупного рогатого скота (АСС), Т4-ДНКлига- зу. Реакцию провод т при 4°С в течение 40 ч. Ее прекращают путем нагревани  при 70°С в течение 10 мин.

Продукт лигировани  переваривают эн- донуклеазой SaC1, затем лигируют и подвергают трансфекции в клетки E.coli HB101. Бактерии нанос т на LB агаровые плитки, содержащие 50 мкл/мл ампициллина.

12 из бактериальных колоний произвольно выбирают, выдел ют плазмиды и режут эндонуклеазой Sad.

Наличие линейной молекулы ДНК длиной 4400 п.о. подтверждает, что мес 5 то распознавани  SaC1 было встроено в плазмиду. Одну из плазмид произвольно выбирают. Плазмиду, обозначенную как рРНЮО, расщепл ют эндонуклеазами EcoR1 и ВатН1, раздел ют в 1% агарового

20 гел  и меньший фрагмент выдел ют из гел . Этот EcoR1-BamH1 фрагмент ДНК длиной примерно 460 п.о. подвергают анализу.

ПримерВ. Конструкци  плазмиды pANFc R-1.

25 дн К переваривают с помощью Hindlll в 50 мкл и затем с помощью EcoR1. Получают фрагмент EcoR1-Hindlll, содержащий область длиной 1 т.п.о. растворимого дДНК FcgR. Переваренную ДНК подвергают

30 электрофорезу в 1%-ном агаровом геле, выдел ют Hindlll-EcoR1 фрагменты путем электроэлюации с последующим осаждением в 70%-ном этаноле. PGEM4 переварива- ютс помощью Hindlll и EcoR1, экстрагируют фенолом и осаждают этанолом. Фрагменты

35 лигируют и подвергают трансфекции в E.coli (МС1065). Один клон отбирают, размножают и обозначают как р ANFcf R-1.

П р и м е р Г. Конструкци  плазмиды pANFc R-2.

40 pFcg R-1 переваривают рестриктазой EcoR1, подвергают электрофорезу в агаровом геле(1%). EcoR1 фрагмент длиной примерно 1,7 т.п.о. выдел ют электроэлюацией с последующим осаждением этанолом при 45 80°С в течение 1 ч. Фрагмент переваривают рестриктазой Асс1 и частично рестриктазой SauSA с последующей экстракцией фенолом и осаждением этанолом с получением Sau3A-EcoR1 фрагмента. ДНК фрагмент

50 подвергают лигированию с синтетическим линкером (S -GATCTGAGTCATGGTACC- ATGACTCAGATCGTGCTG-3 ). ДНК экстрагируют фенолом и осаждают этанолом. Фрагменты раствор ют, переваривают ре55 стриктазой Крп1 и экстрагируют фенолом с последующим осаждением этанолом. Избыточный линкер удал ют хроматографией в геле (биогел А 50 м). pGEM 4 переваривают

27

рестриктазой Крп1, затем EcoRL Фрагменты , св занные с синтетическими линкерами, подвергают лигированию с Крп1 и EcoR1 фрагментом pGEM4 и осуществл ют транс- фекциювЕ.со11(МС1065). &ioHpANFcf R-2, у которого отсутствует только цитоплаз- менный домен, выдел ют и размножают с использованием известного метода гибридизации колоний. П р и м е р 1.

а)Выделение сырого Fc R из культу - ральной нэдосадочной жидкости.

Клетки RPM1-8866 культивируют в среде RPM1-1640, содержащей еще 10% эмбриональной тел чьей сыворотки, 100 ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина, при плотности 1x10° клеток/мл и жизнеспособности клеток 95-99%. Клетки собирают, центрифугируют при 5000 об/мин в течение 15 мин, промывают три раза раствором Хен- ка ББС и культивируют в бессывороточной среде в течение 48 ч при той же плотности. Культуральную надосадочную жидкость собирают и добавл ют 1 мМ фенилметилсуль- фонилфторида (ФМСФ), 0,02% азида натри  и 200 ед/мл апротеина. Культураль- ныенадосадочные жидкости хран т при 4°С во врем  концентрировани , которое осуществл ют фильтрацией. Затем концентри- рованный в 200-300 раз материал центрифугируют с тем, чтобы удалить нерастворимый материал. Получают при этом сырой FcЈ R.

б)Выделение FC R из клеточных лиза- тов.

Клетки RPM1-8866 (2х109 клеток) промывают четыре раза буфером РВС (содержит 0,5% поверхностно-активного вещества НП-40) и лизируют в 10 мл буфера лизиса и 1 мМ ФМСФ в течение 45 мин во льду при периодическом перемешивании. Дополнительно добавл ют еще 10 мл буфера лизиса и реакцию продолжают во льду в течение 30 мин. Лизат центрифугируют пр 37000 об/мин в течение 45 мин при 4°С. Липидный слой тщательно собирают, надосадочную жидкость собирают и хран т при -70°С.

П р и м е р 2. Иммуноочистка.

Концентрат культуральной надосадочной жидкости (см. пример 1а), эквивалентный 5- 10л культуры, подвергают последовательной адсорбции на 2 мл сефарозного гел , св занного с альбумином сыворотки крупного рогатого скота, св занного с человеческим трансферрином сефарозного гел  и св занного с мышиным иммуноглобулином сефарозного гел , каждый раз в течение 1 ч при 4°С. Вытекающий поток, собираемый с последнего гел , затем подают на 2 мл анти

1727533

28

5

5

0

5

0

S

0

5

Fcf R (3-5), св занного с сефарозой. Им муноадсорбцию провод т в течение 4-16 ч при 4°С. Гель подают в колонку, вытекающий поток собирают и гель последовательно промывают 150 мл буфера А (10 мМ трис-HCI, рН 7,5, 0,5 М хлорида натри , 0,5% НП-40), 150 мл буфера Б (10 мМ трис- HCI, рН 7,5, 0,1% НП-40), 150 мл буфера В (ЮмМ трис-HCI, рН 7,5), элюируют25мл 2,5 об.% уксусной кислоты и сразу же нейтрализуют в 2 М трис-HCI с рН 8,0. Полученный материал хран т при -80°С, если он не подвергаетс  непосредственной очистке путем жидкостной хроматографии. Затем элюат фракционируют путем жидкостной хроматографии с обращенной фазой на колонке С4 с использованием линейного градиента 0-65% ацетонитрила, содержащего 0,1% трифторуксусной кислоты.

П р и м е р 3. Анализ с использованием св занного с энзимом иммуносорбента (метод эним).

Активность FcgR измер ют за счет определени  его способности к св зыванию с моноклональными антителами 3-5 и 8-30. На микротитровальные пластинки сначала нанос т 100 мкл на пробу моноклонального антител  3-5 (в бикарбонатном буфере) 0,1 М бикарбоната натри , рН 9,6, после чего инкубируют в течение ночи при 4°С, промывают четыре раза фосфатным буфером, содержащим 0,05% твина 20, с последующим добавлением 100 мкл исследуемого образца , разбавленного буфером с рН 8,1 (0,05 М трис-HCI, 1 мМ хлорида магни , 0,15 М хлорида натри , 0,05 об. % твин 20,0,02 % азида натри  и 1 % АСС). Микротитровальные платы инкубируют при комнатной температуре в течение 2 ч и промывают. Добавл ют 100 мкл предварительно титрованного и разбавленного конъюгата из козьего -анати-мыши- ного иммуноглобулина М и щелочной фосфатазы. Платы инкубируют при комнатной температуре в течение 2 ч и промывают, добавл ют 100 мкл субстратного буфера (0,05 М бикарбоната натри , рН 9,8, 10 мМ гексагидрата хлорида магни ), содержащего 1 мг/мл n-фенилфосфата динатри , и ко- лориметрируют каждые 30 мин в течение 2 ч при 405 и 620 нм.

П р и м е р 4. Гидролиз рецептора при помощи лизилендопептидазы и отделение пептидов.

Очищенный FcЈ R переваривают с помощью лизилендопептидазы Achromobacter lyticus в 50 мМ буфера трис-HCI с рН 9,5 при получают путем хроматографии на олиго- dT-целлюлозе. Радиомаркированную дДНК синтезируют из поли/А/+-РНК с использованием P-dCTT. Маркированную дДНК

35°С в течение 6 ч при весовом соотношении энзима к субстрату, равном 1:500. Лио- филизованные пептидные фрагменты, очищают жидкостной хроматографией.

Отделение пептидов жидкостной хроматографией с обращенной фазой.

Отделение пептидов осуществл ют посредством жидкостной хроматографии на колонке С4. Элюацию пептидов осуществл ют с соблюдением следующих условий: линейный градиент смеси 2-пропанола и ацетонитрила в объемном соотношении 7:3 в пределах от 0 до 35% в течение 1 ч в 0,1 % трифторуксусной кислоты, расход 1-,0

Met-Glu-Leu-Gin-Val-Ser-Ser-Gly-Phe-Val-,

Gly-Glu-Phe-Ile-Trp-Val-Asp-Gly-Ser-His-Val-Asp-Tyr-Ser-Asn- Trp-Ala-Pro-Gly-Glu-Pro-Thr-,

Lys-His-Ala-Ser-Hi s-Thr-Gly-Ser-Trp-Ile-Gly-Leu-Arg-Asn-Leu- Asp-Leu-LysLys-Trp-Ile-Asn-Phe-Gln- .

П p и м е р 5. Получение олигонуклеоти- ца формулы

З -ТТ АСС TAG TTЈ AA GT -5 А

Олигонуклеотид синтезируют с использованием синтезатора А 1, деметилируют смесью тиофенола, триэтиламина и диокса- на в соотношении 1:2:2 при комнатной температуре в течение 90 мин и промывают метанолом (10x1 мл метанола). После очистки деметилированного олигонуклеотида на пористом стекле и сн ти  защитной группы концентрированным аммиаком при комнатной температуры в течение 1 ч и при темпе- ратуре 55°С в течение 16 ч осуществл ют сушку продукта.

Дальнейшую очистку осуществл ют с 20% акриламидным гелем в присутствии 8 М мочевины, с элюацией ТБЕ-буфером (10,9 г три(оксиметил)аминометана, 5,5 г борной кислоты и 9,3 г динатриевой соли этиленди- нитрило-тетрауксусной кислоты в 1 л).

Электрофорез провод т в геле (40x25x0,01 см) при 50 Вт. Полосу 17-мер вырезают, элюируют водой и обессоливают на колонке с сефадексом С 25 с водой. Фракции, содержащие 17-мер, собирают и

0

5

мл/мин. Фракционированные пептиды собирают путем определени  абсорбции при 215 нм.

Определение аминокислотных остатков и их последовательности.

Анализы провод т после осуществлени  гидролиза пептидных фрагментов в 5,7 HCI при 110°С в течение 22-24 ч в эвакуированных закрытых трубках. Аминокислоты фенилтиогидантоина {ФТГ) определ ют жидкостной хроматографией с обращенной фазой. Определ ют следующие аминокислотные последовательности:

30

сушат. Выход: 285 мкг (оптическа  плотность 260:7,7).

П р и м е р 6. Установление L-клеточных

трансформантов

Один миллион клеток LtK подвергают трансфекции 150 нгвируса Герпес симплекс из tK гена и 20 мкг высокомолекул рной геномной ДНК из клеток RPM1-8866. После

хранени  в HAT среде в течение 10 дней отбирают клетки. Клетки I, которые про вл ют устойчивость к HAT, собирают, трав т биотинированным анти-Рс,.Р(8-30)иавиди- ном, св занным с изотиоцианатом флуоресцеина (ИТСФ), и классифицируют, провод т несколько циклов классификации дл  каждой трансфекции. В независимых трансфек- ци х получают две трансформантные линии: L-V-80-30 и L-V1-8-30.

Пример. Клонирование дЦНК Fc, R

Проба 1.

РНК выдел ют из трансформанта L-V-8- 30 известным методом с использованием гуанидина и хлорида1 цези . Поли/А/ -РНК

31

подвергают ренатурации избыточной поли/А/ -РНК нетрансформированных LtK клеток и подают на оксиапатит колонку. Од- нонитевую с дДНК собирают и используют в качестве пробы 1.

Проба 2.

Олигонуклеотиды 17-мер, дополнительные к мРНК последовательности, кодирующей аминокислотный фрагмент Lys-Trp-lfe-Asn-Phe-GIn, и содержащие смесь 24 возможных последовательностей, радиомаркируют х 32Р-АТР при помощи Т4-полинуклеотид-киназы. Двухнитевую дДНК синтезируют из поли/А/+-РНК, полученной из клеток RPM1-8866. После обработки метилазой EcoR1 и полимеразой ДНК Т4 двухнитевую дДНК длиной более 1000 п.о. клонируют в EcoR1 место л мбда gt10 с использованием EcoRI-линкеров. Приготовл ют два набора реплика-фильтров из фага. Один набор фильтров подвергают гибридизации с Р-маркированными олиго- нуклеотидами 17-мер (проба 2). Другой набор фильтров подвергают гибридизации с 32Р-маркированной дДНК, специфичной относительно FcfR положительных клеток L (проба 1), при 68°С в течение ночи в 6xSSC(1xSSC:0,15 M хлорида натри , 0,015 М цитрата тринатри , рН 7,0), после чего промывают 0,1xSSC и 0,1% додецилсульфа- та натри . П тна, которые гибридизируют с обеими пробами, выдел ют.

ПримерЗ. Экспресси  дДНК FcfR.

Дл  экспрессии дДНК в pGEM4 с использованием промотора SP6 мРНК синтезируют с помощью SP6 РНК полимеразы с использованием в качестве матрицы переваренного ВатН1 рРс R-1. 10 нг мРНК впрыскивают в один ооцит, в качестве контрольного опыта аналогично получают мышиную BSF-1 мРНК, которую впрыскивают в другой ооцит. После инкубации в течение 2 дней в среде Барта при 20°С ооциты подвергают лизису в 50 мкл буфера лизиса (10 м.М трис-HCfc рН 7,5,0,5 М хлорида натри , 0,5% НП-40). Лизаты ооцитов исследуют на активность Fc R с использованием метода эним, в котором используют два анти-РсЈ R антитела (3-5 и 8-30). В качестве контрольного опыта используют концентрированную надосадочную жидкость, полученную из клеток RPM1-8866.

Дл  экспрессии дДНК Fcg R в клетках Cos-7 вставку pFc R-1 клонируют в EcoR1 место вектора pDE2. 5x10 клеток Cos-7 нанос т на 60 мм плитки за день до трансфек- ции,которую провод т с использованием 2 мкг плазмидной ДНК в 1 мл буфера, состо щего из 25 мМ трис-HCf (рН 7,5), 137 мМ хлорида натри , 5 мМ хлорида кали , 0,6 мМ

10

72753332

гидрогенфосфата натри , 0,5 мМ хлорида магни  и 0,7 мМ хлорида кальци , и 500 мкг декстрана, снабженного диэтиламиноэ- тильными группами. После часовой инкубации при 37°С раствор замен ют ДМЭМ, содержащего 10% FCS и 150 мМ хлорокви- на, инкубируют при 37°С в течение 3 ч и затем замен ют свежим ДМЭМ, содержащим 10% FCS. Через 48 ч клетки обрабатывают св занным с фикоцианином анти-Fc.R антителом (3-5) и биотинированным иммуноглобулином Е, про вл ют при помощи ИТСФ-авидина и подвергают анализу.

П р и м е р 9. Определение нуклеотидной f 5 последовательности дДН К Fc,- R.

Вставку рРсЈ R-1 переваривают энзимами Hindlll и Pvull. ДНК субклонируют в М13 и подвергают анализу.

20 I

Примерю. Анализ мРНК Рсг R.

Поли/А/+-РНК из различных клеток раздел ют в агаровом геле (1 %), подают на нит- роцеллюлозную бугаму и гибридизуют со вставкой pFc-R-1, меченной в ник-трансл 25 ции. Дл  индукции BSF-1, 100 миллионов клеток В или Т культивируют в отсутствии или в присутствии 10 мкг/мл иммуноглобулина Е и 50 мкг/мл рекомбинантного человеческого BSF-1 10 мкг всей РНК

30 экстрагируют и анализируют.

ПримерП. Экспресси  водорастворимой части человеческого рецептора Fc,. малого сродства в дрожжах.

Стади  1. Получение плазмид PjDB-244 и pjDB-245.

а) Получение плазмиды pRH 241, содержащей дрожжевой ADH1 терминатор.

35

Получение вектора.

10 мкг Bluescribe M13+ подвергают двойному перевариванию с 20 единицами Sail и 20 единицами Sphl. Реакцию прекращают путем добавлени  1/25 обьема 0,5 М

динатриевой соли этилендинитрилотетра- уксусной кислоты и нагревани  при 7°С в течение 10 мин. Разрезанный вектор очищает путем электрофореза на агаровом геле (1% агарозы, 1хТВЕ-буфер, состо щий из

6,05 г/л трис-оксиметиламинометана, 3,1 г/л борной кислоты, 0,37 г/л ЭДТА и содержащий 0,5 мкг/мл бромида этиди  при 4 в/см). После обнаружени  полосы ДНК с использованием ультрафиолетового света (254 нм) ДНК выдел ют электроэлюацией с

использованием бумаги ДЕ81 и очищают осаждением этанолом. ДНК раствор ют в 10 мкл ТЕ-буфера (10 мМ трис, рН 8,0, 1 мМ ЭДТА).

33

Получение вставки.

10 мкг pWS214 4 переваривают 20 единицами Sphl и 20 единицами Sail Меньший фрагмент, содержащий ADH1 -терминатор, выдел ют путем электрофореза в агаровом геле, электроэлюации и осаждени . Полученную ДНК раствор ют в 10 мкл ТЕ-буфе- ра. 1 мкл векторной ДНК и 1 мкл вставки ДНКлигируютТУ-ДНКлигазой в 10 мкл раствора . 3 мкл лигазной смеси используют дл  трансформации E.coli IM101 SupE, thi, del/lac-proAB/, F traD36, proAB, tectg, lacZ -del M15, л мбда-минус). После селекции ампициллином плазмиды выдел ют и переваривают с помощью Sphl и Sa(l. Фрагменты раздел ют в агаровом геле. Одну из плазмид отбирают и обозначают как pRH 241.

б) Получение плазмиды pRH 242, содержащей дрожжевой ADH1-промотор и дрожжевой ADHI-терминатор.

Получение вектора.

Плазмиду pRH 241 подвергают двойному перевариванию с помощью EcoR1 и Крп1. Меньший фрагмент удал ют из векторной части путем электрофореза в агаровом геле, электроэлюации и осаждени . Полученный фрагмент раствор ют в ТЕ-буфере.

Получение вставки.

Плазмиды pV-jDB-Hu-jFN-омега 1 (см. пример А) разрезают рестриктазой SphT. S - конец удал ют ДНК полимеразой 1 E.coli в присутствии dGTP. ДНК гидролизуют Xho1, фрагменты выдел ют путем электрофореза в агаровом геле, электроэлюации и осаждени . Тупой конец фрагмента длиной 400 п.о.,

Название

MF 1 TCGAGCCTCATATCAATGAGATTCCCATCTATTTTCACTGCTGTTTTGTT

(50-мер)

MF 2 AGCAGCGAACAAAACAGCAGTGAAAATAGATGGGAATCTCATTGATATGA GGC (53-мер)

MF 3 CGCTGCTTCCTCCGCTTTGGCTGCTCCAGTCAACACTACTACTGAAGACG AAACTGCTCAAATTCCAGCT (70-мер)

MF 4 CAGCTTCAGCTGGAATTTGAGCAGTTTCGTCTTCAGTAGTAGTGTTGACT GGAGCAGCCAAAGCGGAGGA (70-мер)

MF 5 GAAGCTGTCATCGGTTACTCTGACTTGGAAGGTGACTTCGACGTTGCT (48-«ер).

1727533

34

5

5

0

5

содержащий ADH1-промотор, подвергают лигированию с адапторной парой ЕВ1-410: 5 ATTGGAAGGATC 3 ЕВ 1-429: 3 CCTTCCTAG-P5 .

Липкий конец фрагмента видоизмен ют с использованием адапторной пары ЕВ1-418: 5 p-TCGAGCACGTGGTAC 3 ЕВ1-424:CGTGCAC51

После одновременного лигировани  обоих адаптеров фрагмент, содержащий ADH1-промотор , очищают электрофорезом в агаровом геле.

Вектор и вставки лигируют, в результате лигировани  вставки в вектор места EcoR1 и Крп1 разрушаютс . Лигазной смесью трансформируют E.coli IM101. Колонии исследуют на присутствие плазмиды с желаемой конструкцией. Одну плазмиду отбирают и обозначают pRH,242.

в) Получение плазмиды pRH 243, содержащей дрожжевой ADHI-npoMOTOp, ген, кодирующий доминантный пептид дрожжевого фактора MFa, мультиклонирующее место и дрожжевой АОН1-терминатор.

Ген доминантного пептида MF «синтезируют химическим путем с использованием дрожжевого кодона.

Получение вектора.

Плазмиду pRH 242 переваривают с помощью Xhol и ХЬа1. Фрагмент очищают электрофорезом в агаровом геле, электро- элюацией и осаждением.

Получение вставки.

Получают следующие олигодеоксинук- леотиды:

I

Последовательность

MF 6 GCAAAACAGCAACGTCGAAGTCACCTTCCAAGTCAGAGTAACCGATGA (48-мер)

MF 7 GTTTTGCCATTCTCCAACTCCACTAACAACGGTTTGTTGTTCATTAAC ACTACTATTGCATCGATTGCT ()

MF 8 CCTTAGCAGCAATCGATGCAATAGTAGTGTTAATGAACAACAAACCGTTG

TTAGTGGAGTTGGAGAATG (69-uep)

MF 9 GCTAAGGAAGAAGGTGTTTCTTTGGACAAGAGGCCTCTGCAGGAATTCT (49-иет))

MF 10 CTAGAGAATTCCTGCAGAGGGCTCTTGTCCAAAGAAACACCTTCTT

(46-iiep)

60 пмоль каждого олигонуклеотида, за исключением MF 1 и MF 10, фосфорилируют с использованием Т4-полинуклеотидуиназы (ПНК). 60 пмоль MF 1 и MF 2 объедин ют. Объедин ют также растворы MF 3 и MF 4, MF 5 и MF 6, MF 7 и MF 8, MF 9 и MF 10. Объединенные растворы нагревают при 100°С и медленно охлаждают до комнатной температуры. Затем все растворы объедин ют , добавл ют 20ед. Т4-лигазы и реакцию лигировани  провод т при 14°С в течение 16ч.

0.5 мкл векторной ДНК и 7 мкл раствора смеси лигировани  объедин ют и подвергают лигированию с использованием 5 ед. Т4-лигазы. E.coli IM101 трансформируетс  лигазной смесью. Из некоторых колоний выдел ют плазмиды, анализируют их

ЕВ -491: V ТС0А0СТСАТАТАСМТ60- АТС GAA ТТС СМСТТ ТСС ТОТ

СОТ ТТС &ТТ TGT ЛАС ACT TG-T CCA GAAАЛС TGЕШ -95: 3 С АОТЛТАТ&ТТЛСС TAG G-TT ААС СТТ САААСС АСА ССА

ЛАО САЛ АСА TTG TG-A АСА &Л1 СТТ ТТСАСС TAGс тем, чтобы восстановить полный ген с использованием дрожжевого кодона формулы

155160165

Glu Leu Gin Val Ser Ser Gly Phe Val Cys Asn Thr Cys Pro Glu GAA TTG CAA-GTT TCC TCT GGT TTC GTT TGT AAC ACT TGT CCA GAA CTT AAC GTT CAA AGG AGA CCA AAG САА АСА TTG TGA АСА GGT CTT

с помощью Xho1 и ХЬа1. Плазмиды, содержащие вставку размера 290 и.о., подвергают дальнейшей характеристике путем клонировани  вставки в МТЗмрЗ с последующим анализом с использованием метода Сангера. Плазмиду, содержащую ожидаемую вставку, обозначают как pRH 243.

г) Получение плазмиды pRH 244, содержащей ADHI-промотор, последовательность , кодирующую водорастворимый фрагмент Fc R и АОШ-терминатор.

Получение вставки.

Плазмиду pGEM4, содержащую больший Hindlll/EcoR1 фрагмент дДНК , разрезают рестриктазами EcoR1 и Hindlll и обрабатывают фрагментом Кленова, дефос- форилируют, очищают и раздел ют на агаровом геле. Синтезируют два линкерных олигонуклеотида формул

$см/ЗЖ-) Jtei5 TCGAGCTCATATACA АТС

3 CGAGTATATGT ТАС

XhoI

Trp TG ЛСС TAG Sau3A

3

5

25 пмоль каждого олигонуклеотида pe- натурируют и добавл ют примерно к 3 мкг фрагмента SauSA (5 -фосфат/ЕсоР1 /встроенного , дефосфорилиро ванного) и лигируют с использованием Т4-ДНК лигазы. Получаемый фрагмент Xho1-/EcoR1/ очищают путем электрофореза в агаровом геле.

Получение вектора.

Плазмиду pRH 242 разрезают эндонук- леазой ХЬа1, концы затупл ют за фрагментом Кленова. ДНК разрезают Xho1 и больший фрагмент выдел ют электрофорезом в агаровом геле.

Вектор и вставку лигируют (лигирова- ние встроенного EcoRI места на встроенное ХЬа1 место приводит к восстановлению как места EcoRI, так и места ХЬа1). Лигазную смесь используют дл  трансформации E.coll IM101. Из колоний выдел ют плазмиды, которые исследуют на присутствие гена водоGlu Leu Gin Val Ser Ser Gly Phe Val Cys Asn Thr Cys Pro Glu GAA TTG CAA GTT TCC TCT GGT TTC GTT TGT AAC ACT TGT CCA GAA CTT AAC GTT CAA AGG AGA CCA AAG CAA АСА TTG TGA 4 JA GGT CTT

Trp TG ACC TAG Sau3A

3

5

синтезируют два олигонуклеотида формулы

EBI-430:

5 ATGGAATTGCAAGTTTCCTCTGGTTTC ATG GAA TTG CAA GTT TCC TCT GGT TTC GTT TGT AAC ACT TGT CCA GAA AAG TG

EBI-437:

3 TACCTTAACGTTCAAAGGAGACCAAAG TAG CTT AAC GTT CAA AGG AGA CCA AAG CAA АСА TTG TGA АСА GGT CTT TTC .ACC TAG 5

Sau3A

растворимого фрагмента с использованием некоторых рестрикционных энзимов. Одну из плазмид отбирают и фрагмент Xho1- Xba1 подвергают анализу последовательностей с тем, чтобы подтвердить правильную св зь между ADHI-промотором и человеческим геном. Эту плазмиду обозначают как pRH244.

д) Получение плазмиды pRH 245, содержащей дрожжевой АОН1-промотор, доминантный ген дрожжевого фактора MFa , ген водорастворимого фрагмента Fc R и дрожжевой АОН1-терминатор.

Получение вектора.

Плазмиду pRH 243 подвергают перевариванию с помощью EcoR1 и Stu1. Больший фрагмент очищает электрофорезом в агаровом геле, электроэлюацией и осаждением.

Получение вставки.

Плазмиду pGEM4/FcЈ R/ подвергают двойному перевариванию с помощью EcoR1 и Hindlll с последующим дефосфорилирова- нием. Вставку гидролизируют рестриктазой SauSA и больший фрагмент выдел ют. С целью восстановлени  полной области, кодирующей растворимый фрагмент формулы

Met

5f ATG 3 ТАС

0

5

0

5

25 пмолей каждого олигодеоксинуклео- тида подвергают ренатурации и добавл ют к 3 мкг фрагмента Sau3A-EcoR1. Реакцию лигировани  провод т в растворе общего объема 20 мкл с использованием Т4-ДНК лигазы. Получаемую ДНК очищают путем электрофореза в агаровом геле, электро- элюации и осаждени .

1 мкл векторного фрагмента и 1 мкл фрагмента вставки лигируют. Лигазную смесь используют дл  трансформации E.coli IM101. Из некоторых колоний выдел ют плазмиды, которые исследуют на присутствие гена водорастворимого фрагмента FccR с использованием нескольких рестрикцио1н- ных энзимов. Одну из плазмид отбирают и фрагмент Cta1-Xba1 подвергают анализу последовательностей с тем,чтобы подтвердить правильную св зь между участком фактора MFa и геном водорастворимого фрагмента Fc.R. Эту плазмиду обозначают pRH 245.

е) Получение дрожжевых векторов.

Плазмиды pRH 244 и pRH 245 конструируют с использованием вектора из E.coli (Btuescribe), который облегчает анализ вставок . Обе плазмиды разрезают с помощью Hindlll и ВатН1 и лигируют в дрожжевой вектор pjDB207, содержащий 2ц начало репликации и leu 2 избирательный маркер.

Получение вектора.

Плазмиду plDB207 подвергают двойному перевариванию с помощью Hindlll и ВатН1, Большой фрагмент выдел ют путем электрофореза в агаровом геле, электро- элюации и осаждени .

Получение вставки.

Плазмид pRH 244 и pRH 245 подвергают двойному перевариванию с помощью Hindlll и ВатН1.

Вектор и вставки лигируют в растворе и трансформируют E.coli IM101. ДНК полученных колоний исследуют на правильность конструкции, Отбирают две плазмиды, одну из которых обозначают рЮВ-244 (содержащую экспрессионную

EBi-4%:

к

&/iACTGCAG I&AGGTCTSaTrrTGGril1GCAACACTlieCGC&GA,uiAAT& 3:

Ш-;1-97:

CITGAC&TGGAClUaAGAGGAAAGCAAAG&TTST&AACGGGGCTTTTTACGTASкоторые восстанавливают считывающий скелет, начина  с второго кодона (Gfu) гена растворимого фрагмента FcgR ренатурирукассету без доминантной последовательности MF а), а другую - как рЮВ-245 (содержащую экспрессионную кассету с доминантной последовательностью MFa).

Обе плазмиды выдел ют и используют дл  трансформации дрожжевого штамма WS21-3(a, Ien2, his3, игаЗ, рер4).

Стади  2. Получение плазмид 289а1 и 289ЬЗ.

Плазмиду YEpG переваривают рестриктазами Hindlll и BamHl. Линеаризованный вектор выдел ют электрофорезом в агаровом геле. По 1 мкг каждой плазмиды pRH244 и pRH245 переваривают с помощью Hindlll

и BamHl. Из рРН244 выдел ют фрагмент длиной 1650 п.о., а из pRH245 - фрагмент длиной 1900 п.о. 50 нг линеаризованногс вектора и 200 нг фрагментов лигируют и используют дл  трансформации E.coli

НВ101. Отбирают штаммы, устойчивые к ампициллину .

Плазмиды колоний исследуют на правильность конструкции при помощи ре- стрикционных энзимов. Получают две

плазмиды, которые обозначают 289а1 (из PRH244) и 289ЬЗ (из pRH245).

Пример12. Экспресси  растворимогс фрагмента в E.coli. Получение вектора.

Плазмиду pRH 100 (см, пример Б) переваривают с помощью Ssf1, 3 -концы удал ют ДНК полимеразой 1. Линеаризованную плазмиду дефосфорилируют. Получение вставки.

20 мкг pGEM4-FcgR, содержащего больший Hindlll-EcoR1 фрагмент дДНК дл  FccR подвергают двойному перевариванию с помощью EcoR1 и Hindlll. 5-концы затупл ют фрагментом Кленова ДНКполимеразы 1. 5 фосфатные группы удал ют с использованием фосфатаза кишечника теленка. После очистки в агаровом геле фрагмент, содержащий ген растворимого фрагмента , гид- ролизуют рестриктазой ЗаиЗА и больший

фрагмент выдел ют.

50 пмоль каждого олигонуклеотида

С 1

S&c/Jrf

ют и медленно охлаждают. Олигонуклеоти- ды и вставку ДНК лигируют с помощыс Т4-ДНК лигазы.

1 мкл линеаризованной векторной ДНК и 5 мкл ДНК вставки объедин ют и лигиру- ют. Половину материала используют дл  трансформации E.coli HB101 (Г, hsdS20 /rb-, mb/, rec A13, ara-14, proA2, -fecYI, gat K2, rpsL20 /Зм-устойчиво/, xyt-5, mtf-1, SupE44, л мбда минус). Плазмиды устойчивых к ампициллину колоний выдел ют и исследуют на правильность конструкции при помощи рестрикционных энзимов. Одну плазмиду отбирают и подвергают анализу соединени  между Trp-промотором и геном растворимого фрагмента FcЈR. После этого заключительного анализа плазмиду обозначают как pRH 246.

П р и м е р 13. Конструкци  плазмиды pSFcЈR-1.

а)350 мкг pbSF2-38, который содержит дДНК дл  BSF-2 в Sma1 вместе pGEM4, переваривают 700 единицами EcoR1 и ВатН 1 в 500 мкл буфера (100 мМ хлористого натри , 50 мМ трис-HCt, рН 7,5, 10 мМ хлорида магни , 1 мМ ДТТ) при температуре 37°С в течение 2 ч. Переваренную ДНК подвергают очистке путем электрофореза в 1 %- ном агаровом геле. Выдел ют EcoRI-BamHI-фрагмент, содержащий дДНК дл  BSF-2 длиной 1,2 т.п.о. 20 мкг этого фрагмента гидролизуют единицами Hinfl. Экстрагируют фенолом и осаждают этанолом. Фрагмент с тупым концом и длиной 127 п.о. экстрагируют фенолом, переваривают 40 единицами Kpnl, инкубируют 2,5 ед. бактериальной щелочной фосфатазы, после чего подвергают электрофорезу в агаровом геле (1%). Полученный фрагмент длиной 110 п.о., содержащий доминантную последовательность BSF-2, подвергают электро- элюации и осаждению этанолом. Фрагмент длиной 110 п.о. лигируют с переваренной Крп1 и Sma1 плазмидой pGEM4 и трансфи- цируют в E.coli (MC1065). Из полученных колоний отбирают клон, содержащий только одну доимнентную последовательность, его обозначают pBSF2-L8.

б)Плазмиды LE-392 или pGEM4 (pFc R-1) переваривают 150 единицами Н ind 111 и подвергают электрофорезу в агаровом геле (1%). Фрагмент Hindlll, содержащий растворимый участок FcЈ R, электроэлюируют из гел , осаждают этанолом и раствор ют. Фрагмент Hindlll инкубируют при 20°С в течение 30 мин в присутствии 8,2 ед. фрагмента Кленова и 1 мМ dNTP в среде 10 мкл 1 х буфера ник- трансл ции с тем, чтобы заполнить 3 -концы , экстрагируют фенолом и осаждают этанолом. Фрагменты Hindlll с заполненными З -концами гидролизуют рестриктазой

0

5

0

5

0

5

0

5

0

5

Psfl ифосфорируют. pBsF2-L8 гидролизуют рестриктазой ВатН1. экстрагируют фенолом и осаждают этанолом. Затем раствор ют , переваривают нуклеазой Pstl, экстрагируют фенолом и осаждают этанолом . Переваренный Pstl фрагмент, содержащий кодирующий FcЈ R растворимый участок, и переваренный Pstl фрагмент pBsF2-L8 лигируют и используют дл  транс- фекции E.coli (MC1065). Отбирают клон, обозначают psFc R-1. Размноженна  плаз- мида содержит семь оснований от многократного клонировани  в рСЕМ4 между доминантной последовательностью BSF- 2 и последовательностью Fc R.

П р и м е р 14. Экспресси  дДНК дл  Fc,R.

Плазмиду psFc4R-1, содержащую модифицированную дДНК дл  FcЈR, переваривают рестрикционным энзимом В тН1. мРНК синтезируют при помощи SH6 РНК полиме- разы с использованием в качестве матрицы линеаризованной плазмидной ДНК. Примерно 9 нг мРНК впрыскивают в ооциты Xenopus leavis, которые инкубируют при 20°С в модицированной среде Барта, содержащей 100 мкг/мл пенициллина и 1 мкг/м/ стрептомицина. После двухдневной инкубации надосадочную жидкость собирают и ооциты подвергают гомогенизации в среде буфера PBS, содержащего 1 мМ ФМСФ. Литазы PBS раздел ют путем центрифугировани  при 15000 об/мин в течение 10 мин. Центрифугат снова экстрагируют НП-40 со- любилизации св занного с мембраной рецептора (0,5% НП-40,0,1 М хлорида натри , 0,05 М трис-HOf, рН 7,5).

П р и м е р 15. Анализ FcЈR в ооцитах с использованием дрдецилсульфата натри  и полиакриламидного гел .

10 ооцитов, в которые была введена мРНК, инкубируют при температуре 20°С в течение 24 ч в 100 мкл модифицированной среды Барта, содержащей 150 микС 353-ме- тионина. Маркированные ооциты лизируют в 1 мл буфера лизиса (0,5% НП-40, 0,1 М хлорида натри , 0,05 М трис-HCf, рН 7,5) и центрифугируют при 15000 об/мин в течение 10 мин. Осветленные лизаты и надосадочную жидкость подвергают очистке на шариках сефарозы 4В со св занным мышиным иммуноглобулином, с последующей инкубацией в присутствии шариков сефарозы 4В, с которыми св зано антитело 3/5, с которым св зан иммуноглобулин G1. Инкубацию провод т во льду при частом встр хивании. Шарики промывают, продукты элюируют содержащим додецилсульфат натри  буфером путем кип чени  в течение

2 мин. Образцы подвергают анализу с использованием додецилсульфата натри  и полиакриламидного гел  (9%).

Пример 6. Определение .

Активность Fc R определ ют методом эним, дл  чего используют два различных моноклинальных анти-Fc R антитела (3-5; с иммуноглобулином 1; 8-30; с мышиным иммуноглобулином ), которые вступают в реакцию с двум  различными эпитопами на с последующим добавлением 100 мкл образцов , разбавленных буфером (0,05 М трис-HCf, рН 8,1, 1 мМ хлорида магни , 0,15 М хлорида натри , 0,05% твина, 20,1 % альбумина сыворотки крупного рогатого скота и 0,02% азида натри ). Пластинки инкубируют при комнатной температуре в течение 2 ч, промываютчетыре раза промывным буфером , после чего добавл ют 100 мл антитела 8-248, с которым св зана щелочна  фосфа- таза (0,75 мг/мл). После 4-часовой инкубации пластинки промывают 4 раза. Энзиматиче- скую реакцию инициируют добавлением п- нитрофенилфосфата в субстратном буфере.

Пример17. Определение св зывани  FcЈR с иммуноглобулином Е.

Плашеты, снабженные покрытием из антитела 3-5, инкубируют вместе с образцом в течение 2 ч, промывают, добавл ют человеческие моноклональные иммуноглобулины (PS миелома). После двухчасовой инкубации при комнатной температуре пластинки промывают и инкубируют со щелочной фос- фатазой, св занной с моноклональным античеловеческим иммуноглобулином, про вл ют добавлением n-нитрофенилфосфата в субстатном буфере.

Пример 18. Образование розетки иммуноглобулина Е.

Fc, R на лимфоцитах определ ют путем анализа с использованием зафиксированных от RBC, снабженных покрытием из человеческого иммуноглобулина. Число розеток образующих клеток определ ют после вычета числа неспецифического св зывани  с зафиксированными ox RBC, покрытыми альбумином сыворотки крупного рогатого скота. С целью торможени  розетки иммуноглобулина Е 25 мкл несущих клеток (5хЮ°/мл) смешивают со специфическим объемом (например, 100 мкл) исследуемого образца или контрольной среды и инкубатируют при 4°Стечение 1 ч. Вычисл ют число розеток с 3 или больше зафиксиро- ванными ox RBC. В первом и третьем опытах в качестве несущих клеток используют клетки RPM1-8866, а во втором опыте - клетки SKW6-C4. В качестве контрольной среды используют надосадочную

жидкость контрольных ооцитов, т.е. нетрансформированных ооцитов.

Анализ с использованием додецилсульфата натри  и полиакриламидного гел  (а) 5 показывает, что продукт psFcЈR-1 из ооцитов , который распознаетс  обоими антителами 3-5 и 8-30 и имеет св зывающую иммуноглобулин активность с получением широких протеиновых полос и продукт IQ pANFc -R-1 из ооцитов, который не имеет N-концевого трансмембранного участка и может распознаватьс  антителом 3-5, но не антителом 8-30 (б) и который не про вл ет св зывающей иммуноглобулин Е активно- чс сти. Эти результаты свидетельствуют о том, что продукт р Д , который не имеет сигнальной последовательности, не перерабатываетс  нужным образом и что подход ща  обработка, как в клоне psFcg R-1,

2Q создает эпитоп, который распознаетс  антителом 8-30 и имеет св зывающую иммуноглобулин активность.

Экспрессию водорастворимой части рецептора Fc-R провод т путем культивирова25 ни  соответствующего штамма E.coli, дрожжей или клеток другого организма в общеприн тых услови х с последующим концентрированием и очисткой полученного водорастворимого фрагмента.

оДрожжевой штамм WS21-1, трансформированный плазмидой 289ЬЗ (WS21- 1 /289е), культивируют в течение 40 ч в среде УН К8 до оптической плотности (546 нм), равной примерно 45 (вес сухих клеток 13 г/л).

5После отделени  клеток путем центрифугировани  выход FcЈ R составл ет 2,5 ед/мл FcЈ R (1 ед/мл Fcf R соответствует активности надосадочной жидкости, равной 1х105 клеток RPMI/мл).

0

Ф о р м у л а и з о б р е т е н и  

Способ получени  водорастворимой части человеческого рецептора малого сродства Fc,, заключающийс  в том, что выдел с- ют водорастворимую часть св зывающего иммуноглобулин Е-фактора FctR из лимфоб- ластоидных клеток RPM1 8866, очищают ее хроматографией, подвергают гидролизу, затем выдел ют фрагменты, определ ют в них

Q аминокислотную последовательность, на основании которой синтезируют олигонукТ А А

леотид 3 -ТТсТАСС ТА G TT G AA GT-5 ,

A G &

параллельно из клеток RPM1-8866 выдел - 5 ют поли(А)+-РН К, синтезируют дДНК длиной более 1000 Ьр, которую клонируют в EcoR1 сайт-ламбда gt10, далее осуществл ют гибридизацию дДНК Fc,rR+L с синтезированным олигонуклеотидом, отбирают вставку

45

дДН К длиной 1600kb, которую клонируют в EcoR1 сайт-плазмиды LE392 или pGEM4, гидролизуют полученную ДНУ эндонуклеа- зой Pstlll, полученный фрагмент длиной 1,0 kb заполн ют фрагментом Кленова ДНК- полимеразы, далее ДНК переваривают Pst1, полученный фрагмент клонируют в вектор pBSF2-L8, обработанный эндонукле- азами ВатН1 и Psf1, получают экспресси- онную плазмиду psFc R-1 дл  FcЈ R, одновременно Hindlll-EcoR1 фрагмент вставки из плазмиды LE392 клонируют в вектор pGEM4, получают рСЕМА4-Рс Р, которую обрабатывают EcoRI и Hindlll эндо- нуклеазами, 5 -выступающие концы затупл ют с помощью фрагмента Кленова ДНК-полимеразы 1 и четырех деоксинукле- озидтрифосфатов, 5-фосфатные группы удал ют, полученный фрагмент после очистки обрабатывают ЗаиЗА, больший фрагмент лигируют с олигодезоксинуклеотидами

72753346

ЕВ1496 и ЕВТ497 с помощью Т4-ДНК-лига- зы, далее ДНК лигируют с линеаризованной векторной ДНК, которую получают путем обработки плазмиды pRH 100 эндонуклеа5 зой Sstl, удалени  3 -выступающих концов и дефосфорилировани , и получают плазмиду pRH246 или одновременно дрожжевую плазмиду YEp13 гидролизуют Hindlll и BamHI рестриктазами и линеаризованный

10 вектор лигируют с Hlndlll-BamHI фрагментом длиной 1900 Ьр плазмиды pRH245 с помощью Т4-ДНК-лигазы, получают экс- прессионную плазмиду 289ЬЗ, ранее полученными плазмидами pRH246 и psFc R-1

15 трансформируют бактерии E.cofi НВ101, а экспрессионной плазмидой 289ЬЗ - дрожжевой штамм WS21-1, культивируют трансформированные штаммы с последующим выделением и очисткой целевого продукта с

20 помощью хроматографических методов.

Claims (1)

1. Формула изобретения

   Способ получения водорастворимой части человеческого рецептора малого сродства Fc₆, заключающийся в том, что выделяют водорастворимую часть связывающего иммуноглобулин Е-фактора Fc_tR из лимфобластоидных клеток RPM1 8866, очищают ее хроматографией, подвергают гидролизу, затем выделяют фрагменты, определяют в них аминокислотную последовательность, на основании которой синтезируют олигонукТ а А леотид 3‘-ТТс^ТАСС ТА G ТТ G АА GT-5‘,

   A G G параллельно из клеток RPM1-8866 выделяют поли(А)⁺-РН К, синтезируют дДНК длиной более 1000 Ьр, которую клонируют в EcoR1 сайт-ламбда gt10, далее осуществляют гибридизацию дДНК Fc,-R⁺L с синтезированным олигонуклеотидом, отбирают вставку дДНК длиной 1600 kb, которую клонируют в EcoR1 сайт-плазмиды LE392 или pGEM4, гидролизуют полученную ДНУ эндонуклеазой Pstlll, полученный фрагмент длиной 1,0 kb заполняют фрагментом Кленова ДНКполимеразы, далее ДНК переваривают Pstl, полученный фрагмент клонируют в вектор pBSF2-L8, обработанный эндонуклеазами ВатН1 и Psf 1, получают экспрессионную плазмиду psFc^ R-1 для Fc_£ R, одновременно Н ind 111-EcoR 1 фрагмент вставки из плазмиды LE392 клонируют в вектор pGEM4, получают pGEMA4-Fc.R, которую обрабатывают EcoRI и Hindlll эндонуклеазами, 5 -выступающие концы затупляют с помощью фрагмента Кленова ДНК-полимеразы 1 и четырех деоксинуклеозидтрифосфатов, 5-фосфатные группы удаляют, полученный фрагмент после очистки обрабатывают Sau3A, больший фрагмент лигируют с олигодезоксинуклеотидами

   ЕВ 1496 и ЕВ 1497 с помощью Т4-ДНК-лигазы, далее ДНК лигируют с линеаризованной векторной ДНК, которую получают путем обработки плазмиды pRH 100 эндонуклеа5 зой Sstl, удаления 31-выступающих концов и дефосфорилирования, и получают плазмиду pRH246 или одновременно дрожжевую плазмиду YEp13 гидролизуют Hindlll и BamHI рестриктазами и линеаризованный 10 вектор лигируют с HlndllbBamHI фрагментом длиной 1900 Ьр плазмиды pRH245 с помощью Т4-ДНК-лигазы, получают экспрессионную плазмиду 289ЬЗ, ранее полученными плазмидами pRH246 и psFc^ R-1 трансформируют бактерии E.coft НВ 101, а экспрессионной плазмидой 289ЬЗ - дрожжевой штамм WS21-1, культивируют трансформированные штаммы с последующим выделением и очисткой целевого продукта с 20 помощью хроматографических методов.

   Редактор М. Циткина Составитель Т. Забойкина Техред М.Моргентал Корректор М. Демчик

   Заказ 1284 Тираж Подписное

   ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035* Москва, Ж-35, Раушская наб,, 4/5

   Производственно-издательский комбинат Патент, г, Ужгород. ул.Гагарина, 101