DD263538C4 - Verfahren zur herstellung eines human fc tief-rezeptors - Google Patents

Description

ein nach Anspruch 17 hergestellter Fc_£-Rezeptor einor Trypsin- oder Lysylendopeptidasebehandlung unterzogen wird und anschließend mittels HPLC getrennt wird.

20. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß zur Herstellung der DNA-Sequenz das Oligonucleotid der Formel

3'-TT\[ ACC TAG TT^ AA^ GT-5' C _A G G

* durch Zugabe der entsprechenden Nucleotide mittels eines Oligosynthesizers synthetisiert wird. Hierzu 26 Seiten Zeichnungen.

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Human-Fc_t-Rezeptors mit niedriger Affinität, dessen Isolierung, Rekombinantenherstellung und Reinigung.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Rezeptoren für den Fc-Teil von Immunoglobulinen (FcR) werden durch verschiedene Blutbildungszell-Abstammunger. exprimiert und bilden eine wichtige Verbindung zwischen Antikörpermolekülen und ihren Effektorfunktionen, wie beispielsweise Internalisierung der Ligand-Rezeptor-Komplexe, die durch Antikörper bewirkte Zytolyse von Target-Zellen und die Freisetzung von Entzündungsüberträgern. Die Expression von Fc-Rezeptoren wurde auch auf T- und B-Lymphozyten demonstriert, was auf eine mögliche Rolle von FcR sowohl bei der Regulierung der Immunreaktion als auch auf eine Beteiligung von Immunglobulin-(Ig)-bindenden Faktoren, wie beispielsweise IgE-, IgA- und IgG-bindenden Faktoren in der isotypspezifischen Regulierung der Antikörperreaktion schließen läßt.

Gegenwärtig sind weder die Fc-Rezeptoren noch die für die Fc-Rezeptoren kodierenden Gene isoliert, wenn auch zwei Arten Fc-Rezeptoren für IgE (Fc_cR) bekannt sind, die sich in ihrer Struktur und ihrer Funktion unterscheiden, und zwar

a) Fc_E-Re:.epütoren mit hoher Affinität auf Basophilen und Mastzellen und

b) Fcc-Rezeptoren mit niedriger Affinität auf Lymphozyten und Monozyten.

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist es, exprimierte Polypeptide für die Behandlung von iokalen und systemischen IgE-Allergiereaktionen als Wirkstoff für den Einsatz in pharmazeutischen Zusammensetzungen auf ökonomische Weise zu erhalten.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung eines Human-Fc_c-Rezeptor mit niedriger Affinitat, dessen wasserlöslichen Teils, der mit Aminosäuren von etwa 50 bis etwa 150 des ganzen Fc_c-Rezeptors beginnt, vorzugsweise mit dem N-Terminal Met-Giu-Leu-Gln-Val-Ser-Ser-Gly-Phe-Val-, sowie dessen glycosylierte Derivate, deren Isolierung und Reinigung.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe durch die Schritte

a) Isolierung und Reinigung des wasserlöslichen Teils des durch lymphoblastenartige Zellen sekretierten oder ausgeschütteten IgE-btndenden Faktors (Fc_tR);

b) partielle Sequenzierung des wasserlöslichen Teils von Human-FCc-Rezeptor mit niedriger Affinität, der durch Hydrolyse isoliert wurde, wobei die so gewonnenen Fragmente isoliert und die Sequenzen der so gewonnenen Fragmente bestimmt werden;

c) Herstellung von zwei Hybridisierungssonden, und zwar

Sonde 1 für die Herstellung von Fc/L-zellentransformantspezifischer cDNA durch mehrf jche zyklische Substraktion mit Ltk" Zell-mRNA;

und Sonde 2 für die Herstellung eines Oligonucleotids, das für eine der isolierten partiellen Sequenzen codiert, vorzugsweise eines Gemisches von Oligonucleotiden der folgenden Formel

3'-TT^ ACC TAG TT^ AA^ GT-5' C _A G G

das für die Aminosäuresequenz der Formel

Lys-Trp-Ile-Asn-Phe-Gln codiert;

d) Isolierung und identifizierung von Expressionsvehikeln, die die Gencodierung für Human-Fc_c-Rezeptor mit niedriger Affinität enthalten, durch die folgenden Schritte

— Synthetisierung von cDNA aus einer RNA-Matrix, die von Fc_t-Rezeptor-mRNA erzeugenden lymphoblastenartigen Zellen stammt,

— Inkorporation dieser synthetisierten cDNA in Expressionsvehikel zur Bildung einer Expressionsvehikelbank,

— Hybridisierung dieser inkorporierten cDNA zur Identifizierung derjenigen Expressionsvehikel, die ein für Fc_c-Rezeptor codierendes Gen tragen, mit zwei markierten Sonden, die für Fc_cR* L-Zellen spezifische cDNA und ein für das Gen des FCfRezeptors mit niedriger Affinität aligemeines Oligonucleotid enthalten, und

— Replikation des so gewonnenen Fc_c-Rezeptorgans;

e) Expression von Fc_cR-cDNA;

f) Bestimmung des für Human-Fc_c-Rezeptor mit niedriger Affinität codierenden Gens mit Hilfe der isolierten cDNA-Sequenz, die gewonnen wurde aus den Vehikeln aus Verfalirensschritt e) gemäß den Sequenzierungsverfahren nach Sanger u. a. und dem chemischen Spaltungsverfahren nach Maxam und Gilbe^rt;

g) Expression von Fc_tR-mRNA; und

h) Herstellung eines Expressionsvektors, der die für ein wasserlösliches Fragment des Fc_c-Rezeptors codierenden DNA-Sequenzen enthält, deren O-glycosylierten Derivate und die Expression eines löslichen Fragmentes in Mikroorganismen oder in Säugetierzellen.

Die einzelnen Stufen sollen nachfolgend näher erläutert werden.

a) Isolilerung und Reinigung des wasserlöslichen Teils von Fc_cR

Human-B-Iymphoblastenartige Zellen, wie zum Beispiel RPMI-8866-Zellen, sekretieren Fc_cR von etwa 46kd auf ihrer Oberfläche und setzen eine Spezies von etwa 25kd in den Kulturüberstand frei. Es wurde festgestellt, daß die Fc_tR-Aktivität, die durch lymphoblastenartige Zellen, z. B. RPMI-8866-Zellen, sekretiert oder ausgeschüttet wird und die durch die EUSA-Methode (Fig. 1) mit Hilfe von zwei verschiedenen monoclonalen Antikörpern (siehe EP-A Nr.86110420.6 des gleichen Patentanmelders, eingereicht am 29. Juli 1986) nachgewiesen wurde, im Vergleich zu NP-40-Detergens-solubilisierten Membranrezeptoren im konzentrierten Kulturüberstand höher war, obwohl eine gleiche Anzahl, z.B. 10⁵ Zellen/ml zur Herstellung von Fc_ER verwendet wurde. Wenn weiterhin affinitätsgereinigte Überstände auf SDS-PAGE unter nichtreduzierenden Bedingungen chromatographiert wurden und Fc_cR-Aktivität aus Teilen des Gels, das der definierten Molekülmasse entsprach, eluiert wurde, wurde Aktivität in den Bereichen 45-46kd und 24-2bkd beobachtet (Fig. 2). Tatsächlich enthielten die konzentrierten Kulturüberstände einen höheren Anteil an Aktivität im Bereich von 25kd. Daher wurden serumfreie Kulturüberstänae als Rezeptorquelle eingesetzt.

Für die sequentielle Immunoaffinitätsreinigung von Fc_cR mit einer Molekülmasse von etwa 25kd wurden Immunoaffinitätssäulen verwendet, die nach der Beschreibung des Herstellers aus 10mg/ml gereinigtem monoclonaler Antikörper, der mit Sepharose-4B-Perlen (Pharmacia, Piscataway, New York) gekoppelt war, hergestellt wurden. Die sequentielle Adsoiption von 200-250fach konzentriertem Kulturüberstand auf BSA-Sepharose, Transferrin-Sepharose und normaler-Maus-lgG-Sepharose ergab etwa 70% der ursprünglichen Aktivität, ohne jedoch die spezifische Aktivität zu verbessern. Wie in Tabelle 1 dargestellt, Me" man das Rezeptormaterial nach der Präadsorption 4-16 Stunden an die 3-5-Sepharose-Säule binden, die Gesamtaktivität des Essigsäureeluats wurde reduziert, die spezifische Aktivität wurde jedoch auf 83 Einheiten,^ und die Reinheit 190fach erhöht. Die weitere Reinigung des Rezeptors durch HPLC-Umkehrphasenchromatographie auf C-4-Säule mittels eines linearen Gradienten von 0-65% Acetonitril und 0,1 % Trifluoressigsäure erhöhte die spezifische Aktivität auf 1630 Einheiten/^ig und der Rezeptor wurde 3710fach gereinigt. Die Endgewinnung betrug jedoch nur 33% des Originals. Wie aus Tabelle 1 ersieh Ii Jh wird, wurde ein ähnliches Reinigungsschema für Detergens-solubilisiertes Membran-Fc_cR angewandt, aber die gewonnene spezifische Aktivität war beträchtlich niedrigei als die bei den Kulturüberständen beobachtete. Es ist wichtig anzumerken, daß die Wahl des Elutionspuffers für den Grad der Gewinnung eine Rolle spielte, 2,5% Essigsäureelution bei schneller Neutralisierung waren für die Endausbeute des Rezeptors wichtig.

Wie aus Tabelle 1 hervorgeht, reichte die Imrr.unoaffinitätsreinigung von Fc_cR mittels spezifischer monoclonaler Antikörper in der Festphase nicht aus, einen reinen Rezeptor zu gewinnen, wie durch eine einzelne Bande auf SDS-PAGE gemessen wurde. Deshalb wurde frisch eluierter Fc_cR durch HPLC-Umkehrphasenreinigung weiter gereinigt. Der frische, eluierte Fc_cR wurde präparativ auf eine C-4-Säule gegeben und mittels eines linearen Gradienten von 0-65% Acetonitril chromatograph^:ert; das Chromatographieprofil wird in Fig. 3 gezeigt; die zu verschiedenen Retentionszeiten gewonnenen Fraktionen wurden durch ELISA auf Fc_cR-Aktivität geprüft. Es wurde festgestellt, daß der Großteil des Fc_cR durch Acetonitril bei einer Konzentration zwischen 44 und 45% eluiert wurde. AIsO₁SmI Proben gesammelt wurden, entsprach die Fc_cR-Aktivität dem in Fig. 3 gezeigten schraffierten Peak. Die Re-Chromatographieanalyse der aktiven Fraktion zeigte einen einzelnen schraffen Peak, der auf die Anwesenheit eines homogenen Rezeptorgemischs hinweis. Die bei verschiedenen Retentionszeiten gewonnenen Fraktionen wurden auch durch SDS-PAGE-Analyse überwacht.

Deshalb wurde der konzentrierte Kulturüberstand (Roh-Überstand), der den vermutlichen Fc₁R unri das aus der Immunoaffinität und C-4-HPLC-Säule eluierte Material enthielt, nach Dialyse und Lyophilisierung auf einer 10%igerι SDS-PAGE wie im folgenden beschrieben getestet. Die Ergebnisse zeigen die Gegenwart von Mehrfachbanden im Streifen des rohen, konzentrierten Überstandes. Es ist eine 22-24kd entsprechende Breitbande zu sehen.

Die nach der sequentiellen Reinigung auf nicht-spezifischen und spezifischen Immunoaffinitätsgelen gesammelte Rezeptorkomponente zeigt immer noch Melirfachbanden, auch wenn die Aktivität dieser Eluate wesentlich höher ist als die des Rohmaterials. Die nach C-4-HPLC-Reinigung erhaltene Fc_cR-Aktivität (Fig.4) zeigt eine 25kd entsprechende einzelne Bande und das auf diese Weise gereinigte Material wies beim ELISA-Verfahren unter Verwendung von Monoclonalon Antikörpern eine sehr hohe Aktivität auf. Es ist wichtig anzumerken, daß die Bande von 25kd der kleineren Spezies von FccR entspricht, die nach Oberflächenjodierung und Immunopräzipitation von Fc_tR unter Verwendung der gleichen Antikörper nachgewiesen wurde, was darauf schließen läßt, daß die 46- und 25-kd-Komponenten Antigen-identisch sind und das letztere der wasserlösliche Teil von Fc_cR ist

Da die Reinigung der IgE-Bindungsaktivitäl aus RPMI-8866-Zellkulluiüberständen viele Stufen erfordert, mußtp τ·"" r*ic immunologische Aktivität des vermutlichen Fc_cR auf den verschiedenen Reinigungsstufen überprüfen. Gleiche Mengen HPLC-gereinigter Fc_cR wurden erneut auf spezifische 3-5-lmmunoaffinitäts- und nicht-spezifische NMIg-Sepharosegele aufgetragen und die Aktivität wurde im Ablauf und im Eluat dieser Gele überwacht. Die in Tabelle 2 gezeigten Ergebnisse weisen darauf hin, daß das gereinigte Material im Vergleich zum nicht-spezifischen Gel, in dem dia verfügbare Aktivität im Ablauf und ein kleiner Anteil im Eluat festgestellt wurde, offensichtlich eine Bindung zu der spezifischen Säule aufweist und fast die gesamte Aktivität im Eluat gewonnen wird.

Es wird auch deutlich, daß ein guter Teil der Aktivität lose an das nicht-spezifische Gel ""Kunden ist und während des Waschvorgangs verlorengeht.

b) Partielle Sequenzierung des wasserlöslichen Teiles von Fc_cK

Fc_cR, der nach der sequentiellen Reinigung von konzentriertem Zellkulturüberstand urne: 'Λ·. vendung von Immunoaffinitätsgelen und C-4-HPLC hergestellt wurde, einnr einzelnen Bande auf SDS-PAGE entsprach und im ELISA-Verfahren aktiv war, wurde eine Aminosäuresequenzierung unterzogen. Mit Hilfe von Trypsin und Lysylendopeptidase wurden zwei verschiedene proteolytische Präparate hergestellt. Insgesamt wurden mit Trypsin- und Lysylendopeptidasebehandlung 11 bzw. 12 Fragmente gewonnen. Das in Fig. 5 gezeigte HPLC-Profil der Lysylendopeptidasefragmentierung weist 12 Hauptpedks auf, die den definierten Fragmenten von Fc_cR entsprechen. Es wurden die folgenden selektierten Fragmente gewonnen: Met-Glu-Leu-Gln-Val-Ser-Ser-Gly-Phe-Val-(N-Terminal),

Gly-Glu-Phe-Ile-Trp-Val-Asp-Gly-Ser-His-Val-Asp-Tyr-Ser-Asn-Trp-Ala-P'o-Gly-Glu-Pro-Thr-, Lys-His-Ala-Ser-His-Thr-Gly-Ser-irp-lle-Gly-Lou-Arg-Asn-Leu-Asp-Leu-Lys-und Lys-Trp-ile-Asn-Phe-Gln-.

c) Herstellung von zwei Hybridisierungssonden Sonde I (CDNA-spezifisch für Fc_cR-positive L-Zellen):

L-Zellen, denen Thymidinkinase (Tk) fehlte, Ltk~-Zellen, wurden mit DNA mit hoher relativer Molekülmasse aus RPMI-8866-Zellen und mit dem von Herpes simplex virus stammendem Tk-Gen co-transfiziert. Nach HAT-Selektion wurden die Tk-positiven Transformanten mit biotinisiertem Anti-Fc_tR-Antikörper (8-30) und FITC-Avidin gefärbt und durch ein Zellsortiergerät sortiert. Fc_cR-positive-L-Zellen wurden durch mehrere Sorucrzyklen angeraichen.. Zwei L-Zellentransformierte Linien, L-V-8-30 und L-VI-8-30, die Fc_cR exprimieren, was durch Anti-Fc_cR (8-30) nachgewiesen wird, wurden aus zwei unabhängigen Transfektionsexperimenten errichtet. Fig. 6 zeigt die FACS-Analyse dieser beiden transformierten Linien, die sowohl mit Anti-Fc_tR als auch mit Human-lgE gefärbt wurden. Die gesamte RNA wurde durch das Guanidin-Isothiocyanat-Caesium-Chlorid-Verfahren (siehe Biochemistry 18,5294 [1979]) aus L-V-8-30-Zellen hergestellt. Die zu mRNA aus L-V-8-30-Zellen komplementäre DNA wurde unter Anwendung der Enzym-reversen Transkriptase auf einem oligo (dt) Starter synthetisiert, die cDNA wurde durch Inkorporation von a-³²P-Desoxy-CTP in diese Reaktion markiert. Die mit ³²P markierte cDNA wurde gemischt und hybridisiert mit lOfachem Überschuß von poly(A)" RNA, die aus Ltk -Zellen stammte. Dieses Gemisch wurde auf eine Hydroxyapatitsäule aufgetragen und die ungebundene Einzelstrang-cDNA wurde mit poly(A)' RNA aus Ltk -Zellen rehybridisert. Die Einzelstrang-cDNA, die zum Fc_cR-positiven L-Zellentransformanten spezifisch ist, wurde als Sonde für den Nachweis des Gens für Fc_tR in AgMO-Bibliothek (Fig.7) benutzt

Sonde II: Ein Gemisch von Oiigonucleotiden der folgenden Formel:

3'-ΤχΙ ACC TAG TT^ AA^ GT-5' C _A G G

wurde mit Hilfe eines ADI-Synthesizers auf dem 0,2-MMol-Niveau nach bekannten Methoden synthetisiert. Das gewonnene Oligonucleotid, das partiell für die Aminosäuresequenz der folgenden Formel codiert Lys-T.p-Ile-Asn-Phe-Gln,

wurde als markierte Sonde für den Nachweis des Gens für den Fc_t-Rezeptor in einem Expressionsvehikel benutzt.

d) Isolierung und Identifizierung von Expressionsvehikeln, die die Gencodierung für HumanFc_LR mit niedriger Affinität enthalten

Die exponential wachsenden RPMI-8866-Zellen wurden in Guanidin-Isothiocyanat-Lösung zerrissen. Die mRNA wird durch Zentrifugieren auf einem Caesium-Chlorid-Gradienten, Phenolextraktion und Ethanolpräzipitation isoliert. Anschließend wird poly(A)' RNA durch oligo-(dt)-Zellulose-Chromatographie isoliert.

Die Konstruktion der Doppelstrang-cDNA erfolgt nach Gubler und Hoffman (Gene 25,263 [1983]). Die poly(A)'RNA wird als Matrix für die Herstellung einer Einzelstrang-cDNA mittels reverser Transkriptase und eines oligo-(dt)-Starters eingesetzt. Nach der Behandlung mit RNase H wird der zweite Strang der DNA mittels DNA-Polymerase I synthetisiert. Die Synthese des ersten und zweiten Stranges der DNA erfolgte in einer Lösung, die ein Gemisch aus Desoxynucleotidtriphosphat von Adenosin, Thymidin, Guanosin und Cytidin enthielt. Das gewonnene Doppelstrang-cDNA-Gemisch wurde anschließend mittels des Enzyms T4-DNA-Polymerase modifiziert, um jegliche geringen restlichen 3'-überstehenden Enden aus dem ersten Strang der cDNA zu entfernen. Die EcoRI-Linker wurden dazugegeben und mittels Enzym-T4-Ligase an die Doppelstrang-cDNA ligiert. cDNA, die länger als 1000bp war, wurde fraktioniert und die überschüssigen Linker wurde durch eine Säulen-Chromatographie mit Bio-Gel A-GOm entfernt. Die Größen-fraktionierte cDNA wurde an EcoRi-digerierte Xgt-10-Phagenvektor-DNA ligiert. Die die cDNA enthaltenden Xcjt-10-Vektoren wurden in vitro verpackt und ein Stamm Escherichia coli 0600hfl wurde damit infiziert. Unter den auf diese Weise gewonnenen Plaques wurden diejenigen, die für Fc_ch spezifische Sequenzen enthielten, durch Koloniehybridisierung identifiziert, wobei zwei verschiedene Sonden eingesetzt wurden:

1. Fc_£R '-Transformanten-spezifische cDNA.

2. Radioaktiv markierte synthetische Oligonucleotide der folgenden Formel

3'-Tt"[ ACC TAG TT^ AA^ GT-5' C _A G G

2? von etwa 300000 Clonen, die mit beiden Sonden hybridisierten, wurden identifiziert und alle cDNA-lnserts miteinander hybridisiert. Von den cDNA's dieser Clone wurde das größere cDNA-lnsert (etwa 1600 kb) ausgewählt. Das EcoRI-lnsert aus dem Ayt- 10-Rekombinanten-DNA-Clon wurde durch „nick"-Translation mittels a-³²P-dCTP markiert und durch Northern-Hybrisierung mit mRNA aus verschiedenen Zellen, einschließlich RPMI-866, Daudi, CEM, Fc_ER* L-Zellen und Ltk -Zellen analysiert. Das Insert hybridisierte nur mit mRNA aus Fc_tR-positiven Zellen wie beispielsweise RPMI-8866-Zellon und Fc_cR* L-Zellen. Dieses Insert wurae in eine EcoRI-Stelle von pGEM4-Vektor (Promega Biotec) geclont, als pFc_cR-1 bezeichnet und vermehrt.

e) Expression der FccR-cDNA:

Das die Fc_tR-cDNA enthaltende EcoRI-lnsert, das aus dem oben beschriebenen \gt-10-Clon isoliert wurde, wurde an EcoRidigerierten pGEM™4 Plasmid-Vektor (siehe Fig.9) ligiert, der als LE 392 bezeichnet und in E. coli am 1. August 1986 unter der Nummer FERM BP-1116 (Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Japan) deponiert wurde. Da dieser Vektor sowohl SP6· als auch T7-Promotoren in entgegengesetzter Ausrichtung zueinander enthält, läßt sich Fc_cR-cDNA entweder durch SP6- oder T7-RNA-Polymerase leicht in mRNA transkribieren.

Deshalb wurde die die pFc_cR-cDNA enthaltende pGEM4-DNA mit BamHI digeriert und die gewonnene Plasmid-DNA wurde als Matrize zur Synthetisierung der mRNA durch SP6-RNA-Polymerase verwendet und die erhaltene RNA (5pg) wurde in Xenopus-Oozyten injiziert. Nach einer zweitätigen Inkubationszeit wurden die Oozyten lysiert und das Vorhandensein von pFc_cR wurde durch einen enzymgebundenen Immunoadsorptionsassay (ELISA) unter Verwendung von zwei Anti-Fc_tR-Antikörpern, und zwar 3-5 und 8-30, die verschiedene Epitopen auf Fc_cR erkennen, nachgewiesen. Wie in Fig.9 gezeigt wird, wies das Lysat von 10 Oozyten, denen das RNA-Transkript von Fc_ER-1 injiziert worden war, Fc_tR-Werte auf, die mit denen von 1 χ 10⁵ RPMI-8866-Zellen stammenden Werten vergleichbar waren. Andererseits wies das Lysat von Oozyten, die scheininjiziert waren, keine Aktivität aut. Dieses Ergebnis deutet darauf hin, daß das Produkt von Fc_cR-1-cDNA die beiden verschiedenen Antigen-Determinanten mit Fc_cR, die durch die monoclonalen Antikörper erkannt werden, teilt.

Es wurde ein weiterer Expressionsvektor, zum Beispiel pDE 2 (siehe JA-Patentveröffentlichung 1986/88879 vom 7. Mai 1986) verwendet, der zwei frühe Promotoren SV40 in entgegengesetzter Richtung zueinander zur Gewährleistung der cDNA-Expression in jeder Ausrichtung (Fig.8) enthält, um zu bestätigen, daß pFc_tR-1 die gesamte Codierungssequenz von Fc_cR einschließt. Das DNA-Segment zwischen den beiden frühen Promotoren SV40 wurde durch EcoRI-Digeslion entfernt und durch die Insert-cDNA von pFc_cR-1 (pDE2-Fc_ER-1) ersetzt. Cos7-Zellen wurden durch die DEAE-Dextran-Methode mit 2 ug/ml Fc_tR-cDNA enthaltendem pDE 2 transfiziert. Nach zweitägiger Kultur wurden die Zellen zweifach gefärbt mit Anti-Fc_cR und Human-lgE und aut einem Doppel-Laser-FACS analysiert. Wie in Fig.8 gezeigt wird, waren etwa 30% der mit pDE2-Fc_cR-1 transfizierten Zellen sowohl durch Anti-Fc_£R als auch durch Human-lgE markiert. Außerdem stand die Färbung mit Anti-Fc_cR und Human-lgE in guter Wechselbeziehung, was beweist, daß sowohl Anti-Fc_ER als auch IgE an das (die) gleiche(n) MoleküKe), das (die) auf der Oberfläche der transfizierten Zellen neu exprimiert wurde(n), gebunden waren. Tatsächlich färbten sich Zellen, die mit IFN-ßcDN A enthaltendem Kontrollvektor pDE 2 transfiziert worden waren, weder bei Anti-Fc_tR noch bei Human-lgE. Diese Ergebnisse bestätigen, daß die isolierte cDNA tatsächlich für das Fc_cR-Molekül codiert.

f) Bestimmung der vollständigen Nucleotidsequenz der Fc_tR-cDNA und der abgeleiteten Proteinsequenz

Die vollständige Nucleotidsequenz des EcoRI-lnserts aus Fc_cR-1 wurde mittels der Didesoxy-Terminierungsmethode (siehe Sanger u.a. in Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74,5463-5467 [1977]) und der chemischen Spaltungsmethode (siehe Maxam und Gilbert in Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74, 560-564 [1977]) bestimmt. Die vollständige Nucleotidsequenz und die abgeleitete Aminosäuresequenz werden in Tabelle 3 gezeigt, wobei die Codierungssequenz die folgende formel hat:

GIu

GIu

GIy

5

Tyr

Ser

GIu

He

10

GIu

Leu

Pro

Arg

15

Met

GAG

GAA

GGT

GIn

TAT

TCA

GAG

ATC

GIu

GAG

CTT

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CCA

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CTC

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GAG

CTC

GAA

GGG

TCC

AGG

TAC

GTT

CTC

TCC

Cys

Cys

Arg

20

GIy

Thr

GIn

Ue

25

Leu

Leu

GIy

Leu

30

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TGT

TGC

AGG

Arg

GGG

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ATC

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CTG

CTG

GGG

CTG

VaI

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CGT

CCC

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GTC

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GTG

GAC

GAC

CCC

GAC

GTG

GCC

GCA

CAC

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AIa

AIa

Leu

35

AIa

GIy

Leu

Leu

40

Leu

Lou

Leu

-8- 263

538

GCC

GCT

CTG

Trp

GCT

GGG

CTG

CTG

Thr

CTG

CTT

CTC

45

Thr

CGG

CGA

GAC

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CGA

CCC

GAC

GAC

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GAC

GAA

GAG

Leu

Trp

ACC

ACC

TGA

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Trp

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GIn

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Leu

Lys

55

Leu

GIu

GIu

GAC

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GAC

ACC

Thr

CAG

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ACC

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TTT

CAG

GAC

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GCT

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Arg

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VaI

65

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VaI

Ser

Lys

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GIu

Ser

TCC

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CGG

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GTC

Ser

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GTT

TCC

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TTG

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AAC

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TCG

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His

GCC

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CAC

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GIn

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GIn

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He

GTG

GTG

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CAG

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Gin

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Leu

GIu

GIu

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GIu

GIn

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Arg

Leu

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GAA

Leu

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TTG

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CTT

CTT

GCT

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CTT

GTC

CAG

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Ser

Gin

GAA

GAA

GTC

TCT

CAG

CTT •

Leu

GIu

Leu

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Asn

Leu

Asn

115

Leu

Gin

AIa

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TTG

GAG

CTG

Ser

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CTG

AAC

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CTT

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CTC

GAC

TCC

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TTG

GAC

TTG

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GTT

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Leu

GAC

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CTG

CTG

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Phe

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GIu

Leu

Asn

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Asn

GIu

CTA

GAC

AGC

TTC

AAG

Ser

CAG

GAA

TTG

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GIu

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GAA

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TTC

TCC

GTC

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TTG

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TCG

Leu

Leu

GIu

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Leu

Arg

GIu

GIu

145

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Lys

Leu

CGA

AGT

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Arg

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GAG

GAG

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CTC

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Arg

Met

GAT

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Ser

GIy

Phe

VaI

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CAG

GTG

Ser

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GTG

Cys

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AAG

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TTG

TGC

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Pro

GIu

GAG

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GAA

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Cys

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Tyr

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AAG

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Asp

Asp

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TGT

GAC

GAC

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TTC

GTC

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GCC

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GCC

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CTG

CTG

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GIu

ACC

CAG

CGG

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GAA

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GIn

Leu

VaI

200

Me

His

Ser

Pro

205

GIu

GIn

Asp

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CTT

CAG

CTG

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CAC

AGC

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GIu

GAG

CAG

GAC

210

GIy

GTC

GAC

CAG

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GTG

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GTC

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Phe

Leu

GGG

TCG

CTC

TTC

CTG

CCC

Lys

His

AIa

215

His

Thr

GIy

Ser

220

He

GIy

Leu

AAG

GAC

AAG

CAT

GCC

Ser

CAC

ACC

GGC

TCC

Trp

ATT

GGC

CTT

225

Thr

TTC

GTA

CGG

AGC

GTG

TGG

CCG

AGG

TGG

TAA

CCG

GAA

Arg

Asn

ACC

TCG

ACC

CGG

AAC

TGG

Asp

Leu

Lys

230

GIu

Phe

He

Trp

235

Asp

GIy

Ser

ÜCC

TTG

GAC

CTG

AAG

GIy

GAG

TTT

ATC

TGG

VaI

GAT

GGG

AGC

240

Leu

CTG

GAC

TTC

GGA

CTC

AAA

TAG

ACC

GTG

CTA

CCC

TCG

His

VaI

TTG

CCT

CAC

CAT

GTG

AAC

GTA

CAC

Tyr

Ser

Asn

245

Ala

Pro

GIy

GIu

250

Thr

Ser

Arg

-9- 263

538

TAC

AGC

AAC

Trp

GCT

CCA

GGG

GAG

Pro

ACC

AGC

CGG

255

Asp

ATG

TCG

TTG

TGG

CGA

GGT

CCC

CTC

CCC

TGG

TCG

GCC

Ser

GIn

GAC

ACC

GGG

AGC

CAG

CTG

GIu

Asp

Cys

260

Met

Met

Arg

GIy

265

GIy

Arg

Trp

TCG

GTC

GAG

GAC

TGC

VaI

ATG

ATG

CGG

GGC

Ser

GGT

CGC

TGG

270

GIy

CTC

CTG

ACC

GTG

TAC

TAC

GCC

CCG

TCC

CCA

GCG

ACC

Asp

Asp

GGC

CAC

AGG

AAC

GAC

CCG

Phe

Cys

Asp

275

Lys

Leu

GIy

Ala

280

VaI

Cys

Asp

TTG

CTG

TTC

TGC

GAC

Arg

AAG

CTG

GGC

GCC

Trp

GTG

TGC

GAC

285

Ala

AAG

ACG

CTG

CGT

TTC

GAC

CCG

CGG

TGG

CAC

ACG

CTG

Arg

Leu

GCC

GCA

ACC

C(j(j

CTG

CGG

Thr

Cys

Thr

290

Pro

Ala

Ser

GIu

'95

Ser

* AIa

GIu

GCC

GAC

ACA

TGC

ACG

Pro

CCA

GCC

AGC

GAA

GIy

TCC

GCG

GAG

300

Ala

TGC

ACG

TGC

CCG

GGT

CGG

TCG

CTT

GGT

AGG

CGC

CTC

Ser

Met

GCC

GGC

CCA

TCC

ATG

CGG

Pro

Asp

Ser

305

Pro

Asp

Pro

Asp

310

Arg

Leu

Pro

AGG

TAC

CCT

GAT

TCA

Arg

CCA

GAC

CCT

GAC

GIy

CGC

CTG

CCC

315

GIy

GGA

CTA

AGT

AGA

GGT

CTG

GGA

CTG

GGC

GCG

GAC

GGG

Thr

Pro

GGa

Ala

Pro

Leu

TCT

Ser

CCG

ACC

CCC

CCT

GCC

CCT

CTC

His

TCT

TGA

TGG

GGG

Ser

CGG

GGA

GAG

CAC

AGA

ACT

rcT

GTG

AGA

Der einzelne große offene Leseraster beginnt bei Position 186 und erstreckt sich über 963 Nucleotide, und codiert dabei für 321 Aminosäuren. Die isolierten partiellen Aminosäuresequenzen von drei Peptidfragmenten und das isolierte N-Terminal Met-Glu-Leu-Gln-Val-Ser-Ser-Gly-Phe-Val- von gereinigtem Fc_cR bestätigen, daß der längste Raster die Codierungssequenz von Fc_cR-Protein ist. Die aus 21 Aminosäuren bestehende hydrophile N-Terminalsequenz wird von einer hydrophoben Region gefolgt, die aus 26 ungeladenen Aminosäuren (22-47) besteht. Die Signalsequenz, in der Regel im N-Terminus der meisten Membran-gebundenen oder sek^retorischen Proteine gelegen, wurde nicht gefunden. Daher si .^Hie hydrophobe Dehn jng von 26 Aminosäuren wahrscheinlich eine Membran-eingebettete Region, da die anschließenden Rückstände meist hydrophil sind und kein anderer Teil der Sequenz scheint die Membran zu kreuzen. Die N-terminale hydrophile Dehnung wird durch einen Haufen sehr basischer Aminosäurereste (Arg-Arg-Arg-Cys-Cys-Arg-Arg) beendet. Dieser Haufen basischer Aminosäuren, der sich in der Regel auf der Zytoplasmaseite der Membranproteine findet, ist als eine Stop-Transfer-Sequenz bekannt, d^;e eine wichtige Rolle bei der Integration in die Lipiddoppelschicht spielt (siehe Blobel in Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77 1496-1500 [198O)) und Schneider u.a. in Nature 311, 675-678 [ 1984]). Es gibt eine vermutliche N-gebundene Kohlenhydratzusatzstellt· bei Position 63, die in der extrazellularen Region für Membranproteine gelegen sein müßte. Alle diese Ergebnisse zeigen, daß Fc_rR mit dem N-Terminus auf der Zytoplasmaseite und dem C-Terminus auf der Außenseite der Zelle ausgerichtet ist. Relativ große Mengen von löslichem 25-kd-Fc_cR wurden im Kulturüberstand von PiPIVil-8866-Zellen gefunden. Der N-terminale Aminosäurerest (Met) des löslichen Fc_Efl wurde bei Position 150 gefunden, und der vorhergehende Rest, Arginin, ist ein allgemeines Ziel für trypsinartige Proteasen. Die C-terminale Region (150-321 (enthält zwei Cysteinhaufen (160,163,174 und 191 und 259,273,282 und 288), die wahrscheinlich Disulfidbindungen bilden und eine kst gefaltete Struktur ergeben, die gegenüber proteo! ,'tischen Enzymen resistent ist. Die C-terminale Region (150-321) entspricht demnach dem löslichen Fc_tR, der ein Produkt der proteolytiiichen Spaltung des Membran-gebundenen Fc_cR ist

g) Expression der Fc_tR-mRNA:

Die poly(A)' RNA wurde aus verschiedenen Zelltypen hergestellt utid durch „Northern blotting" auf die Expression von Fc_cR-mRNA analysiert, wobei eine Hauptbande von 1700b in lymphoblastenartigen B-Zell-Linien (RPMI-8866, RPMI-1788), in der Epstein-Barr-Virus-transformierten Vor-B-Zell-Linie der fötalen Leber (FL 8-2) und in zwei Fc_tR" L-Zell-Transformanten nachgewiesen wurde, jedoch nicht in Fc_cR Zellen, einschließlich zweier Burkitt-Lymphomaliiiien (Daudi und Jijoy^), einer T-Zell-Linie (CEM) und eines L-Zell-Transformanten, die ein anderes B-Zell-Antigen exprimiert (CD20). Weiterhin wurde Fc_cR-mRNA nicht in normalen T-Zellen nachgewiesen, während normale B-Zellen einen vergleichbaren Wert von FC^R-mRNA als B-Iymphoblastenartige Linien exprimieien.

h) Herstellung eines Expressionsvektors, der die für ein wasserlösliches Fragment des Fc_c-Rezeptors codierenden DNA-Sequenzen enthält

Die für den wasserlöslichen Teil des Fc_E-Rezeptors codierenden Codone, günstigerweise die Codone für -.'¹J Aminosäuren von etwa 50 bis 150, vorzugsweise von etwa 150, wurden mit Hilfe einer geeigneten Endonukluaseaus dem für den Fc_r-Rezeptor erhaltenen Gen entfernt (siehe Tabelle 3). Bei der Einführung der erhaltenen gekürzten Fc_t-Rezeptorgene in die Organismen unter Bedingungen, die zu einer hohen Ausbeute führen, wurden die gewünschten wasserlöslichen Polypeptide ohne die oben erwähnten Aminosäuren gewonnen. Der wasserlösliche Teil des Fc_c-Rezeptors enthält deshalb mindestens die folgende Sequenz:

Leu TTG AAC

GIn CAG GTC

VaI GTG CAC

Ser TCC AGG

Ser AGC TCG

GIy GGC CCG

Phe TTT AAA

VaI GTG CAC

Cys TGC ACG

Asn AAC TTG

Thr ACG TGC

-

10- 263 538

Met ATG TAC

Trp TGG ACC

He ATC TAG

Asn AAT TTA

Phe TTC AAG

GIn CAA GTT

Arg CGG GCC

Lys AAG TTC

Cys TGC ACG

Tyr TAC ATG

Tyr TAC ATG

Phe TTC AAG

GIu CAA CTT

GIu GAG CTC

Lys AAG TTC

GIn CAG GTC

Trp TGG ACC

VaI GTC CAG

His CAC GTG

AIa GCC CGG

Arg CGG GCC

Tyr TAT ATA

AIa GCC CGG

Cys TGT ACA

Asp GAC CTG

Cys TGC ACG

Pro CCT GGA

GIy GGC CCG

Lys AAG TTC

Gin CAG GTC

Leu CTG GAC

VaI GTC CAG

Se. AGC TCG

ile ATC TAG

His CAC GTG

Ser AGC TCG

Pro CCG GGC

GIu GAG CTC

GIu GAG CTC

•Gin CAG GTC

GIy GGC CCG

Lys AAG TTC

GIu GAA CTT

Thr ACC TGG

Lys AAG TTC

His CAT GTA

AIa GCC CGG

Ser AGC ^CG

His CAC GTG

Thr ACC TGG

GIy GGC CCG

Ser TCC AGG

Trp TGG ACC

He ATT TAA

GIy GGC CCG

Asp GAC CTG

Met ATG TAC

Lou CTG GAC

GIy GGG CCC

Asp GAC CTG

Leu CTG GAC

Lys AAG TTC

GIy GGA CCT

GIu GAG CTC

Phe TTT AAA

Ue ATC TAG

Trp TGG ACC

VaI GTG CAC

Asp GAT CTA

Gly GGG CCC

Asp GAC CTG

Phe TTC AAG

Asn AAC TTG

Thr ACC TGG

Tyr TAC ATG

Ser AGC TCG

Asn AAC TTG

Trp TGG ACC

AIa GCT CGA

Pro CCA GGT

GIy GGG CCC

GIu GAG CTC

Pro CCC GGG

Thr ACC TGG

Ser AGC TCG

Leu CTT GAA

Arg CGG GCC

VaI GTG CAC

Lau TTG AAC

GIu GAG CTC

Asp GAC CTG

Cys TGC ACG

VaI GTG CAC

Met ATG TAC

Met ATG TAC

Arg CGG GCC

GIy GGC CCG

Ser TCC AGG

GIy GGT CCA

Arg CGC GCG

Ser AGC TCG

His CAT GTA

GIn CAG GTC

Asp GAC CTG

Pho TTC AAG

Cys TGC ACG

Asp GAC CTG

Arg CGT GCA

Lys AAG TTC

Leu CTG GAC

GIy GGC CCG

AIa GCC CGG

Trp TGG ACC

VaI GTG CAC

Cys TGC ACG

Arg CGG GCC

Ser AGC TCG

Asp GAC CTG

GIy GGC CCG

Thr ACA TGT

Cys TGC ACG

Thr ACG TGC

Pro CCG GGC

Pro CCA GGT

AIa GCC CGG

Ser AGC TCG

GIu GAA CTT

GIy GGT CCA

Ser TCC AGG

AIa GCG CGC

Trp TGG ACC

Asn AAC TTG

Leu CTC GAC

Ala GCC CGG

Pro CCT GGA

Asp GAT CTA

Ser TCA AGT

Arg AGA TCT

Pro CCA GGT

Asp GAC CTG

Pro CCT GGA

Asp GAC CTG

GIy GGC CCG

Arg CGC GCG

Leu CTG GAC

Asp GAC CTG

Arg CGG GCC

Met ATG TAC

Aia GCC CGG

AIa GCC CGG

Pro CCT GGA

Leu CTC GAG

His CAC GTG

Ser TCT AGA

TGA ACT

GIu GAG CTC

Ser TCC AGG

Pro CCC GGG

GIy GGA CCT

Pro CCC GGG

Thr ACC TGG

Ser TCT AGA

Zusätzlich wurde festgestellt, daß die Membran-umspannende Region von Fc_tR in den herkömmlichen Rekombinierungsprozessen nicht als Signalsequenz fungiert, und deshalb ist für die Sekretierung eines wasserlöslichen Rezeptorproteins aus einem geeigneten Wirt die Verwendung einer geeigneten eukaryontisc^hfcii Signalsequenz erforderlich.

Eine solche Signalsequenz kann zusätzlich und in einer Position vor der für dfin wasserlöslichen Teil codierenden cDNA bereitgestellt werden.

Eine bevorzugte erfindungsgemäße Ausführungsart ist daher ein neuartiges wasserlösliches Rekombinantenfragmont, das mindestens eine O-Glycosylierungsstelle hat, vorzugsweise ein durch eine native O-Glycosylierung und deren Erzeugung begleitetes Fragment, die neuartigen Plasmide, die diese DNA-Sequenzen enthalten und deren Herstellung (sieht.· zum Beispiel Fig. 18: Schemata von pFc_cR-1 (siehe auch Fig. 17) und psFc_cR-1 [siehe auch Fig. 19]).

Ein bevorzugtes O-glycosyliertes wasserlösliches Fc_cR-Fragment enthält die Aminosäuren 150 bis 321 wie in Tabelle 3 gezeigt

In e'ner neuartigen erfindungsgemäßen cDNA-Sequenz fehlt die cDNA für mindestens einen Teil der Aminosäuren 1 bis 148 des FctR, insbesondere die Codierungsequenz für die N-terminale Zytoplasmaregion, so daß zum Beispiel nur die Codiersequenz für den Membran-umspannenden Teil des Proteins und der Anteil, der für den wasserlöslichen Ti'! der cDNA des ganzen Rezeptors codiert, vorhanden sind.

In dieser neuartigen cDNA-Sequenz wird zumindest ein Teil der für die Aminosäuren 1 bis 148 codierenden cDNA-Sequenz durch ein geeignetes cDNA-Fragment, das für eine eukaryontische Signalsequenz codiert, mittels geeigneter Restriktionsendonucieasen und Ligasen ausgetauscht.

Zum Beispiel wird ein Plasmid, das ein für Fc₁R codierendes cDNA-lnsert enthält, durch Austausch mindestens eines Teiles der Codiersequenz für die Aminosäuren 1 bis 148, beispielsweise die Aminosäuren 1 bis 134, durch eine eukaryontische cDNA-Signalsequeni, z. B. eine Interleukin-cDNA-Signalsequenz, z. B. durch die BSF-2-Signalsequenz, modifiziert. So wurde in dem folgenden beschriebenen Beispiel ein entsprechendes Plasmid, z. B. Plasmid LE 392 oder pGEM4 (pFc_£R-1) (siehe Fig. 17), beschrieben in Cell 47,659 (1986), mit Hindill digeriert, wobei ein Hindlll-Fragment von 1,0kbp gewonnen wurdf, das die Codiersequenz für die Aminosäuren 134 bis 321 dor vollständigen Fc_tR-cDNA enthielt. Die zurückgesetzten 3'-Enden dieses Fragments wurden dann mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase aufgefüllt und die DNA wurde anschließend mit Pstl digerier*. Das gewonnene Fragment wurde anschließend in einem geeigneten Vektor, vorzugsweise mit einem BamHI-Pstldigerierten pBSF2-L8 geclont. Der Vektor wird günstigerweise folgendermaßen hergestellt:

Das EcoRI-BamHI 1,2kbp BSF-2 cDNA-lnsert wurde durch Digestion von pBSF-2.38 (siehe Nature 324,73-76 (19861) mit Hindill und BamHI hergestellt. Das gewonnene Fragment, das eine vollständige Länge von BSF-2 cDNA enthielt, wurde anschließen mit Hin'! digeriert und das zurückgesetzte 3'-Ende wurde mit Klenow-Fragment der DNA-Polymerase aufgefüllt. Nnch der Kpnl-Digestion wurde das gewonnene Fragment Kpnl-Hinfl 100bp, das die BSF-2-Leader-Sequenz enthielt, in die Mehrfach-Clonierstelle pGEM4, die zuvor mit Kpnl und Smal digeriert worden war, cloniert. Einer der selektionierten Clone wurde vermehrt und als p3SF2-L8 bezeichnet (siehe Fig.20).

pBSF2-L8 wurde mit BamHI digeriert und die zurückgesetzten 3'-Enden wurden mit Klenow-Fragment der DNA-Polymerase aufgefüllt. Nach dem Auffüllen der BamHI-Stelle wurde die oben erwähnte Hindlll-Pstl Fc_t-cDNAin mit pBSF2-L8 digerieitem BamHI-Pst-l cloniert, wie bereits erwähnt wurde. Einer der selektionierten Clone wurde vermehrt und als psFc_cR-1 bezeichnet (siehe Fig. 19).

Zum Vergleich der biologischen Aktivität der durch d^;e Clone pFc_tR-l, psFCcR-1, pAnFc_tR-1 (Beispiel C) und pANFc_tR-2 (Beispiel D) (siehe Fig. 18) erzeugten Proteine wurden diese Plasmide durch Digestion mit geeigneten Enzymen, zum Beispiel pFc_cR-1 und psFccR-1 mit BamHI und pANFc_cR-1 und pANFc_cR-2- mit EcoRI, linearisiert und die gewonnenen Fragmente wurden als Matrize für die Synthetisierung von mRNA mit SP6-RNA-Polymerase verwendet. In gewonnenen mRNA's wurden in Oozyten von Xenopus leavis injizier!. Nach zweitägiger Inkubationszeit wurden die Fc_cR-Aktivitäten in den Kulturüberständen und den Lysaten der Oozyten durch ein enzymgebundenen Immunoadsorptionsassay (ELISA) unter Verwendung von Anitt-Fc_cR-Antikörpern 3-5 und 8-30 (siehe EU-PA 86111488.2, eingereicht am 19. August 1986) bestimmt, die zwei verschiedene Epitopen auf Fc_ER erkennen. Wie in Fig.21 dargestellt ist, wurde die Fc_cR-Aktivität für das NP-40 Lysat der Oozyten, in PBS-Lysat der Oozyten und im Oozyten-Kulturüberstand bestimmt. Es wird deutlich, daß, während in PBS-Lysat und Kulturüberstand von mit Transkripten von pFc_cR-1, pANFc_cR-1, und pAFc_tR-1 und pANFc_cR-2 injizierten Oozyten keine Aktivität nachgewiesen werden konnte, Fc_cR-Aktivität in den Überständen und PBS-Lysaten nach Injektion mit Fragmenten von psFccR-1 entdeckt wurde. Weiterhin wurde mittels eines modifizierten ELISA-Verfahrens mit Anit-FCcR-Antikörper 3-5, IgE und AP-Anti-HumanlgE festgestellt, daß das Fc_cR wasserlösliche Fragmentsektretionsprodukt aus den Oozyten die IgE-bindende Eigenschaft besitzt: Der Kulturüberstand aus den mit psFc_ER-1-mRNA injizierten Oozyten wurde auf mit S-ö-Antikörper-beschichteten Platten inkubiert, die dann mit Human-lgE und schließlich mit AP-Anit-lgE inkubiert wurden. Die Ergebnisse ließen deutlich erkennen, daß der von den Oozyten sekretierte Fc_tR einen Komplex mit IgE (siehe Fig.22) bildete. Als Kontrolle wurde die Bindung mit nicht-transformierten Oozytenüberstand Puffer und RPMI-8866-Überstand durchgeführt.

Zur Einschätzung der IgE-Bindeeigenschaft des aus Oozyten, die mit psFc_tR-1 -mRNA injiziert waren, gewonnenen löslichen FCtR-Fragmentes, wurde der Oozytenüberstand weiter auf seine Fähigkeit zur Inhibition der Rosettenbildung zwischen ORBC, das mit Human-lgE und SKW6-CL4-Zellen, die Fc_cRauf ihrer Oberfläche tragen, beschichtet war, getestet. Das Vorhandensein von löslichem Fc_ER reduzierte die Anzahl der rosettenbildenden Zellen, an die mehr als 20 ORBC gebunden waren, was darauf hinwies, daß der lösliche Rezeptor mit dem Zellmembran-FccR um das an die Oberfläche von ORBC gebundene IgE konkurriert (siehe Fig.23).

Die erfindungsgemäß gewonnenen entsprechenden Gene können in Organismen unter Bedingungen eingeführt werden, die dabei zu hohen Ausbeuten führen, wie bereits zuvor erwähnt wurde. Den Fachleuten sind nützliche Wirte und Vektoren bekannt, wobei zum Beispiel auf die Europäische Patentveröffentlichung 0093619 vom 9. November 1983 verwiesen wird. Im allgemeinen werden Prokaryonten für die Expression bevorzugt. Zum Beispiel ist E. coli K12 Stamm 294 (ATCC Nr. 31446) ^hr onders nützlich. Andere verwendbare mikrobielle Stämme sind beispielsweise E. coli X1776 (ATCC rtr. 31 537). Die genannten Stämme sowie E. coli W3110 (F", Lambda", prototroph, ATCC Nr.27325), Bazillen wie Bacillus subtilus, und ande Enterobacteriaceae wie Salmonella typhimurium oder Serratia marcensos und verschiedene Pseudomonas-Species können verwendet werden.

Im allgemeinen werden in Verbindung mit diesen Wirten Plasmidvektoren eingesetzt, die Replikon- und Kontrollsequenzen enthalten, die aus Spezies gewonnen wurden, dio mit diesen Wirtszellen verträglich sind. Der Vektor trägt in der Regel eine Replikationsstelle sowie Markierungssequenzen, die in der Lage sind, eine Phänotypselektion in transformierten Zellen durchzuführen. Beispielsweise wird. E. coli üblicherweise mit pBR322, einem aus einer tscherichia coli Spezies gewonnenen Hlasmid (Boüvar, u.d, GaneZ: 95 11977]), transformiert. pBR322 entnäll Gene für Ampicillin- und Tetracylinresistenz und bietet so ein einfaches Mittel zur Identifizierung transformierter Zellen. Das pBR 322-Plasmid oder andere mikrobielle Plasmide müssen auch Promotoren enthalten, die von mikrowellen Organismus zur Expression benutzt werden können, oder diese Plasmide müssen so modifiziert werden, daß cii* diese Promotoren enthalten.

Die am häufigsten verwendeten Promotoren für den Aufbau von rekombinanter DNA sind die Beta-Lactamase (Penicillinase) und Lactose-Promotor-Systeine (Chang u.a., Nature275,615[19781; Itakura u.a., Science 198,1056[19771; Goeddel u.a.. Nature 281, 544 i1979l) sowie das Tryptophan-Itrp) Promotor-System (Goeddel u.a., Nucleic Acids Res.8, 4057 [19801; EP-A-O0367/6). Dies sind die am häufigsten verwendeten Promotoren, es wurden jedoch auch andere mikrobielle Promotoren entdeckt und angewendet.

Beispielsweise kann die genetische Sequenz für Fc_tR unter die Kontrolle des linksgerichteten Promotors die Bakteriophagen Lambda (P_L) gestellt werden. Dieser Promotor ist einer der stärksten bekannten Promotoren, der kontrolliert worden kann. Die Kontrolle wird durch den Lambda-Repressor ausgeübt und es sind angrenzende Restriktionsstellen bekannt. Eine temperaturempfindliche AIIeIe dieses Repressorgens kann auf den Vektor gestellt werden, der die vollständige Fc_tR-Sequensz enhält. Wird die Temperatur auf 42⁰C erhöht, wird der Repressor inaktiviert, und der Promotor wird auf seinem Maximalwert exprimiert. Die unter diesen Bedingungen erzeugte mRNA müßte ausreichen, um eine Zelle zu ergeben, die etwa 10% ihrer frisch

synthetisierten RNA aus dem P_L-Prorootor enthält. Nach diesem Schema ist es möglich, eine Clonbank zu errir.iten, in der eine funktionell Fc_cR-Sequenz neben einer Ribosom-Binde-Sequenz und in unterschiedliche τη Abstand zum Larroda-P_L-Promotor steht. Diese Clone können zur Selektion desjenigen mit der höchsten Ausbeute gescreent werden.

Die Expression und Translation der Fc_tR-Sequenz kann auch unter die Kontrolle anderer Regulone gestellt werden, die zum Organismus in seinem untransformierten Zustand „homolog" sein können. Beispielsweise enthält Lactose-abhängige E.colichromosomale-DNA ein Lactose- oder Lac-Operon, das die Lactosedigestion durch Expression der Enzym-Beta-Galactosidase bewirkt. Die Lac-Kontrollelemente können aus Bakteriophage Lambda plaC5, das für E.coli infektiös ist, gewonnen werden. Das Lac-Operon der Phage kann durch Transduktion aus den gleichen Bakterienspezies abgeleitet werden. Für den erfindungsgemäßen Prozeß geeignete Regulone können aus der dem Organismus eigenen Plasmid.-DNA gewonnen werden.

Das Lac-Promotor-Operator-System läßt sich durch IPTG induzieren.

Andere Promotor-Operator-Systeme oder Teile davon können ebenfalls eingesetzt werden. Beispielsweise können Arabinose-Operator, Colicin-E,-Operator, Galactose-Operator, Alkali-Phophatase-Operator, Trp-Operator, Xylose-A-Operator, Tac-Promotor und dergleichen verwendet werden.

Die Gene lassen sich am vorteilhaftesten in Escherichia coli exprimieren, wenn das Promotor-Operator-System des Plasmids pER 103 (siehe Rastl-Dworkin u.a., in Gene 21,237-248 und EP-A-0.115.613), deponiert bei der German Collection of Microorganisms, Grisebachstraße 8, D-3400 Göttingen am 27. Oktober 1983 unter DSM 2773 gemäO dem Budapester Vertrag, verwendet wird. Ein entsprechendes Expressionsplasmid, das beispielsweise den wasserlöslichen Teil des Human-Fc_c-Rezeptors mit niedriger Affinität mit den Aminosäuren 150 bis 321 (siehe Tabelle 3) exprimiert, läßt sich folgendermaßen herstellen:

Ein Plasmid, das das erwähnte Promotor-Operator-System enthält, zum Beispiel das Plasmid pRh 100 (siehe Beispiel B) wurde mit Sstl digeriert. Anschließend wurden die 3'-überstehenden Enden entfernt, und das linearisierte Plasmid wurde dephosphoryliert. Nach der Reinigung, z.B. durch Phenol/Chloroform-Extraktion, Elektrophorese, Elektroelution und Präzipitation wurde der linearisierte Vektor mit einem Insert ligiert, das folgendermaßen gewonnen wurde:

Ein plasmidhaltiger Teil des Human-Fc_c-Rezeptorgens mit niedriger Affinität, zum Beispiel pGEM 4-Fc_cR, das durch Digestion des EcorRI Inserts des Plasmids LE 392 mit Hindill und durch Re-Isertion des größeren EcorRI/Hindlll-Fragmßnts in pGEM 4 (Promega Biotec, Madison, WI53711, USA) gewonnen wurde, wurde mit EcoRI und Hindlll digeriert Anschließend wurden die 5'-überstehendon Enden durch Zusatz von Klenow-Fragment von DNA-Polymerase I geglättet, und alle vier dXTP's und die 5'-Phosphatgruppen wurden entfernt. Nach der Reinigung des gewonnenen Fragmentes wurde dieses mit Sau 3 A wieder ausgeschnitten (recut) und das größere Fragment wurde isoliert. Da dieses Verfahren nicht nur die „upsti eam"-5'-Region, sondern auch die Nucleotide für die ersten 18N-terminalen Aminosäuren des gewitschten wasserlöslichen Teiles entfernt, wurden zwei Oligodesoxynucleotide der Formeln

5' GAACTGCAGGTG XGCTCTGGTTTCGTTTGCAACACTTGCCCGGAAAAATG 3'

3' CTTGACGTCCACTCGAGACCAAAGCAAACGTTGTGAACGGGCCTTTTTACCTAG 5'

Sau3A

synthetisiert, um die entsprechenden Codone der folgenden Formel wiederherzustellen:

GluLeuGlnValSerSerGlyPheValCysAsnThrCysProGluLysTrp

5' GAACTGCAGGTGAGCTCTGGTTTCGTTTGCAACACTTGCCCGGAAAAATG 3'

3' CTTGACGTCCACTCGAGACCAAAGCAAACGTTGTGAACGGGCCTTTTTACCTAG 5'

Sau3A

(ohne das ATG-Codon, da dieses Codon im Promotor/Operator/Linker-System des Plasmids pER 103 enthalten ist). Jedes der hergestellten Oligodesoxyneucleotide wurde „annealed" und an das oben erwähnte wasserlösliche Fc_cR-Fragment ligiert. Nach der Hitzedenaturierung der eingesetzten T4-DNA-Ligase wurden T4-Polynucleotidkinase und ATP zugegeben, um die 5'-Enden der DNA zu phosphorylieren.

Nach der Reinigung des Inserts durch Agarosegel-Elektrophorese wurde dieses Insert mit der lir earisierten Vektor-DNA ligiert. Die gewonnene Ligationslösung wurde in E.coli HB101 transformiert und einige der Ampicillin resietenten Kolonien wurden isoliert. Diese Plasmide wurden mittels Restriktions-Enzym-Analyse auf die Korrektheit ihres Aufbaus untersucht. Ein Plasmid wurde selektioniert und als pRH 246 (siehe Fig. 16) bezeichnet.

Neben Prokaryonten können auch eukaryontische Mikroben wie beispielsweise Hefekultu' en verwendet werden. Unter den eukaryontischen Mikroorganismen werden am häufigsten Saccharomyces cerevisiae verwendet, wenn auch eine Anzahl anderer Spezies allgemein zur Verfügung steht. Zur Expression in Saccharomyces werden üblicherweise die folgenden Plasmide verwendet: Plasmid YRp7 (Stinchcomb, u.a., Nature 282, 39 [19791; Kingsman u.a., Gene 7,141 119791; Tschumper, u.a., Gene 10,157 [19801), Plasmid YEp 13 (Bwach u.a., Gene 8,121-133 [19791) und Plasmid pJDB207 (siehe V.D.Beggs u.a. in „Gene cloning in yeast" (Genclonierung in Hefe), Hrg.R.Williamson; Genetic engineering Vol.2,175-203 (1981), Academic Press, London; deponiert am 28. Dezember 1984 unter DSM 3181 bei German Collection of Microorganisms, Grisebachstraße 8, D-3400 Göttingen, gemäß dem Budapester Vertrag). Das Plasmid YRp7 enthält das Gen TRP1, das einen Selektionsmarker für einen mutanten Hefestamm darstellt, dem die Fähigkeit, in Tryptophan zu wachsen, fehlt, beispielsweise ATCC Nr.44076. Die Gegenwart von TRP1-Läsion als ein Charakteristikum des Hefewirt-Zellgenoms schafft dann eine wirksame Umgebung für den Nachweis der Transformation durch Wachstum in Abwesenheit von Tryptophan. In gleicher Weise enthält das Plasmid YEp 13 das Hefegen LEU 2, das für die Komplementierung eines LEU2-Minusmutanten Stammes eingesetzt werden kann. Zu einer geeigneten unterstützenden Sequenz in Hefevektoren gehören die 5'-flankierdcnde Region der Gene für ADHI (Ammerer, G., Methods of Enzymology 101,192-201 119831), 3-Phosphoglyceratkinase (Hitzemann, u.a., I. Biol. Chem. 255, 2073 [19801) oder andere glycolytische Enzyme (Kawasaki und Fraenkel, BBRC 108,1107-1112 [19821), wie beispielsweise Enolase,

Glyceraldehyd-S-phosphatdehydrogenase, Hexokinase, Pyruvatdecarboxylase, Phosphofructokinase, Glucose-6-phosphatisomerase, Phosphoglucoseisomerase und Glucokinase. Bei der Konstruktion geeigneter Expressionsplasmiüe werden die Terminationssequenzen, die mit diesen Genen verbunden sind, ebenfalls in dieses Expressionsvektor-3'-Ende der gewünschten auszuprägenden Sequenz ligiert, um die Polyadenylierung der mRNA und Termination zu schaffen. Andere Promotoren, die den zusätzlichen Vorteil einer durch Wachstumsbedingungen gesteuerten Transkription aufweisen, sind die Promotorregionen der Gene für Alkoholdehydrogenase-2, Isocytochrom C, Säurephosphatase, mit dem Stickstoff-Stoffwechsel veibundene degradative Enzyme, die zuvor erwähnte Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase und Enzyme, die für die Maltose- und Galactoseausnutzung verantwortlich sind. Promotoren, die durch die Hefe-„mating"-Stelle reguliert werden wie beispielsweise die Promotoren der Gene BARI, MR-Alpha-1, STE 2, STE 3 und STE 5 können für ein temperaturreguliertes System mittels temperaturabhängiger Siv-Mutr.tionen (Rhine, Doktorarbeit, University of Oregon, Eugen, Oregon (1979), Herskowitz und Oshima in The Molecular Biology «f thi Yeast Saccharomyces, Teil 1,181-209 [19811, Cold Spring Harbor Laboratory) verwendet werden. Diese Mutationen beeinflusse τ direkt die Expressionen der stillen „mating"-Kassetten der Hefe und daher indirekt die „mating"-abhängigen Promotoren.

Im allgemeinen ist jedoch jeder Plasmidvektor, der einen hefeverträglichen Promotor, einen Ursprung der Replikation und Terminationssequenzen enthält, geeignet.

Die Gene, vorzugsweise die Gene für den wasserlöslichen Teil des Human-FCt-Rezeptors mit niedriger Affinität mit den Aminosäuren 150 bis 321 (siehe Tabelle 3), können in Hefe am besten exprimiert werden, wenn d'er ADHI-Promotor zusammen mit dem ADHI-Terminator verwendet wird. Beispielsweise kann die Herstellung eines geeigneten Hefe-Expressionsvektors erfolgen, indem hergestellt werden:

a) ein den Hefe-ADHI-Terminator enthaltendes Plasmid,

b) ein den Hefe-AOHI-Promotor und den Hefe-ADHI-Terminator enthaltendes Plasmid (siehe J. Biol. Chem. 257, 3018-3025 11932]),

c) ein Plasmid, das folgendes enthält: den Hefe-ADHI-Promotor, ein Gen das für den Hefe-„mating "Faktor α Leader-Peptid (MFa-Leader-Sequenz) codiert (siehe Cell 30,933-943 [1982)), ein Multiclonierstelle und den Hefe-ADHI-Terminator,

d) ein Plasmid, das folgendes enthält: den ADHI-Promotor, die Codiersequenz für den wasserlöslichen Teil des Human-Fc_t-Rezeptors mit n'edriger Affinität und den ADHI-Terminator,

e) ein Plasmid, das folgendes enthält: den Hefe-ADHI-Promotor, einen Hefe-„mating"-Faktor a-Leader-Gen, das Gen für den wasserlöslichen Teil des Human-Fc_c-Rezeptors mit niedriger Affinität, eine Mulitclonieretelle und den Hefe-ADHI-Terminator, sowie

f) die Transformierung der gewonnenen Plasmid-DNA in einem geeigneten Hefevektor, wobei ein Plasmid, das die Expressionskassette ohne die MFa-Leadersequenz und ein Plasmid, das die Expressionskassette mit der MFa-Leadersequenz enthält, gewonnen werden.

Beschreibung der Verfahren a bis f:

a) Der ADHI-Terminator kann aus einem Plasmid, das diesen Promotor enthält, isoliert werden, beispielsweise aus dem Plasmid pJD 14 (siehe J. L.Bennetzen u.a. in J. Biol. Chem.257,3018-3025 [1982]). Der ADHI-Terminator wurde in Plasmid pHC18 (Pharmacia P-L, Nr. 27-4949-01) als Hindlll-Sphi-Fragment subcloniert. Während des Subclones wurde die Hindlll-Stelle durch eine Auffüll-Reaktion zerstört und nach der Zugabe von Sa Il-Linker wurde das Plasmid pWS214S4 gewonnen. Nach der bigestion von pWS214S4 mit Sphl und Sa 11 wurde das kleinere Fragment mittels Agarosegel-Elektrophorese, Elektroelution und Präzipitation nach bekannten Methoden isoliert.

Das den ADHI-Terminator enthaltende isolierte Fragment wurde mit Vektor-DNA ligiert, die vorzugsweise durch Digestion von Bluescribe M13+ (Siehe Stratagene, San Diego, Kalifornien 92121, USA) mit Sa 11 und Sphl und nach Reinigung der gewonnenen Vektor-DNA mittels Agarosegel-Elektrophorese, Elektroelution und Präzipitation nach bekannten Methoden gewonnen wurde. Die gewonnene Ligaselösung wurde in E.coli JM101 transformiert und das Plasmid einer der Ampicillin-resistenten Kolonien wurde als pRG241 (siehe Fig. 10) bezeichnet, das ein etwa 340bp langes Fragment mit dem ADHI-Terminator enthielt.

b) Der ADHI-Terminator kann aus einem Plasmid, das diesen Promotor enthält, isoliert werdem, zum Beispiel aus einem Plasmid pY-JDB-HulFN-Omega 1 (siehe Beispiel A und DE-PA P 3635867.3, eingereicht am 22.Oktober 1986), das anschließend in einen geeigneten Vektor eingeführt wird, wie beispielsweise das Plasmid pRH 241.

Das erforderliche Insert wurde durch Digestion des Plasmids pY-JDB-HulFN-Omega 1 mit Sphl hergestellt, wobei das 3'-Ende entfernt wurde unter Verwendung von E.coli DNA-Polymerase I in Gegenwart von dGTPund mit Xhol nachgeschnitten wurde. Nach Isolierung der durch Agarosegel-Elektrophorese, durch Elektroelution und Präzipitation nach bekannten Methoden gewonnenen Fragmente, w>>rde das glatte Ende des 400-bp-langen-Fragmenies durch Ligaticn mit dem Adaptorpaar der folgenden Formel

EBI-410: 5' AATTGGAAGGATC 3'

EBI-429: 3' CCTTCCTAG-p 5'

und das klebrige Ende durch Ligation mit dem Adaptorpaar der folgenden Formel

EBI-418: 5' p-TCGAGCCACGTGÜTAC3'

EBI-424: 3' CGTGCAC 5'

umgewandelt.

Die Ligationen wurden gleichzeitig ausgeführt und nach der Reinigung des Ligationsproduktos mittels Agarosegel-Elektrophorese wurde es mit einer geeigneten linearisierten Vektor-DNA, vorzugsweise mit durch Digestion des Plasmids pRH241 mit EcoRI und Kpnl gewonnener linearisierter Vektor-DNA ligiert. Die gewonnene Ligaselösung wurde in E.coli transformiert, die entstandenen Kolonien wurden mittels bekannter Methoden auf das Vorkommen eines Plasmids mit der korrekten Konstruktion untersucht. Ein als Plasmid pRH 242 (siehe Fig. 11) bezeichnetes Plasmid wurde selektioniert.

c) Nach der chemischen Synthese des Hefe-„mating"-Faktorsa-Leader-Peptid (siehe J.Kurian u.a. in Cell 30, 933—943 (1982]) wurde das Insert nach Synthese der folgenden Oligodesoxynucleotide folgendermaßen hergestellt:

MF1 TCGAGCCTCATATCAATGAGATTCCCATCTATTTTCACTGCTGTTTTGTT (50mer) MF2 AGCAGCGAACAAAACAGCAGTGAAAATAGATGGGAATCTCATTGATATGAGGC (53mer) MF3 CGCTGCTTCCTCCGCTTTGGCTGCTCCAGTCAACACTACTACTGAAGACGAAACTGCTCAAATTCCAGCT (70mer) MF4 CAGCTTCAGCTGGAATTTGAGCAGTTTCGTCTTCAGTAGTAGTGTTGACTGGAGCAGCCAAAGCGGAGGA (70mer) MF5 GAAGCTGTCATCGGTTACTCTGACTTGGAAGGTGACTTCGACGTTGCT (48mer) MF6 GCAAAACAGCAACGTCGAAGTCACCTTCCAAGTCAGAGTAACCGATGA (48mer)

MF7 GTTTTGCCATTCTCCAACTCCACTAACAACGGTTTGT TCATTAACACTACTATTGCATCGATTGCT (69mer) MF8 CCTTAGCAGCAATCGATGCMTAGTAGTGTTAATGAACAACAMCCGTTGTTAGTGGAGTTGGAGAATG(69mer) MF9 GCTAAGGAAGAAGGTGTTTCTTTGGACAAGAGGCCTCTGCAGGAATTCT (49mer) MF10 CTAGAGAATTCCTGCAGAGGCCTCTTGTCCAAAGAAACACCTTCTT (46mer)

Jedes der Oligonucleotide MF 2 bis MF9 wurde phosporyliert. Nach abbruch der Reaktionen durch Wär.ne wurden die folgenden Mischungen hergestellt: MF1 und MF2; MF3und MF4; MF5undMF6; MF7 und MF8 sowie MF9 und MF10. Anschließend wurden, nach Erhitzen und Abkühlen, die entstandenen fünf Lösungen zusammengenommen und ligiert. Dieser Lösung wurde , eine linearisiei te Vektor-DNA, die vorzugsweise gewonnen wurde durch Digestion von pRH 242 mit Xhol und Xbal nach Reinigung durch Elektrophorese, Elektroelution und Präzipitation nach bekannten Methoden, zugegeben. Diese Ligationslösung wurde benutzt, um E.coli JM101 zu transformieren, die Plasmide der entstandenen Kolonien wurden durch Digestion mit Xhol und Xbal untersucht, wobei diejenigen Plasmide, die ein Insert von etwa 230 bp (siehe Fig. 12) enthielten, weiter durch Subclonen des Inserts in M13 mp8 und durch Sequenzierung nach der Didesoxy-Ketten-Terminations-Methode von Sanger (siehe Proc. Natl. Acad. Sei.74, 5463-5467, (19771) charakterisiert wurden. Ein Plasmid, das das korrekte Insert enthielt, wurde selektioniert und als pRH 243 bezeichne! (siehe Fig. 13).

d) Die Codiersequenz für den wasserlöslichen Teil des Humcn-FCe-Rezeptors mit niedriger Affinität wurde aus dem Plasmid pGEM4 durch Digestion mit Hind III und EcoR I isoliert, zusätzlich wurden die klebrigen Enden mit dem Klenow-Fragment von E.coli-DNA-Polymerase I und den vier Desoxynucleosidtriphosphaten aufgefüllt. Das größere Fragment wurde dephosphoryliert und nach bekannten Methoden gereinigt.

Da Hindlll die Fc_tR-cDNA etwa 50bp in 5'-Richtung („upstream") der ersten Aminosäure schneidet, wird das Insert mit Sau3A nachgeschnitten. Da bei diesem Verfahren nicht nur die 5'-„upstream" liegende Region sondern auch die Nucleotide für die ersten 18 N-terminalen Aminosäuren des wasserlöslichen Fragmentes, beginnend mit Aminosäure 150 des kompletten Fc_t· Rezept" s beseitigt werden, wurden zwei Oligodesoxynucleotide der folgenden Formeln

5' TCGAGCTCATATACAATGG ATG GAA TTG CAA GTT TCC TCT GGT TTC GTT TGT AAC ACT TGT CCA GAA AAG TG

3' CGAGTATATGTTACC TAC CTT AAC GTT CAA AGG AGA CCA AAG CAA ACA TTG TGA ACA GGT CTT TTC ACC TAG

Sau3A

synthetisiert, um das komplette Gen mittels der Hefe-Codon-Nutzung der folgenden Formel

Met

5' TCGAGCTCATATACA ATG 3' CGAGTATATGT TAC

Xhol

VaI GTT CAA

155 Ser TCC AGG

Ser TCT AGA

GIy GGT CCA

Phe TTC AAG

VaI GTT CAA

160 Cys TGT ACA

Asn AAC TTG

Th r ACT TGA

Cys TGT ACA

Pro CCA GGT

165 GIu GAA CTT

GIu GAA CTT

Leu GIn TTG CAA AAC GTT

3' 5'

Lys AAG TTC

Trp TG ACC TAG

Sau 3 A

wiederherzustellen.

Die präparierten Oligodesoxynucleotide wurden „annealed", das Sau3A-EcoRI-Fragment wurde zugegeben und mittels T4-DNA-Ligase ligiert. Das entstandene Fragment wurde durch Elektrophorese, Elektroelution und Präzipitation nach bekannten Methoden gereinigt.

Dieses Insert wurde mit einer geeigneten linearisierten Vektor-DNA, vorzugsweise mit dem größeren Fragment, das durch Digestion von pRH 242 mit Xba I (Auffüllung) und Xho I und zusätzliche Reinigung nach bekannten Methoden gewonnen wurde, ligiert.

Die gewonnene Ligationslösung wurde in E.coli JM101 transformiert, die Plasmide einiger der entstandenen Kolonien wurden mit verschiedenen Restriktionsenzymen mittels bekannter Methoden untersucht. Ein Plasmid, das das korrekte Insert enthielt, wurde selektioniert und als pRH 244 bezeichnet (siehe Fig. 14).

e) Die Codiersequenz für den wasserlöslichen Teil des Human-Fc_c-Rezeptors mit niedriger Affinität wurde aus dem Plasmid oGEM4-Fc_cR durch Digestion mit Hindill und EcoRI isoliert, zusätzlich wurden die klebrigen Enden mit dem Klenow-Fragment von E.coli-DNA-Polymerase I und den vier Desoxyrtucleosidtriphosphaten aufgefüllt. Das so gewonnene kleinere Fragment wurde dephosphoryliert und nach bekannten Methoden gereinigt.

Da Hind III die Fc₁R-DNA etwa 5Ubp „upstream" der ersten Aminosäure schneidet, wird das Insert mit Sau 3 A nachgeschnitten. Da bei diesem Verfahren nicht nur die 5'-„upstream" liegende Region, sondern auch die Nucleotide für die ersten 18N-terminalen Aminosäuren des wasserlöslichen Fragmentes beseitigt werden, wurden zwei Oligodesoxynucleotide der folgenden Formeln

5' ATGGAATTGCAAGTTTCCTCTGGTTTC ATG GAA TTG CAA GTT TCC TCT GGT TTC GTT TGT AAC ACT TGT CCA GAA AAG TG

3¹ TACCTTAACGTTCAAAGGAGACCAAAG TAC CTT AAC GTT CAA AGG AGA CCA AAG CAA ACA TTG TGA ACA GGT CTT TTC ACC TAG 5' Sau3A

synthetisiert, um das komplette Gen mittels der Hefe-Codon-Nutzung der Formel

Met

5' ATG 3' TAC

GIu Leu Gin VaI Ser Ser GIy Phe VaI Cys Asn Thr Cys Pro GIu GAA TTG CAA GTT TCC TCT GGT TTC GTT TGT AAC ACT TGT CCA GAA CTT AAC GTT CAA AGG AGA CCA AAG CAA ACA TTG TGA ACA GGT CTT

Lys Trp

AAG TG 3'

TTC ACC TAG 5'

Sau 3 A

wiederherzustellen.

Beide Oligodesoxynucleotide wurden „annealed", das Sau3 A-EcoRI-Fragment wurde zugegeben und mittels T4-DNA-Ligase ligiert. Das entstandene Fragment wurde durch Elektrophorese, Elektroelution und Präzipitation nach bekannten Methoden gereinigt.

Dieses Insert wurde mit einer geeigneten linearisierten Vektor-DNA, vorzugsweise mit dem größeren Fragment, das durch Digestion von Plasmid pRH 243 mit EcoR I und Stu I und durch zusätzliche Reinigung mittels Elektrophorese, Elektroelution und Präzipitation nach bekannten Methoden gewonnen wurde, ligiert.

Die gewonnene Ligationslösung wurde in E.coli JM 101 transformiert. Die Plasmide einiger der entstandenen Kolonien wurden mit verschiedenen Restriktionsenzymen mittels bekannter Methoden untersucht. Ein Plasmid, das das korrekte Insert enthielt, wurde selektioniert und als pRH245 bezeichnet (siehe Fig. 15).

f) Die Expressionskassetten der Plasmide pRH244und pRH245, bestehend aus ADHI-Promotor, MFa-Leader-Gen (nur bei pRH245), FccR-wasserlöslichem Gen und ADHI-Terminator, wurden durch Digestion mit Hindill und BamHI isoliert und mit einem Hefeplasmid ligiert, zum Beispiel mit einer geeigneten Vektor-DNA wie dom Flasmid pJDB207 oder YEp 13. Neben Mikroorganismen können auch aus vielzelligen Organismen abgeleitete Zellkulturen als Wirt verwendet werden. Prinzipiell ist jede Zellkultur, ob von vertebralen oder invertebralen Kulturen, verwendbar. Das Interesse an vertebralen Zellen ist jedoch am größten und die Reproduktion von vertebralen Zellen in Kultur (Gewebekultur) ist in den letzten Jahren zu einer Routinearbeit geworden (Tissue Culture, Academic Press, Kruse und Patterson, Hrg. [1973]). Beispiele solcher nützlichen Wirt-Zell-Linien sind VERO-Zellen und HeLa-Zellen, Ovar-Zell-Linien vom Chinesischen Hamster (CHO) und W1-38-, BHK-, COS-7- und MDCK-Zell-Linien. Expressionsvektoren für diese Zell-Linien enthalten in der Regel (wenn notwendig) einen Ursprung der Replikation, einer vor dem auszuprägenden Gen gelegenen Promotor, zusammen mit notwendigen Ribosom-Bindestellen, RNA-Spleiß-Stellen, Polyadenylierungsstelle und transkriptioneile Terminatorsequenzen.

Für die Verwendung in Säugetierzellen werden die Kontrollfunktio :en an den Expressionsvektoren häufig durch ein virales Genom zur Verfügung gestellt. Zum Beispiel werden die häufig verwendeten Promotoren aus Polyoma, Adenovirus 2 und am häufigsten aus Simian Virus 40 (SV40) abgeleitet. Die ersten und letzten Promotoren von SV40 sind besonders nützlich, da sich beide leicht als Fragment, das auch den Ursprung der Replikation von Virus SV40 enthält (Fiers u. a., Nature 273,113 [1978]), aus dem Virus gewinnen lassen.

Kleinere oder größere SV-40-Fragmente können ebenfalls verwendet werden, vorausgesetzt, sie enthalten die etwa 250 bp lange Sequenz, die sich von der Hindlll-Stelle bis zur Bgll-Stelle im viralen Ursprung der Replikation erstreckt. Weiterhin ist auch möglich und oft erwünscht, Promotor- oder Kontrollsequenzen, die normalerweise mit der gewünschten Gensequenz verbunden sind, zu benutzen, vorausgesetzt, diese Kontrollsequenzen sind mit den Wirtsze'lsystemen verträglich.

Ein Ursprung der Replikation kann entweder durch den Aufbau des Vektors, der einen exogenen Ursprung enthält, wie er beispielsweise von SV40 oder einer anderen viralen Quelle abgeleitet werden kann (z. B. Polyoma, Adeno, VSV, BPV usw.) bereitgestellt werden oder er kann durch den Chromosomenreplikationsmechanismus der Wirtszelle bereitgestellt werden. Wenn der Vektor in das Chromosom der Wirtszelle eingebaut ist, ist letzterer hjufig ausreichend. \

Am besten wird jedoch ein Cioner-Vehikel (Shuttle-Plasmid) eingesetzt, das die Replikation sowohl in Eukaryonten als auch in Prokaryonten gestattet. Die Fähigkeit des Plasmids zur Replikation in Prokarytonen bietet ein einfaches Mittel zur Manipulierung der DNA-Sequenz und zur Erreichung großer Mengen von Plasmid-DNA, die zur Transfektion in Säugetierzellen benötigt werden. Ein derartiges Shuttle-Plasmid enthält sowohl prokaryontische DNA-Strukturprinzipien als auch DNA-Sequenzen, die von Eurkarvonten abgeleitet sind. Der prokaryontische Teil des Plasmids besteht aus einem Ursprung der Replikation, die in der Regel vom Plasmid pBR322 (Mulligan R.C. u. a. in Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78,2072-207611981 ]) abgeleitet wird, und einem Markergen, das die Selektion auf einem Antibiotika-haltigen Medium gestattet. Die am häufigsten verwendeten Gene für die Selektion sind diejenigen, die eine Resistenz entweder gegenüber Ampicillin, Tetracyclin oder Chloramphenicol (Mulligan R.C. u.a. in Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78,2072-2076 [1931!! bewirken.

Der eukaryontische Teil des Shuttle-Plasmids muß einen Ursprung der Replikation enthalten, der in der Regel von viralen Genomen abgeleitet ist, wie beispielsweise Simian 40 Virus (Mulligan R.C. u.a. in Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78,2072-2076 (1981)) oder Rinder-Papillom-Virus (DiMaio D. u.a. in Mol. Cell. Biol. 4,340-350 [1984]). Zweitens ist ein selektierbares Markergen erforderlich, das den das Shuttle-Plasmid aufnehmenden Zellen ermöglicht, unter selektiven Bedingungen zu wachsen, um das Plasmid in den Zellen zu erhalten. Dieses Markergen kann entweder prokaryontischen oder eukaryontischen Ursprungs sein (z.B. prokaryontische Gene: Gengpt, das für Xanthin-Guenin-Phosphoribosyltransferase codiert (Mulligan R.C. u.a. in Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78, 2072-2076 (1981], Mulligan R.C. u.a. in Science 209,1422 [1980]), Gen neo, das für eine bakterielle Phosphatase codiert, die Resistenz gegenüber Neomycinderivat G418 bewirkt (Southern P. u.a. in J. Mol. Appl. Genet. 1,327 [19821, Scholer U. u.a. in Cell 36,1422 11984)), CAT-Gen, das für die Chloramphenicol-Acetyl-Transferase codiert, (Gorman C. in Mol. Cell. Biol. 2,1044 [19821); eukaryontische Gene: Gene, die für Thymidinkinase codieren (Wigler M. u.a. in Cell 11, 223 [1977]). Das dritte eukaryontische DNA-Strukturprinzip, das die Expression eines interessierenden clonierten Gens erlaubt, ist eineiromotorsequenz, die entweder konstitutiv oder induzierbar sein kann (z. B. konstituier Promotor: Simian 40 Virus oder Rous-Sarkom-Virus (Mulligan R.C. u.a. in Science209,1422 [1980], Lalmons L u.a. in Proc. Natl. Acad. Sei. USA79,6453 [1982]); induzierbarer Promotor: Viruspromotor des Milchdrüsentumors bei der Maus (Chapman A. B. u. a. in Mol. Cell. Biol. 3,1421-1429, Hitzeschock-Proteinpromotor (Pelham I-'. u.a. in EMBO J. 1,1473 [1982]), MetaUothionein-Promotor (Mayo K. u.a. in Cell 29,99 [1982), Karin M. u.a. in Nature 299,197 [1982]).

Ein Weg, relativ große Mengen des löslichen Teiles des Fc_c-Rezeptorproteins in höheren Eukaryonten zu erhalten, besteht darin, den löslichen Teil des Fc_c-Rezeptorgens an de ι SV-40-Promotor (konstitutiv) zu „annealen" und dieses Hybridgen in ein Plasmki zu clonieren, das das für die Dihydrofolatreiiuktase (dhfr) codierende Gen enthält. Unter selektivem Druck wird die Anzahl der dhfr-Gene und der Nachbar-DNA-Sequenzen bis zu tausendmal erhöht, wodurch nicht nur die Ausbeute des dhfr-Gens sondern auch die des löslichen Teils des Fc_c-Rezeptors steigt (EP-A-O 093619).

i) Der erfindungsgemäß hergestellte präparierte Human-FCt-Rezeptor mit niedriger Affinität, vorzugsweise dessen wasserlöslicher Teil, der etwa b«! Aminosäure 50 des vollständigen Fc_E-Rezeptors beginnt und bis etwa 150 reicht, eignet sich für die Behandlung cder Prophylaxe von lokalen und allergischen Reaktionen, die durch IgE induziert werden und kann in geeignete pharmazeutische Zusammensetzungen wie beispielsweise Lösungen oder Sprays eingearbeitet werden. Die als Vergleichsplasmide (siehe Fig.21) eingesetzten Plasmide pANFc_E R-1 und pANFc_c R-2 werden folgendermaßen hergestellt: Das Plasmid LE392 oder pGEM4 (pFc_c R-D (siehe Fig. 17) wurde mit Hind III und EcoR I digeriert. Das isolierte cDNA-Fragment, das mit Nucleotid 584 beginnt und in Fig. 17 dargestellt wird, wurde in ein mit Hind III und EcoR I digeriertes pGEM 4 cloniert. Eines der selektionierten Clone wurde vermehrt und als pANFc_c R-1 bezeichnet.

Das erwähnte Plasmid LE392 odet pGEM4 (pFc_t R-1) wurde mit EcoRI digeriert, und ein Fragment, das die volle Länge der Fc_cR-cDNA von ~ 1,7 Kbp enthielt, wurde gewonnen. Das gewonnene EcoR I-Fragmen; wurde anschließend mit Sau 3 A partiell digeriert, um die cDNA-Sequenz zu entfernen, die für die vermutliche Zytopldsmadomäne codiert, z. B. für die Aminosäuren 1 bis 23, und ein cDNA-Fragment, das mit dem Nucleotid 254, wie in Fig. 17 gezeigt, beginnt, wurde gewonnen, das mit einem palifidromischen 26mer-Linker der Formel

ö'-GATCTGAGTCATGGTACCATGACTCA-S'

ligiert wurde, um ein ATG-Start-Codon am 5'-Ende und eine Kpn I-Restriktionsstelle wiederherzustellen. Das so gewonnene ligierte Fragment wurde mit KpnI digeriert und in mit KpnI und EcoRI digeriertem pGEM4 cloniert. Es wurden nur diejenigen Clone durch Koloniehybridisierung selektioniert, in denen die Region für die vermutliche Zytoplasmadomäne fehlte. Ein Clon wurde selektioniert und vermehrt und als pANFc_t R-2 bezeichnet.

Die Erfindung soll an den folgenden Beispielen, die nicht erschöpfend sind, an Hand der Zeichnungen veranschaulicht werden. In den zugehörigen Zeichnungen zeigen:

Fig. 1: die aus NP-40-Detergens-solubilisierten RPMI-8866-Zellen und serumfreien Kulturüberständen (0 0) abgeleitete

FCfAktivität, Zellysat des Kulturüberstands (Δ Λ).

Fig.2: den Immunoaffinitäts-gereinigten löslichen Fc_tR. Irnmunoaffinitäts-gereinigter löslicher Fc_cR, der aus P.PMI-8866-Kulturüberständen abgeleitet war, wurde unter nichtreduzierenden Bedingungen durch NaDodSOj/PAGE analysiert. Nach der Elektrophorese wurden 4 mm breite Streifen geschnitten, zerkleinert und über Nacht bei Raumtemperatur in Lysepuffer eluiert.

Die Fc_cR-Aktivität wurde durch eine ELISA-Methode mittels zweier spezifischer monoclonaler Antikörper bewertet.

Fig.3: die Reinigung von wasserlöslichem Fc_cR. Serumfreie Kulturüberstände von RPMI-8866-Zellen wurde auf Amicon YM10 200fach konzentriert, sequentiell präadsorbiert auf BSA-Sepharose, Transferrin-Sepharose, NMIg-Sepharose, gefolgt von einer spezifischen Immunoaffinitätschromatographie auf 3-5-Sepharose. Das Eluat wurde auf HPLC-C- 1-Säule aufgetragen und mit einem linearen Gradienten von Acetonitril von 0-65%, 0,1 % Trifluoressigsäure enthaltend, eluiert. Die Fc_cR-Aktivität enthaltenden Fraktionen werden durch Schraffur angegeben.

Fig. 4: den gereinigten wasserlöslichen Fc_c-Rezeptor mit einer Molekülmasse von etwa 25 kd. Der gereinigte lösliche Fc₁R wurde durch SDS-PAGE-Analyse untersucht. Es wird eine Fotografie des Silber-gefärbten Gels gezeigt.

Fig.5: die Peptidkarte des wasserlöslichen Fc_£R nach der Lysylendopeptidase-Digestion, die nach der extensiw.i Präadsorptions-Immunoaffinitäts-Chromatographie und HPLC gewonnen wurde.

Fig.6: die FACS-Analyse von L-Zell-Transformanten. Die beiden unabhängigen L-Zell-Transformanten, L-V-8-30 (A) und L-VI-8-30 (B) wurden mit biotinisiertem Kontroll-Antikörper-Human-lgG (a, d), Human-lgE (b, e) und Anti-Fc_tR 8-30 (c, f) gefärbt und mit FITC-Avidin entwickelt. Ungefärbte Zellen wiesen das gleiche Muster wie die mit Kontroll-Antikörpern gefärbten aus (a und d) auf, die x-Achse und die y-Achse stellen die log Fluoreszenzstärke bzw. die relative Zellanzahl dar. Fig.7: Strategie der cDNA-Clonierung

Sonde II

7 U

Sonde I

Zellulare DNA aus RPMI 8866 Kulturüberstand aus RPMI 8866

Transfektion Reinigung

Ltk" Zellen gereinigter löslicher Fcj.R I FACS-Sortierung

-Transformant Aminosäurensequenzen I L-Zellen

cDNA

J,

Synthetische Oligonucleotide (17mer)

Transformanten-8pezifische cDNA

RPMI 8866 -» mRNA-> Zellen

cDNA-Bibliothek

Koloniehybridie· sierung

cDNA-Clon für Fc^R

Fig.8: das EcoRI-lnsert im Plasmid pDE2, als pDE2-Fc_cR-1-Vektor bezeichnet.

Fig.8': die Expression von Fc_tR-cDNA in transfizierten Cos-7-Zellen. Die transfizierten Cos-7-Zellen wurden mit Phycocyaninkonjugiertem Anti-Fc_cR-Antikörper (3-5) und biotinisiertem IgE gefärbt, mit FITC-Avidin entwickelt und durch Doppel-Laser-FACS analysiert; a) Zellen, die mit Human-IFN-ß-cDNA enthaltendem pDE 2 transfiziert wurden; b) mit pDE-2-Fc_cR-1 transfizierte Zellen. Konturbilder stellen die korrelierte Expression von zwei Oberflächendeterminanten dai, indem Peaklir.ien, die den gleichen Prozentsatz Zellen einschließen, mit den beiden Parameter-Verteilungen gezeigt werden, x-Achse und y-Achse stellen

die grünen bzw. roten log Fluoreszenzstärken dar.

Fig.9: das EcoRI-lnsert im Plasmid pGEM-4.

Fig.9': die Expression einer Fc_cR-cDNA in Xenopus-Oozyten. Die mit mRNA-Transkript von pFc_cR-1, Kontroll-mRNA oder mit mRNA aus 8866-Zellen injizierten Oozyten wurden 2 Tage lang inkubiert und lysiert. Die Fc_cR-Werte in den Lysaten wureen durch

ELISA gemessen.

Fig. 14-16: 1 — löslichem Fragment, 2 — Klenow-Auffüllung Fig. 17: 1—Schema von pcFc_tR-1 Fig.18: 1—Aminosäuren Fig.19: Schema von psFc_tR-1 Fig.20: Schema von pBSF2-L8

Fig.21: Xenopus-Oozyten wurden mit mRNA-Transkripten von pFCtR-1, ρΔΝ-FccR-i, pAN-Fc_cR-2 und psFc_cR-1 injiziert. Nacli zweitägiger Inkubationszeit wurde die Fc_cR-Aktivität in PBS-Lysat, NP-40-Lysat und im Kulturüberstand durch eine ELISA-Methode unter Verwendung der Anti-Fc_tR-Antikörper 3-5 und 8-30 bestimmt.

Fig.22: die IgE-Bindung des löslichen Fc_tR, abgeleitet aus mit psFc_cR-1-mRNA injizierten Oozyten. Der Kulturüberstcnd dieser Oozyten wurde auf der mit Antikörper 3-5 beschichteten Platte inkubiert, es schloß sich Human-lgE und schließlich AP-Anti-lgE

Fig.23: die Inhibition der IgE-Rosettenbildung. Überstände oder Kontrollüberstände aus Oc^yten, die mit psFc_cR-1-mRNA injiziert waren, wurden mit Human-lgE-beschichteten ORBC und SKW-C 14-Zellen (Exp.1l) und RPMI-8866-Zellen (Exp. I und III) inkubiert. X-Achse und y-Achse stellen die Anzahl der an Zellen gebundenen ORBC bzw. die relative Anzahl der

iosettenbildenden Zellen dar.

Fig. 24: dieSDSA-PAGE-Analyseder NP-40-Lysate und Kulturüberstände der Oozytenexpression von pFc_tR-1, pAN-Fc_cR-1,

pAN-Fc_cR-2 und psFc_cR-1. Der Molekülmassenmarker ist links angegeben.

Allgemeine Materialien und Methoden:

Die monoclonalen Anti-FccR-Antikörper 3-5 (γι) und 8-30 (μ) wurden durch Hybridisierung von P3U1 -Myelom mit Milzzellen von Balb/c-Mäusen, die mit RPMI-8866-Zellen (siehe EU-PA Nr. 86110420.6 des gleichen Anmelders, eingereicht am 29. Juli

1986) immunisiert worden waren, hergestellt. Der Antikörper 8-30 erkennt das Epitop an der IgE-Bindestelle von Fc_cR und kann die Bindung von IgE an lymphobiastenartige 8866-Zellen blockieren. Der Antikörper 3-5 erkennt ein anderes Epitop auf Fc_cR und kann die IgE-Bindung an seine Rezeptoren nicht wirksam blockieren. Diese Antikörper präzipitieren 46-kd- und 25-kd-Polypeptide unter reduzierenden und unter nicht-reduzierenden Bedingungen. Die monoclonalen Antikörper wurden von der Aszitesflüssigkeit gereinigt durch 50%ige gesättigte Ammoniumsulfatpräzipitation und anschließender Gelfiltration unter Verwendung von Sepharose 6B (Pharmacia Fine Chemical, Uppsala, Schweden) für IgM-Klasse oder Ionenaustausch-Chromatographie unter Verwendung von QAE-Sephadex (Pharmacia Fine Chemical) für IgG 1. Das polyclonale Maus-IgG wurde auf die gleiche Weise isoliert. Das Anti-Maus-IgM-alkalische-Phosphatase-Konjugat wurde von Tago (Burlingame, Kalifornien) bezogen.

Die Umkehrphasen-HPLC wui 1e mittels eines Waters-HPLC-Systems mit einer Säule Hi-Pore, RP-304 (250 χ 4,6mm) (Bio-Rad) durchgeführt. Der Immunoaffinuäts-gereinigte Fc_cR wurde auf die Umkehrpiiasen-Säule, die mit 0,1 % Trifluoressigsäure enthaltendem Wasser ausbalanciert war, gegeben und mit einem linearen Gradienten von 0,1 % Trifluoressigsäure (TFA) enthaltendem Acetonitril eluiert. Eine Durchflußgeschwindigkeit von 0,5 ml/min und ein linearer Gradient (von 0% bis 65% in 60 Minuten) von Acetonitril wurde angewandt. Das eluierte Material wurde eingefroren und lyophilisiert, bevor seine Aktivität durch ELISA getestet wurde

NaDOdS(VPAGE

Rohe, Irr.munoaffinitäts-gereinigte und HPl C-gereinigte Fraktionen von Fc_cR wuiden durch Elektrophorese auf einem 1-%-NaDodSGv10%-Polyacrylamid-Gel (Fig.4) analysiert und die Proteine wurden bestimmt durch Silberfärbung mittels Daiichikagaku-Silber-Färbung (Daiichi-Kogaku, Tokio). Zur Messung der Fc_tR-Aktivität wurde das Gel nach der Elektrophorese in 4mm starke Scheiben geschnitten, zerkleinert mit Lysepuffer über Nacht bei Raumtemperatur unter Schütteln eluiert, das eluierte Material wurde nach der Zentrifugierung gesammelt und durch ELISA auf Aktivität getestet.

Die Enzymreaktionen wurden mittels Standardprotokolle (siehe Molecular cloning — a laboratory manual, (Molekularclonierung — ejn Handbuch für das Labor), T.Maniatis u.a. (1982), Hrg. Cold Spring Harbour oder nach den Anweisungen des Zulieferers durchgeführt. Die Restriktionskarten der beschriebenen Plasmide und die Reaktionsschemata sind nicht maßstabsgerecht gezeichnet. Die Oligodesoxynucleotide wurden mittels eines Applied-Biosystem-DNA-Synthesizers Modell 381A synthetisiert und durch Polyacrylamidgel-Elektrophorese (12% Acrylamid, 0,6% Bisacrylamid, 8M Harnstoff, 1 χ TBE-Pu^ffer) Elution und Entsalzung mittels einer Sephadex-G-25-Säule gereinigt.

Beispiel A Herstellung des Plasmids pY-JDB-HulFNOmega 1

a) Herstellung des Hefe-ADHI-Promotor-Fragmentes

80 pg des Plasmids pES 103 in 500μΙ wurden mit BamHI und XhoI digeriert. Das etwa 1450 Basenpaar (bp) lange Promotorfragment wird auf einem 1%igen Agarosegel vom Vektor getrennt, durch Elektroelution aus dem Gel isoliert und präzipitiert. Das Fragment wurde in 40 μΙΤΕ-Puffer (1OmM Tris, ImMEDTA, pH 8) suspendiert. — Das verwendete pES 103 wurde durch Insertion des etwa 1450bp langen BamHI-Xhol-Fragmentesvon Plasmid AXa11 (siehe G. Ammerer in Methods Enzymology 101,192-201 11983]) in pUC18 (siehe Pharmacia P-L, Ni.27-4949-01) hergestellt.

b) Herstellung des Vektors pJDB 207

10pg pJDB 207 in 100μΙ Lösung werden mit BamHI geschnitten und dabei linearisiert. Um die Re-Liga ion zu inhibieren, werden die 5'-terminalen Phospiiatgruppen durch Behandlung mit Kälberdarm-Phosphatase (CIP) entfernt. De lineare Form wird vom restlichen nicht-digerierten Plasmid auf einem 1%igen Agarosegel getrennt, durch Elektroelution isoliort und präzipitiert. Die präzipitierte Vektor-DNA wird in 20 μΙ TE-Puffer gelöst.

c) Expressionsvektor für IFN-Omega 1

50pg des Plasmid pRHW12 (siehe EP-A-0.170.204) in 600μΙ Lösung werden durch Spaltung mit Hindlll linearisiert. Die entstandenen versetzten Enden werden durch Zugabe von Klenow-Fragment der DNA-Polymerase 1(10 Einheiten) und jt 25μΜ der vier Desoxynucleosidtriphosphate und durch Inkubation bei Raumtemperatur in glatte Enden verwandelt. Die lineare Form wurde durch Elektrophorese auf Agarosegel und anschließende Isolierung gereinigt. Das Fragment wurds in 50μΙ TE-Puffer suspendiert.

Um mit dem Promotorfragment verträgliche Enden zu erhalten, wurde ein Xhol-Linker an die Enden des linearen pRHW12 angefügt. 3μ! Xhol-Linker (0,06OD_2Mnm, Pharmacia P-L, Nr.27-7758-01, Formel d lOCTCGAGGl) in 20μΙ Lösung werden mittels 5 Einheiten T4-Polynucleotidkinase und rATP phosphoryliert. Nach Inaktivierung des Enzyms durch Erwärmen auf 70^cC für 10 Minuten werden 5μΙ dieser Lösung mit 10μΙ des linearen pRHW 12 zusammengenommen und in insgesamt 20μΙ Reaktionslösungsmittel T4-DNA-Ligaseligiert (16 Stunden bei 14'C). Die Ligase wird anschließend durch Erwärmen duf 70 C für 10 Minuten inaktiviert und das Reaktionsvolumen wird mit 1 χ Mediumpuffer (1OmM Tris, pH 7,5,5OmM NaCI, 1OmM MgCI₂) auf 150μΙ aufgefüllt. Die Xhol-spezifischen, klebrigen 5'-Enden werden durch Behandlung mit 100 Einheiten Xhol erzeugt. Das lineare pRHW12 mit Xhol-Enden wird durch Elektrophorese auf Agarosegel gereinigt und aus dem Gel elektroeluiert. Vor der Präzipitation werden 5μΙ Promotorfragment laus Teil a|) zugegeben. Nach der Präzipitation wird die DNA in 14,5μΙ TE-Puffer suspendiert, Ligasepuffer und 5 Einheiten T4-DNA-Ligase werden zugegeben und die Ligation wird 16 Stunden lang bei 14C durchgeführt. Nach der Enzyminaktivierung wird das Volumen auf 200μΙ aufgefüllt und die DNA wird mit Hilfe von BamH I gespalten. Die DNA wird durch Reinigung auf Agarosegel gewonnen und in 20 μΙ TE-Puffer gelöst.

d) Ligation der Fragmente

Der endgültige Expressionsvektor wird durch Behandlung von 5μΙ der BamH I-Fragmente (Promotor und IFN-Omega 1-Gen) mit 1 μΙ de= linearisierten pJDB207-Vektors (Hefe 2 μ Terminator und Hefe 2 Ursprung der Replikation, Leu 2 Marker, E.coli Ursprung der Repükation, Ampicillinresistenzgen) in 10μΙ Lösung in Gegenwart von 1 Einheit T4-DNA-Ligase gewonnen.

e) Transformation

10μΙ von kompetenten E.coli HB101-Zellen wurden durch Zusatz von 5μΙ Ligaselösung transformiert und auf LB-Agar, der 100μg/ml Ampicillin enthielt, gegeben. 12 der entstandenen Clone wurden selektioniert und die Plasmide wl rden isoliert. Nach dem Schneiden der Plasrnide mit verschiedenen Restriktionienzymen und Elektrophorese auf Agarosegel wjrde ein Plasmid ausgewählt, das den korrekten Aufbau aufwies; es wurde ? Is pY-JDB-HUIFN-Omega 1 bezeichnet.

Beispiel B Konstruktion des Expressionsplasmids pRH 100

7pg des Plasmids pER 103 (siehe Eva Dworkin-Rastl u.a., Gene 21,237-248 (1983] und EP-A-0.115.613) wurden in 50μΙ des Reaktionsmediums mit der Restriktionsendonuclsase Hind III linearisiert. Nach einstündiger Inkubation bei 37⁰C wurden 50 μΙ 2 χ ClP-Puffer zugegeben (2 χ ClP-Puffer = 2OmMTHs, pH = 0,2 mM EDTA). Nach der Zugabe von 2 Einheiten alkalischer Phosphatose aus Kälberdarm (CIP) wurden die 5'-termina!en Phosphatreste entfernt; die Inkubation erfolgte 30 Minuten lang bei 45°C. Die Reaktion wurde durch die Zugabe von 4μΙ 0,5 EDTA-Lösung und die Zugabe von 10μ11 MTris, pH = 8,0, beendet. Die Proteine wurden durch zweimalige Extraktion mit Phenol und einmal mit Phenol/Chloroform entfernt. Die DNA wurde nach Zugabe von 0,1 VoI 3 M Natriumacetatlösung pH 5,5 und 250μΙ Ethanol aus der wäßrigen Phase präzipitiert und das DNA-Präzipitat wurde nach dem Zentrifugieren einmal mit 70%iger Ethanollösung gewaschen. Die DNA wurde getrocknet und das Pellet wurde dann in 20plTE-Puffer (1OmM Tris, pH = 8,01,1 mM EDTA) gelöst.

Ι-μΙ-Portionen der synthetischen OligodesoxynucleotidedlAGCTTAAAGATGAGCT) und d(CATCTTTA) wurden in 10μΙ der Reaktionslösung unter Zusatz von 10 Einheiten T4-PNK (Polynucleotidkinase) und 1 mM rATP phosphoryliert. Die Reaktion fand bei 37°C statt und dauerte 45 Minuten. Oie Reaktion wurde durch zehnminütiges Erwärmen auf 7O⁰C gestoppt.

5μΙ der Plasmidlösung und des phosphorylierten Oligonucleotids wurden miteinander vermischt und 5 Minuten lang auf 70°C erwärmt. Die Lösung wurde anschließend auf O⁰C abgekühlt und 2μ110 χ Ligasepuffer (50OmM Tris, pH = 7,5), 10OmM MgCI₂,

20OmM DDT (Dithiothreitol), 1 mM rATP, 500pg/ml BSA (Rinderserumalbumin), 2μΙ Wasser und'iO Einheiten T4-DNA-Ligase wurden zugegeben. Die Reaktion dauerte 40 Stunden und wurde bei 4°C durchgeführt. Sie wurde durch zehnminütiges Erwärmen auf 70⁰C gestoppt.

2μΙ dieser Ligasereaktion wurden in insgesamt 30μΙ Lösung mit 10 Einheiten Restriktionsendonuclease Sacl (New England Biolabs) 3 Stunden lang bei 37⁰C digeriert. Die Reaktion wurde durch zehnminütiges Erwärmen auf 7O⁰C gestoppt. 5μΙ dieses Reaktionsgemische wurden in insgesamt 30μΙ durch Zugabe von 10 Einheiten T4-PNK 16 Stunden lang bei 14°C ligiert.

200μΙ von kompetenten E.coli HB101 wurden mit 10μΙ dieser Ligasereaktion gemischt. Die Bakterien wurden 45 Minuten lang auf Eis gehalten und anschließend 2 Minuten lang auf 42°C zur DNA-Aufnahme erwärmt. Die Bakteriensuspension wurde weiter 10

Minuten bei O⁰C inkubiert. Schließlich wurden die transformierten Bakterien auf LB-Agar, das 50pl/ml Ampicillin enthielt, gegeben.

12 der Bakterienkolonien wurden zufällig ausgewählt und die Plasmide daraus wurden anschließend im Mikromaßstab isoliert (siehe Birnboim u.a., in Nucl. Acids Res. 7,1513-1523 (1979)). Die entstandene DNA wurde mit der Restriktionsendonuclease Sacl geschnitten, und die DNA wurde auf einem Agarosegel (1%, 1 χ TBE-Puffer) getren it. Die Migration der DNA als ein lineares 4,400pb Molekül betätigte daß eine Sac I-Erkennungsstelle in das Plasmid eingebaut worden war. Eines dieser Plasmide wurde nach dem Zufallsprinzip ausgewählt. E.coli HB101 wurde erneut mit der DNA aus dem entsprechenden Mini-Präparat transformiert. Aus den entstandenen transformierten Bakterien wurde eine Kolonie selektioniert, die man bis zu einem größeren Maßstab wachsen ließ. Das daraus isolierte Plasmid wurde mit dem Restriktionsendonucleasen EcoR I und BamH 1 geschnitten, die DNA wurde auf einem 1%igen Agarosegel getrennt, und das kleinere Fragment wurde durch Elektroelution aus dem Gel isoliert. Dieses EcoRI-BamHI-DNA Fragment von etwa 460 bp Länge wurde nach Sanger (siehe Sanger u.a. in Proc. Natl. Acad.

Sei 74,5463-5467 (19771) sequenziert. Das auf diese Weise analysierte Plasmid wurde als pRH 100 bezeichnet.

Beispiel C

Konstruktion des Plasmids pANFc_cR-1

10pg pFc_cR-1-DNA wurden mit 20 Einheiten Hindlll in 50μΙ eines Medium-Salzpuffers (1OmM Tris-HCI, pH7,5,1OmM MgCI₂, 1mM DDT) 1 Stunde lang und danach mit 20 Einheiten EcoR I in 100μΙ eines stark salzhaltigen Puffers (10OmM NaCI, 5OmM Tris-HCI, pH7,5,1OmM MgCI₂,1 mM DDT) 1 Stunde lang digeriert, um das Hind lll-EcoRI-Fragment zu gewinnen, das eine 1 kbp lange Region der löslichen Fc_cR-cDNA enthält (siehe Fig. 17: Startnucleotid 584). Die digerierte DNA wurde einer 1%igen präparativen Agarose-Elektrophorese unterzogen und die etwa 1 kbp langen Hind IH-EcoR I-Fragmente wurden aus zerkleinerten Gelen elektroeluiert und in 70%igem Ethanol bei - 80^cC 1 Stunde lang präzipitiert. 1 pg pGEM 4 (Promega Biotec) wurde wie oben beschrieben mit 2 Einheiten Hindlll und 2 Einheiten EcoRI digeriert, mit Phenol extrahiert und 1 Stunde bei -80'C mit Ethanol präzipitiert. Das durch Hindlll-EcoRI-Fragment und Hindlll-EcoRI digerierte pGEM4 wurde mit 200 Einheiten/T4-Ligase in 10μΙ eines Ligationspuffers (5OmM Tris-HCI, pH7,4,1OmM MgCI₂,1OmM DDT, 1 mM Spermidin, 1 mM ATP, 0,1 mg/ml BSA) 16 Stunden bei 4^CC inkubiert und in E.coli (MC 1065) transfiziert. Ein Clon wurde selektioniert, vermehrt und nach Betätigung seiner Konstruktion als pANFc_cR-1 bezeichnet.

Beispiel D

Konstruktion des Plasmids pANFc_cR-2

200pgpFc_cR-1 wurden mit 400 Einheiten EcoR I in 200 μΙ eines stark salzhaltigen Puffers 2 Stunden bei 37 C digeriert und wurden dann einer Elektrophorese auf einem 1%igen präparativen Agarosegel unterzogen. Ein etwa 1,7kb langes EcoRI-Fragment wurde elektroeluiert und bei -80"C 1 Stunde lang mit Ethanol präzipitiert. 4pg des Fragmentes wurden bei 37"C 3 Stunden lang mit 10 Einheiten Accl in 40μΙ eines wenig salzhaltigen Puffers digeriert und bei 37⁼C 20 Minuten lang mit 0,4 Einheiten Sau 3A partiell digeriert, mit Phenol extrahiert und mit Ethanol präzipitiert, um das Sau 3 A-EcoR I-Fragment (siehe Fig. 17: Startnucleotic! 254) zu gewinnen. Das DNA-Fragment wurde an 1,7pg synthetischen Linker (5'-GATCTGAGTCATGGTACCATGACTCAGATCGTGCTG-S') mit 200 Einheiten T4/Ligase in 10μΙ eines Ligationspuffers 16 Stunden bei 4 ⁰C ligiert, anschließend mit Phenol extrahiert und mit Ethanol präzipitiert. Die Fragmente wurden gelöst, 3 Stunden bei 37 "C mit 24 Einheiten Kpnl in 40μΙ eine? wenig salzhaltigen Puffers digeriert, mit Phenol extrahiert und mit Ethanol präzipitiert. Die überschüssigen Linker wurden durch Gelchromatographie mit einer Biogel-A50m-Säule entfernt. Die Fragmente wurden mit Ethanol präzipitiert.

Getrennt wurden 1 μ$ pGEM4 mit 8 Einheiten Kpn I in 20 μΙ eines wenig salzhaltigen Puffers 2 Stunden lang bei 37 C digeriert und anschließend mit8 Einheiten EcoRI in 40μΙ eines stark salzhaltigen Puffers 2 Stunden lang bei 37^CC inkubiert. Die zuvor an synthetische Linker ligierten Fragmente wurden dann an durch Kpn l-EcoR I digeriertes pGEM 4 durch Inkubation mit 200 Einheiten T4-Ligase in 10(il eines Ligationspuffers bei 4C 16 Stunden lang iigiert und in E.coli (MC 1065) transfiziert. Mittels Koloniehybridisierung wurde das Clon püNFc_cR-2, dem nur eine Zytoplasmadomäne fehlt isoliert und vermehrt.

Beispiel 1

a) Isolierung von Roh-Fc_tR aus dem Kulturüberstand

RPMI-8866-Zellen wurden in RPM11640-Medium, das mit 10% fötalem Kälberserum und Antibiotika (100 Einheiten/ml Penicillin und ΙΟΟμς/ΓηΙ Streptomycin) ergänzt war, bei einer Dichte von 1 χ 10⁶ Zellen/ml und einer Zellebensfähigkeit von 95-99% in Spinner-Flaschen kultiviert. Di« Zellen wurden nach 15minütiger Zentrifugation bei 5000U min"' geerntet, dreimal mit Hanks BSS gewaschen und 48 Stunden bei der gleichen Dichte in serumfreien Medium in Spinner-Flaschen kultiviert. Der Kulturüberstand wurde gesammelt und mit Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) (1 mM), 0,02% Natriumazid (NaN₃) und 200 Einheiten/ml Aprotenin ergänzt. Die Kulturüberstände wurden während der Konzentrierung bei 4°C gehalten. Die Konzentrierung der RMPI-8866-Kulturüberstände erfolgte mit einem Amioon-Filtersystem mittels eines DIAFLO-YM10-Filters. Das 2U0- . 300fach konzentrierte Material wurde anschließend 40 Minuten bei 4°C und 85000 x G zentrifugiert, um das - lösliche Material ο entfernen, wobei das Roh-FccR-Präparat gewonnen wurde.

b) Isolierung von Fc_cR aus ZellLysaten

RPMI-8866-Zellen (2 χ 10⁹ Zellen) wurden viermal mit PBS gewaschen und in 10ml Lysepuffer (0,5% Nonindet P-40 (NP-40] enthaltendes PBS) und 1 mM PMSF 45 Minuten lang auf Eis unter regelmäßigem Verwirbeln lysiert. Weitere 10 ml Lysepuffer wurden zugegeben, und die Lyse wurde weitere 30 Minuten fortgesetzt. Das Lysat wurde 45 Minuten bei 37000U min"¹ und 4⁰C zentrifugiert. Die Lipidschicht wurde sorgfältig entfernt und der Überstand wurde gesammelt und bei -7O⁰C aufbewahrt.

Beispiel Immunoaffinrtätsreinigung

Kulturüberstandkonzentrat (siehe Beispiel 1 a), das 5 bis 10 Litern Kultur entsprach, wurde sequentiell auf 2 ml BSA-Sepharose-Gelen, Human-Transferrin-Sepharose-Geler: und Normaler-Maus-lg-(NMIg)-Sepharose-Gelen eine Stunde bei jeweils 4°C unter Rotation absorbiert. Der aus dem letzten Immunoaffinitätsgel gesammelte Ablauf wurde anschließend auf 2ml Anti-Fc_cR (3-5), der an Sepharose gekoppelt war, gegeben. Die Immunoadsorption ließ man bei 4°C unter Rotation zwischen 4 und 16 Stunden ablaufen. Das Gel wurde in eine Säule gegossen, der Ablauf wurde gesammelt, und das Gel wurde sequentiell mit 150ml Puffer A (Tris-HCI, 1OmM, pH 7,5, NaCI, 0,5 M, NP-40,0,5%), 150 ml Puffer B (Tris-HCI, 1OmM, pH 7,5, NP-40,0,1 %), 150 ml Puffer C (Tris-HCI, 1OmM, pH7,5) gewaschen und mit 25ml 2,5% Essigsäure (V/V) eluiert und sofort in Tris HCI, 2M, pH8,0, neutralisiert. Das Material wurde, falls es nicht sofort weite^r durch HPLC gereinigt wurde, bei -80⁰C aufbewahrt. Das Eluat wurde anschließend durch Umkehrphasen-HPLC auf einer C4-Säule bei einem linearen Gradienten von 0-65% Acetonitril, das 0,1 % Trifluoressigsäure enthielt, fraktioniert.

Beispiel? Enzymgebundener Immunoadsorptionsassay (ELISA)

Die Aktivität von Fc_cR wurde durch seine Fähigkeit, an die monoclonalen Antikörper 3-5 und 8-30 zu binden, gemessen und mittels eines enzymgebundenen Immunoadsorptionsassays mit zwei Antikörpern (ELISA) überwacht. Mikrotiterplatten mit 96 VcIi jfUi qen wurden zuerst mit dem monoclonalen Antikörper 3-5 (100Ml/Vertiefung)(10pg/ml) in Beschichtungspuffer (NaHCO₃ J,1M, pH9,6) beschichtet und über Nacht bei 4⁰C inkubiert. Die Platten werden anschließend viermal mit Spülpuffer, d.h. Dulbecco's, Phosphatpuffer-pH mit 0,05%Tween 20, gewaschen und anschließend wurden 100μΙ Testprobe, die mit Verdünnungspuffer (Tris-HCI 0,05M, pH8,1, MgCI₂1 mM, NaCI 0,15M, Tween 20 0,05% (V/V], NaN₃ 0,02%, BSA 1 %) verdünnt war, zugegeben. Die Mikrotiterplatten wurden 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert, viermal mit Spülpuffer gewaschen, und anschließend wurden 100 μΙ eines vortitrierten und verdünnten Ziegen-Anti-Maus-lgM-alkalisches-Phosphatase-Konjugat zugefügt. Die Platten wurden zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubiert und viermal mit Spulpuffer gewaschen. In der Endstufe wurden 100μΙ Substrat, p-Phenylphosphatdinaürium (1 mg/ml) in Substratpuffer (NaHCO₃ 0.05M, pH9,8, MgCI₂ x 6H₂0,1OmM) zugegeben, und die kolorimetrische Reaktion wurde zwei Stunden lang alle 30 Minuten bei 405 und 620nm gemessen.

Beispiel 4 Hydrolyse des Fc_e-Rezeptors mittels Lysylendopeptidase und Trennung von Peptiden

Der gereinigte Fc_cR wurde in 5OmM Tris-HCI-Puffer, pH, 9,5,6 Stunden lang bei 35°C bei einem Enzym-Substrat-Verhältnis von 1:500 (M/M) mit Achromobacter lyticus digeriert. Die lyophilisierten Peptidfragmente wurden durch HPLC gereinigt. Trennung der Peptide durch Umkehrphasen-HPLC

Die Trennung der Peptide erfolgte durch HPLC mittels einer C4-Säule auf einem Flüssigkeitschromatographen Hitachi 655, der mit einem Gradienten-Verarbeitungsteil 655-60 und einem Rheodyne-Probengeber mit einer Probenschleife von 100μΙ versehen war. Die Elution von Peptiden erfolgte mit einem linearen Gradienten von 2-Propanol!Acetonitril = 7:3 (V/V) von 0-35% inoiner Stunde und in 0,1 % Trifluoressigsäure bei einer Durchflußgeschwindigkeit von 1,0 ml/min. Die fraktionierten Peptide wurden manuell durch Beobachtung der optischen Dichte bei 215nm gesammelt

Aminosäureanalyse und Sequenzbestimmung

Die Aminosäureanalysen wurden mit einem Aminosäurenanalysegerät Hitachi 835-5 nach der Hydrolyse der Peptidfragmonte in 5,7HCI bei 110X in evakuierten, verschlossenen Röhren für 22-24 Stunden durchgeführt. Automatischer Edman-Abbau wurde mit einem 470-A-Proteinsequencer (Applied Biosystems, Inc. Kalifornien) mittels eines Standardprogramms zur Sequenzierung durchgeführt. Die Phtjnylthiohydantoin-(PTH)-Aminosäuren werden durch Umkehrphasen-HPLC mit isooratischer Elution (sieheTsunasawa u.a. in J. Biochem. 97,701-704(19851) bestimmt.

Es wurden die folgenden Aminosäuresequenzen nachgewiesen:

Met-Glu-Leu-Gln-Val-Ser-Ser-Gly-Phe-Val-,

Gly-Glu-Phe-Ile-Trp-Val-Asp-Gly-Ser-His-Val-Asp-Tyr-Ser-Asn-Trp-Ala-Pro-Glv-Glu-Pro-Thr-,

Lys-His-Ala-Ser-His-Thr-Gly-Ser-Trp-lle-Gly-Leu-Arg-Asn-Leu-Asp-Leu-Lys-und

Lys-Trp-Ile-Asn-Phe-Gln-.

Beispiel 5

Herstellung des Oligonucleotids der For.nel

3'-TtI ACC TAG TTp AAp GT-5¹ C _A G G

Das Oligonucleotid wurde mit einem ADI-Synthesizer auf dem 0,2-pMol-Niveau synthetisiert.

Das entstandene Oligonucleotid wurde mit Thioph.er.ol/Triethyiainin/Dioxan (1:2:2) bei Raumtemperatur innerhalb von 90 Minuten demethyliert und Methanol (10 κ 1 ml Methanol) gewaschen.

Nach Entfernung des demethylierten Oligonucleotids aus dem Glas mit gesteuerter Porosität (CPG) und der Abspaltung der Schutzgruppe mit konzentriertem Ammoniak innerhalb 1 Stunde bei Raumtemperatur und 16 Stunden bei 55⁰C, wurde das Oligonucleotid mit Hilfe von Speedvac⁸ getrocknet.

Die weitere Reinigung erfolgte über 20% Acrylamid/8 Mol Harnstoffgel mit TBE-Puffer (10,9g Tris [Hydroxymethyl]-aminomethan, 5,5g Borsäure und 9,3g Ethylendinitrilo-Tetraessigsäuredinatriumsalz in 11).

Die anschließende Gel-Elektrophorese (40cm x 25 χ 0,1 cm) wurde bei 50Watt durchgeführt, Das 17-mer-ßand wurde ausgeschnitten, mit Wasser eluiert und auf einer 0,9 χ 13cm großen Sephadex-G-25-Medium-Säule in Wasser entsalzen.

Die Fraktionen, die 17-mer enthielten, wurden zusammengenommen und getrocknet.

Ausbeute: 7,7 OD₂₆₀ (~ 285 pg).

Beispiele Aufstellen von Fc₁R⁺ L-Zelltransformanten

Eine Million Ltk" Zellen wurden mit 150 ng Herpes simplex virus, dsr von tk-Gen abgeleitet war, und 20 ^g Gorsorr; DNA mit hoher relativer Molekülmasse aus RPMI-8866-Zellen (siehe Wigler u.a. in Cell 16,777-785 (1978) co-transfizien. Nachdem die Zellen 10 Ta*ge in HAT-Medium aufbewahrt worden waren, wurden sie selektioniert. Gegenüber HAT resistente L-Zellen wurden gesammelt, mit biotinisiertem Anti-Fc_cR (8-30) und durch Fluorescein-Isothiocyanat (FITC)-konjugiertes Avidin gefärbt und durch FACS sortiert. Für jede Transfektion wurden mehrere Sortierzyklen vorgenommen. Zwei Transformantenlinien L-V-8-90 und L-VI-8-30 wurden aus unabhängigen Transfektionen gewonnen.

Beispiel 7 Clonierung von Fc_cR-cDNA

a. Sonde I: Die gesamte RNA wurde aus dem Fc_cR* L-Zelltransformanten L-V-8-30 durch die Guanidium/Caesiumchlorid-Methode (siehe Chirgwin u.a. in Biochemistry 18, 5294-5299 11979]) isoliert. Poly(a)^f RNA wurde durch oligo-dT-Cellulose· Chromatographie hergestellt. Radioaktiv markierte cDNA wurde aus poly(A)' RNA mit Hilfe von ³²P-dCTT (siehe Davis u. a. inProc. Natl. Acad. Sei. USA 81, 2194-2198 [1984]) synthetisiert. Die markierte cDNA wurde mit einem Überschuß an poly(A)* RNA von nirhttrgncfnrmierten I tk" Zellen „annealed" und auf eine Hydroxyapatit-Säule aufgetragen. Die einzelsträngige cDNA wurde gesammelt und als Sonde I benutzt.

b. Sonde II: Die 17-mer-Oligonucleotide, die komplementär zur mRNA-Sequenz sind, für das Äminossurefragment Lys-1 rp-lle-Asn-Phe-Gln codieren, ein Gemisch aus 24 möglichen Sequenzen enthielten, wurden mit y-^3:P-ATP durch T4-Polynucleotidkinase radioaktiv markiert.

Doppelsträngige cDNA wurde aus poly(AK HNA, die von RPMI-8866-Zellen abgeleitet war, mit Hilfe des Amersham- cDNA-Synthesesystems (Amersham, GB) (siehe Gubler und Hoffman in Gene 25, 263-269 [1983I) synthetisiert. Nach der Behandlung mit EcoRI-Methylase und T4-DNA-Polymei ass wurde die doppelsträngige cDNA, die langer als 1000 bp war, mittel? EcoRI-Linker in die EcoRI-Stelle von Agt 10 cloniert und mittels Gigapack in vitro (Vektorcloniersyoteme) verpackt. Es wurden zwei Sätze Replica-Filter von Phagenplaquos hergestellt. Ein Satz wurde mit ³²P-markierten, 17 Basen langen Oligonucleotiden (Sonde II) (siehe Wood u. a. in Proc. Natl. Acad. Sei USA 83,1585-158811985]) hybridisiert. Ein weiterer Filtersatz wurde mit ³²P-markierter substrahierter cDNA, die für FCcR-positive-L-Zellen (Sonde I) spezifisch ist, über Nacht in 6 χ SSC bei 68^CC hybridisiert und mit 0,1 x SSC und 0,1 % SDS 2 Stunden lang gewaschen. Die Plaques, die mit beiden Sonden hybridisierten, wurden isoliert.

Beispiel 8 Expression von Fc_cR-cDNA

a) Zur Expression von Fc_cR cDNA in pGEM4 mittels SP6-Promotor wurde mRNA mit SP6-RNA-Polymerase unter Verwendung von durch BamHI digerierten pFc_cR-1 als Matrize (siehe Melton u.a. in Nucl. Acids. Res 12,7035-7056 [1984]) synthetisiert. 10ng mRNA wurden in eine Oozyte injiziert und als negative Kontrolle wurde murine B3F-1 -mRNA in gleicherweise hergestellt und in eine andere Ouzyte injiziert.

Nach zweitägiger Inkubationszeit in Barth-Nährmedium bei 20°C wurden die Oozyten in 50 μΙ Lysepuffer (1OmM Tris-HCI, pH 7.5, 0,5 M NaCI, 0,5% NP40) lysiert. Die Oozytenlysate wurden auf Fc_tR-Aktivität mittels ELISA-Verfahren, bestehend aus einem „Sandwichverfahren und unter Verwendung von zwei Anti-FCcR-Antikörpern, 3-5 und 8-30, geprüft. Als eine positive Kontrolle wurde konzentrierter Kulturüberstand von RPMI-8866-Zellen verwendet.

b) Zur Expression von Fc_tR-cDNA in Cos-7-Zellen wurde das Insert von pFc_tR-1 in die EcoRi-Sieüe des pOE 2-Vektors cioniert (siehe JA Patentveröffentlichung 1986/88879 vom 7. Mai 1986). Cos-7-Zeilen ιό > IG") wurden einen Tag vor der Transfizierung auf 60-mm-Platten gesät. Die Transfizierung wurde mit 2ug Plasmid-DNA in 1 ml 25mM Tris-HCI (pH7,5), 137 mM NaCI, 5mM KC!, 0,6rnM Ma^HPO₄,0,5mM ΜπΠ_2/ OJmM CaCI₂ und 5QQug DEAE-Dextran (Pharmacia Fine Chemical) durchgeführt. Nach einstündiger Inkubation bei 37°C wurde die Lösung mit DMEM, das 10% FCS und 150μΜ Chlorochin enthielt, ausgetauscht, 3 Stunden bei 37⁰C inkubiert und anschließend mit 10% FCS enthaltendem frischem DMEM ausgetauscht. 48 Stunden später wurden die Zellen mit Phycocyanin-konjugiertem Anti-FCcR-Antikörper (3-5) und biotinisiertem IgE gefärbt, mit FITC-Avidin entwickelt und durch Doppel-Laser-FACS (siehe Kikutani u.a. in J. Exp. Med. in press [198G]) entwickelt.

Beispiel 9

Bestimmung der Nucleotidsequenz der Fc_t-RcDNA

Das Insert von pFc_cR-1 wurde mit Hindlll und Pvull-Restriktionsenzymen digeriert. Die digerierte DNA wurden in M 13 subclonisr'.

und sequenziert (siehe Sanger u. a. in Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74,5463-5467) und durch das Verfahren nach Maxam und Gilbert bestätigt (siehe Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74,560-564 [1977)).

Beispiel 10

»Northern blof-Analyse von Fc_tR-mRNA

3 Mikrogramm poly(A)' RNA aus verschiedenen Zellen wurden auf einem 1 % Agarosegel getrennt, auf Nitrozellulosepapier übertragen und mit einem pFc_cR-1 Insert aus einer „nick"-Translation (siehe Thomas u.a. in Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77, 5201-520511980)) hybridisiert. Für die BSF-1-lnduktion wurden einhundert Millionen B- oder "I'-Zellen 24 Ständen lang mit oder ohne 10pg/ml IgE und 50μ/ηηΙ Rtkombinant-Human-BSF-1 kultiviert (siehe Yokota u.a. in Proc. Natl. Acad. Sei. USA in Press [1986|)und 10pg der gesamten RNA wurden extrahiert und wie oben beschrieben durch „Northern blotting" analysiert.

Beispiel 11 Expression des wasserlöslichen Teiles von Human-Fc_t-Rezeptor mit niedriger Affinität in Hefe

Teil I:

Herstellung der Plasmide pJDB-244 und pJDB-245

a) Herstellung des Plasmids pRH 241, das den Hefe-ADHI-Terminator enthält: Vektorherstellung

10 μς Bluescribe M13* (Strategen, San Diego, Kalifornien 92121, USA) wurden mit je 20 Einheiten Sail und Sphl doppelt digeriert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 1 /25 VoI von 0,5 M EDTA (Ethylendinitrilteuaessigsäuredinatriumsalz) und zehnminütiges Erhitzen auf 7O⁰C beendet. Der ausgeschnittene Vektor wurde durch Agarosegel-Elektrophorese gereinigt (1 % Agarose, 1 χ TBE-Puf'dr: 6,05g/l Tris(hydroxylmethylaminomethan), 3,1 g/l Borsäure, 0,37g/l EDTA) 0,5pg/ml Ethidiumbromid enthaltend; Elektrophorese bei 4V'cm). Nach Lokalisierung der DNA-Bande mittels UV-Licht (254nm) wurde Oie DNA mit DE 81 -Papier elektroeluiert und abschließend durch eine Ethanolpräzipitation gereinigt. Die DNA wurde in 10μΙ TE (1OmM Tris, pH8,0,1 niM EDTA) gelöst

Insertherstellung

10pg pWS214S4 wurden mittels ;s 20 Einheiten Sphl und Sail digeriert. Das den ADHI-Terminator enthaltende kleinere Fragment wurde durch Agarosegel-Elektrophorese, Elektroelution und Präzipitation isoliert. Anschließend wurde die DNA in 10μΙ TE gelöst.

1 μ¹ Vektor-DNA und 1μΙ Insert-DNA wurden in 10μΙ Lösung mittels T4-DNA-Ligaseligieri, 3μΙ der Ligationslösung wurden zur Transformierung von E.coli JM101 (supE, thi, del(lacproAB), F'[traD36, proAB, laclq, lacZ-delM M) Lamda minus) verwendet. Einige der entstandenen Kolonien wurden nach der Ampicillinselektion bis zur Größe von 1 ml gezüchtet. Die Plasmide wurden isoliert (siehe Birnboim H. u.a. in Nucl. Acids Res.7,1513 (1979)) und mit Sphl und Sail digeriert. Die Fragmente wurden auf einem Agarosegel getrennt. Das Vorhandensein des ADHI-Terminatorfragments wurde durch ein etwa 340bp (Basenpaar) langes DNA-Fragment bestätigt. Eines der Plasmide wurde zur weiteren Verwendung selektioniert und als pRH241 bezeichnet (Restriktionskarte: siehe Fig. 10).

b) Herstellung dns den Hefe-ADHI-Promotor und den Hefe-ADHI-Terminator enthaltenden Plasmiöb pRH (siehe J. L. Bennetzen u.a. in J. Biol Chem. 257,3018-3025 119821):

Vektorherstellung

10μ9 pRH241 wurden mit EcoRI und Kpnl doppelt digeriert. Der Vektorteil wurde aus dem kleinen Fragment durch Agarosegel-Elektrophorese, Elektroelution und Präzipitation freigesetzt. Abschließend wurde er in ιΟμΙ TC gelöst. Insertherstellung

10_Mg des Plasmids pY-JDB-Hu-IFN-Orrega 1 (siehe Beispiel A und DE-PA P 3635867.3, eingereicht am 22. Oktober 1986) wurden mit Sphl geschnitten. Das 3'-überstehende Ende wurde durch Zusatz von 5 Einheiten E.coli-DNA-Polymerase I in Gegenwart von dGTP entfernt. Die DNA wurde weiter mit Xhol geschnitten, und die entstandenen Fragmente wurden durch Agarosegel-Elektrophorese, Elektroelution und Präzipitation isoliert. Das glatte Ende des 400 bp langen Fragmentes, das den ADHl-Promotor enthielt, wurde durch Ligation des Adaptorpaares umgewandelt:

EBI-410: 5' AATTGGAAGGATC 3¹ EBI-429: 3' CCTTCCTAG-p 5'

Das klebrige Ende des Restriktionsfragmentes wurde mit Hilfe des Adaptorpaares umgewandelt:

EBI-418: 5' p-TCGAGCACGTGGTAC 3' EBI-424: 3¹ CGTGCAC 5'

Nach der gleichzeitigen Ligation der beiden Adaptoren wurc"¹; das ADHI-Fragment erneui durch Agarosegel-tiektrophorese gereinigt. Die DNA wurde in 5μΙ TE gelöst.

1μΙ Vektor und 5μΙ Insert wurden in insgesamt 10μΙ Lösung mittels T4-DNA-Ligaseligiert. Durch Ligierung des Inserts in den Vektor werden die EcoRI- und die Kpnl-Stellen zerstört. 3μΙ der Ligationslösung wurden zur Transformierung von E.coli JM101 verwendet. Mehrere Kolonien wurden im Mikromaßstab auf die Anwesenheit eines Plasmids mit der gewünschten Konstruktion durch Restriktion der Piasmide mit verschiedenen Restriktionsenzymen untersucht. Ein Plasmid wurde selektioniert und als pRH242 bezeichnet (Restriktionskarte: siehe Fig. 11).

c! Herstellung des Plasmin« pRH243, das dan Hefe ADHI-Prornotor, ein für den Hefe-„mating"-Faktora (MFa) Loader-Peptid codierendes Gen (siehe J. Kurjan u.a. in Cell 30,933-943119821), eine Multiclonier-Stelle und den Hefe-ADHI-Terminator enthält:

Das MFa Leader-Peptid-Gen wurde chemisch durch Hefe-Codon-Nutzung synthetisiert (siehe J. L. Benetzen u.a. in J.Biol. Chem.

257,3026-3031 [1982]).

Vektorherstellung

1 μρ pRH 242 wurde mit Xhol und Xbal doppelt digeriert. Das Vektorfragment wurde durch Agarosegel-Elektrophorese, Elektroelution und Präzipitation gereinigt, die DNA wurde in 30μΙ TE gelöst.

lnsertherstellung

Mit Hilfe eines DNA Synthesizers Applied Biosystems 381A wurde ein Satz von 10 Oligodesoxynucleotiden hergestellt:

Name Sequenz

MF1 TCGAGCCTCATATCAATGAGATTCCCATCTATTTTCACTGCTGTTTTGTT (50mer)

MF2 AGCAGCGAACAAAACAGCAGTGAAAATAGATGGGAATCTCATTGATATGAGGC (53mer)

MF3 CGCTGCTTCCTCCGCTTTGGCTGCTCCAGTCAACACTACTACTGAAGACGAAACTGCTCAAATTCCAGCT (70mer)

MF4 CAGCTTCAGCTGGAATTTGAGCAGTTTCGTCTTCAGTAGTAGrGTTGACTGGAGCAGCCAAAGCGGAGGA (70 mer)

MF 5 GAAGCTGTCATCGGTTACTCTGACTTGGAAGGTGACTTCGACGTTGCT (48 mer)

MF6 GCAAAACAGCAACGTCGAAGTCACCTTCCAAGTCAGAGTAACCGATGA (48 mer)

MF 7 GTTTTGCCATTCTCCAACTCCACTAACAACGGTTTGTTGTTCATTAACACTACTATTGCATCG ATTGCT (69 m?r)

MF8 CCTTAGCAGCAATCGATGCAATAGTAGTGTTAATGAACAACAAACCGTTGTTAGTGGAGTTGGAGAATG (69mer)

MF9 GCTAAGGAAGAAGGTGTTTCTTTGGACAAGAGGCCTCTGCAGGAATTCT (49mer)

MFIO CTAGAGAATTCCTGCAGAGGCCTCTTGTCCAAAGAAACACCTTCTT (46mer)

6OpMoI jedes Oligonucleotids mit Ausnahme von MF1 und MF10 wurden in 5μΙ Lösung mittels T4-Polynucleotidkinase (PNK) phosphoryliert. Die Reaktionen wurden durch zehnminütiges Erhitzen der Proben auf 100⁰C gestoppt. 5 μΙ MF1 (60 pMol) und die MF-2-Lösung wurden zusammengenommen und ebenso wurden die Lösungen von MF3 mit MF4; MF5 mit MF 6; MF7 mit MF8 und 5μΙ von MF10 zur Lösung von MF9 gegeben. Die zusammengenommenen Lösungen wurden wiederum auf 100⁰C erhitzt und langsam auf Raumtemperatur abgekühlt. Nach diesem „annealing"-Schritt wurden die fünf Lösungen zusammengenommen, 20 Einheiten T4-Ligase wurden dazugegeben, und die Ligation wurde bei 14°C 1T Stunden lang durchgeführt.

Schließlich wurden Ο,δμΙ der Vektor-DNA und 7 μΙ der obengenannten Ligationsreaktion zusammengenommen und mit 5Einheiien T4-Ligase ligiert. E.cc¹: JM101 wurde mit 3μΙ dieser Ligationslösung transformiert. Die Plasmide mehrerer Kolonien wurden isoliert, mit Xhol und Xbal erfolgt eine doppelte Restriktion und anschließend wurde mit Agarosegel-Elektrophorese gereinigt. Diejenigen Plasmide, die ein Insert der erwarteten Größe (290 bp) enthielten, wurden durch Subclonierung des Inserts in M 13mp8 und Sequenzierung mittels der Didesoxyketten-Terminationsmethode nach Sanger weiter charakterisiert (siehe Sanger F. u.a. in Proc. Natl. Acad. Sei. 74,5463-5467 H977]). Ein das erwartete Insert (siehe Fiq. 12) enthaltende Plasmid wurde als pRH 243 bezeichnet (Restriktion iskarte: siehe Fig. 13).

d) Herstellung des Plasmids pRH 244, das den ADHI-Promotor, die Codiersequenz für das FccR-wasserlösliche Fragment und den ADHI-Terminator enthält (siehe Fig. 15):

lnsertherstellung

20μg pGEM 4-Fc_cR (Plasmid pGEM (Promega Biotec, Madison Wl 53711, USA], das das größere Hindlll-EcoRI-Fragmer.t der Fc_tR-cDNA enthielt) wurde mit je 40 Einheiten EcoRI und Hindlll geschnitten und die klebrigen Enden wurden mit Klenow-Fragment von E.coli-DNA-Polymerase I und den vier Desoxynucleosidtriphosphaten (dXTP's) aufgefüllt. Die DNA wurde mit 10 Einheiten Kälberdarmphosphatase (CIP, Boehringer Mannheim) dephosphoryliert, durch zwei Phenol/Chloroform-Extraktionen vom Protein befreit und auf einem Agarosegel getrennt. Nach der Elektroelution und Präzipitation wurde das Fragment, das die Codierregion des FCcR-v.asserlöslichen Fragmentes enthielt, in 10μΙ TE gelöst.

Da Hindlll die Fc_cR-cDNAetwa 50 bp „upstream" der ersten Aminosäure des löslichen Fragmentes (Met-150) schneidet, wird das Insert von pGEM 4-Fc_£R mi». Sau 3 A wieder ausgeschnitten. Dieses Verfahren entfernt nicht nur die 5'-Richtung, sondern auch die Nucleotide, die für die ersten 18N-terminalen Aminosäuren des löslichen Fragmentes codieren. Zwei Linker-Oligodesoxynucleotide der folgenden Formeln

5' TCGAGCTCATATACAATGG ATG GAA TTG CAA GTT TCC TCT GGT TTCGTT TGT AAC ACT TGT CCA GAA AAG TG

3' CGAGTATATGTTACC TAC CTT AAC GTT CAA AGG AGA CCA AAG CAA ACA TTG TGA ACA GGT CTT TTC ACC TAG

Sau3A

wurden synthetisiert, um das komplette Gen mittels Hefe-Codon-Nutzung der folgenden Formel wiederherzustellen

Met

Xhol

CGAGTATATGT TAC

VaI

155

Ser

G!y

Phe

VaI

160

As η

Thr

Cys

Pro

165

51 TCGAGCTCATATACA ATG

GTT

Ser

TCT

GGT

TTC

GTT

Cys

AAC

ACT

TGT

CCA

GIu

3'

Leu

CAA

TCC

AGA

CCA

AAG

CAA

TGT

TTG

TGA

ACA

GGT

GAA

TTG

GIn

AGG

ACA

CTT

AAC

CAA

GIu

GTT

GAA

CTT

Lys	Trp	3'
AAG	TG	5'
TTC	ACC TAG
	Sau3A

Je 25pMol der Oligonucleotide wurden miteinander „annealed" und zu etwa 3\ig Sau3A (ö'PhosphaO-EcoRI-laufgefüllt, dephosphoryliert)-Fragment gegeben und in insgesamt 20μΙ mittels T4-DNA-Ligase ligiert. Das entstandende Xhol-(EcoRI)-Fragment wurde durch Agarosegel-Elektrophorese, Elektroelution und Präzipitation gereinigt. Es wurde in 20 μΙ TE gelöst.

Vektorherstellung

ΙΟμΙ pRH242 wurden mit Xbal geschnitten und die Enden wurden durch Klenow-Auffüll-Reaktion glattendig gemacht.

Die DNA wurde mit Xhol wieder ausgeschnitten und das große Fragment wurde durch Agarosegel-Elektrophorese, Elektroelution und Präzipitation isoliert. Es wurde in 100 μΙ TE gelöst. 1 μΙ Vektor und 1 μΙ Insert wurden in insgesamt 10μΙ mittels T4-Ligase ligiert. (Die Ligation einer aufgefüllten EcoRI-Stelle an eine aufgefüllte Xbal-Stelle stellt sowohl die EcoRI- als auch die Xbal-Stelle wieder her.) 3μΙ der Ligationsieaktion wurden zur Transformierung von E.coli JM101 verwendet. Plasmide wurden aus mehreren Kolonien isoliert und auf die Anwesenheit von Fc_cR-wasserlöslichem Fragmenl-Gen unter Verwendung von mehreren Restriktionsenzymen untersucht. Eines der Plasmide wurde weiter selektioniert und das Xhol-Xbal-Fragment wurde partiell sequenziert, um die richtige Verbindung zwischen ADHI-Terminator und dem Human-Gen Λΐ bestätigen. Dieses Plasmid wurde als pRH244 bezeichnet (siehe Fig. 14).

e) Herstellung des Plasmids pRH 245, das den Hefe-ADHI-Promotor, das Hefe-„mating"-Faktor aLeader-Gen, das Gen für das Fc_cR-wasserlösliche Fragment und den Hefe-ADHI-Terminator enthält (siehe Fig. 15):

Vektorherstellung

10pg pRH 243 werden mit EcoRI und Stul doppelt digeriert. Das große Fragment wurde durch Agarosegel-Elektrophorase, Elektroelution und Präzipitation gereinigt. Abschließend wurde es in ΙΟΟμΙ TE gelöst.

insertherstellung

20μ wurden mit EcoRI und Hindill doppelt digeriert und dephosphoryliert. Das Insert wurde mit Sau 3 A wieder ausgeschnitten und das größere Fragment wurde isoliert. Zur Wiederherstellung der kompletten Codierregion für das lösliche Fragment der folgenden Formel

5' 3'

GIu Leu GAA "(TG CCT AAC

Met ATG TAC

3' 5'

VaI GTT CAA

Ser TCC AGG

Ser TCT AGA

GIy GGT CCA

Phe TTC AAG

VaI GTT CAA

Cys TGT ACA

Asn AAC TTG

Thr ACT TGA

Cys TGT ACA

Pro CCA GGT

GIu GAA CTT

Lys Trp AAGTG TTCACCTAG Sau3A

GIn CAA GTT

wurden zwei Oligonucleotide der folgenden Formel two oligodeoxynucleotides of the formula

3' TACCTTAACGTTCAAAGGAGACCAAAG TAC CTT AAC GTT CAA AGG AGA CCA AAG CAA ACA TTG TGA ACA GGT CTT TTC ACCTAG 5'

synthetisiert.

25pMol jedes Oligodesoxynucleotids wurden aneinander „annealed" und zu 3pg des Sau3A-EcoRI-Fragmentes gegeben. Die Ligation erfolgte in 20μΙ Lösung mittels T4-DN'A-Ligase. Die entstandene DNA wurde durch Agarosegel-Elektrophorese, Elektroelution und Präzipitation gereinigt. Die DNA wurde in 2OuI TE gelöst.

1μΙ Vektorfragment und 1 μΙ Insertfragment wurden in insgesamt 10μΙ mit T4-DNA-Ligase ligiert. 3μΙ der Ligationsreaktion wurden zur Transformierung von E.coli JM101 verwendet. Plasmide aus mehreren Kolonien wurden isoliert und auf das Vorhandensein von Fc_tR-wasserlöslichem Fragment-Gen mittels Restriktionsenzymen untersucht. Eines der Plasmide wurde weiter selektioniert und das Clal-Xbal-Fragment wurde partiell sequenziert, um die korrekte Verbindung zwischen dem „mating"Faktor-a-Teil und dem Fc_eR-wasserlöslichem Fragment-Gen zu bestätigen. Dieses Plasmid wurde als pRH245 bezeichnet (siehe Fig. 15).

f) Herstellung der Hefevektoren

pRH244 und pRH245 wurden mittels eines E.coli-Vektors (Bluescribe M13+) konstruiert, der die Sequenzierung der Inserts ermöglicht. Um beide Versionen des Fc_cR-wasserlöslichen Fragment-Gens in Hefe zu exprimieren, müssen beide rekombinierten Plasmide mit Hindlll und BamHI geschnitten werden, wodurch die Expressionskdssette, bestehend aus ADHI-Promotor, MFaLeader-Gen (im Falle von pRH245), Fc_cR-wasserlösliches Fragment-Gen und ADHI-Terminator, freigesetzt werden. Diese DNAs können in fast jeden Hefevektor, der geeignete Restriktionsenzymstellen besitzt, ligiert werden. Als Beispiel wurde das Plasmid pJDB207 gewählt (siehe V. D.Beggsin „Gene cloning in yeast" JGenclonierung in Hefe), herg.R.Williamson: Genetic

Engineering 2,175-203 [1982], bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen unter DSM3181 deponiert). pJDB207 enthält eine 2-p-L)rsprung der Replikation und einen leu 2-Selektionsmarker. Dieses Plasmid repliziert extrachromosomal in

Vektorherstellung

10pg ρJDB 207 wurden mit Hindlll und BamHI doppelt digeriert. Das große Fragment wurde durch Agarosegel-Elektrophorese, Elektroelution und Präzipitation isoliert. Die DNA wurde in 50μΙ TE gelöst.

Insertherstellung

10μς pRH244 und pRH245 wurden mit Hindlll und BamHI doppelt digeriert. Die Expressionskassetten wurden mittels Agarosegel-Elektrophorese isoliert. Die Inserts wurden in 10μΙ TE gelöst.

1 μΙ Vektor und 2 μΙ Insert wurden vermischt und in insgesamt 10μΙ mit T4-DNA-Ligase ligiert. E.coli JM101 wurde mit 3μΙ der Ligationslösung transformiert. Die Plasmide einiger der entstandenen Kolonien wurden durch Restriktionsanalyse auf die Richtigkeit der Konstruktion untersucht.

Je eines der Plasmide wurde selektioniert und folgendermaßen bezeichnet:

pJDB-244, das die Expressionskassette ohne die MFa-Leader-Sequenz enthält, und pJDB-245, das die Expressionskassette rr it der MFa-Leader-Sequenz enthält.

Beide Plasmide wurden in einem größeren Maßstab isoliert und zur Transformierung (siehe Beggs J. D. in Nature 275,104 [19781) des Hefestammes WS21-3 (α, leu2, his3, ura3, pep4) verwendet.

Teil II:

Herstellung der Plasmide 289a 1 und 289b3

1 pg des Hefeplasmids YEpI 3 wurde mit 3 Einheiten Hindlll und BamHI bei 37⁰C innerhalb von 3 Stunden in Core-Puffer (50 mMol Tris-HCI, pH3,0,1OmMoI MgCI₂, 5OmMoI NaCI) digeriert. Der linearisierte Vektor wurde durch Agarosegel-Elektrophorese mittels 0,7% Agarosegel isoliert (siehe Dretzen u.a. in Anal. Biochem. 112,295).

Je 1 μο der Plasmide pRH 244 und pRH 245 wurden ebenfalls mit Hindlll und BamHI digeriert. Das 1650bp lange Fragment aus pRH 244 und das 1900bp lange Fragment aus pRH 245 wurde nach dem oben beschriebenen Verfahren isoliert.

50ng des linearisierten Vektors und je 200ng der Expressionskassetten wurden über Nacht bei 14°C in 20μΙ Ligasepuffer (66mMol Tris-HCI, pH7,6,6,6mMol MgCI₂,1OmMoI DDT, 1 mMol rATP, 0,1 mg/ml BSA) in Gegenwart 1 Einheit T4-DNA-Ligase ligiert.

10μΙ des Ligationsgemischs wurden zur Transformation von E.coli HB101 verwendet (siehe Maniatis u.a. in Molecular Cloning — A Laboratory Manual, [Molekularclonierung — Ein Handbuch für das Laborr], S. 250) und für Ampicillinresistenz selektioniert.

Die Plasmide einiger der entstandenen Kolonien wurden durch Restriktionsanalyse auf die Richtigkeit ihrer Konstruktion überprüft. Zwei Plasmide wurden von pRH 244 bzw. pRH 24b abgeleitet (als Plasmid 289 a 1 bezeichnet [abgeleitet von pRH 244) und als Plasmid 289b3 bezeichnet (abgeleitet von pRH245).

Hefe WS21-1 (a leu 2, his3, trp 1 pep4) wurde mit den Plasmiden 289a 1 und 289b3 transformiert (siehe Nature 275,104 [1978]).

Beispiel 12 Expression des Fc_tR-löslichen Fragmentes in E.coli Vektorherstellung

10μg pRH 100 (siehe Beispiel B und Himmler A., Hauptmann R., Adolf G. und Swetly P. in J. Interferon Res. (1986), in Druck wurden mit Sstl digeriert. Die 3'-überstehenden Enden wurden durch Zusatz von 5 Einheiten E.coli-DNA-Polymerase I und dGPT entfernt. Das linearisiert& Plasmid wurde durch Zusatz von 10 Einheiten CIP linearisierte Plasmid wurde durch Zusatz von 10 Einheiten CIP und durch 30minütige Inkubation bei 37°C dephosphoryliert. Nach zwei Phenol/Chloroform-Extraktionen wurde die DNA weiter durch Agarosegel-Elektrophorese, Elektroelution und Präzipitation gereinigt. Der linearisierte Vektor wurde in ΊΟμΙ TE gelöst.

Insertherstellung

20μg pGEM4-Fc_tR (Plasmid GEM4 (Promega Biotec, Maäison WI53711, USA), die das größere Hindlll-EcoRI-Fragment der Fc_cR-cDNA enthielten, wurden mit EcoRI und Hindlll doppelt digeriert. Die 5'-überstehenden Enden wurden durch Zusatz von Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I und aller vier dXTPs glattendig gemacht. Die 5'-Phosphatgruppen wurden mit CIP entfernt. Nach der Agarosegel-Reinigung wurde das Fragment, das das Fc_cR-lösliche Fragment-Gen enthielt, mit Sau3A nachgeschnitten und das größere Fragment wurde isoliert. 50 pMol jedes Oligodesoxynucleotids

5' GAACTGCAGGTGAGCTCTGGTTTCGTTTGCAACACTTGCCCGGAAAAATG 3'

3' CTTGACGTCCACTCGAGACCAAAGCAMCGTTGTGAACGGGCCTTTTTACCTAG 5,

Sau3A

die den Leseraster, beginnend mit dem zweiten Codon (GIu) des Fc_cR-löslichen Fragment-Gens wiederherstellen, wobei die E.coli-Codone bevorzugt benutzt werden (Sharp P. M., Li W.-H. Nuci. Acids Res. 14, 7737-7749 [19861), wurden in 10μΙ Lösung durch Erhitzen auf 100°C und langsames Abkühlen „annealed". DieOligodesoxynucleotide und die Insert-DNA wurden mit T4-DNA-Ligase ligiert. Nach der Hitzedeniturierung des Enzyms wurden T4-Polynucleotidkinase und ATP zugegeben, um die 5'-Enden des Inserts zu phosphorylieren. Nach der Agarosegel-Reinigung wurde die DNA in 10 μΙ TE gelöst. 1 μΙ linearisierte Vektor-DNA und 5μΙ Insert-DNA wurden zusammengenommen und ligiert. Die Hälfte des Materials wurde zur Transformierung von E. coli HB101 (F-, hsdS20 (rb-, mb), recA13, ara-14, proA2, lacY1, galK2, rpsL20 (Sm-resistent), xyl-5, mitl-i, supE44, Lambda minus) benutzt. Die Plasmide einiger der Ampicillin-resistenten Kolonien wurden isoliert und durch Restriktionsenzymanalyse auf die Richtigkeit der Konstruktion überprüft. Ein Plasmid wurde selektioniert und durch DNA-Sequenzierung der Verbindung Trp-Promotor und FccR-lösliches Fragment-Gen weiter analysiert. Nach diesem letzten Beweis wurde das Plasmid als pRH246 bezeichnet (siehe Fig. 16).

Beispiel 13 Konstruktion des Plasmids psFc_cR-1

a) 350pg pBSF2-38 (siehe Nature 324,73-76 [1986)), die die BSF-2-cDNA in der Smal-Stelle von pGEM4 enthalten, wurden mit 700 Einheiten EcoRI und BamHI in 500μI eines stark salzhaltigen Puffers (10OmM NaCI, 5OmM Tris-HCI, pH 7,5,1OmM MgCI₂, 1mM DTT) 2 Stunden bei 37⁰C digeriert. Die digerierte DNA wurde auf eine preparative 1 % Agarosegel-Elektrophorese aufgetragen und das EcoRI-BamHI-Fragment, das die volle Länge der BSF-2-oDNA von 1,2kbp enthielt, wurde aus dem Gel elektrceluiert, mit 70% Ethanol präzipitiert und bei einer Konstruktion von 1 Mg/μΙ in TE-Puffer gelöst. 20Mg dieses Fragments wurden 1 Stunde lang mit 40 Einleiten Hinfl in 50μΙ eines stark salzhaltigen Puffers digeriert, mit Phenol extrahiert und mit Ethanol präzipitiert. Die digerierten DNAs wurden in 25μΙ eines 1 χ „nick"-Translationspuffers (5OmM Tris-HCI, pH7,2,1OmM MgSO₄,0,1mM DTT, 50 Mg/ml BSA) gelöst und 30 Minuten bei 2O⁰C mit 1 ml 8,2 Einheiten/μΙ Klenow-Fragment und 1 mM dNTP inkubiert. Die Auffüllreaktion wurde durch fünfminütige Inkubation bei 70°C beendet. Das entstandene 127 bp lange, glattendige Fragment wurde mit Phenol extrahiert, mit 40 Einheiten Kpnl 1 Stunde lang bei 37°C in 50μΙ eines wenig salzhaltigen Puffers (1OmM Tris-HCI, pH 7,5,1OmM MgCI₂,1 mM DTT) digeriert, 30 Minuten boi 65⁰C mit 2,5 E'mhe en bakterieller alkalischer Phosphataso inkubiert und anschließend auf 1 % präparativen Agarosegel aufgetragen und eine; Elektrophorese unterzogen. Das die BSF-2-Leader-Sequenz enthaltende 110bp iange Fragment wurde elektroeluiert und mit Ethanol präzipitiert. Das 110bp lange Fragment wurde in 10μΙ Ligationspuffer (5OmM Tris-HCI, pH7,4,1OmM MgCI₂,1OmMDTT, 1mM Spermidin, ImMATP, 0,1 mg/ml BSA) gelöst und mit 1μρ durch Kpnl und Smal digeriertem pGEM4 durch Inkubation bei 4⁰C für 16 Stunden mit 200 Einheiten T4-Ligase ligiert und in E.coli (MC 1065) transfiziert. Von den gewonnenen Kolonien wurden vier Kolonien herausgesucht, ein Clon wurde selektioniert, vermehrt und nach der Bestätigung, daß das Plasmid dieses selektionierten Clons nur eine Leader-Sequenz enthält, wurde es als pBSF2-L8 bezeichnet (siehe Fig. 20).

b) 80pg des Plasmids LE-392 oder pGEM4 (PFc₀R-I) wurden mit 150 Einheiten Hindill in 200μΙ eines wenig salzhaltigen Puffers (1OmM Tris-HCI, pH 7,5,1OmM MgCI₂,1 mM DTT) bei 37⁰C 1 Stunde lang digeriert und einer 1 % präparativen Agarosegel-Elektrophorese unterzogen. Das die lösliche Fc_tR-Region enthaltende Hindlll-Fragment wurde aus dem Gel elektroeluiert, mit Ethanol präzipitiert und bei einer Konzentration von 1 μg/μl in TE-Puffer gelöst. 1 μg des Hindlll-Fragmentes wurden bei 20⁰C 30 Minutenlang mit 8,2 Einheiten Klenow-Fragment und 1mM dNTP in 10μΙ von 1x „nick"-Translationspuffer inkubiert, um die zurückgesetzten 3'-Enden aufzufüllen, anschließend erfolgte Extrahierung mit Phenol und Präzipitierung mit Ethanol. Die Hindlll-Fragmente, deren 3'-Enden aufgefüllt worden waren, wurden mit 2 Einheiten Pstl in 10μΙ des Mediumsalzpuffers (5OmM NaCI, 1OmM Tris-HCI, pH 7,5,1OmM MgCI₂,1 mM DTT) 1 Stunde bei 37°C digeriert, mit 0,25 Einheiten baktorieller alkalischer Phosphatase bei 65°C 30 Minuten lang inkubiert und mit Ethanol präzipitiert. Getrennt davon wurde 1 \ig pBSF2-L8 mit 2 Einheiten BamHI in 20 μΙ eines stark salzhaltigen Puffers bei 37⁰C1 Stunde lang digeriert, mit Phenol extrahiert und mit Ethanol präzipitiert. Das durch BamHI digerierte pBSF-2-L8 wurde in 10μΙ 1x „nick"-Translationspuffer gelöst und mit 8,2 Einheiten Klenow-Fragment und 1 mM dNTP bei 2OX 30 Minuten lang zur Auffüllung der zurückgesetzten 3'-Enden inkubiert, mit Phenol extrahiert und mit Ethanol präzipitiert. Das Präzipitat wurde in 20μΙ eines stark salzhaltigen K uff ers gelöst, mit 2 Einheiten Pstl bei 37⁰C 1 Stunde lang digeriert, mit Phenol extrahiert und mit Ethanol präzipitiert. Das Pst1-digerierte Fragment, das die lösliche Fc_tR-Codierungsregion und durch Pstl digeriertes pBSF2-L8 enthält, wurde durch Inkubation mit 200 Einheiten T4-Ligase in 10μΙ Ligationspuffer bei 4⁰C 16 Stunden lang ligiert und in E.coli (MC 1065) transfiziert. Acht Kolonien wurden aus den gewonnenen Kolonien herausgosucht. Ein Clon wurde selektioniert, vermehrt und nach Betätigung der Plasmidkonstruktion als psFccR-1 bezeichnet. Das vermehrte psFc_tR-1 enthält sieben Basen aus der Mehrfachclonierung in pGEM4 zwischen BSF-2-Leader- und Fc_cR-Sequenzen im Raster (siehe Fig. 17: Nucleotide 137 bis 143).

Beispiel 14

Expression von Fc_cR-cDNA

Das Plasmid psFctR-1, das dia modifizierte Fc_tR-cDNA enthielt, wurde durch Digestion mit dem Restriktionsenzym BamHI linearisiert. mRNA wurde mit SP6-RNA-Polymerase mittels linearisierter Plasmid-DNAals Matrize nach Melton u.a. synthetisiert.

Etwa je 10ng mRNA wurden in Oozyten von Xenopus leavis injiziert und die Oozyten wurden bei 20⁰C in Barth's modifiziertem Medium, das mit 100pg/ml Penicillin und 1 Mg/ml Streptomycin ergänzt war, inkubiert. Nach der zweitägigen Inkubation wurde der Kulturüberstand gesammelt und die Oozyten wurden in Dulbecco's PBS, das 1 mM PMSF enthielt, homogenisiert. Das PBS-Lysat wurde durch Hochleistungszentrifugierung bei 15000U min¹ 10 Minuten lang getrennt. Das Pellet wurde wiederum mit NP-40 extrahiert, um den Membran-gebundenen Rezeptor zu eolubilisieren (0,5% NP-40,0,1 M NaCI, 0.05M Tris-HCI,

Beispiel 15

SDS-PAGE-Analyse von Fc_tR in Oozyten

Zehn mit mRNA injizierte Oozyten wurden mit 100μΙ modifiziertem Barth-Medium, das 150μ Ci ³⁵S-Methionin enthielt, 24 Stunden bei 20⁰C inkubiert. Markierte Oozyten wurden in 1 ml Lysepuffer (0,5% NP-40,0,1 M CaCI, 0.05M Tris-HCI, oH7,5) lysiert und 10 Minuten bei 15000U min"' zentrifugiert. Das geklärte Lysat und der Kulturüberstand wurden mit Normaler-Maus-Ig-gekoppelten Sepharose-4B-Perlen vorgeklärt und anschließend 60 Minuten unter häufigem Schütteln auf Eis mit 3-5-(IgGI)-Antikörper-gekoppelten Sepharose-4 B-Perlen inkubiert. Die Perlen wurden 2ma! mit Lysepuffer und 2mal mit stark salzhaltigem Puffer (0,5% NP-40,0,5 M NaCI, 0,05 M Tris-HCI, pH 8,0) gewaschen und zum Schluß noch einmal mit Lysepuffer gewaschen. Die Immunopräzipitate wurden durch zweiminütiges Kochen mit SDS-Probenpuffer eluiert. Die Proben wurden auf 9% SDS Page analysiert (siehe Fig. 24).

Beispiel 16 Nachweis von FC_CR

-27- 263 S38

Die Fc_cR-Aktivität wurde mit einem enzymgebundenen Immunoadsorptioonsassay (EUSA) mit zwei Antikörpern unter Verwendung von zwei verschiedenen monoclonalen Anti-Fc_tR-Antikörpern, 3-5(IgGI) und 8-30(IgM), gemessen, welche mit zwei verschiedenen Epitopen auf Fc_cR reagieren. Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen (Nunc, Roskilde, Dänemark) wurden mit ΙΟΟμΙ/Vertiefung 3-5-Antikörper (10pg/ml) in Beschichtungspuffer (0,1 M Carbonatpuffer, pH9,6,0,02%) vorbeschichtet und über Nacht bei 4°C inkubiert. Die Platten wurden dann viermal mit Spülpuffer (Dulbeccos Phosphatpuffer, pH 7,4, der 0,05% (V/V) Tween 20 enthielt) gewaschen und anschließend wurden 100 μΙ Proben, die mit Verdünnungspuffer (0,05 Tris-HCI, pH 8,1, mit 1 mM MgCI₂,0,15 M NaCI, 0,05%Tween 20,1 % BSA und 0,02% NaN₃) verdünnt waren, zugegeben. Die Platten wurden 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert, viermal mit Spülpuffer gewaschen und anschließend wurden 100ml 8-248-Antikörperalkalisches-Phosphatasekonjugat (0,75 mg/ml) zugegeben. Nach vierstündiger Inkubationszeit wurden die Platten viermal gewaschen und die Enzymreaktion wurde durch die Zugabe von 100 μΙ/Vertiefung von 1 mg/ml p-Nitrophenylphosphat (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) in Substratpuffer (0,05M Carbonatpuffer, pH 9,8,1OmM MgCI₂) in Gang gesetzt. Nach einer angemessenen Inkubationszeit (60-90 Minuten) wurde die optische Dichte mit Hilfe eines automatischen Mikro-ELISA-Anzeigegerätes (Nippon Inter. Med., Tokio, Japan) bei Wellenlängen von 405 und 620nm abgelesen (siehe Fig.21 und 22).

Beispiel 17

Bestimmung der Bindung von Fc_tR an IgE

Die mit Antikörper 3-5 beschichteten Platten wurden mit 100μΙ Proben 2 Stunden lang beschichtet, viermal mit Spülpuffer gewaschen und anschließend wurden 10pg/ml Human-monoclonales-lgE (PS-Myelom) zugegeben. Nach zweistündiger Inkubation bei Raumtemperatur wurden die Platten viermal gewaschen und weiter mit alkalischer Phosphatase konjugiertem monoclonalen Anii-Human-lgE inkubiert und dann durch Zusatz von Suhstrat-p-Nitrophenylphosphat wie bereits beschrieben, entwickelt.

Beispiel 18 IgE-Rosettenbildung

Fc_tR auf Lymphozyten werden durch einen Test unter Verwendung von mit Human-lgE beschichteten fixierten Ochsen-RBC (ORBC) nachgewiesen (Gonzalez-Molina, A. und Spiegelberg, H. L. J. Clin. Invest 59,616 (19771). Die Anzahl der IgE-rosettenbildenden Zellen wird nach Subtraktion der Anzahl der nicht-spezifischen Bindung mit fixierten ORBC, die mit Rinderserumalbumin beschichtet sind, ermittelt. Für die IgE-Rossetteninhibition werden 25μΙ Fc_cR-tragende Zellen (5 χ 10⁶/ml) mit einem spezifischen Volumen (z. B. 100 μΙ) der Testprobe oder des Kontrollmediums gemischt und 1 Stunde bei 4⁰C inkubiert. Die Anzahl der Rosetten mit 3 oder mehr ORBC wird gezählt. In den Experimenten I und III sind die Fc_cR-tragenden Zellen RPMI8866-Zellen und in Experiment Il sind es SKW6-CL4-Zellen. Das Kontrollmedium ist der Überstand der Kontrolloozyten, d.h. nicht-transformierteOozyten.

Aus den vorangegangenen Testergebnissen ist ersichtlich,

a) daß die SDS-PAGE-Analyse das Produkt von psFc_cR-1 aus den Oozyten zeigt, das von beiden Antikörpern 3-5 und 8-30 erkannt wird und das IgE-bindende Aktivität besitzt, und das breite Proteinbanden hervorbrachte (siehe Fig. 24) und b) daß das Produkt von pANFc_€R-1 aus den Oozyten, dem im Vergleich die N-terminale Transmembranregion fohlt, durch den 3-5-Antikörper, aber nicht durch den 8—30-Antikörper erkannt werden kann und keine IgE-bindende Aktivität aufweist. Diese Ergebnisse zeigen, daß das Produkt von ρΔΝFc_nR-I, das keine Signalsequenz besitzt, nicht richtig verarbeitet wurde und daß somit eine richtige Verarbeitung wie in Clon psFc_cR-1 ein Epitop schafft, das durch den Antikörper 8-30 erkannt wird und das IgE-bindende Aktivität besitzt.

Die Expression des wasserlöslichen Teils des Fc_c-Rezeptors kann durch Kultivierung der entsprechenden E.coli oder Hefe oder anderen Organismen mittels Standardfermentationsverfahren und anschließender Konzentrierung und Reinigung des gewünschten wasserlöslichen Fragmentes mittels der in Abschnitt a) „Isolierung und Reinigung des wasserlöslichen Teils von Fc_cR" erfolgen.

Beispielsweise wurde mit Plasmid 289b3 (WS21 -1/289be) transformierte Hefe WS 21-1 etwa 40 Stunden in YHK8-Medium ineinem Fermenter kultiviert, bis eine optische Dichte (546nm) von etwa 45 (Trockenzellmasse: 13g/l) erreicht war. Nach der Abzentrifugierung der Zellen wurde die Ausbeute an Fc_tR in dem gewonnenen Überstand mit einem spezifischen EIISA-Verfahren bestimmt

Ausbeute: 2,5E/ml Fc_tR (1 E/ml Fc_cRentspricht der Aktivität eines Überstände von 1 χ 10^s RPMI/Zellen/ml).

In 11 YHK8-Medium sind enthalten:

8,0Og(NH₄I₂SO₄,

2,56g (NH₄)₂ HPO₄,

0,60g MgSO₄ x 7H₂O,

0,56g CaCI₂ x 2H₂O,

0,04g Biotin, 80,0mg m-lnosit, 40,0mg Ca-pantothenat,

8.0mgThiamin,

2,0mg Pyridoxin,

3,1 mg CuSO₄ χ 5H₂O, 19,0mg FeCI₃ χ 6H₂O, 12,0 mg ZnSO₄ χ 7 H₂O, 14,0 mg MnSO₄ x H₂O,

5,0mg Borsäure,

2,0mg NaMoO₄ χ 2H₂O₁

1,0 g Hefeextrakt,

0,5g Zitronensäure, 0,2 g Uracil, 0,1 g Adenin, 15,0g Glutaminsäure, 0,5 g Tryptophan, 0,2g Histidin, 100,0 g Glucose

Wenn auch im Zusammenhang mit dem wasserlöslichen Fragment des Fc_t-Rezeptors die Konstruktion von Vektoren, die Transformation von Wirtsorganismen mit ihnen und die Expression des Fragmentes im vorangegangenen ausführlich für das wasserlösliche Fragment, das mit Aminosäure 150 des vollständigen Fc_c-Rezeptors beginnt, beschrieben wurde, so wird deutlich, daß die Vorgänge der Konstruktion, Transformation und Expression in ähnlicher Weise ausgeführt werden können, um andere wasserlösliche Fragmente, die beispiolsweise mit den Aminosäuren 50 bis 149 des gesamten Fc_c-Rezeptors beginnen, zu gewinnen.

Tabelle 1: Reinigung von Fc₁R aus RPMI-8866-Zellen

Material	Gesamt-	132,000	Gesamt	Spezifische	3-5-Sepharose	Ablauf	NMIg-Sepharose	Gewinnung	Reinigung
	Protein	441	aktivität	Aktivität	Eluat	4,5	Eluat Ablauf	(%)
	(Mg)	16	(Einheiten1	*) (E/pg)	2 470		85,5 1170
Zellkulturüberstand	180,000	117,000	78,800	0,44				100	1
Konzentrierter Überstand 172,000	99,000	75,000	0,44		95.2	1
(190fach)	306
NMlg-Ablauf	—	55,000	0,42	70	1
3-5-Sepharose-Eluat	36,800	83.4	47	190
HPLC	26,000	1,630	33	3,710
Rohes ZeIIy sat	6,1GO	0,05	100	1
NMlg-Ablauf	2,475	0,02	40,2	0,47
3-5-Sepharoseeluat	3,795	12,4	61,6	236
HPLC-gereinigt	649	649	10,5	12,400
	* 1 Einheit ist die Aktivität von 1 χ 105 Zellen und entspricht 190fach konzentriertem Überstand.
Tabelle 2
Material	IgE-Sepharose
	Eluat	Ablauf
HPLC-
gereinigt

Tabelle 3	CTCCT	5	GCTTAAACCT	CTGTCTCTGA	CGGTCCCIGC	Leu	Pro	Arg	15	35
	GAGGA	GIu GIy GIn	CGAATTTCriA	GACAGAGACT	GCCAGGGACG	CTT	CCC	AGG	Arg
	GGTCGACCCC	GAA GGT CAA	AACACACAG	GAGGACAGAC	ACAGGCTCCA	GAA	GGG	TCC	AGG	85
CAATCGCTCT	CCAGCTGGGG	CTT CCA GTT	TTGTGTGATC	CTCCTGTCTG	TGTCCGAGGT				ICC
GTTAGCGAGA	AGTGACCAGA	20	GCTGTGATTG	TGCCCGCTGA	GTGGACTGCG	Leu	GIy	Leu	30	135
AACTCCACTA	TCACTGGTCT	Cys Arg Arg	CGACACTAAC	ACGGGCGACT	CACCTGACGC	CTG	GGG	CTG	Va!
TTGAGGTGAT	GTGAGTGCTC	TGC AGG CGT	CATCATCGGG	AGAATCCAAG	CAGGACCGCC	GAC	CCC	GAC	GTG	185
TTGTCAGGGA	CACTCACGAG	ACG TCC GCA	GTAGTAGCCC	TCTTAGGTTC	GTCCTGGCGG				CAC
AACAGTCCCT	35			10	Leu	Leu	Leu	45
	AIa Leu Trp	Tyr Ser	GIu Ue	GIu GIu	CTT	CTC	CTG	Trp
Met GIu	GCT CTG TGG	TAT TCA	GAG ATC	GAG GAG	GAA	GAG	GAC	TGG	230
ATG GAG	CGA GAC ACC	ATA AGT	CTC TAG	CTC CTC				ACC
TAC CTC				25
	GIy Thr	Gin Ue	VaI Leu
Arg Cys	GGG ACT	CAG ATC	GTG CTG				275
CGG TGT	CCC TGA	GTC TAG	CAC GAC
GCC ACA			40
	Ala GIy	Leu Leu	Thr Leu
Thr AIa	GCT GGG	CTG CTG	ACT CTG				320
ACC GCC	CGA CCC	GAC GAC	TGA GAC
TGG CGG

Trp

Asp

Thr

SO

GIn

Ser

Leu

Lys

55

Leu

GIu

GIu

-29

- 263

538

TGG

GAC

ACC

Thr

CAG

AGT

CTA

AAA

GIn

CfG

GAA

GAG

60

His

ACC

CTG

TGG

ACA

GTC

TCA

GAT

TTT

CAG

GAC

CTT

CTC

Arg

AIa

CAC

TGT

GTC

AGG

GCT

365

GTG

Arg

Asn

Va!

65

GIn

VaI

Ser

Lys

70

Leu

GIu

Ser

TCC

CGA

CGG

AAC

GTC

Ser

CAA

GTT

TCC

AAG

Asn

TTG

GAA

AGC

75

Ala

GCC

TTG

CAG

TCT

GTT

CAA

AGG

TTC

AAC

AAC

CTT

TCG

His

His

GCC

AGA

TTG

CAC

CAC

410

CGG

Asp

GIn

Met

80

GIn

Lys

Ser

GIn

85

Thr

GIn

lie

GTG

GTG

GAC

CAG

ATG

AIa

CAG

AAA

TCC

CAG

Ser

ACG

CAG

ATT

90

GIy

CTG

GTC

TAC

GCG

GTC

TTT

AGG

GTC

TCC

TGC

GTC

TAA

Ser

Gin

GGT

CGC

AGG

TCA

CAG

455

CCA

Leu

GIu

GIu

95

Arg

AIa

GIu

GIn

100

Arg

Leu

. Lys

AGT

GTC

CTG

GAG

GAA

Leu

CGA

GCT

GAA

CAG

GIn

AGA

TTG

ΑΛΛ

105

GIu

GAC

CTC

CTT

CTT

GCT

CGA

CTT

GTC

CAG

TCT

AAC

TTT

Ser

Gin

GAA

GAA

GTC

TCT

CAG

500

CTT

Leu

GIu

Leu

110

Trp

Asn

Leu

Asn

115

Leu

GIn

AIa

AGA

GTC

TTG

GAG

CTG

Ser

TGG

AAC

CTG

AAC

GIy

CTT

CAA

GCA

120

Asp

AAC

CTC

GAC

TCC

ACC

TTG

GAC

TTG

GGG

GAA

GTT

CGT

Asp

Leu

GAC

AGG

CCC

GAT

CTG

545

CTG

Ser

Phe

Lys

125

GIn

GIu

Leu

Asn

130

Arg

Asn

GIu

CTA

GAC

•

AGC

TTC

AAG

Ser

CAG

GAA

TTG

AAC

GIu

AGG

AAC

GAA

135

Ser

TCG

AAG

TTC

TCC

GTC

CTT

AAC

TTG

GAG

TCC

TTG

CTT

AIa

Ser

AGC

AGG

CTC

GCT

TCA

590

TCG

Leu

Leu

GIu

140

Leu

Arg

GIu

GIu

145

Thr

Lys

Leu

CGA

AGT

TTG

CTG

GAA

Arg

CTC

CGG

GAG

GAG

VaI

ACA

AAG

CTA

150

Asp

AAC

GAC

CTT

AGA

GAG

GCC

CTC

CTC

GTG

TGT

TTC

GAT

Arg

Met

GAT

TCT

CAC

AGG

ATG

635

CTA

Leu

GIn

VaI

155

Ser

GIy

Phe

VaI

160

Asn

Thr

Cys

TCC

TAC

TTG

CAG

GTG

Ser

AGC

GGC

TTT

GTG

Cys

AAC

ACG

TGC

165

GIu

AAC

GTC

CAC

TCC

TCG

CCG

AAA

CAC

TGC

TTG

TGC

ACG

Pro

GIu

GAG

AGG

ACG

CCT

GAA

680

CTC

Trp

He

Asn

170

GIn

Arg

Lys

Cys

175

Tyr

Phe

GIy

GGA

CTT

TGG

ATC

AAT

Phe

CAA

CGG

AAG

TGC

Tyr

IAC

ITC

GGC

18C

Lys

ACC

TAG

TTA

TTC

GTT

GCC

TTC

ACG

TAC

ATG

AAG

CCG

Ly5

GIy

AAG

AAG

ATG

AAG

GGC

725

TTC

Lys

GIn

Trp

185

His

AIa

Arg

Tyr

190

Cys

Asp

Asp

TTC

CCG

AAG

CAG

TGG

VaI

CAC

GCC

CGG

TAT

AIa

TGT

GAC

GAC

195

Thr

TTC

GTC

ACC

GTC

GTG

CGG

GCC

ATA

GCC

ACA

CTG

CTG

Met

GIu

ACC

CAG

CGG

ATG

GAA

770

TGG

GIn

Leu

VaI

200

Ue

His

Ser

Pro

205

GIu

GIn

Asp

TAC

CTT

CAG

CTG

GTC

Ser

ATC

CAC

AGC

CCG

GIu

GAG

CAG

GAC

210

GIy

GTC

GAC

CAG

AGC

TAG

GTG

TCG

GGC

GAG

CTC

GTC

CTG

Phe

Leu

GGG

TCG

CTC

TTC

CTG

815

CCC

Lys

His

AIa

215

His

Thr

GIy

Ser

220

Ho

GIy

Leu

AAG

GAC

AAG

CAT

GCC

Ser

CAC

ACC

GGC

TCC

Trp

ATT

GGC

CTT

225

Thr

TTC

GTA

CGG

AGC

GTG

TGG

CCG

AGG

TGG

TM

CCG

GAA

Arg

Asn

ACC

TCG

ACC

CGG

AAC

860

TGG

Asp

Leu

Lys

230

GIu

Phe

Ue

Trp

235

Asp

GIy

Ser

GCC

TTG

GAC

CTG

AAG

GIy

GAG

TTT

ATC

TGG

VaI

GAT

GGG

AGC

240

Leu

CTG

GAC

TTC

GGA

CTC

AAA

TAG

ACC

GTG

CTA

CCC

TCG

His

VaI

TTG

CCT

CAC

CAT

GTG

905

AAC

Tyr

Ser

Asn

245

AIa

Pro

GIy

GIu

250

Thr

Ser

Arg

GTA

CAC

TAC

AGC

AAC

Trp

GCT

CCA

GGG

GAG

Pro

ACC

AGC

CGG

255

Asp

ATG

TCG

TTG

TGG

CGA

GGT

CCC

CTC

CCC

TGG

TCG

GCC

Ser

GIn

GAC

ACC

GGG

AGC

CAG

950

CTG

TCG

GTC

	260 Asp Cys VaI Met Met GAC TUC GTG ATG ATG CTG ACG CAC TAC TAC	Arg GIy CGG GGC GCC CCG	265 Ser GIy Arg TCC GGT CGC AGG CCA GCG	Trp TGG ACC	- 30	- 263	538
GIy GIu GGC GAG CCG CTC	275 Cys Asp Arg l.ys Leu TGC GAC CGT AAG CTG ACG CTG GCA TTC GAC	GIy Ala GGC GCC CCG CGG	280 Trp VaI Cys TGG GTG TGC ACC CAC ACG	Asp GAC CTG .	As η AAC TTG	270 Asp GAC CTG	995
Ala Phe GCC TTC CGG AAG	290 Cys Thr Pro Pro Ala TGC ACG CCG CCA GCC ACG TGC GGC GGT CGG	Set GIu AGC GAA TCG CTT	295 GIy Ser Ala GGT TCC GCG CCA AGG OGC	GIu GAG CTC	Arg CGG GCC	285 Leu CTG GAC	1040
Ala Thr GCC ACA CGG TGT	305 Asp Ser Arg Pro Asp GAT TCA AuA CCA GAC CTA AGT TCT GGT CTG	Pro Δοη CCT GAC GGA CTG	310 2|w Ar- _-- GGC CGC CTG CCG GCG GAC	Pro CCC GGG	Ser TCC AGG	300 Met ATG TAC	1085
GIy Pro GGA CCT CCT GGA	Pro Leu His Ser " CCT CTC CAC TCT TGA GGA GAG GTG AGA ACT	GCATGGATA CGTACCTAT		Thr ACC TGG	31S riu CCC GGG	1130
Ser Ala TCT GCC AGA CGG	CCCCAACCAC GGCCTAAAAu GGGGTTGGTG CCGGATTTTC	CCTCTTTGTG GGAGAAACAC	CAGCCAGGCC CAGAGCAAGA GTCGGTCCGG GTCTCGTTCT		1180
CCCTGAAGAC GGGACTTCTG	TTTTCTGCCA CCCAAACGGA AAAAGACGGT GGGTTTGCCT	GGCAGCTGAC CCGTCGACTG	GCTGAAAGGT CGACTTTCCA		1230
CCCTGTGACA GGGACACTGT	GCCCCTGCCT TCCCAGGAGr CGGGGACGGA AGGGTCCTCA	acaccccaac tgtggggttg	ACATCTCCCG TGTAGAGGGC		1280
CTCCTCTATG GAGGAGATAC	GTGCCCCCAA CAGCACCCTC CACGGGGGTT GTCGTGGGAG	TCCAGATGAG AGGTCTACTC	AGCACCCTCT TCGTGGGAGA		1330
CCAGATGGGA GGTCTACCCT	TCTCCAGATG CAGCCCCATC AGAGGTCTAC GTCGGGGTAG	TCCTCAGCAC AGGAGTCGTG	AGTACACCCC TCATGTGGGG		1380
AACAGCACCC TTGTCGTGGG	AGCTCAGGTG GTGAGTCCTC TCGAGTCCAC CACTCAGGAG	CTGTCCAGCC GACAGGTCGG	CCCAGGACCT GGGTCCTGGA		1430
GAGTATCCCC CTCATAGGGG	GTGATGGCCT CCCA CACTACCGGA GGGT		TGCATCAATA ACGTAGTTAT		1480
AAATGGGGCA TTTACCCCGT					1504

Claims (19)

1. Verfahren zur Herstellung eines Human-Fc_E-Rezeptors mit niedriger Affinität oder eines wasserlöslichen Teiles davon mit einer N-terminalen Zytoplasmadomäne, einer C-terminalen extrazellulären Domäne und einer Molekülmasse von etwa 46kd sowie dessen glycolysierte Derivate, dadurch gekennzeichnet, daß ein geeigneter Wirtsorganismus mit einem
Expressionsvektor, Her als eine Codiersequenz Replikon- und Kontrollsequenzen für die Expression in Prokaryonten und Eukrayonten, E. coli oder in Hefe für das gewünschte Polypeptid an einer geeigneten Stelle enthält, transformiert und das gewünschte Polypyp. d aus den entstandenen Transformanten isoliert wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Replikon- und Kontrollsequenzen diejenigen des Plasmids pER 103 oder PlasmidspGEM 4 eingesetzt werden oder als Replikon den 2^-Ursprung und als Kontroüoequenzen den ADHi-Promotor und den ADHI-Terminator enthält und zuf ätzlich die „mating" Faktor-a-Leader-Sequenz (MFa) enthält.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Expressionsvektor ein
Plasmidvektor mit den in Anspruch 2 genannten Codiersequenzen und ein rekombiniertes DNA-Molekül eingesetzt werden.

4. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß als Plasmid Plasmid LE deponiert in E. coli HB101 unter FERm BP-1116 eingesetzt wird,

und dje DNA-Sequenz der Formel

ATG GAG GAA GGT CAA TAT TCA GAG ATC GAG GAG CTT CCC AGG AGG TAC CTC CTT CCA GTT ATA AGT CTC TAG CTC CTC GAA GGG TCC TCC

CGG TGT TGC AGG CGT GGG ACT CAG ATC GTG CTG CTG GGG CTG GTG GCC ACA ACG TCC GCA CCC TGA GTC TAG CAC GAC GAC CCC GAC CAC

ACC GCC GCT CTG TGG GCT GGG CTG CTG ACT CTG CTT CTC CTG TGG TGG CGG CGA GAC ACC CGA CCC GAC GAC TGA GAC GAA GAG GAC ACC

CAC TGG GAC ACC ACA CAG AGT CTA AAA CAG CTG GAA GAG AGG GCT GTG ACC CTG TGG TGT GTC TCA GAT TTT GTC GAC CTT CTC TCC CGA

GCC CGG AAC GTC TCT CAA GTT TCC AAG AAC TTG GAA AGC CAC CAC CGG GCC TTG CAG AGA GTT CAA AGG TTC TTG AAC CTT TCG GTG GTG

GGT GAC CAG ATG GCG CAG AAA TCC CAG TCC ACG CAG ATT TCA CAG CCA CTG GTC TAC CGC GTC TTT AGG GTC AGG TGC GTC TAA AGT GTC

GAA CTG GAG GAA CTT CGA GCT GAA CAG CAG AGA TTG AAA TCT CAG CTT GAC CTC CTT GAA GCT CGA CTT GTC GTC TCT AAC TTT AGA GTC

GAC TTG GAG CTG TCC TGG AAC CTG AAC GGG CTT CAA GCA GAT CTG CTG AAC CTC GAC AGG ACC TTG GAC TTG CCC GAA GTT CGT CTA GAC

AGC AGC TTC AAG TCC CAG GAA TTG AAC GAG AGG AAC GAA GCT TCA TCG TCG AAG i'TC AGG GTC CTT AAC TTG CTC TCC TTG CTT CGA AGT

GAT TTG CTG GAA AGA CTC CGG GAG GAG GTG ACA AAG CTA AGG ATG CTA AAC GAC CTT TCT GAG GCC CTC CTC CAC TGT TTC GAT TCC TAC

GAG TTG CAG GTG TCC AGC GGC TTT GTG TGC AAC ACG TGC CCT GAA CTC AAC GTC CAC AGG TCG CCG AAA CAC ACG TTG TGC ACG GGA CTT

AAG TGG ATC AAT TTC CAA CGG AAG TGC TAC TAC TTC GGC AAG GGC TTC ACC TAG TTA AAG GTT GCC TTC ACG ATG ATG AAG CCG TTC CCG

ACC AAG CAG TGG GTC CAC GCC CGG TY .' GCC TGT GAC GAC ATG GAA TGG TTC GTC ACC CAG GTG CGG GCC ATA 'GG ACA CTG CTG TAC CTT

GGG CAG CTG GTC AGC ATC CAC AGC CCG GAG GAG CAG GAC TTC CTG CCC GTC GAC CAG TCG TAG GTG TCG GGC CTC CTC GTC CTG AAG GAC

ACC AAG CAT GCC AGC CAC ACC GGC TCC TGG ATT GGC CTT CGG AAC TGG TTC GTA CGG TCG GTG TGG CCG AGG ACC TAA CCG GAA GCC TTG

TTG GAC CTG AAG GGA GAG TTT ATC TGG GTG GAT GGG AGC CAT GTG AAC CTG GAC TTC CCT CTC AAA TAG ACC CAC CTA CCC TCG GTA CAC

GAC TAC AGC AAC TGG GCT CC,\ GGG GAG CCC ACC AGC CGG AGC CAG CTG ATG TCG' TTG ACC CGA GGT CCC CTC GGG TGG TCG GCC TCG GTC GGC GAG GAC TGC GTG ATG ATG CGG GGC TCC GGT CGC TGG AAC GAC CCG CTC CTG ACG CAC TAC TAC GCC CCG AGG CCA GCG ACC TTG CTG

GCC TTC TGC GAC CGT AAG CTG GGC GCC TGG GTG TGC GÄC CGG CTG CGG AAG ACG CTG GCA TTC GAC CCG CGG ACC CAC ACG CTG GCC GAC

GCC ACA TGC ACG CCG CCA GCC AGC 3AA GGT TCC GCG GAG TCC ATG CGG TGT ACG TGC GGC GGT CGG TCG CTT CCA AGG CGC CTC AGG TAC

GGA CCT GAT TCA AGA CCA GAC CCT GAC GGC CGC CTG CCC ACC CCC •CCT GGA CTA AGT TCT GGT CTG GGA CTG CCG GCG GAC GGG TGG GGG

TCT GCC CCT CTC CAC TCT TGA .
AGA CGG GGA GAG GTG AGA ACT

oder ein degeneratives Derivat davon sowie dessen glycosylierte Derivate innerhalb des Plasmids pGEM ™4 als EcoRI-lnsert enthält.

5. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß als Plasmid Plasmid pDE2-FceR-1 eingesetzt wird und die DNA-Sequenz nach Anspruch 4 enthält.

6. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß als Plasmid Plasmid pRH 246 eingesetzt wird, das die DNA-Sequenz der Formel

ATG TAC

GAG TTG CAG GTG TCC AGC GGC TTT GTG TGC AAC ACG TGC CCT GAA CTC AAC GTC CAC AGG TCG CCG AAA CAC ACG Ti¹G TGC ACG GGA CTT

AAG TGG ATC AAT TTC CAA CGG AAG TGC TAC TAC TTC GGC AAG GGC TTC ACC TAG TTA AAG GTT GCC TTC ACG ATG ATG AAG CCG TTC CCG

ACC AAG CAG TGG GTC CAC GCC CGG TAl GCC TGT GAC GAC ATG GAA TGG TTC GTC ACC CAG GTG CGG GCC ATA CGG ACA CTG CTG TAC CTT

GGG CAG CTG GTC AGC ATC CAC AGC CCG GAG GAG CAG GAC TTC CTG CCC GTC GAC CAG TCG TAG GTG TCG GGC CTC CTC GTC CTG AAG GAC

ACC AAG CAT GCC AGC CAC ACC GGC TCC TGG ATT GGC CTT CGG AAC TGG TTC GTA CGG TCG GTG TGG CCG AGG ACC TAA CCG GAA GCC TTG

TTG GAC CTG AAG GGA GAG TTT ATC TGG GTG GAT GGG AGC CAT GTG AAC CTG GAC TTC CCT CTC AAA TAG ACC CAC CTA CCC TCG GTA CAC

GAC TAC AGC AAC TGG GCT CCA GGG GAG CCC ACC AGC CGG AGC CAG CTG ATG TCG TTG ACC CGA GGT CCC CTC GGG TGG TCG GCC TCG GTC

GGC GAG GAC TGC GTG ATG ATG CGG GGC TCC GGT CGC TGG AAC GAC CCG CTC CTG ACG CAC TAC TAC GCC CCG AGG CCA GCG ACC TTG CTG

GCC TTC TGC GAC CGT AAG CTG GGC GCC TGG GTG TGC GAC CGG CTG CGG AAG ACG CTG GCA TTC GAC CCG CGG ACC CAC ACG CTG GCC GAC

GCC ACA TGC ACG CCG CCA GCC AGC GAA GGT TCC GCG GAG TCC ATG CGG TGT ACG TGC GGC GGT CGG TCG CTT CCA AGG CGC CTC AGG TAC

GGA CCT GAT TCA AGA.CCA GAC CCT GAC GGC CGC CTG CCC ACC CCC CCT GGA CTA AGT TCT GGT CTG GGA CTG CCG GCG GAC GGG TGG GGG

TCT GCC CCT CTC CAC TCT TGA
AGA CGG GGA GAG GTG AGA ACT

oder ein degeneratives Derivat davon sowie dessen 0-g!ycosy!ierte Derivate und die des Plasmids pER 103 innerhalb des Plasmids pBR322 als EcoRI-lnsert mit der in Figur 16 gezeigten Restriktionskarte enthält.

7. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß als Plasmid Plasmid

pRH 244 eingesetzt wird, das die DNA-Sequenz nach Anspruch 6 und die Replikonsequenz die des 2^m-Ursprungs und als Kontrollsequenz den ADHI-Promotor und den ADHI-Promotor innerhalb des Plasmids Blueocribp M13+ als Barn Hl/Hind lii-lnsert mit der in Figur 14 ge*eigten Restriktionskarte enthält.

8. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß als Piasmio Plasmid pRH 245 eingesetzt wird, das die DNA-Sequenz des Anspruchs 7 mit der in Figur 15 gezeigten Restriktionskarte enthält.

9. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß als Plasmid Plasmid psFc_£R-1 eingesetzt wird, das die DNA-Sequenz nach Anspruch 6 mit der in Figur 19 gezeigten Restriktionskarte enthält.

10. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Expressionsvektor ein Hefevekto.·, der die DNA-Sequenz nach Anspruch 8 oder 9 enthält, eingesetzt wird.

11. Verfahren nach Anspruch 1,2 und 10, dadurch gekennzeichnet, daß als Hefevektor der Hefevektor pJHDB-244, der die DNA-Sequenz nach Anspruch 7 als BamHI/Hind Ill-Insert innerhalb des Plasmids pJDB207 enthält, eingesetzt wird.

12. Verfahren nach Anspruch 1,2 und 10, dadurch gekennzeichnet, daß als Hefevektor der Hefevektor pJDB-245, der die DNA-Sequenz nach Anspruch 8 als BamHI/Hind Ill-Insert innerhalb des Plasmids pJDB207 enthält, eingesetzt wird.

13. Verfahren nach Anspruch 1,2 und 10, dadurch gekennzeichnet, daß als Hefevektor der Hefevektor 289a 1, der die DNA-Sequenz nach Anspruch 8 als BamHI/Hind Ill-Insert innerhalb des Plasmids YEp 13 enthält, eingesetzt wird.

14. Verfahren nach Anspruch 1,2 und 10, dadurch gekennzeichnet, daß als Hefevektor der Hefevektor 289b3, der die DNA-Sequenz nach Anspruch 7 als BamHI/Hind Ill-Insert inerhalb des Plasmids YEp 13 enthält, eingesetzt wird.

15. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Kultivierung von lymphoblastenartigen B-Zellen und Trennung des Fc_ER aus dem Überstand oder aus den lysierten Zellen durch sequentielle Immunoaffinitätsreinigung erfolgt.

16. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß RPMI-8866-Zellen als lymphoblastenartige Zellen eingesetzt werden.

17. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß eine Fc_ER enthaltende Lösung sequentiell auf BSA-Sepharose, Human-Transferrin-Sepharose und normaler-Maus-lg-Sepharose absorbiert wird, der Ablauf auf eine Anti-FceR-Affinitätssäule aufgetragen wird und der Ablauf mittels HPLC weiter gereinigt wird.

18. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß eine Immunoaffinitätssäule durch Kopplung eines entsprechenden Antikörpers an Sepharose hergestellt wird.

19. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, ciaß für die Herstellung von partiellen Aminosäuresequenzen der Formel

Met-Glu-Leu-Gln-Val-Ser-Ser-Gly-Phe-Val-,

Gly-Glu-Phe-Ile-Trp-Val-Asp-Gly-Ser-His-Val-Asp-Tyr-Ser-Asn-Trp-Ala-Pro-Gly-Glu-Pro-Thr-, Lys-His-Ala-Ser-His-Thr-Gly-Ser-Trp-lle-Gly-Leu-Arg-Asn-Leu-Asp-Leu-Lys-und Lys-Trp-Ile-Asn-Phe-Gln-.