DE3781217T2

DE3781217T2 - Herstellung von verwandten polypeptiden des bindungsfaktors.

Info

Publication number: DE3781217T2
Application number: DE8787110458T
Authority: DE
Inventors: Hans Dr Hofstetter; Erich Dr Kilchherr; Albert Dr Schmitz
Original assignee: Ciba Geigy AG
Current assignee: Novartis AG
Priority date: 1986-07-22
Filing date: 1987-07-20
Publication date: 1992-12-17
Anticipated expiration: 2007-07-21
Also published as: JP2713912B2; ES2033747T3; GR3006306T3; AU602907B2; IE60393B1; PT85364B; JPH08242865A; IE871967L; JP2619232B2; JPS6368097A; DE3781217D1; AU7594787A; DK172259B1; DK381287D0; DK381287A; US5081028A; EP0254249B1; PT85364A; EP0254249A1

Description

Diese Erfindung betrifft Polypeptide, die zu menschlichen Immunoglobulin E-Bindungsfaktoren (IgE-BFs) verwandt sind, mRNAs, DNAs und Hybridvektoren, die für diese Polypeptide codieren, Wirte, die diese Hybridvektoren enthalten, und Verfahren zur Herstellung dieser Polypeptide, mRNAs, DNAs, Hybridvektoren und Wirte. Die Polypeptide können zur Verhinderung und/oder Behandlung allergischer Erkrankungen verwendet werden, und demgemäß betrifft diese Erfindung auch pharmazeutische Zubereitungen, die sie enthalten.
Hintergrund der Erfindung: Allergische Erkrankungen sind wegen ihres häufigen Auftretens (20 bis 30 % der Bevölkerung) und aufgrund des Mangels an Heilbehandlung noch immer ein bedeutendes Gesundheitsproblem. Üblicherweise beschränkt sich die Therapie auf die Verwendung von Antihistaminika oder auf mehr oder weniger wirksame Immunisierungsmethoden. Die klassischen antiallergischen Medikamente haben gewisse Nachteile, insbesondere weil sie verschiedene Nebenwirkungen beim behandelten Patienten hervorrufen. Die Immunisierungsmethode beschränkt sich auf ein oder zwei Allergene, wohingegen die meisten Patienten gegen eine große Anzahl von Allergenen empfindlich sind. Weiters ist die Desensibilisierungsbehandlung weder heilend noch schützend.
Die Mehrzahl allergischer Erkrankungen wird durch Immunglobulin E (IgE)-Antikörper vermittelt, die gegen eine große Anzahl von Allergenen in der Luft gerichtet sind, z.B. Pollen, tierische Hautschuppen, Staubmilben, Nahrungsmittel-Antigene, pharmakologische Mittel, z.B. Penizilline oder Hymenoptera-Gift. Die Mechanismen, die die Produktion von IgE regulieren, wurden an Labortieren ausführlich untersucht [K. Ishizaka, Ann. Rev. Immunol. 2, 159 (1984)]. Diese Untersuchungen haben klar die Existenz von nicht antigenspezifischen, aber IgE-Isotypspezifischen Mechanismen, die die Produktion von IgE in Tiermodellen kontrollieren, gezeigt. Die Effektor-Moleküle dieser Regulationsmechanismen wurden IgE-Bindungsfaktoren (IgE-BFs) genannt, aufgrund ihrer Affinität für IgE. Die IgE-BFs können unterteilt werden in IgE-suppressive Faktoren (IgE-SFs) und in IgE-potenzierende Faktoren (IgE-PFs): Diese Moleküle unterscheiden sich nur durch ihren Kohlenhydratgehalt. IgE-SFs sind nicht glycosyliert oder weniger glycosyliert als die entsprechenden IgE-PFs. Die tatsächliche Produktion von IgE in dermodellen wird durch das Verhältnis zwischen diesen beiden Arten von IgE-BFs bestimmt.
Dieselben Zellen sind in der Lage, IgE-SFs oder IgE-PFs abzugeben, in Abhängigkeit vom Einfluß von die Glycosylierung inhibierenden oder verstärkenden Faktoren, die durch bestimmte regulatorische T-Lymphozyt-Subpopulationen abgegeben werden.
M. Sarfati u.a. [Immunology 53, 197, 207, 783 (1984)] haben die Existenz von Human-B-Zellinien dokumentiert, die IgE-BFs sezernieren, die ausgestattet sind mit ähnlichen biologischen Aktivitäten wie die, die bei Nagern beschrieben wurden. Andere Forscher haben die Produktion von IgE-BFs durch Human-T-Zellen beschrieben [T.F. Huff und K. Ishizaka, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 81, 1514 (1984)] und durch gentechnologische Methoden [Europäische Patentanmeldung 155 192]. Die Beziehungen zwischen IgE-BFs von T-Zellen- und jenen von B-Zellen-Ursprung waren bisher nicht bekannt. Wie anhand der vorliegenden Erfindung klar werden wird, hat der IgE-BF aus B-Zellen-Ursprung weniger als statistische Homologie mit dem IgE-BF von T-Zellen-Ursprung.
Gereinigte IgE-BFs sind wichtig für die Diagnose und Therapie allergischer Erkrankungen und damit verbundener Immunregulationserkrankungen. Insbesondere IgE-BFs mit IgE-suppressiver Aktivität könnten bei der Behandlung allergischer Erkrankungen nützlich sein, während IgE-BFs mit IgE-potenzierender Aktivität die Widerstandsfähigkeit gegen Infektionen, z.B. die Resistenz gegen parasitäre Infektionen, erhöhen könnten.
Assays für den Nachweis von IgE-BFs von B-Zellen basieren auf einem Rosetteninhibierungstest, worin RPMI 8866-Zellen (eine Lymphoblastoid-B-Zellinie), die Rezeptoren für IgE exprimieren (Fc&epsi;R) mit IgE-überzogenen Rindererythrozyten zu Rosettenbildung gebracht werden. Wenn letztere zuerst mit IgE-BFs vorinkubiert werden, sind sie nicht mehr in der Lage, an RPMI 8866-Zellen zu binden, und der Anteil der Zellen, die Rosellen bilden, wird dementsprechend reduziert. Dieser Assay ist nicht quantitativ, er ist technisch schwierig aufgrund der Variabilität bei der Kopplung von IgE an Rindererythrozyten und mühsam, weil Rosetten unter dem Mikroskop untersucht werden müssen, Zellinien permanent verfügbar sein müssen, IgE-überzogene Erythrozyten regelmäßig hergestellt werden müssen, etc., so daß nur eine kleine Anzahl von Tests (20-40) vernünftig an einem Tag von einer Person ausgeführt werden kann. In einem passenderen, quantitativen und leicht auszuführenden Assay werden monoklonale Antikörper zu Lymphozyt-Fc&epsi;R, die mit IgE-BFs kreuzreagieren, verwendet. Solche monoklonale Antikörper wurden von G. Delespesse u.a., EP 86810244.3, hergestellt, und die Hybridom-Zellinien, die sie produzieren, sind bei der Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, Paris hinterlegt und unter der Zugriffsnummer I-425 (Klon 208.25 A.4,3/135), I-420 (Klon 208.25 D.2,1/176), I-451 (Klon 207.25 A.4,4/30), I-452 (Klon 207.35 A.4,4/45) und I-486 (Klon 208.25 D.2/94) verfügbar. Die entsprechenden monoklonalen Antikörper werden Mab-135, Mab-176, Mab-30, Mab-45 bzw. Mab-94 genannt. Sie erlauben auch eine effiziente Reinigung von IgE-BFs durch Affinitäts-Chromatographie.
Trotz der Verwendung obiger monoklonaler Antikörper war es bisher unmöglich, die Aminosäuresequenz eines einzelnen IgE-BF, der aus einer natürlichen Human-B-Zellinie isoliert wurde, zu bestimmen. Für therapeutische Zwecke wäre es äußerst wünschenswert, ein reines, einzelnes Polypeptid mit einer definierten Aminosäuresequenz zu haben, das die gewünschte IgE-Bindungseigenschaft hat und leicht in großen Mengen herstellbar ist.
Der schnelle Fortschritt der DNA-Rekombinationstechnik in den letzten Jahren bietet die allgemeinen Methoden, um dieses Ziel zu erreichen. In jenen Fällen, wo die Struktur des Polypeptids unbekannt ist, ist der Erfolg der DNA-Rekombinationstechnik abhängig von der Identifizierung einer mRNA oder einer DNA, die für das gewünschte Polypeptid codiert, aus einer natürlichen Quelle.
Nach Identifizierung einer mRNA mittels eines geeigneten Assays kann eine komplementäre DNA hergestellt werden. Die cDNA kann in einen geeigneten Vektor eingebracht werden, worauf Transformation eines geeigneten Wirts mit dem erhaltenen Hybridvektor, Selektion und Kultivierung der transformierten Wirte die Produktion und schließlich die Isolierung des Polypeptids erlaubt. Die Isolierung der für das gewünschte Polypeptid codierenden cDNA und Sequenzierung erlauben die Bestimmung der Aminosäuresequenz des Polypeptids. Die cDNA oder Teile davon können für das Screening der mRNA oder des DNA-Genoms der natürlichen Quelle für weitere Nucleotid-Sequenzen, die für die gewünschten Polypeptide codieren, verwendet werden.
Folglich war in der vorliegenden Erfindung, da die Strukturen der IgE-BFs unbekannt waren, das erste Ziel die Identifizierung einer mRNA von Human-B-Zellen, die für das gewünschte Polypeptid codiert, durch Transformieren von Eiern von Xenopus laevis mit fraktionierter mRNA von besagten B-Zellen und Bestimmung der Klone, die gewünschte mRNA enthalten, durch einen Assay, der obige monoklonale Antikörper verwendet. Weitere Ziele waren die Herstellung von cDNAs und Hybridvektoren, die Transformation von geeigneten Wirten und schließlich die Kultivierung der Wirte und Isolierung der gewünschten Polypeptide. Die letzteren sind nicht notwendigerweise identisch mit den natürlich vorkommenden Polypeptiden, weil posttranslationale Modifizierungen nach Expression des Polypeptids auftreten können.
Ziele der Erfindung: Die Ziele der Erfindung sind Polypeptide, die zu IgE-BFS von Human-B- Zellen verwandt sind, Hybridvektoren, die als ein Insert eine für diese Polypeptide codierende DNA-Sequenz enthalten, transformierte Wirte, die die Hybridvektoren enthalten, RNA- und DNA-Moleküle, die für die Polypeptide codieren, und pharmazeutische Zubereitungen, die wirksame Mengen der Polypeptide enthalten.
Weitere Ziele sind Methoden zur Herstellung besagter Polypeptide, Hybridvektoren, transformierten Wirte, RNA- und DNA-Moleküle, pharmazeutischen Zubereitungen und die Verwendung der genannten Polypeptide.
Ein anderes Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zum Verhindern und/oder Behandeln von Allergie durch Verabreichung einer wirksamen Menge eines vorliegenden Polypeptids, das zu IgE-BFs verwandt ist
Diese Ziele wurden durch die Herstellung einer DNA erreicht, die für das Polypeptid der Formel (I) und Fragmente davon codiert.
Beschreibung der Erfindung: Die erfindungsgemäßen Polypeptide: Die Erfindung betrifft ein Polypeptid mit der Aminosäuresequenz der Formel (I)
ein Fragment, eine Mutante oder ein Derivat davon.
Die einzelnen Buchstaben in der Formel (I) repräsentieren die folgenden natürlich vorkommenden L-Aminosäuren: (A) Alanin, (C) Cystein, (D) Asparaginsäure, (E) Glutaminsäure, (F) Phenylalanin, (G) Glycin, (H) Histidin, (I) Isoleucin, (K) Lysin, (L) Leucin, (M) Methionin, (N) Asparagin, (P) Prolin, (Q) Glutamin, (R) Arginin, (S) Serin, (T) Threonin, (V) Valin, (W) Tryptophan, (Y) Tyrosin.
Die Polypeptide der Formel (I), Fragmente, Mutanten und Derivate davon werden hier unter dem vereinigenden Ausdruck "erfindungsgemäße Polypeptide" gruppiert. Sie sind zu den IgE-Rezeptoren an Human-B-Zellen verwandt und wenn ohne die Membranverankerungssequenz, zu den oben erwähnten IgE-BFs von Sarfati u.a.
Fragmente der erfindungsgemäßen Polypeptide sind Teile des vollständigen Polypeptids der Formel (I) mit zumindest 10 und bis zu 320 aufeinanderfolgenden Aminosäuren in einer Sequenz, die der Formel (I) entspricht. Solche Fragmente sind z.B. Polypeptide der Formel (I), worin die erste Aminosäure oder bis zu etwa 133 Aminosäuren ausgehend von der N-terminalen deletiert sind. Dieser deletierte N-Terminus ist die Membranverankerungssequenz, die das Polypeptid an die cytoplasmatische Membran der B-Zellen bindet. Andere Fragmente sind Polypeptide der Formel (I), worin Aminosäuren zwischen der N-terminalen und der C-terminalen, z.B. Aminosäuren von etwa 110 bis 130, oder Aminosäuren am C-Terminus, z.B. Aminosäuren von etwa 250 bis 321 deletiert sind.
Die Erfindung betrifft insbesondere ein Fragment des Polypeptids der Formel (I), dadurch gekennzeichnet, daß die Aminosäuresequenz umfassend die Aminosäuren 106 bis 127 deletiert ist; oder daß es ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Polypeptiden ausgehend von irgendeiner der Aminosäuren 120, 121, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159 oder 160 und mit irgendeiner der Aminosäuren zwischen 282 und 321, vorzugsweise 321 endend.
Ein bevorzugtes Fragment des Polypeptids der Formel (I) ist dadurch gekennzeichnet, daß es aus der Aminosäuresequenz von Aminosäure 119 bis Aminosäure 321 besteht.
Ein anderes bevorzugtes Fragment des Polypeptids der Formel (I) ist dadurch gekennzeichnet, daß es aus der Aminosäuresequenz von Aminosäure 134 bis Aminosäure 321 besteht.
Ein anderes bevorzugtes Fragment des Polypeptids der Formel (I) ist dadurch gekennzeichnet, daß es aus der Aminosäuresequenz von Aminosäuren 148 oder 150 bis Aminosäure 321 besteht. Diese beiden Fragmente können in Überständen von RPMI 8866-Zellen gefunden werden und entsprechen daher natürlich vorkommendem IgE-BF.
Die Fragmente können ein Methionin an den N-Terminus gebunden haben, insbesondere wenn se durch Expression in E.coli erhalten werden.
Mutanten der erfindungsgemäßen Polypeptide sind durch den Austausch einer (Punktmutante) oder mehrerer, etwa bis zu 10, ihrer Aminosäuren gegen eine oder mehrere andere Aminosäuren gekennzeichnet. Sie sind die Folge der entsprechenden Mutationen am DNA-Level, die zu unterschiedlichen Codons führen.
Derivate des erfindungsgemäßen Polypeptids sind solche, wo funktionelle Gruppen, wie Amino-, Hydroxyl-, Mercapto- oder Carboxylgruppen derivatisiert sind, z.B. glycosyliert, acyliert, amidiert bzw. verestert. In glycosylierten Derivaten ist üblicherweise ein Oligosaccharid an Asparagin, Serin, Threonin und/oder Lysin gebunden. Acylierte Derivate werden speziell acyliert durch eine natürlich vorkommende organische oder anorganische Säure, z.B. Essigsäure, Phosphorsäure oder Schwefelsäure, was üblicherweise an der N-terminalen Aminogruppe erfolgt, oder an Hydroxygruppen, speziell von Tyrosin bzw. Serin. Ester sind die von natürlich vorkommenden Alkoholen, z.B. Methanol oder Ethanol.
Weitere Derivate sind Salze, speziell pharmazeutisch annehmbare Salze, z.B. Metallsalze, wie Alkalimetall- und Erdalkalimetallsalze, z.B. Natrium-, Kalium-, Magnesium-, Calcium- oder Zinksalze, oder Ammoniumsalze, die mit Ammoniak oder einem geeigneten organischen Amin gebildet sind, wie einem niederen Alkylamin, z.B. Triethylamin, Hydroxy-niederalkylamin, z.B. 2-Hydroxyethylamin, und dergleichen.
Polypeptide der Formel (I) haben IgE-Bindungsaktivität, wie durch den Rosetteninhibierungs-Assay und die Bindung an monoklonale Antikörper, z.B. an Mab-135 und Mab-176, die spezifisch für IgE-BFs sind, demonstriert werden kann. Von den Fragmenten, Mutanten und Derivaten werden die bevorzugt die IgE-Bindungsaktivität haben.
Die erfindungsgemäßen Polypeptide werden durch DNA-Rekombinationsmethoden hergestellt, umfassend die Identifizierung einer mRNA, die für ein solches Polypeptid codiert, Herstellung einer DNA oder cDNA, Konstruktion eines cDNA-Hybridvektors, Transformation einer Wirtszelle, die die Expression des Vektors erlaubt, und Isolierung der genannten Polypeptide.
Folgrich betrifft die Erfindung weiters ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids der Formel (I), eines Fragments, einer Mutante oder eines Derivats davon, dadurch gekennzeichnet, daß a) ein transformierter Wirt, der einen Hybridvektor enthält, welcher eine für ein Polypeptid der Formel (I), ein Fragment oder eine Mutante davon codierende DNA-Sequenz enthält, kultiviert wird, oder b) die mRNA, die für ein Pölypeptid der Formel (I), ein Fragment oder eine Mutante davon codiert, in einem passenden Translationssystem translatiert wird und, falls erforderlich, ein Polypeptid der Formel (I), ein Fragment oder eine Mutante davon in ein Derivat davon transformiert wird.
a) Transformierte Wirte werden ausgewählt aus prokaryotischen oder eukaryotischen Zellen, z.B. Bakterien, Pilzen, z.B. Hefen, oder höheren Zellen, einschließlich Human-Zellinien. Bevorzugt werden verfügbare E.coli-Stämme, z.B. HB 101, BZ 234, B1472, oder verfügbare S.cerevisiae-Stämme, z.B. RH971, die mit einem Hybridvektor transformiert werden, der für ein erfindungsgemäßes Polypeptid codiert und einen passenden Promotor, Enhancer, Marker und Signalsequenzen und dergleichen enthält.
Die transformierten Wirtszellen werden nach auf diesem Gebiet bekannten Methoden kultiviert, üblicherweise in einem flüssigen Medium, das assimilierbare Quellen von Kohlenstoff, Stickstoff und anorganische Salze und, falls erforderlich, geeignete Wachstumsfaktoren enthält.
Für das Wachstum transformierter pro- und eukaryotischer Mikroorganismen können verschiedene Kohlenstoffquellen verwendet werden. Beispiele für bevorzugte Kohlenstoffquellen sind assimilierbare Kohlenhydrate, wie Glucose, Maltose, Mannit oder Lactose, oder ein Acetat, die allein oder in geeigneten Mischungen verwendet werden können. Beispiele für geeignete Stickstoffquellen sind Aminosäuren, Proteine, wie Trypton, Pepton oder Fleischextrakte, Hefeextrakte, Malzextrakte und auch Ammoniumsalze, z.B. Ammoniumchlond oder -nitrat, die allein oder in geeigneten Mischungen verwendet werden können.
Das Medium enthält weiters Spurenelemente, z.B. K&spplus;-, Ca²&spplus;-, Mg²&spplus;-, Fe²&spplus;-, Mn²&spplus;-, Zn²&spplus;-, Cu²&spplus;-, NO&sub3;&supmin;-, SO&sub4;²&supmin;-, HPO&sub3;²&supmin;-, H&sub2;PO&sub4;&supmin;-, Cl&supmin;-, BO&sub3;³&supmin;- und MoO&sub4;²&supmin;-Ionen. Vorzugsweise werden auch Substanzen zugesetzt, die Selektionsdruck ausüben und das Wachsen von Zellen verhindern, die den Expressionsvektor verloren haben. Also wird dem Medium z.B. Ampicillin zugesetzt. wenn der Hybridexpressionsvektor ein amp -Gen enthält Die Zugabe antibiotischer Substanzen hat auch den Effekt, daß kontaminierende, gegen Antibiotika empfindliche Mikroorganismen nicht überleben können. Wenn ein Hefestamm, der z.B. in einer essentiellen Aminosäure auxotroph ist, als Wirtsmikroorganismus verwendet wird, enthält das Plasmid vorzugsweise ein Gen, das für ein Enzym codiert, das den Wirtsdefekt komplementiert. Die Kultivierung des Hefestammes erfolgt in einem Minimalmedium, dem diese Aminosäure fehlt.
Zellen von Vertebraten werden unter Gewebekulturbedingungen gezüchtet, unter Verwendung von im Handel erhältlichen Medien (z.B. Gibco. Flow Laboratories), in den meisten Fällen ergänzt durch Serum eines Säugers. Das Wachstum der Zellen erfolgt in großem Maßstab, entweder an einem festen Träger befestigt, wie Roller-Flaschen, Mikroträgern und porösen Glasfasern, oder als freiflotierende Zellen in geeigneten Gefäßen.
Die Kultivierung wird durch Verfahren bewirkt, die auf diesem Gebiet bekannt sind. Die Kulturbedingungen, wie Temperatur, pH-Wert des Mediums und Fermentationszeit werden so gewählt, daß maximaler Titer des erfindungsgemäßen Polypeptids erhalten wird. Ein E.coli- oder Hefe- Stamm wird vorzugsweise unter aeroben Bedingungen durch Submerskultur unter Schütteln oder Rühren bei einer Temperatur von etwa 20 bis 40ºC, vorzugsweise etwa 30ºC, und einem pH-Wert von 4 bis 8, vorzugsweise etwa bei pH 7, etwa 4 bis 30 Stunden lang kultiviert, vorzugsweise bis maximale Ausbeuten des erfindungsgemäßen Polypeptids erreicht sind.
b) Die für ein erfindungsgemäßes Polypeptid codierende mRNA kann in einem geeigneten Translationssystem translatiert und exprimiert werden, wie in den Oocyten von Xenopus laevis. Für die erfindungsgemäßen Polypeptide codierende mRNA wird in Oocyten des weiblichen Frosches Xenopus laevis mikroinjiziert. Die transformierten Oocyten werden in Barth-Lösung, die ergänzt ist mit FCS, bei etwa 20ºC etwa 45 Stunden inkubiert. Nach Entfernung des Inkubationsmediums werden die Oocyten in Oocyten-Lysepuffer homogenisiert und zentrilugiert. Der Überstand enthält die erfindungsgemäßen Polypeptide, wie man durch einen RIA-Assay unter Verwendung monoklonaler Antikörper zeigen kann. Diese Methode zur Herstellung der erfindungsgemäßen Polypeptide ist hauptsächlich nützlich für Identifizierungszwecke.
Wenn das Niveau des erfindungsgemäßen Polypeptids ein Maximum erreicht hat, wird die Kultur unterbrochen, und das Polypeptid kann isoliert werden. Wenn das Polypeptid mit einer geeigneten Signalpeptidsequenz fusioniert ist, wird es durch die Zelle direkt in den Überstand abgegeben. Andernfalls müssen die Zellen zerstört werden, z.B. durch Behandlung mit einem Detergens, wie SDS oder Triton, oder lysiert mit Lysozym oder einem ähnlich wirkenden Enzym. Wenn Hefe als Wirtsmikroorganismus verwendet wird, kann die Zellwand durch enzymatische Verdauung mit einer Glucosidase entfernt werden. Alternativ oder zusätzlich dazu können mechanische Kräfte, wie Scherkräfte (z.B. X-Presse, French-Press, Dyno mill) oder Schütteln mit Glasperlen oder Aluminiumoxid, oder abwechselndes Gefrieren, z.B. in flüssigem Stickstoff, und Auftauen sowie Ultraschall angewendet werden, um die Zellen aufzubrechen. Die Proteine des Zellüberstandes oder der beim Aufbrechen der Zellen erhaltenen Mischung, einschließlich der erfindungsgemäßen Polypeptide, werden nach auf dem Gebiet gut bekannten Methoden angereichert, insbesondere durch Polyethylenimin-Behandlung, Zentrifugieren und Fällung mit Salzen, z.B. Ammoniumsulfat oder Zinksalzen. Weitere Reinigungsschntte sind z.B. Ultrazentrifugieren, Diafiltration, Gelelektrophorese, chromatographische Verfahren, wie Ionenaustausch-Chromatographie, Größenausschluß-Chromatographie, Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatographie (HPLC), Umkehrphasen-HPLC, Schnelle-Druck-Flüssigkeits-Chromatographie (FPLC) und dergleichen, Trennung der Bestandteile der Mischung nach der Molekülgröße mittels einer geeigneten Gelfiltrationssäule, Dialyse, Affinitäts-Chromatographie, z.B. Affinitäts-Chromatographie unter Verwendung von Antikörpern, speziell monoklonalen Antikörpern, insbesondere Mab-135 und Mab-179, und andere auf dem Gebiet bekannte Verfahren.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden die erfindungsgemäßen Polypeptide aus den Zellüberständen durch Filtration des Überstandes durch ein Monoklonal-Antikörper-Affigel, z.B. Mab-45-Affigel, Eluieren des gebundenen IgE-BF-Polypeptids, z.B. mit einem 0,1 M Glycin-HCl- Puffer mit pH 2.6, Laden der das gewünschte Polypeptid enthaltenden Fraktionen auf eine Anionenaustauschersäule, z.B. SynChropak AX 300, Waschen der Säule, z.B. mit einem Tris-HCl-Puffer, pH 7,4. Eluieren des Proteins, z.B. mit einer Natriumchloridlösung, wie 1 M NaCl, Dialysieren und Lyophilisieren der das gewünschte Polypeptid enthaltenden Fraktionen, Umkehrphasen-Chromatographie der dialysierten Fraktionen, z.B. an einer SynChropak RP-4-Säule, und Eluieren des gewünschten Polypeptids, z.B. mit Acetonitril/0,1 % TFA-Gradient.
Dieses Verfahren eignet sich speziell für die Reinigung von natürlichem IgE-BF von RPMI 8866-Zellüberständen. Der natürliche IgE-BF, der nach dieser Methode gereinigt wurde, war rein genug für eine Aminosäuresequenzierungsprozedur, die zeigte, daß er aus zwei Proteinen besteht, wobei die N-terminalen Aminosäuresequenzen wie folgt sind:
Die Numerierung entspricht der Numerierung der Formel (I). Die mit einem X bezeichneten Aminosäuren sind nicht bestimmt, jedoch kann durch Vergleich mit den DNA-Sequenzen der Formel II oder III die folgende Bezeichnung vorgenommen werden: X&sub1;&sub4;&sub9; = R, X&sub1;&sub5;&sub1; = E, X&sub1;&sub5;&sub5; = S, X&sub1;&sub6;&sub0; = C, X&sub1;&sub6;&sub3; = C. Die Analyse eriaubt den Schluß, daß natürlicher IgE-BF aus zumindest zwei Polypeptiden besteht mit den Aminosäuresequenzen, die sich von L&sub1;&sub4;&sub8; bis S&sub3;&sub2;&sub1; und M&sub1;&sub5;&sub0; bis S&sub3;&sub2;&sub1; (Formel I) erstrecken und die in einer Proportion von etwa 40 zu 60 vorkommen.
Schließlich kann die IgE-Bindungsaktivität des isolierten Proteins nach auf dem Gebiet gut bekannten Methoden bestimmt werden, z.B. durch den Rosetteninhibierungs-Assay, das Blockieren der IgE-Bindung an Anti-IgE-Antikörper. Affinitäts-Chromatographie-Versuche und Versuche, die die Suppression der vorgehenden in vitro-IgE-Synthese durch Lymphozyten von allergischen Individuen messen.
Erfindungsgemäße Polypeptide mit der korrekten Sequenz, jedoch der falschen dreidimensionalen Faltung, sind als Zwischenprodukte in Renaturierungsversuchen nützlich.
Die Erfindung betrifft auch ein Polypeptid der Formel (I), ein Fragment, Mutante oder Derivat davon, wann immer nach einem erfindungsgemäßen Verfahren erhalten.
Herstellung transformierter Wirte: Die Erfindung betrifft weiters ein Mehrstufenverfahren zur Herstellung eines transformierten Wirtes, der zur Expression eines erfindungsgemäßen Polypeptids befähigt ist, gekennzeichnet durch 1. Herstellung einer für ein Polypeptid der Formel (I), ein Fragment, eine Mutante oder eine Derivat davon codierenden DNA-Sequenz, 2. Einbringen der erhaltenen DNA in einen passenden Vektor, 3. Transformieren eines passenden wirtes mit dem erhaltenen Hybridvektor, 4. Selektion der transformierten Wirte von untransformierten Wirten und wahlweise Isolierung des Hybridvektors von dem transformierten Wirt, Modifizieren der codierenden oder nicht-codierenden Region des Hybridvektors und erneute Durchführung der Schritte 3 und 4.
Die mit der Herstellung der Wirte verbundenen Schritte werden hier im folgenden detaillierter beschrieben werden. Die Erfindung betrifft auch die einzelnen Schritte.
1. Herstellung einer für ein erfindungsgemäßes Polypeptid codierenden DNA: Die Erfindung betrifft auch eine für ein Polypeptid der Formel I, ein Fragment, eine Mutante oder ein Derivat davon codierende DNA und Methoden zu deren Herstellung.
Die für ein erfindungsgemälßes Polypeptid codierende DNA kann a) durch reverse Transcription von isolierter mRNA in cDNA, b) durch Isolierung aus genomischer DNA oder c) durch chemische Synthese erhalten werden.
In der vorliegenden Erfindung mußte, solange die DNA-Struktur unbekannt war, die DNA von genomischer DNA oder einer cDNA-Bibliothek über die mRNA erhalten werden. Eine cDNA-Bibliothek umfaßt die genetische Information, die zu der aus Zellen isolierten mRNA komplementär ist.
a) Reverse Transcription von isolierter mRNA in cDNA: Um eine cDNA-Bibliothek zu erhalten, wird die mRNA aus Zellen isoliert, die IgE-Bindungsaktivität exprimieren, speziell Human-B- Zellen und davon erhaltenen Zellinien. Diese mRNA wird in doppelsträhgige cDNA übergeführt. Eine vorzuziehende Human-B-Zellinie ist RPMI 8866. Andere nützliche B-Zellinien können durch Immortalisierung natürlicher B-Zellen mit Epstein-Barr-Virus hergestellt werden. Auf dem Gebiet gut bekannte Standardmethoden werden bei der Präparation von mRNA angewendet. Die Zellmembran wird aufgebrochen und der Zellinhalt freigesetzt, aus dem die mRNA isoliert wird. Die Zellmembran wird vorzugsweise durch physikalische Methoden oder Lysis mit Detergentien wie SDS, Guanidiniumthiocyanat, bestimmte Salzbedingungen oder Homogenisierung, vorzugsweise durch Mischen, gebrochen. Die mRNA wird nach den Standardmethoden der Phenolextraktion, Ethanolfällung, Zentrifugieren und Chromatographie, vorzugsweise eine Kombination verschiedener Methoden isoliert. Zentrifugieren erfolgt vorzugsweise über Gradienten, beispielsweise über einen CsCl-Gradienten. Für die Chromatographie werden vorzugsweise Säulen verwendet, speziell Oligo-dT-Säulen.
Die gesamte mRNA kann direkt in ds-cDNA nach Methoden dieses Gebiets umgewandelt werden. Vorzugsweise wird die für ein erfindungsgemäßes Polypeptid codierende mRNA weiter unter Anwendung verschiedener Methoden angereichert, wie Elektrophorese, Chromatographie und Zentrifugieren, vorzugsweise Saccharosegradienten-Zentrifugation.
Fraktionen, die für ein erfindungsgemäßes Polypeptid codierende mRNA enthalten, können nach verschiedenen Methoden nachgewiesen werden, wie in vivo- oder in vitro-Translation gefolgt von Nachweis der IgE-Bindungsfaktor-Aktivität oder jetzt, da die Nucleotidsequenz bekannt ist, durch Hybridisierung mit einer Oligonucleotidsonde.
In vivo-Translationssysteme können prokaryotische oder eukaryotische Systeme sein. Ein bevorzugtes in vivo-Translationssystem ist das Oocyten-System von Xenopus laevis, wie es von Maniatis u.a. (1) beschrieben wurde. In vitro-Translationssysteme sind z.B. Weizenkeim und Kaninchen-Reticulozyten-Lysate, die beide im Handel erhältlich sind.
Nachweissysteme zum Screening hinsichtlich IgE-Bindungsfaktor-Eigenschaft verwenden vorzugsweise monoklonale Antikörper gegen das Polypeptid der Formel (I), speziell Mab-135 oder Mab-176. Ein anderes mögliches System verwendet Immunglobuline des IgE-Typs in herkömmlichen Immunoassays.
Aus irgendeinem Pool von mRNA, erhalten aus unfraktionierter oder fraktionierter mRNA kann ds-cDNA nach den auf dem Gebiet gut bekannten Methoden erhalten werden. Bevorzugte allgemeine Methoden werden von Maniatis u.a. (1), Okayama und Berg (2) und Heidecker u.a. (3) beschrieben. Im allgemeinen wird die mRNA zuerst unter Verwendung der Enzyme Reverse Transcriptase in ss-cDNA umgewandelt, und dann zu doppelsträngiger cDNA unter Verwendung der Enzyme Reverse Transcriptase oder DNA-Polymerase I (Klenow-Fragment). In dieser Erfindung erfolgt die Vorgangsweise vorzugsweise nach der von Maniatis u.a. (1) beschriebenen Methode. Zwei Methoden werden alternativ herangezogen für das Priming der Synthese der ds-cDNA. Die erste Methode verwendet die natürliche Schleifenbildung der ss-cDNA. Die zweite Methode erfolgt durch Tailing der ss-cDNA mit einem Homopolymer-Tail wie Poly-dC oder Poly-dT.
Die mRNA-Fraktion, von der das entsprechende Polypeptid die höchste Aktivität in dem Detektionssystem zeigt, wird in die komplementäre cDNA nach auf dem Gebiet gut bekannten Methoden transcribiert. Die mRNA und Oligo-dT als Primer werden gemischt. Dann werden dNTPs als Ausgangsmaterial zugesetzt, und die Synthese des cDNA-mRNA-Hybridmoleküls wird durch das Enzym Reverse Transcriptase realisiert. Die RNA-Moleküle werden durch Zugabe von NaOH abgebaut. DNA-Polymerase wird zugemischt, vorzugsweise das Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I, und das Gemisch wird bei einer geeigneten Temperatur, vorzugsweise 12-15ºC, inkubiert. Das Gemisch wird mit Nuclease S1 inkubiert, und die der für ein erfindungsgemäßes Polypeptid codierenden mRNA entsprechende ds-cDNA wird erhalten.
Für die Ampliflkation und die Strukturaufklärung wird die erhaltene ds-cDNA in einen geeigneten Vektor gespleißt, z.B. Plasmid pUC-KO, und der erhaltene Hybridvektor wird durch Verwendung eines geeigneten wirts vermehrt, z.B. E.coli HB101, wie hier zuvor detaillierter beschrieben wurde. Erneute Isolierung der Hybridvektoren und Gewinnung der inserierten cDNA daraus erlaubt eine Strukturbestimmung der für ein erfindungsgemäßes Polypeptid codierenden DNA. Die erhaltenen Hybridvektoren pCL-2 und pCL-1 enthalten Inserts der Formeln (II) bzw. (III). Das pCL-2-cDNA-Insert hat die Sequenz der Formel (II):
In der DNA-Sequenz der Formel II ist die für das Polypeptid der Formel (I) codierende Region durch die Aminosäuresymbole markiert. Die nichtcodierenden flankierenden Regionen sind auch Teile der nichtcodierenden Region der isolierten mRNA. Die Restriktionsstellen G, H und R werden gezeigt.
Die andere cDNA, die von der mRNA erhalten wird, hat die Sequenz der Formel (III), worin die für die Aminosäuren 106 bis 127 des Polypeptids der Formel (I) codierenden Nudeotide, d.h. die Nucleotide 316 bis 378 der Formel (II) deletiert sind und worin sonst die codierende Region und ein Teil der beiden flankierenden Sequenzen der DNA-Sequenz der Formel (II) identisch sind. Dieses cDNA-insert wurde in pCL-1 gefunden und hat die Sequenz der Formel (III):
b) Eine andere geeignete Methode zum Erhalten der für ein erfindungsgemäßes Polypeptid codierenden DNA besteht in der Isolierung dieser DNA aus der genomischen DNA aus Gewebe oder einer Zellkultur. Die Zellen werden lysiert, vorzugsweise mit SDS und Proteinase K, und die DNA wird durch wiederholte Extraktion mit Phenol deproteinisiert. Die RNA wird vorzugsweise mit RNase verdaut. Die erhaltene Roh-DNA wird teilweise mit geeigneten Restriktionsenzymen verdaut, z.B. HaeIII und AluI, und Fragmente von 15-20 Kb werden isoliert und in einem geeigneten Phagen oder Cosmid vermehrt, z.B. in Charon 4A oder EMBL-3-Phage, und hinsichtlich der gewünschten Sequenzen untersucht, z.B. mit einer radioaktiv markierten DNA-Sonde oder anders, wie zuvor beschrieben.
c) Eine dritte Methode zur Präparation der für ein erfindungsgemäßes Polypeptid codierenden DNA ist chemische Synthese. Chemische Synthesen von DNA wurden in zusammenfassender Form von S.A. Narang (4) präsentiert. Die bekannten Synthesetechniken erlauben die Präparation von Polynucleotiden bis zu 40 oder 60 Basen in guter Ausbeute, hoher Reinheit und in relativ kurzer Zeit. Geeignet geschützte Nucleotide werden durch die Phosphodiester-Methode von K.L Agarwal u.a. (5), die Phosphotriester-Methode von C.B. Reesem (6) oder die Phosphittriester- Methode von R.L Letsinger u.a. (6a) verbunden. Die Vereinfachung der Synthese der Oligonucleotide und Polynucleotide ist durch die Festphasen-Methode möglich, in der die Nucleotidketten an ein geeignetes Polymer gebunden werden. Vorteilhafterweise wird eine DNA-Synthesevorrichtung verwendet.
Die tatsächliche doppelsträngige DNA kann enzymatisch aus chemisch hergestellten kurzen, aber überlappenden Segmenten hergestellt werden. Zum Beispiel werden nach Khorana u.a. (7) überlappende Polynucleotidsequenzen von beiden DNA-Strängen verwendet, die durch Basenpaarung in korrekter Anordnung zusammengehalten werden, und dann chemisch durch das Enzym DNA-Ligase verbunden werden. Eine andere Möglichkeit umfaßt das Inkubieren in jedem Fall einer Polynucleotidsequenz von den beiden DNA-Strängen mit einem kurzen, überlappenden Segment in Gegenwart der vier erforderlichen Desoxynucleosidtriphosphate mit einer DNA-Polymerase, z.B. DNA- Polymerase I, dem Klenow-Fragment von Polymerase I oder T&sub4;-DNA-Polymerase, oder mit Reverser Transcriptase. Die beiden Polynucleotidsequenzen werden dabei in der korrekten Anordnung durch Basenpaarung zusammengehalten und mit den erforderlichen Nucleotiden durch das Enzym ergänzt, um eine vollständige doppelsträngige DNA (S.A. Narang u.a. (8)) zu ergeben.
d) Präparation von DNAs, die für ein Fragment des Polypeptids der Formel (I) codieren: DNAs, die für ein Fragment des Polypeptids der Formel (I) codieren, werden dadurch erhalten, daß die DNA der Formel (II) oder (III) oder ein Vektor, der sie enthält, mit einem geeigneten Restriktionsenzym und/oder einer geeigneten Exonuclease verdaut wird und, falls erforderlich, das erhaltene DNA-Fragment mit einem DNA-Fragment ergänzt wird, das durch chemische Methoden synthetisiert wurde, oder das gewünschte Fragment wird vollständig durch chemische Methoden synthetisiert.
Geeignete Restriktionsenzyme und ihre Restriktionsstellen werden in der Formel (II) gezeigt. Für die Herstellung der DNA-Fragmente, die für die Polypeptidsequenz D&sub1;&sub1;&sub9; bis S&sub3;&sub2;&sub1; der Formel (I) codieren, eignen sich BgI LL und Rsa I. Das für die Polypeptidsequenz A&sub1;&sub3;&sub4; bis S&sub3;&sub2;&sub1; codierende DNA-Fragment kann durch Restriktion mit HindIII und RsaI erhalten werden (s. Formel II, Fig. 4). Die Herstellung der DNA-Fragmente kann auch schrittweise erfolgen, indem zuerst ein größeres DNA-Fragment hergestellt wird, z.B. durch Restriktion mit HincII und RsaI, das in einem geeigneten Vektor subkloniert wird, der anschließend mit BgIII und BamHI bzw. HindIII geschnitten wird (s. Fig. 3 und 4).
Die chemische Synthese - vollständig oder teilweise - in Kombination mit der Verwendung von Restriktionsenzymen und/oder Exonucleasen erlaubt die Präparation jedes gewünschten DNA-Fragmentes, das von der Formel (II) umfaßt wird.
Die Erfindung betrifft weiters DNA-Fragmente der DNA der Formel (II). Die Fragmente codieren für ein Polypeptid mit IgE-Bindungsaktivität oder können als Sonden für die Identifizierung solcher DNA aus natürlichen oder synthetischen Quellen verwendet werden. Bevorzugte DNA-Fragmente sind die, die für die bevorzugten Polypeptidfragmente codieren, die von der Formel (I) umfaßt werden. DNA-Sonden haben zumindest 7, vorzugsweise etwa 15 Nucleotide in Sequenz.
2. Präparation eines Hybridvektors: Ein Hybridvektor dieser Erfindung wird dadurch hergestellt, daß eine DNA, codierend für ein Polypeptid der Formel (I), ein Fragment, eine Mutante oder ein Derivat davon in einen geeigneten Vektor gespleißt wird.
Geeignete Vektoren sind Träger für integrierte Passagier-DNA, die man verwenden kann zum Transformieren eines Wirtsmikroorganismus, einschließlich Humanzellen, und die innerhalb des Wirts replizieren können. Als Vektoren eignen sich Plasmide, Phagen oder Cosmide. Geeignete Vektoren tragen die Insert-DNA an einer definierten Position.
Im allgemeinen enthalten solche Vektoren ein Replikon und eine Kontrollsequenz, d.h. einen Promotor, die von Spezies erhalten werden, die mit der Wirtszelle kompatibel sind, in der sie verwendet werden. Der Vektor trägt üblicherweise eine Replikonstelle sowie Sequenzen (Marker- Gene), die befähigt sind, Phänotyp-Selektion in transformierten Zellen zu bieten. Geeignete Marker-Gene verleihen dem Wirt z.B. Resistenz gegen Antibiotika oder Schwermetalle oder sie komplementieren einen genetischen Defekt des Wirts. Weitere nützliche Sequenzen in solchen Vektoren sind Enhancer- und Aktivatorsequenzen.
Die Ausgangsvektoren eignen sich für die Verwendung in Wirtszellen über einen weiten Bereich eukaryotischer und prokaryotischer Organismen. Der Vektor wird in Abhängigkeit von den für die Transformation ins Auge gefaßten Wirtszellen gewählt.
Bevorzugte Ausgangsvektoren sind Plasmid-DNAs und Bakteriophagen-DNAs, die auf dem Gebiet verfügbar sind. Insbesondere sind das Plasmid pBR322 und Derivate davon nützlich. Solche Derivate sind z.B. die Plasmide pUC-8, pUC-9, pMB-9, pGEM -1 und pGEM -2. Von den Bakteriophagen-Vektoren werden die DNAs der Lambda-Phagen bevorzugt, z.B. die DNA des Lambda-Phagen gt-11. Weitere geeignete Phagen-Vektoren sind Charon 4A und EM BL-3-Phage. Das Lambda-Klonierungssystem wurde von Maniatis u.a. (1) beschrieben.
Ein Vektor, der eine Passagier-DNA wie mit der Formel (II) oder (III) trägt, wird als Hybridvektor bezeichnet.
Die erhaltene DNA wird durch herkömmliche Methoden in den Ausgangsvektor gespleißt.
Ein Ausgangssplasmid z.B. wird zuerst durch ein geeignetes Restriktionsenzym linearisiert, z.B. das Plasmid pUC-KO durch PstI, dann in Gegenwart von dGTP und Terminaler Desoxynudeotidyl-Transferase mit d/G-Enden versehen. Das doppelsträngige cDNA-Insert wird in Gegenwart von dCTP und Terminaler Desoxynucleotidyl-Transferase mit dC-Enden versehen. Das Vereinigen beider, cDNA und Vektor, führt zu dem Hybridvektor. Bakteriophagen wie Lambda werden bevorzugt für die Konstruktion genomischer Bibliotheken. Die Lambda-Klonierungssysteme werden von Maniatis u.a. (1) beschrieben. Die geeignete Vektor-DNA wird mit einem geeigneten Restriktionsenzym vollständig verdaut und die linken und rechten Arme werden von den zentralen Fragmenten durch Geschwindigkeitsgradienten-Zentrifugation oder Gelelektrophorese abgetrennt. Eine andere Methode ist die Verdauung von Teilen der Stuffer-Fragmente mit Restriktionsenzymen, denen Erkennungsstellen im linken und rechten Arm fehlen. Die isolierte genomische DNA wird teilweise verdaut zu Fragmenten von 15-20 kb Länge. Danach werden die Arme ligiert mit den Fragmenten von fremder DNA mit Termini, die mit denen der Arme kompatibel sind.
Das passende DNA-Insert wird rekloniert aus dem ursprünglichen Vektor, der für die ursprüngliche Klonierung verwendet wurde, in einen geeigneten Expressionsvektor. Zu diesem Zweck werden passende Restriktionsenzyme (Fig. 3 und 4) verwendet, gegebenenfalls in Kombination mit Exonukleasen, insbesondere Bal31, um die gewünschten DNA-Fragmente herzustellen. Diese Fragmente werden in einen passenden Expressionsvektor integriert, indem die kohäsiven Enden direkt verwendet werden oder durch die Zugabe von passenden chemisch synthetisierten Oligonucleotid-Brücken. Für die Modifizierung der Enden können z.B. HindIII und BgIII verwendet werden. Das Verfahren ist nicht auf diese speziellen Restriktionsenzyme beschränkt. Es kann jedwede gewünschte Verbindung zwischen dem Expressionsvektor und den DNA-Insert hergestellt werden unter Verwendung von geeigneten Restriktionsenzymen in Kombination mit chemisch synthetisierten Oligonudeotiden.
Die Erfindung betrifft auch einen Hybridvektor, umfassend eine DNA, welche codiert für ein Polypeptid der Formel (I), ein Fragment, eine Mutante oder ein Derivat davon, operabel verknüpft mit einer Expressionskontrollsequenz.
Für die Expression wird ein geeigneter Hybridexpressionsvektor verwendet. Der Ausdruck Hybridexpressionsvektor schließt spezielle Vektoren ein, die in der Lage sind, darin enthaltene DNA-Sequenzen zu exprimieren, wo solche DNA-Sequenzen operabel verknüpft sind mit anderen Sequenzen, die in der Lage sind, ihre Expression zu bewirken, d.h. Operator-, Enhancer- und Promotor-Sequenzen. In Summe sind Expressionsvektoren durch eine funktionelle Definition charakterisiert: jedwede DNA-Sequenz, die in der Lage ist, Expression der darin angeordneten spezifizierten DNA-Sequenz zu bewirken. Die Erfindung umfaßt alle Formen von Hybridexpressionsvektoren, die gemacht werden können aus einem Expressionsvektor, der auf dem Gebiet bekannt ist, und funktionellen Äquivalenten, die die für ein erfindungsgemäßes Polypeptid codierenden DNA-Inserts enthalten.
Verschiedene Expressionskontroll-Sequenzen können für die Regulierung der Genexpression verwendet werden. Die mikrobiellen Expressionsvektoren enthalten normalerweise Promotoren, die von dem mikrobiellen Wirt für die Expression seiner eigenen Proteine verwendet werden. Diese Promotoren, die am häufigsten in Konstruktionen rekombinanter DNA verwendet werden, schließen die β-Lactamase- und Lactose-Promotorsysteme (Chang u.a. (9); Goeddel u.a. (10)), das Tryptophan (trp)-Promotorsystem (Goeddel u.a. (11)) oder ein Bakteriophagen-Promotorsystem wie den PL-Promotor von Lambda ein. Während diese die am häufigsten verwendeten sind, wurden andere mikrobielle Promotoren entdeckt und verwendet, und Details bezüglich ihrer Nucleotidsequenzen wurden publiziert, die den Fachmann auf diesem Gebiet in die Lage versetzen, sie funktionell mit Plasmidvektoren zu ligieren (Siebenlist u.a. (12)). Im Prinzip eignen sich alle Vektoren, die in dem gewählten Wirt replizieren und die erfindungsgemäßen Polypeptide exprimieren. Beispiele für Vektoren, die sich für die Expression der genannten Polypeptide eignen, sind die Plasmide pKK223-1, pDR720 und pPL-Lambda oder die Vektoren des Bakteriophagen Lambda wie γ-gt11, die alle kommerziell erhältlich sind (Pharmacia, Schweden; Promega Biofec, USA). Die bevorzugten Vektoren der vorliegenden Erfindung sind die Expressions- und Sekretionsvektoren des Typs pIN-ompA (Gharayeb u.a. (13)) und Vektoren, die den PL-Promotor enthalten.
Vektoren, die sich für Replikation und Expression in Hefe eignen, enthalten einen oder mehr, z.B. zwei, Hefe-Replikon-Starts und einen oder mehr selektive genetische Marker für Hefe. Hybridvektoren, die einen Hefe-Replikon-Start enthalten, z.B. chromosomal autonom replizierendes Segment (ars 1) oder 2 u ori, werden extrachromosomal in der Hefezelle nach der Transformation gehalten und werden autonom repliziert. Geeignete Marker-Gene für Hefe sind insbesondere die, die dem Wirt antibiotische Resistenz verleihen, oder, im Falle auxotropher Hefe-Mutanten, Gene, die Wirtsläsionen komplementieren. Entsprechende Gene verleihen z.B. Resistenz gegen das Antibiotikum Cycloheximid oder sorgen für Prototrophie in einer auxotrophen Hefe-Mutante, z.B. URA3-, LEU2-, HIS3- oder insbesondere TRP1-Gen. Hefe-Hybridvektoren enthalten weiters vorzugsweise einen Replikon-Start und ein Marker-Gen für einen bakteriellen Wirt, insbesondere E.coli, so daß die Konstruktion und Klonierung der Hybridvektoren und ihrer Zwischenprodukte auch in einem bakteriellen Wirt erfolgen kann (Shuttle-Vektoren). Expressionskontrollsequenzen, die sich für die Expression in Hefe eignen, sind z.B. die von hochexprimierten Hefe-Genen. Die Promotoren von TRP1-Gen, ADHI- oderADHII-Gen, Phosphatase (PHO3 oder PHO5)-Gen, Isocytochrom-Gen oder ein Promotor, der mit dem glycolytischen Weg verbunden ist, wie der Promotor von Enolase, Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (GAPDH) oder 3-Phosphoglycerat-Kinase (PGK) können verwendet werden.
Bevorzugte Vektoren enthalten Promotoren, die durch Variation der Wachstumsbedingungen an- oder abgedreht werden können. Z.B. der PHO5-Promotor kann allein durch Erhöhen oder Senken der Konzentration von anorganischem Phosphat in dem Medium reprimiert oder dereprimiert werden.
Expressionsvektoren für solche Zellen schließen üblicherweise eine vielseitige und starke Enhancer/Promotor-Einheit ein, die sich vor dem Gen befinden das exprimiert werden soll. Wenn cDNA zu exprimieren ist, werden RNA-Spleißstellen, Polyadenylierungsstellen und schließlich eine Transcriptions-Terminator-Sequenz dem Gen hinzugefügt. Für die Verwendung in Säugerzellen werden die Kontrollfunktionen an den Expressionsvektoren oft von viralem Material bereitgestellt. Beispielsweise üblicherweise verwendete Enhancer-Promotor-Einheiten werden abgeleitet aus simian virus 40 (SV40), Rous Sarkom-Virus, Adenovirus 2 oder Maus- und Human- Cytomegalovirus. Insbesondere sind die Enhancer-Promotor-Einheit des unmittelbaren frühen Gens von Maus-Cytomegalovirus und der SV40-Enhancer kombiniert mit dem Human-α-Globin-Promotor geeignet. Weiters sind induzierbare Promotoren wie die, die von den Hitzeschock- oder Metallothionin-Genen abgeleitet sind, nützlich. Weiters ist es auch möglich, Promotor- und Kontrollsequenzen zu verwenden, die normalerweise mit der gewünschten Gensequenz assoziiert sind. Ein Replikationsursprung kann durch Konstruktion des Vektors, um einen exogenen Ursprung einzuschließen, wie von SV40 oder anderer viraler Quelle abgeleitet (z.B. Polyoma, Adeno, VSV, SPV, etc.), oder durch den chromosomalen Replikationsmechanismus der Wirtszelle bereitgestellt werden. Wenn der Vektor in das Wirtszellenchromosom integriert ist, ist letztere Methode oft effizienter.
Die erneute Isolierung der Vektor-DNA, die das klonierte DNA-Insert enthält, aus einem Wirt erfolgt wie auf diesem Gebiet üblich, insbesondere durch Lysis der Wirtszelle und Reinigung der DNA durch Zentrifugieren, insbesondere CsCI-Dichte-Zentrifugation und Phenol/Chloroform-Extraktion.
Die Erfindung betrifft auch Hybridvektoren, die als ein Insert eine DNA-Sequenz umfassen, codierend für ein Polypeptid der Formel (I), oder ein Fragment, eine Mutante oder ein Derivat davon.
Insbesondere betrifft die Erfindung einen Hybridvektor, umfassend als Insert eine DNA-Sequenz, die für ein Fragment des Polypeptids der Formel (I) codiert, dadurch gekennzeichnet, daß das Insert codiert für ein Polypeptid der Formel (I), worin die Aminosäuresequenz, die die Aminosäuren 106 bis 127 umfaßt, deletiert ist; oder ein Fragment des Polypeptids der Formel (I), das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Polypeptiden ausgehend von irgendeiner der Aminosäuren 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159 oder 160 und mit irgendeiner der Aminosäuren zwischen 282 und 321 endend; oder ein Fragment des Polypeptids der Formel (I), das aus der Aminosäuresequenz von Aminosäure 119 bis Aminosäure 321 besteht; oder ein Fragment des Polypeptids der Formel (I), das aus der Aminosäuresequenz von Aminosäure 134 bis Aminosäure 321 besteht; oder ein Fragment des Polypeptids der Formel (I), das aus der Aminosäuresequenz von Aminosäure 148 bis Aminosäure 321 besteht; oder ein Fragment des Polypeptids der Formel (I), das aus der Aminosäuresequenz von Aminosäure 150 bis Aminosäure 321 besteht.
Insbesondere betrifft diese Erfindung einen Hybridvektor, umfassend eine DNA-Sequenz der Formel (II) oder (III), oder ein Fragment oder eine Mutante davon.
Spezifische Hybridvektoren sind pCL2, pCL1, pFK-1, pFK-2, pPL-BF, pJDB207R/PHO5-BF, pCAL5-R/ND, pCAL8-BF/ND und pPL.PTKIS-BF (Fig. 1 bis 8).
Ein weiterer erfindungsgemäßer Hybridvektor umfaßt eine DNA-Sequenz von zumindest 15 Nucleinsäuren, die 100 % homolog zu einem Teil des Inserts der Formel II) ist.
3. Transformation eines Wirts: Neben einem kraftvollen Expressionsvektor wird eine kompatible Wirtszelle für die Expression des gewünschten erfindungsgemäßen Polypeptids verwendet. Im allgemeinen werden Prokaryoten für die Klonierung von DNA-Sequenzen und Zusammenbauen der Vektoren bevorzugt. Die zusammen gebauten Vektoren werden dann in geeignete Wirtszellen transferiert, wobei prokaryotische sowie eukaryotische Zellen verwendet werden können. Mikrobielle Spezies, die verwendet werden können, schließen E.coli, Bacillus subtilis, Bacillus staerothermophilus und andere Enterobakteriaceae, wie Salmonella tryphimurium oder Serratia marcesans, und verschiedene Pseudomonas-Spezies ein. Insbesondere sind E.coli-Stämme wie E.coli B, HB101, BZ234, X1776, W3110, JA221 und K12 nützlich. Diese Beispiele sollen natürlich nur illustrierend sein, nicht einschränkend.
Zusätzlich zu Prokaryoten, können auch eukaryotische Mikroben, wie Hefe verwendet werden. Saccharomyces cerevisiae oder herkömmliche Bäckerhefe werden am häufigsten unter den eukaryotischen Mikroorganismen verwendet, obgleich eine Anzahl anderer Spezies üblicherweise verfügbar sind. Für die Expression in Saccharomyces kann z.B. das Plasmid YRp7 (Stinchomb u.a. (14); Kingsman u.a. (14a),Tschemper u.a. (15)) verwendet werden.
Zusätzlich zu Mikroorganismen können Kulturen von Zellen, die abgeleitet sind von vielzelligen Organismen auch als Wirte verwendet werden. Im Prinzip ist jede solche Zellkultur einsetzbar, ob nun von Vertebraten oder Invertebraten; Vertebraten-Zellkulturen sind jedoch von größerem Interesse. Beispiele für solche nützlichen Wirtszellinien sind Vero- und HeLa-Zellen, CHO-Zellinien (Chinese hamster ovary), Bowes-Melanom-Zellinien, RPMI 8866 und Cos-7-Zellinien.
Die Transformation der erhaltenen Hybridvektor-DNA in einen Rezipienten erfolgt nach auf dem Gebiet gut bekannten Methoden, z.B. wie von Maniatis u.a. (1) beschrieben. Bakterien werden mit Hybridvektor-DNA z.B. durch die CaCl-Transformationsmethode transformiert.
Eine andere geeignete Transformationsmethode für E.coli-Wirtsbakterien in Verbindung mit der DNA von Lambda-Phagen als Vektor ist in vitro-Verpackung der Hybridvektor-DNA und Infektion der Bakterien. Die in vitro-Verpackung wird hauptsächlich durch Verwendung geeigneter Verpackungs-Kits erreicht (Phannacia, Schweden; Boehringer, Mannheim). Die Infektion erfolgt durch die MgCl&sub2;-Methode, wie von Maniatis (1) beschrieben, Seite 275.
Die Transformation von Hefe umfaßt z.B. die Schritte der enzymatischen Entfernung der Hefe-Zellwand mittels Glucosidasen, Behandlung der erhaltenen Sphäroplasten mit dem Vektor in Gegenwart von Polyethylenglycol und Ca²&spplus;-Ionen und Regeneration der Zellwand durch Einbetten der Sphäroplasten in Agar. Vorzugsweise wird der Regenerationsagar so hergestellt, daß er Regeneration und Selektion der transformierten Zellen gleichzeitig erlaubt.
Die Transformation von Vertebraten-Zellen, die in Gewebekulturen gezüchtet werden, erreicht man durch Anwendung einer von mehreren Methoden, die auf dem Gebiet gut bekannt sind. Direkte Mikroinjizierung von DNA in den Zellkern, Fusion von E.coli-Protoplasten mit der zukünftigen Wirtszelle oder Zugabe von Co-Präzipitaten zwischen DNA und Calciumphosphat können angewendet werden. Die anschließende Selektion transformierter Zellen kann unter Verwendung eines Selektionsmarkers erfolgen, der entweder kovalent in den Expressionsvektor integriert ist oder als separate Einheit hinzugefügt wird. Selektionsmarker schließen Gene ein, die Resistenz gegen Antikörper-Resistenz, wie G418 und Hygromycin, verleihen, oder Gene, die eine genetische Läsion der Wirtszelle komplementieren, wie die Abwesenheit der Thymidin-Kinase oder Hypoxanthin-Phosphoribosyl-Transferase.
4. Selektion transformierter Wirte: Transformierte Wirte, die die Eigenschaften der Selektionseinheiten in den Vektoren integriert tragen, werden von untransformierten Wirten speziell durch Wachstum der Bakterien unter passenden Selektionsbedingungen selektiert, wobei nur die transformierten Wirte überleben. Eine andere Methode der Selektion in Verbindung mit Bakteriophagen ist die Plaque-Bildung an plattierten E.coli-Wirtsbakterien.
Das Screening für Wirte, die einen Hybridvektor tragen, umfassend als Insert eine DNA, die für ein erfindungsgemäßes Polypeptid codiert, kann durch Verwendung radioaktiv markierter Oligonucleotid-Sonden erreicht werden, die für ein Fragment eines solchen Polyoeptids codieren, oder durch Screening für das Polypeptidprodukt des besagten DNA-Inserts. Die Hybridisierung erfolgt speziell mit mRNA oder einer Oligonucleotid-Sonde, die etwa 12 oder mehr aufeinanderfolgende Nucleotide enthält, die für ein Fragment eines erfindungsgemäßen Polypeptids codieren.
Insbesondere kann die Selektion von E.coli-Wirten, die durch Hybridvektoren transformiert wurden, die ein Insert tragen, das für ein erfindungsgemäßes Polypeptid codiert, durch Hybridisierung einer Oligonucleotid-Sonde zu Replika-Filtern erfolgen, die erhalten werden aus einer cDNA-Bibliothek, aufgestrichen auf Agaroseplatten. Das Oligonucleotid kann am 5'-Ende mit ³²P-αATP unter Verwendung des Enzyms T&sub4;-Kinase markiert werden, oder innen durch geprimte Synthese mit Klenow-Polymerase unter Verwendung eines Fragments der cDNA, das für ein erfindungsgemäßes Polypeptid codiert, kloniert in Phage M13.
Das Proteinprodukt für Screening-Zwecke wird durch in vitro- oder in vivo-Translation insbesondere unter Verwendung des Xenopus laevis-Oocytensystems, wie von Maniatis u.a. (1) beschrieben, erhalten. Das translatierte Proteinprodukt wird durch Verwendung monoklonaler Antikörper detektiert, wie Mab-45, Mab-176 und Mab-135, oder durch Verwendung eines funktionellen Testsystems, wie die Bindung von IgE an das Polypeptid, wie das in dem Rosetteninhibierungstest von Sarfati u.a. (17) gemacht wird.
Rekombinante Phagen, die eine DNA-Sequenz tragen, die für ein erfindungsgemäßes Polypeptid codiert, werden durch Hybridisierung identifiziert, wobei eine radioaktiv markierte Nucleinsäuresequenz, umfassend ein Fragment der DNA, das für besagtes Polypeptid codiert, für die Hybridisierung verwendet wird. Alternativ werden sie durch immunologisches Screening unter Verwendung monoklonaler Antikörper, wie Mab-135 oder Mab-176, detektiert.
Modifizierung der codierenden oder nicht-codierenden Region des Hybridvektors wird z.B. durch hier zuvor beschriebene Methoden, z.B. unter 1d), erreicht.
Die Erfindung betrifft weiters die Verwendung der erfindungsgemäßen Polypeptide mit IgE-Bindungsaktivität für die Behandlung oder Verhinderung allergischer Zustände bei Patienten, die gegen alle Arten von Antigenen allergisch sind, z.B. Pollen, Katzen-Hautschuppen, Hausstaubmilben und dergleichen. Speziell wichtig wäre die Behandlung von Risikopatienten während kritischer Perioden, darunter insbesondere Risikoneugeborene, die nicht gestillt werden. Die erfindungsgemäßen Polypeptide werden enteral, z.B. nasal, rektal oder oral, oder parenteral, z.B. intramuskulär, subkutan oder intravenös, üblicherweise in Dosierungseinheitsformen wie Tabletten, Dragees, Ampullen, Vials oder Suppositorien verwendet. Die zu verabreichende Menge des Polypeptids hängt von seiner spezifischen Aktivität, dem Gewicht und allgemeinen Zustand des Patienten, der Heftigkeit der Erkrankung, der Verabreichungsart ab und muß auf der Beurteilung des Arztes beruhen. Im allgemeinen kann eine Dosis zwischen etwa 100 ug und etwa 5000 ug pro kg Körpergewicht und Tag verabreicht werden.
Die Erfindung betrifft weiters pharmazeutische Zubereitungen, die erfindungsgemäße Polypeptide mit IgE-Bindungsaktivität in einer antiallergisch wirksamen Menge enthalten, wahlweise in Verbindung mit herkömmlichen pharmazeutisch annehmbaren Trägern, die sich für orale, rektale, nasale oder parenterale, d.h. intramuskuläre, subkutane oder intraperitoneale Verabreichung eignen und mit dem Wirkstoff nicht nachteilig wechselwirken.
Es gibt geeignete Tabletten, Kapseln, Vials, die ein festes Pulver enthalten, oder Zerstäuber, Sprays, Vials, Ampullen und dergleichen, die Infusionslösungen, vorzugsweise wäßrige Lösungen oder Suspensionen enthalten, wobei es möglich ist, diese vor der Verwendung herzustellen, z.B. aus lyophilisierten Zubereitungen, die den Wirkstoff allein oder zusammen mit einem Träger enthalten, wie Mannit, Lactose, Glucose, Albumin und dergleichen. Die pharmazeutische Zubereitung kann sterilisiert und, falls das gewünscht wird, mit Adjuventien vermischt werden, z.B. Konservierungsmitteln, Stabilisatoren, Emulgatoren, Solubilisatoren, Puffern und/oder Salzen für die Regulierung des osmotischen Druckes. Sterilisierung kann durch Sterilflltration durch Filter kleiner Porengröße (0,45 um Durchmesser oder kleiner) erreicht werden, wonach die Zubereitung lyophilisiert werden kann, falls das gewünscht wird. Antibiotika können zugesetzt werden, um die Bewahrung der Sterilität zu unterstützen.
Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zubereitungen werden in Dosierungseinheitsformen abgegeben, z.B. Ampullen, umfassend 1 bis 2000 mg eines pharmazeutisch annehmbaren Trägers pro Dosierungseinheit und etwa 1 bis 100 mg, vorzugsweise etwa 2 bis 50 mg des Wirkstoffes pro Dosierungseinheit.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstelllung einer pharmazeutischen Zubereitung, dadurch gekennzeichnet, daß ein erfindungsgemäßes Polypeptid mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger vermischt wird.
Die pharmazeutischen Zubereitungen werden auf an sich bekannte Weise hergestellt, z.B. durch herkömmliches Mischen, Lösen, Lyophilisieren und ähnliche Verfahren, und enthalten etwa 0,1 % bis 100%, speziell etwa 1 % bis 50% Wirkstoffe.
Die Verwendung der neuen erfindungsgemäßen Polypeptide für die prophylaktische und therapeutische Behandlung des menschlichen Körpers ist auch ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung.
Die in der ganzen Beschreibung verwendeten Abkürzungen haben die folgende Bedeutung: bp: Basenpaare; BSA: Rinderserumalbumin; cDNA: komplementäre DNA; cpm: ("counts per minute") Impulso pro Minute (radioaktiver Zerfall); dA: 2'-Desoxyadenosin; dATP: 2'-Desoxyadenosintriphosphat; dC: 2'-Desoxycytidin; dCTP: 2'-Desoxycytidintriphosphat; dG: 2'-Desoxyguanosin; dGTP: 2'-Desoxyguanosintriphosphat; dT: 2'-Desoxythymidin; dTTP: 2'-Desoxythymidintriphosphat; DNA: Desoxyribonucleinsäure; dNTP: Mischung von dATP, dCTP, dGTP und dTTP; ds: doppelsträngig; DTT: 1,4-Dithiothreitol; EDTA: Ethylendiamintetraessigsäure-Dinatriumsalz; FCS: fetales Kälberserum; HAT: Hypoxanthin/Aminopterin/Thymidin; HBSS: Hank's "balanced" Salzlösung; HT: Hypoxanthin/Aminopterin; Hepes: N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethensulfonsäure; IgE: Immunglobulin E; mRNA: Messenger-RNA; min: Minuten; PBS: phosphatgepufferte physiologische Kochsalzlösung; Pipes: Piperazin-N,N'-bis(2-ethansulfonsäure); PMSF: Phenylmethylsulfonylfluorid; RIA: Radioimmunoassay; RNA: Ribonucleinsäure; UpM: Umdrehungen pro Minute; SDS: Natriumdodecylsulfat; ss: einzelsträngig; Tris: Tris(hydroxymethyl)aminomethan; tRNA: Transfer-RNA; ug: Mikrogramm.
Die folgenden Beispiele dienen der Illustration der vorliegenden Erfindung und sollen nicht als Einschränkung ausgelegt werden.
Beispiele: Die folgenden Pufferlösungen und Medien werden verwendet: Agar: LB-Brühe, ergänzt mit 2 % Agar; Elutionspuffer: 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM EDT, 0,2 % SDS; LB-Brühe: 1 % Bacto-Trypton (Difco), 0,5 % Bacto Hefe-Extrakt (Difco), 170 mM NaCl, mit NaOH eingestellt auf pH 7,5; Lyselösung: 0,5 M NaOH, 1,5 N NaCl; HBSS: 8 g NaCl, 400 mg KCl, 48 mg Na&sub2;HPO&sub4;, 350 mg NaHCO&sub3;, 60 mg KH&sub2;PO&sub4;, 100 mg Phenolrot in 1 Liter H&sub2;O; HBSS-FCS: HBSS, ergänzt mit 10 % FCS, 0,01 % NaN&sub3;, 66 mM Tris-HCl pH 7,2; HT-Medium: RPMI/c-Medium, ergänzt mit 40 ul 2-Mercaptoethanol, 100 uM Hypoxanthin, 1 uM Thymidin; HAT-Medium: HT-medium, ergänzt mit 10 mM Aminopterin; MBS-H: 88 mM NaCl, 1 mM KCl, 0,33 mM Ca(NO&sub3;)&sub2;, 0,41 mM CaCl&sub2;, 0,82 mM MgSO&sub4;, 2,4 mM NaHCO&sub3;, 10 mM Hepes (pH 7,4); McConkey-Agar: 50g vorvermischter McConkey-Agar (Becton Dickinson) pro Liter destilliertes Wasser, Oocyten Lysepuffer: 20 mM Tris-HCl pH 7,5, 50 mM NaCl, 0,5 % Triton X 100, 0,5 % Natriumdesoxycholat, 0,1 % Methionin, 1 mM PMSF; PBS: 1 Liter enthält 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1.44 g Na&sub2;HPO&sub4;.2H&sub2;O, 0,2 g KH&sub2;PO&sub4;; RPMI 1640-Medium: bei Gibco erhältlich; RPMI 1640/c-Medium: RPMI 1640-Medium, ergänzt mit 1 % Penicillin-Streptomycin (Gibco), 1 % L-Glutamin (Gibco) und 15 % (v/v) FCS (Gibco); RVT-Puffer: 200 mM Tris-HCl, pH 8,3 bei 42ºC, 20 mM MgCl&sub2;, 280 mM KCl, 20 mM DTT; SOC-Medium: 2 % Bacto-Trypton (Gibco), 0,5 % Hefe-Extrakt (Gibco), 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl&sub2;, 5 mM MgSO&sub4;, 20 mM Glucose; SSC-Puffer: 15 mM Natriumcitrat, 150 mM NaCl; TBE-Puffer: 1 Liter enthält 10,8 g Tris, 5,5 g Borsäure, 4 ml 0,5 ml EDTA (pH 8,0); TE-Puffer: 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 1 mM EDTA; TNE-Puffer: 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 0,1 M NaCl, mit NaOH eingestellt auf pH 7,8; Waschpuffer: 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 1 mM EDTA, 0,5 M NaCl, 0,2 % SDS.
Verwendung von Restriktionsenzymen und Isolierung von DNA: Alle Restriktionsenzyme werden unter den Pufferbedingungen verwendet, wie sie vom Lieferanten auf dem Enzymdatenblatt empfohlen werden. Im allgemeinen werden 3 Einheiten eines Enzyms verwendet, um 1 ug DNA zu verdauen. Die Inkubationen läßt man 2 Stunden bei 37ºC. Um die enzymatische Reaktion zu stoppen, werden EDTA und Na-Acetat zu Endkonzentrationen von 15 mM bzw. 200 mM zugesetzt. Um DNA zu extrahieren, wird ein Volumen eines 1:1-Gemischs von Chloroform/Phenol, vorgesättigt mit TNE, zugesetzt und das Gemisch kräftig geschüttelt. Die organische und die wäßrige Phase werden durch Zentrifugieren bei 5000 g für 5 min (Raumtemperatur) getrennt. Die wäßrige Phase wird in ein neues Röhrchen transferiert und mit 1 Volumen Chloroform extrahiert. Nach Zentrifugation wird die DNA durch Zugabe von 2,5 Volumina Ethanol ausgefällt. Die Probe wird zumindest 2 Stunden bei -20ºC inkubiert und bei 10000 g 10 Minuten zentrifugiert. Das DNA-Pellet wird einmal mit 70%igem Ethanol gewaschen, 10 Minuten in einem Vakuum-Exsikkator getrocknet und schließlich in dem geeigneten Volumen TE-Puffer aufgelöst.
Die folgenden Stämme werden verwendet: E.coli-Stamm HB101: F&supmin;, hsdS20 (r&supmin;β, m&supmin;B), recA13, ara14, proA2, lacY1, galK2, rspL20(Sm'), xyl-5, mtl-1, supE44, λ&supmin;. (Boyer und Rouland-Dussoix 1969; Bolivar und Backman 1979).
RPMI 8866-Zellinie: RPMI 8866-Zellen (ATCC Nr. CCL 107) sind aus einer Lymphoblastoid-B-Zellinie, Rezeptoren für IgE exprimierend. Die Zellinie wurde von Dr. P. Ralph, Sloan-Kettering Research Institute, NY, USA erhalten.
Die folgenden Plasmide werden verwendet: pUC-9: Erhältlich bei Pharmacia, P-L Biochemicals Upsalla, Schweden. Das pUC-9-Plasmid besteht aus einem pBR322-abgeleiteten Ampicillinase-Gen und einem Ursprung der DNA-Replikation, ligiert an einen Teil des lac Z-Gens von E.coli. Ein DNA-Insert, das eine Anordnung einzelner Erkennungsstellen für Restriktionsenzyme enthält, wurde in die lac Z-Region dieses Plasmids eingeführt.
pUC-KO: Dieses Plasmid ist ein Derivat von pUC-9, in dem die Promotor/Operator-Region des lac Z-Gens deletiert ist zwischen der Haell-Restriktionsstelle gerade außerhalb der Promotor- Sequenz und der HindIII-Restriktionsstelle, innerhalb des Polylinkers, wobei die anderen Sequenzen des pUC-9-Plasmids unverändert gelassen werden.
pGEM -1. Erhältlich von Promega Biotec, Madison, USA. Dieses Plasmid ist ein spezieller Transcriptionsvektor. Er wurde unter Verwendung des Bakteriophagen SP6 Promotor enthaltenden Plasmids pSP64 (Melton, D.A., u.a. (16)) und einem Bakteriophagen-T7-Promotor konstruiert. Das resultierende Plasmid hat zwei entgegengesetzte Promotoren SP6 und T7, die durch ein kurzes Stück DNA getrennt sind, das multiple Klonierungsstellen enthält.
pIN-III-ompA-Plasmide: Beschrieben von Gharayeb u.a. (13). Diese Plasmide sind spezielle Sekretions-Klonierungsvektoren in E.coli. Die Sekretion eines klonierten Genproduktes über die cytoplasmatische Membran kann durch Fusion passender Signalpeptide an das Amino-terminale Ende des Genproduktes erreicht werden. In diesen Plasmiden wurde das DNA-Fragment, das für das Signalpeptid des ompA-Proteins codiert, ein Hauptprotein äußerer Membran von E.coli, in einen Überexpressionsvektor inseriert. Ein fremdes DNA-Fragment kann in irgendeinem der drei Leserahmen an den einzelnen EcoRI-, HindIII- oder BamHI-Stellen unmittelbar nach der ompA-Signalpeptid codierenden Sequenz kloniert werden. Die pIN-III-ompA-Plasmide des Typs 1, 2 und 3 lösen verschiedene Leseranmen für die Translation aus.
Beispiel 1: Isolierung von mRNA aus RPMI 8866-Zellen: RPMI 8866-Zellen werden in Gewebekulturkolben (Falcon, 175 cm²) mit 50 ml RPMI-1640-Medium, das ergänzt ist durch 15 % FCS, 100 Einheiten/ml Penicillin und 100 ug/ml Streptomycin, gezüchtet. Die Zellen aus 50 konfluenten Kolben (ungefähr 10&sup8; Zellen/Kolben) werden durch Zentrifugieren gesammelt und einmal mit 50 ml PBS gewaschen. Das Zellpellet (5 g) wird in 25 ml einer Lösung gelöst, die hergestellt wird aus 100 g Guanidiniumthiocyanat, 100 ml H&sub2;O, 10,6 ml 1 M Tris-HCl, pH 7,5, 4,2 ml 0,5 M EDTA, 21.2 ml 20%iges N-Laurylsarcosin und 2,1 ml 2-Mercaptoethanol. Das Zell-Lysat wird in einem "Omnimixer" 90 Sekunden bei voller Geschwindigkeit homogenisiert. Zwei Volumina einer 1:1-Mischung von Chloroform und Phenol werden zugesetzt. Das Gemisch wird 1 Minute lang kräftig geschüttelt und dann bei 5000 g 10 min in einer Sorvall-Zentrifuge bei 10ºC zentrifugiert. Die wäßrige Phase wird gewonnen und die Extraktion 4 weitere Male wiederholt. Zwei Volumina Ethanol werden der wäßrigen Phase zugesetzt. Der Niederschlag wird gewonnen durch Abschrecken auf -20ºC für 15 Minuten, gefolgt von Zentrifugation bei 10000 UpM bei 4ºC in einem Sorvall-SS-34-Rotor für 10 Minuten. Das Pellet wird in 4 ml TE-Pulfer gelöst. 7,5 g getrocknetes CsCl (Merck) und 50 ul 0.1 N HCl werden zugesetzt, und die Lösung wird auf 7,5 ml eingestellt und auf ein 2-ml-Kissen von 5.7 M CsCl in einem 12-ml-Zentrifugenröhrchen geschichtet. Das Röhrchen wird mit H&sub2;O aufgefüllt und 16 h bei 29000 UpM bei 20ºC in einem TST-41-Rotor (Kontron) zentrifugiert Am Ende dieses Durchgangs wird das meiste von dem Überstand entfernt, und das Röhrchen wird durch schnelles Umdrehen drainiert. Das glasige RNA-Pellet wird gelöst in 1 ml TE-Puffer und 0,2%igem SDS durch Behandeln im Vortex und fallweises Erwärmen (2 Minuten) bei 37ºC. Die RNA wird mit Ethanol wie von Maniatis u.a. (1) beschrieben, S. 461-462, gefällt. Die getrocknete mRNA wird in 1 ml Elutionspuffer gelöst. Nach Erhitzen für 2 Minuten auf 68ºC und Abschrecken auf Eis werden 130 ul 5M NaCl zugesetzt, und die Lösung wird aufgebracht auf eine 2-ml-Säule Oligo-dT-Gellulose (2 ml Bettvolumen in einer 5-ml-Spritze Typ 7, P-L Biochemicals), äquilibriert in Waschpuffer. Nach zweimaligem aufeinanderfolgendem Aufbringen der Probe wird die Säule mit 15 ml Waschpuffer gewaschen, und die gebundene mRNA mit 4 ml Elutionspuffer eluiert. Das eluierte Material wird 2 Minuten auf 68ºC erhitzt, auf Eis abgeschreckt und 0.44 ml 5 M NaCl werden zugesetzt. Die Lösung wird zweimal auf die re-äquilibrierte Oligo-dT-Cellulose-Säule aufgebracht. Nach Waschen mit 15 ml Waschpuffer wird die gebundene mRNA mit 4 ml Elutionspuffer eluiert. Die Gewinnung von mRNA wird bestimmt durch Messung der Extinktion bei 260 nm (OD260nm=1 gemäß einer Konzentration von 40 ug/ml). Die mRNA (150 ug) wird mit Ethanol gefällt. Der Niederschlag wird durch Zentrifugieren (15 min bei 16000 g) gesammelt, in 0,4 ml H&sub2;O gelöst und erneut mit Ethanol gefällt. Das mRNA-Pellet wird luftgetrocknet und in 150 ul TE-Puffer, der ergänzt ist mit 0,1 % SDS, gelöst.
Beispiel 2: Anreicherung von mRNA, die für IgE-Rezeptor und zu IgE-BF verwandte Polypeptide codiert. 130 ug PolyA-mRNA aus Beispiel 1 (1 ug/ul) werden 5 Minuten auf 70ºC erhitzt, auf Eis abgeschreckt und auf 12 ml eines 5-20 % linearen Saccharose-Gradienten in 0.1 M NaCl, 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 1 mM EDTA und 0,5 % SDS geladen. Der Gradient wird 5 Stunden bei 41000 UpM in einem TST-41-Rotor bei 25ºC zentrifugiert. 30 Fraktionen (Volumen 0.4 ml/Fraktion) werden gesammelt und durch Injizieren in Oocyten von Xenopus laevis wie im Beispiel 3 beschrieben untersucht.
Beispiel 3: In vivo-Translation von mRNA in Xenopus laevis-Oocvyten. Erwachsene männliche und weibliche Xenopus laevis können aus einer Vielzahl von Tierlieferanten erhalten werden, darunter K. Evans (716 Northside, Ann Arbor, MI 48105). Die Frösche können in jeder Art von Wasserbehälter gehalten werden, ohne Belüftung, bei 18-22ºC. Regelmäßige Fütterung (zweimal pro Woche, mit Fragmenten von Rinderleber und Rinderherz wird dabei helfen, die Kolonie gesund zu halten. Oocyten sollten aus gesunden, erwachsenen, weiblichen Xenopus erhalten werden. Dies erfolgt leicht durch Anästhesieren des Frosches in einer 1:1000 (w/v)-Lösung von Ethyl-m-aminobenzoat in Wasser für 10 - 30 Minuten. Ein kleiner Einschnitt (1 cm) an der hinteren Bauchseite ermöglicht leichten Zugriff zum Ovar des Frosches. Nach Entfernung eines Segmentes des Ovars kann der Einschnitt vernäht werden, und der Frosch wird sich im Wasser schnell erholen. Das Ovar sollte sofort in modifizierte Barth-Kochsalzlösung (MBS-H) gebracht werden, und individuelle Oocyten werden mit einer Platinschleife abgenommen. Große, voll ausgewachsene Oocyten werden unter Verwendung einer feinen Mikropipette, einer Micrometerspritze und eines Standard-Stereo-Seziermikroskops injiziert. Die Konstruktion einer geeigneten Injektionspipette wird von Gurdon (18) beschrieben. Oocyten werden auf einen Mikroskop-Objektträger gebracht, mit einem Papierhandtuch trockengetupft, und der Objektträger wird dann auf den Objekttisch gebracht. Vor und während der Insertion der Pipette können die Oocyten mit stumpfen Watchmaker's Zangen positioniert werden. Nachdem die Pipette in die Oocyten eingedrungen ist, wird ein 30-50-nl-Aliquot der mRNA-Lösungen (1 mg/ml) von Beispiel 2 unter Verwendung einer Micrometerspritze abgegeben. Gruppen von 40 Eiern, die die mRNA derselben Fraktion enthalten, werden in 0,5 ml Barth-Lösung, die ergänzt ist mit 6 % FCS, 45 h bei 20ºC inkubiert. Das Inkubationsmedium wird entfernt, und die Oocyten werden in 900 ul Oocyten-Lysepuffer homogenisiert. Das Homogenat wird in einer Eppendorf-Zentrifuge 10 Minuten zentrifugiert. Die obere Phase wird gewonnen und Aliquote von 50 ul in einem RIA getestet, wie im Beispiel 7 beschrieben.
Beispiel 4: Herstellung von Hybridom-Zellen, die monoklonale Antikörper gegen FC&epsi;R produzieren. BALB/c-Mäuse werden durch drei intraperitoneale Injektionen von 5 x 10&sup7; lebensfähigen RPMI 8866-Zellen in PBS in 4-Wochen-Intervallen immunisiert. Individuelle Mausserumproben, die zwei Tage nach der letzten Injektion gesammelt werden, werden hinsichtlich der Anti-Fc&epsi;R-Aktivität getestet. Milzzellen von zwei Tieren, die die höchsten Titer zeigen, werden zusammengefaßt und am nächsten Tag für Fusion verwendet. Milz wird zerzupft und für jede Fusion werden 1 x 10&sup8; gewaschene Milzzellen mit 25x10&sup6; NSI/1-Ag4/1 Maus-Myelomzellen (erhalten von der American type tissue culture collection) 5 min bei 350 x g pelletiert. Das Zellpellet wird vorsichtig 30 s in 2 ml Polyethylenglycol-Lösung (PEG-1540, Baker), bestehend aus 20 g PEG gelöst in 28 in RPMI 1640-Medium (Gibco), das 15 % (v/v) Dimethylsulfoxid enthält, resuspendiert.
8 ml RPMI/c-Medium werden tropfenweise über eine Dauer von 90 s zugesetzt, gefolgt von schneller Zugabe weiterer 5 ml. Die Zellsuspension wird durch Umdrehen des Röhrchens gemischt, 2,5 min stehen gelassen und bei 350 x g 5 min zentrifugiert. Das Pellet wird in 5 ml RPMI/c-Medium resuspendiert und 50-ul-Aliquote werden in jede Vertiefung von 4 Gostar # 3596 Platten mit 24 Vertiefungen abgegeben, die auch 1 x 10&sup6; normale BALB/c-Milzzellen in 1 ml HAT-Medium enthalten. Alle Kulturen werden durch abwechselnde Zugabe oder Ersetzenvon HAT-Medium alle paar Tage, wie erforderlich, aufrechterhalten, wobei am fünften Tag nach der Fusion begonnen wird. Nach 14 Tagen wird HAT durch HT-Medium ersetzt, und nach 28 Tagen durch RPMI/c. Überstände individueller Vertiefungen (192 Kulturen) werden hinsichtlich Anti-Fc&epsi;R-Antikörper ein oder zwei Wochen nach der Fusion gescreent. 21 Kulturen, die die gewünschten Antikörper produzieren, werden durch limitierende Verdünnung kloniert; sie werden in RPMI/c auf eine Konzentration von 10 lebensfähigen Zellen/ml verdünnt, und 50-ul-Aliquote dieser Suspensionen werden in Vertiefungen von Platten mit 96 Vertielungen gebracht (Linbro # 76-003-05, Flow Labs), die 100 ul HT-Medium und 1 x 10&sup5; normale BALB/c-Milzzellen enthalten. Die Vertiefungen werden mikroskopisch untersucht, um sicherzustellen, daß die wachsenden Kulturen monoklonal sind. Davon genommene Proben der Überstände werden hinsichtlich der Antikörper-Aktivität untersucht; positive Kulturen werden selektiert und in größeren Kulturgefäßen expandiert. 14 monoklonale Zellinien, die Antikörper der erforderlichen Spezifität abgeben, werden schließlich erhalten. Drei Klone, die 207.25.A.4.4/45, 208.25A.4.3/135 und 208.25D.2.1/176 genannt werden, die bei der Collection Nationale de Cultures de Microorganismes des Instituts Pasteur, Paris, hinterlegt sind, unter der Zugriffsnummer I-452, I-425 bzw. I-420 erhältlich sind, werden hier verwendet. Die dabei produzierten monoklonalen Antikörper werden als Mab-45, Mab-135 und Mab-176 bezeichnet.
Beispiel 5: Isolierung und Reinigung monoklonaler Antikörper: Balb/c-Mäuse werden intraperitoneal mit 0,5 ml Pristane (Aldrich) vorbehandelt. 2 Wochen später werden 5 x 10&sup6; klonierte Hybridom-Zellen von Beispiel 4 intraperitoneal injiziert. Nach 8 - 10 Tagen wird Aszitesflüssigkeit gesammelt, bei 800 x g zentrifugiert und bei -20ºC gelagert. Aufgetaute Aszitesflüssigkeit wird bei 50000 x g 60 min zentrifugiert. Eine auf der Oberfläche schwimmende Fettschicht wird sorgfältig entfernt, und die Proteinkonzentration wird auf eine Konzentration von 10 - 12 mg/ml eingestellt. Roh-Immunglobulin wird durch tropfenweise Zugabe von 0.9 Volumsäquivalenten gesättigtem Ammoniumsulfat bei 0ºC ausgefällt, dann in 20 mM Tris-HCl/50 mM NaCl (pH 7,9) gelöst und gegen den gleichen Puffer dialysiert. Eine Immunglobulin G-Fraktion wird durch DEAE-D52-Cellulose (Whatman)-Chromatographie unter Verwendung eines Puffergradientensystems von 20 mM Tris-HCl/25-400 mM NaCl, pH 7,9 erhalten.
Beispiel 6: Herstellung von ¹²&sup5;I-markiertem Antikörper Mab-135: 40 ug Mab-135 (PBS-Lösung von Beispiel 5) werden mit 0,5 mCi ¹²&sup5;I-Natriumiodid und Chloramin T nach der allgemeinen Methode von F.G. Greenwood u.a. (19) iodiert. Die iodiertes Mab-135-Protein enthaltende Lösung wird 4 Mal jeweils 6 Stunden gegen 1 Liter PBS-Puffer dialysiert. Das Endprodukt hat eine spezifische Aktivität von ungefähr 2 x 10&sup7; cpm/ug Protein. ¹²&sup5;I-markierter Antikörper Mab-176 wird ähnlich hergestellt.
Beispiel 7: Radioimmunoassay zur Detektion von IgE-BF in Zellüberständen und Semm: Vertiefungen von Polyvinyl-Mikrotiterplatten werden über Nacht bei Raumtemperatur mit 150 ul 0,01 M Carbonatpuffer, pH 9, der 5 ug/ml Mab-176 von Beispiel 5 enthält, inkubiert. Die Platten werden dann einmal mit PBS gewaschen und 2 Stunden bei Raumtemperatur mit 200 ul Hanks "balanced" Salzlösung umgesetzt, die 10 % fetales Kälberserum (HBSS-FCS) enthält, dann wieder 10 Mal mit PBS gewaschen und mit 100 ul Testprobe 8 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Der Blindwert wird unter Verwendung von HBSS-FGS bestimmt. Die Platten werden 10 Mal mit PBS gewaschen und über Nacht bei Raumtemperatur mit 100 ul ¹²&sup5;I-Mab-135 pro Vertiefung (2 bis 4 x 10&sup5; cpm in HBSS-FCS, Beispiel 6) inkubiert, dann 10 Mal mit PBS gewaschen und in einem Gamma- zähler gezählt.
Beispiel 8: Synthese von ss-cDNA aus mRNA: 12 ul (0,5 mg,ml) mRNA-Lösung von Beispiel 2, die die höchste Bindungskapazität für ¹²&sup5;I-Mab-135 zeigt, nachgewiesen in dem RIA von Beispiel 7, werden zugesetzt zu 25 ul RVT-Puffer, 2,5 ul dNTP-Mischung (jeweils 20 mM dATP, dTTP und dGTP), 5 ml 1 mg/ml Oligo-dT&sub1;&sub2;&submin;&sub1;&sub8; (P-L-Biochemicals), 1 ul α-³²P-dCTP (10 uCi, 3000 Ci/mmol), 3 ul RNasin (60 Einheiten, Promega Biotec, Madison, USA) und 3 ul Reverse Transcriptase (66 Einheiten, Promega Biotec.). Radioaktives dCTP wird in das Reaktionsgemisch eingebracht, um die Gewinnung und Bestimmung der Ausbeute der cDNA in allen folgenden Schritten der Synthese zu erleichtern. Die Mischung wird 1,5 h bei 42ºC inkubiert. Die Reaktion wird durch Zugabe von 2 ul 0,5 M EDTA pH 7.5 gestoppt. Die mRNA wird durch Zugabe von 25 ul 0,15 M NaOH und Inkubation bei 45ºC fur 1 Stunde abgebaut. Die Lösung wird durch Zugabe von 25 ul 1 M Tris-HCl (pH 8,0) und 6 ul 1 M HCl neutralisiert. 2 ul 20%iges SDS werden zugesetzt, und die Lösung wird mit 0,15 ml Phenol-Chloroform-Mischung extrahiert (gleiche Volumina Phenol und Chloroform, äquilibriert mit TNE-Puffer). Die wäßrige Phase wird auf eine 2-ml-Sephadex -G-50-Säule in einer Pasteur-Pipette, äquilibriert mit TNE-Puffer, aufgebracht, um die neu synthetisierte cDNA von den nicht eingebrachten Nucleotiden und der abgebauten mRNA zu trennen. Zwölf Fraktionen von jeweils 200 ul werden gesammelt, und die Radioaktivität in jeder Fraktion wird ungefähr mit einem Geigerzähler bestimmt. Die ersten drei Fraktionen, die Radioaktivität enthalten, werden zusammengefaßt. 1,9 ug ss-cDNA werden gewonnen und wie von Maniatis u.a. (1), S. 461-462, beschrieben mit Ethanol gefällt. Die ss-cDNA wird in 20 ul H&sub2;O gelöst.
Beispiel 9: ds-cDNA-Synthese und S1-Verdauung: Die erhaltene ss-cDNA wird in 100 ul Endvolumen von 100 mM Hepes, pH 6,9, 10 mM MgCl&sub2;, 2,5 mM DTT, 70 KCl, 0,5 mM von jedem dNTP (dATP, dCTP, dTTP, dGTP) und 20 Einheiten großes Fragment der DNA-Polymerase I, Klenow-Enzym (Boehringer Mannheim), 3 Stunden bei 15ºC inkubiert. Dann werden weitere 20 Einheiten desselben Enzyms zugesetzt, und die Inkubation wird 10 Stunden bei 15ºC fortgesetzt. Die Reaktion wird durch Zugabe von EDTA zu 20 mM beendet. Das Gemisch wird mit Phenol-Chloroform extrahiert und mit Ethanol gefällt, wie von Maniatis u.a. (1), S. 461-462 und 458-459 beschrieben. Die resultierende ds-cDNA wird 30 min bei 30ºC in 100 ul Inkubationsgemisch behandelt, das 250 mM NaCl, 50 mM Natriumacetat pH 4,5, 1 mM ZnSO&sub4;, 200 Einheiten S1-Nuclease (Boehringer, Mannheim) enthält. Die Reaktion wird durch Zugabe von EDTA zu 25 mM gestoppt. Nach Zugabe von 1 M Tris-HCl, pH 8,0 zu 100 mM und SDS zu 1 % wird die Reaktion mit Pheno/Chloroform extrahiert und durch eine Sephadex G-200-Säule in einer Pasteur-Pipette und 2 ml Volumen, äquilibriert mit TNE-Puffer, geleitet Die Fraktionen, die ds-cDNA enthalten, werden durch Messung der Radioaktivität bestimmt, zusammengefaßt, mit Ethanol ausgefällt und in 15 ul H&sub2;O gelöst. 3,2 ug ds-cDNA werden erhalten.
Beispiel 10: 3'-Oligo(dG)-Tailing von pUC-KO-Plasmid: 20 ug pUC-KO-Plasmid werden mit 50 Einheiten PstI (Boehringer, Mannheim) in 200 ul 50 mM Tris-HCl pH 8,0, 10 mM MgCl&sub2; und 50 mM NaCl geschnitten. EDTA wird zu 20 mM zugesetzt. und das Reaktionsgemisch wird mit einem gleichen Volumen Chloroform/Phenol (1:1) extrahiert. Die geschnittene Plasmid-DNA wird durch die Zugabe von 2,5 Volumina Ethanol gefällt und durch Zentrifugieren bei 10000 g für 10 Minuten gewonnen. Der Überstand wird verworfen, und das Pellet wird in 50 ul H&sub2;O gelöst. Die Sonde wird 5 min bei 37ºC in 150 ul einer Lösung inkubiert, die 200 mM Kaliumcacodylat pH 6,9, 1 mM CoCl, 2 mM DDT, 10 uM dGTP und 80 Einheiten Terminale Desoxynucleotidyl-Transferase (Pharmacia P-L Biochemicals, Upsalla, Schweden) enthält. Um die Reaktion zu stoppen, wird EDTA zu 10 mM zugesetzt, und das Gemisch wird einmal mit Phenol/Chloroform (1:1) extrahiert. Die DNA wird mit Ethanol ausgefällt und durch Zentrifugieren bei 10000 g gewonnen. Das DNA-Pellet wird in 200 ul TE-Puffer gelöst und auf ein horizontales 0,8%iges Agarosegel in TBE-Puffer unter Verwendung einer Geltasche (slot) mit einer Breite von 3 cm geladen. Nach Elektrophorese während 16 Stunden bei 1 V/cm wird die DNA durch Elektroelution bei 5 V/cm, 20 min, gewonnen und aus dem Beutel durch kräftiges Pipettieren gewonnen. Die DNA wird mit Phenol-Chloroform extrahiert und mit Ethanol gefällt, wie im Beispiel 1 beschrieben. Nach Zentrifugation wird die DNA in TE-Puffer gelöst und bei -20ºC gelagert.
Beispiel 11: Herstellung eines Plasmids, das ds-cDNA enthält, die für zu IgE-Rezeptor verwandtes Polypeptid codiert, und Transformation von E.coli HB101 damit. 800 ng ds-cDNA von Beispiel 9 werden 5 min bei 37ºC in 40 ul einer Lösung inkubiert, enthaltend 200 mM Kaliumcacodylat, pH 6,9, 1 mM CoCl&sub2;, 2 mM DTT, 100 pmol ³H-dCTP und 12 Einheiten Terminale Desoxynucleotidyl-Transferase (P-L Biochemicals). Um die Reaktion zu stoppen, wird EDTA zu 10 mM zugesetzt. Das Gemisch wird mit Phenol/Chloroform extrahiert und die DNA mit Ethanol gefällt. Die ds-cDNA mit dC-Enden wird in H&sub2;O gelöst und bei -20ºC gelagert. Ein Gemisch von 50 ng ds-cDNA mit dC-Enden und 150 ng pUC-KO mit dC-Enden von Beispiel 10 in 200 ul TNE-Puffer wird 5 min bei 65ºC, 60 min bei 55ºC inkubiert und dann langsam auf 30ºC in einem Wasserbad über eine Dauer von 3-5 Stunden abgekühlt. 2-ul-Aliquote dieser Annealing-Mischung werden zu 200 ul kompetenten E.coli HB101 zugesetzt, die für die Transformation durch Behandlung mit Calciumchlorid präpariert wurden, wie von Maniatis u.a. (1), S. 250, beschrieben. Das Gemisch wird 30 min auf Eis gehalten und 2 min auf 42ºC erhitzt, dann mit 1 ml SOC-Medium verdünnt und 1 h bei 37ºC inkubiert. Der Inhalt von 10 Röhrchen wird zusammengefaßt, und die Zellen werden durch 5 min Zentrifugieren bei 2000 g gesammelt. Jedes Zellpellet wird in 1 ml SOC-Medium resuspendiert und auf eine 10 cm-Agarplatte gestrichen, die LB-Medium und 50 ug/ml Ampicillin enthält. Die Platten werden bei 37ºC 16 h inkubiert. Etwa 5000 transformierte Kolonien werden erhalten, gekennzeichnet durch ihre Ampicillinresistenz.
Beispiel 12: Identifizierung von Klonen, die ds-cDNA enthalten, die für zu Human-IgE-Rezeptor und IgE-Bindungsfaktor verwandte Polypeptide codiert, durch Hybrid-selektierte Translation. Individuelle Kolonien von Beispiel 11 werden zur Sättigung in 2 ml LB-Brühe, die 100 ug/ml Ampicillin enthält, gezuchtet. 96 Kulturen werden zusammengefaßt, und die Plasmid-DNA wird unter Anwendung der alkalischen Lysemethode (Maniatis u.a., S. 90 (1)) isoliert. 100 ug Alkali-denaturierte Plasmid-DNA werden kovalent gebunden an 50 mg aktivierte ATP-Cellulose, hergestellt nach der Methode von Seed (20).
PolyA-mRNA (60 ug) von RPMI 8866-Zellen (Beispiel 1) wird in 300 ul 15 mM Pipes pH 6,4, 1,5 mM EDTA, 600 mM NaCl, 0,2 % SDS. 50 % Formamid gelöst und zu der Cellulose-gebundenen Plasmid-DNA 16 h bei 37ºC unter leichtem Rühren hybridisiert. Die Cellulose wird 10 Mal mit 50%igem Formamid, 45 mM NaCl, 4,5 mM Natriumcitrat, 20 mM Pipes pH 6,4 und 1 mM EDTA gewaschen. Die hybridisierte mRNA wird aus der Cellulose durch zweimaliges Inkubieren bei 65ºC für 2 Minuten in 100 ul 90%igem Formamid, 0,2% SDS, 10 mM Pipes 6,4, 5 mM EDTA, 20 ug/ml Kalbsleber-tRNA eluiert. Die eluierte mRNA wird zweimal mit Etnanol gefällt. Die gefällte PolyA-mRNA, die aus jedem Pool erhalten wird, wird in 6 ul Wasser gelöst und zum Injizieren in Xenopus laevis-Oocyten verwendet und wie im Beispiel 3 beschrieben analysiert. Die translatierten Proteine werden in dem RIA wie im Beispiel 7 beschrieben gescreent. Von 10 Pools mit jeweils 96 Kolonien ist einer positiv. Diese 96 Kolonien werden zu 12 neuen Pools von 8 Kolonien vereinigt und auf die gleiche Weise gescreent. Schließlich wird eine einzelne Kolonie identifiziert, von der das Protein ein positives Signal in dem RIA nach der Translation der mRNA in Frosch-Oocyten gibt. Der Klon wird in LB-Brühe expandiert, die 100 ug/ml Ampicillin enthält. Die Plasmid-DNA wird aus dieser Kolonie isoliert. 1 ug der Plasmid-DNA wird mit dem Restriktionsenzym PstI isoliert, einem Enzym, das an beiden Grenzen zwischen der Vektor-DNA und dem ds-cDNA-Insert spaltet, und die Sequenz des cDNA-Inserts wird von Ende zu Ende unter Verwendung der Didesoxy-Kettenabbruch-Sequenzierungsmethode von Sanger u.a. (21) bestimmt. Die Sequenzierung erfolgt wie im Detail im Amersham-Handbuch "M13 cloning and sequencing" beschrieben, unter Verwendung der in dem Sequenzierungskit enthaltenen Reagenzien (Amersham, N 4501 und N 4502). Das ds-cDNA-Insert ist 417 bp lang und seine Sequenz wird in Formel II zwischen bp Nr. 878 und bp Nr. 1295 gezeigt. Diese ds-DNA, die für den C-terminalen Teil von IgE-Rezeptor und IgE-Bindungsfaktor codiert, wird als DNA-Sonde verwendet für das Screening durch Hybridisierung hinsichtlich längerer cDNA-Klone, die alle Codierungsinformation für die zu Human-IgE-Rezeptor oder IgE-Bindungsfaktor verwandten Polypeptide enthalten.
Beispiel 13: Klonieren einer cDNA, die die vollständige codierende Seguenz für Human-IgE-Rezeptor enthält. Die PolyA-mRNA wird aus RPMI 8866-Zellen wie in Beispiel 1 beschrieben, isoliert. Die ersten Schritte der cDNA Synthese erfolgen nach Beispiel 2 - 8. Dann wird das Protokoll geändert, um hinsichtlich ds-cDNA voller Länge anzureichem. Die ss-cDNA wird in 32 ul H&sub2;O gelöst. Die ss-cDNA wird mit Oligo-dC-"Enden" in einem Reaktionsgemisch verlängert. das 32 ul ss-cDNA (2,8 ug), 10 ul 1 M Kaliumcacodylat, pH 7,0, 5 ul 10 mM CoCl&sub2;, 5 ul 1 mM DTT und 1 nmol dCTP enthält. Nach 5 min Vorinkubation bei 37ºC werden 3 ul Terminale Desoxynucleotidyl-Transferase (81 Einheiten, P-L Biochemicals) zugesetzt, und man läßt die Inkubation 10 min fortschreiten. 50 ul TNE-Puffer werden zugesetzt, und die ss-cDNA wird mit Chloroform/Phenol extrahiert und mit Ethanol gefällt. Das Pellet wird mit 70%igem Ethanol gewaschen, luftgetrocknet und gelöst in 15 ul H&sub2;O, 25 ul RVT-Puffer, 2,5 ul dNTP-Mischung (jeweils 20 mM dATP, dTTP und dGTP) und 5 ul 0,2 mg/ml Oligo-dG&sub1;&sub2;&submin;&sub1;&sub8; (P-L-Biochemicals). 3 ul Reverse Transcriptase (66 Einheiten, Promega Biotec) werden zugesetzt, und das Gemisch wird 90 Minuten bei 42ºC inkubiert. Die Reaktion wird durch Zugabe von 2 ul 0,5 M EDTA, pH 7,5 und 50 ul TNE-Puffer gestoppt, und das Gemisch wird mit 0,15 ml Phenol-Chloroform (1:1) extrahiert. Die wäßrige Phase wird auf eine Sephadex -G-50-Säule (2,5 ml in TNE-Puffer) aufgebracht, und die Durchbruchsfraktion (0,4 ml), die 1,1 ug ds-cDNA enthält, wird gesammelt. Die ds-cDNA wird mit Ethanol gefällt. Das resultierende Pellet wird in 32 ul H&sub2;O aufgenommen und die ds-cDNA mit radioaktiv markierten Oligo-dC-Enden, wie im Beispiel 11 beschrieben, verlängert. Die Reaktion wird durch Zugabe von 1ul 0,5 M EDTA, pH 7.5 gestoppt, und die Probe wird auf horizontales 1%iges Agarosegel in TBE-Puffer unter Verwendung von Taschen mit 0,5 cm Breite gebracht. In eine parallele Tasche lädt man 1 pg Bakteriophage-Lambda-DNA (verdaut mit EcoRII und HindIII), um als Größenmarker zu fungieren. Nach 2 Stunden Elektrophorese bei 2,5 V/cm wird das Gel in TBE-Puffer getränkt, der 0,5 ug/ml Ethidiumbromid enthält, um die ds-DNA zu färben. Die Region, die ds-cDNA mit ungefährer Größe zwischen 1,4 und 2 Kilobasen enthält, wird exzisiert und in zwei Mikro-Collodium-Beutel (Sartorius) gebracht, die mit H&sub2;O vorgetränkt sind. 0,3 ml Wasser werden zugesetzt, und die Beutel werden in eine horizontale Elektrophorese-Vorrichtung (Bio-Rad) gebracht, die halbkonzentrierten TBE-Puffer enthält. Die ds-cDNA wird bei 5 V/cm 20 min elektroeluiert und aus dem Beutel durch kräftiges Pipettieren gewonnen. Die ds-cDNA wird mit Phenol-Chloroform extrahiert und mit Ethanol gefällt. Nach Zentrifugieren wird die ds-cDNA in 100 ul TNA-Puffer gelöst. 100 ng ds-cDNA werden gewonnen (bestimmt aus der Ausbeute an Radioaktivität).
Beispiel 14: Annealing von "dG-tailed" pUC-KO mit Poly(dG)-Enden zu ds-cDNA mit Poly(dC)-Enden und Transformation von E.coli mit dem erhaltenen Plasmid. 40 ul ds-cDNA (40 ng größenfraktioniertes Material von Beispiel 13) werden gemischt mit 16 ul (200 ng) pUC-KO-Plasmid-DNA mit Oligo-dG&sub1;&sub0;&submin;&sub2;&sub0;-Enden aus Beispiel 10 und 194 ul TNE-Puffer und nacheinander inkubiert bei 65ºC 10 min, bei 46ºC 1 h und bei Raumtemperatur 1 h. Die hybridisierte (annealed) DNA wird verwendet, um kompetente E.coli HB101-Zellen (Stamm LM 1035) zu transformieren, die für Transformation wie im Beispiel 11 beschrieben präpariert wurden. Aliquote von 2 ul der Annealing-Mischung werden in parallele Röhrchen gebracht, die 200 ul kompetente Zellen enthalten. Die Röhrchen werden 30 min auf Eis gelassen. Nach einem Hitzeschock von 90 s bei 42ºC und Abschrecken in Eis für 2 min werden 0,8 ml SOC-Medium pro Röhrchen zugesetzt, das dann 60 min bei 37ºC inkubiert wird. Nach der Inkubation wird der Inhalt von 10 Röhrchen zusammengefaßt. Die Zellen werden durch Zentrifugieren bei 2000 g für 5 min gesammelt und auf McConkey-Agarplatten (15 cm Durchmesser) plattiert, die 100 ug/ml Ampicillin enthalten. Die Platten werden über Nacht bei 37ºC inkubiert. Ungefähr 1000 ampicillinresistente Kolonien werden pro Platte erhalten. Sie werden auf Nylon-Membranen (Pall-Biodyne, Glen Cove, New York, USA) gehoben, und die Membranen werden auf McConkey-Agarplatten gelegt, wobei die Kolonien nach oben schauen. Nach 5 Stunden Inkubation bei 37ºC werden zwei Repliken auf Nylon-Membranen gemacht. Die Master-Membran wird bei 4ºC auf einer Agarplatte gelagert. Die Repliken werden für Kolonie-Hybridisierung verarbeitet, indem nacheinander auf 3 MM-Papier (Whatman Ltd., Maidstone, USA) gebracht werden, das gesättigt ist mit 0,5 M NaOH, 1.5 M NaCl für 5 min und mit 0,5 M Tris-HCl, pH 8,0, 1,5 M NaCl für 10 min. Zwischen jeder Inkubation werden die Filter auf trockene Whatman-3MM-Filter geblottet. Die Replikafilter werden 2 Stunden bei 80ºC in einem Vakuumofen gebacken und sofort für DNA-Hybridisierung verwendet.
Beispiel 15: Filter-Hybridisierung. Das cDNA-Insert von 10 ug Plasmid, das für einen Teil des IgE-Rezeptors codiert, erhalten aus dem positiven Klon von Beispiel 12. wird durch Verdauung mit Restriktionsendonuclease PstI präpariert. Das cDNA-Insert (460 bp) wird von pUC-KO- Vektor-DNA (2900 bp) durch Elektrophorese durch ein 1,5%iges Agarosegel in TBE-Puffer abgetrennt und durch Elektroelution und Fällung mit Ethanol gewonnen, wie im Beispiel 13 beschrieben. Das reine cDNA-Insert (200 ng) wird radioaktiv gemacht unter Verwendung eines Nick-Translationssystems von Amersham (N.5000) nach der Anleitung des Lieferanten. Die radioaktiv markierte cDNA-Sonde hat eine spezifische Aktivität von 5 x 10&sup8; dpm/ug. Die radiomarkierte cDNA wird denaturiert durch Inkubation für 10 min bei 95ºC und sofort auf Eis abgeschreckt. Die Replika-Filter von Beispiel 14 werden in einem verschlossenen Kunststoffbeutel 2 h vorhybridisiert in 100 ml einer Lösung, enthaltend 0,9 M NaCl, 0,18 M Tris-HCl, pH 8,0, 6 mM EDTA, 0,02 % Ficoll 400, 0,02 % Polyvinylpyrrolidon, 0,02 % BSA, 0,2 % SDS und 50 ug/ml denaturierte Kalbsthymus-DNA. Die Hybridisierung erfolgt über Nacht in einem geschlossenen Kunststoffbeutel, der 5 ml der gleichen Lösung enthält, ergänzt mit dem Hitze-denaturierten radioaktiv markierten cDNA-Insert von oben. Nach Hybridisierung werden die Filter in 2xSSC/0,2 % SDS gewaschen, gefolgt von drei Waschungen bei 65ºC mit 200 ml 0,2xSSG/0,2 % SDS. Die Filter werden getrocknet und Kodak-Röntgenfilm (XAR-5) über Nacht exponiert. Die Filter werden mit radioaktiver Tinte markiert, um Ausrichtung der Filter mit dem Autoradiogramm zu erlauben. Zwei positive Klone werden gefunden, deren DNAs zu dem radioaktiv markierten DNA-Fragment hybridisieren, das für IgE-Rezeptor codiert. Sie werden pCL-1 und pCL-2 genannt.
Beispiel 16: Isolierung und Analyse von pCL-1- und pCL-2-DNA. Die pCL-1- und pCL-2-Klone werden aufgezogen und ihre Plasmid-DNAs isoliert unter Verwendung der Methode der alkalischen Lyse (Maniatis T., u.a. (1), S. 90). Die DNA wird mit PstI verdaut, einem Enzym, das die cDNA an den Grenzen zwischen Vektor-DNA und DNA-Inserts schneidet. Die Fragmente werden durch Elektrophorese getrennt und die vollständigen cDNA-Inserts durch Elektroelution isoliert, wie im Beispiel 13 beschrieben. Die cDNA-Inserts dieser beiden Plasmide werden von Ende zu Ende unter Anwendung der Methode von Sanger u.a. (21) sequenziert, die im Detail im Amersham-Handbuch beschrieben wird. Eine Zusammenfassung der Restriktions- und Sequenzanalyse wird in Fig. 2 und Formel II gegeben.
Beispiel 17: Transfer der zu IgE-Rezeptor verwandten cDNA in ein Plasmid, das sich für Transcription eignet. 10 ug der pCL-2-Plasmid-DNA werden mit den Restriktionsenzymen PstI und HincII (Boehringer Mannheim) verdaut. Das 1,5 kb-cDNA-Insert und die 2,9 kb-Plasmidvektor-DNA werden auf einem 1%igen Agarosegel in TBE-Puffer unter Verwendung einer Taschenbreite von 3 cm getrennt. Nach 16 h Elektrophorese bei 1 V/cm wird die DNA durch Elektroelution, wie im Beispiel 13 beschrieben, gewonnen. Parallel werden 10 ug Plasmid pGEM -1 mit PstI und HincII verdaut, einmal mit Phenol/Chloroform extrahiert und mit Ethanol gefällt 10 ng des 1,5 kb-cDNA-Inserts und 10 ng PstI-gespaltenes pGEM -1 werden in einem Volumen von 10ul 4 Stunden bei 15ºG ligiert. Das Reaktionsgemisch enthält weiters 10 Tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgCl&sub2;, 2 mM DTT, 0,1 mM ATP und 100 Einheiten T&sub4;-Ligase (Boehringer Mannheim) 5 ul des Gemischs werden verwendet, um kompetente E.coli HB101-Zellen (Stamm LM 1035) wie bei Maniatis u.a. (1), S. 250, beschrieben zu transformieren. Etwa 100 ampicillinresistente Kolonien werden erhalten. 24 Kolonien werden aufgezogen, und Plasmid-DNA wird aus den Kulturen isoliert. Ungefähr 1 ug Plasmid-DNA aus jeder Kultur wird mit HindIII verdaut, und die Länge der verdauten DNA-Fragmente wird auf 1%igem Agarosegel unter Verwendung von HindIII-verdauter Lambda-DNA (Pharmacia, Schweden) als Größenmarkierer analysiert. Die verdaute Plasmid-DNA verschiedener Kolonien gibt DNA-Fragmente mit 1,0 kb und 3,3 kb Länge. Diese Plasmide werden pGEM -1/CL2 (s. Fig. 3) genannt. Sie enthalten den Aminoterminus des IgE-Rezeptors nächst dem T&sub7;-Polymerase-Promotor auf der pGEM -1-Vektor-DNA.
Beispiel 18: Transcription der zu IgE-Rezeptor verwandten cDNA. 10 ug Plasmid pGEM -1/CL2 von Beispiel 17 werden mit dem Restriktionsenzym Rsal (Boehringer Mannheim) verdaut. 5 ul 0,5 M EDTA werden zugesetzt, und das Gemisch wird einmal mit Phenol/Chloroform (1:1, V:V) und einmal mit Chloroform extrahiert. Die DNA wird durch Ethanol-Fällung konzentriert und in 20 ul TE-Puffer gelöst. 4 ul der DNA-Lösung werden zu 100 ul einer Lösung zugesetzt, die 40 mM Tris-HCl pH 7,5, 6 mM MgCl&sub2;, 2 mM Spennidin, 10 mM NaCl, 10 mM DTT, 1 Einheit/ul RNasin, 0,5 mM dNTP und 20 Einheiten Riboprobe T&sub7;-RNA-Polymerase (Promega Biotec) enthält. Das Gemisch wird 1 Stunde bei 37ºC inkubiert. Abschließend an die RNA-Synthesereaktion werden zwei Einheiten RQI TM DNAse (Promega Biotec) zugesetzt, und die Inkubation wird 1 h bei 37ºC fortgesetzt. Das Gemisch wird einmal mit Phenol/Chloroform und einmal mit Chloroform extrahiert, und die neu synthetisierte RNA durch Ethanol-Fällung gewonnen. Das RNA-Pellet wird mit 70%igem Ethanol gewaschen und schließlich in 20ul H&sub2;O gelöst.
Beispiel 19: Translation der Plasmid-abgeleiteten IgE-Rezeptor-mRNA in Frosch-Oocyten und Detektion von IgE-Rezeptor-Protein. Die im Beispiel 18 erhaltene mRNA wird direkt für die Injektion in Frosch-Oocyten verwendet, wie im Beispiel 3 beschrieben. Die Synthese von IgE-Rezeptor-Protein wird in einem RIA wie im Beispiel 7 beschrieben getestet. PolyA-mRNA aus Beispiel 1 wird als Kontrollprobe verwendet. Die Ergebnisse werden in der folgenden Tabelle zusammengefaßt: Typ der in Frosch-Oocyten injizierten mRNA ¹³&sup5;I-Mab-135 gebunden in dem RIA (Input 3x10&sup5; cpm) Plasmid-abgeleitete mRNA (Beisp. 18) PolyA-mRNA (Beisp. 1) keine RNA
Beispiel 20: Zusammenbau von Plasmid pFK-1 und pFK-2 für die Expression eines Polypeptids mit IgE-Bindungsfaktor-Aktivität in E.coli. In diesem Beispiel werden Plasmide konstruiert, die die Produktion und Sekretion von zu IgE-Bindungsfaktor verwandten Polypeptiden in E.coli erlauben, wobei die Amino-terminale Region von den Positionen Met&sub1; bis Ala&sub1;&sub1;&sub8; oder Glu&sub1;&sub3;&sub3;, die die Membranverankerungssequenz enthalten, deletiert ist. 10ug pCL-2-Plasmid-DNA wird mit den Restriktionsenzymen HincII und RsaI verdaut. Fragmente von 1,6, 1,25, 0,72, 0,46 und 0,23 kB werden erhalten und durch Elektrophorese durch ein 1%iges Agarosegel in TBE-Puffer getrennt. Das 1,25 kB-DNA-Fragment wird wie im Beispiel 13 beschrieben gewonnen. Parallel werden 10 ug Plasmid pGEM -1 Iinearisiert mit 20 Einheiten HincII (Boehringer) in 50 ul 10 mM Tris-HCl pH 7,6, 50 mM NaCl, 10 mM MgCl&sub2; und 5 mM DTT. Nach 2 Stunden bei 37ºC wird das Reaktionsgemisch mit 50 ul Tris-HCl pH 8,5, 10 ul H&sub2;O und 20 Einheiten alkalischer Phosphatase aus Kälberdarm (Boehringer) ergänzt, und es wird weitere 30 min bei 37ºC inkubiert. Das Gemisch wird dreimal mit Phenol-Chloroform extrahiert und dann durch 1%iges Agarosegel in TBE-Puffer elektrophoretisiert. Die Plasmid-DNA wird aus dem Gel durch Elektroelution gewonnen, wie im Beispiel 13 beschrieben. 10 ng des 1,25 kb-cDNA-Fragments und 10 ng des HincII-gespaltenen pGEM -1 werden in einem Volumen von 10 ul 10 Stunden bei 15ºC ligiert. Das Reaktionsgemisch enthält weiters 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgCl&sub2;, 2 mM DTT, 0,5 mM ATP und 100 Einheiten T&sub4;-Ligase (Boehringer). 5 ul des Gemischs werden verwendet, um kompetente E.coli HB101-Zellen zu transformieren, wie von Maniatis u.a. (1), S. 250, beschrieben. Die Bakterien werden auf Agarplatten plattiert, die mit 100 ug/ml Ampicillin ergänzt sind. Etwa 50 ampicillinresistente Kolonien werden erhalten. 24 Kolonien werden aufgezogen, und die Plasmid-DNA wird aus jeder Kultur isoliert. Ungefähr 1 ug Plasmid-DNA von jeder Kultur wird mit HindIII verdaut, und die Länge der verdauten DNA-Fragmente an einem 1%igen Agarosegel unter Verwendung einer HindIII-verdauten Lambda-DNA als Größenmarkierer (Pharmacia, Schweden) analysiert. Die verdauten Plasmid-DNA verschiedener Kolonien geben DNA-Fragmente mit 0,5 kb und 3,6 kb, verschiedene andere mit 0,7 kb und 3,4 kb Länge, entsprechend den zwei möglichen Orientierungen der Fragmentinsertionen. Diese Plasmide werden pCAL-3 bzw. pCAL-4 (Fig. 4) genannt. Ein pCAL-3-Klon und ein pCAL-4-Klon werden aufgezogen, und die Plasmid-DNAs unter Anwendung der Methode der alkalischen Lyse isoliert, wie von Maniatis u.a. (1) , S. 90, beschrieben. 10 ug pCAL-4-Plasmid-DNA werden mit HindIII verdaut, und 1 ug pCAL-3-Plasmid-DNA werden mit BgIII- und BamHI-Restriktionsenzym verdaut. Die Fragmente werden durch Elektrophorese getrennt, und die 0,8-BgIII bis BamHI- und 0,75-kb-HindIII- bis HindIII-Fragmente werden durch Elektroelution gewonnen, wie im Beispiel 13 beschrieben. Parallel werden 10 ug pIN-III-ompA-2-Plasmid- DNA (Gharayeb u.a. (5)) und 10 ug pIN-III-ompA-3-Plasmid-DNA mit HindIII bzw. BamHI verdaut. Diese beiden Plasmide sind gut bekannte Sekretions-Klonierungsvektoren in E.coli, die die Klonierung von fremden DNA-Fragmenten in zwei Leserahmen erlauben, die zu Sequenzen fusioniert sind, die für das Signalpeptid von OmpA-Protein codieren. Dann werden die linearisierten Plasmide mit alkalischer Phosphatase aus Kälberdarm behandelt, und die lineare DNA wird an 0,8%igem Agarosegel gereinigt, wie oben beschrieben. Zwei Ligationsgemische werden aufgestellt, die in einem Volumen von 20 ul 10 ng HindIII-gespaltenes pIN-III-ompA-2 und 10 ng 0,8-kb-HindIII- bis HindIII-Fragment (Mischung 1) und 10 ng 0,75-kb-BgIII bis BamHI-Fragment zusammen mit 10 ng BamHI-gespaltenem pIN-III-ompA-3 (Mischung 2) enthalten. Die Reaktionsgemische enthalten zusätzlich 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgCl&sub2;, 2 mM DTT, 0,1 mM ATP und 100 Einheiten T&sub4;-Ligase (Boehringer Mannheim). Nach 12 Stunden bei 15ºC werden 5 ul der Mischungen verwendet, um kompetente E.coli-HB101-Zellen zu transformieren, wie von Maniatis u.a. (i), S. 250, beschrieben. 50 - 100 ampicillinresistente Kolonien werden aus Mischung 1 und Mischung 2 erhalten. 12 Kolonien von ieder Mischung werden aufgezogen, und die Plasmid-DNA wird aus den Kulturen isoliert. Ungefähr 1 ug Plasmid-DNA aus jeder Kultur werden mit PstI und EcoRI (Mischung 1) und BamHI und EcoRI (Mischung 2) verdaut. Die Länge der DNA-Fragmente wird an 1 %igem Agarosegel unter Verwendung von HindIII-verdauter Lambda-DNA (Pharmacia, Schweden) als Größenmarkierer analysiert. Verschiedene von Mischung 1 abgeleitete Plasmide produzieren ein 0,75-kb-Fragment. Diese Plasmide werden pFK-2 genannt Sie enthalten die DNA, die für Aminosäuren Ala&sub1;&sub3;&sub4; bis Ser&sub3;&sub2;&sub1; des IgE-Rezeptors codiert, fusioniert an die OmpA-Signalsequenz. Analog produzieren verschiedene von Mischung 2 abgeleitete Plasmide ein 0,8-kb-Fragment. Diese Plasmide werden pFK-1 genannt. Sie enthalten die DNA, die für Aminosäuren Asp&sub1;&sub1;&sub9; bis Ser&sub3;&sub2;&sub1; codiert, an die OmpA-Signalsequenz fusioniert.
Beispiel 21: Detektion von zu IgE-Bindungsfaktor verwandten Polypeptiden in E.coli-Stämmen, die Plasmide pFK-1 und pFK-2 tragen. 10 ng Plasmid pFK-1, pFK-2 und Plasmid pIN-III-ompA-2 als Kontrolle werden für die Transfektion von kompetenten E.coli-Zellen BZ 234 und E.coll-Zellen B1472 verwendet. Kompetente Zellen werden hergestellt und wie von Maniatis u.a. (1), S. 250, beschrieben transfektiert. Über 100 ampicillinresistente Kolonien werden aus jeder Transfektion erhalten. Eine Kolonie wird in 2 ml LB-Brühe transferiert, die mit 100 ug Ampicillin/ml ergänzt ist, und über Nacht bei 37ºC kultiviert. 1 ml der Kulturen werden in 100 ml LB-Brühe transferiert, die mit 100 ug Ampicillin/ml ergänzt ist. Die Zellen werden unter kräftigem Schütteln (250 UpM) bei 37ºC kultiviert. 10-ml-Aliquote werden nach 4, 7, 10 und 24 Stunden entfernt. Die Aliquote werden sofort verarbeitet. Die Zeilen werden durch 10 min Zentrifugieren mit 1000 g bei Raumtemperatur gesammelt. Der Überstand wird verworfen, und die Zellen werden in 2,5 ml 20%iger Saccharose, 0,1 M Tris-HCl pH 8,0 suspendiert.
Die Mischungen werden 20 Minuten bei Raumtemperatur gelassen, und die Zellen werden wieder durch Zentrifugieren gesammelt. Die Überstände werden verworfen, und die Zellen werden in 1,5 ml eiskaltem H&sub2;O suspendiert. Die Mischungen werden auf Eis 20 min inkubiert und bei 4ºC mit 12000 g 10 min zentrifugiert. 5 ul der Überstände werden zu 100 ul HBSS-FGS zugesetzt, und diese Proben werden mit dem im Beispiel 7 beschriebenen RIA analysiert. pIN-III-ompA-2 wird zur Kontrolle verwendet. Die folgenden Ergebnisse werden erhalten: Kultivierungszeit
Die Werte sind als cmp, gemessen pro Vertiefung in dem RIA, wie im Beispiel 7 beschrieben, angegeben. Der Input an Radioaktivität pro Vertiefung ist 325000 cpm.
Beispiel 22: Herstellung eines Immunoaffinitätsgels für die Reinigung des IgE-Bindungsfaktor-Proteins: Affi-Gel 10-Material (Bio-Rad) wird, wie der Hersteller anweist, mit kaltem destilliertem Wasser und Kopplungspuffer pH 8,0 (0,1 M NaHCO&sub3;-Lösung) gewaschen. Eine 50 % starke Suspension von Gel in 2 ml Kopplungspuffer wird in ein Kunststoffröhrchen eingeführt und mit dem gleichen Volumen einer Lösung gemischt, die 10 mg Mab-135 oder Mab-176 enthält, und das Gemisch wird 4 Stunden bei Raumtemperatur rotiert. Das Gel wird wieder mit Kopplungspuffer gewaschen. Um die aktiven Stellen, die noch frei sind, zu blockieren, wird das Gel 2 Stunden bei Raumtemperatur mit 0,1 ml 1 M Ethanolamin-HCl, pH 8,0, behandelt, dann mit PBS gewaschen. das 10 mM Natriumazid enthält, und darin bei 4ºC gehalten.
Beispiel 23: Fermentation transformierter Zellen und Isolierung von IgE-Bindungsfaktor-Protein aus der Bakterienkultur. Eine Kolonie von E.coli BZ 234, die das Plasmid pFK-1 von Beispiel 20 enthält, wird in 10 ml LB-Brühe transferiert, die ergänzt ist mit Ampicillin (100 ug/ml), und bei 37ºC unter kräftigem Schütteln über Nacht kultiviert. 1-ml-Aliquote der Kultur werden in 6 Kolben transferiert, die jeder 800 ml LB-Brühe enthalten, die ergänzt ist mit Ampicillin (100 ug/ml). Die Zellen werden unter kräftigem Schütteln (250 UpM) 8 h bei 37ºC gezüchtet und durch Zentrifugieren mit 1000 g bei Raumtemperatur für 10 min gesammelt. Der Überstand wird verworfen, und die Zellen werden in 300 ml einer Lösung suspendiert, die 20 % Saccharose, 30 mM Tris-HCl pH 8,0 und 1 mM EDTA enthält. Die Suspension wird 20 min bei Raumtemperatur gelassen, und die Zellen werden wieder durch Zentrifugieren gesammelt. Der Überstand wird verworfen, und die Zellen werden in 200 ml eiskaltem H&sub2;O suspendiert. Die Suspension wird auf Eis 20 min inkubiert und bei 4ºC mit 10000 g 15 min in einem Rotor einer Sorvall-Zentrifuge zentrifugiert. Der Überstand (etwa 180 ml) wird sorgfältig gewonnen, ergänzt mit Natriumazid (0,1 mg/ml) und durch eine Nalgene -Sterilisationsfiltereinheit (0,2 Mikron; Nalge Company, Rochester, N.Y., USA, filtriert. Die filtrierte Lösung wird mit einer Fließrate von 50 ml/h auf eine 2-ml-Säule von Mab-135- oder Mab-176-gekoppeltem Affi-Gel 10 geladen, das wie im Beispiel 22 beschrieben gewonnen wird. Das Gel wird nacheinander mit 20 Volumina PBS, das ergänzt ist mit 0,5 NaCl und 0,05 % Tween 20, 5 Volumina PBS und 5 Volumina NaCl 0,9 % gewaschen. Der Proteingehalt der Waschlösungen wird durch Messung der Extinktion bei 280 nm geprüft, um vollständige Entfernung von ungebundenen Proteinen sicherzustellen. Die Säule wird dann mit Aliquoten von 1 ml Volumen eluiert, die jeweils 0,1 M Glycin-HCl, 0,1 M NaCl, pH 2,6, enthalten. Die Proteine enthaltenden Fraktionen werden zusammengelaßt und mit 1 M Tris neutralisiert.
Die konzentrierten Lösungen eines gereinigten erfindungsgemäßen Polypeptids werden durch Behandlung mit einem elektrophoretischen ISCO-Konzentrator Modell 1750 (Isco Inc.) und einer Spectrapor -Membran (Spectrum Medical Industries) mit 3.5 KD "cut-off" erhalten. Die Lösungen werden gegen 25 mM Ammoniumacetat, pH 8,3, dialysiert und dabei auf ein Volumen von 0.2 ml konzentriert.
Das gereinigte Protein wird auf folgende Weise analysiert: Fraktionen werden mit Laemmli-Puffer inkubiert, dann aufgetrennt in individuelle Proteine durch 12%ige SDS-PAGE und Silber-Anfärbung, wie in dem BioRad-Manual beschrieben. Proteine mit einem ungefähren Molekulargewicht von 25 KD werden nachgewiesen. Sie werden elektrophoretisch 4 Stunden bei 0,12 Ampere mit Transferpuffer auf eine Nitrocellulosemembran transferiert. Die Membran wird mit Tris-gepufferter Salzlösung, die 10 % FCS enthält, blockiert. Streifen werden ausgeschnitten und mit Mab-135 und Mab-176, jedes bei 10 ug/ml, individuell umgesetzt. Nach 6 Stunden Inkubation werden die Streifen gewaschen und über Nacht mit Meerettich-Peroxidase- Ziege-Anti-Maus-IgG umgesetzt. Die Streifen werden gewaschen und über Nacht mit 4-Chlor-1-naphthol (Peroxidase- Substrat) entwickelt, wie in dem BioRad-Manual detailliert ausgeführt. Die Mab-135- und Mab-176-monoklonalen Antikörper reagieren jeweils mit dem 25 KD-Proteinfragment.

Beispiel 24: Expression von Polypeptid mit IgE-Bindungsfaktor-Aktivität in E.coli unter der Kontrolle des Promotors PL von Phage λ.

24.1 Konstruktion von Expressionsplasmid: Plasmid pHRi148 (Europäische Patentanmeldung EP 146 785) wird als Zwischenvektor verwendet. 10 ug pHRi148-Plasmid-DNA wird mit NcoI verdaut, dann mit Klenow-Polymerase und dNTP (50uM) behandelt, um die Enden stumpf zu machen. Die DNA wird weiter mit BamHI verdaut und mit alkalischer Phosphatase behandelt. Die 4,3 kb-Vektor- DNA wird durch Agarosegelelektrophorese isoliert. Parallel werden 10 ug pCAL3-Plasmid-DNA (Beispiel 20) mit BgIII gespaltet, dann mit Klenow-Polymerase und dNTP (50 uM) behandelt. Die DNA wird weiter mit BamHI gespaltet, und das 0,78-kb-Insert-DNA-Fragment durch Agarosegelelektrophorese isoliert. 10 ng gereinigter Vektor und 3 ng gereinigte Insert-DNA werden ligiert, und das Gemisch wird zum Transformieren kompetenter E.coli HB101-Zellen verwendet. Ein Klon mit dem korrekten rekombinanten Plasmid wird auf der Basis von Restriktionsenzymanalysen (Fig. 5) gewählt.
10 ug DNA eines korrekten Plasmids werden mit BamHI und EcoRI verdaut. Die 0,79-kb-Insert-DNA wird durch Agarosegelelektrophorese isoliert. Parallel werden 10 ug pPLc24-Plasmid- DNA [Remaut E. u.a. (1981), GENE 15, 81-93] mit EcoRI und BamHI verdaut, dann mit alkalischer Phosphatase behandelt, und die 2,9-kb-Vektor-DNA wird durch Agarosegelelktrophorese gereinigt. 10 ng der 2,9-kb-Vektor-DNA und 3 ng der 0,79-kb-Insert-DNA werden ligiert und dann verwendet, um kompetente E.coli-K12-Zellen zu transformieren. Es wird Standard-Restriktionsanalyse durchgeführt, um ein korrektes Plasmid (pPL-BF; Fig. 5) zu selektieren. Dieses Plasmid trägt die DNA-Sequenz der Formel II, die für Aminosäuren 119 bis 321 des Polypeptids der Formel I codiert, stromabwärts von dem Hitze-induzierbaren PL-Promotor. Der Aminosäure 119 geht ein Methionin voraus, das während des Zwischenklonierungsschrittes in Plasmid pHRi148 hinzugefügt wurde.
Das Plasmid pBL-BF wird verwendet, um E.coli-Stämme W3110 und HB101 zu transformieren, die beide λc1857 beherbergen (Remaut u.a., loc. cit). Die Transformanten werden auf LB-Platten ausplattiert, die 40 ug/ml Kanamycin und Ampicillin enthalten, und durch Inkubation bei 30ºC für 24 Stunden gezüchtet. Resultierende rekombinante Kolonien werden für Fermentation verwendet.
24.2 Fermentation. Rekombinante E.coli-Stämme, die im Beispiel 24.1 erhalten werden, werden über Nacht bei 30ºC in LB-Brühe gezüchtet, die 40 ug/ml Ampicillin und Kinamycin enthält. Die Kulturen werden 1:5 mit dem gleichen Medium verdünnt und 4 h bei 42ºC inkubiert. Die Zellen werden durch Zentrifugation gesammelt.
24. 3 Reinigung von Polypeptiden mit IgE-Bindungsaktivität. 22,5 ml Zellsuspension (OD&sub6;&sub5;&sub0;=20) in 50 mM Hepes pH 8,0, 30 mM NaCl und 0,1 % Ethanolamin, hergestellt aus einem Bakterienpellet von Beispiel 24.2, werden mit 18 g Harnstoff vermischt. Die Suspension wird 3 x 30 s mit 30-s-Intervallen mit einem MSE Soniprep 150 unter Verwendung einer 9,5 mm-Sonde und 24 Mikron Amplitude beschallt. Das Lysat wird durch 30 min Zentrifugieren bei 17000 UpM in einem Sorvall-SS34-Rotor bei 20ºC geklärt. Der Überstand wird bei 4ºC gegen drei jeweils ausgewechselte 10 mM Hepes pH 7,5 und 130 mM NaCl dialysiert. Das Dialysat wird durch Zentrifugieren für 30 min bei 17000 UpM in einem Sorvall-SS34-Rotor bei 4ºC geklärt, und der Überstand wird mit Natriumazid ergänzt (0,1 mg/ml). Die Polypeptide mit IgE-Bindungsaktivität werden weiter gereinigt und analysiert wie zuvor beschrieben, z.B. im Beispiel 22 und 23.

Beispiel 25: Expression eines Polypeptids mit IgE-Bindungsfaktor-Aktivität in Hefe Saccharomyces cerevisiae.

25.1 Konstruktion von Expressionsplasmid pJDB207R/PHO5-BF (Fig.6). Um die Vektor-DNA herzustellen, werden 10ug Plasmid-DNApJDB207R/PHO5-TPA(12-2) (Europ. Patentanmeldung EP 143031) vollständig mit BamHI verdaut. Die verdaute DNA wird mit alkalischer Phosphatase behandelt. Das große 6,85-kb-BamHI-Fragment wird von dem kleinen Fragment an einem 1%igen Agarosegel in TBE-Puffer getrennt, und das 6,85-kb-DNA-Fragment wird aus dem Gel durch Elektroelution gewonnen. Ein DNA-Fragment, das codiert für den induzierbaren PHO5-Promotor und die PHO5-Signalsequenz, wird aus Plasmid pJDB207/PHO5-TPA18 abgeleitet (Europ. Patentanmeldung 143081) erhalten. 50 ug dieses Plasmids werden vollständig mit BamHI und HindIII verdaut, und das 2.3-kb-Fragment wie isoliert. 5 ug dieses Fragments werden weiter mit Ball verdaut, und das 0,58-kb-Fragment wird isoliert. 20 ng der oben beschriebenen Vektor-DNA, 4 ng des 0,58-kb-Fragments, 8 ng des 0,8-kb-BgIII/BamHI-cDNA-Fragments, das aus pCAL3 (Beispiel 20) erhalten wurde, und 0,1 ng eines chemisch synthetisierten ds-DNA-Linkers mit der Nucleinsäuresequenz 5'PCCAATGCA-3'/3'-GGTTACGTCTAGp-5' werden vermischt und 24 Stunden bei 15ºC in einem Volumen von 20 ul ligiert. Die ligierte DNA wird verwendet, um kompetente E.coli-HB101-Zellen zu transformieren. Die Plasmid-DNA von etwa 100 ampicillinresistenten Kolonien wird durch Restriktionsenzym-Verdauung analysiert. Es zeigt sich, daß einige Kolonien alle drei Insert- DNA-Fragmente in der gewünschten Orientierung aufgenommen haben (Plasmid pJDB207R/PHO5-BF; Fig. 6). Die korrekte Struktur der Konstruktion an den Verbindungen zwischen der PHO5-Signalsequenz, der chemisch synthetisierten Linker-DNA und der IgE-BF-cDNA wird durch Sequenzierung verifiziert.
25. 2 Transformation und Fermentation von Hefe. Plasmid pJDB207R/PHO5-BF wird in Saccharomyces cerevisiae-Stamm GRF18 (α, his 3-11, his 3-15, leu 2-3, leu 2-112, kan ) unter Anwendung des von Hinnen u.a. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 1979) beschriebenen Transformationsprotokolls transformiert. Selektion transformierter Hefezellen erfolgt auf Hefe-Minimalmedium-Platten, denen Leucin fehlt. Einzelne transformierte Hefe-Kolonien werden isoliert und als Saccharomyces cerevisiae GRF18 [pJDB207R/PHO5-BF] bezeichnet. Solche transformierte Hefezellen werden in 50 ml Hefe-Minimalmedium (Difco Yeast Nitrogen Base ohne Aminosäuren), dem 2 % Glucose, 20 mg/l L-Histidin und 10 g/l L-Asparagin zugesetzt werden, unter Schütteln bei 30ºC 25 Stunden zu einer Dichte von 3 x 10&sup7; Zellen/ml gezüchtet. Die Zellen werden in 0,9%igem NaCl gewaschen und verwendet, um 100 ml niedriges Pi-Minimalmedium zu inokulieren, das hergestellt wurde nach der Rezeptur des Difco Yeast Nitrogen Base-Mediums (ohne Aminosäuren) mit 0,03 g/l KH&sub2;PO&sub4;, 1 g/l KCl, 10 g/l L-Asparagin statt (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, 2 % und 1 g/l L-Histidin. Das Medium wird auf eine Ausgangs-OD&sub6;&sub0;&sub0; von 0,25 inokuliert. Die Zellen werden bei 30ºC bis zu 48 Stunden gezüchtet und bei einer OD&sub6;&sub0;&sub0; von etwa 10 geerntet.
Zellen von 35 ml niedrigem Pi-Medium werden durch Zentrifugieren gesammelt und in einem Gesamtvolumen von 4 ml kaltem 66 mM Natriumphosphatpuffer pH 7,4 und 0,1 % (v/v) Triton X-100 resuspendiert. Die Zellsuspension wird in ein 30-ml-Gorex-Röhrchen transferiert. 8 g Glasperlen (0,4 mm Durchmesser) werden zugesetzt, und die Suspension wird auf einem Vortex-Mixer (Scientific Instruments Inc., USA) bei voller Geschwindigkeit 4 min geschüttelt und dann in einem Eisbad gekühlt. Mehr als 90 % der Zellen werden durch diesen Vorgang aufgebrochen. Zelldetritus und Glasperlen werden durch 10 min Zentrifugieren bei 8000 UpM bei 4ºC in einem Sorval-HB4-Rotor sedimentiert. Polypeptide mit IgE-Bindungsfaktor-Aktivität werden aus den Überständen unter Anwendung von Affinitäts-Ghromatographie gereinigt, wie in den Beispielen 22 und 23 beschrieben.
Beispiel 26: Aufbau von Plasmiden pCALS-R/ND und pCAL8-BF/ND für die Expression von Polypeptiden mit IgE-Bindungsaktivität in kultivierten Säugerzellen. In diesem Beispiel wird die Konstruktion von Plasmiden pCAL5-R/ND und pCAL8-BF/ND beschrieben (Fig. 7). Sie erlauben die Produktion von Membran-gebundenem IgE-Rezeptor oder sezemiertem IgE-Bindungsfaktor in kultivierten Säugerzellen. Weiters sind diese Plasmide für die Selektion von Genamplifikation in den Wirtszellen gemacht, ein Verfahren, das zu hohen Ausbeuten des gewünschten Polypeptids führt.
26.1. Konstruktion von Plasmid pCAL5. Das Plasmid pSV2911 neo [Asselbergs F.A.M. u.a. (1986) J. Mol. Biol. 189, 401-411] wird verwendet, um die Vektor-DNA herzustellen. Es wird mit den Restriktionsenzymen HindIII und SaII verdaut. Fragmente von 3,9 und 1,8 kb werden erhalten. Das Gemisch wird mit alkalischer Phosphatase behandelt, und das 3,9-kb-Fragment wird nach Elektrophorese durch 1%iges Agarosegel isoliert.
Parallel werden zwei DNA-Inserts hergestellt, die für den IgE-Rezeptor bzw. die 3'-Hälfte des Beta-Globingens von Kaninchen codieren. Andererseits werden 10 ug Plasmid pCAL3 (Beispiel 20; Fig. 4) teilweise mit HindIII und vollständig mit BamHI verdaut. das cDNA-Insert von 1,26 kb wird durch Agarosegelelektrophorese und Gelelution isoliert. Andererseits werden 10 ug Plasmid pUß [Weber F. und Schaffner W. (1985) Nature 315, 75-77] vollständig mit BamHI und SaII verdaut. Das 1,2-kb-DNA-Fragment wird isoliert. Es enthält das große Intron und das Poly(A)-Signal des Kaninchen-Beta-Globingens.
10 ng der Vektor-DNA von oben und 10 ng von jeder Insert-DNA werden ligiert. Die resultierende DNA wird für die Transfektion kompetenter E.coli HB101 verwendet. Ein rekombinantes Plasmid (pCAL5; Fig. 7) wird gewählt, das das erwartete Restriktionsmuster zeigt, wie es nach Aufnahme von beiden DNA-Inserts in die Vektor-DNA erwartet wird.
26.2 Konstruktion von Plasmid pCAL5-R/ND. 10 ng pCAL5-Plasmid-DNA werden teilweise mit Sall verdaut. DNA-Moleküle, die nur einmal geschnitten werden und daher Lineare voller Länge darstellen, werden durch Agarosegelelektrophorese gereinigt. Parallel werden 10 ug pND2-Plasmid-DNA (Asselbergs u.a., loc. cit.) vollständig mit Xhol und Sall gespaltet.
Dieses Plasmid enthält zwei Selektionsmarker, Neomycin (neo) und Dihydrofolat-Reduktase (dhfr), die die Selektion hinsichtlich Integration bzw. Amplifikation von Fremd-DNA im Genom von Säugerwirten erlauben. Die gespaltene pND2-DNA wird mit alkalischer Phosphatase behandelt. Dann werden 10 ng Sall-gespaltenes pCAL5 und 10 ng Sall/Xhol-gespaltenes pND2-Plasmid gemischt und ligiert. Die resultierende DNA wird verwendet, um kompetente E.coli HB101-Zellen zu transformieren. Die transformierten Zellen werden auf eine Agarplatte gestrichen, die LB-Brühe und 50 ug/ml Kanamycin enthält. Ein rekombinantes Plasmid (pCAL5-R/ND, Fig. 7), das das erwartete DNA-Restriktionsmuster zeigt, wird für die Expression des IgE-Rezeptors in Säugerwirten gewählt. Es enthält die neo- und dhfr-Selektionsmarker stromabwärts von der IgE-Rezeptor-cDNA. Die Richtung der Transcription ist für alle drei Gene identisch.
26.3 Konstruktion von Plasmid pCAL8-BF/ND. Das Plasmid pCAL8-BF/ND ist ein Derivat von dem oben beschriebenen Plasmid pCAL5-R/ND, worin die für die Aminosäuren 1 bis 147 des Polypeptids der Formel I codierende DNA-Sequenz durch eine neue DNA-Sequenz ersetzt ist, die für die Signalsequenz des "avian" Influenza-Hämagglutinin codiert. Dieser Wechsel erlaubt die Sekretion von IgE-Bindungsfaktoren, umfassend die Aminosäuren 148 bis 321 des Polypeptids der Formel I.
Zu diesem Zweck wird ein ds-DNA-Fragment gemäß in den Literaturstellen 4, 5, 6, 6a, 7, 8 beschriebenen Standardmethoden chemisch synthetisiert, mit der Formel:
0,2 ng dieser DNA werden mit 10 ng Vektor-DNA und 2 ng eines 0,7-kb-Ddel/Xbal-cDNA-Inserts ligiert. Der Vektor wird aus pCAL5-Plasmid-DNA durch (a) vollständige Verdauung mit Xbal und HindIII, (b) Dephosphorylierung mit alkalischer Phosphatase und (c) Agarosegel-Reinigung der 5,9-kb-Vektor-DNA erhalten. Das 0,7-kb-cDNA-Insert-Fragment wird von pCAL3 (Beispiel 20) erhalten. 30 ug pCAL3-Plasmid-DNA werden mit HindIII und Xbal verdaut, und das 0,8-kb-cDNA-Insert-Fragment wird durch Agarosegel-Reinigung isoliert. 3 ug dieses 0,8-kb-Fragments werden mit Ddel verdaut, wobei DNA-Fragmente von 0.1 und 0,7 kb erzeugt werden. Schließlich wird das 0,7 kB-DNA-Fragment durch Agarosegelelektrophorese und Reinigung isoliert.
Die ligierte DNA wird verwendet, um kompetente E.coli HB101-Zellen zu transformieren. Ein rekombinantes Plasmid (pCAL8; Fig. 7) wird gewählt, das die erwarteten Restriktionsfragmente zeigt, wie nach Integration des DNA-Inserts in die Vektor-DNA erwartet.
10 ug pCAL8-Plasmid-DNA werden vollständig mit Sall verdaut. Die linearen DNA-Moleküle werden durch Agarosegelelektrophorese gereinigt. 10 ng Sall-gespaltenes pCAL8 werden ligiert mit 10 ng SaII/XhoI-gespaltenem pND2-Plasmid (Beispiel 26.2). Die ligierte DNA wird verwendet, um kompetente E.coli HB101-Zellen zu transformieren, die auf eine Agarplatte plattiert werden, die LB-Medium enthält, das ergänzt ist mit 50 ug/ml Kanamycin. Ein rekombinantes Plasmid (pCAL8-BF/ND; Fig. 7) wird für die Expression und Produktion von IgE-BFs in transformierten Säugerwirten verwendet.
Beispiel 27: Selektion transformierter Säugerzellinien, die Polypeptide mit IgE-Bindungsaktivität exprimieren. Die Methoden zur Transfektion von DNA in Säugerzellen sowie die Selektion transformierter Zellen und Selektion hinsichtlich der Genamplifikation wurden im Detail [US- Patent 4,399,216 (1983); Kaufman R.J. und Sharp P.A. (1982), J. Mol. Biol. 159, 601-621] beschrieben und sind den Fachleuten auf dem Gebiet gut bekannt. Eine Dihydrofolat-Reduktase-negative Mutante (dhfr&supmin;) einer CHO-Zellinie (Chinese hamster ovary) wird als Wirt verwendet [Zellinie DUKX-B1; Ghasin L.A. und Urlaub G. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4216-4220]. Die Zellen werden in MEM-Medium gehalten (Gibco, Paislay, Schottland), das ergänzt ist mit 5 % dialysiertem FCS und 0,1 mg/ml Gentamycin (Gibco). Subkonfluente CHO-Zellen werden transfektiert mit 10 ug pCAL5-R/ND oder pCAL8-BF/ND-Plasmid-DNA unter Verwendung der Ca-Phosphat-Mitfällungsmethode. Die transfektierten Zellen werden in Alpha-MEM-Medium gezüchtet, das mit 5 % FCS, Gentamycin und 0,5 mg/ml G418 (Gibco) ergänzt ist.
Nach zwei Wochen wachsen einzelne Kolonien von G418-resistenten Zellen aus. 48 Kolonien werden individuell in Vertiefungen einer Mikrotiterplatte mit 24 Vertiefungen transferiert und zu Konfluenz in dem oben beschriebenen Selektionsmedium gezüchtet. Dann werden Aliquote von dem Medium entfernt und auf die Gegenwart von IgE-Bindungsaktivität unter Anwendung des im Beispiel 7 beschriebenen RIA untersucht. Etwa 50 % der Kolonien sind positiv und produzieren ungefähr 0,1-10 ng rekombinantes Polypeptid pro ml. Die transformierten Kolonien, die erhalten wurden aus pCAL8-BF/ND sind im allgemeinen stärkere Produzenten als die, die mit Plasmid pCAL5-R/ND erhalten werden. Die fünf am besten produzierenden Kolonien werden für Genamplifikation mit Methotrexat (Kaufman und Sharp op. cit) verwendet. Nach mehreren Durchgängen der Amplifikation werden Zellinien erhalten, die bis zu 1 ug/ml rekombinantes Polypeptid produzieren. Der beste Produzent, Zellinie CHO-BF/ND, wird in "bulk"-Kulturen gezüchtet. Ungefahr 3 x 10&sup6; Zellen werden pro Gewebekulturflasche (Falcon, 175 cm²) mit 50 ml Selektionsmedium gesät. Nachdem die Zellschicht Konfluenz erreicht hat, wird das Medium entfernt und durch 50 ml Alpha-MEM-Medium ersetzt, das mit 1 % FCS und 0,1 mg/ml Gentamycin ergänzt ist. Das Medium wird zweimal pro Woche mehrere Wochen lang gesammelt. Es wird 10 min bei 5000 g zentrifugiert und bei -20ºC gelagert. Schließlich werden rekombinante Polypeptide mit IgE-Bindungsaktivität von vereinigten Überständen durch Affinitäts-Chromatographie wie hier zuvor beschrieben, z.B. in den Beispielen 22 und 23, gereinigt.
Reinigung von naturlichem IgE-BF von RPMI 8866-Zellen und Sequenzanalyse. Durch Reinigung von IgE-BF enthaltenden Fraktionen von RPMI 8866-Zellüberständen (EP 86810244.3) nach den folgenden Beispielen B bis D ist es möglich, einen IgE-BF zu erhalten, der rein genug für Sequenzierung und Bestimmung des Aminoterminus ist.
Beispiel A: ELISA (Enzyme-linked-immuno-sorbent-assay) von IgE-BF. Die Fraktionen werden hinsichtlich IgE-BF auf folgende Art untersucht: PVC-Mikrotiterplatten-Vertiefungen werden mit Mal:-176 (5 ug/ml in PBS; 100 ug pro Vertiefung) über Nacht in der Feuchtigkeitskammer bei Raumtemperatur überzogen. Die Platten werden zweimal mit PBS gewaschen, bevor nichtspezifische Bindungsstellen mit PBS blockiert werden, das 0,2 % Gelatine enthält (150 ul/Vertiefung; 1 h bei 37ºC). Die Platten werden wieder zweimal mit PBS gewaschen. Fraktionen aus Chromatographie-Experimenten werden 1/50 in PBS verdünnt, den Vertiefungen zugegeben (100 ul/Vertiefung) und über Nacht bei Raumtemperatur in einer Feuchtigkeitskammer inkubiert. Platten werden 4 Mal mit PBS gewaschen. Gebundener IgE-BF wird durch Zugabe von Mab-135 nachgewiesen, an die Biotin kovalent gebunden worden war (Beispiel 19, EP 86810244.3) (0,5 ug/ml in 0,2 % Gelatine enthaltendem PBS; 100 ul/Vertiefung) und 4 h bei 37ºC in einer Feuchtigkeitskammer inkubiert. Nach Waschen mit PBS (4 Mal) werden die Platten mit 100 ul Konjugat von Avidin und alkalischer Phosphatase (Sigma Cat. Nr. A 2527 0,5 ug/ml) in PBS, das 0,2 % Gelatine enthält, 2 h bei 37ºC inkubiert. Nach weiterem Waschen mit PBS werden die Platten mit 1 mg/ml p-Nitrophenylphosphat-dinatrium in Substratpuffer (100 mg MgCl&sub2; x 6 H&sub2;O, 200 mg NaN&sub3;, 97 ml Diethanolamin, gelöst in 800 ml H&sub2;O, pH mit 37%iger HCl eingestellt auf 9,8) entwickelt. Die gelbe Farbreaktion ist optimal nach 20-40 min bei 37ºC. Die Reaktion wird dann gestoppt mit 50 ul NaOH (1 M) pro Vertiefung. Die optische Dichte wird unter Verwendung eines Modell 2550 EIA- Reader (Bio-Rad) bei 405 mm bestimmt.
Beispiel B: Reinigung von IgE-BF aus Human-B-Zellüberständen durch Immunoaffinitäts-Chromatographie. 10 Liter Kulturüberstand von RPMI 8866-Zellen werden durch eine 20-ml-Säule von Mab-45-Affigel (Beispiel 10 von EP 86810244.3) in einer Fließrate von 120 ml/h flltriert. Das Gel wird mit PBS gewaschen. Der Proteingehalt des Durchflusses wird durch on-line-Extinktion bei 280 nm mittels eines Uvicord -Spektralphotometers überwacht, um vollständige Entfernung ungebundener Proteine sicherzustellen. Die Säule wird mit 50 ml 0,1 M Glycin-HCl, pH 2,6 eluiert. Fraktionen werden in Röhrchen gesammelt, die gleiche Mengen 1 M Tris-HCl, pH 8,0 und 0,5 % Tween 20 enthalten. IgE-BF enthaltende Fraktionen werden zusammengefaßt und gegen 10 mM Tris-HCl, pH 7,4, dialysiert.
Beispiel C: Reinigung von IgE-BF durch Ionenaustausch-Chromatographie. Gereinigter IgE-BF von Beispiel B wird auf eine SynChropak AX 300-Anionenaustauschersäule (SynChrom Inc., Linden, IN) geladen. Die Säule wird mit 10 mM Tris-HCl, pH 7,4, gewaschen, und das Protein wird mit einem Gradienten von 0 bis 1 M NaCl in 100 min bei einer Fließrate von 1 ml/min eluiert. Die Elution wird hinsichtlich der UV-Absorption bei 254 nm überwacht. Die Fraktionen werden in 1%igem Octylpyranoglucosid (Sigma) gesammelt und hinsichtlich IgE-BF wie im Beispiel A beschrieben untersucht.
Beispiel D: Weitere Reinigung von IgE-BF durch Umkehrphasen-Chromatographie: 50 ml IgE-BF von Beispiel C werden gegen 0,5 l PBs dialysiert und zweimal gegen 0,5 l PBs, das 0,1 % Octylpyranoglucosid enthält. Nach Lyophilisierung wird der IgE-BF in 1,5 ml H&sub2;O solubilisiert und wieder gegen 2 x 0,5 l 0,1 % Octylpyranoglucosid enthaltendes PBS dialysiert. Umkehrphasen- Chromatographie wird an einer SynChropak RP-4-Säule (SynChrom) in 0,1 % TFA (Pierce) und 5 % Acetonitril (Merck) durchgeführt. Elution von IgE-BF erreicht man durch Anwendung eines Gradienten von 5-60 % Acetonitril in 0,1 % TFA während 30 min bei einer Fließsrate von 0,5 ml/min. Die Elution wird hinsichtlich der UV-Extinktion bei 254 nm überwacht. 1-ml-Fraktionen wurden in 0,05%iges SDS gesammelt und wie im Beispiel A beschrieben hinsichtlich IgE-BF untersucht. Die Reinheit von IgE-BF wird durch SDS-PAGE mit umschließender Scriber-Färbung (EP 86810244.3, Beispiel 22) kontrolliert.
Beispiel E: Aminosäuresequenzanalyse von IgE-BF. Der gereinigte IgE-BF von Beispiel D wird N-terminaler Aminosäuresequenzanalyse unter Verwendung eines Positive-Phase-Proteinsequenators Modell 470 (Applied Biosystems) nach der Methode von M.W. Hunkapillar und LE. Hood, Methods in Enzymology 91, 399, 1983 unterworfen. Die Aminothiozolinon-Derivate werden wieder angeordnet zu Phenylthiohydantoin (PTH)-Aminosäuren durch Behandlung mit 25%igem wäßrigem TFA bei 50ºC. Die PHT-Aminosäuren werden an einer Zorbax CN -HPLC-Säule (Du Pont, 200 x 4,6 mm) (R. Knecht u.a., Anal. Biochem, 130, 65, 1983) analysiert. Die folgende N-terminale Aminosäuresequenz wird für 40 % des Materials gefunden:
X&sub1;&sub4;&sub9;, X&sub1;&sub5;&sub5;, X&sub1;&sub6;&sub0; und X&sub1;&sub6;&sub3; stellen nicht-bestimmte Aminosäuren dar. Diese Sequenz ist gemäß der Sequenz des IgE-Rezeptors, bestimmt durch cDNA-Analyse, ausgehend von Aminosäure Nr. 148 des Rezeptors.
Die folgende N-terminale Aminosäuresequenz findet man für 60 % des Materials:
X&sub1;&sub5;&sub1;, X&sub1;&sub6;&sub0; und X&sub1;&sub6;&sub3; stellen nicht-bestimmte Aminosäuren dar. Diese Sequenz ist in Übereinstimmung mit der Sequenz von IgE-Rezeptor, bestimmt durch cDNA-Analyse, ausgehend von Aminosäure Nr. 150 des Rezeptors.

Beispiel 28: Überexpression (High-Level-Expression) eines Polypeptids mit IgE-Bindungsfaktor-Aktivität in E.coli.

28.1 Konstruktion von Expressionsplasmid. 10 ng gereinigte 2,9-kb-Vektor-DNA von Beispiel 24.1 (Plasmid pPbLc24 geschnitten mit EcoRI und BamHI) werden vermischt mit 0,1 ng des Oligonucleotids 5'-pAATTTGGAGGAAAAAATTATG (Pharmacia, Nr.27-4878-01) und 0,1 ng des Oligonucleotids 5'-pGATCCATAATTTTTTCCTCCA (Pharmacia, Nr. 27-4898-01) in 20 ul einer Lösung, die 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgCl&sub2;, 2 mM DDT, 0,1 mM ATP und 100 Einheiten T&sub4;-DNA-Ligase (Boehringer, Mannheim) enthält, Nach 16 Stunden bei 4ºC wird das Gemisch verwendet, um kompetente E.coli K12-Zellen zu transformieren. Individuelle Kolonien wachsen auf, und Plasmid-DNA wird daraus isoliert. Standard-Restriktionsanalyse erfolgt, um ein korrektes Plasmid (pPL.PTIS; s. Fig. 8) zu wählen, das durch BamHI, aber nicht durch EcoRI geschnitten wird. Die korrekte Insertion der Oligonucleotide wird durch DNA-Sequenzierung bestätigt. Das neu inserierte DNA- Fragment codiert für eine portabl,e Translationsinitiationsstelle (PTIS, Pharmacia).
10 ug pPL.PTIS-Plasmid-DNA werden mit BamHI verdaut, dann mit alkalischer Phosphatase behandelt, und die lineare 2,9-kb-Vektor-DNA wird durch Agarosegelelektrophorese gereinigt. 10 ng dieser Vektor-DNA werden mit 3 ng des 0,8-kb-BgIII- bis BamHI-Fragmentes, das aus Plasmid pCAL-3 abgeleitet ist (Beispiel 20) ligiert und dann zur Transformation kompetenter E.coli K12-Zellen verwendet. Plasmid-DNA wird aus individuellen Kolonien isoliert, und Standard-Restriktionsanalyse erfolgt, um ein Plasmid zu wählen, pPL.PTIS-BF, das die 0,8-kb-Insertion in der korrekten Orientierung hat (Fig. 8).
Plasmid pPL.PTIS-BF wird verwendet, um E.coli-Stämme W3110 und HB101, die beide λI857 (Remaut u.a., loc. cit.) beherbergen, zu transformieren. Die Transformanten werden auf LB-Platten ausplattiert, die 40 ug/ml Kanamycin und Ampicillin enthalten, und durch Inkubation bei 30ºC für 24 Stunden gezüchtet. Resultierende rekombinante Kolonien werden für Fermentation verwendet.
28.2 Fermentation. Rekombinante E.coli-Stämme, die im Beispiel 28.1 erhalten werden, werden wie im Beispiel 24.2 beschrieben gezüchtet. Nach 3 Stunden Induktion bei 42ºC werden die Kulturen 30 min in einem Eis/Wasser-Bad gekühlt und durch Zentrifugieren gesammelt.
28.3 Reinigung von Polypeptiden mit IgE-Bindungsaktivität. Das aus 1 l Hitze-induzierter Kultur erhaltene Zellpellet wird in 20 ml 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 1 mM EDTA bei 4ºC resuspendiert. Die Zellsuspension wird, während konstant auf Eis gekühlt wird, 4x30 s mit einer Minute Intervall (MSE Soniprep 150, 9,5 mm Sonde, 24 Mikron Amplitude) beschallt. Die Suspension wird dann 10 min (Sorvall-Zentrifuge, HB-4-Rotor, 9000 UpM, 4ºC) zentrifugiert. Das Pellet wird in 20 ml 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 1 mM EDTA bei 4ºC resuspendiert und 30 s wie oben beschrieben beschallt. Die Suspension wird wie oben beschrieben zentrifugiert, und der Waschzyklus zweimal wiederholt.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen: Fig. 1: Herstellung von Plasmiden pCL-1 und pCL-2, enthaltend als Inserts ds-cDNA von mRNA, isoliert aus RPMI 8866-B-Zellen. Die Insert-cDNA codiert für Polypeptide, die mit IgE-Rezeptoren und IgE-Bindungsfaktoren verwandt sind. Fig. 2: Die beiden Inserts der Plasmide pCL-1 und pCL-2 werden verglichen, wobei gezeigt wird: die Codierenden Regionen zu beiden Inserts identisch, die nicht-codierenden Regionen zu beiden Inserts identisch, die codierende Region nur in pCL-2 anwesend und nicht-codierende Regionen in beiden Inserts verschieden, sowie einige Restriktionsstellen. Fig. 3: Die Konstruktion von Plasmid pGEM -1/CL2 aus pCL-2 und pGEM -1 und Transkription des DNA-Inserts in mRNA. Fig. 4: Die Konstruktion der Plasmide pFK-1, mit dem Insert, das für die Aminosäuresequenz Asp&sub1;&sub1;&sub9; bis Ser&sub3;&sub2;&sub1; codiert, und pFK-2, das für die Aminosäuresequenz Ala&sub1;&sub3;&sub4; bis Ser&sub3;&sub2;&sub1; der Formel I codiert, ausgehend von Plasmid pCL-2. Fig. 5: Die Konstruktion von Plasmid pBL-BF für die Expression von IgE-BF in E.coli W3110 und HB101. Exprimiert werden die Aminosäuren 119 bis 321 unter dem PL-Promotor von Phage λ. Fig. 6: Die Konstruktion von Plasmid pJDB207R/PHO5-BF für die Expression von IgE-BF in Saccharomyces cerevisiae. Exprimiert werden die Aminosäuren 119 bis 321 unter dem PHO5-Promotor. Fig. 7: Die Konstruktion von Plasmid pCAL5-R/ND und pCAL8-BF/ND für die Expression von Membran-gebundenem IgE-Rezeptor bzw. sezefrniertem IgE-BF in kultivierten Säugerzellen (CHO-Zellen, Chinese hamster ovary). Fig. 8: Die Konstruktion von Plasmid pPL.PTIS-BF für die Transformätion und Expression von IgE-BF in E.coli.

Legende: Restriktionsenzyme

A = HaeII
B = BamHI
C = HincII
E = Eco RI
G = BglIII
H = HindIII
N = NcoI
P = PstI
R = RsaI
Sequenz, die für Polypeptid codiert, das verwandt ist mit IgE-Rezeptoren und/oder IgE-BFs
codierende Sequenz, spezifisch für pCL-2 (Fig. 2)
nicht-codierende Sequenz, verschieden in pCL-1 und pCL-2
nicht-codierende Sequenz, identisch in pCL-1 und pCL-2 (Fig. 2)
mRNA
Hinterlegung von Mikroorganismus: Escherichia coli HB101/pCL-2, das Plasmid pCL-2 enthaltend, wurde am 30. Juli 1986 bei "Deutsche Sammlung für Mikroorganismen", Griesbachstraße 8, D-3400 Göttingen, unter der Nummer DSM 3807 hinterlegt.

Literatur:

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Claims

1. Polypeptid mit der Aminosäuresequenz der Formel (I)

ein Fragment, eine Mutante oder ein Derivat davon.

2. Fragment eines Polypeptids der Formel (I) nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die die Aminosäuren 106 bis 127 umfassende Aminosäuresequenz deletiert ist.

3. Fragment eines Polypeptids der Formel (I) nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Polypeptiden, die mit irgendeiner der Aminosäuren 120, 121, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159 oder 160 anfangen und mit der Aminosäure 321 enden.

4. Fragment eines Polypeptids der Formel (I) nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Polypeptiden, die mit irgendeiner der Aminosäuren 120, 121, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159 oder 160 beginnen und mit irgendeiner der Aminosäuren zwischen 282 und 321 enden.

5. Fragment eines Polypeptids nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es aus der Aminosäuresequenz von Aminosäure 119 bis Aminosäure 321 besteht.

6. Fragment eines Polypeptids nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es aus der Aminosäuresequenz von Aminosäure 134 bis Aminosäure 321 besteht.

7. Fragment eines Polypeptids nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es aus der Aminosäuresequenz von Aminosäure 148 bis Aminosäure 321 besteht.

8. Fragment eines Polypeptids nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es aus der Aminosäuresequenz von Aminosäure 150 bis Aminosäure 321 besteht.

9. Mutante oder Derivat eines Fragments nach irgendeinem der Ansprüche 2 bis 8.

10. Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids der Formel (I), eines Fragments, einer Mutante oder eines Derivats davon, dadurch gekennzeichnet, daß (a) ein transformierter Wirt, der einen Hybridvektor enthält, welcher eine DNA-Sequenz enthält, codierend für ein Polypeptid der Formel (I), ein Fragment oder eine Mutante davon, kultiviert wird, oder (b) die mRNA, die codiert für ein Polypeptid der Formel (I), ein Fragment oder eine Mutante davon, in einem passenden Translationssystem translatiert wird und, falls erforderlich, ein Polypeptid der Formel (I), ein Fragment oder eine Mutante davon in ein Derivat davon transformiert wird.

11. Verfahren zur Herstellung eines zur Expression eines Polypeptids nach Anspruch 1 befähigten transformierten Wirtes, gekennzeichnet durch 1. Herstellung einer DNA, codierend für ein Polypeptid der Formel (I), ein Fragment, eine Mutante oder ein Derivat davon, 2. Einbringen der erhaltenen DNA in einen passenden Vektor, 3. Transformieren eines geeigneten Wirts mit dem erhaltenen Hybridvektor, 4. Selektion der transformierten Wirte von untransformierten Wirten und wahlweise Isolierung des Hybridvektors aus dem transformierten Wirt, Modifizieren der codierenden oder nicht-codierenden Region des Hybridvektors und erneutes Durchführen der Schritte 3 und 4.

12. DNA, die für ein Polypeptid nach Anspruch 1 codiert.

13. DNA nach Anspruch 12 mit der Formel (II) oder ein Fragment oder eine Mutante davon.

14. DNA nach Anspruch 12 mit der Formel (III) oder ein Fragment oder eine Mutante davon.

15. DNA nach Anspruch 12, die für ein Polypeptid mit der Aminosäuresequenz D&sub1;&sub1;&sub9; bis S&sub3;&sub2;&sub1; der Formel (I) codiert.

16. DNA nach Anspruch 12, die für ein Polypeptid mit der Aminosäuresequenz A&sub1;&sub3;&sub4; bis S&sub3;&sub2;&sub1; der Formel (I) codiert.

17. DNA nach Anspruch 12, die für ein Polypeptid mit der Aminosäuresequenz L&sub1;&sub4;&sub8; bis S&sub3;&sub2;&sub1; der Formel (I) codiert.

18. DNA nach Anspruch 12, die für ein Polypeptid mit der Aminosäuresequenz M&sub1;&sub5;&sub0; bis S&sub3;&sub2;&sub1; der Formel (I) codiert.

19. Hybridvektor, umfassend als Insert eine DNA-Sequenz codierend für ein Polypeptid der Formel (I) nach Anspruch 1 oder ein Fragment, eine Mutante oder ein Derivat davon.

20. Hybridvektor nach Anspruch 19, umfassend als Insert eine DNA-Sequenz codierend für ein Fragment des Polypeptids der Formel (I), dadurch gekennzeichnet, daß das Insert für ein Polypeptid der Formel (I) codiert, in dem die die Aminosäuren 106 bis 127 umfassende Aminosäuresequenz deletiert ist.

21. Hybridvektor nach Anspruch 19, umfassend als Insert eine für ein Fragment des Polypeptids der Formel (I) codierende DNA-Sequenz, dadurch gekennzeichnet, daß das Insert für ein Fragment des Polypeptids der Formel (I), codiert, das ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Polypeptiden ausgehend von irgendeiner der Aminosäuren 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159 oder 160 und mit Aminosäure 321 endend.

22. Hybridvektor nach Anspruch 19, umfassend als Insert eine für ein Fragment des Polypeptids der Formel (I) codierende DNA-Sequenz, dadurch gekennzeichnet, daß das Insert für ein Fragment des Polypeptids der Formel (I) codiert, das ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Polypeptiden ausgehend von irgendeiner der Aminosäuren 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159 oder 160 und mit irgendeiner der Aminosäuren zwischen 282 und 321 endend.

23. Hybridvektor nach Anspruch 19, umfassend als Insert eine für ein Fragment des Polypeptids der Formel (I) codierende DNA-Sequenz, dadurch gekennzeichnet, daß das Insert für ein Fragment des Polypeptids der Formel (I) codiert, das aus der Aminosäuresequenz von Aminosäure 119 bis Aminosäure 321 besteht.

24. Hybridvektor nach Anspruch 19, umfassend als Insert eine für ein Fragment des Polypeptids der Formel (I) codierende DNA-Sequenz, dadurch gekennzeichnet, daß das Insert für ein Fragment des Polypeptids der Formel (I) codiert, das aus der Aminosäuresequenz von Aminosäure 134 bis Aminosäure 321 besteht.

25. Hybridvektor nach Anspruch 19, umfassend als Insert eine für ein Fragment des Polypeptids der Formel (I) codierende DNA-Sequenz, dadurch gekennzeichnet, daß das Insert für ein Fragment des Polypeptids der Formel (I) codiert, das aus der Aminosäuresequenz von Aminosäure 148 bis Aminosäure 321 besteht.

26. Hybridvektor nach Anspruch 19, umfassend als Insert eine für ein Fragment des Polypeptids der Formel (I) codierende DNA-Sequenz, dadurch gekennzeichnet, daß das Insert für ein Fragment des Polypeptids der Formel (I) codiert, das aus der Aminosäuresequenz von Aminosäure 150 bis Aminosäure 321 besteht.

27. Hybridvektor nach Anspruch 19, umfassend eine DNA-Sequenz der Formel (II) oder (III) oder ein Fragment oder eine Mutante davon.

28. Hybridvektor nach Anspruch 19, der pCL2 ist.

29. Hybridvektor nach Anspruch 19, der pCL1 ist.

30. Hybridvektor nach Anspruch 19, der pPL-BF ist.

31. Hybridvektor nach Anspruch 19, der pCAL8-BF/ND ist.

32. Hybridvektor nach Anspruch 19, der pPL.PTIS-BF ist.

33. Wirt, der transformiert ist mit einem Hybridvektor nach irgendeinem der Ansprüche 19 bis 32.

34. Wirt nach Anspruch 33, der ein Stamm von E.coli ist.

35. Wirt nach Anspruch 33, der ausgewählt wird aus E.coli HB101, E.coli BZ234, E.coli B1472 und W3110.

36. Wirt nach Anspruch 33, der ausgewählt wird aus Saccharomyces cerevisiae-Stämmen, z.B. GRF18.

37. Wirt nach Anspruch 35. der ausgewählt wird aus Säugerzellinien, z.B. der Zellinie aus Ovarzellen eines chinesischen Hamsters, DUKX-B1.

38. Polypeptid nach Anspruch 1, ein Fragment, eine Mutante oder ein Derivat davon, wann immer nach dem Verfahren von Anspruch 10 hergestellt.

39. Pharmazeutische Zubereitung, umfassend eine therapeutisch wirksame Menge eines Polypeptids nach Anspruch 1.

40. Polypeptid nach Anspruch 1 zur Verwendung in einem Verfahren zur therapeutischen Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers.

41. Verwendung eines Polypeptids nach Anspruch 1 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Verwendung als Antiallergikum.

42. Verwendung eines Polypeptids nach Anspruch 1 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zubereitung.