JPS61268184A - 組換えプラスミド及び当該プラスミドによる形質転換株 - Google Patents
組換えプラスミド及び当該プラスミドによる形質転換株Info
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- JPS61268184A JPS61268184A JP60246917A JP24691785A JPS61268184A JP S61268184 A JPS61268184 A JP S61268184A JP 60246917 A JP60246917 A JP 60246917A JP 24691785 A JP24691785 A JP 24691785A JP S61268184 A JPS61268184 A JP S61268184A
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- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、組換えプラスミド及び当該プラスミドによる
形質転換株に関し、さらに詳しくは、生理活性物質をコ
ードする異種遺伝子を効率よく発現する組換えプラスミ
ド及び当該プラスミドによる形質転換株に関する。かく
して、本発明は遺伝子工学による生理活性物質の製造技
術分野において、極めて有用である。
形質転換株に関し、さらに詳しくは、生理活性物質をコ
ードする異種遺伝子を効率よく発現する組換えプラスミ
ド及び当該プラスミドによる形質転換株に関する。かく
して、本発明は遺伝子工学による生理活性物質の製造技
術分野において、極めて有用である。
酵母〔サン力ロマイセスセレビジア（Ｓａｃｃｈａ−ｒ
ｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））には、クリプ
テイク（ｃｒｙｌｌ−ｔｉｃ）プラスミドである２−プ
ラスミド（６，３１８塩基対）が存在し、その全塩基配
列の決定は、すでになされている〔バートリー及びドネ
ルソン、ネーチャー、第２８６巻、第８６０頁、 １９
８０年（Ｈａｒｔｌｅｙａｎｄ Ｄｏｎｅｌｓｏｎ、
Ｎａｔｕｒｅ ２８６．８６０．１９８０） ） 、そ
して、この２Ｐ、プラスミドを持つ酵母はＣｒｔ“株と
、また、これを欠く酵母はＣｉｒ ”株と呼ばれている
。
ｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））には、クリプ
テイク（ｃｒｙｌｌ−ｔｉｃ）プラスミドである２−プ
ラスミド（６，３１８塩基対）が存在し、その全塩基配
列の決定は、すでになされている〔バートリー及びドネ
ルソン、ネーチャー、第２８６巻、第８６０頁、 １９
８０年（Ｈａｒｔｌｅｙａｎｄ Ｄｏｎｅｌｓｏｎ、
Ｎａｔｕｒｅ ２８６．８６０．１９８０） ） 、そ
して、この２Ｐ、プラスミドを持つ酵母はＣｒｔ“株と
、また、これを欠く酵母はＣｉｒ ”株と呼ばれている
。
２ Ｐ＠プラスミドのコピー数は、５０〜１００と言わ
れており、比較的効率の良いベクターになりうる。また
、２ｐ＊プラスミドには、少なくとも４つの遺伝子が存
在することが知られており、ブローチ（Ｂｒｏａｃｈ）
らは、２Ｐ輸プラスミドがコードするベーカー（Ｂ
ａｋｅｒ）遺伝子（以下、単にＢ遺伝子）およびチャー
リー（Ｃｈａｒｌｉｅ）遺伝子（以下、単にＣ遺伝子）
の産物（Ｒｅｐ １及びＲｅｐ ２ ）が関与してプラ
スミドの複製をさかんにし、コピー数をあげることによ
りその安定性をよくしていると報告している〔セル、第
２８巻、第２０３頁、 １９８２年（Ｃｅｌ＋訃、 ２
０３．１９８２）） （セル、第３４巻、第９５頁、
１９８３年（Ｃｅ１ｌ ３４．９５．１９８３） ）
、また、菊池は、２Ｐ−プラスミドが細胞内で安定に
維持されるためには、Ｒｅｐ ｌ及びＲｅｐ ２のほか
に、安定分配に関与するＳＴＢ遺伝子が必要である旨を
報告している〔細胞、長、 Ｌ３Ｌ（１９８３））。さ
らにブローチらは、Ｒｅｐ遺伝子産物を欠くす工°株で
高いコピー数を持つプラスミドとして、全２Ｐｇａプラ
スミドを含むｐｃＶ２０． ｐＣν２１を報告している
〔エンザイモロジイー、第１０１巻、第３０７〜３２５
頁、 １９８３年（ＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙＢ■、 ３０
７−３２５．１９８３））。
れており、比較的効率の良いベクターになりうる。また
、２ｐ＊プラスミドには、少なくとも４つの遺伝子が存
在することが知られており、ブローチ（Ｂｒｏａｃｈ）
らは、２Ｐ輸プラスミドがコードするベーカー（Ｂ
ａｋｅｒ）遺伝子（以下、単にＢ遺伝子）およびチャー
リー（Ｃｈａｒｌｉｅ）遺伝子（以下、単にＣ遺伝子）
の産物（Ｒｅｐ １及びＲｅｐ ２ ）が関与してプラ
スミドの複製をさかんにし、コピー数をあげることによ
りその安定性をよくしていると報告している〔セル、第
２８巻、第２０３頁、 １９８２年（Ｃｅｌ＋訃、 ２
０３．１９８２）） （セル、第３４巻、第９５頁、
１９８３年（Ｃｅ１ｌ ３４．９５．１９８３） ）
、また、菊池は、２Ｐ−プラスミドが細胞内で安定に
維持されるためには、Ｒｅｐ ｌ及びＲｅｐ ２のほか
に、安定分配に関与するＳＴＢ遺伝子が必要である旨を
報告している〔細胞、長、 Ｌ３Ｌ（１９８３））。さ
らにブローチらは、Ｒｅｐ遺伝子産物を欠くす工°株で
高いコピー数を持つプラスミドとして、全２Ｐｇａプラ
スミドを含むｐｃＶ２０． ｐＣν２１を報告している
〔エンザイモロジイー、第１０１巻、第３０７〜３２５
頁、 １９８３年（ＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙＢ■、 ３０
７−３２５．１９８３））。
本発明の目的は、前記２１ＡＩＢプラスミドの担持する
遺伝子を利用して、生理活性物質をコードする異種遺伝
子の効率的発現をさせるために、組換えプラスミド及び
当該プラスミドによる形質転換株を提供することにある
。
遺伝子を利用して、生理活性物質をコードする異種遺伝
子の効率的発現をさせるために、組換えプラスミド及び
当該プラスミドによる形質転換株を提供することにある
。
本発明は、前記目的を達成するために、酵母の２１、プ
ラスミドに存在するＢ遺伝子とＣ遺伝子を含む断片の少
なくとも２個を、生理学的活性物質をコードする遺伝子
を担持するプラスミドに挿入することを特徴とする組換
えプラスミド及び当該プラスミドによる形質転換株から
なる。
ラスミドに存在するＢ遺伝子とＣ遺伝子を含む断片の少
なくとも２個を、生理学的活性物質をコードする遺伝子
を担持するプラスミドに挿入することを特徴とする組換
えプラスミド及び当該プラスミドによる形質転換株から
なる。
以下、本発明の個々の構成を詳細に説明する。
［ａ） 酵母の２−プラスミドの調製バートリー（Ｈ
ａｒｔｌｅｙ） らの方法〔ネーチャー。
ａｒｔｌｅｙ） らの方法〔ネーチャー。
第２８６巻、第８６０頁、 １９８０年（Ｎａｔｕｒｅ
２８６．８６０゜１９８０） ）に準じて２Ｐｍプラ
スミドが得られる。また、この２−プラスミド由来のＢ
遺伝子及びＣ遺伝子を担持するプラスミドとしては、ｐ
ＪＤＢ２１９゜ｐＪＤＢ２０７． ｐｃＶ２０． ｐｃ
Ｖ２１． ｐｓ＋４があげられる。
２８６．８６０゜１９８０） ）に準じて２Ｐｍプラ
スミドが得られる。また、この２−プラスミド由来のＢ
遺伝子及びＣ遺伝子を担持するプラスミドとしては、ｐ
ＪＤＢ２１９゜ｐＪＤＢ２０７． ｐｃＶ２０． ｐｃ
Ｖ２１． ｐｓ＋４があげられる。
Ｃｂｌ Ｂ遺伝子及びＣ遺伝子を持つ断片の調製ｔａ
＋によって得られたＢ遺伝子及びＣ遺伝子を担持するプ
ラスミドを制限酵素で切断し、Ｂ遺伝子及びＣ遺伝子を
含む断片を分離・回収する。
＋によって得られたＢ遺伝子及びＣ遺伝子を担持するプ
ラスミドを制限酵素で切断し、Ｂ遺伝子及びＣ遺伝子を
含む断片を分離・回収する。
この切断は、少なくともＢ遺伝子とＣ遺伝子を担持する
遺伝子断片を得るための適当な制限酵素による消化によ
って行われる。制限酵素は特に限定されず、一種または
２種の所望の制限酵素を組み合わせることによって目的
の断片を得ることができる。好適な制限酵素としては、
ＥｃｏＲＩが例示される。なお、断片は、Ｂ遺伝子及び
Ｃ遺伝子に加えて、ＳＴＢ遺伝子または／および○ｒｉ
遺伝子を担持していてもよい。消化処理は、Ｂ遺伝子お
よびＣ遺伝子を担持する原料プラスミドを含む水溶液を
各々の制限酵素に適応した条件に調整後（表１）、各制
限酵素を適当量添加し、１〜２時間処理を行うことによ
ってなされる。目的とするＤＮＡ断片の回収は、例えば
、ロバート（Ｒｏｂｅｒｔ）等の電気泳動法［メソッズ
イン エンザイモロジイー、第６８巻、第１７６〜１
８２頁、 １９７９年（Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ ｅｎｚｙ
ｍｏｌｏｇＶ ６８．１７６−１８２．１９７９）］に
準じて行われる。例えば、ＥｃｏＲＩを用いた消化によ
って約４Ｋｂの断片を得る。Ｂ遺伝子及びＣ遺伝子を担
持することの確認は、各種制限酵素により生ずるＤＮＡ
断片のフラグメントの長さによった。〔ザモレキュラー
バイオロジー オブ ザ イースト サン力ロマイセ
ス、′ライフ サイクル アンド インヘリタンス”、
第４４５〜４７０頁、 １９８）年（Ｔｈｅ Ｍｏ１ｅ
ｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｙｅａｓ
ｔ Ｓａｃｃｈａ−ｒｏｍｙｃｅｓ、 ” Ｌｉｆｅ
ｃｙｃｌｅ ａｎｄ ｒｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ”＋ ４
４５−４７０、１９８） ） ）。
遺伝子断片を得るための適当な制限酵素による消化によ
って行われる。制限酵素は特に限定されず、一種または
２種の所望の制限酵素を組み合わせることによって目的
の断片を得ることができる。好適な制限酵素としては、
ＥｃｏＲＩが例示される。なお、断片は、Ｂ遺伝子及び
Ｃ遺伝子に加えて、ＳＴＢ遺伝子または／および○ｒｉ
遺伝子を担持していてもよい。消化処理は、Ｂ遺伝子お
よびＣ遺伝子を担持する原料プラスミドを含む水溶液を
各々の制限酵素に適応した条件に調整後（表１）、各制
限酵素を適当量添加し、１〜２時間処理を行うことによ
ってなされる。目的とするＤＮＡ断片の回収は、例えば
、ロバート（Ｒｏｂｅｒｔ）等の電気泳動法［メソッズ
イン エンザイモロジイー、第６８巻、第１７６〜１
８２頁、 １９７９年（Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ ｅｎｚｙ
ｍｏｌｏｇＶ ６８．１７６−１８２．１９７９）］に
準じて行われる。例えば、ＥｃｏＲＩを用いた消化によ
って約４Ｋｂの断片を得る。Ｂ遺伝子及びＣ遺伝子を担
持することの確認は、各種制限酵素により生ずるＤＮＡ
断片のフラグメントの長さによった。〔ザモレキュラー
バイオロジー オブ ザ イースト サン力ロマイセ
ス、′ライフ サイクル アンド インヘリタンス”、
第４４５〜４７０頁、 １９８）年（Ｔｈｅ Ｍｏ１ｅ
ｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｙｅａｓ
ｔ Ｓａｃｃｈａ−ｒｏｍｙｃｅｓ、 ” Ｌｉｆｅ
ｃｙｃｌｅ ａｎｄ ｒｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ”＋ ４
４５−４７０、１９８） ） ）。
（以下余白）
表】
ｆｃ） 生理活性物質をコードする遺伝子を担持する
プラスミドの調製 生理活性物質としては、広く既知の物質が例示され、各
種インターフェロン、各種プラスミノゲンアクティベー
ター、ＨＢｓＡｇ等、特に限定されるものではない。よ
り好ましくは、ＨＢｓＡｇが例示される。また当該プラ
スミドは、２Ｐ−プラスミド由来のＯｒ＋、プロモータ
ー、オペレーター、ターミネータ−等の生理活性物質の
発現制御系をすでに担持するものが好ましく、さらにＣ
遺伝子及びＣ遺伝子を担持する断片を入手するために適
した制限酵素部位を、当該プラスミドの発現制御系遺伝
子以外の部分に有することが好ましい。また、適当な制
限酵素部位がなくとも、ｄＣテイル及びｄＧテイルの付
加方法、リンカ−を用いる方法、Ｓ■ヌクレアーゼによ
るＦｌｕｓｈ ｅｎｄ （平滑末端）により連結する方
法を応用することによって利用できる。
プラスミドの調製 生理活性物質としては、広く既知の物質が例示され、各
種インターフェロン、各種プラスミノゲンアクティベー
ター、ＨＢｓＡｇ等、特に限定されるものではない。よ
り好ましくは、ＨＢｓＡｇが例示される。また当該プラ
スミドは、２Ｐ−プラスミド由来のＯｒ＋、プロモータ
ー、オペレーター、ターミネータ−等の生理活性物質の
発現制御系をすでに担持するものが好ましく、さらにＣ
遺伝子及びＣ遺伝子を担持する断片を入手するために適
した制限酵素部位を、当該プラスミドの発現制御系遺伝
子以外の部分に有することが好ましい。また、適当な制
限酵素部位がなくとも、ｄＣテイル及びｄＧテイルの付
加方法、リンカ−を用いる方法、Ｓ■ヌクレアーゼによ
るＦｌｕｓｈ ｅｎｄ （平滑末端）により連結する方
法を応用することによって利用できる。
具体例として、好適には、バイオジエン社によって開発
された生理活性物質をコードする遺伝子を担持するプラ
スミド〔特開昭５９−４８０８２、英国特許２１２５０
４７ ： ｐ３１１１／ＩＰ（α−２）、ｐＪり８２０
？／ＰＨ０５／１１８ＶｓΔ１４（以下、ｐＨＩＮと呼
ぶ）〕が例示される。
された生理活性物質をコードする遺伝子を担持するプラ
スミド〔特開昭５９−４８０８２、英国特許２１２５０
４７ ： ｐ３１１１／ＩＰ（α−２）、ｐＪり８２０
？／ＰＨ０５／１１８ＶｓΔ１４（以下、ｐＨＩＮと呼
ぶ）〕が例示される。
ｆｄｌ Ｃ遺伝子及びＣ遺伝子断片の生理活性物質を
コードする遺伝子を担持するプラスミドへの連結 常法〔ヨーエン。ニス、エン、ら、プロシーデインダス
オブ ザ ナショナル アカデミーオブ サイエンシ
ーズ オブ ザ ニー、ニス。
コードする遺伝子を担持するプラスミドへの連結 常法〔ヨーエン。ニス、エン、ら、プロシーデインダス
オブ ザ ナショナル アカデミーオブ サイエンシ
ーズ オブ ザ ニー、ニス。
ニー１．第６９巻、第２１１０頁、 １９７２年（Ｃｏ
ｈｅｎ、 Ｓ、Ｎ。
ｈｅｎ、 Ｓ、Ｎ。
ｅｔ ａｔ、、 Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ
ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙｏ
ｆ ５ｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕ、Ｓ、Ａ、
６９．２１１０； １９７２） ）に従い、Ｃ遺伝子及
びＣ遺伝子断片を７４ＤＮＡリガーゼにより、特定の制
限酵素処理による当該プラスミドの切断部位に結合させ
、組換えプラスミドを構築する。断片は、例えば第１図
番ご示すように同方向に２個以上を、生理活性物質をコ
ードする遺伝子に連結される。
ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙｏ
ｆ ５ｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕ、Ｓ、Ａ、
６９．２１１０； １９７２） ）に従い、Ｃ遺伝子及
びＣ遺伝子断片を７４ＤＮＡリガーゼにより、特定の制
限酵素処理による当該プラスミドの切断部位に結合させ
、組換えプラスミドを構築する。断片は、例えば第１図
番ご示すように同方向に２個以上を、生理活性物質をコ
ードする遺伝子に連結される。
（ｅｌ 宿主の調製
本発明のＣ遺伝子及びＣ遺伝子は、酵母の２Ｐ−プラス
ミド由来であるため、宿主としては酵母が好ましい。よ
り好ましい宿主は、２Ｐ、、プラスミドを持たない酵母
す工°株が例示され、例えば、公知の菌ＧＲＦ １８の
誘導体であるｐｈｏ８０り工０株がある。当該り１０株
の分離と確認は、参考例１に示した。また、この菌株は
通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所へ昭和５９
年１１月３０日に微工研菌寄第７９７０号として受託さ
れている。
ミド由来であるため、宿主としては酵母が好ましい。よ
り好ましい宿主は、２Ｐ、、プラスミドを持たない酵母
す工°株が例示され、例えば、公知の菌ＧＲＦ １８の
誘導体であるｐｈｏ８０り工０株がある。当該り１０株
の分離と確認は、参考例１に示した。また、この菌株は
通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所へ昭和５９
年１１月３０日に微工研菌寄第７９７０号として受託さ
れている。
（ｆｌ 形質転換
本発明の組換えプラスミドによる宿主の形質転換は、例
えば公知の方法〔ヒンネンら、プロシーデインダス オ
ブ ザ ナショナル アカデミーオブ サイエンシーズ
オブ ザ ニー。ニス。
えば公知の方法〔ヒンネンら、プロシーデインダス オ
ブ ザ ナショナル アカデミーオブ サイエンシーズ
オブ ザ ニー。ニス。
ニー０．第７５巻、第１９２９頁、 １９７８年（旧ｎ
ｎｅｎ ｅｔａｌ。Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔ
ｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆＳｃｉ
ｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕ、Ｓ、Ａ、 ７５．１９
２９； １９７８））により行う。
ｎｅｎ ｅｔａｌ。Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔ
ｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆＳｃｉ
ｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕ、Ｓ、Ａ、 ７５．１９
２９； １９７８））により行う。
ｆｇ＋ 形質転換株の培養
ｆｆ＋の工程によって得られた形質転換株は、宿主に適
した自体公知の培地で培養する。培地としては、たとえ
ば、ＹＮＢ液体培地〔０，７％イーストナイト口ジエン
ヘース（Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａ５ｅ
）（Ｄｉｆｃｏ社）２％グルコース、２％寒天〕が好適
に用いられる。培養は、通常１５〜３２℃で、２０〜５
０時間行い、必要により通気や攪拌を行うこともできる
。培養後、公知の方法、例えば、遠心分離法によって菌
体を集め、例えば、適当な緩衝液に懸濁させた後、例え
ば超音波処理後、遠心分離によって上澄みを回収する。
した自体公知の培地で培養する。培地としては、たとえ
ば、ＹＮＢ液体培地〔０，７％イーストナイト口ジエン
ヘース（Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａ５ｅ
）（Ｄｉｆｃｏ社）２％グルコース、２％寒天〕が好適
に用いられる。培養は、通常１５〜３２℃で、２０〜５
０時間行い、必要により通気や攪拌を行うこともできる
。培養後、公知の方法、例えば、遠心分離法によって菌
体を集め、例えば、適当な緩衝液に懸濁させた後、例え
ば超音波処理後、遠心分離によって上澄みを回収する。
この上澄み中に目的とする生理活性物質が産生されてお
り、以下この生理活性物質に応した、例えば、モノクロ
ーナル抗体を用いた固定化カラムや疎水性基によるアフ
ィニティクロマトによって目的物質の精製が行われ得る
。
り、以下この生理活性物質に応した、例えば、モノクロ
ーナル抗体を用いた固定化カラムや疎水性基によるアフ
ィニティクロマトによって目的物質の精製が行われ得る
。
かくして提供された本発明プラスミド及び形質転換株は
、Ｂ遺伝子及びＣ遺伝子を含まないプラスミド及び宿主
にす工゛を用いる所の従来系に比較して、極めて高単位
の生理活性物質の産生を可能とする。
、Ｂ遺伝子及びＣ遺伝子を含まないプラスミド及び宿主
にす工゛を用いる所の従来系に比較して、極めて高単位
の生理活性物質の産生を可能とする。
実験例１
本発明の効果を確認するために、生理活性物質としてＨ
ＢｓＡｇを用いて、既知プラスミドと本発明プラスミド
とのＨＢｓＡｇの産生に関する比較実験をした。実施例
で得られた組換えプラスミドｐＧＢ１９７で形質転換し
て得られた株（ｐＧＢ１９７／ＧＲＦ１８珈８０り工６
）と、対照としてｐＨＩＮ （バイオジエン社Ｇ３２１
２５０４７ ）で形質転換した酵母〔サン力ロマイセス
セレビジア（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅ
ｖｉｓｉａｅ）ＧＲＦ１８珈８０り工゛〕を試料とした
。
ＢｓＡｇを用いて、既知プラスミドと本発明プラスミド
とのＨＢｓＡｇの産生に関する比較実験をした。実施例
で得られた組換えプラスミドｐＧＢ１９７で形質転換し
て得られた株（ｐＧＢ１９７／ＧＲＦ１８珈８０り工６
）と、対照としてｐＨＩＮ （バイオジエン社Ｇ３２１
２５０４７ ）で形質転換した酵母〔サン力ロマイセス
セレビジア（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅ
ｖｉｓｉａｅ）ＧＲＦ１８珈８０り工゛〕を試料とした
。
各菌株は、ＹＮＢ液体培地（前出）にて、３０℃、２日
間振盪培養した（０．０．２．。１．３）。培養液を遠
心分離にて菌体を集め、緩衝液〔５０１１１Ｍトリス−
塩ｅｌｌ （ｐＨ７，５＞ 、Ｉ ＩＭ ＥＤＴＡ、
１ｍＭ ＰＭＳＦ（フェニル−メチル−スルフォニル−
フルオライド）〕で洗浄後、菌体を等量の同緩衝液に懸
濁し、超音波処理（トミー社製２００Ｗ、９分間）を行
った。
間振盪培養した（０．０．２．。１．３）。培養液を遠
心分離にて菌体を集め、緩衝液〔５０１１１Ｍトリス−
塩ｅｌｌ （ｐＨ７，５＞ 、Ｉ ＩＭ ＥＤＴＡ、
１ｍＭ ＰＭＳＦ（フェニル−メチル−スルフォニル−
フルオライド）〕で洗浄後、菌体を等量の同緩衝液に懸
濁し、超音波処理（トミー社製２００Ｗ、９分間）を行
った。
この溶液を１０，０００ Ｘ ｇで２０分間遠心分離し
て上清を回収した。上清中のＨＢｓＡｇ活性をアンティ
ヘブセル（ミドリ十字社製ＲＰＩＩＡ試薬）を用いて測
定し、表２の結果を得た。
て上清を回収した。上清中のＨＢｓＡｇ活性をアンティ
ヘブセル（ミドリ十字社製ＲＰＩＩＡ試薬）を用いて測
定し、表２の結果を得た。
表２
この結果、本発明の組換えプラスミドは、従来のものに
比べて、約８倍のＨＢｓＡｇ産生能を有することが確認
された。なお、これらプラスミドのコピー数をリグビー
（Ｒ４ｇｂｙ）らのサザン ハイブリダイゼーション（
Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ） （
ジャーナル オブ モレキュラー バイオロジー、第１
１３巻、第２３７真、１９７７年（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏ
ｆ ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ、 １１３．２
３７．１９７７））に従って調べたが、プラスミドにお
いては、コピー数の変化は認められなかった。
比べて、約８倍のＨＢｓＡｇ産生能を有することが確認
された。なお、これらプラスミドのコピー数をリグビー
（Ｒ４ｇｂｙ）らのサザン ハイブリダイゼーション（
Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ） （
ジャーナル オブ モレキュラー バイオロジー、第１
１３巻、第２３７真、１９７７年（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏ
ｆ ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ、 １１３．２
３７．１９７７））に従って調べたが、プラスミドにお
いては、コピー数の変化は認められなかった。
参考例Ｉ
酵母り工０株の分離
形質転換の対象宿主の好適なものとして、酵母Ｃｉｒ
’株の分離を行った。
’株の分離を行った。
２１、プラスミド由来のＢ遺伝子およびＣ遺伝子を担持
するｐＪＩ］Ｂ ２１９（前出）のＳａｌ ｆ部位に、
トランスポーシン（Ｔｎ）９０３ Ｄ Ｎ Ａ断片（１
，８にｂ）を挿入したプラスミドｐＪＤＢ２１９−Ｔｎ
を作成し、酵母ＧＲＦ１８り工“株を形質転換した。な
お、酵母ＧＲＦ１８以コ株は、バイオジエン社より人手
した（ＧＢ２１２５０４７）。得られた形質転換株をＹ
ＰＤ液体培地（酵母エキス１％、ポリペプトン２％、ブ
ドウ糖２％）で３７℃、４日間振盪培養した。培養菌液
を超音波処理（トミー社製、２０Ｗ）して、菌が集合せ
ずに１個ずつ存在していることを顕微鏡にてｒａ認後、
ＹＰＤ寒天平板（ＹＰＤ液体培地＋寒天２％）に単コロ
ニーを形成する様にスブレンドし、３０℃、２日間培養
した。この平板をマスク−プレートとしてＧ４１８
［２−デオキシストレブタミン（２−ｄｅｏｘｙｓｔｒ
ｅｐｔａｍｉｎ）５００ Ｔ ／ｍｌ含有ＹＰＤ寒天平
板にレプリカしてＧ４１８ ａ受性株をひろった。この
ようにしてｐＪＤＢ２１９−Ｔｎプラスミドの脱落した
株２３０個を得た。得られた２３０個のｐＪＤＢ２１９
−Ｔｎ脱落株をカメロン（Ｃａｍｅｒｏｎ） らの方
法〔ヌクレイツク アシノズ リサーチ、第４巻。
するｐＪＩ］Ｂ ２１９（前出）のＳａｌ ｆ部位に、
トランスポーシン（Ｔｎ）９０３ Ｄ Ｎ Ａ断片（１
，８にｂ）を挿入したプラスミドｐＪＤＢ２１９−Ｔｎ
を作成し、酵母ＧＲＦ１８り工“株を形質転換した。な
お、酵母ＧＲＦ１８以コ株は、バイオジエン社より人手
した（ＧＢ２１２５０４７）。得られた形質転換株をＹ
ＰＤ液体培地（酵母エキス１％、ポリペプトン２％、ブ
ドウ糖２％）で３７℃、４日間振盪培養した。培養菌液
を超音波処理（トミー社製、２０Ｗ）して、菌が集合せ
ずに１個ずつ存在していることを顕微鏡にてｒａ認後、
ＹＰＤ寒天平板（ＹＰＤ液体培地＋寒天２％）に単コロ
ニーを形成する様にスブレンドし、３０℃、２日間培養
した。この平板をマスク−プレートとしてＧ４１８
［２−デオキシストレブタミン（２−ｄｅｏｘｙｓｔｒ
ｅｐｔａｍｉｎ）５００ Ｔ ／ｍｌ含有ＹＰＤ寒天平
板にレプリカしてＧ４１８ ａ受性株をひろった。この
ようにしてｐＪＤＢ２１９−Ｔｎプラスミドの脱落した
株２３０個を得た。得られた２３０個のｐＪＤＢ２１９
−Ｔｎ脱落株をカメロン（Ｃａｍｅｒｏｎ） らの方
法〔ヌクレイツク アシノズ リサーチ、第４巻。
第１４２９頁、 １９７７年（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１
ｄｓ Ｒｅ５ｅｒｃｈ＋ ４＋１４２９、１９７７）
）で２−プラスミドＤＮＡの有無を検討した。ＹＰＤ
寒天平板に植菌し、３０℃、１〜２昼夜培養した。寒天
平板に生育した菌体を白金耳でかきとった。コニカルチ
ューブ（１，５ｍ１）に、０．６ｍｉの緩衝液〔５０１
リン酸緩衝液（ｐｉｔ７．５）−１，２Ｍソルビトール
−２０ｍＭ ２−メルカプトエタノール−５００ｍｃ
ｇ／ａ＋］ ザイモリアーゼ（Ｚ４ｏ１ｙａｓｅ）
）を入れ、菌体を懸濁した。３０℃、９０分インキエベ
ートした後、Ｉ Ｍ ＥＤＴＡ （ｐＨ８，０） 、２
Ｍ ｔｒｉｓ、 Ｌ Ｏ％ＳＤＳの各溶液を各々３０
μ、ジエチルピロカーボネイトを２μ加え、混合後、６
５℃で４０分インキヱベートする。
ｄｓ Ｒｅ５ｅｒｃｈ＋ ４＋１４２９、１９７７）
）で２−プラスミドＤＮＡの有無を検討した。ＹＰＤ
寒天平板に植菌し、３０℃、１〜２昼夜培養した。寒天
平板に生育した菌体を白金耳でかきとった。コニカルチ
ューブ（１，５ｍ１）に、０．６ｍｉの緩衝液〔５０１
リン酸緩衝液（ｐｉｔ７．５）−１，２Ｍソルビトール
−２０ｍＭ ２−メルカプトエタノール−５００ｍｃ
ｇ／ａ＋］ ザイモリアーゼ（Ｚ４ｏ１ｙａｓｅ）
）を入れ、菌体を懸濁した。３０℃、９０分インキエベ
ートした後、Ｉ Ｍ ＥＤＴＡ （ｐＨ８，０） 、２
Ｍ ｔｒｉｓ、 Ｌ Ｏ％ＳＤＳの各溶液を各々３０
μ、ジエチルピロカーボネイトを２μ加え、混合後、６
５℃で４０分インキヱベートする。
次に氷上で１０分間放置し、５Ｍ酢酸カリウム１６０ｆ
ｉｌを加え混合し、氷上で６０分以上放置する。これを
卓上遠心ｉｎ＜エンペンドルフ５４１４）で５分遠心し
、上澄みを新しいコニカルチューブに移し、等量のエタ
ノールを加え、室温１０分放置後、１０分間遠心する。
ｉｌを加え混合し、氷上で６０分以上放置する。これを
卓上遠心ｉｎ＜エンペンドルフ５４１４）で５分遠心し
、上澄みを新しいコニカルチューブに移し、等量のエタ
ノールを加え、室温１０分放置後、１０分間遠心する。
得られた沈渣を乾燥し、４０ｔＪのＴＥ温溶液１０ｎ＋
Ｍ ｔｒｉｓ−Ｈ（Ｊ （ｐＨ７，５） −１１１１
Ｍ ＥＤＴＡ 〕にｔ容解し、ＲＮａ５ｅ Ａ （ツー
シントンハイオケミカル社製）を最終１０ ｍｃｇ／＋
＋＋１になるように加え、３７℃で３０分間インキエベ
ートし、ＤＮＡ試料とした。このＤＮＡ試料全量を１％
アガロースゲル電気泳動にかけ、２−プラスミドが存在
するか否かを調べた。２３０個のＧ４１８ ｉ受性株（
ｐＪＤＢ２１９−Ｔｎ脱落株）のうち、７０株が前述の
方法で２．、、ＤＮＡバンドを欠失していた。この７０
株のうち生育、性状等から１７株を選んで、前述した方
法とほぼ同様な方法で、ＹＰＤ液体培地１０り＋１にて
菌体を培養し、２−プラスミドＤＮＡを測定した。１％
アガロースゲル電気泳動にてｐＪＤＢ２１９−Ｔｎおよ
び２ ｐｇ Ｄ Ｎ Ａともに存在しないことを確認し
た。かくして酵母り工°株を調製した（微工研菌寄第７
９７０号）。
Ｍ ｔｒｉｓ−Ｈ（Ｊ （ｐＨ７，５） −１１１１
Ｍ ＥＤＴＡ 〕にｔ容解し、ＲＮａ５ｅ Ａ （ツー
シントンハイオケミカル社製）を最終１０ ｍｃｇ／＋
＋＋１になるように加え、３７℃で３０分間インキエベ
ートし、ＤＮＡ試料とした。このＤＮＡ試料全量を１％
アガロースゲル電気泳動にかけ、２−プラスミドが存在
するか否かを調べた。２３０個のＧ４１８ ｉ受性株（
ｐＪＤＢ２１９−Ｔｎ脱落株）のうち、７０株が前述の
方法で２．、、ＤＮＡバンドを欠失していた。この７０
株のうち生育、性状等から１７株を選んで、前述した方
法とほぼ同様な方法で、ＹＰＤ液体培地１０り＋１にて
菌体を培養し、２−プラスミドＤＮＡを測定した。１％
アガロースゲル電気泳動にてｐＪＤＢ２１９−Ｔｎおよ
び２ ｐｇ Ｄ Ｎ Ａともに存在しないことを確認し
た。かくして酵母り工°株を調製した（微工研菌寄第７
９７０号）。
更に、サザン ハイブリダイゼーシロン（Ｓｏｕｔｈ−
ｅｒｎ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ） （前出）によ
って確認したが、１７株すべては、ｐＪＤＢ２１９−Ｔ
ｎ及び２ 、Ａｌｌ Ｄ Ｎ Ａを脱落していた。尚、
確認のために使用したＤＮＡプローブは、ｐＪ［１Ｂ２
１９のＥｃｏＲＩ 、ＤＮＡ断片（４Ｋｂ）を二ツク
トランスレーション（ｎｉｃｋ ｔｒａｎｓ−１ａｌｉ
ｏｎ）法によってラヘルした。比活性は、１×１０８ｃ
、 ｐ、ｍ、 ／ Ｄ Ｎ Ａ ｐｇのものを使った。
ｅｒｎ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ） （前出）によ
って確認したが、１７株すべては、ｐＪＤＢ２１９−Ｔ
ｎ及び２ 、Ａｌｌ Ｄ Ｎ Ａを脱落していた。尚、
確認のために使用したＤＮＡプローブは、ｐＪ［１Ｂ２
１９のＥｃｏＲＩ 、ＤＮＡ断片（４Ｋｂ）を二ツク
トランスレーション（ｎｉｃｋ ｔｒａｎｓ−１ａｌｉ
ｏｎ）法によってラヘルした。比活性は、１×１０８ｃ
、 ｐ、ｍ、 ／ Ｄ Ｎ Ａ ｐｇのものを使った。
実施例
■ Ｂ遺伝子及びＣ遺伝子断片の調製
反応液は、１００ｍＭ ｔｒｉｓ−Ｈ（１！ （ｐＨ１
，５） 、７ｍＭＭｇＣ１、，５０ｍＭ ＮａＣｊ！、
７＋ＩＩＭ２−メルカプトエタノールを用い、３Ｐｇの
ｐＪＤＢ２１９ （前出）、ＥｃｏＲＩ５Ｕ（宝酒造社
製）を加え、３７℃で１時間反応を行い、完全消化した
。反応液は、１％アガロ−ススラフ゛ゲルを用し）、１
麦１對ン（１，（４０ｍごトリズマヘース［相］、２０
ｍＭ酢酸ナトリウム、Ｉ ｍＭ ＥＤＴＡ 、酢酸にて
ｐＨ，３とする）中７５Ｖ、４時間電気泳動にかけた。
，５） 、７ｍＭＭｇＣ１、，５０ｍＭ ＮａＣｊ！、
７＋ＩＩＭ２−メルカプトエタノールを用い、３Ｐｇの
ｐＪＤＢ２１９ （前出）、ＥｃｏＲＩ５Ｕ（宝酒造社
製）を加え、３７℃で１時間反応を行い、完全消化した
。反応液は、１％アガロ−ススラフ゛ゲルを用し）、１
麦１對ン（１，（４０ｍごトリズマヘース［相］、２０
ｍＭ酢酸ナトリウム、Ｉ ｍＭ ＥＤＴＡ 、酢酸にて
ｐＨ，３とする）中７５Ｖ、４時間電気泳動にかけた。
アガロースゲルは、エチジウムブロマイド溶液（０，５
ｗａｇ／麟ｌ）にて染色後、ＵＶ存在下でゲル中の目的
ＤＮＡ断片（４Ｋｂ）を切り出し、電気泳動法にてゲル
からＤＮＡを単離した〔ロパートら、メソッズ イン
エンザイモロジー、第６８巻、第１７６頁、 １９７９
年（Ｒｏｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ、、 Ｍｅｔｈｏｄｓｉ
ｎ ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ６Ｂ １７６、１９７９）
。
ｗａｇ／麟ｌ）にて染色後、ＵＶ存在下でゲル中の目的
ＤＮＡ断片（４Ｋｂ）を切り出し、電気泳動法にてゲル
からＤＮＡを単離した〔ロパートら、メソッズ イン
エンザイモロジー、第６８巻、第１７６頁、 １９７９
年（Ｒｏｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ、、 Ｍｅｔｈｏｄｓｉ
ｎ ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ６Ｂ １７６、１９７９）
。
■ 生理活性物質をコードする遺伝子を担持するプラス
ミドの調製 プラスミドｐＨＩＮ（８，７Ｋｂ） （前出）の消化を
、ＥｃｏＲｌで行った。反応液は■と同じものを用い、
ｐＨｌＮＤＮＡ３５ｇ、 ＥｃｏＲＩ Ｉ Ｕ （宝酒
造社製）を加え、３７℃で１５分間反応させた。反応液
を０．８％低融点アガロース（ｌｏｗ ｍｅｌｔｉｎｇ
ｐｏｉｎｔ ａｇａｒｏｓｅ ）（ＢＲＬｉｎｃ、
）を用いて■に示した如く電気泳動した。
ミドの調製 プラスミドｐＨＩＮ（８，７Ｋｂ） （前出）の消化を
、ＥｃｏＲｌで行った。反応液は■と同じものを用い、
ｐＨｌＮＤＮＡ３５ｇ、 ＥｃｏＲＩ Ｉ Ｕ （宝酒
造社製）を加え、３７℃で１５分間反応させた。反応液
を０．８％低融点アガロース（ｌｏｗ ｍｅｌｔｉｎｇ
ｐｏｉｎｔ ａｇａｒｏｓｅ ）（ＢＲＬｉｎｃ、
）を用いて■に示した如く電気泳動した。
ＥｃｏＲＩによって１ケ所のみ切断されているｐＨＩＮ
（８，７Ｋｂ） ＤＮＡバンドを切り出し、倍量のＴＥ
緩衝液を加えて６５℃にて溶解し、フェノール処理を行
って、倍量のエタノールにて、ｐＨｒＮＤＮＡを沈澱さ
せた。得られたＤＮＡは緩衝液５０ｍＭ ｔｒｉｓ−）
ＩＣｎ 、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ （ｐＨ１８，０）中
アルカリホスファターゼ１．Ｕ（ベーリンガーマンハイ
ム社製）を加え、３７℃、３００分間反応せ、５゛末端
リン酸を除去し、フェノール処理をして、エタノールに
てＤＮＡを沈澱させた。
（８，７Ｋｂ） ＤＮＡバンドを切り出し、倍量のＴＥ
緩衝液を加えて６５℃にて溶解し、フェノール処理を行
って、倍量のエタノールにて、ｐＨｒＮＤＮＡを沈澱さ
せた。得られたＤＮＡは緩衝液５０ｍＭ ｔｒｉｓ−）
ＩＣｎ 、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ （ｐＨ１８，０）中
アルカリホスファターゼ１．Ｕ（ベーリンガーマンハイ
ム社製）を加え、３７℃、３００分間反応せ、５゛末端
リン酸を除去し、フェノール処理をして、エタノールに
てＤＮＡを沈澱させた。
■ 遺伝子組換え
■で得られた２つのＤＮＡ断片を緩衝液（６６）１Ｍ
ｔｒｉｓ −ＨＣＪ （ｐＨ７，６）、 ６．６ｍＭ
ＭｇＣ１ｇ 、 １０ｔａＭ ＤＴＴ、 １ ｍ
Ｍ ＡＴＰ）中においてＴ４ＤＮＡリガーゼ５単位（宝
酒造製）を加え、１６℃−夜反応させた。反応産物で大
腸菌を形質転換し、次にこの大腸菌を２ Ｏｒ／ｍｌア
ンピシリンを含むし寒天（１％ポリペプトン、０．５％
酵母エキス、１％ＮａＣｊ！、１．５％寒天）上にまき
、３７℃−夜培養した。生じたアンピシリン耐性コロニ
ー中、Ｂ遺伝子、Ｃ遺伝子を組み込んだｐｌ（ＩＮプラ
スミドをもつ大腸菌は、アルカリ抽出法〔バーンポイン
、エイチ。
ｔｒｉｓ −ＨＣＪ （ｐＨ７，６）、 ６．６ｍＭ
ＭｇＣ１ｇ 、 １０ｔａＭ ＤＴＴ、 １ ｍ
Ｍ ＡＴＰ）中においてＴ４ＤＮＡリガーゼ５単位（宝
酒造製）を加え、１６℃−夜反応させた。反応産物で大
腸菌を形質転換し、次にこの大腸菌を２ Ｏｒ／ｍｌア
ンピシリンを含むし寒天（１％ポリペプトン、０．５％
酵母エキス、１％ＮａＣｊ！、１．５％寒天）上にまき
、３７℃−夜培養した。生じたアンピシリン耐性コロニ
ー中、Ｂ遺伝子、Ｃ遺伝子を組み込んだｐｌ（ＩＮプラ
スミドをもつ大腸菌は、アルカリ抽出法〔バーンポイン
、エイチ。
シー、およびドーリ−、ジェイ、ヌクレイノクアシソズ
リサーチ、第７巻、第１５１３頁、１９７９年（Ｂｉ
ｒｎｂｏｉｍ、 Ｈ，Ｃ，ａｎｄ Ｄｏｌｙ、 Ｊ
、 Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ、
７１５１３．１９７９））によってプラスミドを単
離し、制限酵素による分解パターンを調べた。
リサーチ、第７巻、第１５１３頁、１９７９年（Ｂｉ
ｒｎｂｏｉｍ、 Ｈ，Ｃ，ａｎｄ Ｄｏｌｙ、 Ｊ
、 Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ、
７１５１３．１９７９））によってプラスミドを単
離し、制限酵素による分解パターンを調べた。
かくして、Ｂ遺伝子及びＣ遺伝子を担持したＨＢｓＡｇ
ＢｓＡｇ発現プラスミドルＧ１７（約１６．７にｂ）を
構築した。
ＢｓＡｇ発現プラスミドルＧ１７（約１６．７にｂ）を
構築した。
このプラスミドは、１１）Ｉ ＩｌｌのＩｅｕ ２のＥ
ｃｏＲ１部位にはｐＪＤＢ ２１９の４Ｋｂ断片は入っ
ておらず、さらに、この断片は、同方向に２個連結して
、ｐＨＩＮに挿入されていた。
ｃｏＲ１部位にはｐＪＤＢ ２１９の４Ｋｂ断片は入っ
ておらず、さらに、この断片は、同方向に２個連結して
、ｐＨＩＮに挿入されていた。
■形質転換
参考例１で得られたＧＲＦ］８ ｐｈｏ８０り工０株を
、■によって得られたプラスミドを用いて、ヒンネン（
旧ｎｎｅｎ）等の方法（前出）に従って、ロイシンを含
まないＹＮＢ寒天平板を用いて形質転換した。
、■によって得られたプラスミドを用いて、ヒンネン（
旧ｎｎｅｎ）等の方法（前出）に従って、ロイシンを含
まないＹＮＢ寒天平板を用いて形質転換した。
かくして、ｐＧＢ １９７／ＧＲＦ １８ ｐｈｏ８０
Ｃ４ｒ ’株を得た。
Ｃ４ｒ ’株を得た。
■ｔｌ Ｂ ｓ Ａ ｇの産生
１１のＹＮＢ液体培地に、ＩＩＧＢ １９７／ＧＲＦ
１８ ｐｈ。
１８ ｐｈ。
８０り工°を接種し、３０℃、２日間振盪培養した。
この培養液を実験例と同様に処理して、ｌ（ＢｓＡｇ含
有上清を得た。
有上清を得た。
第１図は、ｐＪＤＢ ２１９ （１２，４Ｋｂ）とｐ）
ＩＩＮ （８，７Ｋｂ）の連結のフローシートである。 図において、ＥはＥｃｏＲＩを、Ｘは 珈１、Ｐｓｔは
Ｐｓｔ Ｉ ＳＲａｍは加旧、ＨはＨｉｎｄｌｌｌの
各々制限酵素部位を示し、ＴＲはインバーテンド リピ
ート （Ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｒｅ−ｐｅａ ｔ）、 ｌ
ｅｕ ２は２−イソプロビルーマレートデハイドロゲナ
ーゼ遺伝子、Ｂはベーカー遺伝子、Ｃはチャーシー遺伝
子、但噌５はリプレッシブルアシンド ホスファターゼ
遺伝子、Ｐはプロモーター、ｌｌＢｓＡｇは肝炎ウィル
ス表面抗原遺伝子、ｏｒｉは複製開始点、Ａｐはアンピ
シリン耐性遺伝子、Ｔはターミネータ−を示す。
ＩＩＮ （８，７Ｋｂ）の連結のフローシートである。 図において、ＥはＥｃｏＲＩを、Ｘは 珈１、Ｐｓｔは
Ｐｓｔ Ｉ ＳＲａｍは加旧、ＨはＨｉｎｄｌｌｌの
各々制限酵素部位を示し、ＴＲはインバーテンド リピ
ート （Ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｒｅ−ｐｅａ ｔ）、 ｌ
ｅｕ ２は２−イソプロビルーマレートデハイドロゲナ
ーゼ遺伝子、Ｂはベーカー遺伝子、Ｃはチャーシー遺伝
子、但噌５はリプレッシブルアシンド ホスファターゼ
遺伝子、Ｐはプロモーター、ｌｌＢｓＡｇは肝炎ウィル
ス表面抗原遺伝子、ｏｒｉは複製開始点、Ａｐはアンピ
シリン耐性遺伝子、Ｔはターミネータ−を示す。
Claims (10)
- （１）酵母の２−プラスミドに存在するベーカー（Ｂａ
ｋｅｒ）遺伝子とチャーリー（Ｃｈａｒｌｉｅ）遺伝子
を含む断片の少なくとも２個を、生理学的活性物質をコ
ードする遺伝子を担持するプラスミドに連結することを
特徴とする組換えプラスミド。 - （２）当該断片の２個を同方向に連結した特許請求の範
囲第（１）項記載の組換えプラスミド。 - （３）断片が、ＥｃｏＲ I によって切断された特許請
求の範囲第（１）又は（２）項記載の組換えプラスミド
。 - （４）生理学的活性物質が、ＨＢｓＡｇである特許請求
の範囲第（１）、（２）又は（３）項記載の組換えプラ
スミド。 - （５）酵母の２μｍプラスミドに存在するベーカー遺伝
子とチャーリー遺伝子を含む断片の少なくとも２個を、
生理学的活性物質をコードする遺伝子を担持するプラス
ミドに連結した組換えプラスミドによる形質転換株。 - （６）当該断片の２個を同方向に連結した特許請求の範
囲第（５）項記載の形質転換株。 - （７）断片が、ＥｃｏＲ I によって切断された特許請
求の範囲第（５）又は（６）項記載の形質転換株。 - （８）生理学的活性物質が、ＨＢｓＡｇである特許請求
の範囲第（５）、（６）又は（７）項記載の形質転換株
。 - （９）形質転換株が酵母である特許請求の範囲第（５）
、（６）、（７）又は（８）項記載の形質転換株。 - （１０）組換えプラスミドによって酵母の２−プラスミ
ド脱落株（￥Ｃｉｒ￥株）を形質転換することからなる
特許請求の範囲第（５）、（６）、（７）、（８）又は
（９）項記載の形質転換株。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59-232683 | 1984-11-05 | ||
| JP23268384 | 1984-11-05 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61268184A true JPS61268184A (ja) | 1986-11-27 |
Family
ID=16943153
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60246917A Pending JPS61268184A (ja) | 1984-11-05 | 1985-11-01 | 組換えプラスミド及び当該プラスミドによる形質転換株 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4757021A (ja) |
| EP (1) | EP0180958B1 (ja) |
| JP (1) | JPS61268184A (ja) |
| KR (1) | KR860004148A (ja) |
| CA (1) | CA1264687A (ja) |
| DE (1) | DE3577215D1 (ja) |
| ES (1) | ES8800350A1 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3781217T2 (de) * | 1986-07-22 | 1992-12-17 | Ciba Geigy Ag | Herstellung von verwandten polypeptiden des bindungsfaktors. |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU560472B2 (en) * | 1981-08-25 | 1987-04-09 | Celltech Limited | Yeast expression vectors |
| EP0103201B1 (en) * | 1982-08-16 | 1990-05-30 | Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute | Shuttle vector |
-
1985
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