CN113699128B - 一种发酵生产尼克酰胺磷酸核糖转移酶的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种发酵生产尼克酰胺磷酸核糖转移酶的方法，属于生物工程技术领域。包括以下步骤：(1)将NAMPT生产菌株接种至培养基中进行发酵培养，所述发酵培养条件为：发酵温度32℃‑34℃、溶氧20‑40％、发酵培养时间5‑8h；(2)将发酵体系的温度降至21℃‑23℃，加入IPTG进行诱导培养20‑30h，即生产得到NAMPT。采用本发明的方法可以实现NAMPT的大规模、工业化生产。

Description

一种发酵生产尼克酰胺磷酸核糖转移酶的方法

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种发酵生产尼克酰胺磷酸核糖转移酶的方法。

背景技术

尼克酰胺磷酸核糖转移酶(nicotinamide phosphoribosyl transferase，NAMPT)是NAD补救合成通路的限速酶，通过合成NAD参与细胞物质和能量代谢、蛋白质修饰、DNA修复等重要过程。对于NAMPT的前期研究主要集中于衰老、免疫应答、炎症反应、糖尿病、氧化应激、代谢方面。近期研究发现NAMPT在恶性肿瘤中表达升高，推测其可能是潜在的治疗靶点之一。NAMPT成为抗肿瘤治疗策略研究热点之一，其生物学功能被不断发掘利用。

因此，NAMPT具有广泛的应用价值，需求量不断增加。但目前还很少见有通过发酵法大规模生产NAMPT的报道。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种发酵生产尼克酰胺磷酸核糖转移酶的方法。采用本发明的方法可以实现NAMPT的大规模、工业化生产。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种发酵生产尼克酰胺磷酸核糖转移酶的方法，包括以下步骤：

(1)将NAMPT生产菌株接种至发酵培养基中进行培养，初始发酵温度为32-34℃，搅拌转速为200-400rpm，发酵过程中控制溶氧为20-40％，pH值为6.8-7.2；发酵培养至发酵液稀释100倍后的OD₆₀₀值为0.18-0.20；

(2)将发酵体系的温度降至21℃-23℃，加入IPTG，同时流加补料，调控补料的流加速度使发酵体系的溶氧控制在20-40％，诱导培养20-30h，即生产得到含有NAMPT酶的发酵液。

优选的，步骤(1)中，所述NAMPT生产菌株由如下方法构建而成：

将SEQ ID NO.1所示的编码NAMPT的核苷酸片段连入质粒pLLP-ompA，获得第一重组表达载体；将SEQ ID NO.2所示的编码PARP1的核苷酸片段连入质粒pET-42a(+)，获得第二重组表达载体；再将获得的第一重组表达载体和第二重组表达载体导入大肠杆菌，即构建得到NAMPT生产菌株。

本发明在构建NAMPT生产菌株时，将表达NAMPT的重组表达载体和表达PARP1的重组表达载体同时导入到大肠杆菌中，通过少量PARP1的表达，可以显著提高NAMPT的表达量。

优选的，步骤(1)中，所述发酵培养基的组成为：甘油10g/L，酵母浸膏8g/L，氯化钠3g/L，硫酸铵2.5g/L，三水磷酸氢二钾4g/L，柠檬酸铁铵0.3g/L，柠檬酸2.1g/L，蛋白胨12g/L，七水硫酸镁0.5g/L。

优选的，步骤(2)中，加入IPTG，使IPTG在发酵体系中的终浓度为0.5mmol/L。

优选的，步骤(2)中，所述补料由甘油和水按体积比1:1配制而成。

优选的，步骤(2)中，补料的加入量为发酵培养基重量的10-20％。

本发明的有益效果：

(1)本发明对原核表达NAMPT的生产菌株进行了优化，将表达NAMPT的重组表达载体和表达PARP1的重组表达载体同时导入到大肠杆菌中，通过少量PARP1的表达，可以显著提高NAMPT的表达量。

(2)本发明对NAMPT的发酵用培养基、发酵培养条件以及诱导培养条件进行了优化，实现了NAMPT的规模化、工业化生产，并进一步提高了NAMPT的表达量。

附图说明

图1：实施例1构建的表达NAMPT酶的第一重组表达载体的酶切验证结果；图中，M1、M2为DNA Marker，泳道1和泳道3为BamHⅠ/NhelⅠ双酶切pLLP-ompA-NAMPT，泳道2为pLLP-ompA-NAMPT。

图2：实施例1构建的表达PARP1蛋白的第二重组表达载体的酶切验证结果；图中，M为DNA Marker，泳道1为pET-42a(+)-PARP1，泳道2和泳道3为SacⅡ/SphⅠ双酶切pET-42a(+)-PARP1。

图3：实施例2中所使用的149L发酵罐的照片。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

术语说明：

通风比：一分钟内通过单位体积培养液的无菌空气体积；例如，装有18m³培养液的发酵罐，若每分钟通入无菌空气18L，则称通风比为1:1。

如前所述，NAMPT具有广泛的应用价值，需求量不断增加。但目前还很少见有通过发酵法大规模生产NAMPT的报道。

有鉴于此，本发明开发了一种发酵生产尼克酰胺磷酸核糖转移酶的方法。本发明首先对原核表达NAMPT的生产菌株进行了优化，将表达NAMPT的重组表达载体pLLP-ompA-NAMPT和表达PARP1的重组表达载体pET-42a(+)-PARP1同时导入到大肠杆菌中，通过少量PARP1的表达，可以显著提高NAMPT的表达量。质粒pLLP-ompA和pET-42a(+)均为诱导表达型质粒，在不加诱导剂时不会表达NAMPT酶和PARP1蛋白，这样就减少了菌种上来就表达PARP1蛋白而导致直接自溶的风险；而且，选择质粒pET-42a(+)一方面能使PARP1蛋白的表达量适中，既能有效促进NAMPT酶的表达，又能避免PARP1蛋白表达过多导致菌体死亡；另一方面，质粒pET-42a(+)能使两个基因的诱导剂相同，也减少了操作步骤。质粒pLLP-ompA采用E.coli强启动lpp和OmpA分泌信号肽，同时在C端添加了6个His，本发明利用质粒pLLP-ompA来表达NAMPT酶，所表达的NAMPT酶加上原来NAMPT带的总共有8个His尾，通过His尾和镍离子亲和的原理，可以有效的将NAMPT酶和PARP1蛋白分离。

本发明进一步还对NAMPT的发酵用培养基、发酵培养条件以及诱导培养条件进行了优化。对于发酵培养基，本发明发现碳源的选择是NAMPT酶生产的关键，以甘油作为唯一碳源，NAMPT酶的生产效果最佳，将碳源换成其他种类，例如“葡萄糖”，则基本上不产生NAMPT酶。

对于发酵培养条件，本发明研究发现：在发酵培养过程中，加入诱导剂IPTG之前发酵液OD₆₀₀值的控制非常关键，如果OD₆₀₀值太低，会导致菌体量不足；但如果OD太高，后期基本在16h左右就不产NAMPT酶了；经综合考察，将加入IPTG之前发酵液OD₆₀₀值控制为“稀释100倍后的OD₆₀₀值为0.18-0.20”，NAMP酶的产量最优。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。

本发明实施例和对比例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，如无特殊说明，均可通过商业渠道购买得到。其中：

培养基中所使用的酵母浸膏为酵母浸膏LM800，蛋白胨为蛋白胨FP330，均为市售产品。发酵生产中所使用的消泡剂为聚醚g·p·e消泡剂(泡敌)。

实施例1：NAMPT生产菌株的构建

将质粒pLLP-ompA用BamHⅠ和NhelⅠ进行双酶切，然后通过DNA连接酶将SEQ IDNO.1所示的编码NAMPT酶的核苷酸片段连接到pLLP-ompA载体上，构建得到表达NAMPT酶的第一重组表达载体(pLLP-ompA-NAMPT)。

对构建的第一重组表达载体(pLLP-ompA-NAMPT)进行双酶切验证，将pLLP-ompA-NAMPT用BamHⅠ和NhelⅠ进行双酶切，若产生1.5kb和7.5kb两条带，则证明重组表达载体构建成功。构建的第一重组表达载体双酶切验证结果见图1。结果表明：SEQ ID NO.5所示的核苷酸片段已经成功插入到pLLP-ompA载体中。

将质粒pET-42a(+)用SacⅡ和SphⅠ双酶切，然后通过DNA连接酶将SEQ ID NO.2所示的编码PARP1蛋白的核苷酸片段连接到pET-42a(+)载体上，构建得到表达PARP1蛋白的第二重组表达载体(pET-42a(+)-PARP1)。

对构建的第二重组表达载体(pET-42a(+)-PARP1)进行双酶切验证，将pET-42a(+)-PARP1用SacⅡ和SphⅠ进行双酶切，若产生3.0kb和4.9kb两条带，则证明重组表达载体构建成功。构建的第二重组表达载体双酶切验证结果见图2。结果表明：SEQ ID NO.2所示的核苷酸片段已经成功插入到pET-42a(+)载体中。

将第一重组表达载体和第二重组表达载体通过钙离子诱导导入到同一大肠杆菌B21(DE3)中，获得转化子。

将转化子在LB平板上涂布，等长出单菌落之后用影印法分别在KAN平板(含100μg/ml KAN的LB平板)和AMP平板(含100μg/ml AMP的LB平板)上接种，待两个抗性平板上都长出单菌落之后，通过对比位置，在LB平板中挑出能同时在KAN和AMP中生长的单菌落，将其作为阳性转化子。

将阳性转化子接种含有100μg/ml KAN和100μg/ml AMP的LB培养基中，33℃培养至OD₆₀₀＝0.6，加入IPTG(使IPTG的终浓度为0.5mmol/L)，20℃诱导培养12h。诱导培养结束后，超声破菌，加入非离子型去垢剂Triton X-100去除包涵体，离心，分离出上清液，调节pH至7.2-7.4，通过SDS-PAGE和Western blot鉴定NAMPT酶。

选取能够表达NAMPT酶的阳性转化子，传代5代，最终选择能够表达NAMPT酶、且能稳定遗传的阳性转化子，将其作为NAMPT酶的生产菌株。

实施例2：NAMPT酶的发酵生产

(1)菌种活化：将低温保存的实施例1制备的NAMPT酶的生产菌株于含有100μg/mlKAN和100μg/ml AMP的LB平板上划线，33℃培养24h；挑取生产菌株单菌落再次划线转接于含有100μg/ml KAN和100μg/ml AMP的LB平板上，33℃培养24h，备用。

LB平板的培养基配方：蛋白胨10.0g，酵母粉5.0g，NaCl 10.0g，琼脂15.0g，水1.0L。

(2)一级种子液制备：用接种环刮取2环步骤(1)活化后的生产菌株菌苔，接种于LB液体培养基中，33℃，200r/min，摇瓶培养12h得到一级种子液。

LB液体培养基配方：蛋白胨10.0g，酵母粉5.0g，NaCl 10.0g，水1.0L。

(3)二级种子液制备：将步骤(2)制得的一级种子液按照二级种子培养基2.0％(体积百分比)的比例接种到种子罐中发酵培养；转速150rpm，温度33℃，罐压0.05～0.06MPa，培养12h，作为二级种子液。

二级种子培养基的组成为：甘油10g/L，酵母浸膏8g/L，氯化钠3g/L，硫酸铵2.5g/L，三水磷酸氢二钾4g/L，柠檬酸铁铵0.3g/L，柠檬酸2.1g/L，蛋白胨12g/L，七水硫酸镁0.5g/L。

(4)发酵培养：将步骤(3)所得二级种子液按照4％(体积比)接种到含有发酵培养基的发酵罐中进行发酵培养。

发酵培养基的组成为：甘油10g/L，酵母浸膏8g/L，氯化钠3g/L，硫酸铵2.5g/L，三水磷酸氢二钾4g/L，柠檬酸铁铵0.3g/L，柠檬酸2.1g/L，蛋白胨12g/L，七水硫酸镁0.5g/L。

发酵罐的体积为149L(图3)，罐压：0.05Mpa，通风比1:1。

初始发酵温度为33℃，搅拌转速为200-400rpm，发酵过程中控制溶氧(DO)为20-40％，pH值为6.8-7.2；发酵培养至发酵液稀释100倍后的OD₆₀₀值为0.18-0.20。将发酵体系的温度降至22℃，加入IPTG，使IPTG的终浓度为0.5mmol/L；流加补料(所述补料由甘油和水按体积比1:1配制而成，121℃灭菌20min)，补料的加入量为发酵培养基重量的10-20％，调控补料的流加速度使发酵体系的溶氧(DO)控制在20-40％，诱导培养24h，即生产得到含有NAMPT酶的发酵液。

溶氧(DO)采用溶氧电极测定，溶氧以溶氧电极在空气中的溶氧水平设定为100％，以饱和亚硫酸钠溶液中的溶氧为0。OD600和pH值采用取样测定，每2h取样一次。

注意：在发酵培养过程中，如果发现出现大量泡沫，加入10mL消泡剂，每次发酵过程总量不超过50mL。

对比例1：

将质粒pLLP-ompA用BamHⅠ和NhelⅠ进行双酶切，然后通过DNA连接酶将SEQ IDNO.1所示的编码NAMPT酶的核苷酸片段连接到pLLP-ompA载体上，构建得到表达NAMPT酶的重组表达载体(pLLP-ompA-NAMPT)；将构建的重组表达载体导入到大肠杆菌B21(DE3)，获得转化子；通过含有100μg/ml AMP的LB平板对转化子进行筛选，挑取生长旺盛的菌株作为阳性转化子。

将阳性转化子接种含有100μg/ml AMP的LB培养基中，33℃培养至OD₆₀₀＝0.6，加入IPTG(使IPTG的终浓度为0.5mmol/L)，20℃诱导培养12h。诱导培养结束后，超声破菌，加入非离子型去垢剂Triton X-100去除包涵体，离心，分离出上清液，调节pH至7.2-7.4，通过SDS-PAGE和Western blot鉴定NAMPT酶。

选取能够表达NAMPT酶的阳性转化子，传代5代，最终选择能够表达NAMPT酶、且能稳定遗传的阳性转化子，将其作为NAMPT酶的生产菌。

对比例2：

将对比例1的生产菌按实施例2的方法进行菌种活化、一级种子液制备、二级种子液制备。基于成本考虑，发酵培养采用的是5L发酵罐，发酵培养条件同实施例2，生产得到发酵液。

对比例3：

将实施例2中的发酵培养基的组成调整为：

葡萄糖10g/L，酵母浸膏8g/L，氯化钠3g/L，硫酸铵2.5g/L，三水磷酸氢二钾4g/L，柠檬酸铁铵0.3g/L，柠檬酸2.1g/L，蛋白胨12g/L，七水硫酸镁0.5g/L。

将实施例2中补料调整为40g/L的葡萄糖溶液。

另外，基于成本考虑，发酵培养采用的是5L发酵罐；其余条件同实施例2，生产得到发酵液。

对比例4：

菌种活化、一级种子液制备、二级种子液制备同实施例2。

将二级种子液按照4％(体积比)接种到含有发酵培养基的发酵罐中进行发酵培养。

发酵培养基的组成为：甘油10g/L，酵母浸膏8g/L，氯化钠3g/L，硫酸铵2.5g/L，三水磷酸氢二钾4g/L，柠檬酸铁铵0.3g/L，柠檬酸2.1g/L，蛋白胨12g/L，七水硫酸镁0.5g/L。

发酵罐的体积为5L，罐压：0.05Mpa，通风比1:1。

初始发酵温度为33℃，搅拌转速为200-400rpm，发酵过程中控制溶氧(DO)为20-40％，pH值为6.8-7.2；发酵培养至发酵液稀释100倍后的OD₆₀₀值为0.4-0.5。将发酵体系的温度降至22℃，加入IPTG，使IPTG的终浓度为0.5mmol/L；流加补料(所述补料由甘油和水按体积比1:1配制而成，121℃灭菌20min)，补料的加入量为发酵培养基重量的10-20％，调控补料的流加速度使发酵体系的溶氧(DO)控制在20-40％，诱导培养24h，生产得到发酵液。

试验例：

分别从实施例2、对比例2-对比例4生产得到的发酵液中取等量的发酵液样品，超声破菌，加入非离子型去垢剂Triton X-100去除包涵体，离心，分离出上清液，调节pH至7.2-7.4。采用NAMPT酶检测试剂盒(Human Nicotinamide Phosphoribosyltransferase(NAMPT)ELISA Kit，购自abbexa公司)对上清液中的NAMPT酶进行检测。结果见表1。

表1：

发酵液	NAMPT酶表达量
		实施例2	15g/L
对比例2	6g/L
		对比例3	＜3g/L
对比例4	5g/L

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 新泰市佳禾生物科技有限公司,汕头市佳禾生物科技有限公司

<120> 一种发酵生产尼克酰胺磷酸核糖转移酶的方法

<130> 2021

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1485

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ggatccatga acccggctgc tgaagctgaa ttcaacatcc tgctggctac cgactcttac 60

aaagttaccc actacaaaca gtacccgccg aacacctcta aagtttactc ttacttcgaa 120

tgccgtgaaa aaaaaaccga aaactctaaa ctgcgtaaag ttaaatacga agaaaccgtt 180

ttctacggtc tgcagtacat cctgaacaaa tacctgaaag gtaaagttgt taccaaagaa 240

aaaatccagg aagctaaaga cgtttacaaa gaacacttcc aggacgacgt tttcaacgaa 300

aaaggttgga actacatcct ggaaaaatac gacggtcacc tgccgatcga aatcaaagct 360

gttccggaag gtttcgttat cccgcgtggt aacgttctgt tcaccgttga aaacaccgac 420

ccggaatgct actggctgac caactggatc gaaaccatcc tggttcagtc ttggtacccg 480

atcaccgttg ctaccaactc tcgtgaacag aaaaaaatcc tggctaaata cctgctggaa 540

acctctggta acctggacgg tctggaatac aaactgcacg acttcggtta ccgtggtgtt 600

tcttctcagg aaaccgctgg tatcggtgct tctgctcacc tggttaactt caaaggtacc 660

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ggttactctg ttccggctgc tgaacactct accatcaccg cttggggtaa agaccacgaa 780

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gactcttacg acatctacaa cgcttgcgaa aaaatctggg gtgaagacct gcgtcacctg 900

atcgtttctc gttctaccca ggctccgctg atcatccgtc cggactctgg taacccgctg 960

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<210> 2

<211> 3055

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

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Claims (4)

1.一种发酵生产尼克酰胺磷酸核糖转移酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）将NAMPT生产菌株接种至发酵培养基中进行培养，初始发酵温度为32-34℃，搅拌转速为200-400rpm，发酵过程中控制溶氧为20-40%，pH值为6.8-7.2；发酵培养至发酵液稀释100倍后的OD₆₀₀值为0.18-0.20；

（2）将发酵体系的温度降至21℃-23℃，加入IPTG，同时流加补料，调控补料的流加速度使发酵体系的溶氧控制在20-40%，诱导培养20-30h，即生产得到含有NAMPT酶的发酵液；

步骤（1）中，所述NAMPT生产菌株由如下方法构建而成：

将SEQ ID NO.1所示的编码NAMPT的核苷酸片段连入质粒pLLP-ompA，获得第一重组表达载体；将SEQ ID NO.2所示的编码PARP1的核苷酸片段连入质粒pET-42a（+），获得第二重组表达载体；再将获得的第一重组表达载体和第二重组表达载体导入大肠杆菌，即构建得到NAMPT生产菌株；

步骤（1）中，所述发酵培养基的组成为：甘油 10g/L，酵母浸膏 8g/L，氯化钠 3g/L，硫酸铵 2.5g/L，三水磷酸氢二钾 4g/L，柠檬酸铁铵 0.3 g/L，柠檬酸2.1 g/L，蛋白胨12 g/L，七水硫酸镁0.5 g/L。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，加入IPTG，使IPTG在发酵体系中的终浓度为0.5mmol/L。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述补料由甘油和水按体积比1:1配制而成。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，补料的加入量为发酵培养基重量的10-20%。

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