CN114196712B - 一种固定化酶法生产l-鸟氨酸的方法 - Google Patents

一种固定化酶法生产l-鸟氨酸的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种固定化酶法生产L‑鸟氨酸的方法，包括以下步骤：(1)将人重组精氨酸酶I生产菌的种子液接种至发酵培养基中进行发酵培养，降温向体系中加入IPTG，诱导培养20‑28h；(2)将诱导培养后的培养液进行破菌处理并过陶瓷膜，收集滤液；滤液进行挂柱；(3)将含有L‑精氨酸的底物溶液流经挂柱后的镍柱进行生物转化，收集流出的转化液，即生产得到L‑鸟氨酸。本发明首先构建了一种新的人重组精氨酸酶I生产菌，并对发酵工艺进行了优化，提高了人重组精氨酸酶I的产量和酶活；然后将发酵生产的人重组精氨酸酶I采用镍柱挂柱对酶进行固定化处理；再流加底物液进行转化处理，从而实现了固定化酶法生产L‑鸟氨酸，提高了转化率。

Description

一种固定化酶法生产L-鸟氨酸的方法
技术领域
本发明涉及氨基酸生产技术领域，具体涉及一种固定化酶法生产L-鸟氨酸的方法。
背景技术
L-鸟氨酸(L-ornithine)是生物体内普遍存在的氨基酸之一。1877年杰弗在喂养安息香酸的鸟类的尿液水解产物中发现了鸟氨酸，由此得名。在动物体内，鸟氨酸主要参与尿素循环，L-鸟氨酸作为产生尿素的中间产物，参与了瓜氨酸、精氨酸等氨基酸的新陈代谢，尤其是在鸟氨酸循环中起到重要作用，能够在很大程度上促进体内氨的排出以起到解毒作用，所以对于人体的肝脏细胞来说，L-鸟氨酸是非常重要的。在医学上，L-鸟氨酸也具有广泛的应用，在氨基酸保健品家族中具有重要的地位和广阔的市场前景，直接参与了抗菌性药物的生物或化学合成。
现有制备L-鸟氨酸的方法主要有提取法、化学法、微生物发酵法和酶法。其中，提取法制备L-鸟氨酸的成本太高，且提供工艺繁琐，现已很少报道；化学法合成鸟氨酸，原料来源广泛且成本低，但该法经过多步化学反应合成，收率偏低，且合成出的鸟氨酸为DL型混合物，产物的手性拆分亦给该工艺增加了难度和成本；微生物发酵法制备L-鸟氨酸是近年来主要采用的制备工艺之一，用发酵法生产鸟氨酸原料成本低廉，但产量不高；酶法生产鸟氨酸是利用动植物或微生物体内的精氨酸酶作催化剂，水解精氨酸生成鸟氨酸和尿酸。酶法生产L-鸟氨酸专一性强，反应条件温和，同时底物转化率高，产品较纯，有利于后续分离，但精氨酸酶的来源不易，底物精氨酸的成本也较高。
对于酶法生产L-鸟氨酸，张鹏等利用粪肠球菌体内的精氨酸酶转化生产L-鸟氨酸，最高产量达112g/L，转化率达99.5％。但是，其生产过程是利用游离细胞转化底物L-精氨酸，转化液中会含有少量菌体蛋白和其他杂质，不利于产物的分离纯化。因此，游离细胞转化不利于工业化连续生产，酶的利用率也不高。针对于此，专利CN 1661026A、专利CN102286563A提出了固定化酶制备L-鸟氨酸的方法，但是，上述现有技术固定精氨酸酶采用的是固定化载体包埋或者利用自制的纤维素微球载体吸附，其必然会减少精氨酸酶与底物的接触面积，从而降低了酶的催化效率。
发明内容
针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种固定化酶法生产L-鸟氨酸的方法。本发明首先构建了一种新的人重组精氨酸酶I生产菌，并对发酵工艺进行了优化，显著提高了发酵生产人重组精氨酸酶I的产量和酶活；然后将发酵生产的人重组精氨酸酶I采用镍柱挂柱对酶进行固定化处理；再流加底物液进行转化处理，从而实现了固定化酶法生产L-鸟氨酸，提高了转化率。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种固定化酶法生产L-鸟氨酸的方法，包括以下步骤：
(1)将人重组精氨酸酶I生产菌的种子液接种至发酵培养基中进行发酵培养，发酵培养的温度为32-34℃，pH为6.8-7.2，溶氧(DO)为20-40％，搅拌转速180-220rpm；发酵培养至发酵液稀释100倍后的OD600值为0.50-0.60时，降温至22℃，向体系中加入IPTG，使IPTG在体系中的终浓度为0.2mmol/L，诱导培养20-28h；
培养过程中监测体系的甘油含量，当体系的甘油含量≤1.0g/L时开始添加补料，通过流加补料使体系中的甘油含量保持在0.5-1g/L；
(2)将步骤(1)诱导培养后的培养液的pH值调至7.1-7.3，进行破菌处理；将细胞破碎后的混合匀浆过陶瓷膜，收集滤液；将滤液稀释至滤液中人重组精氨酸酶I的浓度为8-12g/L，采用镍柱亲和层析，将稀释后的滤液进行挂柱；
(3)将含有L-精氨酸的底物溶液流经步骤(2)挂柱后的镍柱进行生物转化，收集流出的转化液，即生产得到L-鸟氨酸。
优选的，步骤(1)中，所述人重组精氨酸酶I生产菌由如下方法构建而成：
将pHT304质粒用NdeⅠ和HincⅡ双酶切处理，将SEQ ID NO.1所示的Pg3启动子序列整合到双酶切处理后的pHT304质粒上，得到质粒pHT304-Pg3，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；再用SphⅠ和SacⅠ对质粒pHT304-Pg3进行双酶切处理，将arg1基因整合到双酶切处理后的质粒pHT304-Pg3上，获得重组表达载体(pHT304-Pg3-arg1)，其核苷酸序列如SEQ IDNO.8所示；
将获得的重组表达载体导入到枯草芽孢杆菌中，构建得到人重组精氨酸酶I生产菌。
更优选的，对arg1基因进行了优化改造处理，首先将人重组精氨酸酶I的第158位的天冬氨酸突变为谷氨酸，基于突变后的人重组精氨酸酶I的氨基酸序列重新获得了编码核苷酸序列，并进行了密码子优化；然后在优化后的核苷酸序列中增加了一段信号肽序列，并插入了凝血酶酶切位点和10个His尾巴。最终优化改造处理后的arg1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
优选的，步骤(1)中，发酵培养基的组成为：蛋白胨12g/L、甘油10g/L、酵母膏8g/L、氯化钠3g/L、硫酸铵2.5g/L、三水磷酸氢二钾4g/L、柠檬酸铁铵0.3g/L、柠檬酸2.1g/L、七水硫酸镁0.5g/L、氨苄青霉素100ppm。
优选的，步骤(1)中，所述补料中含有甘油400g/L、蛋白胨30g/L、酵母膏100g/L。
优选的，步骤(2)中，镍柱亲和层析的条件为：以50mM的PBS作为结合缓冲液，将滤液挂柱。
优选的，步骤(3)中，所述底物溶液中含有：L-精氨酸50g/L，磷酸吡哆醛1mg/L，二甲基亚砜(DMSO)0.1mg/L。
优选的，步骤(3)中，底物溶液的流速为3m3/h。
优选的，步骤(3)中，生物转化的条件为：转化温度25℃-45℃，pH7.2-7.3。
更优选的，生物转化的温度为37℃，pH7.25。
本发明的有益效果：
(1)对于固定化酶法生产L-鸟氨酸而言，精氨酸酶的来源及酶活尤为关键，本发明首先采用分子动力学模拟的方法对人重组精氨酸酶I进行了结构优化，将人重组精氨酸酶I的第158位的天冬氨酸突变为谷氨酸。突变后的人重组精氨酸酶I的酶活与野生型人重组精氨酸酶I相比，有了显著的提高。针对突变处理后的人重组精氨酸酶I，本发明进一步构建了相应的生产菌株，选择pHT304质粒作为基础质粒，并对其进行了改造，将Pg3启动子整合到pHT304质粒，Pg3启动子只有在加入IPTG后才开始表达，因此，将启动子进行替换后，菌株前期生长快，进入稳定期所需时间短，进而提高了人重组精氨酸酶I的表达量。
(2)对于精氨酸酶的固定化，本发明对精氨酸酶的编码核苷酸序列进行了优化处理，增加了组氨酸尾巴，配合镍柱进行酶的固定化处理。采用本发明的固定化酶的处理方式，能够使精氨酸酶与底物精氨酸充分接触，提高了酶的催化效率。
(3)本发明对底物溶液的组成进行了优化，通过添加磷酸吡哆醛和二甲基亚砜，提高了精氨酸酶的转化效率。
附图说明
图1：质粒pHT304-Pg3的结构示意图。
图2：人精氨酸酶I的三维结构示意图。
图3：野生型精氨酸酶I(W-Arginase1)与突变型精氨酸酶I(R-Arginase1)的蛋白主链的均方根偏差(RMSD)曲线。
图4：不同浓度DMSO存在时对突变前后精氨酸酶I催化反应初始速率的影响。
图5：本发明构建的重组表达载体(pHT304-Pg3-arg1)的结构示意图。
图6：本发明构建的重组表达载体(pHT304-Pg3-arg1)的电泳验证。
图7：本发明构建的人重组精氨酸酶I生产菌的菌落PCR验证。
图8：本发明构建的人重组精氨酸酶I生产菌的western blot验证；图中，右侧泳道为Marker。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。
本发明实施例和对比例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。其中：
本实施例和对比例中所使用的枯草芽孢杆菌为BS168枯草芽孢杆菌，购自上海北诺生物科技有限公司。
需要说明的是，本发明人重组精氨酸酶I生产菌的构建方法，均采用的是现有的基因工程技术的手段，是本领域技术人员能够重复实施的方法，故无需对其进行生物保藏。
实施例1：人重组精氨酸酶I生产菌的构建
1、质粒改造：
将pHT304质粒(购自优宝生物)用NdeⅠ和HincⅡ双酶切处理，然后将Pg3启动子(序列如SEQ ID NO.1所示)整合到双酶切处理后的pHT304质粒上，构建得到质粒pHT304-Pg3(图1)。
构建得到质粒pHT304-Pg3为单一氨苄青霉素抗性，有乳糖操纵子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
对pHT304质粒进行改造的目的是：一是减少载体的长度，提高其在枯草芽孢杆菌中的表达稳定性；二是将Pg3启动子整合到pHT304质粒中，Pg3启动子只有在加入IPTG后才开始表达，因此，整合Pg3启动子后，菌株前期生长快，进入稳定期所需时间短，进而缩短了人重组精氨酸酶I的表达时间，并且提高了人重组精氨酸酶I的表达量；三是降低诱导表达后对枯草芽孢杆菌菌体生长的影响。
2、arg1基因的优化改造：
从现有数据库中获得人源精氨酸酶I的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；其编码基因arg1的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
为提高人重组精氨酸酶I的活性，采用分子动力学模拟的方法对人重组精氨酸酶I进行了结构优化，将人重组精氨酸酶I的第158位的天冬氨酸突变为谷氨酸，突变后的人重组精氨酸酶I的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
人精氨酸酶I的三维结构示意图如图2所示，第158位天冬氨酸(D)是向外突起的，突变为谷氨酸(E)后，不向外突起，且P和V之间的夹角也缩小，所以整体的结构也更加紧凑。
经过50ns的分子动力学模拟，野生型精氨酸酶I(W-Arginase1)与突变型精氨酸酶I(R-Arginase1)的蛋白主链的均方根偏差(RMSD)曲线如图3所示。结果表明，二者在15ns后就接近平衡状态，25ns后基本平衡，RMSD值在0.13-0.15之间，说明点突变对精氨酸酶I的整体结构几乎没有影响。
通过测定不同浓度DMSO存在时对突变前后精氨酸酶I催化反应初始速率的影响，结果如图4所示，当DMSO浓度为30％时，突变型精氨酸酶I的活力上升10.2倍，野生型精氨酸酶I的活力上升4.7倍。
上述结果表明：将人重组精氨酸酶I的第158位的天冬氨酸突变为谷氨酸，能够显著提高精氨酸酶I的催化活性。
为使arg1基因能够更适用于枯草芽孢杆菌表达系统，进一步对编码突变后的人重组精氨酸酶I的arg1基因的核苷酸序列进行了密码子优化；为提高人重组精氨酸酶I在枯草芽孢杆菌中的分泌表达，在密码子优化后的arg1基因的核苷酸序列的基础上，增加了一段信号肽，具体如下：
ATGAAAAGATTTTTGTCCACTTTGTTGATTGGAATGATGCTGGTTACATGTGCCTCGCCGGCATTTGCC。(SEQ ID NO.6)
为方便所表达的人重组精氨酸酶I的分离纯化，进一步的在上述核苷酸序列中增加了凝血酶的酶切位点和10His序列。
最终优化改造后的arg1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
3、重组表达载体的构建：
将改造后的质粒pHT304-Pg3用SphⅠ和SacⅠ双酶切双酶切处理，再将最终优化改造后的arg1基因(SEQ ID NO.7所示)整合到双酶切处理后的质粒pHT304-Pg3上，获得重组表达载体(pHT304-Pg3-arg1)。重组表达载体的结构示意图如图5所示。
将构建的重组表达载体进行电泳验证，结果如图6所示。结果表明：arg1基因(SEQID NO.7所示)已成功整合到质粒pHT304-Pg3上。经测序验证，所构建的重组表达载体(pHT304-Pg3-arg1)的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
4、人重组精氨酸酶I生产菌的构建
将构建的重组表达载体(pHT304-Pg3-arg1)导入到到BS168枯草芽孢杆菌中，获得转化子。将转化子在AMP平板(含100μg/ml AMP的LB平板)上接种，挑出能够在AMP平板中生长的单菌落，将其作为阳性转化子。
对阳性转化子进行菌落PCR验证和western blot验证，菌落PCR验证结果如图7所示，western blot验证结果如图8所示。结果表明：实施例3构建的重组表达载体已成功导入到受体菌中。
由此证明：本实施例已成功构建得到稳定的人重组精氨酸酶I生产菌。
实施例2：人重组精氨酸酶I的发酵生产
(1)菌种活化：
将实施例1构建的人重组精氨酸酶I生产菌划线接种到含有100μg/ml氨苄青霉素的LB平板中，33℃、培养24h。
(2)一级种培养：
从平板划取1接种环菌体接到一级种子培养基(添加50ppm氨苄青霉素的LB液体培养基)中，在33℃、pH7.0、转速200rpm的条件下培养18h。
(3)二级种培养：
以1％(体积分数)接种量，将一级种子液接种于二级种子培养基(添加50ppm氨苄青霉素的LB液体培养基)中，33℃、溶氧(DO)20-40％，培养至稀释100倍的OD600nm值0.5。
(4)发酵培养：
将L-鸟氨酸生产菌的二级种子液接种至含有发酵培养基的发酵罐(18L)中进行发酵培养，二级种子液的接种量为发酵培养基重量的4％，发酵培养的温度为33℃，pH为7.0，溶氧(DO)为20-40％，搅拌转速200rpm；发酵培养至发酵液稀释100倍后的OD600值为0.60时，降温至22℃，向体系中加入IPTG，使IPTG在体系中的终浓度为0.2mmol/L，诱导培养26h；
发酵培养基的组成为：蛋白胨12g/L、甘油10g/L、酵母膏8g/L、氯化钠3g/L、硫酸铵2.5g/L、三水磷酸氢二钾4g/L、柠檬酸铁铵0.3g/L、柠檬酸2.1g/L、七水硫酸镁0.5g/L、氨苄青霉素100ppm。
培养过程中监测体系的甘油含量，当体系的甘油含量≤1.0g/L时开始添加补料，通过流加补料使体系中的甘油含量保持在0.5-1g/L。所述补料中含有甘油400g/L、蛋白胨30g/L、酵母膏100g/L。
上述发酵生产过程中，溶氧(DO)采用溶氧电极测定，溶氧以溶氧电极在空气中的溶氧水平设定为100％，以饱和亚硫酸钠溶液中的溶氧为0。OD600和pH值采用取样测定。
实施例3：固定化酶法生产L-鸟氨酸
(1)精氨酸酶固定化处理：
将实施例2中诱导培养后的发酵液的pH值调至7.2，过匀质机破碎。将细胞破碎后的混合匀浆过陶瓷膜，收集滤液；陶瓷膜的孔径为100nm，压力0.5MPa。
将滤液稀释至精氨酸酶浓度为10g/L，加入PBS，使PBS的浓度为50mM，过镍柱，流速3m3/h。
镍柱亲和层析条件：以50mM的PBS作为结合缓冲液，将滤液挂柱。
(2)L-精氨酸转化：
将底物溶液(含有L-精氨酸50g/L，磷酸吡哆醛1mg/L，二甲基亚砜0.1mg/L)以3m3/h的流速流经步骤(1)挂柱后的镍柱进行生物转化，生物转化的温度为37℃，pH7.25，收集流出的转化液，即生产得到L-鸟氨酸。
对比例1：
将实施例3中的底物溶液调整为L-精氨酸50g/L，磷酸吡哆醛1mg/L；其余同实施例2。
对比例2：
将实施例3中的底物溶液调整为L-精氨酸50g/L，二甲基亚砜0.1mg/L；其余同实施例2。
试验例：
对实施例3、对比例1和对比例2的L-精氨酸转化率进行计算。
L-精氨酸转化率＝(转化了的精氨酸/所有投入的精氨酸)×100％。
结果见表1。
表1：
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 新泰市佳禾生物科技有限公司
<120> 一种固定化酶法生产L-鸟氨酸的方法
<130> 2021
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 366
<212> DNA
<213> Pg3启动子
<400> 1
atatgagcac tctttccact atccctacag tgttatggct tgaacaatca cgaaacaata 60
attggtacgt acgatctttc agccgactca aacatcaaat cttacaaatg tagtctttga 120
aagtattaca tatgtaagat ttaaatgcaa ccgttttttc ggaaggaaat gatgacctcg 180
tttccaccgg aattagcttg gtaccagcta ttgtaacata atcggtacgg gggtgaaaaa 240
gctaacggaa aagggagcgg aaaagaatga tgtaagcgtg aaaaattttt tatcttatca 300
cttgacattg gaagggagat tctttataat aagaatgtgg aattgtgagc ggataacaat 360
ttcaac 366
<210> 2
<211> 3461
<212> DNA
<213> 质粒pHT304- Pg3
<400> 2
ccatcctcca aagttggaga gtgagtttta tgtcgcaaat attaatgttt ctggtgaacc 60
ttatcaaatt ttcgttgatt taatagaaac atagcggtaa aattagcagt aacttaatag 120
aacggaaatg aaaaaagcca ctctcatatg agcactcttt ccactatccc tacagtgtta 180
tggcttgaac aatcacgaaa caataattgg tacgtacgat ctttcagccg actcaaacat 240
caaatcttac aaatgtagtc tttgaaagta ttacatatgt aagatttaaa tgcaaccgtt 300
ttttcggaag gaaatgatga cctcgtttcc accggaatta gcttggtacc agctattgta 360
acataatcgg tacgggggtg aaaaagctaa cggaaaaggg agcggaaaag aatgatgtaa 420
gcgtgaaaaa ttttttatct tatcacttga cattggaagg gagattcttt ataataagaa 480
tgtggaattg tgagcggata acaatttcaa ctcaactgtt tactaaaaat cagtttcatc 540
aagcaatgaa acacgccaaa gtaaacaatt taagtaccat tacttatgag caagtattgt 600
ctatttttaa tagttatcta ttatttaacg ggaggaaata attctatgag tcgctttttt 660
aaatttggaa agttacacgt tactaaaggg aatggagata aattattaga tatactactg 720
acagcttcca agaaggtaaa gaggtcccta gcgcctacgg ggaatttgta tcgggattga 780
aaaaggaaga gtatgagtat tcaacatttc cgtgtcgccc ttattccctt ttttgcggca 840
ttttgccttc ctgtttttgc tcacccagaa acgctggtga aagtaaaaga tgctgaagat 900
cagttgggtg cacgagtggg ttacatcgaa ctggatctca acagcggtaa gatccttgag 960
agttttcgcc ccgaagaacg ttttccaatg atgagcactt ttaaagttct gctatgtggc 1020
gcggtattat cccgtattga cgccgggcaa gagcaactcg gtcgccgcat acactattct 1080
cagaatgact tggttgagta ctcaccagtc acagaaaagc atcttacgga tggcatgaca 1140
gtaagagaat tatgcagtgc tgccataacc atgagtgata acactgcggc caacttactt 1200
ctgacaacga tcggaggacc gaaggagcta accgcttttt tgcacaacat gggggatcat 1260
gtaactcgcc ttgatcgttg ggaaccggag ctgaatgaag ccataccaaa cgacgagcgt 1320
gacaccacga tgcctgtagc aatggcaaca acgttgcgca aactattaac tggcgaacta 1380
cttactctag cttcccggca acaattaata gactggatgg aggcggataa agttgcagga 1440
ccacttctgc gctcggccct tccggctggc tggtttattg ctgataaatc tggagccggt 1500
gagcgtgggt ctcgcggtat cattgcagca ctggggccag atggtaagcc ctcccgtatc 1560
gtagttatct acacgacggg gagtcaggca actatggatg aacgaaatag acagatcgct 1620
gagataggtg cctcactgat taagcattgg taactgtcag accaagttta ctcatatata 1680
ctttagattg atttaaaact tcatttttaa tttaaaagga tctaggtgaa gatccttttt 1740
gataatctca tgaccaaaat cccttaacgt gagttttcgt tccactgagc gtcagacccc 1800
gtagaaaaga tcaaaggatc ttcttgagat cctttttttc tgcgcgtaat ctgctgcttg 1860
caaacaaaaa aaccaccgct accagcggtg gtttgtttgc cggatcaaga gctaccaact 1920
ctttttccga aggtaactgg cttcagcaga gcgcagatac caaatactgt ccttctagtg 1980
tagccgtagt taggccacca cttcaagaac tctgtagcac cgcctacata cctcgctctg 2040
ctaatcctgt taccagtggc tgctgccagt ggcgataagt cgtgtcttac cgggttggac 2100
tcaagacgat agttaccgga taaggcgcag cggtcgggct gaacgggggg ttcgtgcaca 2160
cagcccagct tggagcgaac gacctacacc gaactgagat acctacagcg tgagctatga 2220
gaaagcgcca cgcttcccga agggagaaag gcggacaggt atccggtaag cggcagggtc 2280
ggaacaggag agcgcacgag ggagcttcca gggggaaacg cctggtatct ttatagtcct 2340
gtcgggtttc gccacctctg acttgagcgt cgatttttgt gatgctcgtc aggggggcgg 2400
agcctatgga aaaacgccag caacgcggcc tttttacggt tcctggcctt ttgctggcct 2460
tttgctcaca tgttctttcc tgcgttatcc cctgattctg tggataaccg tattaccgcc 2520
tttgagtgag ctgataccgc tcgccgcagc cgaacgaccg agcgcagcga gtcagtgagc 2580
gaggaagcgg aagagcgccc aatacgcaaa ccgcctctcc ccgcgcgttg gccgattcat 2640
taatgcagct ggcacgacag gtttcccgac tggaaagcgg gcagtgagcg caacgcaatt 2700
aatgtgagtt agctcactca ttaggcaccc caggctttac actttatgct tccggctcgt 2760
atgttgtgtg gaattgtgag cggataacaa tttcacacag gaaacagcta tgaccatgat 2820
tacgccaagc ttgcatgcct gcaggtcgac tctagaggat ccccgggtac cgagctcgaa 2880
ttcactggcc gtcgttttac aacgtcgtga ctgggaaaac cctggcgtta cccaacttaa 2940
tcgccttgca gcacatcccc ctttcgccag ctggcgtaat agcgaagagg cccgcaccga 3000
tcgcccttcc caacagttgc gcagcctgaa tggcgaatgg cgcctgatgc ggtattttct 3060
ccttacgcat ctgtgcggta tttcacaccg catatggtgc actctcagta caatctgctc 3120
tgatgccgca tagttaagcc agccccgaca cccgccaaca cccgctgacg cgccctgacg 3180
ggcttgtctg ctcccggcat ccgcttacag acaagctgtg accgtctccg ggagctgcat 3240
gtgtcagagg ttttcaccgt catcaccgaa acgcgcgaga cgaaagggcc tcgtgatacg 3300
cctattttta taggttaatg tcatgataat aatggtttct tagacgtcag gtggcacttt 3360
tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta 3420
tccgctcatg agacaataac cctgataaat gcttcaataa t 3461
<210> 3
<211> 322
<212> PRT
<213> 人源精氨酸酶I
<400> 3
Met Ser Ala Lys Ser Arg Thr Ile Gly Ile Ile Gly Ala Pro Phe Ser
1 5 10 15
Lys Gly Gln Pro Arg Gly Gly Val Glu Glu Gly Pro Thr Val Leu Arg
20 25 30
Lys Ala Gly Leu Leu Glu Lys Leu Lys Glu Gln Glu Cys Asp Val Lys
35 40 45
Asp Tyr Gly Asp Leu Pro Phe Ala Asp Ile Pro Asn Asp Ser Pro Phe
50 55 60
Gln Ile Val Lys Asn Pro Arg Ser Val Gly Lys Ala Ser Glu Gln Leu
65 70 75 80
Ala Gly Lys Val Ala Glu Val Lys Lys Asn Gly Arg Ile Ser Leu Val
85 90 95
Leu Gly Gly Asp His Ser Leu Ala Ile Gly Ser Ile Ser Gly His Ala
100 105 110
Arg Val His Pro Asp Leu Gly Val Ile Trp Val Asp Ala His Thr Asp
115 120 125
Ile Asn Thr Pro Leu Thr Thr Thr Ser Gly Asn Leu His Gly Gln Pro
130 135 140
Val Ser Phe Leu Leu Lys Glu Leu Lys Gly Lys Ile Pro Asp Val Pro
145 150 155 160
Gly Phe Ser Trp Val Thr Pro Cys Ile Ser Ala Lys Asp Ile Val Tyr
165 170 175
Ile Gly Leu Arg Asp Val Asp Pro Gly Glu His Tyr Ile Leu Lys Thr
180 185 190
Leu Gly Ile Lys Tyr Phe Ser Met Thr Glu Val Asp Arg Leu Gly Ile
195 200 205
Gly Lys Val Met Glu Glu Thr Leu Ser Tyr Leu Leu Gly Arg Lys Lys
210 215 220
Arg Pro Ile His Leu Ser Phe Asp Val Asp Gly Leu Asp Pro Ser Phe
225 230 235 240
Thr Pro Ala Thr Gly Thr Pro Val Val Gly Gly Leu Thr Tyr Arg Glu
245 250 255
Gly Leu Tyr Ile Thr Glu Glu Ile Tyr Lys Thr Gly Leu Leu Ser Gly
260 265 270
Leu Asp Ile Met Glu Val Asn Pro Ser Leu Gly Lys Thr Pro Glu Glu
275 280 285
Val Thr Arg Thr Val Asn Thr Ala Val Ala Ile Thr Leu Ala Cys Phe
290 295 300
Gly Leu Ala Arg Glu Gly Asn His Lys Pro Ile Asp Tyr Leu Asn Pro
305 310 315 320
Pro Lys
<210> 4
<211> 969
<212> DNA
<213> 人源精氨酸酶I
<400> 4
atgagcgcca agtccagaac catagggatt attggagctc ctttctcaaa gggacagcca 60
cgaggagggg tggaagaagg ccctacagta ttgagaaagg ctggtctgct tgagaaactt 120
aaagaacaag agtgtgatgt gaaggattat ggggacctgc cctttgctga catccctaat 180
gacagtccct ttcaaattgt gaagaatcca aggtctgtgg gaaaagcaag cgagcagctg 240
gctggcaagg tggcagaagt caagaagaac ggaagaatca gcctggtgct gggcggagac 300
cacagtttgg caattggaag catctctggc catgccaggg tccaccctga tcttggagtc 360
atctgggtgg atgctcacac tgatatcaac actccactga caaccacaag tggaaacttg 420
catggacaac ctgtatcttt cctcctgaag gaactaaaag gaaagattcc cgatgtgcca 480
ggattctcct gggtgactcc ctgtatatct gccaaggata ttgtgtatat tggcttgaga 540
gacgtggacc ctggggaaca ctacattttg aaaactctag gcattaaata cttttcaatg 600
actgaagtgg acagactagg aattggcaag gtgatggaag aaacactcag ctatctacta 660
ggaagaaaga aaaggccaat tcatctaagt tttgatgttg acggactgga cccatctttc 720
acaccagcta ctggcacacc agtcgtggga ggtctgacat acagagaagg tctctacatc 780
acagaagaaa tctacaaaac agggctactc tcaggattag atataatgga agtgaaccca 840
tccctgggga agacaccaga agaagtaact cgaacagtga acacagcagt tgcaataacc 900
ttggcttgtt tcggacttgc tcgggagggt aatcacaagc ctattgacta ccttaaccca 960
cctaagtaa 969
<210> 5
<211> 322
<212> PRT
<213> 人重组精氨酸酶I
<400> 5
Met Ser Ala Lys Ser Arg Thr Ile Gly Ile Ile Gly Ala Pro Phe Ser
1 5 10 15
Lys Gly Gln Pro Arg Gly Gly Val Glu Glu Gly Pro Thr Val Leu Arg
20 25 30
Lys Ala Gly Leu Leu Glu Lys Leu Lys Glu Gln Glu Cys Asp Val Lys
35 40 45
Asp Tyr Gly Asp Leu Pro Phe Ala Asp Ile Pro Asn Asp Ser Pro Phe
50 55 60
Gln Ile Val Lys Asn Pro Arg Ser Val Gly Lys Ala Ser Glu Gln Leu
65 70 75 80
Ala Gly Lys Val Ala Glu Val Lys Lys Asn Gly Arg Ile Ser Leu Val
85 90 95
Leu Gly Gly Asp His Ser Leu Ala Ile Gly Ser Ile Ser Gly His Ala
100 105 110
Arg Val His Pro Asp Leu Gly Val Ile Trp Val Asp Ala His Thr Asp
115 120 125
Ile Asn Thr Pro Leu Thr Thr Thr Ser Gly Asn Leu His Gly Gln Pro
130 135 140
Val Ser Phe Leu Leu Lys Glu Leu Lys Gly Lys Ile Pro Glu Val Pro
145 150 155 160
Gly Phe Ser Trp Val Thr Pro Cys Ile Ser Ala Lys Asp Ile Val Tyr
165 170 175
Ile Gly Leu Arg Asp Val Asp Pro Gly Glu His Tyr Ile Leu Lys Thr
180 185 190
Leu Gly Ile Lys Tyr Phe Ser Met Thr Glu Val Asp Arg Leu Gly Ile
195 200 205
Gly Lys Val Met Glu Glu Thr Leu Ser Tyr Leu Leu Gly Arg Lys Lys
210 215 220
Arg Pro Ile His Leu Ser Phe Asp Val Asp Gly Leu Asp Pro Ser Phe
225 230 235 240
Thr Pro Ala Thr Gly Thr Pro Val Val Gly Gly Leu Thr Tyr Arg Glu
245 250 255
Gly Leu Tyr Ile Thr Glu Glu Ile Tyr Lys Thr Gly Leu Leu Ser Gly
260 265 270
Leu Asp Ile Met Glu Val Asn Pro Ser Leu Gly Lys Thr Pro Glu Glu
275 280 285
Val Thr Arg Thr Val Asn Thr Ala Val Ala Ile Thr Leu Ala Cys Phe
290 295 300
Gly Leu Ala Arg Glu Gly Asn His Lys Pro Ile Asp Tyr Leu Asn Pro
305 310 315 320
Pro Lys
<210> 6
<211> 69
<212> DNA
<213> 信号肽
<400> 6
atgaaaagat ttttgtccac tttgttgatt ggaatgatgc tggttacatg tgcctcgccg 60
gcatttgcc 69
<210> 7
<211> 1101
<212> DNA
<213> 优化改造后的arg1基因
<400> 7
gcatatgaaa agatttttgt ccactttgtt gattggaatg atgctggtta catgtgcctc 60
gccggcattt gccggccgcg gcatgtctgc taaatctcgt acaatcggca tcatcggcgc 120
tcctttctct aaaggccaac ctcgtggcgg cgttgaagaa ggccctacag ttcttcgtaa 180
agctggcctt cttgaaaaac ttaaagaaca agaatgcgat gttaaagatt acggcgatct 240
tcctttcgct gatatcccta acgattctcc tttccaaatc gttaaaaacc ctcgttctgt 300
tggcaaagct tctgaacaac ttgctggcaa agttgctgaa gttaaaaaaa acggccgtat 360
ctctcttgtt cttggcggcg atcattctct tgctatcggc tctatctctg gccatgctcg 420
tgttcatcct gatcttggcg ttatctgggt tgatgctcat acagatatca acacacctct 480
tacaacaaca tctggcaacc ttcatggcca acctgtttct ttccttctta aagaacttaa 540
aggcaaagga cctgaagttc ctggcttctc ttgggttaca ccttgcatct ctgctaaaga 600
tatcgtttac atcggccttc gtgatgttga tcctggcgaa cattacatcc ttaaaacact 660
tggcatcaaa tacttctcta tgacagaagt tgatcgtctt ggcatcggca aagttatgga 720
agaaacactt tcttaccttc ttggccgtaa aaaacgtcct atccatcttt ctttcgatgt 780
tgatggcctt gatccttctt tcacacctgc tacaggcaca cctgttgttg gcggccttac 840
ataccgtgaa ggcctttaca tcacagaaga aatctacaaa acaggccttc tttctggcct 900
tgatatcatg gaagttaacc cttctcttgg caaaacacct gaagaagtta cacgtacagt 960
taacacagct gttgctatca cacttgcttg cttcggcctt gctcgtgaag gcaaccataa 1020
acctatcgat taccttaacc ctcctaaagg ccgcggccat catcatcatc atcatcatca 1080
tcatcattaa taataagtac c 1101
<210> 8
<211> 4525
<212> DNA
<213> 重组表达载体(pHT304- Pg3- arg1)
<400> 8
ccatcctcca aagttggaga gtgagtttta tgtcgcaaat attaatgttt ctggtgaacc 60
ttatcaaatt ttcgttgatt taatagaaac atagcggtaa aattagcagt aacttaatag 120
aacggaaatg aaaaaagcca ctctcatatg agcactcttt ccactatccc tacagtgtta 180
tggcttgaac aatcacgaaa caataattgg tacgtacgat ctttcagccg actcaaacat 240
caaatcttac aaatgtagtc tttgaaagta ttacatatgt aagatttaaa tgcaaccgtt 300
ttttcggaag gaaatgatga cctcgtttcc accggaatta gcttggtacc agctattgta 360
acataatcgg tacgggggtg aaaaagctaa cggaaaaggg agcggaaaag aatgatgtaa 420
gcgtgaaaaa ttttttatct tatcacttga cattggaagg gagattcttt ataataagaa 480
tgtggaattg tgagcggata acaatttcaa ctcaactgtt tactaaaaat cagtttcatc 540
aagcaatgaa acacgccaaa gtaaacaatt taagtaccat tacttatgag caagtattgt 600
ctatttttaa tagttatcta ttatttaacg ggaggaaata attctatgag tcgctttttt 660
aaatttggaa agttacacgt tactaaaggg aatggagata aattattaga tatactactg 720
acagcttcca agaaggtaaa gaggtcccta gcgcctacgg ggaatttgta tcgggattga 780
aaaaggaaga gtatgagtat tcaacatttc cgtgtcgccc ttattccctt ttttgcggca 840
ttttgccttc ctgtttttgc tcacccagaa acgctggtga aagtaaaaga tgctgaagat 900
cagttgggtg cacgagtggg ttacatcgaa ctggatctca acagcggtaa gatccttgag 960
agttttcgcc ccgaagaacg ttttccaatg atgagcactt ttaaagttct gctatgtggc 1020
gcggtattat cccgtattga cgccgggcaa gagcaactcg gtcgccgcat acactattct 1080
cagaatgact tggttgagta ctcaccagtc acagaaaagc atcttacgga tggcatgaca 1140
gtaagagaat tatgcagtgc tgccataacc atgagtgata acactgcggc caacttactt 1200
ctgacaacga tcggaggacc gaaggagcta accgcttttt tgcacaacat gggggatcat 1260
gtaactcgcc ttgatcgttg ggaaccggag ctgaatgaag ccataccaaa cgacgagcgt 1320
gacaccacga tgcctgtagc aatggcaaca acgttgcgca aactattaac tggcgaacta 1380
cttactctag cttcccggca acaattaata gactggatgg aggcggataa agttgcagga 1440
ccacttctgc gctcggccct tccggctggc tggtttattg ctgataaatc tggagccggt 1500
gagcgtgggt ctcgcggtat cattgcagca ctggggccag atggtaagcc ctcccgtatc 1560
gtagttatct acacgacggg gagtcaggca actatggatg aacgaaatag acagatcgct 1620
gagataggtg cctcactgat taagcattgg taactgtcag accaagttta ctcatatata 1680
ctttagattg atttaaaact tcatttttaa tttaaaagga tctaggtgaa gatccttttt 1740
gataatctca tgaccaaaat cccttaacgt gagttttcgt tccactgagc gtcagacccc 1800
gtagaaaaga tcaaaggatc ttcttgagat cctttttttc tgcgcgtaat ctgctgcttg 1860
caaacaaaaa aaccaccgct accagcggtg gtttgtttgc cggatcaaga gctaccaact 1920
ctttttccga aggtaactgg cttcagcaga gcgcagatac caaatactgt ccttctagtg 1980
tagccgtagt taggccacca cttcaagaac tctgtagcac cgcctacata cctcgctctg 2040
ctaatcctgt taccagtggc tgctgccagt ggcgataagt cgtgtcttac cgggttggac 2100
tcaagacgat agttaccgga taaggcgcag cggtcgggct gaacgggggg ttcgtgcaca 2160
cagcccagct tggagcgaac gacctacacc gaactgagat acctacagcg tgagctatga 2220
gaaagcgcca cgcttcccga agggagaaag gcggacaggt atccggtaag cggcagggtc 2280
ggaacaggag agcgcacgag ggagcttcca gggggaaacg cctggtatct ttatagtcct 2340
gtcgggtttc gccacctctg acttgagcgt cgatttttgt gatgctcgtc aggggggcgg 2400
agcctatgga aaaacgccag caacgcggcc tttttacggt tcctggcctt ttgctggcct 2460
tttgctcaca tgttctttcc tgcgttatcc cctgattctg tggataaccg tattaccgcc 2520
tttgagtgag ctgataccgc tcgccgcagc cgaacgaccg agcgcagcga gtcagtgagc 2580
gaggaagcgg aagagcgccc aatacgcaaa ccgcctctcc ccgcgcgttg gccgattcat 2640
taatgcagct ggcacgacag gtttcccgac tggaaagcgg gcagtgagcg caacgcaatt 2700
aatgtgagtt agctcactca ttaggcaccc caggctttac actttatgct tccggctcgt 2760
atgttgtgtg gaattgtgag cggataacaa tttcacacag gaaacagcta tgaccatgat 2820
tacgccaagc ttgcatatga aaagattttt gtccactttg ttgattggaa tgatgctggt 2880
tacatgtgcc tcgccggcat ttgccggccg cggcgatgtc tgctaaatct cgtacaatcg 2940
gcatcatcgg cgctcctttc tctaaaggcc aacctcgtgg cggcgttgaa gaaggcccta 3000
cagttcttcg taaagctggc cttcttgaaa aacttaaaga acaagaatgc gatgttaaag 3060
attacggcga tcttcctttc gctgatatcc ctaacgattc tcctttccaa atcgttaaaa 3120
accctcgttc tgttggcaaa gcttctgaac aacttgctgg caaagttgct gaagttaaaa 3180
aaaacggccg tatctctctt gttcttggcg gcgatcattc tcttgctatc ggctctatct 3240
ctggccatgc tcgtgttcat cctgatcttg gcgttatctg ggttgatgct catacagata 3300
tcaacacacc tcttacaaca acatctggca accttcatgg ccaacctgtt tctttccttc 3360
ttaaagaact taaaggcaaa ggacctgaag ttcctggctt ctcttgggtt acaccttgca 3420
tctctgctaa agatatcgtt tacatcggcc ttcgtgatgt tgatcctggc gaacattaca 3480
tccttaaaac acttggcatc aaatacttct ctatgacaga agttgatcgt cttggcatcg 3540
gcaaagttat ggaagaaaca ctttcttacc ttcttggccg taaaaaacgt cctatccatc 3600
tttctttcga tgttgatggc cttgatcctt ctttcacacc tgctacaggc acacctgttg 3660
ttggcggcct tacataccgt gaaggccttt acatcacaga agaaatctac aaaacaggcc 3720
ttctttctgg ccttgatatc atggaagtta acccttctct tggcaaaaca cctgaagaag 3780
ttacacgtac agttaacaca gctgttgcta tcacacttgc ttgcttcggc cttgctcgtg 3840
aaggcaacca taaacctatc gattacctta accctcctaa aggccgcggc gcatcatcat 3900
catcatcatc atcatcatca ttaataataa gtaccgagct cgaattcact ggccgtcgtt 3960
ttacaacgtc gtgactggga aaaccctggc gttacccaac ttaatcgcct tgcagcacat 4020
ccccctttcg ccagctggcg taatagcgaa gaggcccgca ccgatcgccc ttcccaacag 4080
ttgcgcagcc tgaatggcga atggcgcctg atgcggtatt ttctccttac gcatctgtgc 4140
ggtatttcac accgcatatg gtgcactctc agtacaatct gctctgatgc cgcatagtta 4200
agccagcccc gacacccgcc aacacccgct gacgcgccct gacgggcttg tctgctcccg 4260
gcatccgctt acagacaagc tgtgaccgtc tccgggagct gcatgtgtca gaggttttca 4320
ccgtcatcac cgaaacgcgc gagacgaaag ggcctcgtga tacgcctatt tttataggtt 4380
aatgtcatga taataatggt ttcttagacg tcaggtggca cttttcgggg aaatgtgcgc 4440
ggaaccccta tttgtttatt tttctaaata cattcaaata tgtatccgct catgagacaa 4500
taaccctgat aaatgcttca ataat 4525

Claims (7)

1.一种固定化酶法生产L-鸟氨酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将人重组精氨酸酶I生产菌的种子液接种至发酵培养基中进行发酵培养，发酵培养的温度为32-34℃，pH为6.8-7.2，溶氧为20-40%，搅拌转速180-220rpm；发酵培养至发酵液稀释100倍后的OD600值为0.50-0.60时，降温至22℃，向体系中加入IPTG，使IPTG在体系中的终浓度为0.2mmol/L，诱导培养20-28h；
培养过程中监测体系的甘油含量，当体系的甘油含量≤1.0g/L时开始添加补料，通过流加补料使体系中的甘油含量保持在0.5-1g/L；
（2）将步骤（1）诱导培养后的培养液的pH值调至7.1-7.3，进行破菌处理；将细胞破碎后的混合匀浆过陶瓷膜，收集滤液；将滤液稀释至滤液中人重组精氨酸酶I的浓度为8-12g/L，采用镍柱亲和层析，将稀释后的滤液进行挂柱；
（3）将含有L-精氨酸的底物溶液流经步骤（2）挂柱后的镍柱进行生物转化，收集流出的转化液，即生产得到L-鸟氨酸；
步骤（1）中，所述人重组精氨酸酶I生产菌由如下方法构建而成：
将pHT304质粒用NdeⅠ和HincⅡ双酶切处理，将SEQ ID NO.1所示的Pg3启动子序列整合到双酶切处理后的pHT304质粒上，得到质粒pHT304- Pg3，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；再用SphⅠ和SacⅠ对质粒pHT304- Pg3进行双酶切处理，将arg1基因整合到双酶切处理后的质粒pHT304- Pg3上，获得重组表达载体，其核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；
将获得的重组表达载体导入到枯草芽孢杆菌中，构建得到人重组精氨酸酶I生产菌；
arg1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 7中第5-1087位核苷酸所示；
步骤（3）中，所述底物溶液中含有：L-精氨酸 50 g/L，磷酸吡哆醛1mg/L，二甲基亚砜0.1mg/L。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，发酵培养基的组成为：蛋白胨12g/L、甘油10g/L、酵母膏 8g/L、氯化钠3g/L、硫酸铵2.5g/L、三水磷酸氢二钾4 g/L、柠檬酸铁铵 0.3 g/L、柠檬酸 2.1g/L、七水硫酸镁0.5g/L、氨苄青霉素100ppm。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述补料中含有甘油400g/L、蛋白胨30g/L、酵母膏100g/L。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，镍柱亲和层析的条件为：以50mM的PBS作为结合缓冲液，将滤液挂柱。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）中，底物溶液的流速为3m³/h。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）中，生物转化的条件为：转化温度25℃-45℃，pH7.2-7.3。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤（3）中，生物转化的条件为：转化温度37℃，pH7.25。
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