CN108977454A - 一种大肠杆菌合成角鲨烯用质粒pTsqs及其制备和使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种大肠杆菌合成角鲨烯用质粒pTsqs，包括载体pTrc99A，载体pTrc99A内插入有阻碍蛋白表达基因lacIq、复制起始位点pBR_322ori、氨苄青霉素抗性基因和依据大肠杆菌密码子偏好性优化后的角鲨烯合酶基因ERG9，角鲨烯合酶基因ERG9的上游有启动子Ptrc，角鲨烯合酶基因ERG9的基因下游包含1个多克隆位点(Multiple cloning site,MCS)。本发明开公开了该质粒pTsqs的制备方法和使用方法，本发明涉及的这种可表达角鲨烯合酶使大肠杆菌合成角鲨烯的质粒，该质粒包含强启动子Ptrc控制下的角鲨烯合酶基因ERG9，ERG9基因通过依据参照大肠杆菌密码子偏好性所优化以提高蛋白表达量。本发明为大肠杆菌发酵生产角鲨烯提供了有效的载体工具。

Description

一种大肠杆菌合成角鲨烯用质粒pTsqs及其制备和使用方法

技术领域

本发明属于生物基因工程领域，特别是涉及一种大肠杆菌合成角鲨烯用质粒pTsqs，还涉及一种该质粒pTsqs的制备方法，还涉及一种该质粒pTsqs的使用方法。

背景技术

角鲨烯是一种天然存在于多种微生物及动植物细胞内的三萜烯类化合物，具有抗氧化，保护心脏，提高免疫力，降低血脂及抑制癌症发展等多种功效，已被广泛应用于医药及保健品领域。当前，市面上的角鲨烯主要来源于植物种子及动物肝脏的提取，因此价格比较昂贵，另外通过提取的方法获得还具有周期长、成本高、破坏环境等缺点，因此，亟需新的更环保、更廉价的生产方式。

微生物发酵生产活性化合物具有廉价、快速、环保等优点。近年来，诸多研究致力于利用酵母、微藻及沼泽红假单胞菌等微生物进行角鲨烯的发酵生产，但均未实现突破，其产量与工业化生产要求尚有较大差距。究其原因，角鲨烯含量低或发酵密度低等因素限制了角鲨烯的最终产量。

大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)作为模式菌，具有研究透彻、易改造、易培养等特点，是发酵生产活性化合物的理想菌之一。目前，通过大肠杆菌已经生产出青蒿素、类胡萝卜素等多种活性物质。然而，大肠杆菌由于缺乏角鲨烯合酶，不能天然合成角鲨烯。

发明内容

本发明的第一目的是提供大肠杆菌合成角鲨烯用质粒pTsqs，用于实现大肠杆菌合成角鲨烯。

本发明的第二个目的是提供一种上述质粒pTsqs的制备方法，用于制备该质粒pTsqs。

本发明的第三个目的是提供一种利用质粒pTsqs使大肠杆菌合成角鲨烯的方法，用以实现如何使用该质粒pTsqs促使大肠杆菌合成角鲨烯。

为了达到上述第一个目的，本发明所采用的第一种技术方案是，一种大肠杆菌合成角鲨烯用质粒pTsqs，包括载体pTrc99A，载体pTrc99A内插入有阻碍蛋白表达基因lacIq、复制起始位点pBR_322ori、氨苄青霉素抗性基因和优化后的角鲨烯合酶基因ERG9，角鲨烯合酶基因ERG9的上游有启动子Ptrc，角鲨烯合酶基因ERG9的基因下游包含1个多克隆位点(Multiple cloning site,MCS)，质粒pTsqs的核苷酸序列如序列1所示，角鲨烯合酶基因ERG9的核苷酸序列如序列3所示。

为了达到上述第二个目的，本发明所采用的第二个技术方案是，一种质粒pTsqs的制备方法，具体按照以下步骤实施：

步骤1，先选取野生型酿酒酵母S288C基因ERG9，并根据大肠杆菌密码子偏好性对野生型酿酒酵母S288C基因ERG9的核苷酸序列进行优化，得到新的角鲨烯合酶基因ERG9，之后将角鲨烯合酶基因ERG9插入载体pUC57中得到质粒pUCsqs，野生型酿酒酵母S288C基因ERG9的核苷酸序列如序列2所示，优化后的角鲨烯合酶基因ERG9的核苷酸序列如序列3所示；

步骤2，质粒pUCsqs中的角鲨烯合酶基因ERG9通过酶切和连接反应插入载体pTrc99A中，形成质粒pTsqs；

步骤3，利用菌落PCR与双酶切方法对质粒pTsqs进行验证。

本发明的第二种技术方案，还具有以下特点：

在所述步骤1中，角鲨烯合酶基因ERG9的两端分别添加有NcoI(CCATGG)酶切位点和KpnI(GGGTACC)酶切位点。

在所述步骤2中，先采用NcoI与KpnI两种限制性内切酶对质粒pUCsqs与载体pTrc99A分别进行双酶切，然后通过凝胶电泳回收角鲨烯合酶基因ERG9片段与线性化的载体pTrc99A，之后再通过连接反应将角鲨烯合酶基因ERG9插入线性化的载体pTrc99A并转入大肠杆菌DH5α中，利用氨苄青霉素抗性筛选得到质粒pTsqs。

为了达到上述第三个目的，本发明所采用的技术方案是，一种利用质粒pTsqs使大肠杆菌合成角鲨烯的方法，具体按照以下步骤实施：

步骤1，先将野生菌株E.coli C43(DE3)制备成氯化钙感受态细胞，然后通过热击法转化质粒pTsqs，最后利用氨苄青霉素抗性筛选和菌落PCR验证获得重组菌E.coli CSQ1；

步骤2，验证重组菌E.coli CSQ1中角鲨烯的合成。

本发明的第三种技术方案，还具有以下特点：

在步骤2的验证具体为：先将采用LB液体培养基培养E.coli CSQ1，并加入诱导剂IPTG诱导角鲨烯合酶基因ERG9表达；之后通过皂化法分离、提取合成的角鲨烯；最后通过高效液相色谱法检测该角鲨烯的含量。

本发明的有益效果是：

(1)通过本发明技术方案得到的质粒pTsqs，可用于大肠杆菌中角鲨烯的合成，其内含有氨苄青霉素抗性基因作为筛选标记，以强启动子Ptrc控制角鲨烯合酶基因ERG9的表达，提高角鲨烯合酶蛋白的表达量。

(2)通过本发明技术方案得到的质粒pTsqs中包含的角鲨烯合酶基因ERG9是通过参照大肠杆菌密码子偏好性所优化，用以提高角鲨烯合酶的表达量，最终达到了提高大肠杆菌中角鲨烯含量的目的。

(3)本发明技术方案得到的质粒pTsqs为大肠杆菌发酵生产角鲨烯提供了有效的载体工具。

附图说明

图1是本发明所涉及的质粒pTsqs的构建原理图；

图2是本发明所涉及的质粒pUCsqs中角鲨烯合酶基因ERG9双酶切回收凝胶电泳图；

图3是本发明所涉及的质粒pTsqs及其验证示意图；

图4是本发明所涉及的质粒pTsqs的菌落PCR验证图；

图5是本发明所涉及的质粒pTsqs的双酶切验证凝胶电泳图；

图6是本发明所涉及的重组菌E.coli CSQ1合成的角鲨烯的验证高效液相色谱图。

具体实施方式

以下结合附图说明和具体实施例对本发明的技术方案作进一步地详细说明。

实施例1

一种大肠杆菌合成角鲨烯用质粒pTsqs，包括载体pTrc99A，载体pTrc99A内插入有阻碍蛋白表达基因lacIq、复制起始位点pBR_322ori、氨苄青霉素抗性基因和角鲨烯合酶基因ERG9，角鲨烯合酶基因ERG9的上游有启动子Ptrc，角鲨烯合酶基因ERG9的基因下游包含1个多克隆位点(Multiple cloning site,MCS)，质粒pTsqs的核苷酸序列如序列1所示，角鲨烯合酶基因ERG9的核苷酸序列如序列3所示。

实施例2

一种上述质粒pTsqs的制备方法，具体按照以下步骤实施：

步骤1，先选取野生型酿酒酵母S288C基因ERG9，并根据大肠杆菌密码子偏好性对野生型酿酒酵母S288C基因ERG9的核苷酸序列进行优化得到角鲨烯合酶基因ERG9，之后将角鲨烯合酶基因ERG9插入载体pUC57中得到质粒pUCsqs，角鲨烯合酶基因ERG9的上下游两端分别添加有NcoI(CCATGG)酶切位点和KpnI(GGGTACC)酶切位点，野生型酿酒酵母S288C基因ERG9的核苷酸序列如序列2所示，角鲨烯合酶基因ERG9的核苷酸序列如序列3所示；

步骤2，pUCsqs中的角鲨烯合酶基因ERG9通过酶切和连接反应插入载体pTrc99A中，形成质粒pTsqs，具体为：

先采用NcoI与KpnI两种限制性内切酶对质粒pUCsqs与载体pTrc99A分别进行双酶切，然后通过凝胶电泳回收从质粒pUCsqs中切下的角鲨烯合酶基因ERG9片段与线性化的载体pTrc99A，之后再通过连接反应将角鲨烯合酶基因ERG9插入线性化的载体pTrc99A并转入大肠杆菌DH5α中，利用氨苄青霉素抗性筛选得到质粒pTsqs。

步骤3，利用菌落PCR与双酶切方法对质粒pTsqs进行验证。

实施例3

一种利用上述质粒pTsqs使大肠杆菌合成角鲨烯的方法，具体按照以下步骤实施：

步骤1，先将野生菌株E.coli C43(DE3)制备成氯化钙感受态，然后通过热击法转化质粒pTsqs，最后利用氨苄青霉素抗性筛选和菌落PCR验证获得重组菌E.coli CSQ1；

步骤2，验证重组菌E.coli CSQ1中合成的角鲨烯，具体为：

先将采用LB液体培养基培养重组E.coli CSQ1，并加入诱导剂IPTG诱导角鲨烯合酶基因ERG9表达；之后通过皂化法分离、提取合成的角鲨烯；最后通过高效液相色谱法检测该角鲨烯。

其中，野生菌株E.coli C43(DE3)的DNA序列为GenBank号具体为CP011938.1的序列(BCT 17-DEC-2015)；野生菌株E.coli C43(DE3)在西安医学院分子病毒与病毒免疫学实验室保藏；载体pTrc99A购自Nonagon公司，质粒pUCsqs由华大基因科技有限公司提供；限制性内切酶(NcoI与KpnI)、T4连接酶、ExTaq聚合酶、DH5α感受态细胞以及250bp DNA Marker等均购自Takara公司；质粒提取试剂盒和胶回收试剂盒购自天根生物科技有限公司；无水Na₂SO₄、色谱级甲醇、己烷及二氯甲烷等化学试剂均购自海默生物科技有限公司；角鲨烯标准品购自Sigma公司。

酿酒酵母S288C基因ERG9的核苷酸序列的优化：

(1)在NCBI网站查找酿酒酵母S288C株的ERG9基因序列(序列2)，该基因位于染色体VIII(NC_001140.6)的第484845-486179位；

(2)对照大肠杆菌密码子偏好性表，在不改变编码的氨基酸序列基础上对ERG9基因序列进行优化，得到角鲨烯合酶基因ERG9(见序列3)，在角鲨烯合酶基因ERG9的序列两端分别加上NcoI(CCATGG)与KpnI(GGGTACC)酶切位点，将该序列插入载体pUC57形成质粒pUCsqs。

制备质粒pTsqs：

构建过程如图1所示，首先，采用NcoI与KpnI等两种限制性内切酶对质粒pUCsqs进行双酶切，通过凝胶电泳回收角鲨烯合酶基因ERG9片段，然后同样对载体pTrc99A进行双酶切并进行回收，进一步通过连接反应将角鲨烯合酶基因ERG9插入载体pTrc99A并转入大肠杆菌DH5α中，利用氨苄青霉素抗性筛选，最后经过菌落PCR与双酶切验证得到质粒pTsqs。

具体来说：

步骤1.带粘性末端的角鲨烯合酶基因ERG9获取

(1)采用NcoI与KpnI对质粒pUCsqs进行双酶切；

酶切反应体系为：10×QC Buffer，10μl；NcoI，2μl；KpnI，2μl；pUCsqs，20μl；ddH₂O，66μl；总体积为100μl。

酶切反应条件为：37℃水浴锅放置4h；

实验结果为：酶切反应液进行凝胶电泳后分别获得一条1344bp(角鲨烯合酶基因ERG9)和一条2704bp(载体pUC57)的条带，结果如图2所示。

(2)依照凝胶回收试剂盒操作说明对角鲨烯合酶基因ERG9进行回收；

(3)通过酶标仪对回收的角鲨烯合酶基因ERG9浓度进行测定，并放入-20℃冰箱保存备用。

步骤2.角鲨烯合酶基因ERG9插入载体pTrc99A

(1)采用NcoI与KpnI两种限制性内切酶对质粒pTsqs进行双酶切并回收；

酶切体系与条件除加入的质粒pUCsqs替换为载体pTrc99A外，其它条件同步骤1中所述，酶切后获得一条4158bp的条带，采用凝胶电泳回收并测定浓度。

(2)采用T4连接酶将角鲨烯合酶基因ERG9与载体pTrc99A连接；

连接反应体系：10×T4Buffer，2μl；T4Ligase，1μl；ERG9，6μl；pTrc99A，2μl；ddH₂O，9μl；总体积为20μl。

反应条件：16℃保温12h。

(3)将连接产物暨质粒pTsqs转入大肠杆菌DH5α；

①取10μl连接反应液加入至100μl DH5α感受态细胞中轻轻混匀，冰上放置30min；

②将混合液放入42℃水浴热击90s，冰上放置3min；

③往连接反应液中加入700μl LB液体培养基，于37℃培养箱放置50min；

④6000g离心5min收集菌体，吸出650μl上清液，将沉淀与剩余的上清液混合均匀后涂布于含50mg/l氨苄青霉素的LB固体培养基上。

步骤3，质粒pTsqs的筛选与验证

于LB固体培养基上挑取阳性单克隆，利用设计的验证引物Check_pTsqs_up和Check_pTsqs_down进行菌落PCR，含有质粒pTsqs的单克隆PCR后将获得一条1338bp的扩增条带；随后，将获得目标条带的单克隆接种于含氨苄青霉素的LB液体培养基，37℃培养16h后提取质粒；最后对提取的质粒进行双酶切、测序验证，验证原理如图3所示。

(1)验证引物的设计与合成；

大肠杆菌基因组中不含优化前或优化后的角鲨烯合酶基因ERG9，故根据角鲨烯合酶基因ERG9的序列设计并合成一对验证引物如下：

Check_pTsqs_up：5’-ATGGGCGGTAAACTGCTGCAG-3’(该序列为序列3的第1-21位)

Check_pTsqs_down：5’-TTAAGCACGGTGCAGGGTGTAG-3’(该序列为序列3的第1317-1338位的反向互补序列)

(2)菌落PCR验证；

PCR反应体系：ExTaq Mix，25μl；Check_pTsqs_up(10μM)，1μl；Check_pTsqs_down(10μM)，1μl；ddH₂O，23μl；反应体系总体积为50μl；采用20μl枪头挑取单克隆混入反应液中。

PCR反应条件为：先，98℃，3min；再98℃，10s，62℃，30s，72℃，1min 30s，72℃，5min(循环32次)；最后4℃至结束。

PCR结果：PCR反应液进行凝胶电泳后获得一条1338bp的条带，结果如图4所示。

(3)将获得目标条带的单克隆接种于含有50mg/l氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃培养16h；

(4)取上述培养菌液3ml并提取质粒；

(5)双酶切验证重组质粒pTsqs。

酶切反应体系为：10×QC Buffer，10μl；NcoI，2μl；KpnI，2μl；pTsqs，20μl；ddH₂O，66μl；总体积为100μl。

酶切反应条件为：37℃水浴锅放置2h；

实验结果为：酶切反应液进行凝胶电泳后分别获得一条1344bp(角鲨烯合酶基因ERG9)和一条4158bp(载体pTrc99A)的条带，证明角鲨烯合酶基因ERG9被成功插入载体pTrc99A，表明质粒pTsqs(图2)构建成功，双酶切结果如图5所示。

应用质粒pTsqs使大肠杆菌合成角鲨烯：

步骤1，重组菌E.coli CSQ1的构建

(1)野生菌株E.coli C43(DE3)感受态细胞的制备；

①野生菌株E.coli C43(DE3)接种于10ml LB培养液中，37℃振荡培养约3h使菌体密度达到OD₆₀₀＝0.4；

②取菌液冰浴10min，4000g，离心5min，收集菌体；

③将收集的菌体重悬于10ml的CaCl₂(50mmol/L)溶液中，冰浴10min，再次4000g，离心5min，收集菌体；

④将收集的菌体再次重悬于2ml预冷的CaCl₂溶液(50mmol/L)中，使菌液浓缩，继续冰浴15min，使菌体受敏成感受态细胞。

(2)质粒pTsqs转入野生菌株E.coli C43(DE3)感受态细胞中；

①取1μl质粒pTsqs加入至100μl野生型菌株E.coli C43(DE3)感受态细胞中轻轻混匀，冰上放置30min；

②将混合液放入42℃水浴热击90s，冰上放置3min；

③往连接反应液中加入700μl LB液体培养基，于37℃培养箱放置50min；

④6000g离心5min收集菌体，吸出650μl上清液，将沉淀与剩余的上清液混合均匀后涂布于含50mg/l氨苄青霉素的LB固体培养基上，筛选获得重组菌E.coli CSQ1。

步骤2.角鲨烯合酶的表达及角鲨烯的提取

(1)将E.coli CSQ1接种至含50mg/l氨苄青霉素的LB液体培养基，37℃培养3h至OD₆₀₀＝0.3，加入终浓度为0.5mM的IPTG诱导角鲨烯合酶蛋白表达；

(2)野生菌及重组菌中角鲨烯的提取；

对野生菌株E.coli C43(DE3)及重组菌E.coli CSQ1做同样的提取处理，以野生菌株E.coli C43(DE3)为对照验证重组菌种角鲨烯的合成，方法如下：

①取20ml同浓度的菌液，12000g离心5min，倒掉上清液，加入20ml ddH₂O重悬菌体，再次离心并倒掉上清液，重复2次；

②将收集的菌泥放入50ml离心管中，冷冻干燥过夜；

③往离心管中加入5ml 60％氢氧化钾/水溶液(w/v),7.5ml甲醇，7.5ml 0.5％焦性没食子酸/甲醇溶液(w/v)，放入45℃摇床150rpm温育10h；

④往离心管中加入10ml己烷并震荡5min，用分液漏斗分离收集上层己烷，重复三次，将所有己烷收集到同一个新的50ml离心管中；

⑤往己烷中加入5g无水Na₂SO₄，在通风橱中于40℃蒸干己烷，得到固体粗提物。

(3)HPLC法分析角鲨烯合成；

①将上述固体粗提物溶解于1ml甲醇/二氯己烷(9:1，v/v)中；

②采0.22μm孔径的有机系无菌滤膜过滤甲醇/二氯己烷溶液；

③通过HPLC法对标准品、野生菌株E.coli C43(DE3)的提取物及重组菌E.coliCSQ1的提取物进行检测分析，检测条件：柱体为C₁₈，柱温为40℃，样品注入体积为10μl，流动相为甲醇/水溶液(9:1，v/v)，流速为1.0ml/min；

④将标准品、野生菌株E.coli C43(DE3)的提取物及重组菌E.coli CSQ1的提取物的检测结果进行对比分析，结果如图6所示。

结果显示，由标准品的分析证明了角鲨烯的出峰时间约为27.2min(图6A)。野生菌株E.coli C43(DE3)的提取物在27.2min附近未出现任何峰(图6B)，表明野生菌株E.coliC43(DE3)未合成角鲨烯。重组菌E.coli CSQ1的提取物在27.2min附近出现明显的吸收峰(图6C)，证明重组菌E.coli CSQ1合成了角鲨烯。

以上结果表明，本发明涉及的这种可表达角鲨烯合酶使大肠杆菌合成角鲨烯的质粒，该质粒包含强启动子Ptrc控制下的角鲨烯合酶基因ERG9，ERG9基因通过依据参照大肠杆菌密码子偏好性所优化以提高蛋白表达量。本发明为大肠杆菌发酵生产角鲨烯提供了有效的载体工具。

序列表

<110> 西安医学院

<120> 一种大肠杆菌合成角鲨烯用质粒pTsqs及其制备和使用方法

<130> 2018

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 5502

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 1

gtttgacagc ttatcatcga ctgcacggtg caccaatgct tctggcgtca ggcagccatc 60

ggaagctgtg gtatggctgt gcaggtcgta aatcactgca taattcgtgt cgctcaaggc 120

gcactcccgt tctggataat gttttttgcg ccgacatcat aacggttctg gcaaatattc 180

tgaaatgagc tgttgacaat taatcatccg gctcgtataa tgtgtggaat tgtgagcgga 240

taacaatttc acacaggaaa cagaccatgg atgggcggta aactgctgca gctggctctg 300

cacccggttg aaatgaaagc tgctctgaaa ctgaaattct gccgtacccc gctgttctct 360

atctacgacc agtctacctc tccgtacctg ctgcactgct tcgaactgct gaacctgacc 420

tctcgttctt tcgctgctgt tatccgtgaa ctgcacccgg aactgcgtaa ctgcgttacc 480

ctgttctacc tgatcctgcg tgctctggac accatcgaag acgacatgtc tatcgaacac 540

gacctgaaaa tcgacctgct gcgtcacttc cacgaaaaac tgctgctgac caaatggtct 600

ttcgacggta acgctccgga cgttaaagac cgtgctgttc tgaccgactt cgaatctatc 660

ctgatcgaat ttcacaaact gaaaccggaa taccaggaag ttatcaaaga aatcaccgaa 720

aaaatgggta acggtatggc tgactacatc ctggacgaaa actacaacct gaacggtctg 780

cagaccgttc acgactacga cgtttactgc cactacgttg ctggtctggt tggtgacggt 840

ctgacccgtc tgatcgttat cgctaaattc gctaacgaat ctctgtactc taacgaacag 900

ctgtacgaat ctatgggtct gttcctgcag aaaaccaaca tcatccgtga ctacaacgaa 960

gacctggttg acggtcgttc tttctggccg aaagaaatct ggtctcagta cgctccgcag 1020

ctgaaagact tcatgaaacc ggaaaacgaa cagctgggtc tggactgcat caaccacctg 1080

gttctgaacg ctctgtctca cgttatcgac gttctgacct acctggctgg tatccacgaa 1140

cagtctacct tccagttctg cgctatcccg caggttatgg ctatcgctac cctggttctg 1200

gttttcaaca accgtgaagt tctgcacggt aacgttaaaa tccgtaaagg tactacctgc 1260

tacctgatcc tgaaatctcg taccctgcgt ggttgcgttg aaatcttcga ctactacctg 1320

cgtgacatca aatctaaact ggctgttcag gacccgaact tcctgaaact gaacatccag 1380

atctctaaaa tcgaacagtt catggaagaa atgtaccagg acaaactgcc gccgaacgtt 1440

aaaccgaacg aaaccccgat cttcctgaaa gttaaagaac gttctcgtta cgacgacgaa 1500

ctggttccga cccagcagga agaagaatac aaattcaaca tggttctgtc tatcatcctg 1560

tctgttctgc tgggtttcta ctacatctac accctgcacc gtgcttaagg tacccgggga 1620

tcctctagag tcgacctgca ggcatgcaag cttggctgtt ttggcggatg agagaagatt 1680

ttcagcctga tacagattaa atcagaacgc agaagcggtc tgataaaaca gaatttgcct 1740

ggcggcagta gcgcggtggt cccacctgac cccatgccga actcagaagt gaaacgccgt 1800

agcgccgatg gtagtgtggg gtctccccat gcgagagtag ggaactgcca ggcatcaaat 1860

aaaacgaaag gctcagtcga aagactgggc ctttcgtttt atctgttgtt tgtcggtgaa 1920

cgctctcctg agtaggacaa atccgccggg agcggatttg aacgttgcga agcaacggcc 1980

cggagggtgg cgggcaggac gcccgccata aactgccagg catcaaatta agcagaaggc 2040

catcctgacg gatggccttt ttgcgtttct acaaactctt tttgtttatt tttctaaata 2100

cattcaaata tgtatccgct catgagacaa taaccctgat aaatgcttca ataatattga 2160

aaaaggaaga gtatgagtat tcaacatttc cgtgtcgccc ttattccctt ttttgcggca 2220

ttttgccttc ctgtttttgc tcacccagaa acgctggtga aagtaaaaga tgctgaagat 2280

cagttgggtg cacgagtggg ttacatcgaa ctggatctca acagcggtaa gatccttgag 2340

agttttcgcc ccgaagaacg ttttccaatg atgagcactt ttaaagttct gctatgtggc 2400

gcggtattat cccgtgttga cgccgggcaa gagcaactcg gtcgccgcat acactattct 2460

cagaatgact tggttgagta ctcaccagtc acagaaaagc atcttacgga tggcatgaca 2520

gtaagagaat tatgcagtgc tgccataacc atgagtgata acactgcggc caacttactt 2580

ctgacaacga tcggaggacc gaaggagcta accgcttttt tgcacaacat gggggatcat 2640

gtaactcgcc ttgatcgttg ggaaccggag ctgaatgaag ccataccaaa cgacgagcgt 2700

gacaccacga tgcctacagc aatggcaaca acgttgcgca aactattaac tggcgaacta 2760

cttactctag cttcccggca acaattaata gactggatgg aggcggataa agttgcagga 2820

ccacttctgc gctcggccct tccggctggc tggtttattg ctgataaatc tggagccggt 2880

gagcgtgggt ctcgcggtat cattgcagca ctggggccag atggtaagcc ctcccgtatc 2940

gtagttatct acacgacggg gagtcaggca actatggatg aacgaaatag acagatcgct 3000

gagataggtg cctcactgat taagcattgg taactgtcag accaagttta ctcatatata 3060

ctttagattg atttaaaact tcatttttaa tttaaaagga tctaggtgaa gatccttttt 3120

gataatctca tgaccaaaat cccttaacgt gagttttcgt tccactgagc gtcagacccc 3180

gtagaaaaga tcaaaggatc ttcttgagat cctttttttc tgcgcgtaat ctgctgcttg 3240

caaacaaaaa aaccaccgct accagcggtg gtttgtttgc cggatcaaga gctaccaact 3300

ctttttccga aggtaactgg cttcagcaga gcgcagatac caaatactgt ccttctagtg 3360

tagccgtagt taggccacca cttcaagaac tctgtagcac cgcctacata cctcgctctg 3420

ctaatcctgt taccagtggc tgctgccagt ggcgataagt cgtgtcttac cgggttggac 3480

tcaagacgat agttaccgga taaggcgcag cggtcgggct gaacgggggg ttcgtgcaca 3540

cagcccagct tggagcgaac gacctacacc gaactgagat acctacagcg tgagctatga 3600

gaaagcgcca cgcttcccga agggagaaag gcggacaggt atccggtaag cggcagggtc 3660

ggaacaggag agcgcacgag ggagcttcca gggggaaacg cctggtatct ttatagtcct 3720

gtcgggtttc gccacctctg acttgagcgt cgatttttgt gatgctcgtc aggggggcgg 3780

agcctatgga aaaacgccag caacgcggcc tttttacggt tcctggcctt ttgctggcct 3840

tttgctcaca tgttctttcc tgcgttatcc cctgattctg tggataaccg tattaccgcc 3900

tttgagtgag ctgataccgc tcgccgcagc cgaacgaccg agcgcagcga gtcagtgagc 3960

gaggaagcgg aagagcgcct gatgcggtat tttctcctta cgcatctgtg cggtatttca 4020

caccgcatat ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg ccgcatagtt aagccagtat 4080

acactccgct atcgctacgt gactgggtca tggctgcgcc ccgacacccg ccaacacccg 4140

ctgacgcgcc ctgacgggct tgtctgctcc cggcatccgc ttacagacaa gctgtgaccg 4200

tctccgggag ctgcatgtgt cagaggtttt caccgtcatc accgaaacgc gcgaggcagc 4260

agatcaattc gcgcgcgaag gcgaagcggc atgcatttac gttgacacca tcgaatggtg 4320

caaaaccttt cgcggtatgg catgatagcg cccggaagag agtcaattca gggggtgaat 4380

gtgaaaccag taacgttata cgatgtcgca gagtatgccg gtgtctctta tcagaccgtt 4440

tcccgcgtgg tgaaccaggc cagccacgtt tctgcgaaaa cgcgggaaaa agtggaagcg 4500

gcgatggcgg agctgaatta cattcccaac cgcgtggcac aacaactggc gggcaaacag 4560

tcgttgctga ttggcgttgc cacctccagt ctggccctgc acgcgccgtc gcaaattgtc 4620

gcggcgatta aatctcgcgc cgatcaactg ggtgccagcg tggtggtgtc gatggtagaa 4680

cgaagcggcg tcgaagcctg taaagcggcg gtgcacaatc ttctcgcgca acgcgtcagt 4740

gggctgatca ttaactatcc gctggatgac caggatgcca ttgctgtgga agctgcctgc 4800

actaatgttc cggcgttatt tcttgatgtc tctgaccaga cacccatcaa cagtattatt 4860

ttctcccatg aagacggtac gcgactgggc gtggagcatc tggtcgcatt gggtcaccag 4920

caaatcgcgc tgttagcggg cccattaagt tctgtctcgg cgcgtctgcg tctggctggc 4980

tggcataaat atctcactcg caatcaaatt cagccgatag cggaacggga aggcgactgg 5040

agtgccatgt ccggttttca acaaaccatg caaatgctga atgagggcat cgttcccact 5100

gcgatgctgg ttgccaacga tcagatggcg ctgggcgcaa tgcgcgccat taccgagtcc 5160

gggctgcgcg ttggtgcgga tatctcggta gtgggatacg acgataccga agacagctca 5220

tgttatatcc cgccgttaac caccatcaaa caggattttc gcctgctggg gcaaaccagc 5280

gtggaccgct tgctgcaact ctctcagggc caggcggtga agggcaatca gctgttgccc 5340

gtctcactgg tgaaaagaaa aaccaccctg gcgcccaata cgcaaaccgc ctctccccgc 5400

gcgttggccg attcattaat gcagctggca cgacaggttt cccgactgga aagcgggcag 5460

tgagcgcaac gcaattaatg tgagttagcg cgaattgatc tg 5502

<210> 2

<211> 1335

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 2

atgggaaagc tattacaatt ggcattgcat ccggtcgaga tgaaggcagc tttgaagctg 60

aagttttgca gaacaccgct attctccatc tatgatcagt ccacgtctcc atatctcttg 120

cactgtttcg aactgttgaa cttgacctcc agatcgtttg ctgctgtgat cagagagctg 180

catccagaat tgagaaactg tgttactctc ttttatttga ttttaagggc tttggatacc 240

atcgaagacg atatgtccat cgaacacgat ttgaaaattg acttgttgcg tcacttccac 300

gagaaattgt tgttaactaa atggagtttc gacggaaatg cccccgatgt gaaggacaga 360

gccgttttga cagatttcga atcgattctt attgaattcc acaaattgaa accagaatat 420

caagaagtca tcaaggagat caccgagaaa atgggtaatg gtatggccga ctacatctta 480

gatgaaaatt acaacttgaa tgggttgcaa accgtccacg actacgacgt gtactgtcac 540

tacgtagctg gtttggtcgg tgatggtttg acccgtttga ttgtcattgc caagtttgcc 600

aacgaatctt tgtattctaa tgagcaattg tatgaaagca tgggtctttt cctacaaaaa 660

accaacatca tcagagatta caatgaagat ttggtcgatg gtagatcctt ctggcccaag 720

gaaatctggt cacaatacgc tcctcagttg aaggacttca tgaaacctga aaacgaacaa 780

ctggggttgg actgtataaa ccacctcgtc ttaaacgcat tgagtcatgt tatcgatgtg 840

ttgacttatt tggccggtat ccacgagcaa tccactttcc aattttgtgc cattccccaa 900

gttatggcca ttgcaacctt ggctttggta ttcaacaacc gtgaagtgct acatggcaat 960

gtaaagattc gtaagggtac tacctgctat ttaattttga aatcaaggac tttgcgtggc 1020

tgtgtcgaga tttttgacta ttacttacgt gatatcaaat ctaaattggc tgtgcaagat 1080

ccaaatttct taaaattgaa cattcaaatc tccaagatcg aacagtttat ggaagaaatg 1140

taccaggata aattacctcc taacgtgaag ccaaatgaaa ctccaatttt cttgaaagtt 1200

aaagaaagat ccagatacga tgatgaattg gttccaaccc aacaagaaga agagtacaag 1260

ttcaatatgg ttttatctat catcttgtcc gttcttcttg ggttttatta tatatacact 1320

ttacacagag cgtga 1335

<210> 3

<211> 1338

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 3

atgggcggta aactgctgca gctggctctg cacccggttg aaatgaaagc tgctctgaaa 60

ctgaaattct gccgtacccc gctgttctct atctacgacc agtctacctc tccgtacctg 120

ctgcactgct tcgaactgct gaacctgacc tctcgttctt tcgctgctgt tatccgtgaa 180

ctgcacccgg aactgcgtaa ctgcgttacc ctgttctacc tgatcctgcg tgctctggac 240

accatcgaag acgacatgtc tatcgaacac gacctgaaaa tcgacctgct gcgtcacttc 300

cacgaaaaac tgctgctgac caaatggtct ttcgacggta acgctccgga cgttaaagac 360

cgtgctgttc tgaccgactt cgaatctatc ctgatcgaat ttcacaaact gaaaccggaa 420

taccaggaag ttatcaaaga aatcaccgaa aaaatgggta acggtatggc tgactacatc 480

ctggacgaaa actacaacct gaacggtctg cagaccgttc acgactacga cgtttactgc 540

cactacgttg ctggtctggt tggtgacggt ctgacccgtc tgatcgttat cgctaaattc 600

gctaacgaat ctctgtactc taacgaacag ctgtacgaat ctatgggtct gttcctgcag 660

aaaaccaaca tcatccgtga ctacaacgaa gacctggttg acggtcgttc tttctggccg 720

aaagaaatct ggtctcagta cgctccgcag ctgaaagact tcatgaaacc ggaaaacgaa 780

cagctgggtc tggactgcat caaccacctg gttctgaacg ctctgtctca cgttatcgac 840

gttctgacct acctggctgg tatccacgaa cagtctacct tccagttctg cgctatcccg 900

caggttatgg ctatcgctac cctggttctg gttttcaaca accgtgaagt tctgcacggt 960

aacgttaaaa tccgtaaagg tactacctgc tacctgatcc tgaaatctcg taccctgcgt 1020

ggttgcgttg aaatcttcga ctactacctg cgtgacatca aatctaaact ggctgttcag 1080

gacccgaact tcctgaaact gaacatccag atctctaaaa tcgaacagtt catggaagaa 1140

atgtaccagg acaaactgcc gccgaacgtt aaaccgaacg aaaccccgat cttcctgaaa 1200

gttaaagaac gttctcgtta cgacgacgaa ctggttccga cccagcagga agaagaatac 1260

aaattcaaca tggttctgtc tatcatcctg tctgttctgc tgggtttcta ctacatctac 1320

accctgcacc gtgcttaa 1338

Claims (6)

1.一种大肠杆菌合成角鲨烯用质粒pTsqs，其特征在于，包括载体pTrc99A，载体pTrc99A内插入有阻碍蛋白表达基因lacIq、复制起始位点pBR_322 ori、氨苄青霉素抗性基因和依据大肠杆菌密码子偏好性优化的角鲨烯合酶基因ERG9，角鲨烯合酶基因ERG9的上游有启动子Ptrc，角鲨烯合酶基因ERG9的基因下游包含1个多克隆位点(Multiple cloningsite,MCS)，质粒pTsqs的核苷酸序列如序列1所示，优化的角鲨烯合酶基因ERG9的核苷酸序列如序列3所示。

2.一种权利要求1所述质粒pTsqs的制备方法，其特征在于，具体按照以下步骤实施：

步骤1，先选取酿酒酵母S288C的基因ERG9，并根据大肠杆菌密码子偏好性对野生型酿酒酵母S288C基因ERG9的核苷酸序列进行优化得到角鲨烯合酶基因ERG9，之后将角鲨烯合酶基因ERG9插入载体pUC57中得到质粒pUCsqs，野生型酿酒酵母S288C基因ERG9的核苷酸序列如序列2所示，角鲨烯合酶基因ERG9的核苷酸序列如序列3所示；

步骤2，质粒pUCsqs中的角鲨烯合酶基因ERG9通过酶切和连接反应插入载体pTrc99A中，形成质粒pTsqs；

步骤3，利用菌落PCR与双酶切方法对质粒pTsqs进行验证。

3.根据权利要求2所述的质粒pTsqs的制备方法，其特征在于，在所述步骤1中，角鲨烯合酶基因ERG9的两端分别添加有NcoI(CCATGG)酶切位点和KpnI(GGGTACC)酶切位点。

4.根据权利要求3所述的质粒pTsqs的制备方法，其特征在于，在所述步骤2中，先采用NcoI与KpnI两种限制性内切酶对质粒pUCsqs与载体pTrc99A分别进行双酶切，然后通过凝胶电泳回收角鲨烯合酶基因ERG9片段与线性化的载体pTrc99A，之后再通过连接反应将角鲨烯合酶基因ERG9插入线性化的载体pTrc99A并转入大肠杆菌DH5α中，利用氨苄青霉素抗性基因筛选得到质粒pTsqs。

5.一种利用根据权利要求1-4任一项中所述质粒pTsqs使大肠杆菌合成角鲨烯的方法，其特征在于，具体按照以下步骤实施：

步骤1，先将野生菌株E.coli C43(DE3)制备成氯化钙感受态细胞，然后通过热击法转化质粒pTsqs，最后利用氨苄青霉素抗性筛选和菌落PCR验证获得重组菌E.coli CSQ1；

步骤2，验证重组菌E.coli CSQ1中合成的角鲨烯。

6.根据权利要求5所述的利用质粒pTsqs使大肠杆菌合成角鲨烯的方法，其特征在于，在步骤2的验证具体为：先将采用LB液体培养基培养E.coli CSQ1，并加入诱导剂IPTG诱导角鲨烯合酶基因ERG9表达；之后通过皂化法分离、提取合成的角鲨烯；最后通过高效液相色谱法检测该角鲨烯。