CN111518739A - 角鲨烯工程菌株、角鲨烯合成质粒、细胞膜空间扩展质粒及制备方法 - Google Patents

角鲨烯工程菌株、角鲨烯合成质粒、细胞膜空间扩展质粒及制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种角鲨烯工程菌株、角鲨烯合成质粒、细胞膜空间扩展质粒及制备方法，通过构建角鲨烯合成途径的工程菌株，开发微生物细胞工厂，构建与膜面积扩展相关基因的角鲨烯合成单元，从而推进角鲨烯的生物合成和工业化生产进程。该角鲨烯工程菌株、角鲨烯合成质粒及其制备方法在大肠杆菌中合成角鲨烯的绿色合成方法，可以减少对自然资源的依赖和过度开发。并且，其成本较低，能实现大规模的角鲨烯生产，具有巨大的经济效益。

Description

角鲨烯工程菌株、角鲨烯合成质粒、细胞膜空间扩展质粒及制 备方法
技术领域
本发明涉及一种角鲨烯工程菌株、角鲨烯合成质粒、细胞膜空间扩展质粒及制备方法，属于生物基因工程领域。
背景技术
角鲨烯是由6个异戊二烯连接而成的不饱和三萜类化合物，是人体胆固醇代谢途径中一个关键的中间产物。角鲨烯广泛存在于动、植物或微生物体内。在动物体内，尤以深海鲨鱼的肝脏中角鲨烯含量最为丰富，此外，在牦牛肉中角鲨烯的含量也较为丰富。在植物中角鲨烯的分布也很广，如橄榄油、南瓜籽等均含有丰富的角鲨烯。角鲨烯具有强携氧能力、抗氧化、抗辐射、解毒作用、抑制微生物的生长、调控动物体中胆固醇的代谢以及防癌和抗癌作用等重要生理活性，在食品、医药、化妆品等领域具有广泛应用：①角鲨烯抗氧化、抵御紫外线伤害，可用作化妆品；②角鲨烯可作为药物缓释剂，增强药物的治疗效果；③角鲨烯可摄取大量的氧，加强细胞新陈代谢消除疲劳，已成为功能明确的活性成分，在功能性食品中应用广泛；④角鲨烯是一种良好的自由基清除剂，因其具有抗氧化、降血糖、降血脂等生物活性，可用于保健品的生产加工，如角鲨烯软胶囊(角鲨烯含量为100-500mg/粒)等；⑤角鲨烯常被添加于大豆油、花生油等食用植物油中，抑制或延缓油脂的氧化，从而提高食用植物油的稳定性，延长产品的货架期。
由上述可知，角鲨烯具有很高的经济效益。但是角鲨烯在于动物、植物及微生物中的含量不高。深海鲨鱼是迄今为止从自然界发现的角鲨烯含量较高的动物体之一，随着人们对野生动物保护意识的增强，以鲨鱼为原料提取角鲨烯的途径并不可取，目前角鲨烯仍处于供不应求的状态。
然而，现有的角鲨烯的生产方法主要有植物萃取、化学合成以及生物合成等，植物萃取受限于植物周期且产量低；化学合成要求条件苛刻、生产过程安全性低，最主要的问题是工业合成的成本高昂；而生物合成的方法则采用廉价的培养基及易编辑、生长周期短的微生物，相对于化学合成苛刻的反应条件与高昂的成本，更为廉价、高效。
目前国外学者在生物合成角鲨烯方面做了一些开创性的工作，但由于这些方法在菌种和目的物的得率等方面都还不理想，且存在某些局限性，无法进行大规模生产。
生物合成角鲨烯是一种理想的途径，但关键是要找到一种非常合适且具有实用价值的微生物底盘。而大肠杆菌作为常用的模式生物通常具有以下几个优势：①生长速率快，繁殖迅速；②易于培养；③遗传背景简单；④易进行基因操作。因此，本技术通过改造大肠杆菌使其高效地合成角鲨烯是一种可行的“绿色”方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种角鲨烯工程菌株、角鲨烯合成质粒、细胞膜空间扩展质粒及制备方法，通过开发微生物细胞工厂合成角鲨烯，以较低成本来来提高角鲨烯的产量并实现大规模生产，带来了巨大经济效益的同时，还能减轻对自然生态的破坏。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：一种角鲨烯工程菌株的制备方法，包括以下步骤：
S1、提供IPP和DMAPP的pS-MVA质粒，pTrc99A质粒，以及大肠杆菌菌株E.coli DH5α；
S2、以大肠杆菌基因组为模版，扩增大肠杆菌ispA基因，经EcoRI和BamHI消化后插入到所述pTrc99A质粒的EcoRI和BamHI两位点之间，得到pT-ispA质粒；
S3、以酿酒酵母基因组为模板，扩增角鲨烯Erg9TC基因，经BamHI和Sall消化后插入到所述pT-ispA质粒的中，得到pT-IE质粒；
S4、以大肠杆菌基因组为模版扩增细胞膜空间基因uncF、plsB、mtlA、frdABCD、tsr，以小鼠cDNA为模板，扩增细胞膜空间基因Caveolin1；所获基因经过BglII(BamHI)和Sall(XhoI)消化后分别插入到所述pT-IE质粒的BglII和Sall位点，得到pT-IE-uncF质粒、pT-IE-FRD质粒、pT-IE-tsr质粒和pT-IE-CAV质粒；
S5、将所述pT-IE质粒、pT-IE-uncF质粒、pT-IE-FRD质粒、pT-IE-tsr质粒、pT-IE-CAV质粒中的任意一种与所述pS-MVA质粒共转化到所述大肠杆菌菌株E.coli DH5α中，构建得到角鲨烯工程菌株。
进一步地，步骤S2中，在所述扩增过程中，引物为：
上游引物ispA-F：
ACGAATTCATAAGGTAAAGGTATGGACTTTCCGCAGC；
下游引物ispA-R：
TCGGATCCTAAGATCTTATTTATTACGCTGGATG；
步骤S3中，在所述扩增过程中，引物为：
上游引物Erg9TC-F：
GCGGATCCAAGGAGATATATCAAATGGGAAAGCTATTACAATTGG；
下游引物Erg9TC-R：
TATCGTCGACTCTAAGATCTTAGTACTCTTCTTCTTGTTGG。
进一步地，步骤S4中，在所述扩增过程中，引物为：
上游引物uncF-F：
GCGGATCCAGAGGAATAATATATGAATCTTAACGCAACAATC；
下游引物uncF-R：
CTACTCGAGTTACAGTTCAGCGACAAGTTTATC；
上游引物FRD-F：
CGGGATCCAATCTGGAGGAATGTCGTGCAAACC；
下游引物FRD-R：
ACACTCGAGTTAGATTGTAACGACACCAATC；
上游引物tsr-F：
CGAGATCTAAGAGGAGTAAACCATGTTAAAACGTATC；
下游引物tsr-R：
ACACTCGAGATTAAAATGTTTCCCAGTTCTCC；
上游引物Erg9TC-Bam-F：
CGAGATCTAAGAGGAGTAAACCATGGCAGACGAGGTGACTGAG；
下游引物Erg9TC-Bam-R：
ACACTCGAGATTATATCTCTTTCTGCGTGCTGATG。
本发明还提供一种根据所述的角鲨烯工程菌株的制备方法所制得的角鲨烯工程菌株。
本发明还提供一种角鲨烯合成质粒的制备方法，包括以下步骤：
S1、提供pTrc99A质粒；
S2、以大肠杆菌基因组为模版，扩增大肠杆菌ispA基因，经EcoRI和BamHI消化后插入到所述pTrc99A质粒的EcoRI和BamHI两位点之间，得到pT-ispA质粒；
S3、以酿酒酵母基因组为模板，扩增角鲨烯Erg9TC基因，经BamHI和Sall消化后插入到所述pT-ispA质粒的中，得到pT-IE质粒。
进一步地，步骤S2中，在所述扩增过程中，引物为：
上游引物ispA-F：
ACGAATTCATAAGGTAAAGGTATGGACTTTCCGCAGC；
下游引物ispA-R：
TCGGATCCTAAGATCTTATTTATTACGCTGGATG；
步骤S3中，在所述扩增过程中，引物为：
上游引物Erg9TC-F：
GCGGATCCAAGGAGATATATCAAATGGGAAAGCTATTACAATTGG；
下游引物Erg9TC-R：
TATCGTCGACTCTAAGATCTTAGTACTCTTCTTCTTGTTGG。
本发明还提供一种根据所述的角鲨烯合成质粒的制备方法所制得的角鲨烯合成质粒。
本发明还提供一种细胞膜空间扩展质粒的制备方法，包括以下步骤：
S1、提供pTrc99A质粒和所述的角鲨烯合成质粒：pT-IE质粒；
S2、以大肠杆菌基因组为模版扩增细胞膜空间基因uncF、frdABCD、tsr，以小鼠cDNA为模板，扩增细胞膜空间基因Caveolin1；所获基因经过BglII(BamHI)和Sall(XhoI)消化后分别插入到所述pT-IE质粒的BglII和sall位点，得到pT-IE-uncF质粒、pT-IE-FRD质粒、pT-IE-tsr质粒和pT-IE-CAV质粒；所述细胞膜空间扩展质粒选自所述pT-IE-uncF质粒、pT-IE-FRD质粒、pT-IE-tsr质粒或pT-IE-CAV质粒中的任意一种。
进一步地，步骤S2中，在所述扩增过程中，引物为：
上游引物uncF-F：
GCGGATCCAGAGGAATAATATATGAATCTTAACGCAACAATC；
下游引物uncF-R：
CTACTCGAGTTACAGTTCAGCGACAAGTTTATC；
上游引物FRD-F：
CGGGATCCAATCTGGAGGAATGTCGTGCAAACC；
下游引物FRD-R：
ACACTCGAGTTAGATTGTAACGACACCAATC；
上游引物tsr-F：
CGAGATCTAAGAGGAGTAAACCATGTTAAAACGTATC；
下游引物tsr-R：
ACACTCGAGATTAAAATGTTTCCCAGTTCTCC；
上游引物Erg9TC-Bam-F：
CGAGATCTAAGAGGAGTAAACCATGGCAGACGAGGTGACTGAG；
下游引物Erg9TC-Bam-R：
ACACTCGAGATTATATCTCTTTCTGCGTGCTGATG。
本发明还提供一种根据所述的细胞膜空间扩展质粒的制备方法所制得的细胞膜空间扩展质粒。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：本发明的角鲨烯工程菌株、角鲨烯合成质粒及其制备方法在大肠杆菌中合成角鲨烯的绿色合成方法，可以减少对自然资源的依赖和过度开发。并且，其成本较低，能实现大规模的角鲨烯生产，具有巨大的经济效益。
同时，在角鲨烯工程菌株的制备过程中研发了一种细胞膜空间扩展质粒及其制备方法，通过诱导细胞膜折叠来增加膜面积提供更多的场所来储存角鲨烯，从而进一步提高角鲨烯在大肠杆菌合成的产量。该细胞膜空间扩展质粒还能应用于其他类似脂溶性产品，如番茄红素，虾青素等生物，有助于其合成产量的提高。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。
附图说明
图1为本发明实施例一中通过气相色谱(A)和质谱(B)法鉴定角鲨烯在大肠杆菌中的合成的结果图(1为SQ-00工程菌株提取物，SQ为角鲨烯标准品)；
图2为本发明实施例一中角鲨烯合成菌株SQ-0和SQ-00细胞生长和合成角鲨烯产量随时间变化图(空心圆代表SQ-0，实心圆代表SQ-00，误差来自于两次生物重复)；
图3为本发明实施例二中拓展细胞膜的空间对细胞生长和角鲨烯产量的影响结果图(空心柱与实心柱分别表示24h和48h数据，误差来自于两次生物重复)；
图4为本发明实施例三中角鲨烯工程菌株SQ-02的透射电镜图(120kV)。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
需要说明的是：本发明以下实施例中，采用的供试菌株为大肠杆菌E.coli DH5α，IPP和DMAPP的pS-MVA质粒可参考中国专利CN108300726自行制备或市面购买，其他质粒、各种酶和试剂均可从市面上购买。
本发明的角鲨烯工程菌株的详细制备过程如下：
(一)制备角鲨烯合成质粒(以pTrc99A质粒为骨架质粒)
将大肠杆菌ispA基因片段经PCR以大肠杆菌基因组DNA为模版扩增获取，扩增所得基因片段经过EcoRI和BamHI消化后插入到pTrc99A载体质粒的EcoRI和BamHI两位点之间，获得质粒pT-ispA。再将截短的角鲨烯合成酶Erg9TC基因经PCR以酿酒酵母基因组为模板DNA扩增获取，经过BamHI和Sall消化后分别插入到pTrc99A和pT-ispA的相应位点获得角鲨烯合成质粒质粒pT-E和pT-IE。
在ispA基因片段扩增过程中，扩增的上游引物ispA-F的序列为：
5’-ACGAATTCATAAGGTAAAGGTATGGACTTTCCGCAGC-3’；
下游引物ispA-R的序列为：
5’-TCGGATCCTAAGATCTTATTTATTACGCTGGATG-3’。
在角鲨烯Erg9TC基因扩增过程中，扩增的上游引物Erg9TC-F的序列为:
5’-GCGGATCCAAGGAGATATATCAAATGGGAAAGCTATTACAATTGG-3’；
下游引物Erg9TC-R的序列为:
5’-TATCGTCGACTCTAAGATCTTAGTACTCTTCTTCTTGTTGG-3’。
(二)制备细胞膜空间拓展质粒(以pT-IE质粒为底盘质粒)
以大肠杆菌基因组为模版扩增细胞膜空间基因uncF、plsB、mtlA、frdABCD、tsr，以小鼠cDNA为模板，扩增细胞膜空间基因Caveolin1；所获基因经过BglII(BamHI)和Sall(XhoI)消化后分别插入到所述pT-IE质粒的BglII和Sall位点，得到pT-IE-uncF质粒、pT-IE-pslB质粒、pT-IE-mtlA质粒、pT-IE-FRD质粒、pT-IE-tsr质粒和pT-IE-CAV质粒。
在细胞膜空间基因uncF、plsB、mtlA、frdABCD、tsr扩增过程中，引物为：
上游引物uncF-F：
5’-GCGGATCCAGAGGAATAATATATGAATCTTAACGCAACAATC-3’；
下游引物uncF-R：
5’-CTACTCGAGTTACAGTTCAGCGACAAGTTTATC-3’；
上游引物plsB-F：
5’-CTAGATCTAAGAGGTATCGTTTATGTCCGGCTGGCCACG-3’；
下游引物plsB-R：
5’-ACACTCGAGGCAATTCTCTCTGATTACC-3’；
上游引物mtlA-F：
5’-CTGGATCCAAGAAGGGGTGTTTTTATGTCATCCG-3’；
下游引物mtlA-R：
5’-GTACTCGAGGTGGGATTGGATTACTTACGACC-3’；
上游引物FRD-F：
5’-CGGGATCCAATCTGGAGGAATGTCGTGCAAACC-3’；
下游引物FRD-R：
5’-ACACTCGAGTTAGATTGTAACGACACCAATC-3’；
上游引物tsr-F：
5’-CGAGATCTAAGAGGAGTAAACCATGTTAAAACGTATC-3’；
下游引物tsr-R：
5’-ACACTCGAGATTAAAATGTTTCCCAGTTCTCC-3’。
在细胞膜空间基因Caveolin1扩增过程中，引物为：
上游引物Erg9TC-Bam-F：
5’-CGAGATCTAAGAGGAGTAAACCATGGCAGACGAGGTGACTGAG-3’；
下游引物Erg9TC-Bam-R：
5’-ACACTCGAGATTATATCTCTTTCTGCGTGCTGATG-3’。
(三)合成角鲨烯工程菌株
将所述pT-E质粒、pT-IE质粒、pT-IE-FRD质粒、pT-IE-tsr质粒、pT-IE-mtlA质粒、pT-IE-pslB质粒、pT-IE-CAV质粒、pT-IE-uncF质粒分别与所述pS-MVA质粒共转化到所述大肠杆菌菌株E.coli DH5α中，构建得到角鲨烯工程菌株SQ-0、SQ-00、SQ-01、SQ-02、SQ-03、SQ-03、SQ-05、SQ-06。
在制备过程中，工程菌株进行质粒抽提前培养时使用的是2YT培养基，质粒转化之后单菌落的培养使用的是LB固体培养基，2YT和LB固体培养基的配方如下：2YT培养基(500mL)：蛋白胨8g，酵母提取物5g，NaCl 2.5g，pH7.0。LB固体培养基(1000mL)：蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，琼脂15g，pH7.0。将配制好的2YT培养基和LB固体培养基分装于1L容积的蓝盖瓶和200mL的三角瓶中，三角瓶用纱布和牛皮纸包扎好，蓝盖瓶的瓶盖稍微松动，然后放进高压蒸汽灭菌锅中进行灭菌，灭菌条件为121℃，0.1Mpa，灭菌15分钟。
在对角鲨烯工程菌株进行培养时，优选的，采用两级培养方式进行，具体的：挑取在固体培养基划线培养过夜的单菌落接种种子培养基，在37℃摇床振荡培养至OD600为3左右。种子培养基为胰蛋白胨16g/L、酵母抽提物10g/L、氯化钠5g/L、氨苄青霉素100mg/L和氯霉素50mg/L。将培养好的种子按0.1OD600接种到主培培养基，。在30℃摇床振荡培养到规定时间。主培培养基为胰蛋白胨16g/L、酵母抽提物10g/L、氯化钠5g/L、2％(v/v)甘油、IPTG0.2mM、氨苄青霉素100mg/L和氯霉素50mg/L。
对大肠杆菌进行角鲨烯提取和产量测定优选采用以下方法：角鲨烯产量的测定通过气相色谱(GC)法进行。摇瓶培养到规定时间(如48h)后收集细胞，通过MeOH/CHCl3(1:2)抽提两次，合并CHCl3相并低温真空挥发干燥，再以乙酸乙酯溶解；上样1μL到气相色谱仪。柱温箱控温程序为：50℃保持1min；以20℃/min升温到200℃，然后再以10℃/min升温到260℃，保持2min。色谱柱为安捷伦HP-INNOWAX 133。测量析出角鲨烯峰面积，以角鲨烯标准品标产量。
下面将结合具体实施例进行说明。
实施例一角鲨烯合成质粒pT-IE在大肠杆菌中的应用
采用上述方法制备角鲨烯工程菌株，将角鲨烯工程菌株SQ-0、SQ-00、SQ-01、SQ-02、SQ-03、SQ-03、SQ-05、SQ-06分别置于摇瓶中培养48h，抽提角鲨烯。TCL分析显示一条与角鲨烯标准品位置的层析带。
请参见图1，气相色谱分析显示在保留时间17.82min有一个明显大峰与标准品相同，并且，气质联用分析(GC-MS)确定为角鲨烯。
培养SQ-0和SQ-00菌株，分别在培养24h、48h和72h时收集菌体测定其细胞含量和角鲨烯合成产量。请参见图2，两菌株在生长方面没有明显差异，但是SQ-00菌株的角鲨烯产量明显高于SQ-0菌株，说明过表达ispA基因片段(FPP合成酶)后FPP库充足，角鲨烯产量明显提升。且，SQ-00在48h时获取最大产量约280mg/L。
故，本实施例显示角鲨烯合成质粒pT-IE与pS-MVA质粒共转化到大肠杆菌菌株E.coli DH5α中，能大幅度提高大肠杆菌的角鲨烯产量。
实施例二细胞膜面积大小对大肠杆菌中角鲨烯产量的影响
发明人在实验过程中发现，角鲨烯呈脂溶性并最终储存在细胞膜上，但有限的细胞膜大小使角鲨烯储存量受限，因此，可通过扩大膜的面积来提高角鲨烯在大肠杆菌中的储存量，进而增加角鲨烯的产量。
培养SQ-01，SQ-02，SQ-03，SQ-04，SQ-05，SQ-06菌株，分别在培养24h和48h时收集菌体测定其细胞含量和角鲨烯合成产量。请参见图3，工程菌株SQ-03和SQ-04与SQ00表现出显著的细胞抑制和角鲨烯产量降低。菌株细胞SQ-01，SQ-02，SQ-05，SQ-06在生长方面没有表现出不同，产量在24h时比SQ-00要低，但是在48h时均有所提高，分别对应过表达基因frdABCD、tsrCAV和uncF。特别是过表达基因tsr的工程菌株SQ-02的产量达到近600mg/L。
故，本实施例显示细胞膜空间扩展质粒pT-IE-FRD、pT-IE-tsr、pT-IE-CAV、pT-IE-uncF能增加大肠杆菌的细胞膜面积，进而提高角鲨烯产量。
实施例三角鲨烯工程菌株SQ-02的细胞膜面积
本实施例用甲醛固定SQ-02细胞，制备透射电镜样品观察细胞膜的形态结构。请参见图4，其表明过表达tsr诱导细胞膜结构拓展从而将角鲨烯产量提高2倍多。
本发明中所公开的细胞膜空间扩展质粒不仅可以用于提高大肠杆菌的细胞膜面积，进而提高角鲨烯产量，其在其他实施例中还能应用于其他类似脂溶性产品，如番茄红素，虾青素等生物。
综上所述：本发明的角鲨烯工程菌株、角鲨烯合成质粒及其制备方法在大肠杆菌中合成角鲨烯的绿色合成方法，可以减少对自然资源的依赖和过度开发。并且，其成本较低，能实现大规模的角鲨烯生产，具有巨大的经济效益。
同时，在角鲨烯工程菌株的制备过程中研发了一种细胞膜空间扩展质粒及其制备方法，通过诱导细胞膜折叠来增加膜面积提供更多的场所来储存角鲨烯，从而进一步提高角鲨烯在大肠杆菌合成的产量。该细胞膜空间扩展质粒还能应用于其他类似脂溶性产品，如番茄红素，虾青素等生物，有助于其合成产量的提高。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Figure BDA0002487878530000121
Figure BDA0002487878530000131
Figure BDA0002487878530000141
Figure BDA0002487878530000151
Figure BDA0002487878530000161
序列表
<110> 苏州大学
<120> 角鲨烯工程菌株、角鲨烯合成质粒、细胞膜空间扩展质粒及制备方法
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列-ispA-F(Artificial Sequence)
<400> 1
acgaattcat aaggtaaagg tatggacttt ccgcagc 37
<210> 2
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列- ispA-R(Artificial Sequence)
<400> 2
tcggatccta agatcttatt tattacgctg gatg 34
<210> 3
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列- Erg9TC-F(Artificial Sequence)
<400> 3
gcggatccaa ggagatatat caaatgggaa agctattaca attgg 45
<210> 4
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列-Erg9TC-R(Artificial Sequence)
<400> 4
tatcgtcgac tctaagatct tagtactctt cttcttgttg g 41
<210> 5
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列-uncF-F(Artificial Sequence)
<400> 5
gcggatccag aggaataata tatgaatctt aacgcaacaa tc 42
<210> 6
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列-uncF-R(Artificial Sequence)
<400> 6
ctactcgagt tacagttcag cgacaagttt atc 33
<210> 7
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列-FRD-F(Artificial Sequence)
<400> 7
cgggatccaa tctggaggaa tgtcgtgcaa acc 33
<210> 8
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列-FRD-R(Artificial Sequence)
<400> 8
acactcgagt tagattgtaa cgacaccaat c 31
<210> 9
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列-tsr-F(Artificial Sequence)
<400> 9
cgagatctaa gaggagtaaa ccatgttaaa acgtatc 37
<210> 10
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列-tsr-R(Artificial Sequence)
<400> 10
acactcgaga ttaaaatgtt tcccagttct cc 32
<210> 11
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列-Erg9TC-Bam-F(Artificial Sequence)
<400> 11
cgagatctaa gaggagtaaa ccatggcaga cgaggtgact gag 43
<210> 12
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列-Erg9TC-Bam-R(Artificial Sequence)
<400> 12
acactcgaga ttatatctct ttctgcgtgc tgatg 35
<210> 13
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列-plsB-F(Artificial Sequence)
<400> 13
ctagatctaa gaggtatcgt ttatgtccgg ctggccacg 39
<210> 14
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列-plsB-R(Artificial Sequence)
<400> 14
acactcgagg caattctctc tgattacc 28
<210> 15
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列-mtlA-F(Artificial Sequence)
<400> 15
ctggatccaa gaaggggtgt ttttatgtca tccg 34
<210> 16
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列-mtlA-R(Artificial Sequence)
<400> 16
gtactcgagg tgggattgga ttacttacga cc 32

Claims (10)

1.一种角鲨烯工程菌株的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、提供IPP和DMAPP的pS-MVA质粒，pTrc99A质粒，以及大肠杆菌菌株E.coli DH5α；
S2、以大肠杆菌基因组为模版，扩增大肠杆菌ispA基因，经EcoRI和BamHI消化后插入到所述pTrc99A质粒的EcoRI和BamHI两位点之间，得到pT-ispA质粒；
S3、以酿酒酵母基因组为模板，扩增角鲨烯Erg9TC基因，经BamHI和Sall消化后插入到所述pT-ispA质粒的中，得到pT-IE质粒；
S4、以大肠杆菌基因组为模版扩增细胞膜空间基因uncF、frdABCD、tsr，以小鼠cDNA为模板，扩增细胞膜空间基因Caveolin1；所获基因经过BglII(BamHI)和Sall(XhoI)消化后分别插入到所述pT-IE质粒的BglII和Sall位点，得到pT-IE-uncF质粒、pT-IE-FRD质粒、pT-IE-tsr质粒和pT-IE-CAV质粒；
S5、将pT-IE质粒、pT-IE-uncF质粒、pT-IE-FRD质粒、pT-IE-tsr质粒、pT-IE-CAV质粒中的任意一种与所述pS-MVA质粒共转化到所述大肠杆菌菌株E.coli DH5α中，构建得到角鲨烯工程菌株。
2.如权利要求1所述角鲨烯工程菌株的制备方法，其特征在于，步骤S2中，在所述扩增过程中，引物为：
上游引物ispA-F：
ACGAATTCATAAGGTAAAGGTATGGACTTTCCGCAGC；
下游引物ispA-R：
TCGGATCCTAAGATCTTATTTATTACGCTGGATG；
步骤S3中，在所述扩增过程中，引物为：
上游引物Erg9TC-F：
GCGGATCCAAGGAGATATATCAAATGGGAAAGCTATTACAATTGG；
下游引物Erg9TC-R：
TATCGTCGACTCTAAGATCTTAGTACTCTTCTTCTTGTTGG。
3.如权利要求1所述角鲨烯工程菌株的制备方法，其特征在于，步骤S4中，在所述扩增过程中，引物为：
上游引物uncF-F：
GCGGATCCAGAGGAATAATATATGAATCTTAACGCAACAATC；
下游引物uncF-R：
CTACTCGAGTTACAGTTCAGCGACAAGTTTATC；
上游引物FRD-F：
CGGGATCCAATCTGGAGGAATGTCGTGCAAACC；
下游引物FRD-R：
ACACTCGAGTTAGATTGTAACGACACCAATC；
上游引物tsr-F：
CGAGATCTAAGAGGAGTAAACCATGTTAAAACGTATC；
下游引物tsr-R：
ACACTCGAGATTAAAATGTTTCCCAGTTCTCC；
上游引物Erg9TC-Bam-F：
CGAGATCTAAGAGGAGTAAACCATGGCAGACGAGGTGACTGAG；
下游引物Erg9TC-Bam-R：
ACACTCGAGATTATATCTCTTTCTGCGTGCTGATG。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的角鲨烯工程菌株的制备方法所制得的角鲨烯工程菌株。
5.一种角鲨烯合成质粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、提供pTrc99A质粒；
S2、以大肠杆菌基因组为模版，扩增大肠杆菌ispA基因，经EcoRI和BamHI消化后插入到所述pTrc99A质粒的EcoRI和BamHI两位点之间，得到pT-ispA质粒；
S3、以酿酒酵母基因组为模板，扩增角鲨烯Erg9TC基因，经BamHI和Sall消化后插入到所述pT-ispA质粒的中，得到pT-IE质粒。
6.如权利要求5所述的角鲨烯合成质粒的制备方法，其特征在于，步骤S2中，在所述扩增过程中，引物为：
上游引物ispA-F：
ACGAATTCATAAGGTAAAGGTATGGACTTTCCGCAGC；
下游引物ispA-R：
TCGGATCCTAAGATCTTATTTATTACGCTGGATG；
步骤S3中，在所述扩增过程中，引物为：
上游引物Erg9TC-F：
GCGGATCCAAGGAGATATATCAAATGGGAAAGCTATTACAATTGG；
下游引物Erg9TC-R：
TATCGTCGACTCTAAGATCTTAGTACTCTTCTTCTTGTTGG。
7.根据权利要求5或6所述的角鲨烯合成质粒的制备方法所制得的角鲨烯合成质粒。
8.一种细胞膜空间扩展质粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、提供pTrc99A质粒和如权利要求7所述的角鲨烯合成质粒：pT-IE质粒；
S2、以大肠杆菌基因组为模版扩增细胞膜空间基因uncF、frdABCD、tsr，以小鼠cDNA为模板，扩增细胞膜空间基因Caveolin1；所获基因经过BglII(BamHI)和Sall(XhoI)消化后分别插入到所述pT-IE质粒的BglII和Sall位点，得到pT-IE-uncF质粒、pT-IE-FRD质粒、pT-IE-tsr质粒和pT-IE-CAV质粒；所述细胞膜空间扩展质粒选自所述pT-IE-uncF质粒、pT-IE-FRD质粒、pT-IE-tsr质粒或pT-IE-CAV质粒中的任意一种。
9.如权利要求8所述的细胞膜空间扩展质粒的制备方法，其特征在于，步骤S2中，在所述扩增过程中，引物为：
上游引物uncF-F：
GCGGATCCAGAGGAATAATATATGAATCTTAACGCAACAATC；
下游引物uncF-R：
CTACTCGAGTTACAGTTCAGCGACAAGTTTATC；
上游引物FRD-F：
CGGGATCCAATCTGGAGGAATGTCGTGCAAACC；
下游引物FRD-R：
ACACTCGAGTTAGATTGTAACGACACCAATC；
上游引物tsr-F：
CGAGATCTAAGAGGAGTAAACCATGTTAAAACGTATC；
下游引物tsr-R：
ACACTCGAGATTAAAATGTTTCCCAGTTCTCC；
上游引物Erg9TC-Bam-F：
CGAGATCTAAGAGGAGTAAACCATGGCAGACGAGGTGACTGAG；
下游引物Erg9TC-Bam-R：
ACACTCGAGATTATATCTCTTTCTGCGTGCTGATG。
10.根据权利要求8或9所述的细胞膜空间扩展质粒的制备方法所制得的细胞膜空间扩展质粒。
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