CN108300726A - α-红没药醇合成质粒及其构建方法与大肠杆菌工程菌株 - Google Patents

α-红没药醇合成质粒及其构建方法与大肠杆菌工程菌株 Download PDF

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Abstract

本发明公开了α‑红没药醇合成质粒及其构建方法与大肠杆菌工程菌株，构建IPP和DMAPP合成质粒pS‑MVA以及α‑红没药醇合成质粒，再将两种质粒共同导入到大肠杆菌菌株E.coli DH5α。α‑红没药醇合成质粒是以pTrc99A载体为骨架质粒，组装有大肠杆菌基因ispA和一个不同来源的人工合成型α‑红没药醇合成酶基因或野生型α‑红没药醇合成酶基因；人工合成型α‑红没药醇合成酶基因选自AaBBS、LdBBS、MrBBS、ScBBS以及SsBBS中一种；野生型α‑红没药醇合成酶基因选自LdBBS、ScBBS以及MrBBS中一种。本发明利用生物方法合成了α‑红没药醇，产量高，活性高，绿色环保。

Description

α-红没药醇合成质粒及其构建方法与大肠杆菌工程菌株
技术领域
本发明属于代谢工程领域，具体涉及一种α-红没药醇合成质粒及其构建方法与大肠杆菌工程菌株和应用。
背景技术
α-红没药醇（bisabolol）又称甜没药醇，是自然界中存在的一种天然倍半萜醇。它有几种旋光异构体如下所示：
他们分别在医药，食品和化妆品等行业发挥着重要的作用。(-)-α-红没药醇主要存在于菊科植物春黄菊花（Matricaria recutita）等植物中，具有抗菌、抗炎、抗微生物、抗消化等作用。它作为活性成分用于皮肤化妆品或抑制皮肤炎症，以保护和护理过敏性皮肤等。
美洲本土草药甜舌草（Lippia dulcis）中含有的荷南度辛（hernandulcin）是一种天然的高效甜味剂，其的主链就是(+)-α-红没药醇。荷南度辛具有比蔗糖千倍以上的增甜能力，且不会像其它的合成甜味剂（如糖精、阿斯巴甜和三氯蔗糖）等对人体产生不好的影响。它可以作为理想的蔗糖的替代品为肥胖和糖尿病人群提供更好的甜品食物体验，而不产生高热量负担。因此，利用(+)-α-红没药醇合成荷南度辛，值得期待。此外，红没药醇还会散发出清淡令人愉快的香气，也是一种稳定性优良的定香剂，日益在香料香精化妆品的应用中受到重视。然而，α-红没药醇作为次级代谢产物，天然产量有限，以现行的生物质直接提取方式获取α-红没药醇还受制于生物体生长周期、环境、地域等诸多因素，且生产规模的扩张会危及生态和环境安全，甚至造成濒危植物消失的生态灾难。若采用化学合成的方式，α-红没药醇复杂手性化学结构，使得直接化学合成难度高，纯度低，生物活性差。
大肠杆菌(Escherichia coli)作为最为广泛的模式微生物，相较于植物细胞，甚至其它一些微生物，具有生长周期短、遗传背景清晰、遗传操作简单成熟和易于规模扩大化培养等优点，因此，利用合成生物构建大肠杆菌微细胞工厂可以实现以廉价的碳源和培养基生产具有高附加值和广泛用途的α-红没药醇，是一条可持续发展的替代途径。
发明内容
本发明目的是提供一种α-红没药醇合成质粒及其构建方法与大肠杆菌工程菌株和应用，本发明构建了一种α-红没药醇合成质粒并导入大肠杆菌中获得大肠杆菌工程菌株，在大肠杆菌工程菌株合成α-红没药醇，还通过合成生物学方法优化工程菌株提高α-红没药醇产量。
为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：一种α-红没药醇合成质粒，α-红没药醇合成质粒是以pTrc99A载体为骨架质粒，该骨架质粒上组装有大肠杆菌基因ispA和一个不同来源的人工合成型α-红没药醇合成酶基因或野生型α-红没药醇合成酶基因；所述人工合成型α-红没药醇合成酶基因选自人工合成型AaBBS基因、人工合成型LdBBS 基因、人工合成型MrBBS基因、人工合成型ScBBS基因以及人工合成型SsBBS基因中的任意一种，核苷酸序列分别如序列表SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4以及SEQ ID No.5所示，相对应地，所述α-红没药醇合成质粒被分别命名为pT-IAa、pT-ILd、pT-IMr、pT-ISc以及pT-ISs；所述野生型α-红没药醇合成酶基因选自野生型LdBBS基因、野生型ScBBS基因以及野生型MrBBS基因中的任意一种，相对应的，所述α-红没药醇合成质粒被分别命名为pT-ILdWT、pT-IScWT和pT-IMrWT。
当骨架质粒上组装有大肠杆菌基因ispA和一个不同来源的人工合成型α-红没药醇合成酶基因时，所述α-红没药醇合成质粒的构建方法，包括如下步骤：
（1）ispA 基因片段经PCR以大肠杆菌MG1655基因组DNA为模版扩增获取，扩增的上游引物ispA-EcoR-F的序列为5’-ACGAATTCATAAGGTAAAGGTATGGACTTTCCGCAGC-3’和下游引物ispA-BamH-R的序列为5’- TCGGATCCTAAGATCTTATTTATTACGCTGGATG-3’；扩增所得基因片段经过EcoRI和BamHI消化后插入到pTrc99A载体的EcoRI和BamHI两位点之间，获得质粒pT-ispA；
（2）所述人工合成型α-红没药醇合成酶基因克隆在所述质粒pT-ispA的BamHI和SalI位点之间，即分别获得质粒pT-IMr、pT-ILd、pT-IAa、pT-ISc、pT-ISs。
当骨架质粒上组装有大肠杆菌基因ispA和一个不同来源的野生型α-红没药醇合成酶基因时，所述α-红没药醇合成质粒的构建方法，包括如下步骤：
（1）ispA 基因片段经PCR以大肠杆菌MG1655基因组DNA为模版扩增获取，扩增的上游引物ispA-EcoR-F的序列为5’-ACGAATTCATAAGGTAAAGGTATGGACTTTCCGCAGC-3’和下游引物ispA-BamH-R的序列为5’- TCGGATCCTAAGATCTTATTTATTACGCTGGATG-3’；扩增所得基因片段经过EcoRI和BamHI消化后插入到pTrc99A载体的EcoRI和BamHI两位点之间，获得质粒pT-ispA；
（2）所述野生型ScBBS基因通过PCR的方法从 S. citricolor基因组DNA扩增获取，所述野生型LdBBS和野生型MrBBS基因从相应的cDNA中扩增获取；所用基因引物序列如下：
上游引物ScBBSWT–F的序列为 5’-GTGGATCCAAGGAGATATATCAAATGAACTCCCTCCTCCACGCCGCAGAG-3’；
下游引物ScBBSWT-R的序列为5’-TAGCTCGAGAAGGCCCGTGCGTGTCATGGGTGGTAG-3’；
上游引物LdBBSWT-F的序列为 5’-AGTGGATCCAAGGAGATATATCAAATGAATTCCACATCCAGGAGATC-3’；
下游引物LdBBSWT-R的序列为5’-TATCGTCGACTTATGGAAGAGGAATGGGTTC-3’；
上游引物MrBBSWT-F的序列为5’-TGGATCCAAGGAGATATATCAAATGTCAACTTTATCAGTTTCTAC-3’；
下游引物MrBBSWT–R的序列为5’-TAGAGTCGACTTAGACAATCATAGGGTGAACGAAG-3’；
（3）将步骤（2）扩增所得的基因片段插入到质粒pT-ispA的BamHI和SalI 位点之间，即分别获得质粒pT-ILdWT、pT-IMrWT和pT-IScWT。
一种大肠杆菌工程菌株，是由下列方法构建得到的：
（1）由粪肠球菌基因mvaES、 肺炎链球菌基因mvaK1DK2 以及大肠杆菌基因idi组成完整的IPP和DMAPP合成操纵子，将IPP和DMAPP合成操纵子克隆到pSTV28质粒的EcoRI 和HindIII 两个限制性内切酶位点之间，并受乳糖启动子lac的驱动，得到IPP和DMAPP合成质粒pS-MVA；
（2）按照权利要求2或3所述的构建方法构建权利要求1所述的α-红没药醇合成质粒，所述α-红没药醇合成质粒选自pT-IAa、pT-ILd、pT-IMr、pT-ISc以及pT-ISs中的任意一种，或者所述α-红没药醇合成质粒选自pT-ILdWT、pT-IScWT以及pT-IMrWT中的任意一种；
（3）将步骤（2）获得的α-红没药醇合成质粒与所述IPP和DMAPP合成质粒pS-MVA一起共转化到大肠杆菌菌株E. coli DH5α中，得到大肠杆菌工程菌株。
所述大肠杆菌工程菌株在大肠杆菌合成α-红没药醇中的应用，具体步骤如下：挑取在固体培养基划线培养过夜的单菌落接种种子培养基，在30~37℃摇床振荡培养至OD600为3左右。种子培养基为胰蛋白胨16g/L、酵母抽提物10g/L、氯化钠5g/L、氨苄青霉素100mg/L和氯霉素50mg/L。将培养好的种子按0.1 OD600接种到主培培养基， 再覆盖1/4培养体积的癸烷；在30℃摇床振荡培养到规定时间。主培培养基为胰蛋白胨16g/L、酵母抽提物10g/L、氯化钠5g/L、2% (v/v) 甘油、IPTG 0.2mM、氨苄青霉素 100mg/L和氯霉素50mg/L。
上述技术方案中的有关内容解释如下：
1、上述方案中，所述野生型LdBBS基因的Genbank登录号为JQ731636、野生型ScBBS基因的Genbank登录号为AB621339以及野生型MrBBS基因的Genbank登录号为KJ020282。
2、上述方案中，所述粪肠球菌的拉丁名为Enterococcus faecalis，所述肺炎链球菌的拉丁名为Streptococcus pneumoniae。
3、上述方案中，所述人工合成型AaBBS 基因的来源具体为黄花蒿（Artemisia annua）α-红没药醇合成酶基因AaBBS；人工合成型LdBBS 基因的来源具体为甜舌草（Lippia dulcis）α-红没药醇合成酶基因LdBBS；人工合成型MrBBS基因的来源具体为春黄菊花（Matricaria recutita）α-红没药醇合成酶基因（MrBBS）；人工合成型ScBBS基因的来源具体为放线菌（Streptomyces citricolor）α-红没药醇合成酶基因；人工合成型SsBBS基因的来源具体为 澳洲檀香（Santalum spicatum）α-红没药醇合成酶基因SsBBS。
4、上述方案中，pSTV28质粒是现有的可通过商业渠道购买的质粒，生产厂家为Takara；IPP和DMAPP合成质粒pS-MVA的构建可参考现有技术文献：Yoon S. H., Lee S.H., Das A. et al. (2009). Combinatorial expression of bacterial wholemevalonate pathway for the production of β-carotene in E. coli. J Biotechnol140, 218-226。
本发明的设计特点以及有益效果是：如同所有的萜类化合物一样，α-红没药醇的合成起始于异戊二烯焦磷酸（IPP， isopentenyl diphosphate）和其异构体双甲基丙烯基焦磷酸（DMAPP, dimethylallyl diphosphate）。此两个焦磷酸前体在自然界中可以通过甲基赤藓糖醇（MEP）路径和甲羟戊酸（MVA）路径进行合成。MEP路径起始于甘油醛-3-磷酸和丙酮酸，主要存在于原核生物及植物质体中；MVA路径起始于乙酰辅酶A，主要存在于真核生物和少量细菌中。大肠杆菌具有一条天然的MEP路径，外源导入由6个酶基因（mvaES、 mvaK1DK2、 idi）组成MVA途径同样可以实现IPP和DMAPP的大量合成。这两种基本的结构单元在法尼烯基焦磷酸（FPP，farnesyl diphosphate）的催化下可以合成FPP，然后经过α-红没药醇合成酶继续催化脱磷、环化和水和反应形成靶产物α-红没药醇，参见附图1所示。本发明创造性地构建了α-红没药醇合成质粒，α-红没药醇合成质粒上可以克隆有经密码子优化的人工合成型α-红没药醇合成酶基因或野生型α-红没药醇合成酶基因。也就是说，本发明构建IPP和DMAPP合成质粒pS-MVA以及α-红没药醇合成质粒，再将两种质粒共同导入到大肠杆菌菌株E. coli DH5α，进而利用生物方法合成了α-红没药醇，产量高，活性高，绿色环保。
附图说明
附图1为本发明的α-红没药醇在大肠杆菌中的合成通路和构建示意图；
附图2为本发明的pSTV28质粒的结构图；
附图3为本发明的pTrc99A载体质粒的结构图；
附图4为本发明的pT-IMr、pT-ILd、pT-IAa、pT-ISc、pT-ISs以及pT-ILdWT、pT-IMrWT和pT-IScWT 载体构建路线图；
附图5为实施例的大肠杆菌工程菌株的菌株1合成(+)-α-红没药醇的GC-MS分析；
附图6为实施例的α-红没药醇在不同大肠杆菌工程菌株中的产量；
附图7为实施例的α-红没药醇在不同大肠杆菌工程菌株中的生长状况；
附图8为实施例的优化核糖体结合位点序列（RBS）提高α-红没药醇产量；
附图9为优化基因顺序提高α-红没药醇产量；
附图10为增加碳源供给提高α-红没药醇产量；
附图11为优化核糖体结合位点序列（RBS）的pT-IiMrj载体构建图；
附图12为优化核糖体结合位点序列（RBS）的pT-MrjIi载体构建图。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：
实施例1：α-红没药醇合成质粒及其构建方法与大肠杆菌工程菌株
1、α-红没药醇合成质粒及其构建
α-红没药醇合成质粒是以pTrc99A载体为骨架质粒，该骨架质粒上组装有大肠杆菌基因ispA和一个不同来源的人工合成型α-红没药醇合成酶基因或野生型α-红没药醇合成酶基因；所述人工合成型α-红没药醇合成酶基因选自密码子优化的人工合成型AaBBS 基因、人工合成型LdBBS 基因、人工合成型MrBBS基因、人工合成型ScBBS基因以及人工合成型SsBBS基因中的任意一种，核苷酸序列分别如序列表SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ IDNo.3、SEQ ID No.4以及SEQ ID No.5所示，相对应的，所述α-红没药醇合成质粒被分别命名为pT-IAa、pT-ILd、pT-IMr、pT-ISc以及pT-ISs；所述野生型α-红没药醇合成酶基因选自野生型LdBBS基因、野生型ScBBS基因以及野生型MrBBS基因中的任意一种，所述野生型LdBBS基因的Genbank登录号为JQ731636、野生型ScBBS基因的Genbank登录号为AB621339以及野生型MrBBS基因的Genbank登录号为KJ020282；相对应地，所述α-红没药醇合成质粒被分别命名为pT-ILdWT、pT-IScWT和pT-IMrWT。
当骨架质粒上组装有大肠杆菌基因ispA和一个不同来源的人工合成型α-红没药醇合成酶基因时，所述α-红没药醇合成质粒的构建方法，包括如下步骤：
（1）ispA 基因片段经PCR以大肠杆菌MG1655基因组DNA为模版扩增获取，扩增的上游引物ispA-EcoR-F的序列为5’-ACGAATTCATAAGGTAAAGGTATGGACTTTCCGCAGC-3’（ 如SEQ IDNo.6所示）和下游引物ispA-BamH-R的序列为5’- TCGGATCCTAAGATCTTATTTATTACGCTGGATG-3’ （ 如SEQ ID No.7所示）；扩增所得基因片段经过EcoRI和BamHI消化后插入到pTrc99A载体的EcoRI和BamHI两位点之间，获得质粒pT-ispA；
（2）所述密码子优化的人工合成型α-红没药醇合成酶基因在合成时分别在质粒pT-ispA的上游引入BamHI位点， 在下游引入BglII和SalI位点，密码子优化的人工合成型α-红没药醇合成酶基因经BamHI和SalI消化后插入到pT-ispA的BamHI和SalI位点之间，即分别获得质粒pT-IMr、pT-ILd、pT-IAa、pT-ISc、pT-ISs。
当骨架质粒上组装有大肠杆菌基因ispA和一个不同来源的野生型α-红没药醇合成酶基因时，所述α-红没药醇合成质粒的构建方法，包括如下步骤：
（1）ispA 基因片段经PCR以大肠杆菌MG1655基因组DNA为模版扩增获取，扩增的上游引物ispA-EcoR-F的序列为5’-ACGAATTCATAAGGTAAAGGTATGGACTTTCCGCAGC-3’ （ 如SEQ IDNo.6所示）和下游引物ispA-BamH-R的序列为5’- TCGGATCCTAAGATCTTATTTATTACGCTGGATG-3’ （ 如SEQ ID No.7所示）；扩增所得基因片段经过EcoRI和BamHI消化后插入到pTrc99A载体的EcoRI和BamHI两位点之间，获得质粒pT-ispA；
（2）所述野生型ScBBS基因通过PCR的方法从 S. citricolor基因组DNA扩增获取，所述野生型LdBBS和野生型MrBBS基因从相应的cDNA中扩增获取；所用基因引物序列如下：
上游引物ScBBSWT–F的序列为 5’-GTGGATCCAAGGAGATATATCAAATGAACTCCCTCCTCCACGCCGCAGAG-3’ （ 如SEQ ID No.8所示）；
下游引物ScBBSWT-R的序列为5’-TAGCTCGAGAAGGCCCGTGCGTGTCATGGGTGGTAG-3’ （ 如SEQ ID No.9所示）；
上游引物LdBBSWT-F的序列为 5’-AGTGGATCCAAGGAGATATATCAAATGAATTCCACATCCAGGAGATC-3’ （ 如SEQ ID No.10所示）；
下游引物LdBBSWT-R的序列为5’-TATCGTCGACTTATGGAAGAGGAATGGGTTC-3’ （ 如SEQ IDNo.11所示）；
上游引物MrBBSWT-F的序列为5’-TGGATCCAAGGAGATATATCAAATGTCAACTTTATCAGTTTCTAC-3’ （ 如SEQ ID No.12所示）；
下游引物MrBBSWT–R的序列为5’-TAGAGTCGACTTAGACAATCATAGGGTGAACGAAG-3’ （ 如SEQ ID No.13所示）；
（3）将步骤（2）扩增所得的基因片段插入到质粒pT-ispA的BamHI和SalI 位点之间，即分别获得质粒pT-IScWT、pT-ILdWT和pT-IMrWT。
2、大肠杆菌工程菌株的构建以及应用
大肠杆菌工程菌株的构建方法如下：
（1）由粪肠球菌基因mvaES、 肺炎链球菌基因mvaK1DK2 以及大肠杆菌基因idi组成完整的IPP和DMAPP合成操纵子，将IPP和DMAPP合成操纵子克隆到pSTV28质粒的EcoRI 和HindIII 两个限制性内切酶位点之间，并受乳糖启动子lac的驱动，得到IPP和DMAPP合成质粒pS-MVA；
（2）按照上述方法构建所述的α-红没药醇合成质粒，所述α-红没药醇合成质粒选自pT-IAa、pT-ILd、pT-IMr、pT-ISc以及pT-ISs中的任意一种，或者所述α-红没药醇合成质粒选自pT-ILdWT、pT-IScWT以及pT-IMrWT中的任意一种；
（3）将步骤（2）获得的α-红没药醇合成质粒与所述IPP和DMAPP合成质粒pS-MVA一起共转化到大肠杆菌菌株E. coli DH5α中，得到大肠杆菌工程菌株。
所述大肠杆菌工程菌株在大肠杆菌合成α-红没药醇中的应用，具体步骤如下：挑取在固体培养基划线培养过夜的单菌落接种种子培养基，在30~37℃摇床振荡培养至OD600为3左右。种子培养基为胰蛋白胨16g/L、酵母抽提物10g/L、氯化钠5g/L、氨苄青霉素100mg/L和氯霉素50mg/L。将培养好的种子按0.1 OD600接种到主培培养基， 再覆盖1/4培养体积的癸烷；在30℃摇床振荡培养到规定时间。主培培养基为胰蛋白胨16g/L、酵母抽提物10g/L、氯化钠5g/L、2% (v/v) 甘油、IPTG 0.2mM、氨苄青霉素 100mg/L和氯霉素50mg/L。经鉴定，使用质粒pT-ILd转化时，大肠杆菌工程菌株合成了(+)-epi-α-红没药醇；使用质粒pT-ISc转化时，大肠杆菌工程菌株合成了epi-（-）α-红没药醇；使用质粒pT-IAa或pT-IMr转化时，大肠杆菌工程菌株合成了（-）α-红没药醇。
表1 大肠杆菌工程菌株命名如下：
菌株名 描述
菌株1 E. coli DH5α 共转化质粒 pS-MVA和pT-ILdWT
菌株2 E. coli DH5α 共转化质粒pS-MVA和pT- ILd
菌株3 E. coli DH5α 共转化质粒pS-MVA和pT- IScWT
菌株4 E. coli DH5α 共转化质粒pS-MVA和pT- ISc
菌株5 E. coli DH5α 共转化质粒pS-MVA和pT-IMrWT
菌株6 E. coli DH5α 共转化质粒pS-MVA和pT-IMr
菌株7 E. coli DH5α 共转化质粒pS-MVA和pT-IAa
菌株8 E. coli DH5α 共转化质粒pS-MVA和pT-ISs
3、α-红没药醇产量的测定
α-红没药醇产量的测定通过气相色谱（GC）法进行。摇瓶培养到规定时间（48 h）后，离心分离所覆盖的癸烷，α-红没药醇能够被萃取到癸烷中。然后上样1μL 到气相色谱仪。柱温箱控温程序为：50°C 保持1min；以20°C/min升温到200°C，然后再以10°C/min升温到260°C，保持2min。色谱柱为安捷伦HP-INNOWAX 133。测量析出α-红没药醇峰面积。以α-红没药醇标准品标定各菌株产量。大肠杆菌工程菌株1~8在摇瓶中培养48h，然后从摇瓶分离癸烷有机层。以菌株1为例，气相色谱分析显示在保留时间10.88min 有一个明显大峰。气质联用分析（GC-MS）确定为(+)-α-红没药醇。同时还在7.42min和11.86min检测到两个很小的峰分别为α-红没药烯和法尼烯。此外还有大肠杆菌宿主色氨酸（Try）代谢调控产物吲哚（保留时间）12.79min。此结果说明经编辑构建的大肠杆菌工程菌株能够合成α-红没药醇，且α-红没药醇是合成的主要产物，占比达到95%以上，参见附图5所示。
4、不同工程菌株合成α-红没药醇的产量比较
大肠杆菌工程菌株1-8在摇瓶中培养48h，然后从摇瓶分离癸烷有机层。GC分析定量结果如附图6所示。不同物种来源的α-红没药醇合成酶展现出不同的活性，使得α-红没药醇产量在各菌株中产量各异。优化密码子方面，优化LdBBS基因密码子对α-红没药醇产量的提升效果不明显；而优化ScBBS和MrBBS基因密码子对产量有明显提升。总体而言，甜舌草α-红没药醇合成酶（LdBBS）、放线菌α-红没药醇合成酶（ScBBS）、春黄菊花α-红没药醇合成酶（MrBBS）、黄花蒿α-红没药醇合成酶（AaBBS）具有较高的酶活性，可以在摇瓶培养方式下合成α-红没药醇 1170mg/L、1190mg/L、1470mg/L和1069mg/L。细胞生长方面，工程菌株1-7的差异不大；菌株8含有澳洲檀香α-红没药醇合成酶合成α-红没药醇能力较弱，可能会导致FPP的累积毒性使得细胞生长受到影响，如附图7所示。
5、优化核糖体结合位点序列（RBS）提高α-红没药醇产量
在所有工程菌株中，FPP合成酶基因和α-红没药醇合成酶基因的表达协调水平决定了α-红没药醇合成操纵子的合成效率。优化核糖体结合位点序列（RBS）是一种有效的协调操纵子内基因表达水平的有效策略。工程菌株6中，ispA基因和MrBBS基因起始密码前RBS序列为RBSA和RBS1。根据在线软件预测为其起始强度分别为100单位和1000单位。以此菌株（菌株6）为例，为优化α-红没药醇合成操纵子中两基因翻译起始的能力进而调控两个酶的表达水平。本发明设计不同强度的RBS序列如下：
IspA 基因RBS序列：
RBSA ATAAGGTAAAGGT 100
RBSB AAGGAGCAGTCGAAGA 700
RBSC GGGAGGTTTTCAGTA 3000
RBSD AAGGAGGTTACGGAAA 9000
MrBBS 基因RBS序列：
RBS1 AAGGAGATATATCAA 1000
RBS2 AGGAGGTAAAAGTTC 3000
RBS3 ATAAAGGAGGTAAGA 9000
以此序列调控ispA基因和MrBBS基因的表达水平，构建12株工程菌株A1-D3，如表2所示。采用摇瓶培养48h后，GC分析定量产量如附图8所示。 菌株D3合成α-红没药醇1590mg/L，比起始菌株A1高出1.25倍。
表2
菌株名 描述
菌株A1 E. coli DH5α 共转化质粒pS-MVA和pT-IAMr1 (此菌株等同于菌株6)
菌株A2 E. coli DH5α 共转化质粒pS-MVA和pT-IAMr2
菌株A3 E. coli DH5α 共转化质粒pS-MVA和pT-IAMr3
菌株B1 E. coli DH5α 共转化质粒pS-MVA和pT-IBMr1
菌株B2 E. coli DH5α 共转化质粒pS-MVA和pT-IBMr2
菌株B3 E. coli DH5α 共转化质粒pS-MVA和pT-IBMr3
菌株C1 E. coli DH5α 共转化质粒pS-MVA和pT-ICMr1
菌株C2 E. coli DH5α 共转化质粒pS-MVA和pT-ICMr2
菌株C3 E. coli DH5α 共转化质粒pS-MVA和pT-ICMr3
菌株D1 E. coli DH5α 共转化质粒pS-MVA和pT-IDMr1
菌株D2 E. coli DH5α 共转化质粒pS-MVA和pT-IDMr2
菌株D3 E. coli DH5α 共转化质粒pS-MVA和pT-IDMr3
菌株1A E. coli DH5α 共转化质粒pS-MVA和pT-Mr1IA
菌株1B E. coli DH5α 共转化质粒pS-MVA和pT-Mr1IB
菌株1C E. coli DH5α 共转化质粒pS-MVA和pT-Mr1IC
菌株1D E. coli DH5α 共转化质粒pS-MVA和pT-Mr1ID
菌株2A E. coli DH5α 共转化质粒pS-MVA和pT-Mr2IA
菌株2B E. coli DH5α 共转化质粒pS-MVA和pT-Mr2IB
菌株2C E. coli DH5α 共转化质粒pS-MVA和pT-Mr2IC
菌株2D E. coli DH5α 共转化质粒pS-MVA和pT-Mr2ID
菌株3A E. coli DH5α 共转化质粒pS-MVA和pT-Mr3IA
菌株3B E. coli DH5α 共转化质粒pS-MVA和pT-Mr3IB
菌株3C E. coli DH5α 共转化质粒pS-MVA和pT-Mr3IC
菌株3D E. coli DH5α 共转化质粒pS-MVA和pT-Mr3ID
设计ispA基因和MrBBS基因引物如下：
IspAA-F：ACGGATCCATAAGGTAAAGGTATGGACTTTCCGCAGC（ 如SEQ ID No.14所示）；
IspAB-F：ACGGATCCGGGAGGTTTTCAGTAATGGACTTTCCGCAGCAAC（ 如SEQ ID No.15所示）；
IspAC-F：ACGGATCC AAGGAGCAGTCGAAGAATGGACTTTCCGCAGCAAC（ 如SEQ ID No.16所示）；
IspAD-F：ACGGATCCAAGGAGGTTACGGAAAATGGACTTTCCGCAGCAAC（ 如SEQ ID No.17所示）；
IspA-R：TATC GTCGACTCTAAGATCTTATTTATTACGCTGGATG（ 如SEQ ID No.18所示）；
MrBBS2-F：ACGGATCCAGGAGGTAAAAGTTCATGTCAACCCTGTCAGTCTCC（ 如SEQ ID No.19所示）；
MrBBS3-F：ACGGATCC ATAAAGGAGGTAAGAATGTCAACCCTGTCAGTCTCC（ 如SEQ ID No.20所示）；
MrBBS-R：TATCGTCGACTCTAAGATCTTCACACAATCATCGGGTG（ 如SEQ ID No.21所示）。
利用PCR的方法可以扩增得到具有不同RBS序列的ispA i （i=A,B,C,D）和MrBBSj（j=2，3）和酶切得到的MrBBS1。在所以片段的上游都有BamHI位点，下游都有BglII 和SalI位点。将经过BamHI和SalI消化的ispA i （i=A,B,C,D）片段首先插入到pTrc99A质粒的BamHI和SalI之间，可以获取pT-ispAi（i=A,B,C,D），再将经过BamHI和SalI消化的MrBBS j（j=1，2，3）插入到pT-ispAi质粒的BgllI和SalI之间，即可获取pT-IiMrj系列的质粒。调整ispA i（i=A,B,C,D）和MrBBS j（j=1，2，3）插入到pTrc99A的先后顺序，即可获取pT-MrjIi系列的质粒。两系列质粒构建路线图如附图11所示。
6、优化α-红没药醇合成操纵子基因顺序提高α-红没药醇产量
操纵子中基因的表达受到启动子表达极性的影响，同时基因转录形成的二级结构也会影响着RBS的翻译起始效率, 进而影响α-红没药醇合成操纵子合成效率。将ispA基因和MrBBS基因表达顺序调整，构建12株新型工程菌株1A-3D。采用摇瓶培养48h后，GC分析定量产量如附图9所示。菌株3D合成α-红没药醇1578mg/L，比起始菌株（1A）高出1.15倍。
7、增加培养基碳源共计提高α-红没药醇产量
将培养基中碳源增加到3%（v/v），考察菌株菌株D3和3D在重组碳源下合成α-红没药醇的能力。α-红没药醇在摇瓶培养条件下合成产量如附图10所示。碳源增加使得在48小时时，菌株6合成α-红没药醇产量达到1743mg/L,比碳源为3%（v/v）提高了1.4倍；到72小时时产量继续增加到1878mg/L，表明培养基优化有继续提高α-红没药醇产量的潜力。菌株D3和3D合成随培养时间逐渐增加，约在48小时达到顶峰。α-红没药醇产量分别为2042mg/L 和2090mg/L，比菌株6在相同条件产量提高1.17倍和1.12倍，表明优化菌株比原始菌株更强的合成α-红没药醇的能力。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 苏州大学
<120> α-红没药醇合成质粒及其构建方法与大肠杆菌工程菌株
<160> 21
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1678
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggatccaagg agatatatca aatgtcgctg accgaagaaa aaccgatccg tccgattgct 60
aatttctcgc cgtccatttg gggtgaccag ttcctgattt acgataatca ggttgaacaa 120
ggcgtcgaac agatcgtgaa agacctgaaa aaagaagtgc gtcaactgct gaaagaagca 180
ctggatattc cgatgaaaca tgctaacctg ctgaaactgg tggacgaaat tcagcgcctg 240
ggtatctcgt acctgtttga acaggaaatc gatcatgcac tgcaacacat ttatgaaacg 300
tacggcgata attggtcagg tgaccgtagc tctctgtggt ttcgtctgat gcgcaaacag 360
ggctactttg ttacctgcga tgtcttcaac aatcataaag acgaatccgg cgtcttcaaa 420
caatcactga aaaaccacgt ggaaggtctg ctggaactgt atgaagccac gagcatgcgt 480
gtcccgggtg aaattatcct ggaagatgca ctggtgttta cccagtcgca cctgagcatt 540
atcgctaaag acacgctgtc gatcaatccg gcgctgagca ccgaaattca gcgcgccctg 600
aaaaaaccgc tgtggaaacg tctgccgcgc atcgaagcgg ttcaatacat tccgttttat 660
gaacagcaag attcccataa caaaaccctg attaaactgg ccaaactgga atttaatctg 720
ctgcagtcac tgcaccgtga agaactgtct caactgagta aatggtggaa agcgttcgat 780
gttaaaaaca atgccccgta ctctcgtgac cgcattgtcg aatgctattt ttgggcgctg 840
gcctctcgct tcgaaccgca gtatagtcgt gcgcgcatct ttctggcaaa agtgattgct 900
ctggttacgc tgattgatga catctatgat gcgtacggca cgtatgaaga actgaaaatt 960
ttcaccgaag ccatcgaacg ttggagtatt acctgcctgg atatgatccc ggaatacatg 1020
aaaccgatct acaaactgtt catggacacg tataccgaaa tggaagaaat cctggcaaaa 1080
gaaggcaaaa ccaacatctt caactgtggt aaagaatttg ttaaagattt cgtgcgcgtt 1140
ctgatggtcg aagctcagtg gctgaacgaa ggccatatcc cgaccacgga agaactggat 1200
agcattgcag tgaacctggg cggtgctaat ctgctgacca cgacctgtta cctgggcatg 1260
tctgacatcg tgaccaaaga agcgtttgaa tgggccgtta gtgaaccgcc gctgctgcgt 1320
tataaaggca ttctgggtcg tcgcctgaat gatctggcgg gtcataaaga agaacaggaa 1380
cgcaaacacg tcagttcctc agtggaatcg tacatgaaag aatataacgt tagcgaagaa 1440
tacgccaaaa atctgctgta taaacaggtg gaagacctgt ggaaagacat caaccgtgaa 1500
tacctgatta cgaaaaccat cccgcgcccg ctgctggtcg cagtgattaa tctggttcac 1560
tttctggatg tcctgtatgc tgaaaaagac aacttcaccc gcatgggcga agaatacaaa 1620
aatctggtga aatccctgct ggtttatccg atgtcaattt aaagatctta gagtcgac 1678
<210> 2
<211> 1641
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgaactcaa cctcccgccg ctccgctaac tacaaaccga ccatctggaa caacgaatat 60
ctgcaatctc tgaactcaat ctacggtgaa aaacgttttc tggaacaggc cgaaaaactg 120
aaagatgaag tgcgcatgct gctggaaaaa acctccgacc cgctggatca tattgaactg 180
gtggacgttc tgcagcgtct ggcaatctca tatcacttca cggaatacat tgatcgcaat 240
ctgaaaaaca tctatgacat tctgatcgat ggccgtcgct ggaatcatgc tgataacctg 300
cacgcgacca cgctgagttt tcgtctgctg cgccagcatg gttatcaagt ctccccggaa 360
gtgtttcgca atttcatgga tgaaaccggc aatttcaaga aaaacctgtg cgatgacatt 420
aaaggtctgc tgtcactgta tgaagcatcg tacctgctga ccgaaggcga aacgatcatg 480
gatagcgcac aggcttttgc gacccatcac ctgaaacaaa aactggaaga aaacatgaac 540
aaaaacctgg gtgatgaaat tgcccatgca ctggaactgc cgctgcactg gcgtgttccg 600
aaactggacg tccgctggtc gatcgatgcc tatgaacgtc gccaggatat gaatccgctg 660
ctgctggaac tggccaaact ggactttaac attgcacagt caatgtatca agatgaactg 720
aaagaactga gtcgttggta ctccaaaacc catctgccgg aaaaactggc tttcgcgcgt 780
gatcgcctgg ttgaaagcta tctgtggggc ctgggtctgg cctctgaacc gcatcacaaa 840
tactgccgca tgatggtggc acagagcacc acgctgattt ctattatcga tgacatctat 900
gacgtgtacg gcaccctgga tgaactgcaa ctgttcacgc acgctgttga ccgttgggat 960
attaaatatc tggaacagct gccggaatac atgcaaatct gctttctggc gctgttcaat 1020
accgttaacg aacgctctta tgactttctg ctggataaag gcttcaatgt cattccgcat 1080
agctcttatc gttgggctga actgtgtaaa acgtacctga tcgaagcgaa ctggtatcac 1140
agtggttaca aaccgtccct gaatgaatat ctgaaccagg gcctgatttc agttgccggt 1200
ccgcatgcac tgtcgcacac ctacctgtgt atgacggaca gtctgaaaga aaaacatatc 1260
ctggatctgc gtaccaatcc gccggttatt aaatgggtct caatcctggt gcgcctggct 1320
gatgacctgg gcacctcgac ggacgaactg aaacgtggtg ataacccgaa aagcattcag 1380
tgccatatgc acgataccgg ctgtaatgaa gaagaaacgc gcgcgtatat taaaaacctg 1440
atcggtagca cctggaagaa aattaacaaa gacgtgctga tgaacttcga atactctatg 1500
gatttccgta cggcagcaat gaacggtgcc cgcgtcagtc agtttatgta tcaatacgat 1560
gacgatggcc atggtgtgcc ggaaggtaaa agcaaagaac gtgtgtgtag cctgattgtt 1620
gaaccgattc cgctgccgtg a 1641
<210> 3
<211> 1756
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggatccaagg agatatatca aatgtcaacc ctgtcagtct ccacgccgtc cttctcatcg 60
tcgccgctgt cctcagtgaa caaaaatagc acgaaacaac acgttacgcg caatagtgtg 120
atctttcatg attccatttg gggcgaccag ttcctggaat acaaagaaaa attcaacgtt 180
gcaaccgaaa aacaactgat tgaagaactg aaagaagaag tccgcaatga actgatgatc 240
cgtgcgtgca acgaagccag tcgctatatt aaactgatcc agctgattga tgtggttgaa 300
cgtctgggcc tggcctacca ctttgaaaaa gaaatcgaag aatccctgca acatatttat 360
gttacctacg gtcacaaatg gacgaactac aacaacatcg aaagcctgtc tctgtggttt 420
cgcctgctgc gtcagaacgg ttttaatgtc agctctgata tcttcgaaaa ccatattgac 480
gaaaaaggca atttccaaga aagtctgtgc aacgatccgc aaggcatgct ggcactgtat 540
gaagcggcct acatgcgcgt ggaaggcgaa attatcctgg acaaagctct ggaatttacc 600
aaactgcacc tgggtattat cagcaacgat ccgtcttgtg acagttccct gcgtacggaa 660
attaaacagg cgctgaaaca gccgctgcgt cgccgtctgc cgcgtctgga agcagttcgt 720
tatattgcta tctaccagca aaaagcgagt cattccgaag tcctgctgaa actggccaaa 780
ctggatttca atgtgctgca ggaaatgcac aaagacgaac tgtcacaaat ttgtaaatgg 840
tggaaagacc tggacatccg taacaaactg ccgtatgttc gcgatcgtct gattgaaggc 900
tatttttgga ttctgggtat ttacttcgaa ccgcagcatt cgcgcacccg tatgtttctg 960
atgaaaacgt gcatgtggct gatcgtcctg gatgacacct ttgataatta tggcacgtac 1020
gaagaactgg aaattttcac ccaggcggtg gaacgctgga gcatcacgtg tctggatgaa 1080
ctgccggaat acatgaaact gatctaccat gaacagttcc gtgtgcacca agaaatggaa 1140
gaatctctgg aaaaagaagg taaagcatac cagatccatt acatcaaaga aatggctaaa 1200
gaaggcaccc gctctctgct gctggaagcg aaatggctga aagaaggtta tatgccgacg 1260
ctggatgaat acctgtcaaa ctcgctggtt acctgcggct atgcactgat gacggctcgc 1320
tcatacgttg cccgtgatga cggtattgtc accgaagatg cgtttaaatg ggtggccacg 1380
cacccgccga tcgttaaagc agcttgtaaa attctgcgtc tgatggatga catcgcgacc 1440
cataaagaag aacaggaacg cggccacatc gcctcatcga ttgaatgcta tcgtaaagaa 1500
accggtgcat ctgaagaaga agcgtgtatg gattttctga aacaggtcga agacggctgg 1560
aaagtgatca atcaagaatc actgatgccg accgatgtgc cgttcccgct gctgatcccg 1620
gcgattaacc tggcccgcgt ttcggacacg ctgtataaag ataacgacgg ttacaatcat 1680
gctgataaag aagtgattgg ttacattaaa agtctgtttg tccacccgat gattgtgtga 1740
agatcttaga gtcgac 1756
<210> 4
<211> 979
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggatccaagg agatatatca aatgaactca ctgctgcacg ccgctgaact ggcaccgaaa 60
aaacgcaact gctcgccgcg ctcaccggaa gaatttgaag ccgccgtcac ccgtcatacg 120
gcatgggcag tcggccgcca cctgctggct ccgcaggatg tgccgcatta tcgtctggca 180
ctgccggacc tgattggtca cgcatacccg cgtgcacgcg gtccggaact ggatctgctg 240
ctggacattc tgggttggtt taccatcctg gatgaccgtt tcgatggccc ggttggtcat 300
cgcccgaaag atgctcacgc gctgattgac ccgctgctgg gcatcctgcg ttatccgggt 360
ccgccggcaa tcgcaccgga agatccgctg gtcgcggcat ggcgtgacct gtggcatcgt 420
caggcaggtc cgatgccgga tacctggcgt caccgtgcag ctgcagaatg gcaagcgtgc 480
ctgaccacgt ttctggctga aacccatcac cgtgcgggcg gtaccacgcc ggatctgccg 540
gaaacggcac tgctgcgtcg ccatgcaagt tgtctgtacc cgttcatgaa catgctggaa 600
cgtgtgcgtg gtaccgaagc tccggcactg ctgctggcag aaccggcact gtatcgtctg 660
cgcgcttaca ccgcggatgc cgcaacgctg attaatgacc tgtgctccct gcagcgtgaa 720
gaaggcctgc cggcagtcca gtttaacatg gtgatgaccc tgcaacgtac gcatggtctg 780
agccgcaatc aggcggtgca agtggttcgt acccgcgttc gtcgcctgcg tgatgactct 840
gaagttctgc gtggtcatct gctgcgtcgc cacccggctg cgggctggta tctgaacggt 900
acccgcgata tggttgacgg tctgcatgtc tgggccggta cgagccgtcg ctaccacccg 960
taaagatctt agagtcgac 979
<210> 5
<211> 1731
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atggacgcct ttgcgacctc tccgacgacc gccctgttcg aaaccgttaa ttgtaatgcc 60
cacgttgccc cgatggccgg tgaagacagc tctgaaaacc gtccggcgag taattataaa 120
ccgtccacct gggattacga atttctgcaa agcctggcca ccacgaacaa taccgtcggt 180
gaaaaacata cgcgcatggc agataaactg aaagaagaag tgaaatccat gatgaaaggt 240
accatggaac cggtggcaaa actggaactg attaatatcg ttcaacgtct gggcctgaaa 300
taccgcttcg aatcagaaat caaagaagaa ctgttctcgc tgtacaaaga tggcaccgac 360
gcgtggtggg ttggtaatct gcacgcaacg gctctgcgtt ttcgcctgct gcgtgaaaac 420
ggcatcttcg tgccgcagga cgtttttgaa accttcaaag ataaaagcgg tgaatttaaa 480
tcgcaactgt gcaaagacgt gcgcggcctg ctgagcctgt atgaagcgag ctacctgggc 540
tgggaaggtg aagaactgct ggatgaagcg aaaaaattca gcaccacgaa cctgaacaac 600
gtgaaagaat ctatcagttc caacaccctg ggtcgtctgg ttaaacatgc cctgaacctg 660
ccgctgcact ggagtgcggc ccgttatgaa gcacgctggt ttattgacga atacgaacgc 720
gaagaaaacg tgatcccgaa tctgctgaaa tacgccaaac tggatttcaa tgtggttcag 780
tctatccatc aaaaagaact gggcaacctg gcacgttggt gggttgaaac cggcctggat 840
aaactgggtt ttgtccgcaa cacgctgatg cagaatttta tgtggggctg cgcgatggcc 900
ttcgaaccgc aatatggtaa agttcgtgac gcagctgtca aactgggcag cctgattacc 960
atggtcgatg acgtgtatga tgtttacggt accctggaag aactggaaat tttcacggat 1020
atcgttgacc gttgggatat taacggcatc gataaactgc cgcgcaatat tagcatgatc 1080
gtcctgacca tgtttaacac ggccaatcag atcagttatg acctgctgcg tgatcgcggt 1140
ttcaattcca ttccgcatat cgcagaagcg tgggcgaccc tgtgtaaaac gtatctgaaa 1200
gaagctaaat ggtatcacag cggttacaaa ccgaccctgg aagaatacct ggaaaacggc 1260
ctggttagca tttcttttgt cctgtctctg gtgaccgcct atctgcaaac ggaacgtctg 1320
gaaaacctga cgtatgaaag tgcggcctac gtcaattccg tgccgccgct ggtgcgttat 1380
agcggtctgc tgaaccgcct gtacaatgac ctgggcacct catcggccga aattgcacgc 1440
ggtgatacgc tgaaatcaat ccagtgctat atgacccaaa cgggcgctac cgaagaagtc 1500
gcgcgtgaac atattaaagg cctggtgcac gaagcgtgga agggtatgaa ccgctgtctg 1560
tttgaacaga ccccgctggc ggaaccgttt gttggcttca acgttaatac ggtccgcggt 1620
tcacagtttt tctatcaaca cggcgatggt tacgcggtga ccgaatcgtg gaccaaagac 1680
ctgagcctga gtgtgctgat tcatccgatt ccgctgaacg aagaagatta a 1731
<210> 6
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
acgaattcat aaggtaaagg tatggacttt ccgcagc 37
<210> 7
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tcggatccta agatcttatt tattacgctg gatg 34
<210> 8
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gtggatccaa ggagatatat caaatgaact ccctcctcca cgccgcagag 50
<210> 9
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tagctcgaga aggcccgtgc gtgtcatggg tggtag 36
<210> 10
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
agtggatcca aggagatata tcaaatgaat tccacatcca ggagatc 47
<210> 11
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
tatcgtcgac ttatggaaga ggaatgggtt c 31
<210> 12
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tggatccaag gagatatatc aaatgtcaac tttatcagtt tctac 45
<210> 13
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
tagagtcgac ttagacaatc atagggtgaa cgaag 35
<210> 14
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
acggatccat aaggtaaagg tatggacttt ccgcagc 37
<210> 15
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
acggatccgg gaggttttca gtaatggact ttccgcagca ac 42
<210> 16
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
acggatccaa ggagcagtcg aagaatggac tttccgcagc aac 43
<210> 17
<211> 43
<212> DNA
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acggatccaa ggaggttacg gaaaatggac tttccgcagc aac 43
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<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
tatcgtcgac tctaagatct tatttattac gctggatg 38
<210> 19
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
acggatccag gaggtaaaag ttcatgtcaa ccctgtcagt ctcc 44
<210> 20
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
acggatccat aaaggaggta agaatgtcaa ccctgtcagt ctcc 44
<210> 21
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
tatcgtcgac tctaagatct tcacacaatc atcgggtg 38

Claims (5)

1.一种α-红没药醇合成质粒，其特征在于：所述α-红没药醇合成质粒是以pTrc99A载体为骨架质粒，该骨架质粒上组装有大肠杆菌基因ispA和一个不同来源的人工合成型α-红没药醇合成酶基因或野生型α-红没药醇合成酶基因；所述人工合成型α-红没药醇合成酶基因选自人工合成型AaBBS 基因、人工合成型LdBBS 基因、人工合成型MrBBS基因、人工合成型ScBBS基因以及人工合成型SsBBS基因中的任意一种，核苷酸序列分别如序列表SEQ IDNo.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4以及SEQ ID No.5所示，相对应的，所述α-红没药醇合成质粒被分别命名为pT-IAa、pT-ILd、pT-IMr、pT-ISc以及pT-ISs；所述野生型α-红没药醇合成酶基因选自野生型LdBBS基因、野生型ScBBS基因以及野生型MrBBS基因中的任意一种，相对应地，所述α-红没药醇合成质粒被分别命名为pT-ILdWT、pT-IScWT和pT-IMrWT。
2.根据权利要求1所述α-红没药醇合成质粒的构建方法，其特征在于：包括如下步骤：
（1）ispA 基因片段经PCR以大肠杆菌MG1655基因组DNA为模版扩增获取，扩增的上游引物ispA-EcoR-F的序列为5’-ACGAATTCATAAGGTAAAGGTATGGACTTTCCGCAGC-3’和下游引物ispA-BamH-R的序列为5’- TCGGATCCTAAGATCTTATTTATTACGCTGGATG-3’；扩增所得基因片段经过EcoRI和BamHI消化后插入到pTrc99A载体的EcoRI和BamHI两位点之间，获得质粒pT-ispA；
（2）所述人工合成型α-红没药醇合成酶基因克隆在所述质粒pT-ispA的BamHI和SalI位点之间，即分别获得质粒pT-IMr、pT-ILd、pT-IAa、pT-ISc、pT-ISs。
3.根据权利要求1所述α-红没药醇合成质粒的构建方法，其特征在于：包括如下步骤：
（1）ispA基因片段经PCR以大肠杆菌MG1655基因组DNA为模版扩增获取，扩增的上游引物ispA-EcoR-F的序列为5’-ACGAATTCATAAGGTAAAGGTATGGACTTTCCGCAGC-3’和下游引物ispA-BamH-R的序列为5’- TCGGATCCTAAGATCTTATTTATTACGCTGGATG-3’；扩增所得基因片段经过EcoRI和BamHI消化后插入到pTrc99A载体的EcoRI和BamHI两位点之间，获得质粒pT-ispA；
（2）所述野生型ScBBS基因通过PCR的方法从 S. citricolor基因组DNA扩增获取，所述野生型LdBBS和野生型MrBBS基因从相应的cDNA中扩增获取；所用基因引物序列如下：
上游引物ScBBSWT–F的序列为 5’-GTGGATCCAAGGAGATATATCAAATGAACTCCCTCCTCCACGCCGCAGAG-3’；
下游引物ScBBSWT-R的序列为5’-TAGCTCGAGAAGGCCCGTGCGTGTCATGGGTGGTAG-3’；
上游引物LdBBSWT-F的序列为 5’-AGTGGATCCAAGGAGATATATCAAATGAATTCCACATCCAGGAGATC-3’；
下游引物LdBBSWT-R的序列为5’-TATCGTCGACTTATGGAAGAGGAATGGGTTC-3’；
上游引物MrBBSWT-F的序列为5’-TGGATCCAAGGAGATATATCAAATGTCAACTTTATCAGTTTCTAC-3’；
下游引物MrBBSWT–R的序列为5’-TAGAGTCGACTTAGACAATCATAGGGTGAACGAAG-3’；
（3）将步骤（2）扩增所得的基因片段插入到质粒pT-ispA的BamHI和SalI 位点之间，即分别获得质粒pT-IScWT、pT-ILdWT和pT-IMrWT。
4.一种大肠杆菌工程菌株，其特征在于：是由下列方法构建得到的：
（1）由粪肠球菌基因mvaES、 肺炎链球菌基因mvaK1DK2 以及大肠杆菌基因idi组成完整的IPP和DMAPP合成操纵子，将IPP和DMAPP合成操纵子克隆到pSTV28质粒的EcoRI 和HindIII 两个限制性内切酶位点之间，并受乳糖启动子lac的驱动，得到IPP和DMAPP合成质粒pS-MVA；
（2）按照权利要求2或3所述的构建方法构建权利要求1所述的α-红没药醇合成质粒，所述α-红没药醇合成质粒选自pT-IAa、pT-ILd、pT-IMr、pT-ISc以及pT-ISs中的任意一种，或者所述α-红没药醇合成质粒选自pT-ILdWT、pT-IScWT以及pT-IMrWT中的任意一种；
（3）将步骤（2）获得的α-红没药醇合成质粒与所述IPP和DMAPP合成质粒pS-MVA一起共转化到大肠杆菌菌株E. coli DH5α中，得到大肠杆菌工程菌株。
5.权利要求4所述大肠杆菌工程菌株在大肠杆菌合成α-红没药醇中的应用。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110016458A (zh) * 2019-04-24 2019-07-16 江南大学 一种发酵合成α-红没药醇的工程菌株及其构建方法
CN110982723A (zh) * 2019-12-30 2020-04-10 江苏瑞霆生物科技有限公司 一种重组酿酒酵母及其在生产α-红没药醇中的应用
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104450762A (zh) * 2013-09-17 2015-03-25 中国科学院广州生物医药与健康研究院 α-硫辛酸的生物合成方法、工程菌株及其制备方法

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104450762A (zh) * 2013-09-17 2015-03-25 中国科学院广州生物医药与健康研究院 α-硫辛酸的生物合成方法、工程菌株及其制备方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GUI HWAN HAN等: "Fermentative production and direct extraction of (−)‑α‑bisabolol in metabolically engineered Escherichia coli", 《MICROBIAL CELL FACTORIES》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110016458A (zh) * 2019-04-24 2019-07-16 江南大学 一种发酵合成α-红没药醇的工程菌株及其构建方法
CN110016458B (zh) * 2019-04-24 2022-08-23 江南大学 一种发酵合成α-红没药醇的工程菌株及其构建方法
CN110982723A (zh) * 2019-12-30 2020-04-10 江苏瑞霆生物科技有限公司 一种重组酿酒酵母及其在生产α-红没药醇中的应用
CN111518739A (zh) * 2020-05-12 2020-08-11 苏州大学 角鲨烯工程菌株、角鲨烯合成质粒、细胞膜空间扩展质粒及制备方法

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