BR112019017561A2 - sintase de santaleno - Google Patents

Abstract

a invenção é direcionada a uma sintase de santaleno, a um ácido nucleico que codifica a dita sintase de santaleno, a um vetor de expressão que compreende o dito ácido nucleico, a uma célula hospedeira que compreende o dito vetor de expressão, a um método de preparar santaleno, a um método de preparar santalol e a um método de preparar uma sintase de santaleno. a invenção é adicionalmente direcionada a um anticorpo específico para a sintase de santalano.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para: SINTASE DE SANTALENO [001] A invenção é direcionada a uma sintase de santaleno, a um ácido nucleico que codifica a dita sintase de santaleno, a um vetor de expressão que compreende o dito ácido nucleico, a uma célula hospedeira que compreende o dito vetor de expressão, a um método de preparar santaleno, a um método de preparar santalol e a um método de preparar uma sintase de santaleno.

[002] Muitos organismos têm a capacidade para produzir um amplo arranjo de terpenos e terpenoides. Os terpenos são, na realidade ou conceitualmente, construídos a partir de resíduos de 2-metilbutano, geralmente chamados de unidades de isopreno, que tem a fórmula molecular Cr>Hg. É possível considerar a unidade de isopreno como um dos blocos de construção comuns da natureza. As fórmulas moleculares básicas de terpenos são múltiplas de tal fórmula: (CsHgJn, em que n é o número de unidades de isopreno ligadas. Isso se chama a regra de isopreno, como um resultado de quais terpenos também são denotados como isoprenoides. As unidades de isopreno podem ser ligadas em conjunto da cabeça à cauda para formar cadeias lineares ou podem ser dispostas para formar anéis. Em sua biossíntese, terpenos são formados a partir dos precursores de 5 carbonos universais difosfato de isopentenila (IPP) e

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2/120 seu isômero, difosfato de dimetilalila (DMAPP). Consequentemente, um esqueleto de carbono de terpeno geralmente compreende um múltiplo de 5 átomos de carbono. Os mais comuns são os terpenos com 5, 10, 15, 20, 30 e carbonos, que são chamados de hemi-, mono-, sesqui-, di-, tri- e tetraterpenos, respectivamente. Além disso, conexões da cabeça à cauda, tri- e tetraterpenos também contêm uma conexão de cauda a cauda em seu centro. Os terpenos podem compreender grupos funcionais adicionais, como álcoois e seus glicosideos, éteres, aldeídos, cetonas, ácidos carboxílicos e ésteres. Esses terpenos funcionalizados são, no presente documento, chamados de terpenoides. Como os terpenos, os terpenoides geralmente têm um esqueleto de carbono que tem um múltiplo de 5 átomos de carbono. Deve ser observado que o número total de carbonos em um terpenoide não precisa ser um múltiplo de 5, por exemplo, o grupo funcional pode ser um grupo éster que compreende um radical alquila que tem inúmeros de átomos de carbono.

[003] Além das definições fornecidas acima, é importante observar que os termos terpeno, terpenoide e isoprenoide são frequentemente usados de modo intercambiável na literatura aberta, assim como literatura de patente.

[004] O santaleno é um sesquiterpeno de ocorrência natural, produzido em plantas específicas, como a árvore de

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3/120 sândalo. O santaleno e especialmente β-santaleno é útil como um material de partida para a síntese química ou a biossíntese de santalol e, em particular, para β-santalol, que é um constituinte principal de óleo de sândalo. O óleo de sândalo é um ingrediente de perfumaria importante obtido por destilação de vapor de cerne de várias espécies de árvore de sândalo (Santalum), por exemplo, Santalum album e Santalum spicalum. O óleo de sândalo é usado em perfumes, produtos cosméticos e para aromatização. O óleo de sândalo contém mais de 90% de álcoois de sesquiterpene do qual 40 a 60% é o α-santalol, enquanto β-santalol compreende 15 a 25%. Embora outros constituintes como a-santalol, epi-βsantalol e bergamotol também possam contribuir para o perfil sensorial de óleo de sândalo típico, β-santalol é considerado como a molécula de definição de odor mais importante em óleo de sândalo. A composição exata do óleo depende da espécie de Santalum, as condições de colheita e o processo de destilação empregado.

[005] As árvores de sândalo foram superexplorados para produzir sândalo e óleo de sândalo durante um longo período, levando à situação ameaçada de várias espécies de sândalo (Teixeira da Silva et al., 2016). Consequentemente, o suprimento de óleo de sândalo diminuiu significativamente ao longo dos últimos anos. Portanto, é desejável fornecer uma fonte alternativa de terpenos de óleo de sândalo, e

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4/120 especialmente os a- e β-santalóis, que são as moléculaschave na definição do odor doce, morno e amadeirado de óleo de sândalo (Baldovini et al, 2011) (Diaz-Chavez et al., 2013).

[006] Foi proposta a preparação de santaleno (ou santalol) microbiologicamente, utilizando micro-organismos geneticamente modificados por incorporação de um gene que codifica para uma proteína que tem atividade de sintase de santaleno. Um sintase de santaleno pode ser usada para a preparação de santaleno a partir de FPP, uma conversão que pode ser executada como uma reação isolada (in vitro) ou como parte de uma trajetória metabólica mais longa que eventualmente leva à produção de santaleno a partir de açúcar (in vivo).

[007] O documento WO/2010/067309 descreve um método para produzir β-santaleno com o uso de uma sintase de santaleno a partir de Santalum (Schalk, 2014). Patente n£ U.S. 8993284, [008] W0201100026 e Jones et al. (2011) descrevem sintases de terpeno a partir de três espécies de Santalum diferentes (Santalum album, S. austrocaledonicum e S. spicatum), produzindo a-santaleno, a-trans-bergamoteno, epi^-santaleno e β-santaleno, simultaneamente (Zulak et al, 2016) . O documento W02015153501 descreve enzimas de sintase de santaleno modificadas derivadas a partir da

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5/120 sintase de santaleno de S. album com atividade de sintase de terpeno aumentada em comparação com a sintase de santaleno de S. album nativa. O documento W02012/110375 descreve uma via de síntese para um intermediário que pode ser usada para a síntese química de beta-santalol.

[009] As únicas sintases de terpeno conhecidas por formar a-santaleno, β-santaleno, epi-p-santaleno, e bergamoteno, até o presente momento, foram identificadas no gênero Santalum. Outras plantas, entretanto, foram descritas como produzindo alguns dos sesquiterpenoides tipo santalol: O documento WO2006/134523 descreve uma sintase de terpeno capaz de sintetizar sesquiterpenes com uma cadeia principal de santaleno, como epi-p-santaleno e trans-abergamoteno, porém, nenhuma produção de β-santaleno e asantaleno é descrita (SCHALK, 2006). O epi-β- santaleno não pode ser usado para a síntese do β-santalol desejado. O documento W02009/109597 descreve outra sintase de terpeno capaz de produzir terpenos do tipo santaleno (Schalk, 2016) . Entretanto, a sintase descrita produz α-santaleno a partir de pirofosfato E,E-farnesila, porém, sem βsantaleno. O documento WO 2008/142318 descreve uma asintase de santaleno a partir de Solatium habrochailes. Essa enzima usa pirofosfato de Z,Z-farnesila como um substrato para produzir α-santaleno. Novamente, a sintase descrita produz apenas α-santaleno e nenhum β-santaleno.

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6/120 [010] Os óleos essenciais derivados de hidrodestilação de folhas, haste e casca da árvore de cânfora, Cinnamomum camphora, foram descritos de modo a conter terpenos tipo santaleno, a saber, a-santaleno, cisα-bergamoteno, epi-beta-santaleno e beta-santaleno (Pelissier & Bessiere, 1995), porém, nenhuma sintase de terpeno correspondente foi identificada.

[011] As sintases de santaleno atualmente conhecidas têm um número de desvantagens distintas que são, em particular, indesejáveis quando são aplicadas em um processo de produção de santaleno industrial, em que o santaleno (ou santalol e em particular β-santalol) é preparado a partir de FPP, em uma reação isolada (in vitro) , por exemplo, com o uso de uma sintase de santaleno isolada ou células integrais (permeabilizadas) ou, de outro modo, por exemplo, em um processo fermentativo que é parte de uma trajetória metabólica mais longa, eventualmente levando à produção de β-santalol a partir de açúcar (in vivo) .

[012] Assim, há uma necessidade de uma sintase de santaleno alternativa que pode ser usada na preparação de santaleno, em particular, β-santaleno e/ou β-santalol. Em particular, há uma necessidade de uma sintase de santaleno alternativa que exibe uma expressão aprimorada, pelo menos em células hospedeiras selecionadas; uma sintase de

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7/120 santaleno alternativa que tem uma alta atividade enzimática pelo menos sob condições específicas, como em um pH neutro ou alcalino e/ou intracelularmente na célula em que foi produzida; e/ou uma sintase de santaleno alternativa que é altamente específica, em particular, que tem especificidade aprimorada em comparação com a sintase de santaleno de Santalum album, em relação à catalização da conversão de FPP em β-santaleno, pelo menos sob condições específicas, como em pH aproximadamente neutro ou em pH alcalino e/ou intracelularmente na célula em que foi produzida.

[013] Constatou-se que um polipeptídeo específico, que era desconhecido até o presente momento, tem atividade de sintase de santaleno e que esse polipeptídeo pode ser usado como um catalisador que pode servir como uma alternativa para sintases de santaleno conhecidas.

[014] Consequentemente, a presente invenção se refere a uma sintase de santaleno que compreende uma sequência de aminoácidos como mostrado em SEQ ID NO: 3 ou um homólogo funcional da mesma, em que o dito homólogo

funcional	é uma sintase de	santaleno	que	compreende	uma
sequência	de aminoácidos	que tem	uma	identidade	de
sequência	de pelo menos 60	% com SEQ	ID	NO: 3. 0	dito

homólogo pode, em particular, ser uma sintase de santaleno que compreende uma sequência de aminoácidos que tem uma identidade de sequência de pelo menos 65%, pelo menos 70%,

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pelo	menos	75%,	pelo	menos	80%,	pelo	menos 85%, pelo menos
90%,	pelo	menos	95%,	pelo	menos	98%	ou pelo menos 99% com
SEQ	ID NO:	3 .

[015] Ademais, a invenção se refere a um anticorpo que tem afinidade de ligação a uma sintase de santaleno de acordo com a invenção. Um anticorpo de acordo com a invenção, portanto, se liga especificamente a uma sintase de santaleno de acordo com a invenção.

[016] O anticorpo, que pode ser monoclonal ou policlonal, pode ser produzido por métodos conhecidos na técnica, por exemplo, como descrito por Hudson et al. Practical Immunology, Terceira Edição (1989), Blackwell Scientific Publications.

[017] A invenção se refere adicionalmente a um ácido nucleico, que compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codificam uma sintase de santaleno de acordo com a invenção ou que compreende uma sequência de ácidos nucleicos complementar à dita sequência de codificação. Em particular, o ácido nucleico pode ser selecionado a partir de ácidos nucleicos que compreendem uma sequência de ácidos nucleicos como mostrado em SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2, e outras sequências de ácido nucleico que codifica uma sintase de santaleno de acordo com a invenção, em que as ditas outras sequências compreendem uma sequência de ácidos nucleicos que tem uma identidade de sequência de pelo menos

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60%, em particular, de pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% com a sequência de ácidos nucleicos mostrada em SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2 ou respectivamente ácidos nucleicos complementares à mesma. A dita outra sequência de ácidos nucleicos que codifica uma sintase de santaleno de acordo com a invenção pode, doravante, ser chamada de um análogo funcional.

[018] Um sintase de santaleno ou ácido nucleico de acordo com a invenção pode ser um composto natural ou fragmento de um composto isolado de sua fonte natural (por exemplo, Cinnamomum camphora), ser um composto ou fragmento sintetizado química ou enzimaticamente de um composto ou um composto ou fragmento de um composto produzido em uma célula recombinante, a célula recombinante na qual pode estar presente ou a célula da qual pode ter sido isolada.

[019] A invenção se refere adicionalmente a um vetor de expressão que compreende um ácido nucleico de acordo com a invenção.

[020] A invenção se refere a uma célula hospedeira, que pode ser um organismo em si ou parte de um organismo multicelular, compreendendo um vetor de expressão que compreende um ácido nucleico, preferencialmente um ácido nucleico heterólogo à dita célula hospedeira, de acordo com a invenção. A célula hospedeira é

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10/120 preferencialmente selecionada a partir do grupo de células bacterianas, células fúngicas (incluindo levedura) e células vegetais.

[021] A invenção se refere adicionalmente a um método para preparar o santaleno_; que compreende converter FPP em santaleno na presença de uma sintase de santaleno de acordo com a invenção. Quatro isômeros geométricos diferentes de FPP podem existir, isto é, 2E.6E-FPP, 2Z,GEFPP, 2E,6Z-FPP e 2Z,6Z-FPP. Bons resultados foram obtidos com 2E,6E-FPP, embora, em princípio, qualquer outro isômero de FPP possa ser um substrato adequado para uma enzima de acordo com a invenção.

[022] A invenção é adicionalmente direcionada a um método para produzir uma sintase de santaleno de acordo com a invenção, compreendendo cultivar uma célula hospedeira de acordo com a invenção sob condições conducentes para a produção da sintase de santaleno e opcionalmente recuperar a sintase de santaleno da célula hospedeira.

[023] Foi constatado que uma sintase de santaleno de acordo com a invenção é mais específica em relação ao santaleno e em particular síntese de β-santaleno do que uma sintase de santaleno de S. album, em particular, em pH neutro ou aproximadamente neutro em um ensaio in vitro ou em um método em que santaleno, e em particular β-santaleno, é sintetizado intracelularmente em uma célula hospedeira

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11/120 geneticamente modificada para produzir uma sintase de santaleno de acordo com a invenção e uma sintase de santaleno de S. album, respectivamente. Os resultados iniciais mostram que sob condições idênticas, a quantidade de produto lateral principal (bergamoteno) formado com a enzima inovadora da invenção é significativamente inferior, a saber, uma razão molar a-santaleno/bergamoteno= 2:1 (0,5):1 para S. album) p-santaleno/bergamoteno= 0,9:1 (0,3:1 para S. album) a+p-santaleno/bergamoteno= 2,9:1 (0,8:1 para S. album) [024] De acordo com a invenção, foi constatado que é possível trazer a sintase de santaleno em expressão com bom rendimento em organismos distintos. Por exemplo, foi constatado que a sintase de santaleno é bem expresso em E. coli, Rhodobacter sphaeroides e em plantas de Nicotiana Benthamiana.

[025] Assim, em uma modalidade vantajosa, a presente invenção fornece uma sintase de santaleno com especificidade aprimorada para a catálise de síntese de santaleno e uma taxa de produção aprimorada para βsantaleno quando usada em um método para preparar santaleno, em particular, em comparação com a sintase de santaleno a partir de S. album ou outra sintase de santaleno de acordo com a técnica anterior, mencionada no presente documento.

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12/120 [026] Em uma modalidade preferencial, um método para preparar santaleno de acordo com a invenção é fornecido, em que o santaleno é preparado em uma célula hospedeira, uma planta ou cultura de planta, ou um cogumelo ou cultura de cogumelo, de acordo com a invenção, expressando a dita sintase de santaleno. Preferencialmente, o método para preparar santaleno de acordo com a invenção compreende adicionalmente isolar o santaleno da dita célula hospedeira, planta ou cultura de planta ou cogumelo ou cultura de cogumelo. Preferencialmente, o método para preparar santaleno de acordo com a invenção resulta em uma razão de α-santaleno para α-bergamoteno que é superior a 1:1, mais preferencialmente superior a 1,5:1, mais preferencialmente superior a 1,7:1, mais preferencialmente superior a 1,9:1, com maior preferência cerca de 2:1. Preferencialmente, o método para preparar santaleno de acordo com a invenção resulta em uma razão de β-santaleno para α-bergamoteno superior a 0,5:1, mais preferencialmente superior a 0,6:1, mais preferencialmente superior a 0,7:1, mais preferencialmente superior a 0,8:1, com maior preferência, cerca de 0,9:1. Preferencialmente, o método para preparar santaleno de acordo com a invenção resulta em uma razão de santalenos (a- e β-santaleno) para abergamoteno superior a 2:1, mais preferencialmente superior a 2,3:1, mais preferencialmente superior a 2,5:1, mais

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13/120 preferencialmente superior a 2,7:1, mais preferencialmente superior a 2,8:1, com maior preferência, cerca de 2,9:1.

[027] Sem se ater à teoria, acredita-se que uma alta especificidade em relação à catálise de síntese de santaleno em pH neutro ou brandamente alcalino seja, em particular, considerada desejável para métodos em que o

santaleno	é	preparado	intracelularmente,	visto	que	se
acredita	que várias	células hospedeiras	têm	um	pH
intracelular	neutro ou	ligeiramente alcalino,	como	um pH	de

7,0 a 8,5 (para valores de pH intracelular de bactérias, consultar, por exemplo: Booth, Microbiological Reviews (1985) 49: 359 a 378) . Quando, por exemplo, células de E. coli. foram expostas a valores de pH que variam de 5,5 a 8,0, o pH intracelular foi entre 7,1 e 7,9 (Olsen et al., Appl. Environ. Microbiol. (2002) 68: 4.145 a 4.147) . Isso pode explicar uma especificidade aprimorada em relação à síntese de santaleno de uma sintase de santaleno de acordo com a invenção, também intracelularmente.

[028] O termo ou, como usado no presente documento, é definido como e/ou, exceto se especificado de outro modo.

[029] O termo um ou uma, como usado no presente documento, é definido como pelo menos um exceto se especificado de outro modo.

[030] Ao se referir a um pronome (por exemplo, um

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14/120 composto, um aditivo, etc.) no singular, o plural se destina a ser incluído.

[031] Os termos difosfato de farnesila e farnesilpirofosfato (ambos abreviados como FPP), como usado de modo intercambiável, no presente documento se referem ao composto pirofosfato de 3,7,1l-trimetil-2,6,10-dodecatrien1-ila e incluem todos os isômeros conhecidos deste composto. 0 termo recombinante, em relação a uma célula, vetor, ácido nucleico ou similares recombinantes, como usado no presente documento, se refere a uma célula, vetor, ácido nucleico ou similares contendo ácido nucleico de ocorrência não natural em tal célula, vetor, ácido nucleico ou similares e/ou de ocorrência não natural na mesma localização. De modo geral, o dito ácido nucleico foi introduzido em tal cepa (célula) com o uso de técnicas de DNA recombinante.

[032] O termo heterólogo, quando usado em relação a um ácido nucleico (DNA ou RNA) ou proteína se refere a um ácido nucleico ou proteína que não ocorre naturalmente como parte do organismo, célula, genoma ou sequência de DNA ou RNA em que a mesma está presente ou que é encontrada em uma célula ou local ou locais no genoma ou sequência de DNA ou RNA que diferem deste em que a mesma é encontrada na natureza. Ácidos nucleicos ou proteínas heterólogas não são endógenas à célula em que são

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15/120 introduzidas, mas foram obtidas a partir de outra célula sintética ou recombinantemente produzida. Geralmente, embora não necessariamente, tais ácidos nucleicos codificam proteínas que não são normalmente produzidas pela célula em que o DNA é expresso.

[033] Um gene que é endógeno a uma célula hospedeira particular, porém, foi modificado a partir de sua forma natural, através, por exemplo, do uso de embaralhamento de DNA, também é chamado de heterólogo. O termo heterólogo também inclui múltiplas cópias de ocorrência não natural de uma sequência de DNA de ocorrência natural. Assim, o termo heterólogo pode se referir a um segmento de DNA que é estranho ou heterólogo à célula, ou homólogo à célula, porém, em uma posição e/ou um número no ácido nucleico da célula hospedeira em que o segmento não é comumente encontrado. Os segmentos de DNA exógenos são expressos para produzir polipeptídeos exógenos. Uma sequência de DNA homóloga é uma sequência de DNA que é naturalmente associada a uma célula hospedeira na qual é introduzida.

[034] Qualquer ácido nucleico ou proteína que os especialistas no assunto reconheceríam como heteróloga ou estranha à célula em que a mesma é expressa é abrangida no presente documento pelo termo ácido nucleico ou proteína heteróloga.

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16/120 [035] O termo mutado ou mutação, como usado no presente documento a respeito de proteínas ou polipeptídeos, significa que pelo menos um aminoácido na sequência de polipeptídeos ou proteína de tipo selvagem ou de ocorrência natural foi substituída por um aminoácido diferente ou deletada de, ou inserida na sequência por meio de mutagênese de ácidos nucleicos que codificam esses aminoácidos. A mutagênese é um método bem conhecido na técnica e inclui, por exemplo, mutagênese direcionada ao sítio por meio de PCR ou por meio de mutagênese mediada por oligonucleotídeo como descrito em Sambrook, J. e Russell, D.W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual.3l edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, (2001). O termo mutado ou mutação, como usado no presente documento a respeito de genes, significa que pelo menos um nucleotídeo na sequência de nucleotídeos de tal gene ou uma sequência reguladora do mesmo, foi substituído por um nucleotídeo diferente, ou foi deletado de ou inserido na sequência por meio de mutagênese.

[036] Os termos quadro de leitura aberta e ORF se referem à sequência de aminoácidos codificada entre códons de iniciação e de terminação de tradução de uma sequência de codificação. Os termos códon de iniciação e códon de terminação se referem a uma unidade de três nucleotídeos adjacentes (códon) em uma sequência de

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codificação	que especifica a iniciação e terminação de
cadeia, respectivamente, da síntese de proteína (tradução de mRNA).
[037]	0 termo gene é usado amplamente para fazer
referência	a qualquer segmento de ácidos nucleicos
associado a	uma função biológica. Assim, os genes que
incluem sequências de codificação e/ou as sequências

reguladoras necessárias para sua expressão. Por exemplo, gene se refere a um fragmento de ácido nucleico que expressa mRNA ou RNA funcional, ou codifica uma proteína específica e que inclui sequências reguladoras. Os genes também incluem segmentos de DNA não expressos que, por exemplo, formam sequências de reconhecimento para outras proteínas. Os genes podem ser obtidos a partir de uma variedade de fontes, incluindo clonagem de uma fonte de interesse ou sintetização de informações de sequência conhecidas ou previstas, e podem incluir sequências projetadas para ter parâmetros desejados.

[038] O termo gene quimérico se refere a qualquer gene que contém 1) sequências de DNA, incluindo sequências reguladoras e de codificação, que não são encontradas juntas na natureza, ou 2) sequências que codificam partes de proteínas não adjuntas naturalmente ou 3) partes de promotores que não são adjuntos naturalmente. Consequentemente, um gene quimérico pode compreender

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18/120 sequências reguladoras e sequências de codificação que são derivadas de diferentes fontes, ou compreender sequências reguladoras e sequências de codificação derivadas da mesma fonte, porém, dispostas de uma maneira diferente daquela encontrada na natureza.

[039] O termo transgênico para uma célula ou organismo transgênico como usado no presente documento, se refere a um organismo ou célula (em que tal célula pode ser um organismo em si ou uma célula de um organismo multicelular do qual foi isolada) contendo um ácido nucleico de ocorrência não natural em tal organismo ou célula e o ácido nucleico o qual foi introduzido em tal organismo ou célula (isto é, foi introduzido no organismo ou célula em si ou em um antecessor do organismo ou um organismo ancestral de um organismo do qual a célula foi isolada) com o uso técnicas de DNA recombinante.

[040] Um transgene se refere a um gene que foi introduzido no genoma por transformação e preferencialmente é mantido de modo estável. Os transgenes podem incluir, por exemplo, genes que são heterólogos ou homólogos aos genes de uma planta particular a ser transformada. Adicionalmente, os transgenes podem compreender genes nativos inseridos em um organismo não nativo ou genes quiméricos. O termo gene endógeno se refere a um gene nativo e sua localização natural no genoma de um organismo.

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Um gene estranho se refere a um gene não encontrado normalmente no organismo hospedeiro, porém, que é introduzido por transferência de gene.

[041] A transformação e transformação, como usado no presente documento, se refere à introdução de uma sequência de nudeotídeos heteróloga em uma célula hospedeira, independentemente do método usado para a inserção, por exemplo, absorção direta, transdução, conjugação, f-acoplamento ou eletroporação. O polinucleotídeo exógeno pode ser mantido como um vetor não integrado, por exemplo, um plasmídeo ou, alternativamente, pode ser integrado no genoma de célula hospedeira.

[042] A sequência de codificação se refere a uma sequência de DNA ou RNA que codifica para uma sequência de aminoácidos específica e exclui as sequências de não codificação. A mesma pode constituir uma sequência de codificação ininterrupta, isto é, desprovida de um intron, como em um cDNA ou pode incluir um ou mais introns ligados por junções de splicing adequadas. Um intron é uma sequência de RNA que é contida na transcrição primária, porém, que é removida através da divagem e religação do RNA dentro da célula para criar o mRNA maduro que pode ser traduzido em uma proteína.

[043] As sequências reguladoras se referem a sequências de nudeotídeos localizadas a montante

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20/120 (sequências de não codificação 5'), dentro, ou a jusante (sequências de não codificação 3') de uma sequência de codificação, e que influencia a transcrição, processamento de RNA ou estabilidade ou tradução da sequência de codificação associada. As sequências reguladoras incluem intensificadores, promotores, sequências líderes de tradução, introns e sequências de sinal de poliadenilação. Os mesmos incluem sequências naturais e sintéticas, assim como sequências que podem ser uma combinação de sequências sintéticas e naturais. Como é observado acima, o termo sequências reguladoras adequadas não é limitado a promotores.

[044] Os exemplos de sequências reguladoras incluem promotores (como promotores transcricionais, promotores constitutivos, promotores induzíveis), operadores ou intensificadores, sítios de ligação ribossômicos de mRNA e sequências adequadas que controlam a iniciação e terminação de transcrição e tradução. As sequências de ácido nucleico são operacionalmente ligadas quando a sequência reguladora se refere de modo funcional à sequência de cDNA da invenção.

[045] Cada uma das sequências reguladoras pode ser independentemente selecionada a partir de sequências reguladoras heterólogas e homólogas.

[046] Promotor se refere a uma sequência de

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21/120 nucleotídeos, geralmente a montante (δ') de sua sequência de codificação, que controla a expressão da dita sequência de codificação através do fornecimento do reconhecimento para RNA polimerase e outros fatores necessários para a transcrição adequada. Promotor inclui um promotor mínimo que é uma sequência de DNA curta compreendida de uma caixa de TATA e outras sequências que servem para especificar o sítio de iniciação de transcrição, ao qual os elementos reguladores são adicionados para o controle de expressão. Promotor também se refere a uma sequência de nucleotídeos que inclui um promotor mínimo mais elementos reguladores que são capazes de controlar a expressão de uma sequência de codificação ou RNA funcional. Esse tipo de sequência promotora consiste em elementos a montante proximais e mais distais, estes elementos são frequentemente chamados de intensificadores. Consequentemente, um intensificador é uma sequência de DNA que pode estimular a atividade de promotor e pode ser um elemento inato do promotor ou um elemento heterólogo inserido para intensificar o nível ou tecido especificidade de um promotor. O mesmo é capaz de operar em ambas as orientações (normal ou virada), e é capaz de funcionar mesmo quando movido a montante ou a jusante do promotor. Ambos os intensificadores e outros elementos de promotor a montante se ligam às proteínas de ligação de DNA específicas de sequência que mediam seus

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22/120 efeitos. Os promotores podem ser derivados em sua totalidade de um gene nativo, ou ser compostos por diferentes elementos derivados de diferentes promotores encontrados em natureza ou até mesmo ser compreendidos por segmentos de DNA sintético. Um promotor também pode conter sequências de DNA que são envolvidas na ligação de fatores de proteína que controlam a eficácia de iniciação de transcrição em resposta a condições fisiológicas ou desenvolvimentais. O termo ácido nucleico como usado no presente documento, inclui referência a um deoxirribonucleotídeo ou polímero de ribonucleotídeo, isto é, um polinucleotídeo, em uma forma de filamento único ou duplo e, exceto se limitado de outro modo, engloba análogos conhecidos que têm a natureza essencial de nucleotídeos naturais no sentido de que hibridizam para ácidos nucleicos de filamento único de uma maneira similar aos nucleotídeos de ocorrência natural (por exemplo, ácidos nucleicos de peptídeo). Um polinucleotídeo pode ter comprimento total ou uma subsequência de um gene nativo ou heterólogo, estrutural ou regulador. Exceto se indicado de outro modo, o termo inclui referência à sequência especificada, assim como à sequência complementar da mesma. Assim, os DNAs ou RNAs com cadeias principais modificadas pela estabilidade ou por outras razões são polinucleotídeos, visto que tal termo é pretendido no presente documento. Ademais, DNAs ou

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RNAs que compreendem bases incomuns, como inosina ou bases modificadas, como bases tituladas, mencionando apenas dois exemplos, são polinucleotideos como o termo é usado no presente documento. Será observado que uma grande variedade de modificações foi feita no DNA e RNA, que servem muitos propósitos úteis conhecidos por especialistas no assunto. O termo polinucleotídeo, como é empregado no presente documento, engloba tais formas modificadas de modo químico, enzimático ou metabólico de polinucleotideos, assim como as formas químicas de DNA e RNA características de vírus e células, incluindo, dentre outras coisas, células simples e complexas.

[047] Toda sequência de ácidos nucleicos no presente documento que codifica um polipeptídeo também, através de referência ao código, descreve toda variação silenciosa possível do ácido nucleico. O termo variantes modificadas de modo conservador se aplica tanto às sequências de aminoácido quanto de ácido nucleico. Em relação às sequências de ácido nucleico particulares, o termo variantes modificadas de modo conservador se refere àqueles ácidos nucleicos que codificam variantes modificadas de modo conservador ou idênticas das sequências de aminoácido devido à degeneração do código genético. O termo degeneração do código genético se refere ao fato de que um grande número de ácidos nucleicos funcionalmente

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24/120 idênticos codifica qualquer dada proteína. Por exemplo, os códons GCA, GCC, GCG e GCU, todos, codificam o aminoácido, alanina. Assim, em toda posição em que uma alanina é especificada por um códon, o códon pode ser alterado para qualquer um dentre os códons correspondentes descritos sem alterar o polipeptídeo codificado. Tais variações de ácido nucleico são variações silenciosas e representam uma espécie de variação modificada de modo conservador. Os termos polipeptídeo, peptídeo e proteína são usados de modo intercambiável no presente documento para fazer referência a um polímero de resíduos de aminoácido. Os termos se aplicam a polímeros de aminoácido em que um ou mais aminoácido resíduos são um análogo químico artificial de um aminoácido de ocorrência natural correspondente, assim como a polímeros de aminoácido de ocorrência natural. A natureza essencial de tais análogos de aminoácidos de ocorrência natural é que, quando incorporados em uma proteína, tal proteína é especificamente reativa a anticorpos suscitados à mesma proteína, porém, consistindo totalmente em aminoácidos de ocorrência natural. Os termos polipeptídeo, peptídeo e proteína também são inclusivos de modificações incluindo, mas sem limitações, glicosilação, fixação de lipídio, sulfatação, gamacarboxilação de resíduos de ácido glutâmico, hidroxilação e ADP-ribosilação.

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25/120 [048] Dentro do contexto do presente pedido, os oligômeros (como oligonucleotideos, oligopeptídeos) são considerados uma espécie do grupo de polímeros. Os oligômeros têm um número relativamente pequeno de unidades monoméricas, em geral, 2 a 100, em particular, 6 a 100.

[049] O cassete de expressão, como usado no presente documento, significa uma sequência de DNA capaz de direcionar a expressão de uma sequência de nucleotideos particular em uma célula hospedeira adequada, compreendendo um promotor operacionalmente ligado à sequência de nucleotideos de interesse, que é operacionalmente ligada a sinais de terminação. O mesmo também tipicamente compreende sequências necessárias para a tradução adequada da sequência de nucleotideos. A região de codificação geralmente codifica para uma proteína de interesse, porém, também pode codificar para um RNA funcional de interesse, por exemplo, RNA antissentido ou um RNA não traduzido, na direção de sentido ou antissentido. O cassete de expressão que compreende a sequência de nucleotideos de interesse pode ser quimérico, que significa que pelo menos um de seus componentes é heterólogo em relação a pelo menos um de seus outros componentes. O cassete de expressão também pode ser um que é de ocorrência natural, porém, foi obtido em uma forma recombinante útil para a expressão heteróloga. A expressão da sequência de nucleotideos no cassete de

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26/120 expressão pode estar sob o controle de um promotor constitutivo ou de um promotor induzível, que inicia a transcrição apenas quando a célula hospedeira é exposta a algum estímulo externo particular. No caso de um organismo multicelular, o promotor também pode ser específico a um tecido ou órgão ou estágio de desenvolvimento particular.

[050] O termo vetor como usado no presente documento se refere a uma construção compreendida de material genético projetado para direcionar a transformação de uma célula alvejada. Um vetor contém múltiplos elementos genéticos orientados de modo posicionai e sequencial, isto é, operacionalmente ligados com outros elementos necessários, de modo que o ácido nucleico em um cassete de ácido nucleico possa ser transcrito e, quando necessário, traduzido nas células transformadas. Em particular, o vetor pode ser selecionado a partir do grupo de vetores virais, (bacterid)fagos, cosmídeos ou plasmídeos. O vetor também pode ser um cromossomo artificial de levedura (YAC), um cromossomo artificial bacteriano (BAG) ou um vetor binário Agrobacterium. O vetor pode ser em forma linear ou circular de filamento duplo ou único, que pode ser ou pode não ser auto transmissível ou mobilizável, e que pode transformar o hospedeiro procariota ou eucariota através de integração no genoma celular ou existir de modo extra cromossômico (por exemplo, plasmídeo de replicação autônoma com uma origem de

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27/120 replicação). São especificamente incluídos vetores de transporte por meio dos quais é dito que um veículo de DNA capaz, naturalmente ou através de projeto, de replicação em dois organismos hospedeiros diferentes, que podem ser selecionados a partir de actinomicetos e espécies relacionadas, bactérias e eucariotas (por exemplo, células vegetais superiores, de mamífero, de levedura ou fúngicas). Preferencialmente, o ácido nucleico no vetor está sob o controle de, e operacionalmente ligado a, um promotor adequado ou outros elementos reguladores para a transcrição em uma célula hospedeira, como uma célula microbiana, por exemplo, bacteriana ou vegetal. O vetor pode ser um vetor de expressão bifuncional que funciona em múltiplos hospedeiros. No caso de DNA genômico, o mesmo pode conter seu próprio promotor ou outros elementos reguladores e, no caso de cDNA, o mesmo pode ser sob o controle de um promotor adequado ou outros elementos reguladores para a expressão na célula hospedeira.

[051] Os vetores contendo um ácido polinucleico de acordo com a invenção podem ser preparados com base na metodologia conhecida na técnica em si. Por exemplo, pode ser feito uso de uma sequência de cDNA que codifica o polipeptídeo de acordo com a invenção operacionalmente ligada a elementos reguladores adequados, como sequências reguladoras de ácido nucleico transcricrionais ou

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28/120 translacionais.

[052] O termo vetor como usado no presente documento, inclui referência a um vetor para trabalho de clonagem padrão (vetor de clonagem) assim como um tipo mais especializado de vetores, como um vetor de expressão (autossômico) e um vetor de clonagem usado para integração no cromossomo da célula hospedeira (vetor de integração).

[053] Os vetores de clonagem tipicamente contêm um ou um pequeno número de sítios de reconhecimento de endonuclease de restrição em que sequências de DNA estranhas podem ser inseridas de uma forma determinável sem perda de função biológica essencial do vetor, assim como um gene marcador que é adequado para uso na identificação e seleção de células transformadas com o vetor de clonagem.

[054] O termo vetor de expressão se refere a uma molécula de DNA, linear ou circular, que compreende um segmento que codifica um polipeptídeo de interesse sob o controle de (isto é, operacionalmente ligado a) segmentos de ácido nucleico adicionais que fornecem essa transcrição. Tais segmentos adicionais podem incluir sequências promotoras e terminadoras, e pode incluir opcionalmente uma ou mais\ origens de replicação, um ou mais marcadores selecionáveis, como intensificador, um sinal de poliadenilação e similares. Os vetores de expressão são geralmente derivados de plasmídeo ou DNA viral, ou podem

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29/120 conter elementos de ambos. Em particular, um vetor de expressão compreende uma sequência de nucleotídeos que compreende na direção de 5' a 3' e operacionalmente ligada: (a) uma região de iniciação de transcrição e tradução que são reconhecidas pelo organismo hospedeiro, (b) uma sequência de codificação para um polipeptídeo de interesse, e (c) uma região de terminação de transcrição e tradução que são reconhecidas pelo organismo hospedeiro. Plasmídeo se refere a replicar autonomamente o DNA extracromossômico que não é integrado em um genoma do micro-organismo e é geralmente circular de natureza.

[055] Um vetor de integração se refere a uma molécula de DNA, linear ou circular que pode ser incorporada em um genoma do micro-organismo e fornece a herança estável de um gene que codifica um polipeptídeo de interesse. O vetor de integração geralmente compreende um ou mais segmentos que compreendem uma sequência genética que codifica um polipeptídeo de interesse sob o controle de (isto é, operacionalmente ligado a) segmentos de ácido nucleico adicionais que proporcionam sua transcrição. Tais segmentos adicionais podem incluir sequências promotoras e terminadoras, e um ou mais segmentos que conduzem a incorporação do gene de interesse no genoma da célula-alvo, geralmente pelo processo de recombinação homóloga. Tipicamente, o vetor de integração será um que pode ser

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30/120 transferido para a célula-alvo, porém, que tem um réplicon que é não funcional em tal organismo. A integração do segmento que compreende o gene de interesse pode ser selecionada se um marcador adequado for incluído em tal segmento.

[056] Como usado no presente documento, o termo operacionalmente ligado ou operativamente ligado se refere a uma justaposição, em que os componentes assim descritos estão em uma relação que permite que os mesmos funcionem de sua maneira pretendida. Uma sequência de controle operacionalmente ligada a outra sequência de controle e/ou a uma sequência de codificação é ligada de tal modo que tal transcrição e/ou expressão da sequência de codificação seja alcançada sob condições compatíveis com a sequência de controle. De modo geral, operacionalmente ligado significa que as sequências de ácido nucleico que são ligadas são contíguas e, onde for necessário unir duas regiões de codificação de proteína, contíguas e no mesmo quadro de leitura.

[057] O termo sintase de santaleno é usado no presente documento para polipeptídeos que têm atividade catalítica na formação de santaleno e terpenos tipo santaleno como a-santaleno, β-santaleno, trans-abergamoteno e epi^-santaleno de difosfato de farnesila, e de outras porções químicas que compreendem tal

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31/120 polipeptídeo. Os exemplos de tais outras porções químicas incluem complexos do dito polipeptídeo com um ou mais outros polipeptídeos, proteínas de fusão que compreendem um polipeptídeo de sintase de santaleno fundido a um peptídeo ou sequência de etiqueta de proteína, outros complexos dos ditos polipeptídeos (por exemplo, complexos de metaloproteína), compostos macromoleculares que compreendem o dito polipeptídeo e outra porção química orgânica, o dito polipeptídeo ligado a um material de suporte, etc. A sintase de santaleno pode ser fornecida em seu ambiente natural, isto é, dentro de uma célula em que foi produzida, ou no meio em que foi excretada pela célula, produzindo a mesma. A mesma também pode ser fornecida separada da fonte que produziu o polipeptídeo e pode ser manipulada por fixação a um carreador, marcado com uma porção química de marcação e similares. O termo homólogo funcional de uma sequência, ou abreviadamente, homólogo, como usado no presente documento, se refere a um polipeptídeo que compreende a dita sequência específica desde que um ou mais aminoácidos sejam substituídos, deletados, adicionados e/ou inseridos, e o polipeptídeo o qual tem (qualitativamente) a mesma funcionalidade enzimática para conversão de substrato no caso de o termo homólogo funcional ser usado para uma enzima, isto é, um homólogo da sequência com SEQ ID NO: 3 que tem atividade catalítica na formação de santaleno a

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32/120 partir de difosfato de farnesila. Nos exemplos, é descrito um teste que é adequado para verificar se um polipeptídeo ou uma porção química que compreende um polipeptídeo é uma sintase de santaleno (teste de atividade de sintase de santaleno). Ademais, o especialista no assunto reconhece que as sequências de nucleotideos equivalentes englobadas por esta invenção também podem ser definidas pela capacidade para hibridizar, sob condições baixas, moderadas e/ou rigorosas, com as sequências de nucleotideos que estão dentro do escopo literal das presentes reivindicações.

[058] Um homólogo preferencial para SEQ ID NO: 3 de acordo com a invenção tem uma especificidade em relação à catálise de formação de santaleno, expressada como a razão molar de santaleno para bergamoteno (um subproduto conhecido, formado em reações catalisadas de sintase de santaleno conhecidas) de pelo menos 1:1, em particular, de pelo menos 1,5:1, mais particular, de pelo menos 2:1, mais particular, de pelo menos 2,4:1, com mais particularidade, de pelo menos 2,8:1, quando determinado em pH 7, com o uso do teste de atividade de sintase de santaleno descrito no presente documento abaixo nos exemplos (como uso de um polipeptídeo purificado). A dita razão pode ser infinita (1:0; isto é, sem quantidade detectável de bergamoteno formado), ou até 100:1, ou até 10:1 ou até 5:1. A identidade de sequência ou similaridade é definida no

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33/120 presente documento como uma relação entre duas ou mais sequências de polipeptídeo ou duas ou mais sequências de ácido nucleico, como determinado pela comparação de tais sequências. Geralmente, as identidades ou similaridades de sequência são comparadas ao longo de todo o comprimento das sequências, porém, entretanto, também podem ser comparadas apenas para uma parte das sequências que se alinham uma com a outra. Na técnica, identidade ou similaridade também significa o grau de relação de sequência entre as sequências de polipeptídeos ou sequências de ácido nucleicos, conforme for o caso, conforme determinado pela correspondência entre tais sequências. A identidade de sequência, como usado no presente documento, é o valor como determinado pelo Algoritmo de Alinhamento EMBOSS Pairwise Needle, por exemplo, no servidor do Instituto Europeu de Bioinformática (http://www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/alignfl). Para o alinhamento de sequências de aminoácido, os parâmetros predefinidos são: Matriz = Blosum62; Penalidade de Vão Aberto = 10,0; Penalidade de Extensão de Vão = 0,5. Para o alinhamento de sequências de ácidos nucleicos, os parâmetros predefinidos são: Matriz = DNAfull; Penalidade de Vão Aberto = 10,0; Penalidade de Extensão de Vão = 0,5.

[059] As discrepâncias entre uma sintase de santaleno de acordo com SEQ ID NO: 3 ou um ácido nucleico de acordo com SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2 disponível e um

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34/120 homólogo funcional da dita sintase de santaleno podem, em particular, ser o resultado de modificações realizadas, por exemplo, para aprimorar uma propriedade da sintase de santaleno ou ácido polinucleico (por exemplo, expressão aprimorada) por uma técnica biológica conhecida pelo especialista no assunto como, por exemplo, evolução molecular ou projeto racional ou com o uso de uma técnica de mutagênese conhecida na técnica (mutagênese aleatória, mutagênese direcionada ao sitio, evolução direcionada, recombinação de gene, etc.). A sequência de aminoácidos ou a sequência de codificação de ácidos nucleicos da sintase de santaleno pode ser alterada em comparação com as sequências de SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2, respectivamente, como um resultado de uma ou mais de variações de ocorrência natural. Os exemplos de tais modificações/variações naturais são diferenças na glicosilação (mais amplamente definidas como modificações pós-translacionais), diferenças devido ao splicing alternativo e polimorfismos de ácido nucleico único (SNPs). O ácido nucleico pode ser modificado de modo que codifique um polipeptideo que difere em pelo menos um aminoácido do polipeptideo de SEQ ID NO: 3, de modo que codifique um polipeptideo que compreende uma ou mais substituições de aminoácido, deleções e/ou inserções comparadas com SEQ ID NO: 3, em que tal polipeptideo ainda tem atividade de

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35/120 sintase de santaleno. Ademais, pode ser feito usode otimização de códon ou otimização de par de códon.Por exemplo, com base em um método como descrito no documento WO 2008/000632, ou como oferecido por companhiasde sintetização de DNA comercial como DNA2.0, Genearte

GenScript. Os exemplos de uma sequência otimizada por códon consistem em SEQ ID NO: 2. Uma ou mais sequências que codificam peptídeos de sinal adequados que não são naturalmente associados aos polipeptídeos da invenção podem ser incorporadas em vetores (de expressão). Por exemplo, uma sequência de DNA para um líder de peptídeo de sinal pode ser fundida no quadro a uma sequência de ácidos nucleicos da invenção, de modo que o polipeptídeo da invenção seja inicialmente traduzido como uma proteína de fusão que compreende o peptídeo de sinal. Dependendo da natureza do peptídeo de sinal, o polipeptídeo expresso será alvejado de modo diferente. Um peptídeo de sinal secretor que é funcional nas células hospedeiras pretendidas, por exemplo, intensifica a secreção extracelular do polipeptídeo expresso. Outros peptídeos de sinal direcionam os polipeptídeos expressos para certas organelas, como os cloroplastos, as mitocôndrias e o peroxissomos. O peptídeo de sinal pode ser clivado do polipeptídeo mediante a transportação para a organela pretendida ou a partir da célula. É possível fornecer uma fusão de uma sequência de

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36/120 peptideos adicional na extremidade terminal amino ou carboxila de um polipeptídeo de acordo com SEQ ID NO: 3 ou homólogo do mesmo.

[060] Como mencionado acima, a invenção se refere adicionalmente a uma célula hospedeira que compreende um vetor de acordo com a invenção. O termo célula hospedeira significa uma célula que contém um vetor e suporta a replicação e/ou expressão do vetor.

[061] O ácido nucleico da invenção é heterólogo à célula hospedeira da invenção. A célula hospedeira pode ser uma célula procariota, uma célula eucariota ou uma célula de um membro da Archaea. A célula hospedeira pode ser de qualquer organismo, em particular, qualquer organismo não humano. Em particular, a célula hospedeira pode ser selecionada a partir de células bacterianas, células fúngicas, archaea, protistas, células vegetais (incluindo algas), células originárias de um animal (em particular, isoladas do dito animal). A célula hospedeira pode formar parte de um organismo multicelular, diferente de um organismo humano ou do organismo do qual a enzima se origina naturalmente (como Cinnamomum camphora no caso da sintase de santaleno de SEQ ID NO: 3) . Em uma modalidade específica, as células hospedeiras da invenção estão em uma cultura de células oriunda de um organismo multicelular, contudo, isoladas do mesmo.

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37/120 [062] Em geral, a célula hospedeira é uma célula isolada que compreende genes para expressar as enzimas para catalisar as etapas de reação da trajetória de mevalonato ou outra trajetória metabólica (como a trajetória de deoxixilulose-5-fosfato (DXP)) possibilitando a produção de difosfatos de prenila C5, difosfato de isopentenila (IPP) e difosfato de dimetilalila (DMAPP), que são os blocos de construção isoprenoides universais. Até onde se sabe, exceto se genes específicos tiverem sido submetidos a knockout, todos os organismos conhecidos compreendem tal trajetória. Os eucariotas em geral são naturalmente capazes de preparar IPP por meio da trajetória de mevalonato. Esse IPP é, então, isomerizado em DMAPP pela ação do difosfato de isopentenila isomerase (Idi) de enzima. A trajetória de DXP, que fornece TPP e DMAPP em uma razão de 5: 1, é comum para procariotas, embora vários procariotas sejam naturalmente capazes de preparar IPP por meio da trajetória de mevalonato. Essas trajetórias são conhecidas na técnica, e foram descritas, por exemplo, por Withers & Keasling em Appl. Microbiol. Biotechnol. (2007) 73: 980 a 990. Os genes dessas trajetórias podem, cada um, ser independentemente homólogos ou heterólogos à célula.

[063] As células hospedeiras compreenderão, ainda, endogenicamente ou a partir de fontes heterólogas, um ou mais genes para expressar enzimas com atividade de prenila

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38/120 transferase que catalisa a condensação da cabeça à cauda dos difosfatos de prenila C5, produzindo difosfatos de prenila mais longos. O difosfato de farnesila precursor (FPP) de sesquiterpeno universal, por exemplo, é formado pela ação dessas enzimas através da adição da cabeça à cauda sucessiva de 2 moléculas de IPP a 1 molécula de DMAPP.

[064] Em uma modalidade, a célula hospedeira é uma bactéria. A bactéria pode ser gram-positiva ou gramnegativa. As bactérias gram-positivas podem ser selecionadas a partir dos gêneros de Bacillus e Lactobacillus, em particular, a partir das espécies de Bacillus subtilis e Lactobacillus casei.

[065] Em uma modalidade preferencial, a bactéria é selecionada a partir do grupo de bactérias gram-negativas, em particular, a partir do grupo de Rhodobacter, Paracoccus e Escherichia, mais particularmente, a partir do grupo de Rlwdobacter capsulatus, Rhodobacter sphoeroides, Paracoccus carotinifaciens, Paracoccus zeaxanthinifaciens e Escherichia coli. Rhodobacter sphoeroides é um exemplo de um organismo que contém naturalmente todos os genes necessários para expressar enzimas que catalisam as várias interrupções de reação na trajetória de DXP, possibilitando a produção intracelular de IPP e DMAPP. Em uma modalidade preferencial, a célula hospedeira é uma célula fúngica, em

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39/120 particular, uma célula fúngica selecionada a partir do grupo de Aspergillus, Blakeslea, Penicillium, Phaffia (Xanthophyllomyces). Pichia, Saccharomyces e Yarrowia, mais particularmente, do grupo de Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Blakeslea trispora, Penicillium chrysogenum, Phaffia rhodozyma (Xanthophyllomyces dendrorhous), Pichia pastoris, Saccharornyces cerevisiae e Yarrowia lipolytica. Também é possível expressar os ácidos nucleicos da invenção em células derivadas a partir de organismos eucariotas superiores, como células vegetais e células animais, como célula de inseto ou células de camundongo, rato ou ser humano. As ditas células podem ser mantidas em uma célula ou cultura de tecido e serem usadas para produção in vitro de sintase de santaleno.

[066] Um	organismo	muitice	lular que	compreende	as
células hospedei	ras de	acordo	com a	invenção,	em
particular, pode	ser selecionado	a partir	do grupo	de

plantas de cogumelos multicelulares (Basidiomicetos).

[067] Assim, em uma modalidade específica, a invenção se refere a uma planta transgênica ou célula vegetal ou cultura de tecido que compreende células de planta transgênica, em que a dita planta ou cultura compreende células hospedeiras vegetais de acordo com a invenção. A planta ou cultura transgênica de células de

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40/120 planta transgênica pode, em particular, ser selecionada a partir de Nicotiana spp., Solarium spp., Cichomm infybus, Lactuca saliva, Mentha spp., Artemisia annua, plantas de formação de tubérculos, como Helianthus tuberosus, cassava e Beta vulgaris, culturas oleaginosas, como Brassica spp., Elaeis spp. (palmeira oleaginosa), Helianthus annuus, Glycine max e [068] Arachis hypogaea, plantas de cultura líquida, como Lemna spp. de lentilha-de-água, células de BY2 de tabaco e Physcomitrella patens, árvores, como pinheiro e álamo, respectivamente, uma cultura celular ou uma cultura de tecido de qualquer uma das ditas plantas. Em uma modalidade específica, a cultura de tecido é uma cultura de raiz capilar.

[069] Em uma modalidade específica adicional, a invenção se refere a uma cultura ou cogumelo transgênico compreendendo células de cogumelo transgênico. A cultura ou cogumelo transgênico que compreende células hospedeiras transgênicas, em particular, pode ser selecionado a partir do grupo de Schizophyllum, Agaricus e Pleurotus, mais particularmente a partir de Schizophyllum commune, o cogumelo comum (Agaricus Msporus), o cogumelo-ostra (Pleurotus ostreotus e Pleurotus sapidus), respectivamente, uma cultura que compreende células de qualquer um dos ditos cogumelos.

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41/120 [070] Uma célula hospedeira de acordo com a invenção pode ser produzida com base em técnicas de biologia genética e molecular predefinidas que são geralmente conhecidas na técnica, por exemplo, como descrito em Sambrook, J. e Russell, D.W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3^ edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, (2001); e F.M. Ausubel et al, edições, Current protocols in molecular biology, John Wiley and Sons, Inc., New York (1987), e suplementos posteriores às mesmas.

[071] Os métodos para transformar Basidiomicetos são conhecidos a partir de, por exemplo, Alves et al (Appl. Environ. Microbiol. (2004) 70: 6.379 a 6.384), Godio et al (Curr. Genet, (2004) 46: 287 a 294), Schuurs et al (Genetics (1997) 147: 589 a 596) e o documento WO 06/096050. Para alcançar a expressão de um gene de sintase de santaleno adequado em basidiomicetos, seu quadro de leitura aberta completo é tipicamente clonado em um vetor de expressão adequado para a transformação de basidiomicetos. O vetor de expressão preferencialmente também compreende sequências de ácido nucleico que regulam a iniciação e terminação de transcrição. Também é preferencial incorporar pelo menos um gene marcador selecionável para permitir a seleção de transformantes. A expressão de uma sintase de santaleno pode ser alcançada

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42/120 com o uso de um promotor de basidiomiceto, por exemplo, um promotor constitutivo ou um promotor induzível. Um exemplo de um promotor constitutivo forte é o promotor de gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (gpdA). Esse promotor é preferencial para a expressão constitutiva quando o material de DNA recombinante é expresso em um hospedeiro basidiomiceto. Outros exemplos são o promotor de fosfoglicerato quinase (pgk), o promotor de piruvato quinase (pki), TPI, o promotor de triose fosfato isomerase (tpi), o promotor de subunidade g de APC sintetase (oliC), o promotor de sc3 e o promotor de acetamidase (amdS) de um basidiomiceto (WO 96/41882).

[072] Se for necessário, a sequência de nucleotídeos primária do gene de sintase de santaleno pode ser adaptado ao uso do códon do hospedeiro basidiomiceto.

[073] Ademais, a expressão pode ser direcionada especialmente ao micélio (monocariota) ou aos corpos frutíferos (dicariotas). Neste último caso, o promotor de

Fbhl de Pleurotis é especialmente	útil 1	[Penas, M.M. et	ai,
Mycologia	(2004) 96: 75 a 82) .
[074]	As metodologias	para	a construção	de
construtos	de transformação de	planta	são descritas	na

técnica. A superexpressão pode ser alcançada por inserção de uma ou mais de uma cópia extra do gene selecionado. Não é um fato desconhecido para plantas ou sua progênie,

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43/120 originalmente transformada com uma ou mais de uma cópia extra de uma sequência de nucleotideos para exibir a superexpressão.

[075] Obter níveis suficientes de expressão transgênica nos tecidos de planta adequados é um aspecto importante na produção de culturas geneticamente modificadas. A expressão de sequências de DNA heterólogas em um hospedeiro vegetal é dependente da presença de um promotor operacionalmente ligado, que é funcional dentro do hospedeiro vegetal. A escolha da sequência promotora irá determinar quando e onde dentro do organismo a sequência de DNA heteróloga é expressa. Embora muitos promotores de dicotiledôneas tenham se mostrado operacionais em monocotiledôneas e vice-versa, os promotores idealmente de dicotiledôneas são selecionados para a expressão em dicotiledôneas, e promotores de monotiledôneas para a expressão em monocotiledôneas. Entretanto, não há restrição à proveniência de promotores selecionados; é suficiente que os mesmos sejam operacionais na condução da expressão das sequências de nucleotideos na célula ou tecido desejado. Em alguns casos, a expressão em múltiplos tecidos é desejável, e os promotores constitutivos como a série de promotor 35S pode ser usada nesse sentido. Entretanto, em algumas das modalidades da presente invenção, é preferencial que a expressão em plantas transgênicas seja específica quanto à

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44/120 folha, mais preferencialmente, a expressão do gene ocorre nos plastídeos da folha. O promotor do gene de sintase de isopreno de Populus alba (PalspS) (Sasaki et al, FEBS Letters (2005) 579: 2.514 a 2.518) parece conduzir a expressão específica de plastídeo. Portanto, esse promotor é um promotor muito adequado para uso em um vetor de expressão da presente invenção.

[076] Outros promotores específicos quanto à folha adequados consistem no promotor de rbcS (Rubisco) (por exemplo, de café, consultar o documento WO 02/092822); de Brassica, consultar o documento n£ U.S. 7.115.733; a partir de soja, consultar Dhanker, O., et al, Nature Diotechnol. (2002) 20: 1.140 a 1.145), o promotor de cy-FBPase (consultar o documento n£ U.S. 6.229.067), a sequência promotora da proteína de ligação de a/b de clorofila de colheita leve da palma oleaginosa (consultar o documento ns U.S. 2006/0288409), o promotor de STP3 de Arabidopsis thaliana (consultar, Bilttner, M. et al, Plant cell & Environ. (2001) 23: 175 a 184), o promotor do gene de PAL2

de feijão (consultar Sablowski,	R.W. et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. EUA	(1995) 92: 6.	.901 a 6.905),	sequências
intensificadoras	do promotor de	ST-LS1 de batata	(consultar
Stockhaus, J. et	al, Proc. Natl.	. Acad. Sci. EUA	(1985) 84:
7.943 a 7.947),	o promotor de	GABI de trigo	(consultar
Gotor, C. et al,	Plant J. (1993]	i 3: 509 a 518),	o promotor

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45/120 especifico aos estômatos do gene de ADP-glicose-fosforilase de batata (consultar o documento ns U.S. 5.538.879), o elemento de LPSE1 do gene de P(D540) de arroz (consultar CN 2007/10051443), e o promotor específico de estômatos, pGC2(Atlg22690) de Arabidopsis thaliana (consultar Yang, Y. et al, Plant Methods (2008) 4: 6).

[077] As espécies de planta, por exemplo, podem ser transformadas pela transformação mediada por DNA de protoplastos de célula vegetal e regeneração subsequente da planta dos protoplastos transformados de acordo com procedimentos bem conhecidos na técnica.

[078] Os exemplos adicionais de métodos para transformar as células vegetais incluem microinjeção (Crossway et al, Mol. Gen. Genet. (1986) 202: 179 a 185), eletroporação (Riggs, CD. e Bates, G.W., Proc. Natl. Acad. Sei. EUA (1986), 83: 5.602 a 5.606), transformação mediada por Agrobacterium (Hinchee et al. , Bio/Technol. (1988) 6: 915 a 922), transferência de gene direta (Paszkowski, J. et al, EMBO J. (1984) 3: 2.717 a 2.722) e aceleração de partícula balística com o uso de dispositivos disponíveis a partir de Agracetus, Inc., Madison, Wisconsin e BioRad, Hercules, Califórnia (consultar, por exemplo, Sanford ef al. Patente ns U.S. 4.945.050 e Pedido de Patente Europeu EP 0 332 581).

[079] Também é possível empregar o método de

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46/120 transformação de protoplasto para mais (Pedido de Patente Europeu EP 0 292 435, Patente ns 5.350.689).

[080] É particularmente preferencial usar os vetores tipo binário dos plasmideos Ti e Ri de Agrobacterium spp. Os vetores derivados de Ti transformam uma ampla variedade de plantas superiores, incluindo plantas monocotiledôneas e dicotiledôneas, como soja, algodão, colza, tabaco e arroz (Pacciotti et al, Bio/technol. (1985) 3: 241; Byrne M.C. et al. Plant Cell Tissue and Organ Culture (1987) 8: 3a 15; Sukhapinda, K. et al, Plant Mol. Biol. (1987) 8: 209 a 217; Hiei, Y. et al, The Plant J. (1994) 6: 271 a 282) . O uso de T-DNA para transformar células vegetais recebeu estudos extensos e é amplamente descrito (por exemplo, EP-A 120 516) . Para a introdução em plantas, os genes quiméricos da invenção podem ser inseridos em vetores binários, como descrito nos exemplos.

[081] Outros métodos de transformação são disponíveis aos especialistas no assunto, como a absorção direta de construtos de DNA estranhos (consultar EP-A 295 959), técnicas de eletroporação (Fromm, M.E. et al, Nature (1986), 319: 791 a 793) ou bombardeamento balístico de alta velocidade com partículas de metal revestidas com os construtos de ácido nucleico (por exemplo, o documento ns U.S. 4.945.050) . Uma vez transformadas, as células podem

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47/120 ser regeneradas pelos especialistas no assunto. São de relevância particular os métodos para transformar genes estranhos em culturas comercialmente importantes, como colza (De Block, M. et al, Plant Physiol. (1989) 91: 694 a 701), girassol (Everett, N.P. et al, Bio/Technology (1987) 5: 1.201 a 1.204), soja (EP-A 301 749), arroz (Hiei, Y. et al, The Plant J. (1994) 6: 271 a 282) e milho (Fromm et al, 1990, Bio/Technology 8: 833 a 839).

[082] Os especialistas no assunto observarão que a escolha do método pode depender do tipo de planta, isto é, monocotiledônea ou dicotiledônea.

[083] Em outra modalidade, o vetor, como descrito no presente documento, pode ser diretamente transformado no genoma de plastideo. A tecnologia de transformação de plastideo é extensivamente descrita, por exemplo, nos documentos na U.S. 5.451.513, na U.S. 5.545.817, na U.S. 5.545.818 e WO 95/16783. A técnica básica para transformação de cloroplasto envolve regiões de introdução de DNA de plastideo clonado que flanqueia um marcador selecionável junto com o gene de interesse em um tecidoalvo adequado, por exemplo, com o uso de biolística ou protoplasto transformação (por exemplo, cloreto de cálcio ou transformação mediada por PEG) .

[084] As células de Agrobacterium tumefadens contendo um vetor de acordo com a presente invenção, em que

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48/120 o vetor compreende um plasmideo de Ti, são úteis em métodos para produzir plantas transformadas. As células vegetais são infectadas com Agrobacterium tumefadens, como descrito acima, para produzir uma célula vegetal transformada e, então, uma planta é regenerada a partir da célula vegetal transformada. Inúmeros sistemas de vetor de Agrobacterium úteis na execução da presente invenção são conhecidos. Esses tipicamente portam pelo menos uma sequência fronteiriça de T-DNA e incluem vetores como pBIN19 (Bevan, Nucl. Acids Res. (1984) 12: 8.711 a 8.720) .

[085] Os métodos com o uso de uma forma de transferência de gene direta ou transferência mediada por Agrobacterium em geral, mas não necessariamente, são realizados com um marcador selecionável, que pode fornecer resistência a um antibiótico (por exemplo, canamicina, higromicina ou metotrexato) ou um herbicida (por exemplo, fosfinotricina). A escolha de marcador selecionável para transformação de planta não é, entretanto, critica para a invenção.

[086] Os métodos gerais de cultivar tecidos de planta são fornecidos, por exemplo, por Maki, K. Y. et al, Plant Physiol. (1993) 15: 473 a 497; e por Phillips, R.I. et al. Em: Sprague GF, Dudley JW, edições. Corn and corn improvement. 3^ edição. Madison (1988) 345 a 387.

[087] Após a transformação, as células de planta

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49/120 transgênica são colocadas em um meio seletivo adequado para a seleção de células transgênicas que são, então, transformadas em calos. As mudas são desenvolvidas a partir de calos e plântulas geradas a partir da muda desenvolvendo-se em meio de enraizamento. O marcador particular usado permitirá a seleção de células transformadas em comparação com as células desprovidas do DNA que foi introduzido.

[088] Para confirmar a presença dos transgenes em células e plantas transgênicas, uma variedade de ensaios pode ser realizada. Tais ensaios incluem, por exemplo, ensaios biológicos moleculares bem conhecidos por especialistas no assunto, como métodos de Southern e Northern blotting, hibridização in situ e amplificação à base de ácido nucleico como ensaios de PGR ou RT-PCR e bioquímicos, como detecção da presença de um produto de proteína, por exemplo, por meio imunológico (ELISAs e Western blots) ou por função enzimática. A presença de sintase de santaleno enzimaticamente ativa pode ser estabelecida por análise química dos produtos voláteis (santaleno) da planta.

[089] Uma sintase de santaleno de acordo com a invenção pode ser usada para a produção industrial de santaleno, em que tal santaleno pode ser usado em si como um sabor ou aroma, por exemplo, em um produto alimentar, ou

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50/120 como uma fragrância, por exemplo, em um produto doméstico, ou como um intermediário para a produção de outro isoprenoide, por exemplo, santalol.

[090] Um método para produzir santaleno de acordo com a invenção compreende preparar santaleno na presença de sintase de santaleno. Em princípio, tal método pode ser baseado em qualquer técnica para empregar uma enzima na preparação de um composto de interesse.

[091] O método pode ser um método em que FPP ou qualquer um de seus precursores (como farnesol, IPP, fosfato de isopentenila, 3-metilbut-3-en-l-ol e até mesmo mevalonato) é alimentado como um substrato às células que compreendem a sintase de santaleno. Alternativamente, o método também pode ser um método em que é feito o uso de um organismo vivo que compreende um sistema de enzima capaz de formar FPP a partir de uma fonte de carbono adequada, estabelecendo, assim, uma via fermentativa completa para santaleno. Deve ser observado que o termo fermentativo é usado no presente documento em um amplo sentido para processos em que é feito o uso de uma cultura de um organismo para sintetizar um composto de uma matéria-prima adequada (por exemplo, um carboidrato, uma fonte de aminoácido, uma fonte de ácido graxo). Assim, os processos fermentativos, como pretendido no presente documento, não são limitados às condições anaeróbicas, e estendidos aos

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51/120 processos sob condições aeróbicas. As matérias-primas adequadas são geralmente conhecidas para espécies específicas de (micro-organismos.

[092] Além disso, pode ser feito o uso da sintase de santaleno isolada da célula em que foi produzida, por exemplo, em um sistema de reação em que o substrato (FPP) e a sintase de santaleno são colocados em contato sob condições adequadas (pH, solvente, temperatura), em que tais condições podem ser baseadas na técnica anterior mencionada no presente documento e a presente revelação, opcionalmente, em combinação com algum teste de rotina. A sintase de santaleno pode ser, por exemplo, solubilizada em um meio aquoso, em que, ainda, o FPP está presente ou a sintase de santaleno pode ser imobilizada em um material de suporte de uma maneira conhecida na técnica e, então, colocada em contato com um líquido compreendendo o FPP. Visto que a enzima tem uma alta atividade e/ou seletividade em relação à catálise de FPP em santaleno, a presente invenção também é vantajosa para tal método in vitro, não apenas sob condições ácidas, mas também, no caso de o pH ser aproximadamente neutro ou alcalino. As condições adequadas podem ser baseadas em metodologia conhecida para sintases de santaleno conhecidas, por exemplo, mencionadas na literatura mencionada no presente documento, as informações reveladas no presente documento, conhecimento

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52/120 geral comum e opcionalmente alguma experimentação de rotina.

[093] Em um método particularmente vantajoso da invenção, o santaleno é fermentativamente preparado, isto é, cultivando-se as células que expressam sintase de santaleno em um meio de cultura. A reação real catalisada pela sintase de santaleno pode ocorrer intracelularmente ou - se a sintase de santaleno for excretada no meio de cultura - extracelularmente no meio de cultura.

[094] As células usadas em um método para preparar o santaleno de acordo com a invenção podem, em particular, ser células hospedeiras de acordo com a invenção. Se for desejado, essas células hospedeiras podem ser geneticamente modificadas para suprir o FPP à sintase de santaleno em quantidades aumentadas. Isso, por exemplo, pode ser realizado intensificando o fluxo de carbono em relação a FPP, que, em si, pode ser realizado de formas diferentes. Em células hospedeiras com uma trajetória de DXP endógena (como E. coli e R. sphaeroides) a desregulação da expressão de enzimas dessa trajetória pode ter um efeito positivo claro sobre a formação de isoprenoides. A superexpressão de dxs que codifica sintase de l-desoxi-D-xilulose-5-fosfato (DXP-sintases), a primeira enzima da trajetória de DXP e, assim, um dos principais alvos para modificação genética metabólica, resultou em biossíntese aumentada de vários

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53/120 isoprenoides (por exemplo, Matthews e Wurtzel, Appl. Microbiol. Biotechnol. (2000) 53: 396 a 400; Huang et al, Bioorg. Med. Chem. (2001) 9: 2.237 a 2.242; Harker e Bramley, FEBS Lett (1999) 448: 115 a 119; Jones et al. Metab. Eng. (2000) 2: 328 a 338; e Yuan et al. Metab. Eng.

(2006) 8: 79 a 90). Além disso, a superexpressão de dxr que codifica para DXP isomerorredutase (também conhecida como l-desoxi-D-xilulose-5-fosfato redutoisomerase), a enzima que catalisa a segunda etapa e dedicada na trajetória de DXP, pode levar à produção isoprenoide aumentada (Albrecht et al, Biotechnol. Lett, (1999) 21: 791 a 795), em que tal efeito pode ser adicionalmente aumentado por coexpressão de matrizes ao mesmo tempo (Kim & Keaeling, Biotechnol Bioeng (2001) 72: 408 a 415). Um efeito positivo sobre a biossíntese de isoprenoide foi adicionalmente obtido por superexpressão de difosfato de isopentenila isomerase (IPP isomerase, Idi), a enzima que catalisa a interconversão de IPP em difosfato de dimetilalila, DMAPP (por exemplo,

Kajiwara et al. Biochem. J. (	1997)	) 324	: 421	a 4 2 6);	Misawa
e Shimada, J. Biotech.	(1998)	59 :	169	a 181;	e Yuan	et	al.
Mctab. Eng. (2006)	8: 79	a	90)	e as	enzimas	MEP
citidililtransferase (	também	conhecida	como	sintase	de	4-

difosfocitidil-2-C-metil-D-eritritol, IspD) e 2C-metil-Deritritol sintase de 2,4-ciclodifosfato (IspF), que são transcritas como um operón ispDF em E. coli (Yuan et al.

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Metab. Eng. (2006) 8: 79 a 90) .

[095] Uma abordagem alternativa e mais eficaz às cepas geneticamente modificadas com uma trajetória de DXP endógena para produção de alto nível de isoprenoides é a introdução de uma trajetória de mevalonato heteróloga. A coexpressão em E. coli da trajetória de mevalonato Saccharomyces cerevisiae com um gene de sintase sintética de amorfa-4,11-dieno resultou na formação do sesquiterpeno amorfadieno em titulações de mais de 110 mg/1 quando a cepa de E. coli recombinante foi cultivada em um meio de LB+ glicerol (Martin et al, Nat. Biotechnol. (2003) 21: 796 a 802). Essa cepa de E. coli. foi subsequentemente aprimorada pela introdução de cópias extras do gene fHMGl que codifica o domínio catalítico C-terminal da enzima de levedura 3hidroxi-3-metil-glutaril-coenzima A (HMG-CoA) redutase. Aumentando-se a formação e, assim, a atividade dessa enzima, o nível intracelular do intermediário de trajetória de mevalonato tóxico HMG-CoA foi reduzida, superando, assim, a inibição de crescimento e levando a uma produção aumentada de mevalonato (Pitera et al. Metab. Eng. (2007) 9: 193 a 207) . O aprimoramento adicional do fluxo através da trajetória de mevalonato heteróloga foi obtido por otimização de códon dos primeiros três genes dessa trajetória em combinação com a substituição do promotor de lac de tipo selvagem com o promotor de lacUV5 duas vezes

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55/120 mais forte (Anthony et al, Met. Eng. (2009) 11: 13 a 19). A produção de amorfadieno podería ser ainda mais aumentada substituindo-se os genes de levedura por sintase de HMG-CoA e redutase de HMG-CoA pelos genes equivalentes da bactéria gram-positiva Staphylococcus aureus. Em combinação com um protocolo de fermentação otimizada, o cultivo dessa cepa de E. coli. geneticamente modificada inovadora produziu uma titulação de amorfadieno de 27,4 g/1 (Tsuruta et al. PloS ONE (2009) 4(2): e4489. doi: 10.1371/journal.pone.0004489). De modo similar, uma cepa de E. coli geneticamente modificada com a trajetória de mevalonato de Streptococcus pneumoniae em combinação com o gene de sintase de difosfato de decaprenila de Agrobacterium tumefaciens (ddsA) produziu coenzima Qio (CoQio) em mais de 2.400 pg/g de peso seco de célula (Zahiri et al. Met. Eng. (2006) 8: 406 a 416. A produção aumentada de CoQio também foi obtida modificandose geneticamente uma cepa de Rhodobacter sphaeroides com a trajetória de mevalonato de Paracoccus zeaxanthinifaciens

em sua forma nativa	(WO 2005/005650) e	uma forma mutada (WO
2006/018211).
[096] Além	disso, as células	hospedeiras com uma
trajetória de MEV	endógena (como S.	cerevisiae) foram a

matéria de múltiplos estudos de modificação genética para obter cepas de hiperprodução de isoprenoide. A introdução em S. cerevisiae da trajetória derivada de E. coli.

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56/120 heteróloga de DXP em combinação com o gene que codifica a sintase de santaleno de Citrus resultou em uma cepa que acumula aproximadamente 10 vezes mais santaleno em comparação com a cepa que expressa apenas a sintase de santaleno (WO 2007/093962). A maioria dos aprimoramentos nas leveduras industrialmente importantes, Candida ulilis e S. cerevisiae, entretanto, se centralizaram na modificação genética da trajetória de MEV homóloga. Especialmente, a superexpressão da enzima redutase de HMG-CoA, a qual se acredita que seja a principal enzima reguladora na trajetória de DXP, em seu comprimento total ou versão truncada, pareceu ser um método eficaz para aumentar a produção de isoprenoides. Esse efeito estimulante de superexpressão da redutase de HMG-CoA truncada N-terminal, por exemplo, foi observado no caso de produção de licopeno em C. utilis (Shimada et al. Appl. Env. Microbiol. (1998) 64: 2.676 a 2.680) e produção de epi-cedrol em S. cerevisiae (Jackson et al. Org. Lett. (2003) 5: 1.629 a 1.632) . No último caso, a produção desse sesquiterpeno pode ser adicionalmente intensificada por introdução de upc2-l, um alelo que suscita um aumento no fluxo metabólico em biossíntese de esterol. Outro método para aumentar oi fluxo através da trajetória de MEV é o emprego de uma variante de quinase de mevalonato que é menos sensível à inibição de retroalimentação por FPP e outros precursores isoprenoides.

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O documento WO 2006/063752, por exemplo, mostra que Paracoccus zeaxanthinifaciens R114, uma bactéria com uma trajetória de MEV endógena, após a introdução do mutante de quinase de mevalonato de S. cerevisiae N66K/I152M e o gene de ddsA de P. zeaxanthinifaciens ATCC 21588 produz significativamente mais coenzima Qio do que a cepa correspondente de P. zeaxanthinifaciens que expressa a quinase de mevalonato de S. cerevisiae de tipo selvagem. Os resultados positivos similares na produção de CoQio com P. zeaxanthinifaciens R114 também foram obtidos com a variante resistente à retroalimentação K93E da quinase de mevalonato de P. zeaxanthinifaciens (WO 2004/111214).

[097] Uma segunda abordagem para quantidades aumentadas de FPP é baseada na redução ou eliminação de atividades colaterais enzimáticas em FPP. Na levedura, o gene ERG9 codifica o difosfato de farnesila de enzima, farnesil transferase (sintase de esqualeno), que catalisa a condensação de duas porções químicas de difosfato de farnesila para formar esqualeno. Visto que essa é a primeira interrupção após o FPP na biossíntese de esterol e, assim, regula o fluxo de unidades de isopreno na trajetória de esterol, ERG9 é um alvo frequente na modificação genética metabólica de levedura para produção de sesquiterpeno aumentado e carotenoides. A perturbação de ERG9 em combinação com a superexpressão da redutase de

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58/120 tHMG-CoA na levedura C. utilis levou à produção aumentada de licopeno (Shimada et al Appl. Env. Microbiol. (1998) 64: 2.676 a 2.680). Uma combinação similar de superexpressão de redutase de tHMG-CoA e regulação descendente de ERG9 com o uso de um promotor repressive! de metionina aumentou a produção do sesquiterpeno amorfadieno em levedura com aproximadamente 10 vezes em comparação com a cepa de levedura que expressa apenas o gene de sintase de amorfadieno (Ro et al Nature (2006) 440: 940 a 943; Lenihan et al Biotechnol. Prog. (2008) 24: 1.026 a 1.032) . Visto que ergosterol é vital para o desenvolvimento de levedura e as células de levedura não podem assimilar ergosterol alimentado externamente durante o desenvolvimento aeróbico, a regulação descendente/knockout de ERG9 é frequentemente combinada com mutações que equipam a cepa de levedura com absorção aeróbica eficaz de ergosterol a partir do meio de cultura. Os exemplos consistem no alelo sue (Takahishi et al Biotechnol. Bioeng. (2007) 97: 170 a 181) e o alelo upc2-l alelo (Jackson et al. Org. Lett. (2003) 5: 1.629 a 1.632). Takahashi et al (Biotechnol. Bioeng. (2007) 97: 170 a 181) também investigou o efeito da limitação da atividade de fosfatase endógena por knockout da fosfatase gene dppl na levedura. Embora esse knockout tenha claramente limitado a desfosforilação de FPP refletida por muito menos acúmulo de farnesol, o mesmo não aprimorou a produção de

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59/120 sesquiterpeno além daquela das mutações combinadas de erg9/sue sob as condições de desenvolvimento aplicadas.

[098] As condições de reação para preparar fermentativamente o santaleno podem ser escolhidas dependendo das condições conhecidas para a espécie de célula hospedeira usada (por exemplo, Rhodobacter capsulatus, Rhodobacter sphaeroides, Paracoccus zeaxanthinifaciens, Escherichia coll, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Saccharornyces cerevisiae, Penicillium chrysogenuni, Phaffia rhodozyma and Pichia pastoris), as informações reveladas no presente documento, conhecimento geral comum e opcionalmente alguma experimentação de rotina. Em principio, o pH do meio de reação (meio de cultura) usado em um método de acordo com a invenção pode ser escolhido em amplos limites, desde que a sintase de santaleno (na célula hospedeira) seja ativa e exiba uma especificidade desejada sob as condições de pH. No caso de o método incluir o uso de células para expressar a sintase de santaleno, o pH é selecionado de modo que as células sejam capazes de realizar sua função ou funções pretendidas. O pH, em particular, pode ser escolhido dentro da faixa de quatro unidades de pH abaixo do pH neutro e duas unidades de pH acima do pH neutro, isto é, entre pH 3 e pH 9 no caso de um sistema essencialmente aquoso a 25 °C. Bons resultados, por exemplo, foram alcançados em um meio

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60/120 de reação aquoso tendo um pH na faixa de 6,8 a 7,5.

[099] Um sistema é considerado aquoso se a água for o único solvente ou o solvente predominante (> 50% em peso, em particular > 90% em peso, com base em líquidos totais), em que, por exemplo, uma quantidade mínima de álcool ou outro solvente (< 50% em peso, em particular < 10% em peso, com base em líquidos totais) pode ser dissolvida (por exemplo, como uma fonte de carbono, no caso de uma abordagem fermentativa total) em tal concentração que micro-organismos que estão presentes permaneçam ativos.

[100] Em particular, em caso de uma levedura e/ou a fungo ser usado, as condições ácidas podem ser preferenciais, em particular, o pH pode ser na faixa de pH 3 a pH 8, com base em um sistema essencialmente aquoso a 25 °C. Se for desejado, o pH pode ser ajustado com o uso de um ácido e/ou uma base ou tamponado com uma combinação adequada de um ácido e uma base.

[101] As condições anaeróbicas, no presente documento, são definidas como condições sem qualquer oxigênio ou em que substancialmente nenhum oxigênio é consumido pelas células cultivadas, em particular, um micro-organismo, e geralmente corresponde a um consumo de oxigênio menor do que 5 mmol/l.h, preferencialmente a um consumo de oxigênio menor do que 2,5 mmol/l.h, ou mais preferencialmente, menor que 1 mmol/l.h. As condições

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61/120 aeróbicas são condições em que um nível suficiente de oxigênio para desenvolvimento irrestrito é dissolvido no meio, capaz de suportar uma taxa de consumo de oxigênio de pelo menos 10 mmol/l.h, mais preferencialmente, mais de 20 mmol/l.h, ainda mais preferencialmente, mais de 50 mmol/l.h, e com maior preferência, mais de 100 mmol/l.h. As condições de oxigênio limitado são definidas como condições em que o consumo de oxigênio é limitado pela transferência de oxigênio do gás para o líquido. O limite inferior para condições de oxigênio limitado é determinado pelo limite superior para condições anaeróbicas, isto é, geralmente pelo menos 1 mmol/l.h, e em particular pelo menos 2,5 mmol/l.h ou pelo menos 5 mmol/l.h. O limite superior para condições de oxigênio limitado é determinado pelo limite inferior para condições aeróbicas, isto é, menos de 100 mmol/l.h, menos de 50 mmol/l.h, menos de 20 mmol/l.h. ou menos de, até 10 mmol/l.h.

[102] A possibilidade de as condições serem aeróbicas, anaeróbicas ou de oxigênio limitado é dependente das condições sob as quais o método é executado, em particular, pela quantidade e composição de fluxo de gás de entrada, as propriedades de transferência de massa/mistura real do equipamento usado, o tipo de micro-organismo usado e a densidade de micro-organismo. Em princípio, a temperatura usada não é crítica, desde que a sintase de

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62/120 santaleno (nas células), mostre atividade substancial. De modo geral, a temperatura pode ser pelo menos 0 °C, em particular, pelo menos 15 °C, mais particularmente, pelo menos 20 °C. Uma temperatura máxima desejada depende da sintase de santaleno e das células, no caso de um método em que é feito uso de células para expressar a sintase de santaleno. A temperatura é de 70 ° ou menos, preferencialmente, 50 °C ou menos, mais preferencialmente, 40 °C ou menos, em particular 35 °C ou menos.

[103] No caso de um processo f ermentativo, as condições de incubação podem ser escolhidas dentro de amplos limites, desde que as células mostrem atividade e/ ou desenvolvimento suficiente. Isso inclui condições aeróbicas, de oxigênio limitado e anaeróbicas.

[104] Em particular, se a reação catalítica, por meio da qual o santaleno é formado, for executada fora de uma célula hospedeira, um meio de reação que compreende um solvente orgânico pode ser usado em uma alta concentração (por exemplo, mais de 50%, ou mais de 90% em peso, com base em líquidos totais), no caso da sintase de santaleno que é usada retém atividade e especificidade suficientes em tal meio.

[105] Se for desejado, o santaleno produzido em um método de acordo com a invenção, ou um composto adicional em que o santaleno foi convertido após sua preparação (como

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63/120 santalol), é recuperada do meio de reação, em que foi produzida. Um método adequado é extração de líquido-líquido com um líquido de extração que não é miscível com o meio de reação.

[106] Em particular, é adequada (para a extração de um meio de reação aquoso) a extração com um solvente orgânico líquido, como um hidrocarboneto líquido. A partir de resultados iniciais, é evidente que esse método também é adequado para extrair o santaleno (ou produto adicional) de um meio de reação compreendendo células de acordo com a invenção usadas para sua produção, sem precisar lisar as células para recuperação do santaleno (ou produto adicional). Em particular, o solvente orgânico pode ser selecionado a partir de alcanos líquidos, álcoois de cadeia longa líquidos (álcoois que têm pelo menos 12 átomos de carbono), e ésteres líquidos de ácidos graxos de cadeia longa (ácidos que têm pelo menos 12 átomos de carbono). Os alcanos líquidos adequados em particular incluem C6-C16 alcanos, como hexano, octano, decano, dodecano, isododecano e hexadecano. O álcool alifático de cadeia longa adequado, em particular, incluem C12-C18 álcoois alifáticos, como álcool oleílico e álcool palmitoleílico. Os ésteres adequados de ácidos graxos de cadeia longa em particular incluem ésteres de C1-C4 álcoois de C12-C18 ácidos graxos, como miristato de isopropila e oleato de etila.

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64/120 [107] Em uma modalidade vantajosa, o santaleno (ou um produto adicional) é produzido em um reator que compreende uma primeira fase liquida (a fase de reação), a dita primeira fase liquida contendo células de acordo com a invenção em que as células o santaleno (ou um produto adicional) é produzido e uma segunda fase liquida (fase orgânica que permanece essencialmente em fases separadas com a primeira fase quando colocada em contato), em que a dita segunda fase liquida é a fase de extração, para a qual o produto formado tem uma afinidade superior. Esse método é vantajoso no sentido de que permite recuperação de produto in situ. Além disso, contribui para prevenir ou pelo menos reduzir os efeitos tóxicos potenciais de santaleno (ou um produto adicional) às células, visto que, devido à presença da segunda fase, a concentração santaleno (ou um produto adicional) na fase de reação pode ser mantida relativamente baixa ao longo do processo. Por fim, há fortes indicações de que a fase de extração contribui para extrair o santaleno (ou produto adicional) para fora da fase de reação.

[108] Em um método preferencial da invenção, a fase de extração forma uma camada sobre a fase de reação ou é misturada com a fase de reação para formar uma dispersão da fase de reação na fase de extração ou uma dispersão da fase de extração na fase de reação. Assim, a fase de

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65/120 extração, não apenas extrai o produto da fase de reação, mas também ajuda a reduzir ou evitar completamente as perdas do produto formado a partir do reator através do gás efluente, gue pode ocorrer se o santaleno for produzido na fase de reação (aquosa) ou extraído na fase de reação (aquosa). 0 santaleno é insatisfatoriamente solúvel em água e, portanto, facilmente volatiliza a partir da água. É contemplado que o santaleno solvatado na fase orgânica (como uma camada ou dispersão) é pelo menos substancialmente impedida de volatilização.

[109] Os líquidos adequados para uso como fase de extração combinam uma densidade inferior à fase de reação com uma boa biocompatibilidade (sem interferência com a viabilidade de células vivas), baixa volatilidade, e próximo à imiscibilidade absoluta com a fase de reação aquosa.

[110] Os exemplos de líquidos adequados para essa aplicação são alcanos líquidos como decano, dodecano, isododecano, tetradecano e hexadecano ou álcoois alifáticos de cadeia longa como álcool oleílico e álcool palmitoleílico ou ésteres de ácidos graxos de cadeia longa como miristato de isopropila e oleato de etila (consultar, por exemplo, Asadollahi et al (Biotechnol. Bioeng. (2008) 99: 666 a 677), Newman et al. (Biotechnol. Bioeng. (2006) 95: 684 a 691) e WO 2009/042070) .

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66/120 [111] O santaleno produzido de acordo com a invenção pode ser usado desse modo, por exemplo, para uso como um sabor ou fragrância, ou como um repelente de inseto ou pode ser usado como um material de partida para outro

composto,	em	particular, outro	sabor	ou	fragrância.	Em
particular	, o	santaleno pode ser	convertido	em santalol	. A
conversão	de	santaleno em santalol	pode	ser executada
intracelular	ou extracelularmente	. Se	essa	preparação	for

executada dentro de uma célula, o santalol é geralmente isolado da célula hospedeira após sua produção. A invenção se refere adicionalmente a um método para preparar santalol, preferencialmente β-santalol, compreendendo converter FPP em santaleno, preferencialmente β-santaleno, na presença de uma sintase de santaleno de acordo com a invenção, que compreende adicionalmente o santaleno em santalol, preferencialmente β-santalol. Preferencialmente, o santaleno é preparado em uma célula hospedeira, uma planta ou cultura de planta ou um cogumelo ou cultura de cogumelo, que expressa a dita sintase de santaleno de acordo com a invenção. Em uma modalidade preferencial, um método para preparar santalol, preferencialmente βsantalol, de acordo com a invenção é fornecido, compreendendo adicionalmente isolar o santalol.

[112] Em geral, os métodos adequados para preparar santalol de santaleno podem ser divididos em: i) métodos

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67/120 puramente químicos como descrito em Willis et al. (1985) no exemplo 11, ii) métodos biocatalíticos (por exemplo, aqueles que usam P450 mono-oxigenases) como exemplificado por Daviet et al. (2015) que também podem ser realizados como uma bioconversão (isto é, métodos que aplicam células vivas integrais) e iv. fermentação total e iii) oxidação autocatalítica de santaleno coo exemplificado por Ngo & Brown (2000) . Em uma modalidade específica, a conversão compreende uma hidroxilação regioespecífica de santaleno para formar santalol. É contemplado que um ou mais genes que codificam uma enzima ou pluralidade de enzimas para catalisar a conversão de santaleno em santalol podem ser incorporados em uma célula hospedeira de acordo com a invenção. Tais enzimas podem, por exemplo, ser selecionadas das enzimas de Chlorella ou Botiyosphaeria, ou Premnaspirodieno oxidase de Hyoscyamus muticus, ou os mutantes de P450cam ou P450BM-3 mencionados no presente documento acima. Como indicado acima, a invenção se refere a um anticorpo que tem afinidade de ligação a uma sintase de santaleno de acordo com a invenção. O termo anticorpo inclui referência à forma de ligação de antígeno de anticorpos (por exemplo, Fab, F (ab) 2) . O termo anticorpo frequentemente se refere a um polipeptídeo substancialmente codificado por um gene de imunoglobulina ou genes de imunoglobulina ou fragmentos dos mesmos, que se

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68/120 liga e reconhece especificamente um analito (antígeno). Entretanto, embora vários fragmentos de anticorpo possam ser definidos em termos da digestão de um anticorpo intacto, um especialista observará que tais fragmentos podem ser sintetizados de novo quimicamente ou utilizando metodologia de DNA recombinante. Assim, o termo anticorpo, como usado no presente documento, também inclui fragmentos de anticorpo como Fv de cadeia única, anticorpos quiméricos (isto é, compreendendo regiões constantes e variáveis de diferentes espécies), anticorpos humanizados (isto é, compreendendo uma região determinante de complementaridade (CDR) de uma fonte não humana) e anticorpos heteroconjugados (por exemplo, anticorpos biespecíficos).

[113] Os anticorpos ou fragmentos dos mesmos podem ser produzidos por qualquer método conhecido na técnica para a síntese de anticorpos, em particular, por síntese química ou preferencialmente, por técnicas de expressão recombinante.

[114] Os anticorpos policlonais para sintase de santaleno podem ser produzidos por vários procedimentos bem conhecidos na técnica. Por exemplo, uma sintase de santaleno heteróloga pode ser administrada a vários animais hospedeiros incluindo, mas sem limitações, coelhos, camundongos, ratos, etc. para induzir a produção de soros contendo anticorpos policlonais específicos para sintase de

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69/120 santaleno. Vários adjuvantes podem ser usados para aumentar a resposta imunológica, dependendo nas espécies hospedeiras e incluem, mas sem limitações, géis minerais de Freund (completo e incompleto), como hidróxido de alumínio, substâncias ativas de superfície como lisolecitina, polióis plurônicos, poliânions, peptídeos, emulsões de óleo, hemocianinas de keyhole limpet, dinitrofenol e adjuvantes humanos potencialmente úteis como BCG (bacille CalmetteGuerin) e Coiynebacterium parvum. Tais adjuvantes também são bem conhecidos na técnica, anticorpos monoclonais podem ser preparados com o uso de uma ampla variedade de técnicas conhecidas na técnica incluindo o uso de tecnologias de hibridoma, recombinante e exibição de fago ou uma

combinação	dos mesmos. Por	exemplo,	os	anticorpos
monoclonais	podem ser produzidos	com o uso	de	técnicas de
hibridoma	incluindo aquelas conhecidas	na	técnica e

ensinadas, por exemplo, em Harlow et al, Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2l edição 1988); Hammerling, et al, in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563 a 681 (Elsevier, N.Y., 1981). 0 termo anticorpo monoclonal como usado no presente documento não é limitado a anticorpos produzidos através de tecnologia de hibridoma. O termo anticorpo monoclonal se refere a um anticorpo que é derivado de um único clone, incluindo qualquer clone eucariota, procariota ou fago, e

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70/120 não o método pelo qual é produzido.

[115] Os métodos para produzir e submeter à triagem para anticorpos específicos com o uso de tecnologia de hibridoma são de rotina e bem conhecidos na técnica. Brevemente, os camundongos podem ser imunizados com sintase de santaleno e uma vez uma resposta imune é detectada, por exemplo, anticorpos específicos para a sintase de santaleno são detectadas no soro de camundongo, o baço de camundongo é colhido e esplenócitos isolados. Os esplenócitos são, então, fundidos por técnicas bem conhecidas a quaisquer células de mieloma adequadas, por exemplo, as células da linhagem celular SP20 disponíveis a partir de ATCC. Os hibridomas são selecionados e clonados por diluição limitada. Os clones de hibridoma são, então, ensaiados por métodos conhecidos na técnica por células que secretam anticorpos capazes de se ligar a um polipeptídeo da invenção. 0 fluido de ascitos, que geralmente contém altos níveis de anticorpos, pode ser gerado imunizando-se camundongos com clones de hibridoma positivos.

[116] Em certas modalidades, um método para gerar anticorpos monoclonais compreende cultivar uma célula de hibridoma que secreta um anticorpo da invenção em que, preferencialmente, o hibridoma é gerado fundindo-se esplenócitos isolados de um camundongo imunizado com sintase de santaleno com células de mieloma e, então,

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71/120 submetendo-se à triagem os hibridomas resultantes da fusão para clones de hibridoma que secretam um anticorpo capaz de se ligar à sintase de santaleno. Um anticorpo de acordo com a invenção, por exemplo, pode ser usado em um método para isolar uma sintase de santaleno produzida de acordo com a invenção, por exemplo, com o uso do anticorpo imobilizado em um material de suporte cromatográfico.

[117] Ademais, a presente revelação é direcionada a um método para preparar santaleno ou santalol, em que o método compreende converter um substrato de difosfato de poliprenila no santaleno ou santalol na presença de uma enzima, em que a enzima compreende um primeiro segmento que compreende uma etiqueta-peptídeo e um segundo segmento que compreende uma sintase de santaleno de acordo com a

invenção. Uma	enzima que compreende	o dito primeiro	e o
dito segundo chamada de uma	segmentos, no presente enzima etiquetada.	documento, pode	ser
[118]	Para a preparação	de santaleno,	em
particular, pode ser feito o uso	de um método,	uma

sequência de aminoácidos, uma sequência de ácidos nucleicos ou uma célula hospedeira como descrito no presente documento. Santalol pode, por exemplo, ser preparado por oxigenação/oxidação de santaleno de uma maneira conhecida em si.

[119] A etiqueta-peptídeo é preferencialmente

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72/120 selecionada a partir do grupo de proteínas de utilização de nitrogênio (NusA; SEQ ID NO: 26), tiorredoxinas (Trx; SEQ ID NO: 27), proteína de ligação de maltose (MBP; SEQ ID NO: 28) uma chamada SET-etiqueta, SEQ ID NO: 29) e homólogos funcionais dos mesmos. Como usado no presente documento, um homólogo funcional de uma etiqueta-peptídeo é uma etiquetapeptideo que tem pelo menos aproximadamente o mesmo efeito na solubilidade da enzima etiquetada, comparada com a enzima não etiquetada. Tipicamente, o homólogo difere no sentido de que um ou mais aminoácidos foram inseridos, substituídos, deletados de ou estendidos para o peptídeo do qual é um homólogo. O homólogo, em particular, pode compreender uma ou mais substituições de um aminoácido hidrofílico por outro aminoácido hidrofílico ou de um aminoácido hidrofóbico por outro. O homólogo, em particular, pode ter uma identidade de sequência de pelo menos 40%, mais particularmente, de pelo menos 50%,

preferencialmente	de	pelo	menos	55%,	mais
preferencialmente, de	pelo	menos	60%, pelo	menos 70%,	pelo
menos 75%, pelo menos	80%,	pelo menos 85%,	pelo menos	90%,
pelo menos 95%, pelo	menos 98%	ou pelo	menos 99% com a
sequência de um NusA,	Trx,	MBP ou	SET.

[120] É particularmente adequada a proteína de ligação de maltose de Escherichia coli, ou um homólogo funcional da mesma.

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73/120 [121] O uso de uma enzima etiquetada de acordo com a invenção é, em particular, vantajoso no sentido de que pode contribuir para uma produção aumentada, especialmente produção celular aumentada de um terpenoide ou um terpeno, como α-santaleno e β-santaleno.

[122] Para a solubilidade aprimorada da enzima etiquetada (comparada com a enzima sem a etiqueta), o primeiro segmento da enzima é preferencialmente ligado em sua terminação C à terminação N do segundo segmento. Alternativamente, o primeiro segmento da enzima etiquetada é ligado em sua terminação N à terminação C do segundo segmento.

[123] Ademais, a presente revelação é direcionada a um ácido nucleico que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo, em que o polipeptídeo compreende um primeiro segmento que compreende uma etiqueta-peptídeo, preferencialmente uma etiqueta MBP, uma NusA, uma Trx, uma SET) ou um homólogo funcional de qualquer um desses e um segundo segmento que compreende uma sintase de santaleno ou uma sintase amorfadieno. O segundo segmento, por exemplo, pode compreender uma sequência de aminoácidos como mostrado em SEQ ID NO: 3.

[124] Ademais, a presente revelação é direcionada a uma célula hospedeira que compreende o dito ácido nucleico que codifica a dita sintase de santaleno

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74/120 etiquetada. Os ácidos nucleicos específicos de acordo com a invenção que codificam uma enzima etiquetada são mostrados em SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31. A célula hospedeira, em particular, pode compreender um gene que compreende qualquer uma dessas sequências ou a análogo funcional das mesmas.

[125] Ademais, a presente revelação é direcionada a uma enzima, compreendendo um primeiro segmento que compreende uma etiqueta-peptídeo e um segundo segmento que compreende um polipeptídeo que tem atividade enzimática para converter um difosfato de poliprenila em um terpeno, em particular, uma sintase de santaleno, em que a etiquetapeptídeo preferencialmente é selecionada a partir do grupo de MBP, NusA. Trx ou SET) . As enzimas específicas que compreendem uma enzima etiquetada de acordo com a invenção são mostradas em SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33.

[126] A invenção agora será ilustrada pelos seguintes exemplos.

Legendas de Figura

[127]	Figura	1: Mapa	de plasmídeo p-m-LPppa-
CiCaSSy-mpmii	alt.
[128]	Figura	2 Mapa de	plasmideo p-m-SPppa-MBP-
OiCaSSy-mpmii	alt.
[129]	Figura	3 Mapa de	plasmideo p-m-PcrtE-TRX-

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CiCaSSy-mpmii alt.

[130] Figura 4 Mapa de plasmídeo p-m-PcrtE-TRXSaSSy-mpmii alt.

[131] Figura 5 Cromatograma de GC de espécies de terpene produzidas por CiCaSSy em R. sphaeroides. Os compostos identificados por GC-MS são: α-santaleno (Tempo de retenção: 5,3 min), trans-a-bergamoteno (Rt: 5,45 min), epi-p-santaleno (Rt: 5,75 min) e β-santaleno (Rt: 5,95 min) .

[132] Figura 6: a produção de terpenos totais (A), α-santaleno (B), β-santaleno (C) e trans-a-bergamoteno (D) durante a fermentação de batelada alimentada de cepas de Khodobacter sphaeroides Rs265-9c que portam plasmideos com o gene que codifica sintase de santaleno de SaSSy ou CiCaSSy. As razões de produto para os terpenos individuais (B, C e D) são representadas como a quantidade (área) relativa à área total dos componentes como indicado no cromatograma de GC da Figura 5.

[133] Figura 7: alinhamento de CiCaSSY com proteínas relevantes. A sequência de proteínas CiCaSSY (TS23-3) (SEQ ID NO: 3) foi alinhada às sequências de proteínas de suas variantes mais próximas TS23-1 (SEQ ID NO: 10) e TS23-2 (SEQ ID NO: 11) encontrada em C. camphora. Os 21 dos 553 resíduos que foram diferentes entre a proteína de TS23-1 e CiCaSSY são destacados.

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[134]	Figura	8: análise	de GC-MS	de	produção	de
terpeno em E.	coli	(exemplo 5) .	amostra	de	controle	de
vetor: E. coli	transformada com pACYCDUET.
[135]	Figura	9: análise	de GC-MS	de	produção	de

terpeno em E. coli (exemplo 5). amostra de clone TS23-1: E. coli transformada com pACYCDuet_TS23-l [136] Figura 10: análise de GC-MS de produção de terpeno em E. coli (exemplo 5). amostra de clone TS23-3: E. coli transformada com pACYCDuet_TS23-3 (CicaSSy) [137] Figura 11: análise de GC-MS de produção de terpeno em E. coli (exemplo 5). Amostra de clone SaSSy: E. coli transformada com pACYCDuet_SaSSy)

Exemplos :

Exemplo 1:

Análise de GC-MS de Cinnamomum Camphora [138] Uma planta de Cinnamomum camphora de cerca de 30 cm de altura foi adquirida junto à Planfor (Pepinieres PLANFOR RD 651 40090 UCHACQ - FRANÇA).

[139] Cinnamomum camphora é conhecida por ocorrer em vários quimiotipos. Em particular, o tipo cineol parece conter santaleno (Stubbs et al., 2004, Pelissier et al., 1995), enquanto outros quimiotipos (cânfora, linalool) não foram relatados como contendo santaleno (por exemplo, Frizzo 2000; Pino 1998).

[140] A planta foi dissecada em material de folha,

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77/120 haste e raiz. 0,5 g de material de planta foi pesado em um tubo de vidro pré-resfriado, e 2 ml de diclorometano foram adicionados. A suspensão foi submetida a vórtex por 1 min, sonicada por 5 min em um banho ultrassônico e centrifugada por 5 min em 1.500 g à temperatura ambiente. O sobrenadante foi coletado e filtrado sobre uma coluna de 1 g de sulfato de sódio. Cerca de 2 μΐ foram analisados por GC/MS com o uso de uma cromatografia de gás como descrito em detalhes por Cankar et al. (2015). Os santalenos foram identificados pela comparação de tempos de retenção e espectros de massa com aqueles de óleo de sândalo (Sigma-Aldrich).

Resultados:

[141] As raízes, folhas e haste de C. camphora pareceram conter compostos que correspondem a a-santaleno (Rt 13,17 min), α-bergamoteno (Rt 13,34 min), epi-βsantaleno (Rt 13,54 min) e β-santaleno (Rt 13,69 min) . A concentração de santalenos foi mais alta nas raízes. Outros compostos encontrados nas raízes da planta de Cinnamomum foram identificados como guaiol, guaiadieno, intermedeol, eremoligenol, germacreno D, isolepidozeno, safrol, limoneno, pineno, canfeno, mirceno, sabineno, 1,8-cineol e cânfora. Portanto, esse tecido foi adicionalmente tomado para extração de RNA.

Exemplo 2:

Extração de RNA e Análise

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78/120 [142] 0 RNA de material de raiz de C. camphora foi isolado como a seguir: cerca de 15 ml de tampão de extração (2% de brometo de hexadecil-trimetilamônio. 2% de polivinilpirrolidinona, K 30, 100 mM de Tris-HCl (pH 8,0), 25 mM de EDTA, 2,0 M de NaCl, 0,5 g/1 de espermidina e 2% de β-mercaptoetanol) foi aquecida a 65 °C, em seguida, 3 g de tecido triturado foram adicionados e misturados. A mistura foi extraída duas vezes com um volume igual de clorofórmio:isoamilálcool (1: 24), e volume de um quarto de 10 M de LiCl foi adicionado ao sobrenadante e misturado. O RNA foi precipitado de um dia para o outro a 4 °C e colhido por centrifugação a 10.000 g por 20 min. O pélete foi dissolvido em 500 de SSTE [1,0 M de NaCl, 0,5% de SDS, 10 mM de Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM de EDTA (pH 8,0)] e extraído uma vez com um volume igual de clorofórmio:isoamilálcool. Dois volumes de etanol foram adicionados ao sobrenadante, incubados por pelo menos 2 h a - 20 °C, centrifugados a 13.000 g e o sobrenadante removido. O pélete foi seco em ar e ressuspenso em água. O RNA Total (60 pg) foi enviado para Vertis Biotechnology AG (Freising, Alemanha). PoliA+ RNA foi isolado, sintetizado com cDNA com iniciador aleatório com o uso de um iniciador de adaptador de N6 randomizado e transcriptase reversa de M-MLV H. cDNA foi submetido ao cisalhamento e fracionado e os fragmentos de um tamanho de 500 bp foram usados para uma análise adicional. Os cDNAs

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79/120 portam, fixadas às suas extremidades 5' e 3', as sequências A e B adaptadoras como especificado por Illumina. O material foi subsequentemente analisado em um dispositivo de sequenciamento Illumina MiSeq. No total, 27.919.287 sequências foram lidas pelo MiSeq, com um comprimento de sequência total de 10.592.407.803 pares de base. Trimmomatic-0,32 foi usado para aparar as sequências de adaptadores de sequenciamento de Illumina, Seqprep foi usado para sobrepor sequências de extremidade emparelhadas e bowtie2 (versão 2.2.1) foram usados para remover contaminação de phiX (DNA de phiX é usado como um controle de surto, geralmente presente em < 1%) . As leituras de extremidade emparelhadas e leituras únicas foram usadas em uma montagem de Trinity (trinityrnaseq-2.0.2) . Um número total de 16.0871 contigs foram montados por Trinity.

[143] Para identificar as sintases de sesquiterpene, os contigs de C. camphora foram usados para criar um banco de dados de sequências de cDNA. Nesse banco de dados, o programa de TBLASTN foi implantado para identificar sequências de cDNA que codificam proteínas que mostram identidade com sequências de proteínas de sintases de sesquiterpene, incluindo sintases de santaleno de Santalum album (acessão de GenBank E3W202). Clausena lansium (ADR71055) e Solarium habrochaites (ACJ38409), sintase de valenceno de Callitropsis nootkatensis

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80/120 (CDM55287) e sintase de trans-a-bergamoteno de Phyla dulcis (AFR23371) . No total, 95 contigs no banco de dados de cDNA de C. camphora foram identificados, que têm homologia significativa às sintases de sesquiterpene. Os contigs foram agrupados em 28 grupos de acordo com sua sobreposição na sequência. Esses 28 contigs foram adicionalmente caracterizados analisando-se os mesmos com o uso do programa BLASTX para alinhar os mesmos às sequências de proteínas presentes no banco de dados UniProt (transferido por download em 28 de agosto de 2015) , e 14 dos mesmos foram identificados como sequências de sintase de sesquiterpeno putativas e outros 14 como sintases de monoterpeno putativas, de acordo com sua homologia às sintases de terpeno sequências presentes em UniProt.

[144] Os contigs foram examinados quanto aos quadros de leitura abertos que codificam as proteínas de sintase de terpeno de comprimento total, com base nos alinhamentos fornecidos pela análise de BLASTX. O seguinte critério para identificar um comprimento total de proteína foi usado: tanto as sintases de sesquiterpeno quanto as sintases de monoterpeno portam um motivo de RRxxxxxxxxW (RRX8W) perto de seu início de N-terminal. Um códon de ATG no quadro deve mapear 2 0 a 7 0 códons a montante da região que codifica o motivo RRX8W, ou sua posição ortóloga, a ser identificada como um códon de partida.

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Exemplo 3: Clonagem de Sintase de Santaleno de Cinnamomum Camphora (CiCaSSy) [145] Os quadros de leitura abertos de comprimento completo foram amplificados a partir do cDNA de C. camphora. Os iniciadores diretos e inversos como mostrado na Tabela 1 foram projetados e usados para amplificar os quadros de leitura abertos totais de tal modo que o quadro de leitura fosse fundido à terminação C de sua etiqueta His-6 no plasmídeo pCDF-DUET- 1 (Novagen Corporation). Um total de 37 ORFs de sintase de terpeno diferentes foram clonados. Usando os iniciadores TS23fw e TS23re (Tabela 1), três cDNAs diferentes, relacionados de modo muito próximo, foram obtidos, que codificaram proteínas com SEQ ID NO: 10 (TS23-1), SEQ ID NO: 11 (TS23-2), e SEQ ID NO: 3 (TS23-3):

Tabela 1

nome	Sequência	Clones
TS23 direto	atatggatcctATGGACTCCATGGAGGTACGCCGCTCTG (SEQ ID NO: 8)	TS23-1, TS23-2, TS23-3
TS23 inverso	atatgcggccgcTCATCCCAAGTTGATGGATTCCTTCAATGGCACTG (SEQ ID NO: 9)

[146] As variantes clonadas foram analisadas através do sequenciamento do inserto de TS. Diferentes variantes foram introduzidas em BL21-RIL de E.coli de

competência química	(Stratagene), por transformação por
choque térmico, e	selecionadas em LB-ágar com 1% de
glicose, 50 ug/ml	de espectinomicina e 50 ul/ml de

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82/120 cloranfenicol. Os transformantes foram transferidos para meio líquido dew 5 ml de LB com 1% de glicose 50 ug/ml de espectinomicina e 50 ug/ml de cloranfenicol e desenvolvidos de um dia para o outro a 37 °C e 250 rpm.

[147] 200 μΐ dessas culturas foram transferidos para meio de 20 ml de LB com o antibiótico adequado em um frasco de 100 ml Erlenmeyer, e incubados a 37 °C, 250 rpm até ο A600 ser 0,4 a 0,6. Subsequentemente, 1 mM de IPTG foi adicionado e as culturas foram incubadas de um dia para o outro a 18°C e 250 rpm. No próximo dia, as células foram colhidas por centrifugação (10 min 8000xg) , o meio foi removido e as células foram ressuspensas em 1 ml de tampão de ressuspensão (50 mM de Tris-HCl pH = 7,5, 1,4 mM de βmercaptoetanol; 4 °C). As células foram perturbadas por agitação 2 vezes por 10 segundos com 0,2 g de areia de zircônio em uma máquina de Fastprep à velocidade 6,5. As partículas insolúveis foram subsequentemente removidas por centrifugação (10 min 13.000xg, 4 °C) . A proteína solúvel foi imediatamente usada para ensaios de enzima.

Exemplo 4: Ensaio de Enzima In Vitro [148] Para os ensaios de enzima, em um tubo de vidro, uma mistura foi feita com 800 μΐ de tampão de MOPSO (15 mM de MOPSO (ácido 3-[N-morfolino]-2-hidroxipropano sulfônico) pH = 7,0, 12,5% de glicerol, 1 mM de MgC12, 0,1% de tween 20, 1 mM de ácido ascórbico, 1 mM de

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83/120 ditiotreitol). 100 μΐ de solução de enzima purificada e 5 μΐ de difosfato de farnesila ou difosfato de geranila (10 mM, Sigma FPP seco por evaporação e dissolvido em 50% de etanol) e 20 μΐ de Na-ortovanadato a 250 mM. Essa mistura foi incubada a 30 °C com agitação branda por 2 horas. Subsequentemente, a fase de água foi extraída com 2 ml de etilacetato. A fase de etilacetato foi coletada, centrifugada a 1200xg, seca em uma coluna de sulfato de sódio e analisada por GC-MS.

[149] A análise de GC-MS foi realizada em um sistema de Agilent Technologies, compreendendo um sistema de GC de 7980A, um detector de MSD inerte 597C (70 eV), um autoamostrador 7683 e injetor e uma coluna Phenomenex Zebron ZB-5ms de 30 m de comprimento x 0,25 mm de diâmetro interno e 0,25 pm de fase estacionária, com uma pré-coluna Guardian (5 m). Nesse sistema, 1 μΐ da amostra foi injetado. A câmara de injeção foi a 250 °C, a injeção foi sem divisão e a coluna ZB5 foi mantida a 45 °C por 2 minutos após os quais um gradiente de 10 °C por minuto foi iniciado, até 300 °C. Os picos foram detectados em cromatogramas da contagem iônica total. Os compostos foram identificados por seu índice de retenção e por seu espectro de massa em combinação com a comparação do espectro de massa para as bibliotecas (NIST8 e in-house).

[150] Constatou-se que o Clone TS23-3 (SEQ ID NO:

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3) produz santalenos nesse ensaio in vitro e, assim, codifica uma sintase de santaleno, e foi denominado CiCaSSY. Os clones relacionados de modo próximo TS23-1 (SEQ ID NO: 10) e TS23-2 (SEQ ID NO: 11) não produziram qualquer santalenos ou outros sesquiterpenes no ensaio in vitro.

Exemplo 5:

Expressão de Sintase de Santaleno em E. Coli [151] Para a produção de sesquiterpenes em E. coli, a sintase de terpene deve ser fornecida com o substrato FPP. Cicassy foi, portanto, co-Rhodobacter com um plasmideo contendo todos os genes necessários para a síntese de FPP (pBb A5c-MevT-MBIS-NPtll). Esse plasmideo é uma variante de plasmideo pBbA5c-MevT(CO)-MBIS(CO, IspA) (Peralta-Yalta et al, 2011), em que o marcador de resistência de cloranfenicol foi trocado por um marcador de resistência à canamicina (NptII). A partir desse plasmideo, um fragmento de par de base 728 que varia do sítio de Apal para o início da cloranfenicol aciltransferase (CAT) foi amplificado com o uso de Phusion polimerase e os iniciadores P7 GCTGTTAGCGGGCCCATTAAG (SEQ ID NO: 12) e P2 GATATTCTCATTTTAGCCATTTTAGCTTCCTTAGCTCCTG (SEQ ID NO: 13), e o gene de neomicina fosfotransferase II (NptII) de pBINPlus (van Engelen 1995) como uso dos iniciadores P5 C AGGAGCTAAGGAAGCT AAAAT GGCT AAAATGAGAAT AT C (SEQ ID NO: 14) e P6 C CAAGC G AGCT C GAT AT C AAACT AAAAC AATT C ATC C

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AG (SEQ ID NO: 15) . Os fragmentos foram isolados de gel e usados como modelo para uma PCR de fusão, com o uso dos iniciadores P6 e P7 e amplificaram um fragmento de fusão de 1524 bp. Esse fragmento, e pBbA5c-MevT(CO)-MBIS(CO, IspA) foram ambos digeridos com enzimas de restrição de Apal e Saci e o fragmento de vetor de pBbA5c-MevT(CO)-MBIS(CO) e o fragmento de PCR de fusão digerido foram ligados e transformados em DH5alfa de E. coli por eletroporação, e colônias recombinantes foram selecionadas em LB+canamicina. A presença dos elementos genéticos incluindo o operón de trajetória de MEV e o gene de NptII foi confirmada isolando-se o DNA de plasmideo de miniprep e a análise desse DNA por digestão com Apal e Saci, produzindo bandas de aproximadamente 12.000 bp e 1.500 bp. O plasmideo resultante foi chamado de pBbA5Sc-MevT-MBIS-Npt11.

[152] Além disso, o fragmento de 1.670 bp de BamHI Notl do vetor pCDF-DUET-1, em que CiCaSSY tinha sido clonado, foi transferido para pACYC-DUET-1 (Novagen Corporation), para uma comparação justa com SaSSY, que também tinha sido introduzido em pACYC-DUET-1 dessa forma.

[153] O primeiro plasmideo pBbA5c-MevT-MBIS-NPtII foi transformado por choque térmico em células BL21DE3 competentes comercialmente disponíveis (New England Biolabs cat C2527). Os transformantes foram selecionados em placas de LB contendo canamicina a 50 ug/ml e glicose a 1%.

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86/120 [154] Um transformante pBbA5c-MevT-MBIS-NPtII fol desenvolvido e as células competentes foram produzidas com o método de CaCÍ2. Brevemente, 10 ml de cultura desse transformante em LB + 1% de glicose + 50 ug/ml de Canamicina foram desenvolvidos até A600 = 0,5.

[155] Subsequentemente, as células foram centrifugadas a 8000xg por 5 min, ressuspensas em 1 ml de 100 mM de CaCÍ2 gelado, centrifugadas novamente de 5 minutos a 8000xg, o sobrenadante foi descartado e as células foram ressuspensas em 1 ml de 100 mM de CaC12 gelado e 50 ul dessas células foram usadas para a transformação. As células foram transformadas por choque térmico com 50 ng de plasmídeos pACYCDuet, pACYCDuet_TS231, pACYCDuet_CicaSSy e pACYCDuet_Sassy. Os transformantes foram selecionados em placas de LB contendo canamicina a 50 ug/ml, cloroanfenicol a 50 ug/ml e glicose a 1%.

[156] Um tubo com 5 ml de meio de LB com canamicina a 50 ug/ml, cloroanfenicol a 50 ug/ml e glicose a 1% foi inoculado com uma colônia contendo ambos os plasmídeos e desenvolvido de um dia para o outro a 37 °C. A cultura de um dia para o outro foi usada para inocular 20 ml de LB mais antibiótico (mas sem glicose) a um OD de 0,1. A cultura foi desenvolvida a OD 0,45 a 0,55 e, então, induzida com 20 ul de IM a IPTG. A cultura foi sobreposta com 2 ml de dodecano para impedir a evaporação de

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87/120 sesquiterpenes do frasco e desenvolvido de um dia para o outre a 28*C e 250 rpm.

[157] Para a análise de GC-MS, o dodecane foi separado da cultura por centrifugação e diluído 200 vezes com acetato de etila. 2 μΐ foram analisados por GC/MS com o uso de uma cromatografia de gás como descrito em detalhes por Cankar et al. (2015).

[158] Ts23-1 não produz uma quantidade detectável de qualquer terpene nesse sistema (Figura 9). Constatou-se que o produto principal do SaSSY nesse sistema é trans αbergamoteno (Figura 11); constatou-se que o produto principal de CiCaSSY é α-santaleno (Figura 10).

Exemplo 6:

Meio de RS102 [159] 20 g/1 de extrato de levedura (Gistex, DSM) e 0,5 g/1 de NaCl são dissolvidos em água destilada, o pH é trazido para 7,4 com NaOH. A água destilada é adicionada a um volume de 930 ml, e o meio é esterilizado com vapor.

[160] Um ml de MgSCU-TELO a 0,5 g/ml estéril, 2 ml de microelementos filtrados estéreis (80 g/1 de (NH₄) 2Fe (S04) 2-6H_0; 6 g/1 de ZnSO,i-7H₂0; 2 g/1 de MnSOiILO; (0,2 g/1 NiSO,-6H20, opcionalmente); 2 g/1 de Vitamina C) , e 2 ml de solução de CaFe autoclavada (75 g/1 de CaCL2H2O; 5 g/1 de FeC13-6H2O; 3,75 ml de HC1 (37%)) e 66 ml de solução de glicose são adicionados ao meio esterilizado.

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Exemplo 7:

Bactérias e Condições de Cultura [161] A cepa de Rhodobacter sphaeroides Rs265-9c foi obtida de Rhodobacter sphaewides cepa ATCC 35053 [adquirida junto à American Type Culture Collection (ATCC Manassas, VA, EUA - www.atcc.org); número 35053; Rhodobacter sphaeroides (van Niel) Imhoff et al., isolada de um lago de assentamento de esgoto em Indiana e depositada como Rhodopseudomonas sphaeroides van Niel] após dois ciclos de mutagênese e foi usada como o hospedeirobase para a construção de cepas recombinantes que têm produção aprimorada de santaleno. Todas as cepas de R. sphaeroides foram desenvolvidas a 30 °C em meio RS102, exceto se mencionado de outro modo.

[162] As cepas de E. coli foram cultivadas a 37 °C em meio de LB (Becton Dickinson, Sparks, MD, EUA) . Para a manutenção de plasmideos em cepas de E. coli recombinante e R. sphaeroides, ampicilina (100 mg/1), cloranfenicol (30 mg/1) e/ou neomicina (25 a 50 mg/1, dependendo do plasmideo), foram adicionados ao meio de cultura. As culturas liquidas foram rotineiramente desenvolvidas de modo aeróbico em um agitador giratório. Quando os meios sólidos foram necessários, ágar (1,5% de concentração final) foi adicionado.

Exemplo 8: Clonagem de Sintase de Santaleno (CiCaSSy)

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89/120 e Construção de plasmideo p-m-LPppa-CiCaSSy-mpmii alt [163] Para a expressão de sintase de santaleno de

Cinnamomum camphora em R. sphaeroides, o ORF de comprimento total foi sintetizado e otimizado de modo personalizado em termos de uso do códon para R. sphaeroides por Genscript EUA Inc. (Piscataway, New Jersey, EUA) . Adicionalmente, a sequência para o promotor LPppa foi adicionada em 5' do gene (SEQ ID NO: 2) . O construto foi entregue clonado em plasmideo pUC57. 0 construto completo foi excisado do plasmideo com o uso das enzimas de restrição EeoRI e BamHI (em 5' e 3', respectivamente) . O fragmento contendo ο promotor e o gene (1758 bp) foi ligado ao vetor p-m-mpmii alt anteriormente digerido com as mesmas duas enzimas de restrição. A mistura de ligação foi transformada em células de E. coli S17-1. Transferência de p-m-LPppa-CiCaSSy-mpmii alt (Figura 1) de S17-1 para R, sphaeroides Rs265-9c por conjugação foi realizada com o uso de procedimentos padrão (Patente n° U.S. 9260709B2). A sequência de nucleotideos do construto LPppa- CiCaSSy é fornecida em SEQ ID NO:2; a sequência de proteínas é representada em SEQ ID NO:3.

Exemplo 9:

Construção de plasmideo p-m-SPppa-MBP-CiCaSSy-mpmii alt [164] Para a expressão do gene CiCaSSy em combinação com a etiqueta de MBP sob a regulação do

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90/120 promotor SPppa, o construto SPppa-MBP foi sintetizado por Genscript EUA Inc. (Piscataway, New Jersey, EUA) . 0 gene que codifica MBP foi otimizado por códon para a expressão em R. sphaeroides. O construto SPppa-MBP foi, então, fundido na sequência de CiCaSSy e clonado no vetor p-mmpmii alt anteriormente diferido com EcoRI e BamHI. Brevemente, o construto SPppa-MBP foi amplificado com o uso dos iniciadores 5’- CTGTCCATGATCTTGTCGTCGTC -3 (SEQ ID NO: 16) e 5’-ACTGGCCTCAGAATTCAAATTTATTTGCTTTGTGAGCGGATAAC-3’ (SEQ ID NO: 17), e CiCaSSy foi amplificado com iniciadores 5’-CAAGATCATGGACAGCATGGAAGTC-3’ (SEQ ID NO: 18) e 5’TTTATGATTTGGATCCTCAGCCCA-3’ (SEQ ID NO: 19). Os amplicons e os vetores digeridos foram, então, montados com o uso da mistura de enzima InFusion® de Clontech. A mistura de reação foi transformada em células de E. coii S17-1.

[165] A Transferência de p-m-SPppa-MBP-CiCaSSympmii alt (Figura 2) de S17-1 em R. sphaeroides Rs265-9c por conjugação foi realizada com o uso dos procedimentos padrão (Patente na U.S. 9260709B2) . A sequência de nucleotideos do construto SPppa-MBP-CiCaSSy é fornecida em SEQ ID NO:4; a sequência de proteínas é representada em SEQ ID NO: 5.

Exemplo 10:

Construção de plasmideo p-m-PcrtE-TKX-CiCaSSy-mpmii alt

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[166]	Para	a expressão do	gene	CiCaSSy	em
combinação	com a	etiqueta de TRX	sob a	regulação	do
promotor PcrtE, o	construto PcrtE-TRX	foi sintetizado	por
Genscript	EUA Inc.	(Piscataway, New Jersey,	EUA). 0	gene

que codifica TRX a partir de E. coli foi otimizado por códon para a expressão em R. sphaeroides. O construto PcrtE-TRX foi, então, fundido na sequência de CiCaSSy e clonado no vetor p-m-mpmii alt anteriormente diferido com EcoRI e BamHI. Brevemente, o construto PcrtE-TRX foi ampliado com o uso dos iniciadores 5'CTGTCCATAATCTTGTCGTCGTCAT -3’ (SEQ ID NO: 20) e 5’ACTGGCCTCAGAATTCCGCTGOTGAACG -3’ (SEQ ID NO: 21), e CiCaSSy foi ampliado com os iniciadores 5'CAAGATTATGGACAGCATGGAAGTCC -3’ (SEQ ID NO: 22) e 5’TTTATGATTTGGATCCTCAGCCCAGGTT-3 ’ (SEQ ID NO: 23) . Os amplicons e os vetores digeridos foram, então, montados com o uso da mistura de enzima [167] InFusion® da Clontech. A mistura de reação foi transformada em células de E. coli S17-1.

[168] A transferência de p-m-PcrtE-TRX-CiCaSSympmii alt (Figura 3) de S17-1 para R.sphaeroides Rs265-9c por conjugação foi realizada com o uso de procedimentos padrão (Patente ns U.S. 9260709B2).

[169] A sequência de nucleotideos do construto PcrtE-TRX-CiCaSSy é fornecida em SEQ ID NO: 6; a sequência

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92/120 de proteínas é representada em SEQ ID NO: 7.

Exemplo 11:

Construção do plasmídeo p-m-PcrtE-TRX-SaSSy-mpmii alt [170] Para a expressão de sintase de santaleno de Santalum album (SaSSy) em R. sphaeroides em combinação com a etiqueta de TRX sob a regulação do promotor PcrtE, o ORE de comprimento total junto com o TRX de E. coli foi sintetizado de e otimizado modo personalizado em termos de uso do códon para R. sphaeroides por Genscript EUA Inc. (Piscataway, New Jersey, EUA). Adicionalmente, a sequência para o promotor PcrtE foi adicionada em 5' do gene (SEQ ID NO: 24). O construto foi entregue clonado em plasmídeo pUC57. O construto completo foi excisado do plasmídeo com o uso das enzimas de restrição EcoRI e BamHI (em 5' e 3', respectivamente). O fragmento contendo o promotor e os genes (2335 bp) foi ligado ao vetor p-m-mpmii alt anteriormente digerido com as mesmas duas enzimas de restrição. A mistura de ligação foi transformada em células de E. coli SI7-1.

[171] A transferência de p-m-PcrtE-TRX-SaSSy-mpmii alt (Figura 4) de S17-1 para R. sphaeroides Rs265-9c por conjugação foi realizada com o uso de procedimentos padrão (Patente ns U.S. 9260709B2) .

[172] A sequência de nucleotídeos do construto PcrtE-TRX-SaSSy é fornecida em SEQ ID NO: 24; a sequência

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93/120 de proteínas é representada em SEQ ID NO: 25.

Exemplo 12:

Frascos de Agitação em Condições de Desenvolvimento [173] As culturas de semente foram realizadas em frascos de agitação de 100 ml sem defletores com 20 ml de meio de meio de RS102 com 100 mg/1 de neomicina e um ciclo de estoque de glicerol. Os frascos de cultura de semente foram cultivados por 72 horas a 30 °C em um incubador de agitação com uma órbita de 50 mm a 110 rpm.

[174] No final das 72 horas, o QD600 da cultura foi avaliado para calcular o volume exato da cultura a ser transferida para os frascos maiores.

[175] Os experimentos de frasco de agitação foram realizados em frascos de agitação de 300 ml com 2 defletores de fundo. Vinte ml de meio de RS102 e neomicina a uma concentração final de 100 mg/1 foram adicionados ao frasco junto com 2 ml de n-dodecano estéril. O volume do inóculo foi ajustado para obter um valor de QDG00 final de 0,05 em 20 ml de meio.

[176] Os frascos foram mantidos por 72 horas a 30 °C em um incubador de agitação com uma órbita de 50 mm a 110 rpm. Os experimentos de frasco de agitação foram realizados em suplicatadas.

Exemplo 13:

Preparação de Amostra para Análise de Teor de

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Isoprenoide em Fase Orgânica [177] As culturas foram coletadas 72 horas após a inoculação em tubos de PP de 50 ml pré-pesados que foram, então, centrifugados a 4500xg por 20 minutos. A camada de n-dodecano foi transferida para um tubo de microcentrífuga para análise de GC posterior.

[178] Dez microlitros de laureate de etila foram pesados em uma ampola de vidro de 10 ml à qual 800 μΐ da solução de dodecano isolada foram adicionados e pesados. Subsequentemente, 8 ml de acetona foram adicionados à ampola para diluir a concentração de dodecano para uma análise de GC mais precisa. Aproximadamente 1,5 ml do dodecano contendo terpeno em solução de acetona foram transferidos para uma ampola de cromatografia.

Exemplo 14:

Cromatografia de Gás [179] A cromatografia de gás foi realizada em um Shimadzu GC2010 Plus equipado com uma coluna capilar Restek RTX-SSil MS (30 m x 0,25 mm, 0,5 pm) . As temperaturas do injetor e detector de FID foram definidas para 280° C e 300° C, respectivamente. O fluxo de gás através da coluna foi definido em 40 ml/min. A temperatura inicial do forno foi de 160° C, aumentada para 180° C a uma taxa de 2^o C/min, aumentada adicionalmente para 300° C a uma taxa de 50° C/min, e mantida a essa temperatura por 3 min. O volume

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95/120 de amostra injetado foi de 1 ui com uma razão de divisão de 1:50, e o fluxo de constituição de nitrogênio foi de 30 ml/min

Exemplo 15:

Análise de terpenos produzidos por CiCaSSy em R. sphaeroides [180] A Figura 5 mostra o cromatograma obtido analisando-se a fase orgânica isolada de todas as culturas de R. sphaeroides que expressam o gene de CiCaSSy (cepas do

exemplo 9, 10	e 11). Quatro	compostos	principais	foram
identificados:	α-santaleno (A)	, trans-a-	-bergamoteno	(B) ,
epi-β-santaleno	(C) e β-santaleno (D) .	0 terpeno	mais

abundante foi o a-santaleno, seguido por trans-abergamoteno e β-santaleno. Visto que nenhum santaleno purificado está disponível para ser usado como os padrões, a titulação de terpeno foi calculada com base no fator de resposta de GC obtido com o terpeno valenceno. A produção total de terpeno (área cumulativa sob a curva para todos os 4 terpenos) obtida nas cepas a partir do exemplo 9, 10 e 11 são 5,3 ± 0,12 g/kg de dodecano, 5,8 ± 0,29 g/kg de dodecano e 3,4 ± 0,09 g/kg de dodecano, respectivamente. A razão para as quatro espécies de terpeno foi conservada em todas as cepas.

Exemplo 16 Meio de Semente para Cultivo de Batelada Alimentada

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96/120 [181] Os seguintes componentes foram dissolvidos em 1 1 de água: 20,8 g de extrato de levedura, 10,3 g de MgSOi - 7 H₂0, 86 mg de ZnSCU -7H₂0, 30 mg de MnSCXi H2O, 1,1 g de CaCb -2H₂0, 0,96 g de FeS0₄7H20, 1,44 g de KH2PO4 e 1,44 g de K2HPO4. O pH foi ajustado para 7,4 com 10 M de NaOH. Após a esterilização (121 °C, 20 min), 50 ml de 50% (p/p) de glicose, e 1 ml de 0,1 mg/ml de Sulfato de neomicina é adicionado por litro do meio.

Exemplo 17

Meio para Cultivo de Batelada Alimentada [182] Os seguintes componentes foram dissolvidos em 1 1 de água: 25 g de extrato de levedura, 1,7 g de MgSOi -7H20, 0,10 g de ZnS0₄-7H₂0, 35 mg de MnSOi H2O, 1,3 g de CaC12 -2H₂0, 0,17 g de FeC12 -6H₂0. 1,7 g de K2HPO4, 1,7 KH2PO4, 1,1 g de (NH4)2Fe(SO4) 2 KH₂0, 2,8 g (NH4)2SO4, 1,1 g (NH4)H₂P0₄, 1,9 g MgC12 -6H₂0 e 1 ml de antiespuma.

[183] Após a esterilização (121 °C, 20 min), o pH é ajustado para 7,0 com 25% de solução de hidróxido de amônio. Por litro de meio estéril, 60 ml de 50% (p/p) de glicose, 1 ml de 0,1 mg/ml de Sulfato de neomicina, 4 mg de Niacina, 8 mg de Tiamina.HCl, 4 mg de Nicotinamida, 0,2 mg de Biotina e 150 ml de n-dodecano foram adicionados.

Exemplo 18

Fermentação de Batelada Alimentada em Condições de Cultivo

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97/120 [184]

As culturas de semente para as cultivações de batelada alimentada foram preparadas por inoculação de 500 ml de meio de semente estéril (exemplo 16) adicionandose 1 ml de estoque de glicerol da cepa adequada de Rhodobacter sphaemides, e incubação por 48 horas a 30 °C.

[185]

Em um vaso fermentador de 1 1, 350 ml de meio de batelada alimentada foram esterilizados e suplementados com glicose esterilizada (filtro), Neomicina, vitaminas e n-dodecano como indicado (exemplo 17) . Através da adição de 50 ml de cultura de semente, o meio foi inoculado e incubado por aproximadamente 24 horas a 30 °C, a agitação de 600 rpm, fluxo de ar de 0,3 wm e um pH de 7 (ajustado por adição automatizada de 12,5% de solução de hidróxido de amônio). Após 24 horas, a agitação foi aumentada a 1.200 rpm, e 450 a 500 g de 50% (p/p) de glicose foi alimentado ao fermentador em 100 horas.

Exemplo 19

Fermentação de Batelada Alimentada de Preparação de Amostra de GC [186] Amostras em caldo de aproximadamente 20 ml foram coletadas durante um cultivo de batelada alimentada. Dez microlitros de laureate de etila foram pesados em uma ampola de vidro de 10 ml à qual 0,8 ml de amostra em caldo foram adicionados e pesados. Subsequentemente, 8 ml de acetona foram adicionados à ampola e a mistura de caldo de

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98/120 acetona foi incubada à temperatura ambiente por 25 minutos enquanto agitada a 400 rpm. Aproximadamente, 1,5 ml da mistura de caldo de acetona contendo terpeno foi transferido para uma ampola de cromatografia e usado para análise de acordo com o exemplo 14.

Exemplo 20

Comparação de produção de terpeno por cepas de Rhodobacter spaeroides portando CiCassy e SaSSy [187] As cepas de Rhodobacter spaeroides portando CiCaSSy (p-m-SPppa-MBP-CiCaSSy-mpmii alt, exemplo 10) ou SaSSy (p-m-PcrtE-TRX-CiCaSSy-mpmii alt, exemplo 11) foram cultivadas em modo de batelada alimentada de acordo com o exemplo 18. As amostras foram retiradas do caldo de fermentação em vários pontos no tempo e foram analisadas para a produção de terpenos de acordo com os exemplos 19 e 14. A concentração de terpenos totais produzida (áreas cumulativas dos picos A a D na Figura 5) foram quase iguais para ambas as cepas ao longo do cultivo (Figura 6A) , e uma concentração de terpeno final de aproximadamente 5,5 g/kg de caldo foi obtida. Ao longo de 120 horas de cultivo de batelada alimentada, os terpenos produzidos pela cepa CiCaSSy consistiram em aproximadamente 49% de a-santaleno (Figura 6B), 21% de β-santaleno (Figura 6C) e 25% de transα-bergamoteno (Figura 6D), enquanto a cepa SaSSy produziu aproximadamente 28% de α-santaleno (Figura 6B), 14% de β

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99/120 santaleno (Figura 6C) e 52% de trans-a-bergamoteno (Figura 6D). As porcentagens de α-santaleno e β-santaleno produzidas pela cepa CiCaSSy foram respectivamente 1,8 vezes e 1,5 vezes superiores àquela da cepa SaSSy. Em contrapartida, a fração de trans-a-bergamoteno produzida pela cepa CiCaSSy foi 2 vezes inferior à da cepa SaSSy.

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and	genetic	transformation.	Planta 243, 847	a 887.
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102/120 [208] Zulak, K., Jones, C, Moniodis, J., Bohlmann,

J., 2016. Terpene synthases from Santalum. US9260728.

Sequências

Seq Id No: 1

CiCaSSy - Cinnamomum camphora

Sequência de Nucleotideos

ATGGACTCCATGGAGGTACGCCGCTCTGCAATCTATCACTCGACCnTFGGGATATTGATAGCATTCGCGCC

CTGCTCGCAAG AAG AGACTGCACTG CTGCAG CTGCATTÕAGTCCTG ACC ATCACAAAAGACTCAAGGAAA

GAATTCAGCGCCGGCTACAAGACATCACACAGCCACACCATCTGCTTGGATTGATCGACGCTGTCCAACGC

CTCGGTGTGGCCTACCAGTnGAGGAAGAAATCAGTGACGCACTGCATG6GCrrCACTCAGAGAi8£ACGG

AGCATGCAATTAAGGACAGTCTGCACCACMATCTCTCTAnTFAGATTGCTTAGi^AACATGGGTGTAACC

TTTCATCAGACATAnCAACAAATTTAAGAAG G AAGGAGGAG GTTTCAÁGGCAAG CCTATGTGAGGATGC

AATGGGACmTGAGCTTGFATGAGGCTGTACGTCnAGCGTCAAAGGTGAAGCCATCKGGAGGAAGCrC

AGGTCTTCTCGATCGCGAATTTGAAGAnCTGATGGAAAGGGTGGAGAGGAAGOrGGCAGATAGAATjMSA

ACATGCCTTGGAGATCCCCTTGTATTGGAGGGGSCCGAGACTGGAAGCFAGATGGTACATAGATGTATAT

GAAMGGMGATGGGAGGATTGATGACTFGCnGATTTTGCAAAGCTAGATTTCAACAGGGTGCAAATGT

TGTACCAAACXGAACTGAAGgAATTATCAATGTGGTGGGAATFGCTGGGGlTACCAGCGAAGATGGGGTT

CTTCCGAGACAGACTATTGGAGAACCATCTCTTTTCAATTGCAGTGGTFGTCGAGCCTCAATACTCÍXAGTG

TAGAGTAGCAATTACAAAAGCCATAGTCCnATGACAGCAATGGATGACTrHATGATGTGCATGGTrrGCC

AGATGAGCTAAAAGTCTTCACGGACACCGTTAATCGGTGGGATTTAGAGGGAATTGATCAACTACCAGAG

TATATGAAGCTGTACTACnGGCGTTATATAATACAACCAATGAG^CGCATACATCATCCTCAAGGAGAA

GGGAlTCMTGCTAOOilWCIGAAGAAACTGFGGGCAATGCAAAGIAACGCGTACTlICGGGAAGCTC

AATGGnCÂACAGTGGTTACÂIACCrAAATTTGATGAGTATTTAGACAATGCnTAffrCTCAGTlGGGGCGC

CCTTTGTATTGGGTCTCTCAlACCCCATGATACAACAACAAATATCAAAGGAGGAAATTGATTTAATCiXCG

AAGATCTAAATCTCCTCCGTTGGGCATCGATCATAnTCGACTATATGATGATnGGÍXACTTCAAAGGCTG

AGCAACAACCTGGGGACGTGC€AAAATCCATCCAATGTTATAT6CATGAAACfGGTAGnCGGAGGAAGT

TGCAGCAAACCATATCAGGGACCTCATCAGTGATGCRGGAAGGAAGTGAATGCAGAGTGTFIGAAACCT

ACnCTCTGTCAAAGCATTACGTGGGAGTAGCTCCAAATTCGGCTAGGTCTGGAGTGCTGATGTACCATCA

TGACmGATGGCnTGCAAGTCCCCATGGCAGGACTAATGCTCATATa^GTCAATATTTmGAACCAGT

G(XAnGAAGGAATCCATCAACnGGGATGA

Seq Id No: 2

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103/120

LPppa-CiCaSSy - Cinnamomum Camphora

Sequência de Nucleotideos (Otimizada com Códon)

C&4 GCTll G G4 GGA4 7TOA4 C7T4 GA TOA G W GA G677.4Q4 TATO GAC AGOATGGA AGTC(XiGCGGTCGGCGA PC 1AUGAGAG C-AUGT'l Cl GGGAGATU-l ,1ACAGCATl .XXi CXXXxCTCCTGGClilCGilfXlGGACTilfL'ACGGOXX'XXKXlGt'CCTflTiXjCCClJAfX^A OGATA AGCGCC' FGAAGG AG CG CATC CAGC G C CG C CTCCAG G.ACATC ACCCAGCC (x:.AC(L\T<TrocTaxxx>T(oAT(XkxcrxXz(;TGCACi(:G(x:^fixxKx:GTG(ia:TA('OA G7TOM(XiAAaVL\T(lT€X^ChVM.M:(X^<K;AC<XXXnx:CATTiX}GA(L\ACACCGA GCACGCaATCAAGGA(MXJCTGCACCATACGTCGCTCTATTTCCGCCTG(jTCCGC θΑα·θΑτααοτ(χυ^χ3τσΓοαΊΧ'ίθ(.^Υί::ΑΤ(7ΐΎθ^ΑνΐΑΑαττϋΑΑαχ4ίχΐΑΑ(·ίθο GGCGt.iC.Tl CAAGG€.-CTULjCTC 1'GCGAGGAüGCcATí.M.tGCiJTGC HJTCGCTGTAI.

G.AGGCCGTG(XXX.n'CTCG(FFGAACKKXOAGCKXlATCCTGGAGGAAGCC<T\GGTG ITCTCGATCGCCAACOI'GAA.GATCCTCATGGAGCGCGTGGAGCGCAAGCTCGCC gACClX3ATCGAGUATG(XX1TGGA(lATCCCGCTCTATI1.X.XGl!GCC’i.'CG<..1.3TCTG (lA(lGCC(X.Urr<:K7FACAT(XLAC(yr(rrA^rIXjAG.₄AA.<.K:iAA<:JA(XlGCiXlCATCGACXlA(J ClXXlIdXI^CjWlltXXiAAGi'TGGAi'lTi'AAi'XXlC'fl'IXXIMlASXlCTk^TlVi'UAGAiXXl AGCTGAAGGAGCrCTi .'41 ATGTGG’i 'G( sG AGCTGCd'GGf tCCT(1C< ..XX-K IC-AAGATí 1G GOT 1 CTIGCGCGACCGCCi’GC· TCGAGAA.CCACC ICaTCTGGAiXXXO.HGG'FGG Γ GGAGÍXX ’CAGTAC1CG CAGTG( XGCGT( 1GCCATC ACC AAGGCG ATC( 4TGCTG AT GACGGiJGAlGGAiJG ΑΟΊTCTA1GAC G IXlCATGUCColGUCGG AUG AG C ICAAGGI GT1X).ACCGAi:A{h)A:iTGAA(?(?(lC'TG(lG.A<'(/r(lGA(X:iGCAr(XlACCAGCT(](XXjGA GTÁOÁTGAAQCTGTAÇTAT'CTGGÇGCTCTÁCAACACÇAÇGAA(’GAGA(XlGC('iTA^:T A1X:ATCX^LAA(l<}.A.GAA(:XXl(:w:AA(Xl(XLA(XXX4TTA(X^XhUGAA<‘X7FCT(l(l (l(XlAr(^JA.(llin:iAA(XLXrrAr’rT(X’il(7.1A(KLXXlAGTG(lTl’(XACTC<T(l(iCTA(;

ATC;CCGAAtyrTCGAC(UGTATCTCGA{jAA(XlC(X/rCGlllTCGGT(X^X’G(XXie<j TrCG’rGClCGGCC'TCTCGTArCCCM’GArCt'AGCAGCAGATCTCCAAGGAAGAGA TCGACCTG ATCCC CGAGG ACCTC AAC CTGCTCCG CTG GO CCTCG ATCATCTTC CG (^,(TGTA(’(iA(XlA(]('TGG(X]A<’CT(X1AAGil(^,CGAfXlAQ('AGCl.K(':(XlC(M.CGTGCC C AAGTCGATCC AGTG CTAT ATG C ATGAílYCG G GCTCGTCGGAG GAAGTGGCGG C CAAÍ.Xh\TAK.XXX:(.b4ÍX;i^,(L\.T(:i'CCXJA(lGCX.rFG(lAA(l(lAA(}T(lA.A{:GCí?(}.A.Crirt [209] Sequência em itálico é o promotor LPppa.

Seq Id No: 3

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104/120

CiCaSSy - Cinnamomum Camphora

Sequência de aminoácidos

MDSMEV’RRSAIYHSTEWDIDfflRAUARKDClAAAAl^PDHHKRf.KERIQRRLQBI

ΤίΐΡϊΙΗΕΙΧΙΙ.ΠΙΛν^βΐΙίνΑΥΟ^ΕΕΕΕΪΑΒΛΕΗΟΕΗΕΕΝΤΕΗΑΙΚΒΕΕΜΙΪΤΚΪΑΡΕΕΕ

RQHGLNLSSDíFNKinaíEGQaFKÁSl.CEDAMGULSLYE.AVRI.SWGEAII.EEAQV

FSlANlJnLMERVERKLADRlEH.YLEIFEYWRAPRLE.ARWYIBVYEKEDGiilDDidj lMòyn,DFNRV%MLYQTELI<EL_íSRIWWElJJSIJ^>AKàRJFlⁱ'RDRLl_JEN.HU^;'SIAVVVE

PQ¥S(Á/RVAiTOIVLMTMíDDI¥DVIKLLPDEL^Viniyr\^RWDLE(lIDQLPEYM

KIAYLMANTTNETAYIIldíEKÁll^.miYLKKLWMíQSNA¥FREAQWFNSGYlPK

FDEYlJJMAIA^VGAPFVUli^YPMlQQQ'iSKEEiDLrPEIILNLLJMASlI'FRIA'DnL

ATSKAEQQKtíDVTKSIQCWHETGSSEEVlYANHIRDLISDA.W.EVNAEí.lLKPTSI.

SKHYVG¥.ÃFNSARSGVlAÍYH.HBFDGFASPHGRTNÀHITSrtTEFVÍ^JlJÍESlNIrt

Seq Id No: 4

SPppa-MBP-CiCaSSy - Sequência de Nucleotídeos

GGA4 'HTCímM G4TC4 CA fZGétCGGHf 147C.4 7A.CGACG AC()UCAAGATCTTC

MiGmMiüíKLYAmYXMia^^

GQmeiiMMíXHiníÁlAmaGG£CTM;QLG^^

CGa^;AÜGÇCGCGTTCAAÇ¥yiGGCGAGAÇÇQÇCATCAW

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CACGTT<.LA\GGLRXlAL.kXX..GLXyAAí.KXX?Tni^:GTtKKXXy 1XKz.I.GIX.X.X.tCGGGCAT

CAAGGGLiGÍXJjXXlCCtlÀílCAAGGÂQTiTLiACGAAGGAyiIXXXGW

GCr£ACCiíACüMlfífí/]iMlGAfiri££ÍÍTGAACAAüfL^ÂÂnQX(_:;TgGO£GCCri^

í.X;C(X/TQAÃGTCQIA.TQAGGAAGAGCTGQTGAAGGACCC(XXXÍATCGCGGCCAC 'X1/A ^jÀí.ZÍ.14.1(.5.1.^/. i./. -l-i. - .-..Χ1..(.-ί ^..·ίί..ϋ..1. Xi .1 U.k.-X../. ..(..-/...0.(.1..1/.(.111../. 1(..11/ €</Τ(Χ;Α{Χ1Α(ΧχΧΧ/ταΑΜΧΜ0Α(:ί;ΧΜαΑΐχ:ΧΧ:χ'·{1ΜΧ1Α0αΑίΧίΑ€ΑΑί/ΑΤΓΑΤ

GG ACAGÍlVrGLí AAGTtXXK A.'GG .lUGGtGA'IlirAiX. AUAGClM.TWirCI/GGCtAC.AJ

CíM(XXG<lAT(XX>GGCGCTCClXXXXXXlGCGGGACTG(UCGGCGGC('.X'JCGGO<X(

Γ(;Γ(..(.τΙ. (X XíAC^:U Aí.XATAAíAX.X.Xi.FíiAAGG AlJí X.íUATCCAlií. í X XX.ií.X.A/t.X.lAí íG

AGATCA.CCC’AGCCCCACCArCTCCT(XX/CCTCAl’GGAÍ'GCCGTGCAG(XXX}TGG

GCGTGGanACCAíJnXXUGGAAGAGÀTCTCGGAUGCGCTGCACGGCXnOCATT (XXlAÍ/>kAí/A(3(X/AG(/À(5(KXlVÍ^,CAAÍi(ÍA(/^!rcacr(3CA(X2/«^,AC(3TÍXH'TCTA^rITT (:XJG(X:T(;X71^:X'.XKXJAGCATí.lí.KnOCAV.X7Fí}TCtílXXU.UGATCrrCUUCjAAGTTC AAGAAGGAAQG(XKJC(1(.tCTTí:.:-AAGGCCT(X1(M'TXU.XxAGGACGCCATGGGCCTG (:TUT(>GGIG’ ΓΆΙG AGGí. .X.G 1 GíA..XA,XG 1GGG1G AAíxGGí G.AGGUU.AI í. A.IÍ GG AG GAAGÜUCAGG ΪΧλ nx'TGGATCGtX^AAC-C'lGAAi jATC-Cd'CATkiGAGt'GCi .1FG GAG CGCAAíX^TCCKXojACíXX/AXXX/AGCzVrt/CXX^llAGArCCCílCTCTAT^RKlCíiC (XXX)í:XXXlT(?-TCKLUiGCC(XM<zTCKitT.AGAT(XíACC}TOTATGA(jAA(:M(iAA(ÍiA(XíGO C(3CATCX.lACGAa:TGCTCXlACTTCG<XlAA.G<nX]GACTIXÍAA(X’:GCGT(}(?AGATO ^íJTCTA'rCxA<jACCGAGCT(.íiAi\GGAGCTí'Tí.XJJVfG'riJG’IXlGGAGCTG(TrGGGCd’G· CO/nrX/AÁGATCXlGCTTCTTCíXXX/ACCGCCTQCTCGAGAAíXACCTCTTíXXGA Ta:XX.’GT<?»GTGG1XlGAG(X’XXAAGTA(^XXl(lAGT(}(XXXXlTC(lC(XATÍ’A.<X?-AAGG (XLATCGTkK.TGLlTGAC(XaCGAlXjGA(XlA(.n^XTi\ATGACGTGCATGGCVl'GC(X}G AlJGAGíjl. CAAqG ΓύΊΤί, AGGGAí ;AuGG'I G AACCGi 1 GGGA.CG^rI GGAGGG CATgG ACC AGCTCX'CCGAGT ACA1XLVV.X’TGTACTATCTG GCG CrCTAGAACAGCACG AA αΐΑ(^\.(.ΧΧΧΧ.·’ΊΑΤΑΤ(ΊΑ1ΧΧ:ΊΧ1ΑΑ(1(1ΑαΑΑίΚΚ3σΠΌΑΑ(Χχ·Χ;·Α<:ΧΚ:ΑΤΓΑ(Χ}Τ G_;AUlAAGCTCTGGGCCAl^lCAGTamCGCX^ATmX.XJCGAG€?CCCAGTGGTF C AAf TOG G G CT AC ATC CCQ AMíTTCG AGGAGT ATCTG G AC AAíXX C CTCG TG TCG (1TCG G CGCaXX/TTCGTG CTCXXXX^^XX/ITAIXXXLVIXIATCXÍAG CAG C-ÀG ATCT CG AÀG (3AAG AG ATCGA.CX)TG ATCCCCX/ A GG AC CTCA Aí. XXGCTCC GCTG G GCCT (i:5ATí^AT(7n'CC(X';CTÍlTA(;GACGACí/T(](XXXUXnXXlAA(X)C<:X)AGílA(X:!AGfj

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106/120

GCGGCGAídTGCíXAAGTCGATGCAGTGCTATAWCATGAGACGGGdCínOGG

AGGdiGTGGGGtdCAACeATATCCGCGMIdGATCTCGGACGiXnviGAAGGAAG

TGAACGCCGAGTGCCTGAAGCCGACCTCGCTCTCGAAGCACTACGTGGGC(.]TGG cC(A/CAA(MXhi(xx:(]CT(]G(MM::GTGCTíUTGTÂT(/A(?(UTr3ACTTe(íA€(XX'TT aiCGTCG(XXXMTCXlCC<KW;X?_iVWG<XX;ACAT<ACGAGCATC'n’(?.TTCGAGCC

GGTCCCCCTCAA.GG AG AGCATCAACCTGGGCTG.A.

[210] Sequência em itálico é o promotor SPppa; a sequência sublinhada é o MBP com códon otimizado.

Seq Id No: 5

MBP-CiCaSSy - Sequência de Proteínas

MKIEJgQMAilWiNG^

LdElOjddDI^^

P-M IVVKBf 1 P^PPTvFWRPIPAT ΡΚΊΡΪ Κ&ΚΠΡ^ΛΪ MP NP fU<PVRTWPl· ϊ Λ ΛΓΚΊ

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VGAPF\A.GI^YPMÍQQQISKEEIDIJPIGX_íNUJWASIIFRIYDDLATSKAEQQRí5D νΡ1γΕΚ^::¥ΜΗίπα88Κ^Αή\ΑΝΗ.ΙΕυΐΑΐ.81)Α\νΚΕνΝΑΕΕΕΚΡΊ'8ί^ΚΗΛ·ν(ΐν.Μ’Ν8

AftSQmíYHHDFiyíP\VSPIMTNA]<FrSIFraM³LKESINLG [211] A sequência sublinhada é a MBP.

Seq Id No: 6

PcrtE-TRX-CiCaSSy - Sequência de Nudeotídeos

Petição 870190082172, de 22/08/2019, pág. 113/248

107/120 <XX7rGí;n24AC(7C(X47Y?f?a7íXXzCGGG<XX7<XJ.4C(7CGfX7GGGCC(JC47Y2CG77·

T(.?Cx4r€'GV7C(7(iGXiC#C(.k4(.XK.X/4(X»(7(X>4'3FX.X7CX7C7’G(74.4(.X7GCT(i46'CT4_i47T('.' /477 7'(r(.X.»í.-GA4'/’GGOG(ríGCACGAJ GGGGC»AAi:XX»GAAxWGGC-C.Ai>'(.T CCTOTTGTOG7 W 71X14 /X W7CTTC CGGCC.4 7GCCC G TG.4 CG CG.4 WTC GC x4 GGCGG47’GGGG(X77¥GCCG,4 7UCGG77/GG4 R7ÁC7UACGCU CGxUG’G’Qi CAT ATCTC(lGAQljiaATCATCCAa^ACCGÀC<MCÀGCTXÇGACACaiA^TGCTC.

AAGATGADlüCüCílü ATÇQTiXhWÜAGΑΠ2β£ΙΧ1^ ACCGlXjGCc.fVVç.XGAACATCGACLAGAA.CGCGGGCACXK.l(X<CGGAAAl AlXàGlo AXUGU££M^IM21MIClj^TL£Üjl2TIX2AA^ .χν.Λ£1£Ε12ΏΑ2<;ΐ34.2ΓΑ]Ί:ί2ι1.ό.ΑυΑ1ί.1!...1..ν2!.2Π.1Α.νι.ΐ!2Δ<212Η.:<2ϊ£2ί.4ΔΤι.λΧ14Λ!...ί.2!22 <h2CGGTGGTG2yKbWGAC.GA€1AAGAT17¥IOGACAGCATQGz^GTCCG<TCGGTf-G G CGATCT ACC ACAG CACGTTCTGGG ACATCG AC AGC ATCCGGG CG CTCCTGGCG CG<1Cí4QGACTGCACQGCGG-CCGCGGCC^:CTCTCGí]CCGACCAC(i4TxG'M2CGCCTG· ^ÁG(1AíjCíjCATC(2AGCGC<:’í1CCTCCAGGACAT('ACCCAí)C^:<4CCACí)ATCTíK'TC GGC.X I lAEGGACGCCG IGUAGCGCG I‘GGGUG'1. Gl« (.Λ. TAIX.'AG'I I. G*.·» A0CIA.AG.AG ATCTCGGACGCGfMXlACGGCOAX’ATTCGGAGAAiMiXGAGCACGCCATCAAG GACTCG CTG CA(; 1 í AT ACGTCG CTCTATTTCCG CCTGCTCCGCCAGCAT< 1GCTG C A A(XzrG^fríXyF(XJGA<=AT(7r^rí^?CAACAAG^rrTCAAGz\AGGAAGGCGGGGGClTCAAG(J CGTCG CTCTGCG AGG AGO CC ATGGG CCTG CTCTQ^GTGTATGAGGCCGTGC G (' 0 'IX/í í. GG' í Q AAG GGUtji AGG4, -GATí, (.IFGGAGG AAG LG.. Aí..?(...< IG' FIXJ ÍOaj A 1’Í.X íí,íjA .MA2TGAA(iÁT(X'TCATG(X\(Xjt4Cí:íTGGAG{XJCAA(XTrCGCCGACCGCA1?CG.AGC AKKX.XMXyAGATCX2(;G(Mn’ATl^fKXlCGCC(XX}CGT(zl:(Xi_iA0G<)CCG('.lTGGT AÇ ATCGA.CGTGTATG AGAAGG.AMU..CGG C CGC AT CGACG ÀCCIX.K2TCG ACTTCG (XhUGCT<lGAmCAACXXJC(nXX4AGATGí:'TCTATaAGAC(XÍAGCT<LAAGGAGC TOTCGArGlGGTGGí.lAJ Cl GCTGGGCC HluCCXKA.AACíATCKjGCIòrCT.Í OCG C-G Aa3GCCTCCT(x:iA(?^ux:A()(.xiO™2T()G2mx:Ki(XTm(mxGTCKU<K‘cc(X\GT ACT(Xh?A(HXK2(7G<XnXÍ(]C€ATC_i4(XXV\G(l(2GAT(:GTG(n’GA^,I'('lA.CGC1(:GA^,lX3Q MXlAí^vrTClA747ÀC(yi7.CÁTGGCX7rG(2C(lGAC(UGCT(2AAGG^,r(Xri'CAí2C(l\f:A (Xl(HXlA.A.(:X'?4xCm(stTACCn:kizMl(KK2A1?CXIA(XlAGC1X2{2(X2ÍU(lTA(:iATGAAGC ^?r(rrAC^T(:nX^X!G<nvrA(lAA(1ACCAC(LAM:X.lAl>AC(KKX.TrAT2Vr(}AT(.X:TGAí4 <.]<3Α<λΑΑ1ΚΚΧΤΙΧ1ΑΑ.αΚΧ2Α<.Χ]<:^ΓίΑ€<?Γ(1ΑΑ(^^(3ί)Τ(.ηΧΧΧ1(ΧΑΤ(Χ:Α(.1Τ(} (lAACGCGT.ATTTCaiCGAGaCCCAGTGGTTCAAl'TCGGllCTACATCCCGAA.GTTC

Petição 870190082172, de 22/08/2019, pág. 114/248

108/120 <j ACG AGTATCT GG ACAACG CCX'TCGTGTCG G-TGG G CGCCCCG TTCGTG CTGGGC CTCT(XiTATCC€ATCATC<)ACrCA(XXA€TATCTCG.AAGG-AAGAi»AT(XlA(XCTGATCC CGG A.GG ACÍ ’TC AACCTG Cl '1 -CGOTGGG CCTC( 3 ATC ATCTTCCG (XMITACGACG A C(7rQGCiAACCrCGAAGGCCGAGCAf}(.lAGCGCGGCGAi:.!(WJCCCA4iJTCGATCCA GTGCrATAlGCATGAGACGGGCTCGTCGGAGG41£\.GTGG€iGGCCAx\CCATATCC-G CGAíXmMT(nXXXUCGanVGlA.AGGÀAGT(m(XKXXláGTGCCTGAAG(XGAC CaXXK^T(:TCGAAGCA(lWl(mi(iG(XiFGGC<XXX:AAarCCiG(:C-CG()TCGG(i(^ST (lCTCArGlATCL\CCAXUACTr(;GACG(lCXTCGCGT(XXX’CCA'GXX:CGCACGAAi? αβΟ(^^(:·ΆΤ{:Α£’αΑ0()ΑΤ(ΤΙ'ΟΊΎ(ΧλΑ(ΚΧΧ1<:Πϊΐα(χ·χ:·Τυ.ΑΑίΜ3Α(1Α(1(ΑΤ(1ΑΑα·Ι TGGí 3 UTGA [212] Sequência em itálico é o promotor PcrtE; a sequência sublinhada é o TRX com códon otimizado.

Seq Id No: 7

TRX-CiCaSSy - Sequência de Proteínas

PDmMDSMEVRSSAIYHSrPWDlDSIRALL.ARaJJC^rAAAAIXÍPDHHKKL.KElGQB:

KlXíDrrQHÍHLLGIJDAVQRIXIVAYQFEEElSDAIJIÜLHSENTEHAiKDSLHHTSL

YFRIGJÍQHGCNLSSDIF'NKFKKEGGGFK.ASLCEDAMGL1/>1AEÁVRLSVKGEAILE

EAQVFKL\NEJ<rLME[WERKi;AD:[tHGIALE:íPl..YWRAPRLEARWYID¥YEK1GX;Rl

DIXJJlFAKWFNRVQMIW^FELKCEJsMWWELUlLPAKMGFI^DRIJ.ENIiMlA \AA’EPQ¥SQClWAlTKÀI\T_JMTAXroDI^;VD¥HaidT)Ei;KVFTDTVNRWDLEaiDQl_J

FEYMKLYYLAL.YNVrNEIÒWHLKEK.CíFG.ArHYLKKLWAMÍ^SNAYFREAQWFNS

GYII^FL>EYLDNAIASVGAFWUlLSYFMlQQQlSEEEi:[)LlPEDL.NLJ..RWAS:nFRI..

YDDLAIiSKAEQQRGDVPKSlQCYMliETGSSEEVAANHlRDLlSlMWKEYNAEClK

ΡΓ8Ε8Κΐηνϊ1¥ΑΡΝΕΛΕ8(ΐνΕΜΥΕΠΙΙ1ΡΊ)(11Αν;ί^!Ι1ΟΚΓΝΑΗ:ΐ'ΤΗΙΡ:ΕΕΡνΡΙ.ΙίΕ81Ν

EG [213] A sequência sublinhada é a TRX.

Seq Id No: 8

TS23 FW - Sequência de Nucleotideos

Petição 870190082172, de 22/08/2019, pág. 115/248

109/120 atai^atóATGGACTCGATCXxAGGTACGCCGCTCTG

Seq Id No: 9

TS23 RE - Sequência de Nucleotideos atat^^gaígíYCAWGCAAGTTG.YFGGATrCCCTGiWrGGCACãr]

Seq Id No: 10

TS23-1 - Sequência de Proteínas

MÜSME VRRSÁNTHSTF%T)TDSm.Ál J .ARRÍ1CTVA A AFSWTOffiKRl .KERIQRRIQD ITQPfflILlX^UIjÀVQRLGVAYQFEEEISDALnGUISENTEHAIKDSU.IHTSL¥FRL LRQMtJ (/NLSSDIFNKFÍÍKEGGGFKWaoEDAAKj LLSLYE^UiUlVKSEAILEE AQ VFS'I^:SNLKILMEfíWRKI._;ADKIDJIALEnAAWFAFRVEAR.WYIBV¥EKEDGKIDDL· LDFAKLDFNRX^MIA^QTEUCEI^MWWELLGIJ’EKMGFFRDRIXESHLFSIGXW B;PQWCR\WKAIATJ^'AMDDFTDVH<H.J^:,EEO^FriXTVNR.Wi:)JAiXIII)Q]:J^>KY MI<L¥YLAL¥NTTNETAY1ILKEK.GFNATH.YIJCK.LW.AMQSNS¥FR'EAQWFNSGVIP KFMSYLDNMA^VGVPIJdi^.^ATMIGQHISKAEIDIJFEDI.NLL.RWASIlFRl.YND LATSKÁEQQKGDiTKSIQCYMHETGSSEEVAANIiníDLISBAWKELNAEíXKPTSL SKriYVGVAFNÉARSGVlAlYiniDFDGFASFnSONMirrSIEFEFVPUiESlNIG

Seq Id No: 11

TS23-2 - Sequência de Proteínas [214]

MDSME VRRSAHVHSTFWDIDMR ALLARRD CTVA AAl^HDHHKRLKE RIQRRLQD lTQPHHLi:X.;i:j:r.RWQRlX5VAYQFEEKi:SDxAi:H<nxHSEOTEHAVKDSLHHTSLYFm.₄ LffiíIIfl(/NI._i8TDIFNKF.KKE<hlGFKA8I.X]Ei:)AMGI_íLSJAEAAHI.ÁÍVKSEAi:LEEéW WSTSNU<n.MER¥WKLADRIDHáWEIPIAYVIUPRA^ARUY7D\YEKroGRIDDL· LIlFAKLDFNIÍVQMLYQTEIJxELSMWWEI.LGIPEKMGFFRDRLUSSHI.FSnínAA⁷ EPQYSQCRVAITKAÍAGJn?AMDDFYBVHGWEEI.KVTI^!DTVmWDLEGIDQIJ;^sEY WrAYTAIAT\^TTTNETA¥^?ni.KEK(>FNATm^?TJ<ICLWAMQ8NSYFREAQ^TNSG¥IP KFDEYIsDNAIA’SVGYPLiJuGLSYIWlQGHlSKAEIDLIPEDI.NLI.RW.lSnFHLYND ΪΑΤ8Ιν¥Ε(^Κ(«:ΛΤΚ8Κ^ΥΆΤ11Τ7Κ^8ΕΕλΛΑΑΝΙ1ΙΚΙ)ΕΙ8ϋΑννΐα2ΥΝΑΕ€[,ΚΡΤ8 IjSKHYYllVAFNSARSiiVLM'Y'HHDFDGFASPHSRTNAlilTSIFFEPVFSlKESINMl

Petição 870190082172, de 22/08/2019, pág. 116/248

110/120

Seq Id No: 12

P7 - Sequência de Nucleotideos

GCTGTTAGCGGGGCCATTAAG

SEQ ID NO: 13

P2 - Sequência de Nucleotideos

GATATTCTCATTTTAGCCATTTTAGCTTCCTTAGCTCCTG

Seq Id No: 14

P5 - Sequência de Nucleotideos

CAGGAGOTAAGGAA.GCTAAAA.TGGCTAAAATGAGAATATC

Seq Id No: 15

P6 - Sequência de Nucleotideos

GCAAGCGAGCTCGATATCAAACTAAAAGAATTCATCCAG

Seq Id No: 16

Sequência de Nucleotideos

CTGTCCATGATCTTGTCGTCGTC

Seq Id No: 17

Sequência de Nucleotideos

ACTGGCCrCAGAATTCAAATTTATTTGCTTTGTGAGCGGATAAC

Seq Id No: 18

Sequência de Nucleotideos

CAAGATCATGGACAGCATGGAAGTC

Seq Id No: 19

Sequência de Nucleotideos

Petição 870190082172, de 22/08/2019, pág. 117/248

111/120

TTTATGATTTGGATCCTCAGCOCAGGTT

Seq Id No: 20

Sequência de Nucleotideos

CTGTCCATAATCTTGTCGTCGTCAT

Seq Id No: 21

Sequência de Nucleotideos

ACTGGCCTCAGAATTGCGCTGCTGAACG

Seq Id No: 22

Sequência de Nucleotideos

CAA.GATTATGGACAGGATGGAAGTCC

Seq Id No: 23

Sequência de Nucleotideos

TTTATGATTTGGATCCTCAGCCCAGGTT

Seq Id No: 24

PcrtE-TRX-SaSSv Sequência de Nucleosideo

Petição 870190082172, de 22/08/2019, pág. 118/248

112/120

7í.ú:.?.<Arí.lXX.X.rGíú'.j(»X.'(24tHl»(X.14(?G(.’í.’(.*.i.'ZY.?(.íCí.íf. ¢1//(74.:1 ί'ί.?Ο'(..'7/.ΐ..ί GG7 21477/.

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A^xnxXXiACAAGATCATCOACCTGACCGACliAGAtKlTFCGACACCGAGGTGi-n'G

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C€AGC(hAGAACX:GT(^lG41O<K^GVACTAGV4GCCGTCGATCTCa^ACrÀT(MCT

Petição 870190082172, de 22/08/2019, pág. 119/248

113/120

TCCT(XU(L4(XX:T(X.X:CA(XXU(X;ATAA(MTCGTG(LA(XU<JCG(X)A(X:tCAAG€ TCKXXlGAGAAGCTffA^GGGCCAGfTFC.WJI'TCAJGIXXXKX^GCXXCTATGCLAGC^ (XCTCGCGAAGCTCGAGCTGÍlTCGAíXlTGGTíXAGCGGCTCfXXXTGAACXACC T(JTTCGAGA(:CGAGAT(;.A4GG.A4G(XXM’TT(.'TCGATCTACAAGGA(XXJCA{XL1 ACGGGTGGTG(nTCQG(’’CA(X.’TG(lVrGCGACGTCGCTCCGCTrCCGGCTGCTCC GCCAGTGCGGCCTGTTCATCCCCCArxiAGGTGTTCLAAGACCTTCCAGAACAAGAC GGGCGAGTTCGACATGAAGCTCTGCGACAACGTCAAGGGCCTGCTCTCGCTGTA (XLAGGCCAGCTATt^TC(?tGCTGGAAGCX}CGAGAACATCCTGGAC(U(X3CCAAGG€ G'nXAACCA(XlAA(aTG€'CTC/\Aíl^?rCG<lCUTGGGAGAACATCA(}CGAG.AAGTGÍj€T <XXXíAA(XXXXlT(}AAGCA(XX:XX^T(Xia)CT(lC(XlCT(XlATT(X}CG(X3TíX¹C(XG GAT(XMGG<XKX.KxTGGTTCATCGAGG(X)TATGAGCAGGAACXCAACATGAA(XX íLACCCTGCTCAAGCTGGCX^kUXTCGACTTCAAGATGGTGCAGTCGATCCACCAG AAGGAGATCGGGGAGCTGGCG€XKxTGGTOGGTQACCACGGGCCTCGAC.AAGCTC G(X™.X^reCíX^AlíLAlCCTCCTCíUGTCGTACAK?rGGAGCT<3i;X/;CCAT(XC-G TaiGAC(.X3CAA{JnXXUGCTCG(Xa.lCGA<JAC€WlXXrfG(.L^lATa3G€nOGGTC· CTC-ACGGTí;íGTCG-A0GACGGCTà(X1ACGTGTATGG('AG-CATCGACG-AGCTGGàí3; CT(.yrA.TÀ('CTC(X4.G(X«TG<JA(XX)GTnGTCGTG(}GTC(3AGATCGA(’AAG(jr(jCC{l AACACCemAAGCTCATCTTCATOTGGATGTTCAACAAGAÍXAACGAGGTCGGCC T(XX;CGT€XA(3CATGAGCG€^JGCTACxAUTa€1AT(}€CCACGTrcATCAAGG€CT GGGTGGAGCAGTGGAAGTCGTATCAGAAGGAAGCCCGCTGGTHXACGGTGGCC ATACCCCGCCCClX,JCL\GGAGTACrCGCTG^CGGCCTCXVPGAGCATCGGCTTCC aU^TCíCTCCTGATCACGGGCTATGlXlGCCíViXXJCí^^AGAACGAGGCCGCGCTCG Α0ΑΑ(Χ?τ1Χ.Χ\Λ(ΧΧΧ3<?πΧΧΧ(1Α(ΧΤ(Χ^,Τ(Χ:ΑΤΙΑ(ΤΓ(Χ^(.ΐα?Τ(Χ^νΓ(:η^,{ΧΧΧΧΧη’ GAT([AACGACATCG(XA(X]AGCCCCGACGAGATGGCGCGG(1GCGACAACCTCAA GTCGATCCACTGCTATATG AACG-AGACGGGCG CCAGCGAGG.AAGTGGCGCGCGA.

(X;ATATCAA<XlGCGTCATCGAG<lAGAACTCTGAAGATCCTGAAC€!AGTGCTGCTr CGA(X14(mkG<14GTTCCAG(L4i:KXXlTTCATCACCTT(lÀACCTCAACTCGGTG(XlC GG C AG C CACTI CTTCTACG AGTTCGG CGAUGGCTTC GG CGTCACCí G ACTCGTG«' 1 ACGAAGGTGG ACATG AÃG A( 3CGTG QI’GAT CG AC GC CATCCCC CTGG GCGAGGAG TGA [215] Sequência em itálico é o promotor PcrtE; a sequência sublinhada é o TRX com códon otimizado.

Seq Id No: 25

Petição 870190082172, de 22/08/2019, pág. 120/248

114/120

TRX-SaSSy - Sequência de Proteínas

AJAAOyMAUAEEYi^^

IMOÜMDS8TATAMTAP>TDmTOJVNIJÍTimXXS'ENKWGmi<PSlWNYDFM^$L

ATnHNIVEElAniKIAF'K].JxnQVKFMlAlAPMl?)PÍAKLEIA^fDVVQRL(IL,Nin.,raTEÍ

KEALFSIYKDGSNGWWFGfn.HATSLRI^I.J.RQ(XH.ElPQ]>VF:K’í’FQNim}B:F1)MK LCl)NVKQ.ÈJ_JS.ÈAEÁSYU/WKtlENUJ.)EAKAFri^,KC.L_ÍKSA.WENi8EKW.Í.AKKVK.H

ΛΙ Aí .Id..H WRVPRÍ RARWFIEAYEQEANMNPTLLKl>A'K1 JJFNMVQSIHQKEIGERA Η^ΑΑΤΤίΗ^ΙΚΙΑΕΑΗΝΝΕΕΜ^ΥΜΑΕί/ΑΕ^ηΐ’ΚΡΚίΛΕΕΙ^νΐίίΐ^νΐ/ΓΧΑ'ΟΠί^Υ Ι.)\ΑυΚ11·).ΕΕΒΕΥ^,Γδ8\ΈΚΑ8(ηΈΐηΚΙ._ίΡ^ΕΚΙΙΕΜ8'ΜΈ'Ν1ΥΓΝΕναϊΑίν(^ΗΕΒ:0Α NRn^íTFIKAWVEQ(XSYQKEAIAVFHGGHTFFLEEYSLNGLVSIGFPI.lAJTQ¥VAIA ENllAAlJ)KV14P:LPDIJJlYSSEJ.SRJAMMaTS[d)EMAE(lI)NLKSnK'YMNETGASE

EVAREHIK(iVIEENWKJLN'Q(X]FDQS(-ÍFQEPFH.''FNI_íNSVRGsSHFFYEF'GDGFGV^MT I)S\YWV[)MKSVUDPI1^:H..GEE [216] A sequência sublinhada é a TRX.

Seq Id No: 26

NusA - Sequência de Proteínas

Μ.ΝΕΕί!;11.ΑννΕΑν8ΝΕΚΑ1^.ί1ΕΚ1.Ε1·ΑΕΕβΑΕΑΙ'ΑΓΚ1\.Κ¥Ε(^Ε1.ί.)ν.Κ¥^Ι1)Κ.Κ^Ε1I)TFElEWI.AVIOEVrQPTKEEIl.JúÍÀR¥EDE^>N].Xfí:HVEDÍ^:ESVI'FDRITTQ^frAKQ

VH^KWEAERAFn’VDQFIÍEHEQEIITGVVKKVNRDFHSlJ)I,GNNAEAVIU<£D.M l,PRENTRPQDRV^.G\^fI.,YSW»EARGAQLFXn^,RSKPEMIIEIJFRIEYTElGEE\^?IEIK AAARDFGSRAKIAVKTNDKIUDFVGACVGMIRlARVQAVSTELGGERroiVLWÜDN FAQFVINAMAPÀDVASlVWEDiniTA® IA VE AGNI AQ Al G -R.NG QNYTILASQLSGW

EI^VMlATM^QzAKHQAEAH^VIDTFTKYLDIlJEDFATVLVEECÍFSTLEElAYVPM: KELLEIEaU)El^VEALREBM^U^kTWiqEESLGDNia^siWDLLNLEG\T.WL

ÁFK'LAÀR(]AY:d^:LEDÍ.AEQl[l[DDI.AlVE(:n.;r'DEKAtMLmÀA.RNKWFGnEA

Seq Id No: 27

TRX - Sequência de Proteínas

MSDI<iniLTDDSFDTD\nJUB(MlIAT>F\¥AEWCGPCKM.IAPILDEL\DEY<^GKLT\’ ΑΚΕΝΠ)^ΝΙΥΤΓΑΡΚΥ(1ΙΒ<11ΡΊΈΕΕΕΚΝαΕνΑΑΤΚΥ(τΑΕ8ΚαίίΕΚΕΕΕΟΑΥΕΑααΠ

DDDKI

Petição 870190082172, de 22/08/2019, pág. 121/248

115/120

Seq Id No: 28

MBP - Sequência de Proteínas

MBFIEGMATO:NGI)KGYGGLAEVGKKraKI.yiXGK¥TVEffid>KI;E:EKFPQVAATG ΙΐυΡΠΙΙΙΪ^ΑΙΙΟΚΡβίΐΤΙ^^ΟύΐΑΕΠΊ/ί^ΑΝ^ρίαγΡΙΤννίΜΑ'ΚΪΝαΚΒίΑΥΡίΑν ΕΑΙ^Εί¥ΝΚΓ441^?ΝΡΡθννΕΕΠ5\ΓυΚ1ιΡΚΑΚαΚρΑΪ_;ΜΡΝΡί>ΡΎΤ^ΪΊ.1ΑΑΓ)α GAA1G\X.EEGKX.LRKIX\ .ϋ\ίΡΝΑθίΑ1νΜ3Ι/Π:\[ΑΧ^,··.1Κ.ΝΙ\ΗΑ1ΧΑΙ91.1Αί8Ρ\ΕΑ3ΑΡΝΙί omaNgw^^

LAKEFLENYLLTDEQLEAWKPKFIUAVAI.KSYEEEItVKIjFpMATWNAQMMl MPNIPQKfSAFWYAVRTAYlNAASGRQTVpEALKDAQT(xp:DI}DKf

Seq Id No: 29

Set - Sequência de Proteínas

EEASVTSTEETLTPAQEAAIUPAANKARKEAELAAATAEQ

Seq Id No: 30

NusA-OiCaSSy - Sequência de Nucleotídeos

AÍKMAGAAGGAGATCCTCCKXGTGGTGGAGGCGGTGTCGAACGAGAAGGCGCTG

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116/120

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117/120

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Seq Id No: 31

SET-CiCaSSy - Sequência de Nucleotídeos

Petição 870190082172, de 22/08/2019, pág. 124/248

118/120

ATGGAGGAGGCx7AGCGTGACCAGCA<XXlAGGAGACCCTOA.CCCCGQCC£A.<ilGAG OL-Lá iCLÁJ4âCAC:í..-(jGUOOC.Í yCCwAAC-yvV.j(^C’L-Ã.-G(.^.A.A(^GtV.jHjl. CG A.f.cC Π.XtCCGCG <lULMlCHCílOü!éAü/3<J..XK.X.iAlü(lACÁ0íilAllí<MAG'rC(X.IG{J(ií.jlX.’GUCüzYl'C TACCAC ACC AC GTTCTGGG AC ATCG AC. A.GC- A^fí 'CCGGG CGCTCCTGG CGCGGCGG CíACíTGCACGGCGGCCGCXltlCCCTCTCGCXXlGACCACCATAACKXSílCTG&AGfaAG CG CÀTCCAGCGCCC CCTCCA.GC ACATCA.CCC AG CCCCACCATCTG CTCGG CCTCA.

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CTGA

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119/120 [218] A sequência sublinhada é a Etiqueta de SET de códon otimizado

Seq Id No: 32

NusA-CiCaSSy - Sequência de Proteínas mWWLVVDE^^PTKEITLEAAm

VIVQKVÍÜ^gRAMVVDQ]mEIlEGEnTGAAl<KVMWNlSLDL(lNNAEAVILREDKl

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GVAPNSARSGVIAÍYH HDFDGFASPHG RTNAHITSIFFEPVPLKESINLG [219] A sequência sublinhada é NusA

Seq Id No: 33

SET-CiCaSSy - Sequência de Proteínas

Petição 870190082172, de 22/08/2019, pág. 126/248

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Claims (20)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Sintase de santaleno caracterizada pelo fato de que compreende uma sequência de aminoácidos como mostrado em SEQ ID NO: 3 ou um homólogo funcional da mesma, em que o dito homólogo é uma sintase de santaleno que compreende uma sequência de aminoácidos que tem uma identidade de sequência de pelo menos 60% com SEQ ID NO: 3.
2. 2. Sintase de santaleno, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que possui pelo menos 65%, pelo menos 75%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou pelo menos 98% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 3.
3. 3. Ácido nucleico caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma sintase de santaleno conforme definida na reivindicação 1 ou 2 ou uma sequência complementar da mesma.
4. 4. Ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico compreende uma sequência de ácidos nucleicos como mostrado em SEQ TD NO: 1 ou SEQ TD NO: 2, ou uma sequência de ácidos nucleicos que tem uma identidade de sequência de pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 75%, pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% com uma sequência mostrada em SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2, ou uma sequência complementar de qualquer uma dessas sequências.

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   2/5
5. 5. Vetor de expressão caracterizado pelo fato de que compreende um ácido nucleico conforme definido na reivindicação 3 ou 4.
6. 6. Célula hospedeira, que pode ser um organismo em si ou parte de um organismo muiticelular, em que a dita célula hospedeira é caracterizada pelo fato de que compreende um vetor de expressão compreendendo uma sequência de ácidos nucleicos heteróloga conforme definidos na reivindicação 3 ou 4.
7. 7. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que a célula hospedeira é uma célula bacteriana selecionada a partir do grupo de bactérias Gram-negativas, em particular, a partir do grupo de Rhodobacter, Paracoccus e Escherichia.
8. 8. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que a célula hospedeira é uma célula fúngica selecionada a partir do grupo de Aspergillus, Blakeslea, Pmicillium, Phaffia, (Xanthophyllomyces), Pichia, Saccharomyces e Yarrowia.
9. 9. Planta ou cultura transgênica compreendendo células de planta transgênica caracterizada pelo fato de que a dita planta ou cultura compreende células hospedeiras conforme definidas na reivindicação 6, em que a célula hospedeira é de uma planta transgênica selecionada a partir de Nicotiana spp, Solatium, spp, Cichorum intybus, Lactuca

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   3/5 sativa, Mentha spp, Artemisia an nua, plantas de formação de tubérculos, culturas oleaginosas, plantas de cultura liquida, células de DY2 de tabaco, Physcomitrella patens e árvores.
10. 10. Cogumelo ou cultura transgênica compreendendo células de cogumelo transgênico, caracterizado pelo fato de que a dita cultura ou cogumelo compreende células hospedeiras conforme definidas na reivindicação 6, em que a célula hospedeira é selecionada partir de Schizophyllum, Agaricus e Pleurotis.
11. 11. Método para preparar santaleno caracterizado pelo fato de que compreende converter um difosfato de farnesila em santaleno na presença de uma sintase de santaleno conforme definida na reivindicação 1 ou 2.
12. 12. Método para preparar santaleno, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o santaleno é preparado em uma célula hospedeira conforme definida na reivindicação 6, 7 ou 8, uma planta ou cultura de planta conforme definida na reivindicação 9, ou um cogumelo ou cultura de cogumelo conforme definida na reivindicação 10, que expressa a dita sintase de santaleno.
13. 13. Método, de acordo com a reivindicação 11 ou 12, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente isolar o santaleno.
14. 14. Método, de acordo com qualquer uma das

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    4/5 reivindicações 11 a 13, caracterizado pelo fato de que a razão de α-santaleno para α-bergamoteno é superior a 1.
15. 15. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 14, caracterizado pelo fato de que a razão de β-santaleno para α-bergamoteno é superior a 0,5:1.
16. 16. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 15, caracterizado pelo fato de que a razão de santalenos (a- e β -santaleno) para a-bergamoteno é superior a 2:1.
17. 17. Método para preparar santalol caracterizado pelo fato de que compreende converter FPP em santaleno na presença de uma sintase de santaleno conforme definida na reivindicação 1 ou 2 que compreende adicionalmente converter o santaleno em santalol.
18. 18. Método para preparar santalol, preferencialmente β-santalol, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o santaleno é preparado em uma célula hospedeira conforme definida na reivindicação 6, 7 ou 8, uma planta ou cultura de planta conforme definida na reivindicação 9, ou um cogumelo ou cultura de cogumelo conforme definida na reivindicação 10, que expressa a dita sintase de santaleno.
19. 19. Método, de acordo com a reivindicação 17 ou 18, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente isolar o santalol, de preferência, o β-santalol.

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    5/5
20. 20. Anticorpo caracterizado pelo fato de que se liga especificamente a uma sintase de santaleno conforme definida na reivindicação 1 ou 2.