CN103906834B - 细胞色素p450及其在萜的酶促氧化中的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种能够氧化的萜分子的细胞色素P450的核酸和氨基酸序列。还提供了氧化萜分子的方法，包括使本发明的待氧化的萜分子与细胞色素P450接触的方法。具体地，所述方法可在体外或体内进行以生产氧化的萜分子，其可以用于不同的技术领域例如香料和调味料。本发明还提供了含有所述核酸的表达载体。用所述核酸转化非人宿主生物体或细胞也是本发明的目的。

Description

细胞色素P450及其在萜的酶促氧化中的用途
技术领域
本发明涉及能够氧化萜分子的细胞色素P450的核酸和氨基酸序列。还涉及包括用本发明的细胞色素P450与待氧化的萜分子进行接触的氧化萜分子的方法。特别地，所述方法可以在体外或体内进行以生产氧化的萜分子，其可以在不同的技术领域例如香料和调味料领域中应用。本发明还涉及含有所述核酸的表达载体。使用所述核酸转化的非人宿主生物体或细胞也是本发明的目的。
背景技术
萜见于大多数生物体(微生物、动物和植物)。这些化合物由称为异戊二烯单元的五碳单元组成，并按由结构之中存在的这些单元的数目来进行划分。因此单萜、倍半萜和二萜分别是包含10个、15个和20个碳原子的萜。例如二萜类化合物广泛存在于植物界中，并且超过2500种二萜结构已被描述过(Connolly and Hill,Dictionary of terpenoids,1991,Chapman&Hall,London)。萜分子及其氧化后的衍生物由于它们的风味和香味特性及其化妆品、医药和抗菌效果已经被关注了几千年。通过不同的方法如水蒸气蒸馏或溶剂萃取得到的植物提取物被用作萜分子的氧化衍生物的来源。或者，植物萃取物中发现的或生物合成的方法制得的萜分子用化学和酶方法进行氧化。
萜的酶促氧化通常涉及被称为细胞色素P450的酶(P450)，其通常能催化疏水底物(如萜分子)转化为较亲水的底物。细胞色素P450酶形成了发现于细菌、古细菌和真核生物中的血红素蛋白的 总科。细胞色素P450最常见的活性之一是作为一个单加氧酶，通过将分子氧中的一个氧原子插入到底物分子中，而另一氧原子被还原成水。
该催化反应需要两个电子对分子氧的活化。来自真核细胞色素P450使用NADPH作为外部还原剂和电子源。两个电子被一次一个地转移到细胞色素P450活性位点上并且该转移需要电子供体蛋白、细胞色素P450还原酶(CPR)。一个CPR并不特定对应一个细胞色素P450。在一个给定的生物体中CPR是对应多个P450的电子供体蛋白。另外，来自一个生物体的CPR可以充当来自其它生物体的用于P450的电子供体蛋白。在某些情形下，P450还可以耦联到细胞色素b5蛋白上，该蛋白可作为电子供体蛋白质或能够提高从CPR到P450的电子转移的效率。在真核细胞中，特别是在植物中，P450和CPR一般都是膜结合蛋白，并与内质网相关联。这些蛋白质是通过N-末端跨膜螺旋锚定于膜上。
许多色素P450具有低的底物特异性，因此能够催化许多不同的结构(诸如例如不同的萜分子)的氧化。这些酶的大多数与给定底物具有特定的区域选择性和立体选择性，但它们往往从一个特定的底物产生几种产物的混合物。这样的P450通常涉及分子(如生物异源物质)的分解和解毒，并且通常存在于细菌和动物中。另一方面，参与生物合成途径的P450通常显示出对某些类型的底物的特异性、区域选择性和立体选择性。对大多数植物色素P450是这种情形。
大量的P450在自然界，特别是在植物中被发现。一个植物基因组可包含数百个编码P450的基因。许多植物的P450已被鉴定，但由于植物界存在的P450的数量极其庞大，它们的大部分功能尚不清楚。
因此，期望寻找能够催化新的酶促反应的新的P450，从而提供新的氧化的化合物的酶促法生产，或寻找可以更容易地达成的，如从不同的底物通过不同类型的反应来生产氧化的化合物。
多种细胞色素P450已经被表征。特别地，与本发明的细胞色素P450具有一定比例的序列同一性的细胞色素P450已经被报道过使用萜分子作为底物。
与本发明的P450最接近的P450来自于高粱，其中最接近的序列与本文中所描述的(序号(accession number)EER94164)的氨基酸序列具有67％的同一性。
在由本发明的细胞色素P450产生的氧化的萜中，有些是在香料和调味料领域非常有用的。特别是客烯醇，这是由客烯的羟基化产生的，是香根草油的关键组分之一，并且其本身就是有价值的加香成分。使用本发明的细胞色素P450对客烯的氧化提供了对从香根油分离客烯醇(这是一个困难且昂贵的方法)的有利的替代。就我们所知，酶促法生产客烯醇是未知的。对于其它一些有价值的加香和调味成分的酶的合成(至今也是未知的)，可以使用如下将要描述的本发明的细胞色素P450来制备。
通过本发明的细胞色素P450生产的其它氧化的萜对于其它目的，例如药物或农业化学产品来说是有用的。因此，本发明的细胞色素P450开启了多种分子的新的生物合成途径，这些分子具有在产业的各个领域有用的经济的特性，并且从自然难以分离甚至不可能分离，以及难以或不能通过有机合成生成。
本发明的一个目的是提供一种以经济的方式制备氧化的萜(尤其是客烯醇)的方法。因此，本发明的目的是生产氧化的萜，同时以极小浪费、能源和资源更加有效的方法，并降低对化石燃料的依赖。本发明的另一个目的是提供一种能够氧化萜分子的酶，如此氧 化后的产物可作为香料和/或芳香成分。
使用的缩写
bp 碱基对
DMAPP 二甲基烯丙基焦磷酸酯
DNA 脱氧核糖核酸
cDNA 互补DNA
CPR 细胞色素P450还原酶
dNTP 脱氧核苷三磷酸
DTT 二硫苏糖醇
EDTA 乙二胺四乙酸
FAD 黄素腺嘌呤二核苷酸
FMN 黄素单核苷酸
FPP 焦磷酸法尼酯
GC 气相色谱
IPP 异戊烯焦磷酸酯
IPTG 异丙基-D-硫代半乳糖苷
LB 溶菌肉汤
MS 质谱
mvaK1 甲羟戊酸激酶
mvaK2 甲羟戊酸焦磷酸酯激酶
NADP 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸
NADPH 还原形式的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸
P450 细胞色素P450
PCR 聚合酶链式反应
3’-/5’-RACE 3’和5’cDNA末端快速扩增
RMCE 重组酶介导的盒式交换
RT-PCR 反转录-聚合酶链式反应
RNA 核糖核酸
mRNA 信使核糖核酸
RBS 核糖体结合位点
发明内容
本发明提供一种以经济、可靠和可再现的方式酶促氧化萜的方法。
如本申请所期望的，在本申请中列举的所有化合物具有如图1所示的化学式的定义。
“细胞色素P450”或“具有细胞色素P450活性的多肽”用于本申请的目的是作为能够催化萜分子的氧化，形成氧化的化合物如醇、醛、酮或羧酸的多肽。根据优选的实施方式，细胞色素P450作为单加氧酶向萜化合物添加唯一的氧原子。催化特定的萜的氧化的多肽的能力可如实施例8中所述通过进行酶测定法简单地证实。
根据本发明，“多肽”也指包括截短的多肽，前提是它们保持本发明的任何实施方式中定义的其细胞色素P450活性，它们与SEQ ID NO:1或2的相应片段具有至少定义的同一性百分比。
两个肽或核苷酸序列之间的同一性的百分比取决于这两个序列的比对时产生的两个序列中相同的氨基酸或核酸残基的数量。相同的残基被定义为在给定位置的两个序列比对是相同的残基。此处所用的序列同一性百分比是从目标比对中通过使两个序列间的相同残基数除以最短的序列中残基总数并乘以100来计算。目标比对是同一性的百分比为最高的可能的比对。间隙可以被引入在比对的一个或多个位置的一个或两个序列中，以获得目标比对。这些间隙则计为序列同一性的百分比计算中的不相同的残基。
用于确定氨基酸或核酸序列同一性的百分比的目的比对可以使用计算机程序的各种方法，例如在万维网上可用的公众可用的计算机程序来获得。优选地，BLAST程序(Tatiana等人的FEMS Microbiol Lett.,1999,174:247-250,1999)(设置为默认参数，其在国家生物技术信息中心(NCBI)http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/bl2seq/wblast2.cgi上可用)可用于获得肽或核苷酸序列的目标比对，并计算序列同一性的百分比。
本发明的一个目的是包含与SEQ ID NO:1或2有至少70％同一性的氨基酸序列，以及具有细胞色素P450活性的多肽。
在优选实施方式中，具有细胞色素P450活性的多肽用作能够催化选自单环或多环单萜和倍半萜类中的至少一种萜化合物的氧化的多肽。在优选的实施方式中，所述倍半萜或单萜包含至少一个甲基基团作为取代基的环状部分。根据更优选的实施方式，本发明的细胞色素P450氧化所述甲基取代基以提供伯醇。
根据一个优选的实施方式，萜化合物选自客烯、α-雪松烯，α-长叶蒎烯、α-柏木萜、罗汉柏烯、朱栾倍半萜、β-花柏烯、香树烯、α-新丁香三环烯、异洒剔烯、喇叭烯、S-柠檬烯，α-蛇麻烯，α-古芸烯、α-蒎烯、β-柏木萜、R–柠檬烯和β-蒎烯构成的组。更优选地，所述萜类化合物选自客烯、α-雪松烯、α-柏木萜、朱栾倍半萜和罗汉柏烯。最优选的，所述萜化合物是客烯。
在优选的实施方式中，一个氧原子被添加到甲基之上以便提供伯醇、醛和/或羧酸。在一个最优选的实施方式中，客烯被氧化成客烯醇、客烯醛和/或客烯酸。
在形成醛和/或羧酸的情形下，所述醛和/或羧酸是或者通过本发明的P450，或者通过来自其它家族的一种或多种酶(例如醇脱氢酶，醛还原酶，醛氧化酶)从伯醇的进一步氧化而形成，其它家族的所述酶是例如存在于表达本发明的多肽的任何宿主生物体或细胞中。
根据优选的实施方式，所述多肽包含的氨基酸序列与SEQ ID NO:1或2有至少75％，优选至少80％，优选至少85％，优选至少89％，优选至少90％，更优选至少95％，甚至更优选地至少98％的同一性。根据一个更优选的实施方式，所述多肽包括SEQ ID NO:1或2，甚至更优选地，其由SEQ ID NO:1和2组成。
在本发明的一个优选实施方案中，序列还包括一个膜锚定序列。由SEQ ID NO:1或2表示的序列，或具有所需同一性的百分比的其衍生物，是提供P450活性的多肽的一部分。膜锚定序列不参与酶的催化活性。锚定序列能结合到膜上。合适的锚定序列取决于生物体，该生物体所表达的多肽且设计成的宿主生物体的常见类型的序列为本领域技术人员公知。任何合适的锚定序列可以与本发明的多肽组合使用。因此，根据优选的实施方式，所述多肽包含结合有一个膜锚定序列的SEQ ID NO:1或2。
更优选地，本发明的多肽由任选地结合有膜锚定序列的SEQ ID NO:1或2组成。
当多肽不与锚定序列结合时，这种多肽不能结合到细胞膜上。在这种情况下，优选地，为了提高其在细胞质中的溶解度可以对多肽SEQ ID NO:1或2进行修饰。
根据另外的优选实施方式，所述多肽包含的氨基酸序列是通过遗传工程得到的SEQ ID NO:1或2的变体。在其它形式，所述多肽包含由已通过修饰SEQ ID NO:3、4或它们的互补序列获得的核苷酸序列编码的氨基酸序列。根据更优选的实施方式，具有细胞色素P450活性的多肽由通过基因工程得到的SEQ ID NO:1或2的变体的氨基酸序列，即由已通过修饰SEQ ID NO:3、4或它们的互补序列的任一获得的核苷酸序列编码的氨基酸序列组成。
如下文所述，由使本发明核酸天然或人工的突变获得的核酸编码的多肽也包括在本发明中。
由氨基和羧基末端其它肽序列的融合得到的多肽变体也包括在本发明的多肽中。尤其是这样的融合可以提高多肽的表达，可用于蛋白的纯化，改善将多肽锚定于膜上的方式或改善在所需环境或表达系统中多肽的酶促活性。这种其它的肽序列例如可以是信号肽。因此，本发明包括本发明的多肽的变体，如那些通过与其他寡肽或多肽熔合和/或那些与信号肽连接而获得的变体。与另一功能蛋白融合产生的多肽，如来自萜生物合成途径中的蛋白，优选萜合酶的蛋白质，也包括在本发明的多肽中。与肽序列融合获得的变体的本发明多肽的一个特定实例是包含本发明的多肽(具有细胞色素P450酶活性)和CPR的融合多肽。
根据另一实施方式，所述多肽是从香根草(Vetiveria zizanioides(L.)Nash)中分离出来的。
编码任意上述实施方式所述的多肽核酸也是本发明的目的。
根据优选的实施方式，所述核酸包含与SEQ ID NO:3、4或它们的互补序列有至少70％、优选至少75％、优选至少80％、优选至少85％、优选至少90％、优选至少93％、更优选至少95％，甚至更优选至少98％同一性的核苷酸序列。根据一个更优选的实施方式中，所述核酸包含SEQ ID NO:3、4或它们的互补序列。根据一个更加优选的实施方式中，所述核酸由任选地与编码膜锚定序列的核苷酸序列连接的SEQ ID NO:3、4或它们的互补序列组成。
根据另一实施方式中，所述核酸是从香根草分离出来的。
本发明的核酸可以被定义为包括单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的聚合物(DNA和/或RNA)。术语“核苷酸序列”还应理解为包含在一个单独的片段形式或作为较大核酸的组分 的多核苷酸分子或寡核苷酸分子。本发明的核酸还包含某些分离的核苷酸序列，这些分离的核苷酸序列包括那些基本上不含污染的内源性材料的那些序列。本发明的核酸可被截短，条件是它编码如上所述本发明所包含的多肽。
根据一个更优选的实施方式，任何上述实施方案的至少一种核酸包含通过修饰SEQ ID NO:3、4或它们的互补序列获得的核苷酸序列。优选地，所述核酸由通过修饰SEQ IDNO:3、4或它们的互补序列获得的核苷酸序列组成。
包含通过将SEQ ID NO:3、4或它们的互补序列突变而得到的序列的核酸都包含于本发明中，条件是这些序列包括与SEQ IDNO:3、4或它们的互补序列的对应片段具有至少定义的同一性百分比，并且它们编码如任何上述实施方案所定义的具有细胞色素P450酶活性的多肽。突变可以是任何类型的这些核酸，如点突变，缺失突变，插入突变和/或移码突变的突变。可制备变体核酸以便其核苷酸序列适应于特定表达系统。例如，已知当氨基酸由优选的密码子编码时细菌的表达系统更有效地表达多肽。由于遗传密码的简并性，其中一个以上的密码子可以编码相同的氨基酸，多个DNA序列可以编码相同的多肽，所有这些DNA序列都包括在本发明中。
本发明还提供了用于氧化至少一种萜化合物的制造方法，包含
a)在细胞色素P450还原酶(CPR)的存在下使所述的萜化合物与本发明的至少一种多肽接触；
b)任选地，分离在步骤a)中产生的氧化的萜。
通过本发明的多肽氧化的萜化合物和本发明多肽本身具有上述任何实施方式中的定义。
该方法可以在体外以及在体内进行，这将进一步详细说明。
当该方法在体外进行时，待与萜化合物接触的本发明的多肽和 CPR可以使用标准的蛋白质或酶提取技术从任何表达它的生物体萃取获得。如果宿主生物体是在培养基中释放的本发明的多肽单细胞生物体或细胞，例如，当无膜锚定存在时，该多肽可简单地从培养基收集(例如通过离心)，然后任选地洗涤步骤和重新悬浮在合适的缓冲液。如果该生物体或细胞在其细胞内聚集多肽，该多肽可通过破坏细胞或裂解，并从细胞裂解物中进一步萃取所述多肽得到。当P450和CPR包括膜锚定序列，如在植物中的天然P450和CPR，它们与膜相关联，并因此位于细胞裂解物的膜组分。膜组分(微粒体)可以从其它蛋白质组分使用已知的方法通过将粗细胞裂解物的差速离心容易地分离。
对于体外方法，本发明和CPR的多肽可独立地以分离的形式或作为蛋白提取物的一部分来提供，并悬浮于在最佳pH值的缓冲溶液中。如果适当，可以添加盐、DTT、NADPH、NADH、FAD、FMN和其它种类的酶辅因子，从而优化酶活性。合适的条件将在实施例进行更详细地描述。
然后将萜化合物添加到悬浮液或溶液中，然后将其在最佳温度下，例如15～40℃，优选在25～35℃，更优选30℃温育。温育后，可以通过标准分离步骤(例如溶剂提取和蒸馏)将所产生的氧化的萜从培养液中分离，任选地从该溶液去除多肽。
当P450和萜化合物接触时CPR必须存在。
根据另外的优选的实施方式，所述用于氧化萜化合物的方法是在体内进行的。在这种情况下，上述方法的步骤a)包括培养非人宿主生物体或细胞，该非人宿主生物体或细胞在有利于萜化合物的氧化的条件、在待氧化的萜化合物的存在下经转化以表达本发明的至少一种多肽，该生物体或细胞进一步表达CPR。
萜化合物和所述多肽如本发明的任何实施方式所定义。
在一个这样方法的实施方案中，待氧化的萜化合物是由表达本发明的多肽的宿主生物体或细胞生产的。在这种情况下，萜化合物是通过一种能够催化从非环状萜前体形成所述萜化合物的萜类合成酶在宿主生物体或细胞生产。所述萜类合成酶既可以是由宿主生物体或细胞天然产生的，也可以在天然不表达此类萜合酶的宿主生物体或细胞(它可被转化以表达所述合成酶)中产生。
在另一个实施方式中，在使用宿主细胞或当宿主生物是微生物的情形下，可以将待氧化的萜化合物加入到所述细胞或微生物的培养基中。萜化合物将渗透通过细胞或微生物的膜，因此可用于与所述的宿主细胞或微生物所表达的本发明的多肽进行反应。
根据一个更优选的实施方式中，所述方法进一步包括，在进行步骤a)之前，用本发明的至少一种核酸转化非人生物体或细胞，从而使所述生物体或细胞表达至少一种本发明的多肽。多肽和核酸是如任何上述实施方式中所定义。
在体内实施该方法是特别有利的，因为无需预先分离该多肽即能实施该方法。在转化以表达所述多肽的生物体或细胞内直接发生反应。
对于催化活性，P450必须与P450还原酶(CPR)结合使用，该还原酶能够从NADPH(还原形式的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)转移电子到P450的活性位点，从而重组P450酶活性。在体外和体内实施该方法时CPR都必须存在。当该方法在体内进行时，CPR可以是天然存在于宿主生物体或细胞，或在转化以表达本发明的多肽之前、同时或之后将这些生物体或细胞转化以表达CPR。在本发明的一个优选实施方式中，使用包含本发明的多肽和CPR的融合多肽转化宿主细胞或生物体。
在另一个优选的实施方式中，CPR是植物的CPR。最优选它 来自拟南芥CPR。
该非人生物体或细胞可有利地进一步用至少一种编码无环萜前体生成代谢涉及的多肽的基因转化，所述无环萜前体如焦磷酸牻牛儿酯，焦磷酸法尼酯或焦磷酸牻牛儿基牻牛儿酯。这些多肽包括，例如，MEP途径的酶，MVA途径的酶和/或异戊二烯转移酶。
如在本发明的任何实施方式中所述，在待氧化的萜化合物的存在下，用具有细胞色素P450活性的多肽和CPR或者包含两者的融合多肽对非人生物体或细胞进行的转化足以使萜的氧化发生。然而，参与无环萜前体、和/或异戊烯基二磷酸(IPP)或二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)的生产的至少一种酶的进一步转化具有使待氧化的萜化合物的量增加的优点。
该生物体或细胞指的是“表达”多肽，条件是该生物体或细胞被转化以包含编码所述多肽的核酸。该核酸被转录为mRNA，并且多肽在宿主生物体或细胞中发现。术语“表达”包括“异源表达”和“过表达”，后者指的是mRNA、多肽和/或酶活性的水平高于在非转化的生物体或细胞中所测量的水平。转化的非人宿主生物体或细胞的合适的方法在后述的说明书部分(其涉及作为本发明的特定目的这种转化的非人宿主生物体或细胞)和实施例中进行更详细描述。
转化生物体(如微生物)从而使它们表达的萜合成酶的方法是本领域公知的。这样的方法可以例如在WO2010/134004中找到，其描述了用客烯合酶(即能够催化从焦磷酸法尼酯生产客烯的酶)转化的多种宿主生物体和细胞。
将宿主生物体或细胞在有利于氧化的萜的生产的条件下培养以在体内实施本发明。这样的条件为使得宿主生物体或细胞的生长的任何条件。优选地，将这样的条件设计为宿主生物体或细胞的最 佳生长条件。因此，如果宿主是转基因植物，提供如最佳光照，水和营养条件的最优生长条件。如果宿主是单细胞生物体，有利于氧化的萜的生产的条件可包括向宿主的培养基添加合适的辅助因子。此外，可选择培养基以使萜的氧化最大化。最佳培养条件对于本领域技术人员来说是已知的且对于本发明不是特定的。适宜条件的实施例将在以下实施例中更详细地描述。
适合于在体内实施本发明的方法的非人宿主生物体可以是任何非人的多细胞或单细胞生物体。在一个优选的实施方式中，用于在体内实施本发明的非人宿主生物体是植物、原核生物或真菌。任何植物、原核生物或真菌都可以使用。特别有用的植物是指那些自然产生大量的萜的植物。在一个更优选的实施方式中，植物选自茄科、禾本科、十字花科、豆科、锦葵科、菊科或唇形科。例如，植物从烟草属、茄属、高粱属、拟南芥属、芸薹属(油菜)、苜蓿属(紫花苜蓿)、棉属(棉花)、蒿属、鼠尾草属和薄荷属选出。优选地，该植物属于烟草种。
在一个更优选的实施例中，用于在体内实施本发明的方法的非人宿主生物体是微生物。任何微生物可以使用，但根据一个更加优选的实施方式，所述微生物是细菌或真菌。优选所述真菌为酵母。最优选，所述细菌是大肠杆菌和所述酵母是酿酒酵母。
众多的这些微生物不会自然产生待氧化的萜。必须将这些生物体转化以生产所述萜以适于实施本发明的方法。在用任意上述实施方式进行所述的核酸转化之前、同时或之后，可如上所述对他们进行这样的转化。
也可以使用分离的高等真核细胞，而不是完整的生物体，作为宿主以在体内实施本发明的方法。合适的真核细胞可以是任何非人细胞，但优选植物细胞。
用于转化宿主生物体或细胞的适当地在体内实施本发明的方法的一个重要工具是包含根据本发明的任何实施方式的核酸的表达载体。因此，这样的载体也是本发明的一个目的。
本文所用的“表达载体”包括任何线性或环状重组载体，包括但不限于病毒载体、噬菌体和质粒。本领域技术人员能够根据该表达系统选择合适的载体。在一个实施方案中，所述表达载体包括可操作地连接有至少一种调控序列(其控制转录，翻译，起始和终止，如转录启动子，操纵子或增强子或mRNA核糖体结合位点)和任选地包括至少一个选择标记的本发明的核酸。当调控序列功能性涉及本发明的核酸时，核苷酸序列是“可操作地连接”。
如下文进一步描述，本发明的表达载体可用于制备基因转化的宿主生物体和/或细胞的方法中，可用于包含本发明的核酸的宿主生物体和/或细胞中以及用于生产或制造本发明多肽的方法中。
经转化包含本发明的任何实施方式的至少一种核酸的重组非人宿主生物体和细胞也是实施本发明的方法非常有用的工具。因此，这样的非人宿主生物体和细胞是本发明的另一目的。在一个优选的实施方式中，该宿主生物体或细胞中异源表达或过表达本发明的任何实施方式的多肽。
根据一个优选的实施方式中，非人宿主生物体或细胞还表达如上所述的P450还原酶(CPR)。CPR可以是天然存在于宿主生物体或细胞中，或者在转化以表达本发明的多肽之前、同时或之后，此类生物体或细胞可被转化以表达CPR。在本发明的一个优选实施方案中，宿主细胞或生物体转化以表达一种融合多肽，其包含本发明的多肽和CPR。
在另一个优选的实施方式中，生物体或细胞能生产待氧化的萜。当生物体或细胞表达能够催化所述萜形成的萜合酶时就是这种 情形。在宿主生物体或细胞天然不表达此类萜合酶的情形下，在用具有P450活性的多肽转化之前、同时或之后对它进行转化。
该非人生物体或细胞可有利地进一步用编码参与无环萜的前体(如焦磷酸牻牛儿酯，焦磷酸法呢酯或焦磷酸牻牛儿基牻牛儿酯)生成代谢的多肽的至少一种基因转化。这些多肽包括，例如，MEP途径的酶、MVA途径的酶和/或异戊二烯转移酶。能用如本发明的任何实施方式中所述的本发明的多肽、CPR或包含两者的融合多肽生产的萜化合物的非人生物体或细胞的转化足够使萜的氧化发生。然而，用参与无环萜的前体和/或异戊烯基二磷酸(IPP)或二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)的生产的至少一种酶的进一步转化具有使可用于氧化的萜的量增加的优点。
本发明的非人宿主生物体和细胞的类型如氧化的萜化合物方法的任一实施例所述。
术语“转化的”是指将宿主进行基因工程使其包含一个，两个或更多个拷贝的如任意上述实施方式中所需要的每种核酸的事实。优选地，术语“转化的”涉及异源表达由转化宿主的核酸编码的多肽和过表达所述多肽的宿主。因此，在一个实施方式中，本发明提供了一种转化的生物体，与不经如此转化的相同生物体相比，表达更高量的所述多肽。
在本领域中已知多种用于创建转基因宿主生物体或细胞，例如植物，真菌，原核生物或高等真核细胞培养物的方法。用于细菌、真菌、酵母、植物和哺乳动物细胞宿主的合适的克隆和表达载体被描述于Pouwels等人的Cloning Vectors:A Laboratory Manual,1985,Elsevier,New York，以及Sambrook等人的Molecular Cloning:A LaboratoryManual,2nd edition,1989,Cold Spring Harbor Laboratory Press中。特定较高等植物和/或植物细胞的克隆和表达载体可为本领域技术人员所用。参见如Schardl等人的Gene61:1-11,1987。
用于转化宿主生物体或细胞使其含有转基因核酸的方法对本领域技术人员来说是熟知的。为创造转基因植物，例如，目前的方法包括：电穿孔植物原生质体，脂质体介导的转化，农杆菌介导的转化，聚乙二醇介导的转化，粒子轰击，植物细胞的显微注射法以及使用病毒的转化。
在一个实施方式中，转化的DNA整合到非人宿主生物体和/或细胞的染色体中，从而得到了稳定的重组系统。任何本领域已知的染色体整合方法都可用于本发明的实践中，包括但不限于重组酶介导的盒式交换(RMCE)，病毒位点特异性染色体插入，腺病毒和原核注射。
为了实施如上文所述该体外氧化萜化合物方法，提供制备本发明多肽的方法是非常有利的。因此，本发明提供了一种制备本发明的多肽的方法，包含
a)培养非人宿主生物体或细胞，其经转化包含本发明至少一种核酸并表达或过表达本发明的至少一种多肽；
b)分离来自于步骤a)中培养的非人宿主生物体或细胞的本发明的多肽。
根据一个优选的实施方式，所述方法还包括，在步骤a)之前，用本发明的至少一种核酸转化非人宿主生物体或细胞以使其表达或过表达本发明的多肽。
非人宿主生物体或细胞的转化和培养可以如上所述的在体内生产氧化的萜的方法来进行。步骤b)可使用从生物体或细胞中分离特定多肽的任何本领域公知的技术来实施。
此处指出的“多肽变体”是指这样的多肽，其能够催化本发明的萜化合物的氧化，并且具有足够的任意上述实施方式的序列同一性百分比。这种变体多肽是由经历过一个或多个缺失，插入或置换的核苷酸序列编码。
变体可包括保守取代的序列，这意味着给定的氨基酸残基被替换为具有相似物理化学特性的残基。保守取代的例子包括一个脂族残基为另一个替换，例如用异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸、或丙氨酸相互替换；或者一个极性残基为另一个替换，例如赖氨酸和精氨酸之间、谷氨酸和天冬氨酸之间、或谷氨酰胺和天冬酰胺之间。见Zubay,Biochemistry,Addison-Wesley Pub.Co.,(1983)。这种替换的效果可以使用替换打分矩阵来计算，例如，Altschul(J.Mol.Biol.219:555-65,1991)所讨论的PAM-120、PAM-200和PAM-250。其他这类保守性取代，例如，具有相似的疏水特性的整个区域的取代是众所周知的。本发明的多肽也可以进行非保守取代，以便产生更多样化的变体，条件是此类变体保留了期望的细胞色素P450活性。变体也可以通过编码变体多肽的核酸序列中核苷酸(多个)的缺失和插入来生产。
本发明的多肽的变体可以用于实现例如期望的增强或降低的酶活性、修饰的区域化学或立体化学特性、或改变的底物应用性或产物分布，基材的增加的亲和性，一种或多种期望化合物的生产中改善的特异性，酶反应的增加的速率，在特定环境(pH，温度，溶剂等)中更高的活性或稳定性，或在期望的表达系统中提高的表达水平。变体或位点定向突变体可以通过本领域中已知的任何方法来制造。变体和天然多肽的衍生物可以通过分离天然存在的变体，或变体的核苷酸序列，或其它或相同植物品系或种属获得，或通过编码本发明多肽的核苷酸序列的人工编程突变而获得。自然的氨基酸序列的改变可通过任何众多的常规方法来完成。
本发明多肽的氨基和羧基末端附加肽序列的融合产生多肽变体可用于增强多肽的表达，用于蛋白质的纯化或在期望的环境或表达系统中改善多肽的酶活性。这种额外的肽序列例如可以是信号肽。因此，本发明包括本发明的多肽的变体，如那些通过与其它寡肽或多肽熔合的变体和/或那些连接有信号肽的变体。
因此，在一个实施方案中，本发明提供了制备能够催化萜化合物的氧化的变体多肽的方法，并包括以下步骤：
(a)选择任意上述公开的实施方式的一种核酸；
(b)修饰所选择的核酸以获得至少一种突变核酸；
(c)用突变核酸序列转化宿主细胞或单细胞生物体，以表达由该突变核酸序列编码的多肽；
(d)筛选至少一种修饰的细胞色素P450活性的多肽；和
(e)任选地，如果该多肽不具有期望的变体的细胞色素P450活性，重复上述过程步骤(a)～(d)，直到获得具有期望的变体的细胞色素P450活性的多肽；
(f)任选地，如果在步骤d中鉴定出具有所期望的变体细胞色素P450活性的多肽，分离步骤(c)中获得的相应突变核酸。
在步骤(b)中，大量的突变核酸序列可被创建，例如通过随机诱变，位点特异性诱变或DNA改组。基因改组的详细步骤可见于Stemmer的DNA shuffling by randomfragmentation and reassembly:in vitro recombination for molecularevolution.Proc Natl Acad Sci U S A.,1994,91(22):10747–10751。简言之，DNA改组指的是体外随机重组已知序列的方法，涉及选定用于重组的至少两个核酸。例如通过合成含有突变序列的寡核苷酸可将突变引入特定位点，侧翼通过限制性位点能连接到天然序列片段之上。连接之后，所得的拼接序列编码具有期望的氨基酸插入、取代或缺失的类似物。可选地，寡核苷酸定向位点特异性诱变步骤可以用来提供改变的基因，其中预定的密码子可通过取代，缺失或插入而改变。
因此，编码包含SEQ ID NO:3，4或它们的互补序列的多肽的核酸可与任何编码有细胞色素P450的其它核酸(例如分离自除了香根草之外的生物体)重组。因此，可以得到突变核酸并进行分离，根据标准程序将其用于转化宿主细胞，例如，如披露于本实施例的那样。
在步骤(d)中，以至少一个修饰的细胞色素P450活性来筛选步骤(c)得到的多肽。期望的改性的细胞色素P450活性(该活性可筛选表达的多肽)的实例包括通过KM或的Vmax值计算的增强或降低的酶活性、改性区域化学或立体化学特性以及改变的底物应用性或产物分布。酶活性的筛选可根据本领域技术人员熟知的步骤和那些在本发明实施例中公开的步骤进行。
步骤(e)提供了方法步骤(a)-(d)的重复，可优选并列地实施。因此，通过创建一个显著数量的突变核酸，许多宿主细胞可以在同时用不同的突变核酸转化，从而允许随后筛选增加数量的多肽。因此，基于本领域技术人员的判定获得期望的变体多肽的机会增加。
所有在本申请中提到的出版物通过引用公开和描述与所述出版物所引用的相关的方法和/或材料而并入。
附图说明
图1：所列的化合物的结构。
图2：具有定义的萜羟化酶活性(现有技术)选择的P450单加氧酶的氨基酸序列的比对。在所有的P450酶中发现的保守区域有下划线。用于设计的萜-羟化酶-特异性寡核苷酸的6个区域有下划线标示的箭头。箭头的方向表示寡核苷酸的方向。
图3：引入到两个香根草P450的N-末端(膜锚定)修饰以改进大肠杆菌中的异源表达。
图4：与VzP521-11重组蛋白获得代表性的CO-示差光谱。
图5：在双顺反子构建体的P450和CPR之间的间隔区的序列。示出了在P450的端部以及在CPR的起始位置的DNA和氨基酸序列。
图6：表达香根草P450VzP521-16和拟南芥(tcATR1)的CPR的大肠杆菌中(+)-客烯的生物转化的GCMS分析。A.总离子色谱。B.底物(1)和具有相应化合物的同一性和结构的产物(2～4)的质谱。
图7：显示了酶促氧化客烯的连续步骤的合成路线图。
图8：由香根草P450生物转化的几种萜分子的GCMS分析的总离子色谱。示出了对应于所述底物的峰的数目和产品的分子量。
图9：示出其产物的香根草P450的几个萜分子的生物转化合成路线图。
图10：设计用于在大肠杆菌共表达香根草P450、CPR和客烯合酶的人工操纵子的组成。
图11：由表达(+)-客烯合酶、香根草P450VzP521-16-1和拟南芥的CPR，以及使用外源甲羟戊酸途径生产FPP的酶的大肠杆菌细胞中产生的倍半萜的GCMS分析的总离子色谱。
本发明特定实施例或实施例
现在将通过以下的实施例进一步详细地描述本发明。
具体实施方式
实施例1
RNA提取和cDNA文库的构建
香根草(Vetiveria zizanioides(L.)Nash)植物从苗圃(The Austral PlantsCompany,Les Avirons,The Reunion Island,France)获得。该植物被种植于温室(LullierAgronomy research Station,Geneva,Switzerland)的花盆中并且 通过分割六个月至一年大的团块进行无性繁殖。收获根部，将植物从盆中取出，用自来水清洗。
提取的RNA，将来自几种植物根部合并：年轻的植株(繁殖4～6个月后)，具有发达密集的根系老的植株(繁殖1～2年后)和从花盆中取出后在室温下干燥24～36小时年轻的植株。将根从植株的地上部分切断并冷冻于液氮中。首先使用Waring搅拌机(WaringLaboratory,Torrington,USA)将根部在液氮中粗切，然后用研钵和研杵研磨成细粉末。总RNA的提取遵循Kolosova等(Kolosova N,Miller B,Ralph S,Ellis BE,Douglas C,Ritland K,and Bohlmann J,Isolation of high-quality RNA from gymnosperm andangiosperm trees.J.Biotechniques,36(5),821-4,2004)所述的步骤，并进行如下的改进：对2g的研磨组织使用20ml的萃取缓冲液，并且萃取缓冲液添加2％(w/v)的PVP(聚乙烯基吡咯烷酮,Sigma-Aldrich)。对于CTAB(溴化十六烷基三甲铵，Sigma-Aldrich)萃取，核酸粒状沉淀于2ml TE缓冲液(10mM Tris-HCl,pH8,1mMEDTA)中再悬浮并且使用2ml的5M NaCl和1ml10％CTAB进行萃取。对于异丙醇沉淀，将核酸粒状溶解于500μl TE中。最终RNA粒状再悬浮在50μl水中。
使用MarathonTMcDNA扩增试剂盒(Clontech,Takara Bio Europe)按照操作手册从1μg mRNA中制备连有接头的双链cDNA文库。
实施例2
P450-特异性寡核苷酸的设计
为了设计具有萜羟化酶活性的植物P450特异性寡核苷酸，选择来自已知的萜羟基化的P450氨基酸序列：来自留兰香的柠檬烯6-羟化酶(GenBank序号：AAD44150)，来自薄荷的两个柠檬烯3-羟化酶(GenBank序号：AAD44152and AAD44151)，来自烟草的表-马兜铃烯羟化酶(Genbank序号：AAK62343)，来自天仙子(Hyoscyamus muticus)的premnaspirodiene(Genbank序号：ABS00393)，来自苏格兰薄荷的两个柠檬烯羟化酶(Genbank序号：AAQ18707and AAQ18708),来自烟草的二萜羟化酶(Genbank序号：AAD47832)以及来自CYP71D科的两个成员、来自马铃薯的Cyp71D4(Genbank序号：CAC24711)和来自马铃薯野生种(chaco potato)的CYP71D6(Genbank序号：P93530)。用ClustalW程序(Thompson,J.D.,Higgins,D.G.and Gibson,T.J.(1994)；CLUSTAL W:improving thesensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequenceweighting,position specific gap penalties and weight matrix choice；NucleicAcids Res.22,4673-4680)对序列进行比对。图2示出了比对。
为了设计用于同源P450cDNA的片段的PCR扩增的寡核苷酸，在该比对中选择保守区域。例如所有序列中氨基酸的保守性以及低密码子简并性的氨基酸的存在等参数在选择这些区域时要进行考虑。另外，由于植物基因组中含有大量参与了多种不同代谢的P450，要刻意地避免涉及所有P450共有的功能的区域。这些区域包括例如血红素结合结构域，该结构域两侧连有完全保守的半胱氨酸残基，通过所述残基的硫醇侧链(在我们的比对中PFGxGRRICPG基序)共价连接到血红素铁上；所谓的“回曲”(在我们的比对中FxPERF基序)，推测其参与了与氧化还原伴侣蛋白的相互作用和血红素蛋白相关的稳定化；I螺旋区域((A/G)GTETSS基序)，位于在血红素的远端侧上的活性位点，并参与质子转移和氧活化。由此选择了六个保守区的推定特性的植物萜单加氧酶(图1中带箭头的下划线)。
遵循共有序列简并杂合寡核苷酸引物(CODEHOP)策略(Rose T.M.,Schultz E.R.,Henikoff J.G,Pietrokovski S.,McCallum C.M.,and Nenikoff S.；1998；Consensus-degenerated hybrid oligonucleotide primers for amplification of distantlyrelated sequences；Nucleic Acids Research26(7),1628-1635)并且使用 于http://blocks.fhcrc.org/blocks/codehop.html上可用的计算机程序的可用的在线界面从这些区域中设计出含3’简并的核心和5’夹板结构的混合引物。寡核苷酸被设计为有192的最大简并性和60～64℃的退火温度的11～15个碱基的简并核心。使用这种方法，从图1所示的六个保守的区域设计出三种上游引物(P450–Terp-F1～F3(SEQ ID NO:5-7))和四种下游引物(P450-Terp-R1～R4(SEQ ID NO:8-11)(表1)。
表1：萜-羟化酶特异性寡核苷酸。各引物的简并核心的序列以小写字母表示，夹板结构以大写字母表示。核苷酸序列表示为从5’到3’端的上游引物和从3’到5’端的下游引物。在核苷酸序列的简并性是使用IUPAC单字母代码表示。
实施例3
香根草P450cDNA的PCR扩增
从香根草cDNA文库通过PCR将实施例2中所述的引物用于扩增P450cDNA片段。使用2聚合酶混合物(Clontech, Takara Bio Europe)进行PCR。每个PCR混合物含有，在50μL总体积中，5μL的2PCR缓冲液、200μM dNTPs、200nM各种寡核苷酸引物、5μL的200-倍稀释的cDNA、1μL的 2聚合物混合物。使用下述条件进行扩增：
-在94℃变性3分钟；
-15个循环
o在94℃变性1分钟，
o第一个循环在65℃退火1分钟，并且每个
随后的循环中降1度，并且
o在72℃延伸2分钟；
-20个循环
o在94℃变性1分钟，
o在58℃退火1分钟并且
o在72°延伸2分钟；以及
-最终在72℃延伸10分钟。
分别用萜-羟化酶特异性上游和下游引物的可能的组合进行不同的PCR。具有期望大小的扩增物使用TOPO TA克隆试剂盒(Invitrogen,Carlsbad,CA)分别克隆到2.1-TOPO载体中。将插入物进行DNA测序，使用BLASTX算法(Altschul,S.F.,Gish,W.,Miller,W.,Myers,E.W.,and Lipman,D.J.(1990)J.Mol.Biol.215,403-410)将序列与GenBank的非冗余蛋白数据库(NCBI)进行比较。
几种引物的组合(P450-terp-F1(SEQ ID NO:5)与P450-terp-R2(SEQID NO:9),P450-terp-F3(SEQ ID NO:7)与P450-terp-R3(SEQ ID NO:10),和P450-terp-F1(SEQ IDNO:5)与P450-terp-R4(SEQ ID NO:11))得到了具有期望大小并显示出与P450序列有同源性的DNA片段。只有显示出与特征化萜单加氧酶有同源性的片段被保留(该测序片段的约50％)。所选择的DNA序列进行比对，并且推导出1167-bp的共有DNA序列(CA521(SEQ ID NO:12))。从CA521推导出的氨基酸序列显示出与已知植物萜单加氧酶高达45％的同一性。
用cDNA末端快速扩增(RACE)技术获得全长序列。将MarathonTMcDNA扩增试剂盒(Clontech,Takara Bio Europe)用于所有RACE实验。典型RACE反应混合物包含，在50μl的最终体积中，5μl2PCR缓冲液(Clontech,Takara Bio Europe),每种200μM的dNTP,1μl 2聚合酶混合物(Clontech,Takara Bio Europe),200μM接头特异性引物,200μM cDNA-特异性引物和5μl的200倍稀释的连有接头的香根草根cDNA。扩增在Eppendorf的Mastercycler梯度热循环仪中进行。热循环条件如下：在94℃1分钟；5个循环的在94℃30秒和在72℃3分钟；5个循环的在94℃30秒，在70℃3分钟；
20个循环的在94℃30秒和在68℃3分钟。当必要时，使用嵌套寡核苷酸进行第二轮扩增。具有期望大小扩增产物分别克隆到 2.1-TOPO载体(Invitrogen,Carlsbad,CA)中和将插入物进行DNA测序，使用BLASTX算法(Altschul,S.F.,Gish,W.,Miller,W.,Myers,E.W.,and Lipman,D.J.(1990)J.Mol.Biol.215,403-410)将序列与GenBank的非冗余蛋白数据库(NCBI)进行比较。
对于CA-521端扩增，上游和下游寡核苷酸从PCR产生的DNA片段推导出来。并分别使用3’RACE和5’RACE：CA521-F1(SEQ IDNO:13),CA521-F2(SEQ ID NO:14),CA521-R1(SEQID NO:15)和CA521-R2(SEQ ID NO:16)。使用上游寡核苷酸，我们得到一个500bp的片段(CA635(SEQ ID NO:17))，与CA521片段具有176个相同的残基的重叠。这个CA635片段含有一个包括终止密码子的额外的138pb的编码区，随后是3’非翻译区。该5’RACE提供了一个426bp片段(CA884(SEQ ID NO:18))，在5’末端含有缺失的243bp的编码区。
寡核苷酸从重组全长序列的起始和终止区域设计，将CA521起始(SEQ ID NO:19)，CA521终止(SEQ ID NO:20)，作全长cDNA扩增的引物。使用Pfu DNA聚合物(Promega,Madison,WI,USA)进行扩增：在50μl的最终体积中，含5μl的Pfu DNA聚合酶10X缓冲液，每种200μM的dNTP，0.4μM每种引物，2.9单位的Pfu DNA聚合物和2.5μl的200倍稀释的香根草cDNA。热循环条件如下：在95℃1.5分钟；30个循环的在95℃45秒，64℃30秒，和72℃4分钟；以及在72℃10分钟。使用TOPO TA克隆试剂盒(Invitrogen,Carlsbad,CA)将PCR产物克隆到2.1-TOPO载体中，以控制DNA序列。从几个克隆的测序中，保留两个不同的具有93％的序列同一性的DNA序列(VzP521-11(SEQ ID NO:21)和VzP521-16(SEQ ID NO:22))。推导出的氨基酸序列分别由513和514个残基组成，具有89％的同一性。序列数据库中与VzP521-11(SEQ ID NO:23)和VzP521-16(SEQ ID NO:24)最匹配的氨基酸序列的同一性列出如下。
序号，命名，生物体 VzP521-11 VzP521-16
EER94164,假定蛋白,高粱属 68％ 67％
ACF87848,未知蛋白,玉蜀黍属 67％ 67％
EER96012,假定蛋白,高粱属 65％ 65％
ACF86186,未知蛋白,玉蜀黍属 65％ 64％
EER96013,假定蛋白,高粱属 65％ 64％
EER92230,假定蛋白,高粱属 63％ 61％
EAY78666,假定蛋白,稻属 61％ 61％
AAP53961,细胞色素P450家族蛋白,稻属 61％ 60％
BAD17264,假定细胞色素P450,稻属 59％ 58％
与公众可用的和功能性特征化蛋白最接近的氨基酸序列的同一性列于下表：
多肽VzP521-11(SEQ ID NO:23)和VzP521-16(SEQ ID NO:24)包括一个膜锚定部分和负责催化P450活性的活性区域。VZP521-11和VzP521-16的活性区域分别示于SEQ IDNO:1和2，。编码这些活性的序列的核酸序列分别示于SEQ ID NO:3和4。
实施例4
细菌中香根草P450的异源表达
在真核生物P450单加氧酶中，蛋白质的N-末端序列构成了这些酶的膜定位必要的膜锚定。由一个富含脯氨酸结构域(在521-11(SEQ ID NO:23)和521-16(SEQ ID NO:24)中的PPGP)隔开的这部分蛋白对于特异性的酶活性控制并不是必需的。因此，这个区域可以通过缺失，插入或突变进行修饰而不影响催化活性。然而，当在微生物中表达时，真核生物的P450(包括植物P450)的N-末端区域的特定修饰已被证明对检测到的重组蛋白的水平有积极的作用(Halkier等人(1995)Arch.Biochem.Biophys.322,369-377；Haudenschield等人(2000)Arch.Biochem.Biophys.379,127-136)。因此，基于这些之前的观测，P450VzP521-11和VzP521-16的膜锚定区域被重新设计以引入图3所示的修饰。
通过如下的PCR获得修饰后的cDNA。使用引物Pfus-NdeI(SEQ ID NO:25)和521_fus_r(SEQ ID NO:26)(用质粒P2-2-48(Haudenschield等人(2000)Arch.Biochem.Biophys.379,127-136)作为模板扩增第一片段对应的膜锚定区域。使用引物521-fus-f(SEQ ID NO:27)和521-Hind(SEQ ID NO:28)，以及或者VzP521-11(SEQ IDNO:21)或者VzP521-16(SEQ ID NO:22)cDNA作为模板扩增其它两个片段。使用第一次PCR产物和后两次PCR’产物的任一作为模板，和Pfus-NdeI(SEQ ID NO:25)和521-Hind(SEQ IDNO:28)作为引物进行第二轮的PCR。用Pfu DNA聚合酶(Promega,Madison,WI,USA)进行所有的PCR：在最终的50μl体积中，包含5μl的Pfu DNA聚合酶10X缓冲液，每种200μM的dNTP，0.4μM每种引物，2.9单位的Pfu DNA聚合酶和2.5μl的200倍稀释的香根草cDNA。热循环条件如下：在95℃1.5分钟；30个循环的在95℃45秒，64℃30秒和在72℃4分钟；最终步骤在72℃10分钟。将两个PCR产物，VzP521-11-1(SEQ ID NO:37)和VzP521-16-1(SEQ ID NO:38)用NdeI和HindIII限制性酶消化，并且连接到pCWori表达质粒中(Barnes H.J(1996)MethodEnzymol.272,3-14)，得到分别含N-末端修饰的VzP521-11和VzP521-16P450s(VzP521-11-1(SEQ ID NO:35)以及VzP521-16-1(SEQ ID NO:36)氨基酸序列)的cDNA的质粒pCW-218-521-11和pCW-218-521-16。
用于异源表达，将JM109大肠杆菌细胞转化为218-521-11或218-521-16表达质粒。将转化体的单菌落在含50μg/mL的氨苄青霉素5毫升LB培养基中接种培养物。在37℃使细胞生长10～12小时。然后将培养物接种到添加了50μg/m氨苄青霉素和1mM硫胺盐酸盐的250毫升TB培养基(极品肉汤)中。该培养物在28℃，以适当摇动(200转)下培养3～4小时，之后添加75毫克/升δ-氨基乙酰丙酸(σ)和1mM IPTG(异丙基-β-D-1-硫代半乳糖苷)，和在28℃ 以200转摇动下将培养物保持24～48小时。
P450酶的表达可以定性评估，以及通过大肠杆菌的蛋白组成的CO结合光谱(Omura,T.&Sato,R.(1964)J.Biol.Chem.239,2379-2387)定量测量。对于蛋白提取，将细胞离心(10分钟，5000g，4℃)并在35毫升冰的缓冲液1(100mM的Tris-HCl，pH 7.5，20％甘油，0.5mM EDTA)中重悬。添加1体积的于水中的0.3mg/ml溶菌酶(来自鸡卵白，Sigma-Aldrich)，并在4℃，搅拌下将该悬浮液静置10～15分钟。在4℃将悬浮液于7000g离心10分钟，将粒状物在20ml缓冲液2 (25 mMKPO4，pH7.4,0.1mMEDTA,0.1mM DTT,20％甘油)重悬。在-80℃将该悬浮液进行一个循环的冻融，添加0.5mM的PMSF(苯甲基磺酰氟，Sigma-Aldrich)，并将该悬浮液超声破碎3次，每次20秒。将悬浮液于10000克离心10分钟，(以除去细胞组分)，并回收上清并于100,000克离心2小时。将粒状物(膜蛋白组分)在2～3ml缓冲液3(50mM的Tris-盐酸，pH为7.4，1mM EDTA，20％甘油)重悬。为测量CO-谱，将蛋白组分在缓冲液3中稀释(1/10)至终体积2mL。添加一些连二亚硫酸钠(Na2S2O4)的晶体，样品被分为两个比色皿，并且基线记录在370～500毫微米。将样品比色皿以一氧化碳使其饱和，并且记录差异光谱。P450酶的浓度可以从450nm处峰的振幅使用91 mM-1·cm-1的降低的CO复合体的扩展系数进行估计(Omura,T.&Sato,R.(1964)J.Biol.Chem.239,2379-2387)。
按照此步骤，测定重组VzP521-11-1(SEQ ID NO:35)的和VzP521-16-1(SEQ IDNO:36)的蛋白在450nm处具有最大吸光度的典型的CO光谱，验证了正确折叠形成有功能P450酶(图4)。
实施例5
植物P450-还原酶在细菌中的异源表达
为了重组植物p450的活性，第二膜蛋白的存在是必要的。该 蛋白，P450还原酶(CPR)，参与到将电子从NAPDH(还原形式的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)转移到P450活性位点。已经表明来自一个植物的CPR可以完善来自另一植物的P450酶的活性(Jensen andMoller(2010)Phytochemsitry71,132-141)。
多个编码CPR核苷酸序列已被报道来自不同的植物。例如，两个不同的CPR，ATR1及ATR2(NCBI序号CAA46814.1和CAA46815)已经在拟南芥中鉴定(Urban等人(1997)J.Biol.Chem.272(31)19176–19186)。这些CPR已显示出完善来自多种植物品种的多个P450酶。使用大肠杆菌表达的密码子使用偏好(DNA2.0,Menlo Park,CA,USA)，并且分别在5’-末端和3’-末端包括NcoI和BamHI限制性位点来合成编码ATR1(17的N-端氨基酸缺失)的截短形式的cDNA(序列tcATR1-opt(SEQ ID NO:29)。此cDNA连接到质粒pJ206(DNA2.0,MenloPark,CA,USA)得到质粒pJ206-tcATR1-opt。插入物用NcoI和BamHI限制性酶从pJ206-tcATR1-opt质粒消化，并连接到pACYCDuet-1表达质粒(Novagen,Merck Chemicals)的相应的限制位点之间得到质粒pACYC-tcATR1-opt。在大肠杆菌细胞中的CPR功能表达可以根据细胞色素C的酶促还原来进行估计。质粒pACYC-tcATR1-opt用于转化Bl21(DE3)(Novagen)或JM109(DE3)(Promega,Madisson,WI,USA)大肠杆菌细胞。培养条件，蛋白表达和无细胞蛋白制备如实施例4所述进行。将蛋白溶解于添加了5μMFAD,5μM FMN,40mM细胞色素C(sigma-Aldrich),1mM MgCl2的pH7.4的1mL Tris中。通过添加0.12mmoles NADPH(Sigma)引发反应。细胞色素C的还原通过测量0.5～2分钟之后550nm处OD的增加进行记录。使用下述公式计算还原酶特异活性(毫单位/μL)：(OD结束-OD起始)/21/时间(秒)/体积(μL)x60000(毫单位/μL)。通常用重组体ATR1测量的活性在7～10毫单位/μL。
实施例6
使用两个质粒P450和P450还原酶的共表达
对于使用植物P450的全细胞生物转化，在单一宿主细胞中共表达的细胞色素P450和CPR蛋白是必需的。这种共表达可以使用两种质粒获得。例如，BL21StarＴＭ(DE3)大肠杆菌细胞(Invitrogen,Carlsbad,CA)可与质粒pACYC-tcATR1-opt和质粒pCW-218-521-11或pCW-218-521-16共转化。转化的细胞在羧苄青霉素(50μg/ml)和氯霉素(34μg/ml)的LB-琼脂平板上进行选择。将单个菌落接种于添加了有相同抗生素的5毫升的LB液体培养基中。将培养物在37℃下温育过夜。第二天在2～250毫升的添加了相同抗生素和1mM硫胺盐酸的TB培养基中接种0.2毫升过夜培养物。在37℃经过6小时的温育，将培养物冷却至28℃，添加1mM的IPTG和75mg/L的σ-氨基乙酰丙酸的溶液。将培养物保持在24～36小时。蛋白组分的制备如实施例4所述，分别用实施例4和5中描述的方法将重组体P450和CPR的表达进行评估。
实施例7
来自单一质粒的P450和P450还原酶的共表达
制备具有双顺反子构建体的表达质粒，其包括编码香根草P450的cDNA和编码CPR的cDNA。将该构建体设计为插入到两个编码区之间的一个包括核糖体结合位点(RBS)的间隔区序列(参见图5)。
将用大肠杆菌偏好密码子应用(DNA2.0,Menlo Park,CA,USA)合成的该tcATR1-opt cDNA(SEQ ID NO:29)修饰为在起始密码子之前在5’端添加含间隔序列(SEQ ID NO:30)和RBS序列的30bp延伸。用引物2390-CPR-F2(SEQ ID NO:31)and2390-CPR-R2b(SEQ IDNO:32)使用Pfu DNA聚合酶(Promega,Madison,WI,USA)扩增tcATR1-opt cDNA： 在最终50μl的体积中，含5μl的Pfu DNA聚合酶10X缓冲液，每种200μM的dNTP,0.4μM每种引物，2.9单位的Pfu DNA聚合酶和2.5μl的50ng的pJ206-tcATR1-opt质粒。热循环条件如下：在95℃1.5分钟；30个循环的在95℃45秒，在60℃30秒和在72℃4分钟；以及在72℃10分钟。在琼脂糖凝胶上纯化后，按照操作手册使用Dry-Down PCR克隆试剂盒(Clontech,Takara BioEurope)将PCR产物连接于用HindⅢ消化的pCW-218-521-11和pCW-218-521-16质粒上。得到的两个质粒pCW-2391-521-11和pCW-2392-521-16包含分别由VzP521-11-1和VzP521-16-1序列后跟tcATR1-opt序列组成的双顺反子构建体。
大肠杆菌细胞用这两个质粒之一转化，并且膜蛋白组分如实施例4中描述的方法制备，如在实施例4和5中所述的CO结合光谱和NADPH的减少测定对P450和CPR的表达进行验证。
实施例8
使用表达香根草的P450和CPR的大肠杆菌的全细胞对由客烯到客烯醇进行生物转 化
可使用表达香根草的P450和CPR的大肠杆菌的全细胞来进行的(+)-客烯的氧化(生物转化)。如专利WO2010/134004描述的方法使用工程化的大肠杆菌细胞并使用序号为HI931369的倍半萜合酶制备客烯。
简言之，BL21StarＴＭ(DE3)大肠杆菌细胞(Invitrogen Ltd)用质粒pACYC-4506和质粒pETDuet-VzZS-opt进行转化。
质粒pACYC-4506包含编码生物合成途径甲羟戊酸转化为FPP的五个酶的基因：甲羟戊酸激酶(MvaK1)，磷酸甲激酶(MvaK2)，甲羟戊酸磷酸脱羧酶(MvaD)，异戊烯基二磷酸异构酶(idi)和法尼基二磷酸合酶(FPS)。为了构建该质粒，酿酒酵母基因组 DNA扩增FPS基因，并连接到pACYCDuet-1的第一多克隆位点(MCS)上，并且将编码MvaK1，MvaK2，MvaD和idi的基因的操纵子从肺炎链球菌(ATCC BAA-334)的基因组DNA扩增出来，并连接到所述第二MCS。pETDuet-VzZS-opt包含香根草的密码子优化形式的香根草(+)-客烯合酶(如WO2010/134004所述的SEQ ID NO:11)。
将转化细胞的单菌落用于接种5毫升的添加了羧苄青霉素(50毫克/毫升)和氯霉素(34毫克/毫升)的LB培养基中。培养物在37℃温育过夜。第二天在1升添加了有相同抗生素的极品肉汤中(TB)培养基中接种1/100体积的过夜培养物。在37℃温育6小时后，将培养物冷却至28℃，向培养物中添加1mM的IPTG、2克/L的甲羟戊酸(通过在0.5N氢氧化钠中溶解甲瓦龙酸内酯(Sigma-Aldrich)至1克/毫升的浓度并在37℃温育30分钟来制备)，和100克/升的AmberliteＴＭXADＴＭ-4树脂(Rhom and Haas)加入到培养物中。经过48小时培养后，将树脂回收，用水冲洗，并用3倍体积的乙醚洗提。除去溶剂，产物用正己烷作溶剂通过硅胶快速色谱法进行纯化。含(+)-客烯的馏分被汇集，通过蒸馏除去溶剂，残余物用作底物进行氧化作用测定。
用质粒pCW-2391-521-11或pCW-2392-521-16转化大肠杆菌细胞(BL21StarＴＭ(DE3)、大肠杆菌细胞(Invitrogen Ltd)或JM109(DE3)(Promega))或用质粒pCW-218-521-11或pCW-218-521-16和pACYC-tcATR1-opt共转化细胞，并在添加了3％的甘油的TB培养基或添加了1％葡萄糖的LB培养基中生长。该培养物在37℃温育，直至达到1的光密度。然后将培养物转移到28℃，1mM的IPTG和74微克/毫升δ-氨基乙酰丙酸中，并将该培养物培养24小时。
在指数生长期收获细胞，离心并在0.5体积的添加有5％的甘油或3％的葡萄糖的50mM pH7.0磷酸钾缓冲液中重悬。添加底物 ((+)-客烯)直至最终浓度达0.5毫克/毫升，形成由10毫克20(sigma-Aldrich)，10mg的消泡剂(Erol DF,PMC Ouvrie,Lesquin,France)，20毫克(+)-客烯和1ml水组成的混合物。在20℃温和摇动下使转化进行24小时，介质用2倍体积乙酸乙酯提取，和提取物在连有Agilent5975质谱检测仪的Agilent6890Series GC系统上通过GCMS进行分析。该GC装有0.25毫米内径的30米SPB-1毛细柱(Supelco,Bellefonte,PA)。载气为以1毫升/分钟的恒定流量的He气。起始炉温为50℃(保持1分钟)，接着以10℃/分钟的梯度升至300℃。产品的鉴定是基于质谱和保留指数与标准样品和内部数据的比较。
在这些条件下，通过含有VzP521-11-1和VzP521-16-1重组蛋白的细胞观察到(+)-客烯的氧化。观察到三种产物并且通过GCMS分析进行确定：客烯醇，客烯醛和客烯酸，获得了从(+)-客烯的连续氧化反应(图6)。因此，VzP521-11-1和VzP521-162-1酶催化了从(+)-客烯到客烯醇的氧化。客烯醇到客烯醛和客烯酸的进一步氧化可由重组P450或通过内源大肠杆菌酶的活性来催化(图7)。
实施例9
使用表达香根草的P450和CPR的大肠杆菌的全细胞对其它单萜和倍半萜分子进行 生物转化
制备表达香根草的P450和CPR的大肠杆菌细胞，如实施例8中描述的磷酸钾缓冲液中的剩余细胞进行生长和生物转化。
采用几个萜分子进行测定，并用如实施例8所述的GCMS分析来评价氧化的萜分子的形成。除了(+)-客烯之外，观察到了在下列分子的生物转化：(+)-柠檬烯、(-)-柠檬烯，α-蒎烯，α-雪松烯，α-长叶蒎烯，α-柏木萜，罗汉柏烯，朱栾倍半萜，β-花柏烯，香树烯，α-新丁香三环烯，异洒剔烯，喇叭烯，α-蛇麻烯，α-古芸烯，γ-古芸烯，β-柏木萜，α-古巴烯，α-古芸烯和β-蒎烯。这些分子 的结构示于图1，从这些生物转化的GCMS分析的色谱图的实例示于图8。对于一些底物的检测，鉴别出产物并示于图9。
实施例10
用香根草的P450体外氧化化合物
使用来自香根草的P450的倍半萜的氧化也可以使用细胞裂解物或部分纯化的蛋白在体外进行。
用质粒pCW-2391-521-11或pCW-2392-521-16转化大肠杆菌细胞(BL21StarＴＭ(DE3)、大肠杆菌细胞(Invitrogen Ltd)或JM109(DE3)(Promega))，或用质粒pCW-218-521-11或pCW-218-521-16和pACYC-tcATR1-opt共转化细胞。细胞培养条件下，蛋白质的表达和膜蛋白的制备如实施例4和5中所描述。这些蛋白质组分用于(+)-客烯或实施例9中列出的萜分子的体外转化。特定测定物是由20～50μL的蛋白，0.4毫克的NADPH(Sigma)，5μM FAD(黄素腺嘌呤二核苷酸，Sigma)，5μM FMN(黄素单核苷酸，Sigma)，0.05毫克(+)-客烯在总体积1毫升的100mM的pH为7.4的Tris缓冲液组成。在一些测定物中，添加NADPH-重构体系，其由25毫摩尔葡萄糖-6-磷酸(Sigma)和6毫单位的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(Sigma)组成。测定物在30℃孵育2～12小时，然后将样品用1体积的乙酸乙酯萃取两次，并进行实施例8中描述的GCMS分析。
使用如实施例8和9描述的大肠杆菌全细胞时用该方法得到了相同的产品。
实施例11
工程设计细胞体内生产客烯醇
(+)-客烯的氧化产物也可以在设计成从一个碳源如葡萄糖或甘油产生倍半萜的大肠杆菌细胞中生产。制备质粒使其由pCWori(Barnes H.J(1996)Method Enzymol.272,3-14)质粒组成，该质粒含有由细胞色素P450，细胞色素P450还原酶和萜类合成酶组成的操纵子。 通过在pCW-2391-521-11或pCW-2392-521-16中CPR序列的终止密码子后插入RBS序列和编码(+)-客烯合酶(VzZS)优化的序列如此制备两个质粒。
使用引物2401-VzZS-F(SEQ ID NO:33)和2401-VzZS-R(SEQ ID NO:34)从pETDuet-VzZS-opt质粒(如WO2010/134004所描述)扩增VzZS。该PCR使用Pfu DNA聚合酶(Promega,Madison,WI,USA)进行，在50μl的最终体积中，含5μl的Pfu DNA聚合酶10X缓冲液,每种200μM的dNTP,0.4μM每种引物,2.9单位的Pfu DNA聚合酶和50ng模板。热循环条件如下：95℃1.5分钟；30个循环的95℃45秒,60℃30秒和72℃4分钟；以及72℃10分钟。对PCR产物进行纯化并连接到用HindIII和EcorI限制性内切酶消化的pCW-2391-521-11或pCW-2392-521-16质粒上。按照操作手册使用 Dry-Down PCR克隆试剂盒(Clontech,Takara Bio Europe)进行连接。所得质粒pCW-2401-521-11和pCW-2402-521-16含有由分别为VzP521-11-1或VzP521-16-1序列，tcATR1-opt序列(P450还原酶)和VzZS序列((+)-客烯合酶)组成的插入物(图10).
制备另一种表达质粒使其含两个操纵子，该操纵子由编码完整的甲羟戊酸途径的基因的酶组成。化学合成第一合成的操纵子(DNA2.0，Menlo Park，CA，USA)，该操纵子由大肠杆菌乙酰乙酰辅酶A硫解酶(atoB)，金黄色葡萄球菌的HMG-CoA合酶(mvaS)，金黄色葡萄球菌HMG-CoA还原酶(mvaA)和酿酒酵母FPP合酶(ERG20)的基因组成，并将其连接到用NcoI-BamHI消化的pACYCDuet-1载体(Invitrogen)上，得到的pACYC-29258。该质粒的基因编码对于乙酰-CoA到甲羟戊酸的转化和对于FPP合成酶所必需的酶。第二操纵子包含编码对于甲羟戊酸IPP和DMAPP的转化必需的四种酶的基因，并使用下述引物：5’-AAGGAGATATACATATGACAAAAAAAAGTTGGTGTCGGTCAGG-3’(正向) 和5’-CTTTACCAGACTCGAGTTACGCCTTTTTCATCTGATCCTTTGC-3’(反向)将其从质粒的pACYC-4506(实施例8)扩增出来。
使用In-Fusion2.0Dry-Down PCR Cloning Kit(Clontech)将所得到的扩增产物克隆到NdeI-XhoI消化的pACYC-29258载体中得到pACYC-29258-4506载体。
用质粒pACYC-29258-4506和质粒PCW-2401-521-11或质粒pCW-2402-521-16将OverExpressＴＭC43(DE3)大肠杆菌细胞(Corporation)共转化。用转化细胞的单菌落来接种添加了羧苄青霉素(100μg/ml)和氯霉素(17μg/ml)的5ml的LB培养基。在37℃将培养物温育过夜，并接种于添加了2克/升酵母提取物，3％甘油，10μM硫酸亚铁，100μg/ml羧苄青霉素和17μg/ml氯霉素的M9培养基中。在37℃将培养物温育6小时，冷却至25℃，并添加0.1mM的IPTG，74μg/mlδ-氨基乙酰丙酸和1/10体积的十二烷。48小时后，将培养物用2倍体积的甲基叔丁基醚(MTBE)萃取，并且萃取物如实施例8中描述的通过GCMS分析，不同的是炉温最初设定在80℃，并保持一分钟，接着以10℃/分钟的梯度升至300℃。
对倍半萜(+)-客烯和衍生的醇和醛(客烯醇和客烯醛)进行检测。客烯酸也被发现作为次要产物(图11)。该实验表明，在工程改造的细胞中，生成了倍半萜(+)-客烯，并被异源P450和CPR复合体氧化。
这个实施例表明，转化后表达本发明多肽的大肠杆菌细胞能够氧化的萜化合物，如客烯的，条件是其与细胞色素P450还原酶结合。用其转化的大肠杆菌细胞的其它酶对于这样的氧化不是必需的。事实上，当大肠杆菌细胞仅用细胞色素P450、还原酶和萜合酶转化时也生成了氧化的萜，但量较低。添加用其转化大肠杆菌细胞的其它酶的唯一目的是用于增加对细胞色素P450可用作底物的萜的量。

Claims (12)

1.一种多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1或2所示，任选地连有膜锚定序列，并且具有细胞色素P450活性，其特征在于所述多肽能够氧化选自单环或多环单萜和倍半萜的至少一种萜化合物。
2.权利要求1所述的多肽，其特征在于所述单环或多环单萜或倍半萜在环状部分包括至少一个甲基作为取代基。
3.权利要求2所述的多肽，其特征在于所述单环或多环单萜或倍半萜选自由客烯、α-雪松烯，α-长叶蒎烯、α-柏木萜、罗汉柏烯、朱栾倍半萜、β-花柏烯、香树烯、α-新丁香三环烯、异洒剔烯、喇叭烯、S-柠檬烯，α-蛇麻烯，α-古芸烯、α-蒎烯、β-柏木萜、R–柠檬烯和β-蒎烯组成的组。
4.一种核酸，其编码权利要求1～3中任一项所述的多肽。
5.权利要求4所述的核酸，其由SEQ ID NO:3、4或它们的互补序列组成，任选地连有编码膜锚定序列的核苷酸序列。
6.包含权利要求4或5所述的核酸的表达载体，其中所述载体为病毒载体或质粒的形式。
7.包含权利要求4或5所述的核酸的表达载体，其中所述载体为噬菌体的形式。
8.经转化包含根据权利要求4或5所述的至少一种核酸的原核生物或真菌。
9.经转化包含根据权利要求4或5所述的至少一种核酸的微生物。
10.权利要求9所述的微生物，其是细菌或酵母。
11.权利要求10所述的微生物，其中所述细菌是大肠杆菌，所述酵母是酿酒酵母。
12.一种氧化至少一种萜化合物的方法，包含：
a)在细胞色素P450还原酶的存在下将所述萜化合物与权利要求1～3中任一项所述的至少一种多肽接触；
b)任选地，分离在步骤a)中产生的氧化的萜，
所述的萜化合物选自由客烯、α-雪松烯，α-长叶蒎烯、α-柏木萜、罗汉柏烯、朱栾倍半萜、β-花柏烯、香树烯、α-新丁香三环烯、异洒剔烯、喇叭烯、S-柠檬烯，α-蛇麻烯，α-古芸烯、α-蒎烯、β-柏木萜、R–柠檬烯和β-蒎烯组成的组。
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