KR101487304B1 - 이소프레노이드 변형 효소를 코드화하는 폴리뉴클레오티드 및 그것의 사용방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 이소프레노이드 변형 효소를 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리된 핵산과, 그 핵산을 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 본 발명은 추가로 본 발명의 핵산 또는 재조합 벡터를 포함하는 유전적으로 변형된 숙주세포를 제공한다. 본 발명은 나아가 본 발명의 핵산을 포함하는 유전자도입 식물을 제공한다. 또한 본 발명은 이소프레노이드 화합물의 제조 방법을 제공하는데, 그 방법은 일반적으로 본 발명의 유전적으로 변형된 숙주세포를, 본 발명의 핵산에 의해 코드화된 이소프레노이드 화합물 변형 효소의 합성을 허용하는 조건하에서 배양하는 것으로 이루어진다.

Description

이소프레노이드 변형 효소를 코드화하는 폴리뉴클레오티드 및 그것의 사용방법{POLYNUCLEOTIDES ENCODING ISOPRENOID MODIFYING ENZYMES AND METHODS OF USE THEREOF}
본 발명은 이소프레노이드 화합물의 제조 분야에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 이소프레노이드 화합물을 변형하는 효소에 관한 것이다.
이소프레노이드(isoprenoid)는 공통적인 생합성 기원, 즉 단일한 대사 전구체인 이소펜테닐 디포스페이트(IPP)를 가지는 천연 생성물의 매우 크고 다양한 그룹을 구성한다. 지금까지 최소한 20,000개의 이소프레노이드가 설명되었다. 정의에 의하면, 이소프레노이드는 소위 이소프렌(C5) 유닛으로 구성된다. 이소프레노이드에 존재하는 C-원자의 번호는 전형적으로 5개로 나눌 수 있지만 (C5, C10, C15, C20, C25, C30 및 C40), 불규칙적인 이소프레노이드와 폴리테르펜도 보고된 바 있다. 이소프레노이드 화합물은 또한 "테르펜" 또는 "테르페노이드"로도 불린다. 이소프레노이드의 중요한 구성원으로는 카로테노이드, 세스퀴테르페노이드, 디테르페노이드, 및 헤미테르펜이 있다. 카로테노이드로는 예를 들면 리코펜, β-카로틴, 등이 있고, 그것들 중 많은 것이 항산화제로서의 기능을 한다. 세스퀴테르페노이드로는 예를 들면 아르테미시닌이 있는데, 이것은 항-말라리아 활성을 가지는 화합물이다. 디테르페노이드로는 예를 들면 암 화학요법제인 탁솔이 있다.
문헌:
Bertea et al., (2005) Planta Med . 71:40-47; deKraker et al., (2003) Tetradedron 59:409-418; Martin et al., (2003) Nat . Biotechnol . 21:796-802; WO 03/025193; 미국 특허 공보 번호 20050019882호; 미국 특허 공보 번호 20030148479호; 미국 특허 공보 번호 20040005678호; 미국 특허 공보 번호 20030166255호.
이소프레노이드는 가장 수가 많고 구조적으로도 다양한 천연 생성물 부류를 포함한다. 이 부류에서, 식물 및 다른 천연 공급원으로부터 분리된 테르페노이드는 통상적인 풍미제 및 방향 화합물로서 사용될 뿐 아니라 항-말라리아, 항-바이러스, 및 항암 약물과 같은 약제학적 화합물로서도 사용된다. 현재 사용되는 테르페노이드 화합물 중 대부분은 천연 생성물이거나 그것들의 유도체이다. 이들 천연 생성물 중 많은 것의 공급원 유기체 (예컨대 나무, 해양 척추동물)는 상업적으로 실용적인 양으로 생산하기에 필요한 대규모 배양을 할 수 없는 것이거나 또는 이들 화합물의 증가된 생성 또는 유도체화를 위해 유전자 조작을 할 수 없는 것들이다. 그러므로 천연 생성물은 유사체로부터 반-합성적으로 생성되거나 또는 종래의 화학적 합성방법들을 사용하여 합성적으로 제조되어야 한다. 나아가 많은 천연 생성물들은 복잡한 구조를 가지고 있고, 그 결과로서 합성하는 것이 현재로서는 비경제적이거나 불가능하다. 그러한 천연 생성물들은 그것들의 천연 공급원, 예컨대 나무, 해면동물, 산호 및 해양 미생물로부터 추출되거나, 또는 보다 풍부한 전구체로부터 합성적으로 또는 반-합성적으로 제조되어야만 한다. 천연 생성물을 천연 공급원으로부터 추출하는 것은 천연 공급원의 활용성에 의해 제한되며, 천연 생성물의 합성 또는 반-합성 제조는 낮은 수율 및/또는 높은 가격으로 인해 곤란할 수 있다. 천연 공급원의 그러한 제조상의 문제점 및 제한된 활용성은 그러한 생성물의 상업적 및 임상적 개발을 제한할 수 있다.
중요한 세스퀴테르펜 화합물의 실례는 아르테미시닌이다. 아르테미시닌은 현재 식물 (Artemisia annua)로부터 추출되고 조합 치료 의약을 제조하기 위해 사용되는 매우 효과적인 항-말라리아 약물이다. 식물-유도된 아르테미시닌은 값이 비싸고 그것의 활용성은 식물이 성장하는 나라의 기후 및 정책적인 상황에 민감하다. 아르테미신산은 아르테미시닌의 핵심적인 중간체이다. 아모르파-4,11-디엔의 아르테미신산 알코올로의 전환은 아르테미시닌을 제조하는 중요한 단계이며, 전통적인 화학에 의해 이루어지는 것으로서 어렵고 값비싼 공정이다.
따라서 상기 언급된 결점들의 일부를 피하는 이소프레노이드 화합물의 제조 방법이 당해 기술분야에 필요하다. 본 발명은 이러한 필요를 이소프레노이드 화합물을 변형하는 효소를 코드화하는 폴리뉴클레오티드와, 그러한 효소를 제조하기 위해 유전적으로 변형된 숙주 세포를 제공함으로써 해결한다.
발명의 개요
본 발명은 이소프레노이드 변형 효소를 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리된 핵산, 및 뿐만 아니라 그 핵산을 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 본 발명은 나아가 그 핵산 또는 재조합 벡터를 포함하는 유전적으로 변형된 숙주 세포를 제공한다. 본 발명은 또한 그 핵산을 포함하는 유전자도입 식물을 제공한다. 본 발명은 또한 이소프레노이드 화합물을 제조하는 방법, 일반적으로 본 발명의 핵산에 의해 코드화된 효소의 합성을 허용하는 조건하에서 본 발명의 유전적으로 변형된 숙주 세포를 배양하는 것을 포함하는 방법을 제공하며, 이때 효소는 이소프레노이드 화합물을 변형한다.
도 1은 CYP71D-A4 cDNA 코딩 서열의 뉴클레오티드 서열 (SEQ ID NO:1)을 도시한다.
도 2는 아모르파디엔 12-산화효소 아미노산 서열 (SEQ ID NO:2)을 도시한다.
도 3은 아르테미시아 안뉴아 시토크롬 P450 환원효소 cDNA의 코딩 영역의 뉴클레오티드 서열 (SEQ ID NO:3)을 도시한다.
도 4는 아르테미시아 안뉴아 시토크롬 P450 환원효소 아미노산 서열 (SEQ ID NO:4)을 도시한다.
도 5a 내지 5c는 생체 내 기질 공급 실험의 결과를 도시한다.
도 6a 및 6b는 GC-MS에 의한 생성물 확인을 도시한다.
도 7a 내지 7c는 효모에서의 아르테미신산의 새로운 생성을 도시한다.
도 8a 내지 8c는 시험관 내 아모르파디엔 산화효소 효소 분석을 도시한다.
도 9는 이소프레노이드-변형 효소를 코드화하는 cDNA (클론 71D-B1)의 뉴클레오티드 서열 (SEQ ID NO:5)을 도시한다.
도 10은 이소프레노이드-변형 효소의 아미노산 서열 (71D-B1; SEQ ID NO:6)을 도시한다.
도 11a 내지 11c는 효소 71D-B1의 히드록실화 활성을 도시한다.
도 12는 이소프레노이드-변형 효소를 코드화하는 게놈 DNA의 뉴클레오티드 서열 (SEQ ID NO:7)을 도시한다.
도 13은 이소펜테닐 디포스페이트(IPP) 및 디메틸알릴 디포스페이트(DMAPP)로부터, 이소프레노이드 생합성 경로 중간체인 폴리프레닐 디포스페이트 게라닐 디포스페이트(GPP), 파르네실 디포스페이트(FPP), 및 게라닐게라닐 디포스페이트(GGPPP)의 생성을 초래하는 이소프레노이드 대사 경로의 개략적인 도면이다.
도 14는 IPP의 생성을 위한 메발로네이트(MEV) 경로의 개략적인 도면이다.
도 15는 IPP 및 이메틸알릴 피로포스페이트(DMAPP)에 대한 DXP 경로의 개략적인 도면이다.
정의
용어 "이소프레노이드", "이소프레노이드 화합물", "테르펜", "테르펜 화합물", "테르페노이드", 및 "테르페노이드 화합물"은 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 이소프레노이드 화합물은 소위 이소프렌(C5) 유닛의 다양한 구성원으로 구성된다. 이소프레노이드에 존재하는 C-원자의 번호는 전형적으로 5개로 골고루 나누어진다 (예컨대 C5, C10, C15, C20, C25, C30 및 C40). 불규칙적인 이소프레노이드 및 폴리테르펜도 보고된 바 있으며, 또한 "이소프레노이드"의 정의에 포함된다. 이소프레노이드 화합물로는 그것들에 한정되는 것은 아니지만, 모노테르펜, 세스퀴테르펜, 트리테르펜, 폴리테르펜, 및 디테르펜을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "프레닐 디포스페이트"는 "프레닐 피로포스페이트"와 상호교환적으로 사용되며, 단일한 프레닐 기를 가지는 모노프레닐 디포스페이트 (예컨대 IPP 및 DMAPP)와, 뿐만 아니라 2 또는 그 이상의 프레닐기를 포함하는 폴리프레닐 디포스페이트를 포함한다. 모노프레틸 디포스페이트는 이소펜테닐 피로포스페이트 (IPP) 및 그것의 이성질체인 디메틸알릴 피로포스페이트 (DMAPP)를 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "테르펜 합성효소"는 IPP, DMAPP, 또는 폴리프레닐 피로포스페이트를 효소적으로 변형함으로써 테르페노이드 화합물이 생성되는 어떠한 효소를 말한다. 용어 "테르펜 합성효소"는 프레닐 디포스페이트의 이소프레노이드로의 전환을 촉매하는 효소를 포함한다.
단어 "피로포스페이트"는 본원에서 "디포스페이트"와 상호교환적으로 사용된다. 그러므로 예를 들어 용어 "프레닐 디포스페이트"와 "프레닐 피로포포스페이트"는 상호교환가능하며, 용어 "이소프레닐 피로포스페이트"와 "이소프레닐 디포스페이트"도 상호교환가능하며, 용어 "파르네실 디포스페이트"와 "파르네실 피로포스페이트"도 또한 상호교환가능하다.
본원에서 사용되는 용어 "메발로네이트 경로" 또는 "MEV 경로"는 아세틸-CoA를 IPP로 전환시키는 생합성 경로를 말한다. 메발로네이트 경로는 다음 단계들을 촉매하는 효소들을 포함한다: (a) 2분자의 아세틸-CoA를 아세토아세틸-CoA로 축합하는 단계; (b) 아세토아세틸-CoA를 아세틸-CoA로 축합하여 HMG-CoA를 형성하는 단계; (c) HMG-CoA를 메발로네이트로 전환하는 단계; (d) 메발로네이트를 메발로네이트 5-포스페이트로 인산화하는 단계; (e) 메발로네이트 5-포스페이트를 메발로네이트 5-피로포스페이트로 전환하는 단계; 그리고 (f) 메발로네이트 5-피로포스페이트를 이소펜테닐 피로포스페이트로 전환하는 단계. 메발로네이트 경로는 도 14에 대략적으로 예시되어 있다. 메발로네이트 경로의 "상부 절반"은 MEV 경로 중간체를 통하여 아세틸-CoA를 메발로네이트로 전환하는 데 기여하는 효소들을 언급한다.
본원에서 사용되는 용어 "1-데옥시-D-크실룰로오스 5-디포스페이트 경로" 또는 "DXP 경로"는 글리세르알데히드-3-포스페이트와 피루베이트를 DXP 경로 중간체를 통하여 IPP와 DMAPP로 전환시키는 경로를 말하고, 이때 DXP 경로는 도 15에서 개략적으로 도시된 반응을 촉매하는 효소들을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "프레닐 트란스페라제"는 용어 "이소프레닐 디포스페이트 합성효소" 및 "폴리프레닐 합성효소" (예컨대 "GPP 합성효소", "FPP 합성효소", "OPP 합성효소")와 상호교환적으로 사용되며, 이소펜테닐 디포스페이트를 알릴성 프라이머 기질로 연속적으로 1'-4 축합하여 다양한 사슬 길이를 가지는 프레닐 디포스페이트를 형성시키는 반응을 촉매하는 효소들을 말한다.
본원에서 사용되는 용어 "폴리뉴클레오티드" 및 "핵산"은 상호교환적으로 사용되며, 어떠한 길이의 뉴클레오티드의 중합체 형태를 말하는 것으로, 리보뉴클레오티드거나 데옥시뉴클레오티드이다. 그러므로 이 용어는 그것들에 한정되는 것은 아니지만, 단일-, 이중-, 또는 다중-가닥의 DNA 또는 RNA, 게놈 DNA, cDNA, DNA-RNA 하이브리드, 또는 퓨린 및 피리미딘 염기 또는 다른 천연의, 화학적으로 또는 생화학적으로 변형된 비-천연의, 또는 유도된 뉴클레오티드 염기를 포함하는 중합체를 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "펩티드", "폴리펩티드", 및 "단백질"은 상호교환적으로 사용되며, 코드된 및 코드되지 않은 아미노산, 화학적으로 또는 생화학적으로 변형된 또는 유도된 아미노산을 포함할 수 있는 어떠한 길이의 아미노산의 중합체 형태, 및 변형된 펩티드 골격을 가지는 폴리펩티드를 말한다.
본원에서 핵산, 세포, 또는 유기체에 적용될 때 사용되는 용어 "자연-발생"이란 자연에서 발견되는 핵산, 세포, 또는 유기체를 말한다. 예를 들어 자연적인 공급원으로부터 분리될 수 있는 유기체 (바이러스를 포함함)에 존재하고 실험실에서 사람에 의해 의도적으로 변형되지 않은 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열이 자연 발생적이다.
본원에서 사용되는 용어 "분리된"은 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, 또는 세포가 자연적으로 발생하는 것과 상이한 환경에 있는 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, 또는 세포를 설명하는 것으로 의도된다. 분리된 유전적으로 변형된 숙주 세포는 유전적으로 변형된 숙주 세포의 혼합된 집단에 존재할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "외인성 핵산"은 주어진 자연계의 박테리아, 유기체, 또는 세포에서 정상적으로 또는 자연적으로 발견되지 않거나 및/또는 그것들에 의해 생성되지 않는 핵산을 말한다. 본원에서 사용되는 "내인성 핵산"은 주어진 자연계의 박테리아, 유기체, 또는 세포에서 정상적으로 발견되고 및/또는 그것들에 의해 생성되는 핵산을 말한다. "내인성 핵산"은 또한 "천연 핵산" 또는 주어진 박테리아, 유기체, 또는 세포에 "천연적인" 핵산으로도 언급된다. 예를 들어 HMGS, 메발로네이트 키나제, 및 포스포메발로네이트 키나제를 코드화하는 핵산들은 대장균에 대해 대표적인 외인성 핵산이다. 이들 메발로네이트 경로 핵산은 사카로마이세스 세레비시아에(맥주효모균)로부터 클론될 수 있다. 맥주효모균에서, 염색체 상에서 HMGS, MK, 및 PMK를 코드화하는 유전자 서열은 "내인성" 핵산일 것이다.
본원에서 사용되는 용어 "이종성 핵산"은 다음 중 최소한 하나의 것이 사실일 때의 핵산을 말한다: (a) 핵산은 주어진 숙주 미생물 또는 숙주 세포에 대해 외래("외인성")이다 (즉 그것에서 자연적으로 발견되지 않는다); (b) 핵산은 주어진 숙주 미생물 또는 숙주 세포에서 자연적으로 발견되는 (즉 "내인성"인) 뉴클레오티드 서열을 포함하지만 (예컨대 핵산은 숙주 미생물 또는 숙주 세포에 대해 내인성인 뉴클레오티드 서열을 포함한다), 세포에서 비천연적인 (예컨대 예상했던 것보다 많거나 자연적으로 발견되는 것보다 더 많은) 양으로 생성되거나, 또는 내인성으로 발견되는 것과 동일한 코드화된 단백질 (동일하거나 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 가짐)이 세포에서 비천연적인 (예컨대 예상했던 것보다 많거나 자연적으로 발견되는 것보다 더 많은) 양으로 생성되도록 내인성 뉴클레오티드 서열과 서열이 다르다; (c) 핵산은 자연계에서 상호 동일한 관계로 밝혀지지 않은 둘 또는 그 이상의 뉴클레오티드 서열 또는 절편을 포함한다, 예컨대 핵산은 재조합체이다.
본원에서 사용되는 용어 "재조합체"는 특정 핵산 (DNA 또는 RNA)이 자연적인 시스템에서 발견되는 내인성 핵산과는 구별되는 구조적 코딩 또는 비-코딩 서열을 가지는 구성물이 생성되는 클로닝, 제한, 및/또는 결찰 단계들의 다양한 조합의 생성물인 것을 의미한다. 일반적으로 구조적 코딩 서열을 코드화하는 DNA 서열은 cDNA 단편 및 짧은 올리고뉴클레오티드 링커로부터, 또는 일련의 합성 올리고뉴클레오티드로부터 조립되어 세포에 또는 세포-유리 전사 및 번역 시스템에 함유된 재조합체 전사 유닛으로부터 발현될 수 있는 합성 핵산이 제공될 수 있다. 그러한 서열은 전형적으로 진핵세포 유전자에 존재하는 내부 비-번역 서열, 또는 인트론에 의해 간섭받지 않는 오픈 리딩 프레임의 형태로 제공될 수 있다. 관련 서열을 포함하는 게놈 DNA는 또한 재조합 유전자 또는 번역 유닛의 형성에 사용될 수 있다. 비-번역된 DNA의 서열은 오른 리딩 프레임으로부터 5' 또는 3'에 존재할 수 있으며, 그곳에서 그러한 서열은 코딩 영역의 조작 또는 발현을 간섭하지 않으며, 실제로 다양한 메커니즘에 의해 원하는 생성물의 생성을 조절하는 작용을 할 수 있다 (아래의 "DNA 조절 서열" 참조).
그러므로 예를 들어 용어 "재조합" 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 자연 발생적이지 않은, 예컨대 사람의 개입을 통하여 두 개의 분리된 서열 절편의 인공적인 조합에 의해 제조된 것을 말한다. 이런 인공적인 조합은 때로 화학적 합성 수단에 의하여, 또는 분리된 핵산 절편의 인공적 조작에 의하여, 예컨대 유전자 공학적 기술에 의하여 이루어진다. 그러한 것은 통상적으로 코돈을 동일하거나 또는 보존성 아미노산을 코드화하는 풍부한 코돈으로 대체하는 것인 한편, 전형적으로는 서열 인지 부위를 도입하거나 제거하는 것이다. 또는 달리 원하는 기능의 조합을 생성하기 위하여 원하는 기능의 핵산 절편을 함께 묶는 것이 수행된다. 이런 인공적인 조합은 때로 화학적 합성 수단에 의하여, 또는 분리된 핵산 절편의 인공적 조작에 의하여, 예컨대 유전자 공학적 기술에 의하여 이루어진다.
"구성물"이란 특이한 뉴클레오티드 서열(들)의 발현을 목적으로 생성된, 또는 다른 재조합 뉴클레오티드 서열의 구성에 사용된 재조합 핵산, 보통은 재조합 DNA를 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "오페론"과 "단일 전사 유닛"은 하나 또는 그 이상의 조절 요소 (예컨대 프로모터)에 의해 협동적으로 조절되는 둘 또는 그 이상의 연속적인 코딩 영역 (RNA 또는 단백질과 같은 유전자 생성물을 코드화하는 뉴클레오티드 서열)을 말하는 것으로 상호교환적으로 사용된다. 본원에서 사용되는 용어 "유전자 생성물"은 DNA에 의해 코드화된 RNA (또는 그 역) 또는 RNA 또는 DNA에 의해 코드화된 단백질을 말하며, 이때 유전자는 전형적으로 단백질을 코드화하는 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함할 것이며, 또한 인트론과 다른 비-코딩 뉴클레오티드 서열도 포함할 수 있다.
용어 "DNA 조절 서열", "제어 요소", 및 "조절 요소"는 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 전사 및 번역 제어 서열, 예컨대 프로모터, 인핸서, 폴리아데닐화 신호, 터미네이터, 단백질 분해 신호 등을 말하고, 숙주 세포에서 코딩 서열의 발현 및/또는 코드화된 폴리펩티드의 생성을 제공하거나 및/또는 조절한다.
본원에서 사용된 용어 "형질전환"은 "유전자 변형"과 상호교환적으로 사용되며, 새로운 핵산 (즉 세포에 대해 외인성인 DNA)이 도입된 후에 세포에 유도된 영구적인 또는 일시적인 유전자 변화를 말한다. 유전자 변화 ("변형")는 새로운 DNA가 숙주 세포의 게놈에 통합됨으로써, 또는 새로운 DNA가 에피솜 요소로서 일시적으로 또는 안정하게 유지됨으로써 이루어질 수 있다. 세포가 진핵세포인 경우 영구적인 유전자 변화는 일반적으로 DNA가 세포의 게놈에 도입됨으로써 이루어진다. 진핵세포에서 영구적인 변화는 염색체 안에 또는 재조합 숙주 세포에서 유지되는 것을 보조하기 위해 하나 또는 그 이상의 선택가능한 마커를 함유할 수 있는 플라스미드 및 발현 벡터와 같은 염색체 외재성 요소를 통해 도입될 수 있다. 적당한 유전자 변형 방법으로는 바이러스 감염, 형질전환, 포합, 원형질체 융합, 일렉트로포레이션, 입자 총 기법, 칼슘 포스페이트 침전, 직접적인 마이크로주사 등이 있다. 방법의 선택은 일반적으로 형질전환되는 세포 유형 및 형질전환이 일어나는 환경 (즉 시험관 내, 생체 외, 또는 생체 내)에 좌우된다. 이들 방법에 대한 일반적인 논의는 참고문헌에서 찾아볼 수 있다 (Ausubel, et al., Short Protocols in Molecular Biology, 3rd ed., Wiley & Sons, 1995).
"작동가능하게 연결된"은 상기에서 설명된 성분들이 그것들의 의도된 방식으로 기능하도록 허용되는 관계로 존재하는 병렬배치를 나타낸다. 예를 들어 프로모터는 만약 프로모터가 그것의 전사 또는 발현에 영향을 준다면 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 것이다.
본원에서 사용되는 용어 "이종성 프로모터" 및 "이종성 제어 영역"은 자연적인 특정 핵산과 정상적으로 결합되지 않은 프로모터 및 다른 제어 영역을 말한다. 예를 들어 "코딩 영역에 이종성인 전사 제어 영역"은 자연적인 코딩 영역과 정상적으로 결합되지 않은 전사 제어 영역이다.
본원에서 사용되는 용어 "숙주 세포"는 생체 내 또는 시험관 내 진핵세포, 원핵세포, 또는 단세포 실체처럼 배양된 다세포 유기체로부터의 세포 (예컨대 셀라인)를 나타내며, 상기 원핵세포 또는 진핵세포는 핵산 (예컨대 메발로네이트 경로 유전자 생성물과 같은 하나 또는 그 이상의 생합성 경로 유전자 생성물을 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터)에 대한 수용체로서 사용될 수 있거나, 또는 사용되어 왔으며, 핵산에 의해 유전적으로 변형되어 있는 원래 세포의 자손을 포함한다. 단일 세포의 자손은 자연적인, 우연한, 또는 고의적인 돌연변이에 의하여, 반드시 원래의 부모와 같은 형태 또는 게놈 또는 총 DNA 보충물과 완전히 동일한 필요는 없다는 것이 인지된다. "재조합 숙주 세포" (또한 "유전자 변형된 숙주 세포"로도 언급됨)는 그 안에 이종성 핵산, 예컨대 발현 벡터가 도입되어 있는 숙주 세포이다. 예를 들어 대상 원핵 숙주세포는 적당한 원핵 숙주 세포 안으로의 이종성 핵산, 예를 들면 원핵 숙주세포에 대해 이물질인 (자연적으로 발견되지 않는) 외인성 핵산, 또는 원핵 숙주세포에서 정상적으로 발견되지 않는 재조합 핵산의 도입에 의하여 유전적으로 변형된 원핵 숙주세포 (예컨대 박테리아)이며; 대상 진핵 숙주 세포는 적당한 진핵 숙주 세포 안으로의 이종성 핵산, 예를 들면 진핵 숙주세포에 대해 이물질인 외인성 핵산, 또는 진핵 숙주세포에서 정상적으로 발견되지 않는 재조합 핵산의 도입에 의하여 유전적으로 변형된 진핵 숙주세포이다.
핵산은 핵산의 단일 가닥 형태가 적절한 온도 및 용액 이온 강도의 조건하에서 다른 핵산에 아닐될 수 있을 때 다른 핵산, 예컨대 cDNA, 게놈 DNA, 또는 RNA에 "혼성화될 수 있다". 혼성화 및 세척 조건은 문헌에 잘 설명되어 있으며 예시되어 있다 (Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (1989), 특히 제 11장 및 표 11.1; 및 Sambrook, J. and Russell, W., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (2001)). 온도 및 이온 강도 조건은 혼성화의 "엄격성"을 결정한다. 엄격성 조건은 적절하게 유사한 단편, 예컨대 관계가 먼 유기체로부터의 동종성 서열에 대하여, 매우 유사한 단편, 예컨대 관계가 밀접한 유기체로부터의 기능성 효소를 복사하는 유전자에 대해 선별하기 위해 조정될 수 있다. 혼성화 조건 및 후-혼성화 세척은 혼성화의 원하는 측정 엄격성 조건을 얻기 위하여 유용하다. 한 세트의 예시적인 후-혼성화 세척은 실온에서 15분 동안 6×SSC (SSC는 0.15M NaCl 및 15mM 시트르산염 완충액이다), 0.5% SDS로 시작하여, 그런 다음 45℃에서 30분 동안 2×SSC, 0.5% SDS를 반복한 후, 50℃에서 30분 동안 0.2×SSC, 0.5% SDS를 반복하는 일련의 세척이다. 다른 엄격성 조건은 세척은 상기와 같고, 단 0.2×SSC, 0.5% SDS의 최종 2회의 30분 세척의 온도가 60℃로 증가되는 보다 높은 온도를 사용함으로써 얻어진다. 다른 세트의 고도로 엄격한 조건은 0.1×SSC, 0.1% SDS의 최종 2회의 세척을 65℃에서 사용한다. 또 다른 세트의 엄격한 혼성화 조건은 50℃ 혹은 그 이상의 온도와 0.1×SSC (15mM 염화나트륨/1.5mM 시트르산 나트륨)에서의 혼성화이다. 다른 세트의 엄격한 혼성화 조건은 다음 용액: 50% 포름아미드, 5×SSC (150mM NaCl, 15mM 3나트륨 시트레이트), 50mM 나트륨 포스페이트 (pH 7.6), 5×덴하르드트 용액, 10% 덱스트란 술페이트, 및 20㎍/ml의 변성된, 전단된 연어 정자 DNA에서 42℃에서 밤새 인큐베이션한 후, 필터를 0.1×SSC에서 약 65℃에서 세척하는 것이다. 엄격한 혼성화 조건 및 후-혼성화 세척 조건은 최소한 상기 대표적인 조건과 같이 엄격한 혼성화 조건 및 후-혼성화 세척 조건이다.
혼성화는 혼성화 엄격성에 따라 염기들 사이의 미스매치가 가능하긴 하지만 두 개의 핵산이 상보하는 서열을 함유하는 것을 필요로 한다. 핵산을 혼성화하기 위해 적절한 엄격성은 당해 기술분야에 잘 알려져 있는 변수들인 핵산의 길이 및 상보성 정도에 따라 좌우된다. 두 개의 뉴클레오티드 서열 사이의 유사성 또는 동종성의 정도가 더 클수록 그러한 서열을 가지는 핵산의 하이브리드에 대한 용융 온도 (Tm)의 값은 더 크다. 핵산 혼성화의 상대적인 안정성 (더 큰 Tm에 해당함)은 다음 순서로 감소한다: RNA:RNA, DNA:RNA, DNA:DNA. 길이가 100 뉴클레오티드 이상인 하이브리드에 대해 Tm을 계산하기 위한 방정식이 유도되었다 (Sambrook et al., 상기동일, 9.50-9.51). 더 짧은 핵산, 예컨대 올리고뉴클레오티드를 사용한 혼성화인 경우, 미스매치의 위치는 더 중요해지며, 올리고뉴클레오티드의 길이는 그것의 특이성을 결정한다 (Sambrook et al., 상기동일, 11.7-11.8). 전형적으로 혼성화할 수 있는 핵산에 대한 길이는 최소한 약 10 뉴클레오티드이다. 혼성화할 수 있는 핵산에 대한 예시적인 최소 길이는 최소한 약 15 뉴클레오티드; 최소한 약 20 뉴클레오티드; 및 최소한 약 30 뉴클레오티드이다. 나아가, 숙련된 당업자는 온도 및 세척 용액 염 농도가 프로브의 길이와 같은 인자에 따라 필요에 따라 조정될 수 있다는 것을 인식할 것이다.
용어 "보존성 아미노산 치환"은 단백질에서 유사한 측쇄를 가지는 아미노산 잔기의 상호교환성을 말한다. 예를 들어 지방족 측쇄를 가지는 아미노산의 그룹은 글리신, 알라닌, 발린, 로이신, 및 이소로이신으로 구성되고; 지방족-히드록실 측쇄를 가지는 아미노산의 그룹은 세린과 트레오닌으로 구성되며; 아미드-함유 측쇄를 가지는 아미노산의 그룹은 아스파라긴과 글루타민으로 구성되고; 방향족 측쇄를 가지는 아미노산의 그룹은 페닐알라닌, 티로신, 및 트립토판으로 구성되며; 염기성 측쇄를 가지는 아미노산의 그룹은 라이신, 아르기닌, 및 히스티딘으로 구성되고; 솽-함유 측쇄를 가지는 아미노산의 그룹은 시스테인과 메티오닌으로 구성된다. 예시적인 보존성 아미노산 치환기는 발린-로이신-이로로이신, 페닐알라닌-티로신, 라이신-아르기닌, 알라닌-발린, 및 아스파라긴-글루타민이다.
"합성 핵산"은 당업자들에게 알려져 있는 과정들을 사용하여 화학적으로 합성되는 올리고뉴클레오티드 빌딩 블록으로부터 조립될 수 있다. 이들 빌딩 블록은 결찰되고 아닐되어 유전자 절편을 형성하게 되고 그것은 나중에 효소적으로 조립되어 전체 유전자를 구성하게 된다. "화학적으로 합성되는"은 DNA의 서열과 관련하여, 성분인 뉴클레오티드가 시험관 내에서 조립되었음을 의미한다. DNA의 수동적인 화학적 합성은 상업적으로 활용할 수 있는 많은 기계 중 하나를 사용하여 수행될 수 있다. 핵산의 뉴클레오티드 서열은 숙주 세포의 코돈 경향을 반영하기 위해 뉴클레오티드 서열의 최적화를 토대로 최적 발현을 위해 변형될 수 있다. 숙련된 당업자는 코돈 용도가 숙주에 의해 선호되는 그런 코돈들을 향해 편향된다면 성공적인 발현의 가능성을 인지할 것이다. 바람직한 코돈의 측정은 서열 정보를 활용할 수 있는 숙주 세포로부터 유도된 유전자의 생존을 토대로 할 수 있다.
폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 다른 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드에 대해 특정 %의 "서열 동일성"을 가지는데, 이것은 배열될 때 염기 또는 아미노산의 백분율이 동일하거나, 두 서열을 비교할 때 동일한 관련 위치에 있는 것을 말한다. 서열 유사성은 많은 상이한 방법으로 측정될 수 있다. 서열 동일성을 측정하기 위하여, 서열은 BLAST를 포함하여, 전세계적인 웹, ncbi.nlm.gov/BLAST 상에서 활용할 수 있는 방법들 및 컴퓨터 프로그램들을 사용하여 배열될 수 있다 (예컨대 Altschul et al (1990), J. Mol . Biol . 215:403-10). 다른 배열 알고리즘은 Oxford Molecular Group, Inc.의 보조적 전권을 가진 Madison, WIsconsin (USA)사로부터의 Genetics Computing Group (GCG) 패키지로 활용할 수 있는 FASTA이다. 다른 배열 기법들은 문헌에 소개되어 있다 (Methods in Enzymology, vol. 266: Computer Methods for Macromolecular Sequence Analysis (1996), ed. Doolittle, Academic Press, Inc., a division of Harcourt Brace & Co., San Diego, California, USA). 특히 관심의 대상이 되는 것은 서열에 갭을 허용하는 배열 프로그램이다. 스미스-워터맨은 서열 배열 중에 갭을 허용하는 알고리즘의 한 유형이다 (Meth Mol . Biol . 70: 173-187 (1997)). 또한 니들맨과 분쉬의 배열 방법을 사용하는 GAP 프로그램도 서열을 배열하기 위해 활용될 수 있다 (Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol . 48:443-453 (1970)).
본 발명을 한층 더 설명하기 전에, 본 발명은 서술되는 특정한 구체예에 한정되지 않으며, 물론 그런 구체예들은 그 자체로서 달라질 수 있다는 것이 인지되어야 한다. 또한 본원에서 사용되는 기술은, 본 발명의 범주가 첨부되는 청구항에 의해서만 한정될 것이기 때문에, 특정한 구체예만을 설명할 목적이며, 제한하려는 의도가 아니라는 것이 인지되어야 한다.
값의 범위가 제공될 때, 분명하게 다른 언급이 없는 한 그 범위의 상한선과 하한선 사이에 있는, 하한선의 단위의 10번째에 이르기까지의 각각의 사이의 값과, 그 표시된 범위에 있는 어떠한 다른 표시된 또는 사이의 값은 본 발명에 포함된다. 이들 보다 작은 범위의 상한선 및 하한선은 독립적으로 보다 작은 범위에 포함될 수 있고, 또한 발명에 포함되며, 표시된 범위에서 어떠한 구체적으로 배제된 한계의 대상이 되기 쉽다. 표시된 범위가 하나 또는 두 개의 모든 한계를 포함하는 경우, 그런 포함된 한계 중 하나 또는 둘 다를 배제하는 범위도 또한 발명에 포함된다.
다르게 규정되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술적이고 과학적인 용어는 본 발명이 속하는 기술분야에 통상적인 지식을 가진 사람에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 비록 본원에서 설명된 것들과 유사하거나 동등한 모든 방법 및 물질이 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 물질을 아래에서 설명한다. 본원에서 언급되는 모든 공보물은 그 공보물이 인용되는 것과 관련된 방법 및/또는 물질을 개시하고 설명하기 위하여 참조로써 본원에 삽입된다.
본원 및 첨부되는 청구항에서 사용되는 것과 같이, 하나의 단수를 나타내는 것으로 표시된 용어의 단일 형태들 (원어에서는 "a", "an", 및 "the"로 앞에 표시됨)은 분명하게 다르게 표시되지 않는 한 다수의 지시대상을 포함한다. 그러므로 예를 들어 "이소프레노이드 변형 효소"에 대한 언급은 다수의 그러한 효소들을 포함하며, "시토크롬 P450 환원효소"에 대한 언급은 하나 또는 그 이상의 시토크롬 P450 환원효소 및 당업자들에게 공지되어 있는 그것의 동등물을 포함하는 식이다. 나아가 청구항은 어떠한 임의의 요소를 배제하도록 기안될 수 있음이 주지된다. 이런 표현은 그 자체로서 배제적인 용어, 예컨대 청구되는 요소의 설명과 관련하여 "단독으로", "단지" 등의 사용에 대한, 또는 "네거티브" 제한의 사용에 대한 선행 기초로서 작용하게 하기 위한 의도이다.
본원에서 논의된 공보물은 본 출원의 출원일 전에 개시된 것에 대해 제공된다. 본원에서는 아무것도 본 발명이 선행 발명에 의해 그러한 공보물보다 앞선 것이라고 해석되는 것은 없다. 나아가, 제공된 공보물의 공보일은 독립적으로 확인될 필요가 있을 수도 있는 실제 공보일과 다를 수 있다.
[발명의 상세한 설명]
본 발명은 이소프레노이드 변형 효소를 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리된 핵산과, 뿐만 아니라 그 핵산을 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 본 발명은 나아가 본 발명의 핵산 또는 재조합 벡터를 포함하는 유전적으로 변형된 숙주 세포를 제공한다. 본 발명은 또한 이소프레노이드 화합물의 제조 방법을 제공하며, 그 방법은 일반적으로 본 발명의 핵산에 의해 코드화된 이소프레노이드 화합물 변형 효소의 합성을 허용하는 조건하에서 유전적으로 변형된 본 발명의 숙주 세포를 배양하는 것을 포함한다.
핵산, 벡터, 및 숙주 세포
본 발명은 이소프레노이드 화합물을 변형하는 효소를 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리된 핵산을 제공하고, 이때 이소프레노이드 화합물을 변형하는 효소는 본원에서 "이소프레노이드 변형 효소"로서 언급된다. 이소프레노이드 변형 효소를 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 본 발명의 핵산은 "이소프레노이드-변형 효소 핵산"으로서 언급된다. 특정 구체예에서는 본 발명의 분리된 이소프레노이드-변형 효소 핵산은 시토크롬 P450 단일 산화효소를 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정한 구체예에서, 본 발명의 분리된 이소프레노이드-변형 효소 핵산은 이소프레노이드 산화효소를 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 어떤 구체예에서, 본 발명의 분리된 이소프레노이드-변형 효소 핵산은 테르펜 수산화효소를 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 어떤 구체예에서, 본 발명의 분리된 이소프레노이드-변형 효소 핵산은 테르펜 산화효소를 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 어떤 구체예에서, 본 발명의 분리된 이소프레노이드-변형 효소 핵산은 세스퀴테르펜 산화효소를 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 어떤 구체예에서, 본 발명의 분리된 이소프레노이드-변형 효소 핵산은 세스퀴테르펜 수산화효소를 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
NADPH-시토크롬 P450 산화환원효소 (CPR, EC 1.6.2.4)는 많은 P450-단일 산화효소의 산화환원 파트너이다. 본 발명은 나아가 시토크롬 P450 환원효소 (CPR)를 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리된 핵산을 제공한다. 본 발명의 CPR을 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산은 "CPR 핵산"으로서 언급된다. 본 발명의 CPR 핵산에 의해 코드화된 CPR은 NADPH로부터의 전자를 시토크롬 P450에 전달한다. 일반적으로 본 발명의 CPR 핵산에 의해 코드화된 CPR은 NADPH로부터의 전자를 본 발명의 이소프레노이드-변형 효소-코드화 핵산에 의해 코드화된 이소프레노이드-변형 효소, 예컨대 세스퀴테르펜 산화효소에 전달한다.
이소프레노이드 변형 효소를 코드화하는 핵산
어떤 구체예에서, 본 발명의 분리된 핵산은 이소프레노이드 수산화효소 및/또는 이소프레노이드 산화효소 활성을 나타내는 폴리펩티드를 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 어떤 구체예에서, 본 발명의 분리된 핵산은 시토크롬 P450 단일 산화효소를 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 어떤 구체예에서, 본 발명의 분리된 핵산은 이소프레노이드 수산화효소를 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 어떤 구체예에서, 본 발명의 분리된 핵산은 이소프레노이드 산화효소를 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 어떤 구체예에서, 본 발명의 분리된 핵산은 연속적인 히드록실화 및 산화 반응을 수행하는 폴리펩티드, 예를 들면 테르펜 화합물을 히드록실화하여 테르펜 알코올을 생성하고, 테르펜 알코올을 산화하여 테르펜 알데하이드를 생성하며, 테르펜 알데하이드를 산화하여 테르펜 카르복실산을 생성하는 폴리펩티드를 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 어떤 구체에에서, 본 발명의 분리된 핵산은 테르펜의 이소프로페닐기의 히드록실화 및/또는 산화를 촉매하는, 예컨대 모노테르펜, 디테르펜, 트리테르펜, 세스퀴테르펜, 또는 폴리테르펜의 이소프로페닐기의 히드록실화를 촉매하는 폴리펩티드를 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 어떤 구체예에서, 본 발명의 분리된 핵산은 모노테르펜 산화효소를 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 어떤 구체예에서, 본 발명의 분리된 핵산은 모노테르펜 수산화효소를 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 어떤 구체예에서, 본 발명의 분리된 핵산은 폴리테르펜 수산화효소를 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 어떤 구체예에서, 본 발명의 분리된 핵산은 폴리테르펜 산화효소를 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 어떤 구체예에서, 본 발명의 분리된 핵산은 디테르펜 수산화효소를 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 어떤 구체예에서, 본 발명의 분리된 핵산은 디테르펜 산화효소를 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 어떤 구체예에서, 본 발명의 분리된 핵산은 트리테르펜 수산화효소를 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 어떤 구체예에서, 본 발명의 분리된 핵산은 트리테르펜 산화효소를 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 어떤 구체예에서, 본 발명의 분리된 핵산은 세스퀴테르펜 수산화효소를 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 어떤 구체예에서, 본 발명의 분리된 핵산은 세스퀴테르펜 산화효소를 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 어떤 구체예에서, 본 발명의 분리된 핵산은 세스퀴테르펜 C12-수산화효소를 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 어떤 구체예에서, 본 발명의 분리된 핵산은 세스퀴테르펜의 C12 산화를 수행하는 폴리펩티드를 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 어떤 구체예에서, 본 발명의 분리된 핵산은 아모르파디엔 12-산화효소를 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
테르펜 시클라아제 (또한 "테르펜 합성효소"로서도 언급된다) 반응의 작용 생성물은 소위 "테르펜 골격"이다. 어떤 구체예에서, 본 발명의 분리된 핵산은 테르펜 골격의 히드록실화 및/또는 산화를 촉매하는 이소프레노이드-변형 효소를 코드화하는 뉴클레오티드 서열, 또는 그것의 하류 생성물을 포함한다. 일반적으로 본 발명의 핵산에 의해 코드화된 이소프레노이드-변형 효소의 기질은 테르펜 골격 또는 변형된 테르펜 골격을 포함한다. 많은 구체예에서, 본 발명의 핵산에 의해 코드화된 이소프레노이드-변형 효소의 기질은 이소프로페닐기를 포함한다.
본 발명의 핵산에 의해 코드화된 이소프레노이드-변형 효소의 모노테르펜 기질은, 그것들에 한정되는 것은 아니지만, 모노테르펜 화합물이거나 모노테르펜 화합물을 발생하는 생합성 경로의 중간체인 산화 생성물을 생산하는 모든 모노테르펜 기질을 포함한다. 예시적인 모노테르펜 기질로는 그것들에 한정되는 것은 아니지만, 다음 부류 중 어느 것에 속하는 모노테르펜 기질이 있다: 비고리식 모노테르펜, 디메틸옥탄, 멘탄, 비규칙적인 모노테르페노이드, 시네올, 캄판, 이소캄판, 단일고리형 모노테르펜, 피난, 펜찬, 츄주안, 카란, 요오논, 이리단, 및 칸나바노이드. 예시적인 모노테르펜 기질, 중간체, 및 생성물로는 그것에 한정되는 것은 아니지만, 리모넨, 시트라넬롤, 게라니올, 멘톨, 페릴릴 알코올, 리날로올, 및 츄요온이 있다.
본 발명의 핵산에 의해 코드화된 이소프레노이드-변형 효소의 디테르펜 기질은 그것들에 한정되는 것은 아니지만, 디테르펜 화합물이거나, 디테르펜 화합물을 발생시키는 생합성 경로의 중간체인 산화 생성물을 생산하는 모든 디테르펜 기질을 포함한다. 예시적인 디테르펜 기질은 그것들에 한정되는 것은 아니지만, 다음 부류 중 어느 하나에 속하는 디테르펜 기질을 포함한다: 비고리형 디테르페노이드, 이중고리형 디테르페노이드, 단일고리형 디테르페노이드, 라브단, 클레로단, 탁산, 삼중고리형 디테르페노이드, 사중고리형 디테르페노이드, 카우렌, 베이에렌, 아티세렌, 아피디콜린, 그레이아노톡신, 지베렐린, 거대고리형 디테르펜, 및 엘리자베타트리안. 예시적인 디테르펜 기질, 중간체, 및 생성물로는 그것에 한정되는 것은 아니지만 카스벤, 엘류테로빈, 파클리탁셀, 프로스트라틴, 및 슈도프테로신을 포함한다.
본 발명의 핵산에 의해 코드화된 이소프레노이드-변형 효소의 트리테르펜 기질은 그것들에 한정되는 것은 아니지만, 세스퀴테르펜 화합물이거나 세스퀴테르펜 화합물을 유발하는 생합성 경로의 중간체인 산화 생성물을 생산하는 모든 세스퀴테르펜 기질을 포함한다. 예시적인 세스퀴테르펜 기질로는, 그것들에 한정되는 것은 아니지만, 다음의 부류 중 어느 것에 속하는 세스퀴테르펜 기질을 포함한다: 파르네산, 모노시클로파르네산, 단일고리형 세스퀴테르펜, 이중고리형 세스퀴테르펜, 이중시클로파르네산, 비스볼란, 산탈란, 쿠프란, 헤르베르탄, 짐노미트란, 트리코테칸, 챠미그란, 카로탄, 아크로란, 안티사틴, 카디난, 오플로파난, 코파안, 피크로톡산, 히마칼란, 론지피난, 론지시클란, 카리오필란, 모드헵판, 시피페르폴란, 휴뮬란, 인테르그리폴리안, 리리폴리안, 프로토일루단, 일루단, 히르수탄, 락타란, 스테르푸란, 포마노산, 마라스만, 게르마크란, 엘레만, 유데스만, 박칸, 킬로시판, 구아이안, 슈도구아이안, 삼중고리형 세스퀴테르펜, 파쵸울란, 트릭산, 아로마덴드란, 고르고난, 나르도시난, 브라실란, 핑구이산, 세스퀴피난, 세스퀴캄판, 츄옵산, 비시클로휴뮬란, 알리아칸, 스테르푸란, 락타란, 아프리칸, 인테그리폴리안, 프로토일루단, 아리스톨란, 및 네오렘난. 예시적인 세스퀴테르펜 기질로는, 그것들에 한정되는 것은 아니지만, 아모르파디엔, 알로이소론지폴렌, (-)-α-트랜스-베르가모텐, (-)-β-엘레멘, (+)-게르마크렌 A, 게르마크렌 B, (+)-γ-구르유넨, (+)-레덴, 네오인테르메데올, (+)-β-셀리넨, 및 (+)-발렌센이 있다.
본 발명의 핵산이 테르펜 산화효소, 또는 테르펜 수산화효소를 코드화하는 지의 여부는 이들 효소적 활성에 대한 표준 분석을 사용하고, 적절한 기질을 사용하여 쉽게 확인될 수 있다. 효소적 변형의 생성물은 일반적으로 가스 크로마토그래피-질량 분광학에 의해 분석된다. 본 발명의 핵산이 세스퀴테르펜 산화효소, 또는 세스퀴테르펜 수산화효소를 코드화하는 지의 여부는 이들 효소적 활성에 대한 표준 분석을 사용하여 쉽게 확인될 수 있다 (미국 특허 공보 20050019882호 참조).
어떤 구체예에서, 본 발명의 핵산은 도 1에 도시되고 SEQ ID NO:1로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 어떤 구체예에서, 본 발명의 핵산은 SEQ ID NO:1에 표시된 뉴클레오티드 서열에 대하여 최소한 약 45%, 최소한 약 50%, 최소한 약 55%, 최소한 약 57%, 최소한 약 60%, 최소한 약 65%, 최소한 약 70%, 최소한 약 75%, 최소한 약 80%, 최소한 약 85%, 최소한 약 90%, 최소한 약 95%, 최소한 약 98%, 또는 최소한 약 99%의 뉴클레오티드 서열 동일성을 가지는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 어떤 구체예에서, 본 발명의 핵산은 SEQ ID NO:1에 표시된 뉴클레오티드 서열에 비교하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 약 10 내지 약 15, 약 15 내지 약 20, 약 20 내지 약 25, 또는 약 25 내지 약 50개의 뉴클레오티드 치환을 가지는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
어떤 구체예에서, 본 발명의 핵산은 SEQ ID NO:1에 표시된 뉴클레오티드 서열에 대하여 최소한 약 45%, 최소한 약 50%, 최소한 약 55%, 최소한 약 57%, 최소한 약 60%, 최소한 약 65%, 최소한 약 70%, 최소한 약 75%, 최소한 약 80%, 최소한 약 85%, 최소한 약 90%, 최소한 약 95%, 최소한 약 98%, 또는 최소한 약 99%의 뉴클레오티드 서열 동일성을 가지는 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 이때 핵산은 테르펜 수산화효소 및/또는 테르펜 산화효소 활성 (예컨대 세스퀴테르펜 산화효소 활성, 세스퀴테르펜 수산화효소 활성 등)을 나타내는 폴리펩티드를 코드화한다.
어떤 구체예에서, 본 발명의 핵산은 SEQ ID NO:1에 표시된 뉴클레오티드 서열의 최소한 약 500, 최소한 약 600, 최소한 약 700, 최소한 약 800, 최소한 약 900, 최소한 약 1000, 최소한 약 1100, 최소한 약 1200, 최소한 약 1300, 최소한 약 1400, 또는 최소한 약 1450개의 연속적인 뉴클레오티드의 스트레치에 대하여 최소한 약 50%, 최소한 약 55%, 최소한 약 57%, 최소한 약 60%, 최소한 약 65%, 최소한 약 70%, 최소한 약 75%, 최소한 약 80%, 최소한 약 85%, 최소한 약 90%, 최소한 약 95%, 최소한 약 98%, 또는 최소한 약 99%의 뉴클레오티드 서열 동일성을 가지는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
어떤 구체예에서, 본 발명의 핵산은 SEQ ID NO:1에 표시된 뉴클레오티드 서열의 최소한 약 500, 최소한 약 600, 최소한 약 700, 최소한 약 800, 최소한 약 900, 최소한 약 1000, 최소한 약 1100, 최소한 약 1200, 최소한 약 1300, 최소한 약 1400, 또는 최소한 약 1450개의 연속적인 뉴클레오티드를 포함한다. 어떤 구체예에서, 본 발명의 핵산은 SEQ ID NO:1에 표시된 뉴클레오티드 서열의 최소한 약 500, 최소한 약 600, 최소한 약 700, 최소한 약 800, 최소한 약 900, 최소한 약 1000, 최소한 약 1100, 최소한 약 1200, 최소한 약 1300, 최소한 약 1400, 또는 최소한 약 1450개의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하며, 테르펜 수산화효소 및/또는 테르펜 산화효소 활성, 예컨대 세스퀴테르펜 수산화효소 및/또는 산화효소 활성을 나타내는 폴리펩티드를 코드화한다.
어떤 구체예에서, 본 발명의 핵산은 SEQ ID NO:1에 표시된 뉴클레오티드 서열, 또는 그것의 상보물을 포함하는 핵산에 대해 엄격한 혼성화 조건하에서 혼성화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
어떤 구체예에서, 본 발명의 핵산은 도 2에 도시되고, SEQ ID NO:2에 표시된 것과 같은 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 어떤 구체예에서, 본 발명의 핵산은 SEQ ID NO:2에 표시된 아미노산 서열에 대하여 최소한 약 45%, 최소한 약 50%, 최소한 약 55%, 최소한 약 60%, 최소한 약 65%, 최소한 약 70%, 최소한 약 75%, 최소한 약 80%, 최소한 약 85%, 최소한 약 90%, 최소한 약 95%, 최소한 약 98%, 또는 최소한 약 99%의 아미노산 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 어떤 구체예에서, 본 발명의 핵산은 SEQ ID NO:2에 표시된 아미노산 서열의 최소한 약 50, 최소한 약 75, 최소한 약 100, 최소한 약 150, 최소한 약 200, 최소한 약 250, 최소한 약 300, 최소한 약 350, 최소한 약 400, 최소한 약 450, 또는 최소한 약 490개의 연속적인 아미노산의 스트레치에 대하여 최소한 약 45%, 최소한 약 50%, 최소한 약 55%, 최소한 약 60%, 최소한 약 65%, 최소한 약 70%, 최소한 약 75%, 최소한 약 80%, 최소한 약 85%, 최소한 약 90%, 최소한 약 95%, 최소한 약 98%, 또는 최소한 약 99%의 아미노산 서열 동일성을 가지는 아미노산을 포함하는 폴리펩티드를 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 어떤 구체예에서, 본 발명의 핵산은 SEQ ID NO:2에 표시된 아미노산 서열에 비교하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 약 10 내지 약 15, 약 15 내지 약 20, 또는 약 20 내지 약 25개의 보존성 아미노산 치환을 가지는 아미노산을 포함하는 폴리펩티드를 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 어떤 구체예에서, 코드화된 폴리펩티드는 테르펜 수산화효소 및/또는 테르펜 산화효소 활성을 나타낸다. 어떤 구체예에서, 코드화된 폴리펩티드는 세스퀴테르펜 산화효소 활성을 나타낸다. 어떤 구체예에서, 코드화된 폴리펩티드는 세스퀴테르펜 기질의 C12 산화를 촉매한다. 다른 구체예에서, 코드화된 폴리펩티드는 세스퀴테르펜 수산화효소 활성을 나타낸다.
어떤 구체예에서, 본 발명의 핵산은 SEQ ID NO:2에 표시된 아미노산 서열에 대하여 최소한 약 45%, 최소한 약 50%, 최소한 약 55%, 최소한 약 60%, 최소한 약 65%, 최소한 약 70%, 최소한 약 75%, 최소한 약 80%, 최소한 약 85%, 최소한 약 90%, 최소한 약 95%, 최소한 약 98%, 최소한 약 99%, 또는 100%의 아미노산 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열의 최소한 약 50, 최소한 약 75, 최소한 약 100, 최소한 약 150, 최소한 약 200, 최소한 약 250, 최소한 약 300, 최소한 약 350, 최소한 약 400, 최소한 약 450, 또는 최소한 약 490개의 연속적인 아미노산을 포함하는 폴리펩티드를 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 어떤 구체예에서, 코드화된 폴리펩티드는 테르펜 수산화효소 및/또는 테르펜 산화효소 활성을 나타낸다. 어떤 구체예에서, 코드화된 폴리펩티드는 세스퀴테르펜 산화효소 활성을 나타낸다. 어떤 구체예에서, 코드화된 폴리펩티드는 세스퀴테르펜 기질의 C12 산화를 촉매한다. 다른 구체예에서, 코드화된 폴리펩티드는 세스퀴테르펜 수산화효소 활성을 나타낸다.
어떤 구체예에서, 본 발명의 핵산은 도 9에 도시되고, SEQ ID NO:5에 표시된 것과 같은 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 어떤 구체예에서, 본 발명의 핵산은 SEQ ID NO:5에 표시된 뉴클레오티드 서열에 대하여 최소한 약 45%, 최소한 약 50%, 최소한 약 55%, 최소한 약 57%, 최소한 약 60%, 최소한 약 65%, 최소한 약 70%, 최소한 약 75%, 최소한 약 80%, 최소한 약 85%, 최소한 약 90%, 최소한 약 95%, 최소한 약 98%, 또는 최소한 약 99%의 뉴클레오티드 서열 동일성을 가지는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 어떤 구체예에서, 본 발명의 핵산은 SEQ ID NO:5에 표시된 뉴클레오티드 서열에 비교하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 약 10 내지 약 15, 약 15 내지 약 20, 약 20 내지 약 25, 또는 약 25 내지 약 50개의 뉴클레오티드 치환을 가지는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
어떤 구체예에서, 본 발명의 핵산은 SEQ ID NO:5에 표시된 뉴클레오티드 서열에 대하여 최소한 약 45%, 최소한 약 50%, 최소한 약 55%, 최소한 약 57%, 최소한 약 60%, 최소한 약 65%, 최소한 약 70%, 최소한 약 75%, 최소한 약 80%, 최소한 약 85%, 최소한 약 90%, 최소한 약 95%, 최소한 약 98%, 또는 최소한 약 99%의 뉴클레오티드 서열 동일성을 가지는 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 이때 핵산은 테르펜 수산화효소 및/또는 테르펜 산화효소 활성 (예컨대 세스퀴테르펜 산화효소 활성, 세스퀴테르펜 수산화효소 활성 등)을 나타내는 폴리펩티드를 코드화한다.
어떤 구체예에서, 본 발명의 핵산은 SEQ ID NO:5에 표시된 뉴클레오티드 서열의 최소한 약 500, 최소한 약 600, 최소한 약 700, 최소한 약 800, 최소한 약 900, 최소한 약 1000, 최소한 약 1100, 최소한 약 1200, 최소한 약 1300, 최소한 약 1400, 또는 최소한 약 1450개의 연속적인 뉴클레오티드의 스트레치에 대하여 최소한 약 45%, 최소한 약 50%, 최소한 약 55%, 최소한 약 57%, 최소한 약 60%, 최소한 약 65%, 최소한 약 70%, 최소한 약 75%, 최소한 약 80%, 최소한 약 85%, 최소한 약 90%, 최소한 약 95%, 최소한 약 98%, 또는 최소한 약 99%의 뉴클레오티드 서열 동일성을 가지는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
어떤 구체예에서, 본 발명의 핵산은 SEQ ID NO:6에 표시된 아미노산 서열에 대하여 최소한 약 50%, 최소한 약 55%, 최소한 약 60%, 최소한 약 65%, 최소한 약 70%, 최소한 약 75%, 최소한 약 80%, 최소한 약 85%, 최소한 약 90%, 최소한 약 95%, 최소한 약 98%, 최소한 약 99%, 또는 100%의 아미노산 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열의 최소한 약 50, 최소한 약 75, 최소한 약 100, 최소한 약 150, 최소한 약 200, 최소한 약 250, 최소한 약 300, 최소한 약 350, 최소한 약 400, 최소한 약 450, 또는 최소한 약 480개의 연속적인 아미노산을 포함하는 폴리펩티드를 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 많은 구체예에서, 코드화된 폴리펩티드는 테르펜 수산화효소 및/또는 테르펜 산화효소 활성을 나타낸다. 많은 구체예에서, 코드화된 폴리펩티드는 세스퀴테르펜 산화효소, 또는 세스퀴테르펜 수산화효소 활성을 나타낸다. 많은 구체예에서, 코드화된 폴리펩티드는 세스퀴테르펜 기질의 히드록실화를 촉매한다.
어떤 구체예에서, 본 발명의 핵산은 SEQ ID NO:5에 표시된 뉴클레오티드 서열의 최소한 약 500, 최소한 약 600, 최소한 약 700, 최소한 약 800, 최소한 약 900, 최소한 약 1000, 최소한 약 1100, 최소한 약 1200, 최소한 약 1300, 최소한 약 1400, 또는 최소한 약 1450개의 연속적인 뉴클레오티드를 포함한다. 어떤 구체예에서, 본 발명의 핵산은 SEQ ID NO:5에 표시된 뉴클레오티드 서열의 최소한 약 500, 최소한 약 600, 최소한 약 700, 최소한 약 800, 최소한 약 900, 최소한 약 1000, 최소한 약 1100, 최소한 약 1200, 최소한 약 1300, 최소한 약 1400, 또는 최소한 약 1450개의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하며, 테르펜 수산화효소 및/또는 테르펜 산화효소 활성, 예컨대 세스퀴테르펜 수산화효소 및/또는 산화효소 활성을 나타내는 폴리펩티드를 코드화한다.
어떤 구체예에서, 본 발명의 핵산은 SEQ ID NO:5에 표시된 뉴클레오티드 서열, 또는 그것의 상보물을 포함하는 핵산에 대해 엄격한 혼성화 조건하에서 혼성화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
어떤 구체예에서, 본 발명의 핵산은 도 9에 도시되고, SEQ ID NO:6에 표시된 것과 같은 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 어떤 구체예에서, 본 발명의 핵산은 SEQ ID NO:6에 표시된 아미노산 서열에 대하여 최소한 약 45%, 최소한 약 50%, 최소한 약 55%, 최소한 약 60%, 최소한 약 65%, 최소한 약 70%, 최소한 약 75%, 최소한 약 80%, 최소한 약 85%, 최소한 약 90%, 최소한 약 95%, 최소한 약 98%, 또는 최소한 약 99%의 아미노산 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 어떤 구체예에서, 본 발명의 핵산은 SEQ ID NO:6에 표시된 아미노산 서열의 최소한 약 50, 최소한 약 75, 최소한 약 100, 최소한 약 150, 최소한 약 200, 최소한 약 250, 최소한 약 300, 최소한 약 350, 최소한 약 400, 최소한 약 450, 또는 최소한 약 480개의 연속적인 아미노산의 스트레치에 대하여 최소한 약 45%, 최소한 약 50%, 최소한 약 55%, 최소한 약 60%, 최소한 약 65%, 최소한 약 70%, 최소한 약 75%, 최소한 약 80%, 최소한 약 85%, 최소한 약 90%, 최소한 약 95%, 최소한 약 98%, 또는 최소한 약 99%의 아미노산 서열 동일성을 가지는 아미노산을 포함하는 폴리펩티드를 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 어떤 구체예에서, 본 발명의 핵산은 SEQ ID NO:6에 표시된 아미노산 서열에 비교하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 약 10 내지 약 15, 약 15 내지 약 20, 또는 약 20 내지 약 25개의 보존성 아미노산 치환을 가지는 아미노산을 포함하는 폴리펩티드를 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 어떤 구체예에서, 코드화된 폴리펩티드는 테르펜 수산화효소 및/또는 테르펜 산화효소 활성을 나타낸다. 어떤 구체예에서, 코드화된 폴리펩티드는 세스퀴테르펜 산화효소 활성을 나타낸다. 어떤 구체예에서, 코드화된 폴리펩티드는 세스퀴테르펜 기질의 히드록실화를 촉매한다. 다른 구체예에서, 코드화된 폴리펩티드는 세스퀴테르펜 수산화효소 활성을 나타낸다.
어떤 구체예에서, 본 발명의 핵산은 SEQ ID NO:6에 표시된 아미노산 서열에 대하여 최소한 약 50%, 최소한 약 55%, 최소한 약 60%, 최소한 약 65%, 최소한 약 70%, 최소한 약 75%, 최소한 약 80%, 최소한 약 85%, 최소한 약 90%, 최소한 약 95%, 최소한 약 98%, 최소한 약 99%, 또는 100%의 아미노산 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열의 최소한 약 50, 최소한 약 75, 최소한 약 100, 최소한 약 150, 최소한 약 200, 최소한 약 250, 최소한 약 300, 최소한 약 350, 최소한 약 400, 최소한 약 450, 또는 최소한 약 480개의 연속적인 아미노산을 포함하는 폴리펩티드를 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 어떤 구체예에서, 코드화된 폴리펩티드는 테르펜 수산화효소 및/또는 테르펜 산화효소 활성을 나타낸다. 어떤 구체예에서, 코드화된 폴리펩티드는 세스퀴테르펜 산화효소 활성을 나타낸다. 어떤 구체예에서, 코드화된 폴리펩티드는 세스퀴테르펜 기질의 히드록실화를 촉매한다. 다른 구체예에서, 코드화된 폴리펩티드는 세스퀴테르펜 수산화효소 활성을 나타낸다.
어떤 구체예에서, 본 발명의 핵산은 SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:6에 표시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드의 변이체를 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 예를 들어 어떤 구체예에서, 본 발명의 핵산은 SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:6에 표시된 아미노산 서열을 포함하는 효소에 비교하여 다음의 특성 중 하나 또는 그 이상의 것을 나타내는 효소를 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다: 1) 증가된 효소 활성; 2) 증가된 시험관 내 및/또는 생체 내 안정성; 3) 증가된 생성물 수율; 4) 변경된 단백질 전환율; 5) 변경된 기질 특이성 (예컨대 변이체 효소는 선택된 기질(들)을 변형시킨다); 6) 증가된 효소 효능 (예컨대 생성물을 생성하기 위한 증가된 기질 전환의 효능); 및 7) 증가된 용해도 (예컨대 세포질 또는 시토솔 내에서의 용해도).
시토크롬 P450 환원효소를 코드화하는 핵산
본 발명은 시토크롬 P450 환원효소 (CPR)를 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리된 핵산을 제공한다. 어떤 구체예에서, 본 발명의 CPR 핵산은 본 발명의 이소프레노이드-변형 효소 핵산에 의해 코드화된 시토크롬 P450 산화효소에 NADPH로부터의 전자를 전달하는 CPR을 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
어떤 구체예에서, 본 발명의 핵산은 도 3에 도시되고 SEQ ID NO:3으로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 어떤 구체예에서, 본 발명의 핵산은 SEQ ID NO:3에 표시된 뉴클레오티드 서열에 최소한 약 85%, 최소한 약 90%, 최소한 약 95%, 최소한 약 98%, 또는 최소한 약 99%의 뉴클레오티드 서열 동일성을 가지는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
어떤 구체예에서, 어떤 구체예에서, 본 발명의 핵산은 SEQ ID NO:5에 표시된 뉴클레오티드 서열, 또는 그것의 상보물을 포함하는 핵산에 대해 엄격한 혼성화 조건하에서 혼성화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
어떤 구체예에서, 본 발명의 핵산은 도 4에 도시되고, SEQ ID NO:4에 표시된 것과 같은 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 어떤 구체예에서, 본 발명의 핵산은 SEQ ID NO:4에 표시된 아미노산 서열에 대하여 최소한 약 80%, 최소한 약 85%, 최소한 약 90%, 최소한 약 95%, 최소한 약 98%, 또는 최소한 약 99%의 아미노산 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 어떤 구체예에서, 본 발명의 핵산은 SEQ ID NO:4에 표시된 아미노산 서열에 비교하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 약 10 내지 약 15, 약 15 내지 약 20, 또는 약 20 내지 약 25개의 보존성 아미노산 치환을 가지는 아미노산을 포함하는 폴리펩티드를 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
어떤 구체예에서, 본 발명의 핵산은 SEQ ID NO:4에 표시된 아미노산 서열에 대하여 최소한 약 80%, 최소한 약 85%, 최소한 약 90%, 최소한 약 95%, 최소한 약 98%, 최소한 약 99%, 또는 100%의 아미노산 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열의 최소한 약 50, 최소한 약 75, 최소한 약 100, 최소한 약 150, 최소한 약 200, 최소한 약 250, 최소한 약 300, 최소한 약 350, 최소한 약 400, 최소한 약 450, 최소한 약 500, 최소한 약 550, 최소한 약 600, 최소한 약 650, 또는 최소한 약 700개의 연속적인 아미노산을 포함하는 폴리펩티드를 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 어떤 구체예에서, 코드화된 폴리펩티드는 본 발명의 이소프레노이드-변형 효소 핵산에 의해 코드화된 폴리펩티드 (예컨대 이소프레노이드-변형 효소)에 NADPH로부터의 전자를 전달한다.
어떤 구체예에서, 본 발명의 핵산은 SEQ ID NO:3에 표시된 뉴클레오티드 서열의 최소한 약 500, 최소한 약 600, 최소한 약 700, 최소한 약 800, 최소한 약 900, 최소한 약 1000, 최소한 약 1100, 최소한 약 1200, 최소한 약 1300, 최소한 약 1400, 최소한 약 1500, 최소한 약 1600, 최소한 약 1700, 최소한 약 1800, 최소한 약 1900, 최소한 약 2000, 또는 최소한 약 2100개의 연속적인 뉴클레오티드를 포함한다. 어떤 구체예에서, 본 발명의 핵산은 SEQ ID NO:3에 표시된 뉴클레오티드 서열의 최소한 약 500, 최소한 약 600, 최소한 약 700, 최소한 약 800, 최소한 약 900, 최소한 약 1000, 최소한 약 1100, 최소한 약 1200, 최소한 약 1300, 최소한 약 1400, 최소한 약 1500, 최소한 약 1600, 최소한 약 1700, 최소한 약 1800, 최소한 약 1900, 최소한 약 2000, 또는 최소한 약 2100개의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하며, 본 발명의 이소프레노이드-변형 효소 핵산에 의해 코드화된 시토크롬 P450에 NADPH로부터의 전자를 전달하는 폴리펩티드를 코드화하고, 예컨대 코드화된 폴리펩티드는 본 발명의 이소프레노이드-변형 효소 핵산에 의해 코드화된 폴리펩티드 (예컨대 이소프레노이드-변형 효소)에 NADPH로부터의 전자를 전달한다.
어떤 구체예에서, 본 발명의 핵산은 SEQ ID NO:4에 표시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드의 변이체를 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 예를 들어 어떤 구체예에서, 본 발명의 핵산은 SEQ ID NO:4에 표시된 아미노산 서열을 포함하는 효소에 비교하여 다음의 특성 중 하나 또는 그 이상의 것을 나타내는 효소를 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다: 1) 증가된 효소 활성; 2) 증가된 시험관 내 및/또는 생체 내 안정성; 3) 증가된 생성물 수율; 4) 변경된 단백질 전환율; 5) 변경된 기질 특이성 (예컨대 변이체 효소는 선택된 기질(들)을 변형시킨다); 6) 증가된 효소 효능 (예컨대 생성물을 생성하기 위한 증가된 기질 전환의 효능); 및 7) 증가된 용해도 (예컨대 세포질 또는 시토솔 내에서의 용해도).
어떤 구체예에서, 본 발명의 핵산은 이종성 폴리펩티드 ("융합 파트너"), 예컨대 상기에서 설명된 것과 같은 이소프레노이드-변형 효소 이외의 폴리펩티드에 융합된, 상기에서 설명된 것과 같은 테르펜 수산화효소 및/또는 테르펜 산화효소 활성을 나타내는 이소프레노이드-변형 효소의 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질을 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 어떤 구체예에서, 본 발명의 핵산은 상기에서 설명된 것과 같이, CPR의 아미노산 서열과, 이종 폴리펩티드, 예컨대 CPR 이외의 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질을 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 적당한 융합 파트너로는, 그것들에 한정되는 것은 아니지만 이소프레노이드-변형 효소 또는 CPR의 용해도를 증가시키는 폴리펩티드; 검출가능한 신호 (예컨대 형광 단백질; 검출가능한 생성물을 생산하는 효소, 예컨대 β-갈락토시다제, 루시페라제, 양고추냉이 과산화효소 등)를 제공하는 폴리펩티드; 이소프레노이드-변형 효소 또는 CPR을 특정한 세포 구획 (예컨대 시토졸, 세포질 등)에 포함시키는 폴리펩티드 등이 있다.
어떤 구체예에서, 본 발명의 핵산은 이소프레노이드-변형 효소 (예컨대 테르펜 수산화효소 및/또는 테르펜 산화효소 활성을 나타내는 폴리펩티드)와 CPR 둘 다를 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 어떤 구체예에서, 본 발명의 핵산은 상술된 것과 같이 CPR 폴리펩티드에 융합된 테르펜 수산화효소 및/또는 테르펜 산화효소 활성을 나타내는 이소프레노이드-변형 효소의 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질을 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 어떤 구체예에서, 코드화된 융합 단백질은 식 NH2-A-X-B-COOH의 것이며, 이때 A는 테르펜 수산화효소 및/또는 테르펜 산화효소 활성을 나타내는 이소프레노이드-변형 효소이고, X는 임의의 링커이며, B는 CPR 폴리펩티드이다. 어떤 구체예에서, 코드화된 융합 단백질은 식 NH2-A-X-B-COOH의 것이며, 이때 A는 CPR 폴리펩티드이고, X는 임의의 링커이며, B는 테르펜 수산화효소 및/또는 테르펜 산화효소 활성을 나타내는 이소프레노이드-변형 효소이다.
링커 펩티드는 다양한 아미노산 서열 중 어느 것을 가질 수 있다. 단백질은 비록 다른 화학적 결합도 포함되지만 일반적으로 가용성 성질을 가지는 스페이서 펩티드에 의해 결합될 수 있다. 적당한 링커 서열은 일반적으로 약 5 내지 약 50 아미노산 길이, 또는 약 6 내지 약 25 아미노산 길이의 펩티드일 수 있다. 다양한 가요성을 가지는 펩티드 링커가 일반적으로 사용될 것이다. 연결 펩티드는 실제로 어떠한 아미노산 서열을 가질 수 있고, 바람직한 링커는 일반적으로 가요성 펩티드를 초래하는 서열을 가질 것임이 주지되어야 한다. 글리신 및 알라닌과 같은 작은 아미노산의 사용은 가요성 펩티드의 생성을 위해 이용된다. 그러한 서열의 생성은 당업자들에게는 기본적인 것이다. 상이하고 다양한 링커들은 상업적으로 활용할 수 있고, 본 발명에 따라 사용하기에 적당한 것으로 여겨진다.
적당한 링커 펩티드는 단백질 구조에 가요성을 부여하는 것으로 알려져 있는 알라닌 및 프롤린 잔기가 풍부한 아미노산 서열을 자주 포함한다. 예시적인 링커는 글리신, 알라닌, 프롤린 및 메티오닌 잔기의 조합을 가지며, 예를 들면 AAAGGM (SEQ ID NO:8); AAAGGMPPAAAGGM (SEQ ID NO:9);AAAGGM (SEQ ID NO:10); 및 PPAAAGGM (SEQID NO:11)이다. 다른 예시적인 링커 펩티드는 IEGR (SEQ ID NO:12) 및 GGKGGK (SEQ ID NO:13)이다. 그러나 일반적으로 약 5 내지 약 50 아미노산 길이의 어떠한 가요성 링커든지 사용될 수 있다. 링커는 실제로 상기에서 예로 들은 유형의 알라닌-프롤린 풍부 서열을 포함하여, 일반적으로 가요성인 펩티드를 초래한는 어떠한 서열이든지 가질 수 있다.
구성물
본 발명은 나아가 본 발명의 핵산을 포함하는 재조합 벡터 ("구성물")를 제공한다. 어떤 구체예에서, 본 발명의 재조합 벡터는 본 발명의 핵산의 증폭을 제공한다. 어떤 구체예에서 본 발명의 재조합 벡터는 진핵세포에서, 원핵세포에서, 또는 세포-유리 전사/번역 시스템에서 코드화된 이소프레노이드-변형 효소, 또는 코드화된 CPR의 생성을 제공한다. 적당한 발현 벡터로는 그것들에 한정되는 것은 아니지만, 배큘로바이러스 벡터, 박테리오파지 벡터, 플라스미드, 파지미드, 코스미드, 포스미드, 박테리아 인공 염색체, 바이러스 벡터 (예컨대 백시니아 바이러스, 폴리오바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, SV40, 단순포진 바이러스 등을 기초로 하는 바이러스 벡터), P1-기초 인공 염색체, 효모 플라스미드, 효모 인공 염색체, 및 관심의 숙주 (예컨대 대장균, 효모, 및 식물세포)에 특이한 어떠한 다른 벡터가 있다.
어떤 구체예에서, 본 발명의 재조합 벡터는 본 발명의 이소프레노이드-변형 효소-코드화 핵산과 본 발명의 CPR-코드화 핵산을 포함한다. 이들 구체예 중 어떤 것에서, 본 발명의 재조합 벡터는 진핵세포에서, 원핵세포에서, 또는 세포-유리 전사/번역 시스템에서 코드화된 이소프레노이드-변형 효소 및 코드화된 CPR 둘 다의 생성을 제공하는 발현 벡터이다.
특정 유형의 벡터는 본 발명의 발현 카세트가 증폭되는 것을 허용한다. 다른 유형의 벡터는 본 발명의 핵산의 세포로의 효과적인 도입과 일단 도입된 후 그것의 안정한 발현에 필요하다. 본 발명의 핵산을 수용할 수 있는 어떠한 벡터든지 본 발명의 목적에 대해 적당한 재조합 벡터로 고려된다. 벡터는 숙주 게놈 안으로 통합되거나 또는 에피솜 형태로 유지되는 어떠한 원형 또는 선형 길이의 DNA일 수 있다. 벡터는 숙주 세포 (예컨대 많은 발현 플라스미드)에 효과적으로 통합되기 위해 추가의 조작 또는 특정한 조건을 필요로 하거나, 또는 자체-통합되는, 세포 특이적 시스템 (예컨대 재조합 바이러스)의 일부일 수 있다. 벡터는 어떤 구체예에서는 진핵세포에서 기능적인데, 그 안에서 그러한 벡터는 재조합 벡터를 증식시키는 기능을 하거나 및/또는 본 발명의 핵산의 발현을 제공한다. 벡터는 어떤 구체예에서는 진핵세포에서 기능적인데, 그때에 벡터는 많은 구체예에서 발현 벡터일 것이다.
수많은 적당한 발현 벡터가 당업자들에게 알려져 있고, 그 중 많은 것들은 상업적으로 이용할 수 있다. 그 실례로서 다음의 벡터들을 들 수 있다: 박테리아 숙주 세포에 대하여: pBluescript (Stratagene, San Diego, Calif.), pQE 벡터 (Qiagen), pBluescript 플라스미드, pNH 벡터, 람다-ZAP 벡터 (Stratagene); pTrc (Amann et al., Gene, 69:301-315 (1988)); pTrc99a, pKK223-3, pDR540, 및 pRIT2T (Pharmacia); 진핵 숙주세포에 대하여: pXTl, pSG5 (Stratagene), pSVK3, pBPV, pMSG, 및 pSVLSV40 (Pharmacia). 그러나 어떠한 다른 플라스미드 또는 다른 벡터라도 그것이 숙주 세포와 부합한다면 사용될 수 있다.
본 발명의 재조합 벡터는 많은 구체예에서 형질전환된 숙주 세포의 선택을 위한 표현형 흔적을 제공하기 위하여 하나 또는 그 이상의 선택가능한 마커 유전자를 함유할 것이다. 적당한 선택가능한 마커로는, 그것들에 한정되는 것은 아니지만, 진핵세포 배양을 위해서는 디히드로폴레이트 환원효소, 네오마이신 내성; 및 대장균과 같은 원핵 숙주세포에서는 테트라사이클린 또는 암피실린 내성이 있다.
많은 구체예에서, 적당한 핵산은 이소프레노이드-변형 효소를 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는데, 그때 이소프레노이드-변형 효소-코드화 뉴클레오티드 서열은 하나 또는 그 이상의 전사 및/또는 번역 제어 요소에 작동가능하게 연결된다. 많은 구체예에서, 본 발명의 핵산은 CPR을 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는데, 그때 CPR-코드화 뉴클레오티드 서열은 하나 또는 그 이상의 전사 및/또는 번역 제어 요소에 작동가능하게 연결된다.
어떤 구체예에서는, 상기에서 주지된 바와 같이, 본 발명의 재조합 벡터는 이소프레노이드-변형 효소-코드화 핵산과 본 발명의 CPR-코드화 핵산을 포함한다. 이들 구체예 중 어떤 것에서, 이소프레노이드-변형 효소-코드화 뉴클레오티드 서열과 본 발명의 CPR-코드화 뉴클레오티드 서열은 상이한 전사 제어 요소에 작동가능하게 연결된다. 다른 구체예에서, 이소프레노이드-변형 효소-코드화 뉴클레오티드 서열과 CPR-코드화 뉴클레오티드 서열은 동일한 전사 제어 요소(들)에 작동가능하게 연결된다. 어떤 구체예에서, 이소프레노이드-변형 효소-코드화 뉴클레오티드 서열과 CPR-코드화 뉴클레오티드 서열은 둘 다 동일한 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 어떤 구체예에서, 이소프레노이드-변형 효소-코드화 뉴클레오티드 서열과 CPR-코드화 뉴클레오티드 서열은 둘 다 동일한 구성성 프로모터에 작동가능하게 연결된다.
원핵 숙주세포에 사용하기에 적당한 프로모터로는, 그것들에 한정되는 것은 아니지만, 다음과 같은 것들이 있다: 박테리오파지 T7 RNA 중합효소 프로모터; trp 프로모터; lac 오페론 프로모터; 하이브리드 프로모터, 예컨대 lac/tac 하이브리드 프로모터, tac/trc 하이브리드 프로모터, trp/lac 프로모터, T7/lac 프로모터; trc 프로모터; tac 프로모터 등; araBAD 프로모터; 생체 내 조절된 프로모터, 예컨대 ssaG 프로모터 또는 관련된 프로모터 (미국 특허 공보 20040131637 참조), pagC 프로모터 (Pulkkinen and Miller, J Bacteriol, 1991: 173(1):86-93; Alpuche-Aranda et al, PNAS, 1992; 89(21): 10079-83), nirB 프로모터 (Harborne et al. (1992) Mol. Micro . 6:2805-2813), 등 (예컨대 Dunstan et al. (1999) Infect . Immun . 67:5133-5141; McKelvie et al. (2004) Vaccine 22:3243-3255; and Chatfield et al. (1992) Biotechnol. 10:888-892); 시그마70 프로머터, 예컨대 일치 시그마70 프로모터 (예컨대 GenBank 승인 번호 AX798980, AX798961, 및 AX798183); 정지상 프로모터, 예컨대 dps 프로모터, spv 프로모터, 등; 병원성 섬(island)으로부터 유도된 프로모터 SPI-2 (WO96/17951); actA 프로모터 (Shetron-Rama et al. (2002) Infect. Immun . 70:1087-1096); rpsM 프로모터 (Valdivia and Falkow (1996). Mol . Microbiol. 22:367-378); tet 프로모터 (Hillen, W. and Wissmann, A. (1989) In Saenger, W. and Heinemann, U. (eds), Topics in Molecular and Structural Biology, Protein - Nucleic Acid Interaction . Macmillan, London, UK, Vol. 10, pp. 143-162); SP6 프로모터 (Melton et al. (1984) Nucl . Acids Res . 12:7035-7056); 등.
적당한 진핵 프로모터의 비-제한적인 실례로는 CMV 즉각 초기, HSV 티미딘 키나제, 초기 및 후기 SV40, 레트로바이러스로부터의 LTR, 및 마우스 메탈로티오네인-I가 있다. 어떤 구체예에서, 예를 들어 효모세포에서의 발현을 위해 적당한 프로모터로는 구성성 프로모터, 예컨대 ADH1 프로모터, PGK1프로모터, ENO 프로모터, PYK1프로모터 등; 또는 조절가능한 프로모터, 예컨대 GAL1 프로모터, GAL10프로모터, ADH2프로모터, PHO5 프로모터, CUP1프로모터, GAL7 프로모터, MET25프로모터, MET3 프로모터 등이 있다. 적절한 벡터와 프로모터의 선택은 당해 기술분야의 통상적인 지식 수준 내에 있다. 발현 벡터는 또한 번역 개시 및 전사 터미네이터에 대한 리보솜 결합 부위를 함유할 수 있다. 발현 벡터는 또한 발현을 증폭시키기에 적절한 서열을 포함할 수 있다.
많은 구체예에서, 이소프레노이드 변형 효소를 코드화하는 뉴클레오티드 서열은 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 많은 구체예에서, CPR을 코드화하는 뉴클레오티드 서열은 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 유도성 프로모터들은 당해 기술분야에 잘 알려져 있다. 적당한 유도성 프로모터로는, 그것들에 한정되는 것은 아니지만, 박테리오파지 λ의 pL; Plac, Ptrp; Ptac (Ptrp-lac 하이브리드 프로모터); 이소프로필-베타-D-티오갈락토피라노시드 (IPTG)-유도성 프로모터, 예컨대 lacZ 프로모터; 테트라사이클린-유도성 프로모터; 아라비노스 유도성 프로모터, 예컨대 PBAD (Guzman et al. (1995) J. Bacteriol . 177:4121-4130); 크실로오스-유도성 프로모터, 예컨대 Pxyl (Kim et al. (1996) Gene 181:71-76); GALl 프로모터; 트립토판 프로모터; lac 프로모터; 알코올-유도성 프로모터, 예컨대 메탄올-유도성 프로모터, 에탄올-유도성 프로모터; 라피노오스-유도성 프로모터; 열-유도성 프로모터, 예컨대 열 유도성 람다 PL 프로모터, 열-민감성 억제제에 의해 제어되는 프로모터 (예컨대 CI857-억제된 람다-기초 발현 벡터, 예컨대 Hoffmann et al. (1999) FEMS Microbiol Lett . 177(2):327-34)가 있다.
효모에서는 구성성 또는 유도성 프로모터를 함유하는 많은 벡터들이 사용될 수 있다. 개관을 위해서는 문헌을 참조한다 (Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 2, 1988, Ed. Ausubel, et al., Greene Publish. Assoc. & Wiley Interscience, Ch. 13; Grant, et al., 1987, Expression and Secretion Vectors for Yeast, in Methods in Enzymology, Eds. Wu & Grossman, 31987, Acad. Press, N. Y., Vol. 153, pp.516-544; Glover, 1986, DNA Cloning, Vol. II, IRL Press, Wash., D.C., Ch. 3; and Bitter, 1987, Heterologous Gene Expression in Yeast, Methods in Enzymology, Eds. Berger & Kimmel, Acad. Press, N.Y., Vol. 152, pp. 673-684; and The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, 1982, Eds. Strathern et al., Cold Spring Harbor Press, Vols. I and II). 구성성 효모 프로모터, 예컨대 ADH 또는 LEU2 또는 유도성 프로모터, 예컨대 GAL이 사용될 수 있다 (Cloning, in Yeast, Ch. 3, R. Rothstein In: DNA Cloning Vol. 11, A Practical Approach, Ed. DM Glover, 1986, IRL Press, Wash., D.C.). 또는 달리 효모 염색체 안으로 외래 DNA 서열이 통합되는 것을 촉진하는 벡터가 사용될 수 있다.
어떤 구체예에서, 본 발명의 핵산 또는 본 발명의 벡터는 식물세포에서 발현하기 위한 프로모터 또는 다른 조절 요소(들)을 포함한다. 식물세포에서 기능적인 적당한 구성성 프로모터의 비-제한적인 실례는 콜리플라워 모자이크 바이러스 35S 프로모터, 탠덤 35S 프로모터 (Kay et al., Science 236:1299 (1987)), 콜리플라워 모자이크 바이러스 19S 프로모터, 노팔린 합성효소 유전자 프로모터 (Singer et al., Plant Mol . Biol . 14:433 (1990); An, Plant Physiol . 81:86 (1986)), 옥토핀 합성효소 유전자 프로모터, 및 유비퀴틴 프로모터이다. 식물세포에서 기능적인 적당한 유도성 프로모터로는, 그것들에 한정되는 것은 아니지만, 페닐알라닌 암모니아-리아제 유전자 프로모터, 챨콘(chalcone) 합성효소 유전자 프로모터, 발병-관련 단백질 유전자 프로모터, 구리-유도성 조절 요소 (Mett et al., Proc . Natl . Acad . Sci. USA 90:4567-4571 (1993); Furst et al. Cell 55:705-717 (1988)); 테트라사이클린 및 클로르-테트라사이클린-유도성 조절 요소 (Gatz et al. Plant J. 2:397-404 (1992); Roder et al, Mol . Gen . Genet . 243:32-38 (1994); Gatz, Meth . Cell Biol. 50:411-424 (1995)); 엑디손 유도성 조절 요소 (Christopherson et al, Proc. Natl . Acad . Sci USA 89:6314-6318 (1992); Kreutzweiser et al., Ecotoxicol. Environ . Safety 28:14-24 (1994)); 열 충격 유도성 조절 요소 (Takahashi et al., Plant Physiol . 99:383-390 (1992); Yabe et al., Plant Cell Physiol. 35:1207-1219 (1994); Ueda et al., Mol . Gen . Genet . 250:533-539 (1996)); 및 예를 들면 IPTG-유도성 발현을 부여하기 위해 구성적으로 발현된 lac 억제제와 조합하여 사용되는 lac 오페론 요소 (Wilde et al., EMBO J. 11:1251-1259 (1992); 시금치 아질산염 환원효소 유전자로부터 유도된 니트레이트-유도성 프로모터 (Back et al., Plant Mol . Biol . 17:9 (1991)); 빛-유도성 프로모터, 예컨대 RuBP 카르복실라제의 작은 하위유닛 또는 LHCP 유전자 부류와 관련된 것과 같은 프로모터 (Feinbaum et al., Mol . Gen . Genet . 226:449 (1991); Lam and Chua, Science 248:471 (1990)); 미국 특허 공보 20040038400에서 설명된 것과 같은 빛-반응성 조절 요소; 살리실산 유도성 조절 요소 (Uknes et al., Plant Cell 5:159-169 (1993); Bi et al., Plant J. 8:235-245 (1995)); 식물 호르몬-유도성 조절 요소 (Yamaguchi-Shinozaki et al., Plant Mol . Biol . 15:905 (1990); Kares et al., Plant Mol . Biol . 15:225 (1990)); 및 사람 호르몬-유도성 조절 요소, 예컨대 사람 글루코코르티코이드 반응 요소 (Schena et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 88:10421 (1991))가 있다.
식물 조직-선택성 조절 요소는 또한 본 발명의 핵산 또는 본 발명의 벡터에 포함될 수 있다. 단일 조직에서 또는 제한된 수의 조직에서 정규 장소 외에서 핵산을 발현하기 위해 사용될 수 있는 적당한 조직-선택성 조절 요소로는, 그것들에 한정되는 것은 아니지만, 크실렌-선택성 조절 요소, 트라키드(trachied)-선택성 조절 요소, 섬유-선택성 조절 요소, 트리콤(trichom)-선택성 조절 요소 (Wang et al., (2002) J. Exp . Botany 53:1891-1897), 선성 트리콤-선택성 조절 요소 등이 있다.
식물세포에 사용하기 위해 적당한 벡터는 당해 기술분야에 공지되어 있고, 그러한 벡터는 어떤 것이든지 식물 숙주세포에 본 발명의 핵산을 도입시키기 위해 사용될 수 있다. 적당한 벡터로는 예를 들면 아그로박테리움 튜메파시엔스의 Ti 플라스미드 또는 아그로박테리움 리조겐의 Ri1 플라스미드가 있다. Ti 또는 Ri1 플라스미드는 아그로박테리움에 의한 감염시 식물세포에 전달되며 식물 게놈에 안정하게 통합된다 (J. Schell, Science, 237:1176-83 (1987)). 사용하기에 또한 적당한 것은 예컨대 미국 특허 제 6,900,012호에서 설명된 것과 같은 식물 인공 염색체이다.
조성물
본 발명은 또한 본 발명의 핵산을 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 나아가 본 발명의 재조합 벡터를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명의 핵산 또는 재조합 벡터를 포함하는 조성물은 많은 구체예에서 하나 또는 그 이상의 염, 예컨대 NaCl, MgCl, KCl, MgSO4 등; 완충제, 예컨대 트리스 완충제, N-(2-히드록시에틸)피페라진-N'-(2-에탄술폰산)(HEPES), 2-(N-모르폴리노)에탄술폰산(MES), 2-(N-모르폴린)에탄술폰산 나트륨 염 (MES), 3-(N-모르폴리노)프로판술폰산 (MOPS), N-트리스[히드록시메틸]메틸-3-아미노프로판술폰산 (TAPS), 등; 가용화제; 세제, 예컨대 비-이온성 세제, 예컨대 트윈-20; 핵화제 억제제 등을 포함할 것이다. 어떤 구체예에서, 본 발명의 핵산 또는 재조합 벡터는 동결건조된다.
숙주세포
본 발명은 유전적으로 변형된 숙주 세포, 예를 들면 본 발명의 핵산 또는 재조합 벡터로 유전적으로 변형된 숙주세포를 제공한다. 많은 구체예에서, 본 발명의 유전적으로 변형된 숙주세포는 시험관 내 숙주세포이다. 다른 구체예에서, 본 발명의 유전적으로 변형된 숙주세포는 생체 내 숙주세포이다. 다른 구체예에서, 본 발명의 유전적으로 변형된 숙주세포는 다세포 유기체의 일부이다.
숙주세포는 많은 구체예에서, 단일세포 유기체이거나, 또는 단일 세포로서 배양중에 성장한다. 어떤 구체예에서, 숙주세포는 진핵세포이다. 적당한 진핵 숙주세포는, 그것들에 한정되는 것은 아니지만, 효모 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 진균 세포, 및 해조류 세포이다. 적당한 진핵 숙주세포로는, 그것들에 한정되는 것은 아니지만, 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 피치아 핀란디카(Pichia finlandica), 피치아 트레할로필라(Pichia trehalophila), 피치아 코클라마에(Pichia koclamae), 피치아 멤브라나에파시엔스(Pichia membranaefaciens), 피치아 오푼티아에(Pichia opuntiae), 피치아 써모톨러란스(Pichia thermotolerans), 피치아 살리크타리아(Pichia salictaria), 피치아 구에르쿰(Pichia guercuum), 피치아 피유페리(Pichia pijperi), 피치아 스팁티스(Pichia stiptis), 피치아 메타놀리카(Pichia methanolica), 피차아 종(Pichia sp.), 사카로마이세스 세레비시아에(Saccharomyces cerevisiae), 사카로마이세스 종(Saccharomyces sp.), 한세뉼라 폴리모르파(Hansenula polymorpha), 클루이베로마이세스 종(Kluyveromyces sp.), 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 아스페르길루스 니듈란스(Aspergillus nidulans), 아스페르길루스 니거(Aspergillus niger), 아스페르길루스 오리자에(Aspergillus oryzae), 트리코더마 레에세이(Trichoderma reesei), 크리오스포리윰 룩크노웬스(Chrysosporium lucknowense), 푸사리움 종(Fusarium sp.), 푸사리움 그라미네움(Fusarium gramineum), 푸사리움 베네나툼(Fusarium venenatum), 뉴로스포라 크라싸(Neurospora crassa), 클라미도모나스 레인하르드티이(Chlamydomonas reinhardtii), 등이 있다. 어떤 구체예에서, 숙주 세포는 식물세포 외의 진핵세포이다.
다른 구체예에서, 숙주세포는 식물세포이다. 식물세포는 단자엽식물 ("monocots") 및 쌍떡잎식물 ("dicots")의 세포를 포함한다.
다른 구체예에서, 숙주세포는 원핵세포이다. 적당한 원핵세포로는, 그것들에 한정되는 것은 아니지만, 대장균, 락토바실루스 종, 살모넬라 종, 쉬겔라 종 등의 다양한 실험실 균주 중 어느 것을 포함한다 (Carrier et al. (1992) J Immunol . 148:1176-1181; 미국 특허 6,447,784호; 및 Sizemore et al. (1995) Science 270:299-302). 본 발명에 사용될 수 있는 살모넬라 균주의 실례로는 살모넬라 타이피(S. typhi)와 살모넬라 타이피뮤리움(S. typhimurium)이 있으며, 그것들에 한정되는 것은 아니다. 적당한 쉬겔라 균주로는, 그것들에 한정되는 것은 아니지만, 쉬겔라 플렉스네리(S. flexneri), 쉬겔라 소네에이(S. sonnei), 및 쉬겔라 디센테리아에(S. disenteriae)가 있다. 전형적으로 실험실 균주는 비-병원성인 것이다. 다른 적당한 박테리아의 비-제한적인 실례로는, 그것들에 한정되는 것은 아니지만, 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 슈도모나스 푸디타(Pseudomonas pudita), 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 슈도모나스 메발로니이(Pseudomonas mevalonii), 로도박터 스파에로이데스(Rhodobacter sphaeroides), 로도박터 캡슐라투스(Rhodobacter capsulatus), 로도스피릴룸 루브룸(Rhodospirillum rubrum), 로도코쿠스 종(Rhodococcus sp.), 등이 있다. 어떤 구체예에서 숙주세포는 대장균이다.
유전적으로 변형된 본 발명의 숙주세포를 생성하기 위하여, 이소프레노이드-변형 효소를 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 본 발명의 핵산은, 그것들에 한정되는 것은 아니지만, 칼슘 포스페이트 침전, DEAE-덱스트란 중재 형질전환, 리포솜-중재된 형질전환, 등을 포함하는 수립된 기법을 사용하여 원래의 숙주세포에 안정하게 또는 일시적으로 도입된다. 안정한 형질전환을 위하여, 핵산은 일반적으로 추가로 선택가능한 마커, 예컨대 네오마이신 내성, 암피실린 내성, 테트라사이클린 내성, 클로르암페니콜 내성, 카나마이신 내성 등과 같은 잘 알려져 있는 여러 선택가능한 마커 중 하나를 포함할 것이다.
어떤 구체예에서, 본 발명의 유전적으로 변형된 숙주세포는 식물세포이다. 본 발명의 유전적으로 변형된 식물세포는 시험관 내 식물세포 배양물에서 선택된 이소프레노이드 화합물을 생성하는 데 유용하다. 식물 조직 배양에 대한 안내는 문헌에서 찾아볼 수 있다 (Plant Cell and Tissue Culture, 1994, Vasil and Thorpe Eds., Kluwer Academic Publishers; and in; Plant Cell Culture Protocols (Methods in Molecular Biology 111), 1999, Hall Eds, Humana Press).
유전적으로 변형된 숙주세포
어떤 구체예에서, 본 발명의 유전적으로 변형된 숙주세포는 본 발명의 발현 벡터를 포함하는데, 이때 본 발명의 발현 벡터는 이소프레노이드-변형 효소를 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 어떤 구체예에서, 본 발명의 유전적으로 변형된 숙주세포는 본 발명의 발현 벡터를 포함하는데, 이때 본 발명의 발현 벡터는 테르펜 수산화효소 및/또는 테르펜 산화효소 활성을 나타내는 폴리펩티드를 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
어떤 구체예에서, 본 발명의 유전적으로 변형된 숙주세포는 첫 번째 본 발명의 발현 벡터를 포함하는데, 이때 첫 번째 본 발명의 발현 벡터는 테르펜 수산화효소 및/또는 테르펜 산화효소 활성을 나타내는 폴리펩티드를 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 본 발명의 핵산을 포함하고; 추가로 두 번째 본 발명의 발현 벡터를 포함하는데, 이 두 번째 본 발명의 발현 벡터는 CPR을 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 본 발명의 핵산을 포함한다. 다른 구체예에서, 본 발명의 유전적으로 변형된 숙주세포는 본 발명의 발현 벡터를 포함하는데, 이때 본 발명의 발현 벡터는 이소프레노이드-변형 효소를 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 본 발명의 핵산과 CPR을 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 본 발명의 핵산을 포함한다. 다른 구체예에서, 본 발명의 유전적으로 변형된 숙주세포는 본 발명의 발현 벡터를 포함하는데, 이때 본 발명의 발현 벡터는 융합 폴리펩티드 (예컨대 이소프레노이드-변형 효소와 CPR을 포함하는 폴리펩티드)를 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 본 발명의 핵산을 포함한다.
적당한 CPR-코드화 핵산은 식물에서 발견되는 CPR을 코드화하는 핵산을 포함한다. 적당한 CPR-코드화 핵산은 진균에서 발견되는 CPR을 코드화하는 핵산을 포함한다. 적당한 CPR-코드화 핵산의 실례로는 다음과 같은 것들이 있다: GenBank 승인번호 AJ303373 (Triticum aestivum CPR); GenBank 승인번호 AY959320 (Taxus chinensis CPR); GenBank 승인번호 AY532374 (Ammi majus CPR); GenBank 승인번호 AG211221 (Oryza sativa CPR); 및 GenBank 승인번호 AF024635 (Petroselinum crispum CPR).
어떤 구체예에서, 본 발명의 유전적으로 변형된 숙주세포는 메발로네이트 경로를 통하여 정상적으로 이소펜테닐 피로포스페이트 (IPP) 또는 메발로네이트를 합성하지 못하는 숙주세포이다. 메발로네이트 경로는 (a) 2분자의 아세틸-CoA를 아세토아세틸-CoA로 축합하는 단계; (b) 아세토아세틸-CoA를 아세틸-CoA로 축합하여 HMG-CoA를 형성하는 단계; (c) HMG-CoA를 메발로네이트로 전환하는 단계; (d) 메발로네이트를 메발로네이트 5-포스페이트로 인산화하는 단계; (e) 메발로네이트 5-포스페이트를 메발로네이트 5-피로포스페이트로 전환하는 단계; 그리고 (f) 메발로네이트 5-피로포스페이트를 이소펜테닐 피로포스페이트로 전환하는 단계를 포함한다. IPP의 생성에 필요한 메발로네이트 경로 효소들은 배양 조건에 따라 달라진다.
상기에서 주지된 바와 같이, 어떤 구체예에서, 본 발명의 유전적으로 변형된 숙주세포는 메발로네이트 경로를 통하여 정상적으로 이소펜테닐 피로포스페이트 (IPP) 또는 메발로네이트를 합성하지 못하는 세포이다. 이들 구체예 중 어떤 것에서, 숙주세포는 이소프레노이드-변형 효소를 코드화하는 본 발명의 핵산을 포함하는 본 발명의 발현 벡터로 유전적으로 변형되고; 숙주세포는 아세토아세틸-CoA 티올라제, 히드록시메틸글루타릴-CoA 합성효소 (HMGS), 히드록시메틸글루타릴-CoA 환원효소 (HMGR), 메발로네이트 키나제 (MK), 포스포메발로네이트 키나제 (PMK), 및 메발로네이트 피로포스페이트 데카르복실라제 (MPD) (및 임의로 또한 IPP 이소메라제)를 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 하나 또는 그 이상의 이종성 핵산으로 유전적으로 변형된다. 이들 많은 구체예에서 숙주세포는 CPR을 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터로 유전적으로 변형된다. 이들 구체예 중 어떤 것에서, 숙주세포는 이소프레노이드-변형 효소를 코드화하는 본 발명의 핵산을 포함하는 본 발명의 발현 벡터로 유전적으로 변형되고; 숙주세포는 MK, PMK, MPD (및 임의로 IPP 이소메라제)를 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 하나 또는 그 이상의 이종성 핵산으로 유전적으로 변형된다. 이들 많은 구체예에서, 숙주세포는 CPR을 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터로 유전적으로 변형된다.
어떤 구체예에서, 본 발명의 유전적으로 변형된 숙주세포는 메발로네이트 경로를 통하여 IPP 또는 메발로네이트를 정상적으로 합성하지 못하는 숙주세포이고; 숙주세포는 이소프레노이드-변형 효소를 코드화하는 본 발명의 핵산을 포함하는 본 발명의 발현 벡터로 유전적으로 변형되며; 숙주세포는 아세토아세틸-CoA 티올라제, HMGS, HMGR, MK, PMK, MPD, IPP 이소메라제, 및 프레닐 트란스페라제를 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 하나 또는 그 이상의 이종성 핵산으로 유전적으로 변형된다. 이들 많은 구체예에서, 숙주세포는 CPR을 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터로 유전적으로 변형된다. 어떤 구체예에서, 본 발명의 유전적으로 변형된 숙주세포는 메발로네이트 경로를 통하여 IPP 또는 메발로네이트를 정상적으로 합성하지 못하는 숙주세포이고; 숙주세포는 이소프레노이드-변형 효소를 코드화하는 본 발명의 핵산을 포함하는 본 발명의 발현 벡터로 유전적으로 변형되며; 숙주세포는 MK, PMK, MPD, IPP 이소메라제, 및 프레닐 트란스페라제를 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 하나 또는 그 이상의 이종성 핵산으로 유전적으로 변형된다. 이들 많은 구체예에서, 숙주세포는 CPR을 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터로 유전적으로 변형된다.
어떤 구체예에서, 본 발명의 유전적으로 변형된 숙주세포는 메발로네이트 경로를 통하여 IPP 또는 메발로네이트를 정상적으로 합성하는 것이다. 예컨대 숙주세포는 내인성 메발로네이트 경로를 포함하는 것이다. 이들 구체예 중 어떤 것에서, 숙주세포는 효모세포이다. 이들 구체예 중 어떤 것에서 숙주세포는 사카로마이세스 세레비시아에이다.
어떤 구체예에서, 본 발명의 유전적으로 변형된 숙주세포는 데히드로게나제 또는 데히드로게나제들을 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 하나 또는 그 이상의 핵산으로 추가로 유전적으로 변형되며, 이때 데히드로게나제는 추가로 이소프레노이드 화합물을 변형한다. 코드화된 데히드로게나제는 원핵세포 또는 진핵세포에서 자연적으로 발견되는 것일 수 있으며, 또는 그러한 데히드로게나제의 변이체일 수 있다. 어떤 구체예에서, 본 발명은 그러한 데히드로게나제를 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리된 핵산을 제공한다.
메발로네이트 경로 핵산
MEV 경로 유전자 생성물을 코드화하는 뉴클레오티드 서열은 당해 기술분야에 공지되어 있으며, 어떠한 공지된 MEV 경로 유전자 생성물-코드화 뉴클레오티드 서열이든지 본 발명의 유전적으로 변형된 숙주세포를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어 아세토아세틸-CoA 티올라제, HMGS, HMGR, MK, PMK, MPD, 및 IDI를 코드화하는 뉴클레오티드 서열은 당해 기술분야에 공지되어 있다. 다음은 MEV 경로 유전자 생성물을 코드화하는 공지된 뉴클레오티드 서열의 비-제한적인 실례이며, 각 MEV 경로 효소 뒤에 GenBank 승인번호와 유기체를 괄호 안에 표시한다: 아세토아세틸-CoA 티올라제: (NC_000913 REGION: 2324131..2325315; 대장균), (D49362; 파라코쿠스 데니트리피칸스), 및 (L20428; 사카로마이세스 세레비시아에); HMGS: (NC_001145. 상보물 19061..20536; 사카로마이세스 세레비시아에), (X96617; 사카로마이세스 세레비시아에), (X83882; 아라비돕시스 탈리아나), (AB037907; 키타사토스포라 그리세올라) 및 (BT007302; 호모 사피엔스); HMGR: (NM_206548; 드로조필라 멜라노가스터), (NM_204485; 갈루스 갈루스), (AB015627; 스트렙토마이세스 종 KO-3988), (AF542543; 니코티아나 아테뉴아타), (AB037907; 키타사토스포라 그리세올라), (AX128213, 절단된 HMGR을 코드화하는 서열을 제공함; 사카로마이세스 세레비시아에), 및 (NC_001145: 상보물 (115734..118898; 사카로마이세스 세레비시아에)); MK: (L77688; 아라비돕시스 탈리아나), 및 (X55875; 사카로마이세스 세레비시아에); PMK: (AF429385; 헤베아 브라실리엔시스), (NMJ)06556; 호모 사피엔스), (NC_001145. 상보물 712315..713670; 사카로마이세스 세레비시아에); MPD: (X97557; 사카로마이세스 세레비시아에), (AF290095; 엔테로코쿠스 파에시움), 및 (U49260; 호모 사피엔스); 및 IDI: (NC_000913, 3031087..3031635; 대장균), 및 (AF082326; 헤마토코쿠스 플루비알리스).
어떤 구체예에서, HMGR 코딩 영역은 야생형 HMGR의 경막 도메인이 결핍된 HMGR의 절단된 형태 ("tHMGR")를 코드화한다. HMGR의 경막 도메인은 효소의 조절 부분을 함유하고 촉매적 활성을 갖지 않는다.
어떠한 공지된 MEV 경로 효소의 코딩 서열은 코드화된 효소의 아미노산 서열의 표적화된 변화를 생성하기 위해 당해 기술분야에 공지되어 있는 다양한 방법으로 변경될 수 있다. 변이체 MEV 경로 효소의 아미노산은 통상적으로 실질적으로 어떠한 공지된 MEV 경로 효소의 아미노산 서열과 유사할 것이다, 즉 최소한 하나의 아미노산이 다를 것이고, 최소한 2, 최소한 5, 최소한 10, 또는 최소한 20 아미노산만큼, 그러나 전형적으로 약 50 아미노산보다 적게 다를 수 있다. 서열 변화는 치환, 삽입 또는 결실일 수 있다. 예를 들어 아래에서 설명되는 것과 같이, 뉴클레오티드 서열은 특정한 숙주세포의 코돈 편향에 대하여 변경될 수 있다. 또한 코드화된 단백질의 보존성 아미노산 변화를 초래하는 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드 서열 차이가 도입될 수 있다.
프레닐 트랜스페라제
어떤 구체예에서, 본 발명의 유전적으로 변형된 숙주세포는 이소프레노이드-변형 효소를 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 포함하도록 유전적으로 변형되고; 어떤 구체예에서는 또한 상술된 것과 같이 하나 또는 그 이상의 메발로네이트 효소를 코드화하는 뉴클레오티드 서열(들)을 포함하는 하나 또는 그 이상의 핵산; 및 프레닐 트랜스페라제를 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 포함하도록 유전적으로 변형된다.
프레닐 트랜스페라제는 다양한 사슬 길이의 프레닐 디포스페이트의 형성을 초래하는 IPP의 연속적인 축합을 촉매하는 효소의 광범위한 그룹을 구성한다. 적당한 프레닐 트랜스페라제는 IPP와 알릴계 프라이머 기질의 축합을 촉매하여 약 12 이소프렌 유닛 내지 약 6000 또는 그 이상의 이소프렌 유닛을 가지는 이소프레노이드 화합물을 형성하는 효소들을 포함한다. 예를 들면 2 이소프렌 유닛 (제라닐 피로포스페이트 합성효소), 3 이소프렌 유닛 (파르네실 피로포스페이트 합성효소), 4 이소프렌 유닛 (제라닐제라닐 피로포스페이트 합성효소), 5 이소프렌 유닛, 6 이소프렌 유닛 (헥사데실피로포스페이트 합성효소), 7 이소프렌 유닛, 8 이소프렌 유닛 (피토엔 합성효소, 옥타프레닐 피로포스페이트 합성효소), 9 이소프렌 유닛 (노나프레닐 피로포스페이트 합성효소), 10 이소프렌 유닛 (데카프레닐 피로포스페이트 합성효소), 약 10 이소프렌 유닛 내지 약 15 이소프렌 유닛, 약 15 이소프렌 유닛 내지 약 20 이소프렌 유닛, 약 20 이소프렌 유닛 내지 약 25 이소프렌 유닛, 약 25 이소프렌 유닛 내지 약 30 이소프렌 유닛, 약 30 이소프렌 유닛 내지 약 40 이소프렌 유닛, 약 40 이소프렌 유닛 내지 약 50 이소프렌 유닛, 약 50 이소프렌 유닛 내지 약 100 이소프렌 유닛, 약 100 이소프렌 유닛 내지 약 250 이소프렌 유닛, 약 250 이소프렌 유닛 내지 약 500 이소프렌 유닛, 약 500 이소프렌 유닛 내지 약 1000 이소프렌 유닛, 약 1000 이소프렌 유닛 내지 약 2000 이소프렌 유닛, 약 2000 이소프렌 유닛 내지 약 3000 이소프렌 유닛, 약 3000 이소프렌 유닛 내지 약 4000 이소프렌 유닛, 약 4000 이소프렌 유닛 내지 약 5000 이소프렌 유닛, 또는 약 5000 이소프렌 유닛 내지 약 6000 또는 그 이상의 이소프렌 유닛을 가지는 이소프레노이드 화합물들.
적당한 프레닐 트랜스페라제로는, 그것들에 한정되는 것은 아니지만, E-이소프레닐 디포스페이트 합성효소, 이를테면, 그것들에 한정되지는 않지만, 제라닐 디포스페이트(GPP) 합성효소, 파르네실 디포스페이트(FPP) 합성효소, 제라닐제라닐 디포스페이트(GGPP) 합성효소, 헥사프레닐 디포스페이트(HexPP) 합성효소, 헵타프레닐 디포스페이트(HepPP) 합성효소, 옥타프레닐 디포스페이트(OPP) 합성효소, 솔라네실 디포스페이트(SPP) 합성효소, 데카프레닐 디포스페이트(DPP) 합성효소, 치클 합성효소, 및 구타-페르샤 합성효소; 및 Z-이소프레닐 디포스페이트 합성효소, 이를테면 그것에 한정되지는 않지만, 노나프레닐 디포스페이트(NPP) 합성효소, 운데카프레닐 디포스페이트(UPP) 합성효소, 데히드로돌리실 디포스페이트 합성효소, 에이코사프레닐 디포스페이트 합성효소, 천연 고무 합성효소, 및 다른 Z-이소프레닐 디포스페이트 합성효소가 있다.
다양한 종으로부터의 수많은 프레닐 트랜스페라제의 뉴클레오티드 서열이 공지되어 있고, 본 발명의 유전적으로 변형된 숙주세포를 생성하는 데 사용되거나 사용하기 위해 변형될 수 있다. 프레닐 트랜스페라제를 코드화하는 뉴클레오티드 서열은 당해 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어 사람 파르네실 피로포스페이트 합성효소 mRNA (GenBank 승인번호 J05262; 호모 사피엔스); 파르네실 디포스페이트 합성효소 (FPP) 유전자 (GenBank 승인번호 J05091; 사카로마이세스 세레비시아에); 이소펜테닐 디포스페이트:디메틸알릴 디포스페이트 이소메라제 유전자 (J05090; 사카로마이세스 세레비시아에); Wang and Ohnuma (2000) Biochem . Biophys . Acta 1529:33-48; 미국 특허 6,645,747호; 아라비돕시스 탈리아나 파르네실 피로포스페이트 합성효소 2 (FPS2)/FPP 합성효소 2/파르네실 디포스페이트 합성효소 2 (At4g17190) mRNA (GenBank 승인번호 NM_202836); 징코 빌로바 제라닐제라닐 디포스페이트 합성효소 (ggpps) mRNA (GenBank 승인번호 AY371321); 아라비돕시스 탈리아나 제라닐제라닐 피로포스페이트 합성효소 (GGPS1)/GGPP 합성효소/파르네실 트랜스페라제 (At4g36810) mRNA (GenBank 승인번호 NM_119845); 파르네실, 제라닐제라닐, 제라닐파르네실, 헥사프레닐, 헵타프레닐 디포스페이트 합성효소 (SelF-HepPS)에 대한 시네코코쿠스 엘롱가투스 유전자 (GenBank 승인번호 AB016095) 등이 있다.
테르펜 합성효소
어떤 구체예에서, 본 발명의 유전적으로 변형된 숙주세포는 테르펜 합성효소를 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 포함하도록 유전적으로 변형된다. 어떤 구체예에서, 테르펜 합성효소는 세스퀴테르펜을 생성하기 위하여 FPP를 변형하는 것이다. 다른 구체예에서, 테르펜 합성효소는 모노테르펜을 생성하기 위하여 GPP를 변형하는 것이다. 다른 구체예에서, 테르펜 합성효소는 디테르펜을 생성하기 위하여 GGPP를 변형하는 것이다.
테르펜 합성효소를 코드화하는 뉴클레오티드 서열은 당해 기술분야에 공지되어 있으며, 어떠한 공지된 테르펜 합성효소-코드화 뉴클레오티드 서열이든지 숙주세포를 유전적으로 변형시키기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어 다음의 테르펜 합성효소-코드화 뉴클레오티드 서열이 공지되어 있고, 사용될 수 있는데, 서열 뒤에 그것들의 GenBank 승인번호와 그것들이 확인된 유기체가 표시되어 있다: (-)-게르마크렌 D 합성효소 mRNA (AY438099; 포퓰루스 발사미페라 하위종 trichocarpa X Populus deltoids); E,E-알파-파르네센 합성효소 mRNA (AY640154; Cucumis sativus); 1,8-시네올 합성효소 mRNA (AY691947;Arabidopsis thaliana); 테르펜 합성효소 5 (TPS5) mRNA (AY518314; Zea mays); 테르펜 합성효소 4 (TPS4) mRNA (AY518312; Zea mays); 미르센/오시멘 합성효소 (TPSlO) (At2g24210) mRNA (NM_127982; Arabidopsis thaliana); 제라니올 합성효소 (GES) mRNA (AY362553; Ocimum basilicum); 피넨 합성효소 mRNA (AY237645; Picea sitchensis); 미르센 합성효소 le20 mRNA (AY195609; Antirrhinum majus); (E)-β-오시멘 합성효소 (0e23) mRNA (AY195607; Antirrhinum majus); E-β 오시멘 합성효소 mRNA (AYl 51086; Antirrhinum majus); 테르펜 합성효소 mRNA (AF497492; Arabidopsis thaliana); (-)-캄펜 합성효소 (AG6.5) mRNA (U87910; Abies grandis); (-)-4S-리모넨 합성효소 유전자 (예컨대 게놈 서열) (AF326518; Abies grandis); 델타-셀리넨 합성효소 유전자 (AF326513; Abies grandis); 아모르파-4,ll-디엔 합성효소 mRNA (AJ 251751; Artemista annua); E-α-비사볼렌 합성효소 mRNA (AF006195; Abies grandis); 감마-휴물렌 합성효소 mRNA (U92267; Abies grandis); 델타-셀리넨 합성효소 mRNA (U92266; Abies grandis); 피넨 합성효소 (AG3.18) mRNA (U87909; Abies grandis); 미르센 합성효소 (AG2.2) mRNA (U87908; Abies grandis); 등.
코돈 용도
어떤 구체예에서, 본 발명의 유전적으로 변형된 숙주세포를 생성하기 위해 사용된 뉴클레오티드 서열은 뉴클레오티드 서열이 특정한 숙주세포에 대한 코돈 선호성을 반영하도록 변형된다. 예를 들어 뉴클레오티드 서열은 어떤 구체예에서는 효모 코돈 선호성에 대해 변형될 것이다 (Bennetzen and Hall (1982) J. Biol . Chem. 257(6): 3026-3031). 다른 비-제한적인 실례로서, 뉴클레오티드 서열은 다른 구체예에서는 대장균 코돈 선호성에 대해 변형될 것이다 (Gouy and Gautier (1982) Nucleic Acids Res . 10(22):7055-7074; Eyre-Walker (1996) Mol . Biol . Evol . 13(6):864-872. 또한 Nakamura et al. (2000) Nucleic Acids Res. 28(1):292).
추가의 유전자 변형
어떤 구체예에서, 본 발명의 유전적으로 변형된 숙주세포는 이소프레노이드-변형 효소를 코드화하는 뉴클레오티드 서열(들)을 포함하는 하나 또는 그 이상의 핵산을 포함하기 위해 유전적으로 변형되고; 나아가 테르펜 생합성 경로 중간체의 증대된 생성을 이루기 위하여 유전적으로 변형되며, 및/또는 추가로 내인성 테르펜 생합성 경로 유전자가 기능적으로 무능력해지도록 유전적으로 변형된 것이다. 내인성 테르펜 생합성 경로 유전자의 맥락에서 본원에서 사용되는 용어 "기능적으로 무능해진"은 테르펜 생합성 경로 유전자의 유전적 변형을 나타내고, 그 변형은 정상 수준 아래에서 생성되는, 및/또는 기능하지 못하는 유전자에 의해 코드화된 유전자 생성물의 생성을 초래한다.
내인성 테르펜 생합성 경로 중간체의 생성을 증진시키는 유전적 변형으로는, 그것들에 한정되는 것은 아니지만, 숙주세포에서 포스포트랜스아세틸라제의 감소된 수준 및/또는 활성을 초래하는 유전적 변형을 포함한다. 테르펜 생합성 경로 중간체의 세포내 농도는 아세틸-CoA의 세포내 농도를 증가시킴으로써 증진된다. 대장균은 세포내 아세틸-CoA의 상당한 분획을 아세테이트의 형태로 배지로 분비한다. 아세틸-CoA를 아세테이트로 전환시키는 데 기여하는 첫 번째 효소인 포스포트랜스아세틸라제, pta를 코드화하는 유전자를 결실시키면 아세테이트 분비가 감소된다. 원핵 숙주세포에서 포스포트랜스아세틸라제의 수준 및/또는 활성을 감소시키는 유전자 변형은, 특히 유전적으로 변형된 숙주세포가 하나 또는 그 이상의 MEV 경로 유전자 생성물을 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산으로 유전적으로 변형된 것인 경우에 유용하다.
어떤 구체예에서, 원핵 숙주세포에서 포스포트랜스아세틸라제의 감소된 수준을 초래하는 유전자 변형은 포스포트랜스아세틸라제를 코드화하는 원핵 숙주세포의 내인성 pta 유전자를 기능적으로 무능하게 하는 유전자 변형이다. pta 유전자는 다양한 방법 중 어느 하나, 이를테면 이동성 유전자 요소 (예컨대 트랜스포존 등)의 삽입; 유전자 생성물이 생성되지 못하게 하거나 절단되어 아세틸-CoA가 아세테이트로 전환되는 데 비-기능적이 되도록 하는 유전자 전부 또는 일부의 결실; 유전자 생성물이 생성되지 않거나 절단되어 아세틸-CoA가 아세테이트로 전환되는 데 비-기능적이 되도록 하는 유전자의 돌연변이; 유전자 생성물이 생성되지 못하도록 pta 유전자의 발현을 제어하는 하나 또는 그 이상의 제어 요소의 결실 또는 돌연변이 등의 방법으로 기능적으로 무능해질 수 있다.
어떤 구체예에서, 유전적으로 변형된 숙주세포의 내인성 pta 유전자는 결실된다. 유전자를 결실시키기 위한 모든 방법이 사용될 수 있다. pta 유전자를 결실시키는 방법 중 한 가지 비-제한적인 실례는 λRed 재조합 시스템을 사용하는 것이다 (Datsenko and Wanner (2000) Proc Natl Acad Sci USA 97(12): p. 6640-5). pta 유전자는 어떤 구체예에서 MK, PMK, MPD, 및 IDI를 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산으로 유전자 변형된 숙주세포 (예컨대 대장균)로부터 결실될 것이다. pta 유전자는 어떤 구체예에서 MK, PMK, MPD, 및 IPP를 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산으로 유전자 변형된 숙주세포 (예컨대 대장균)로부터 결실될 것이다. pta 유전자는 어떤 구체예에서 MK, PMK, MPD, IPP, 및 프레닐 트랜스페라제를 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산으로 유전자 변형된 숙주세포 (예컨대 대장균)로부터 결실될 것이다.
어떤 구체예에서, 본 발명의 유전적으로 변형된 숙주세포는 MEV 생합성 경로 유전자 생성물(들)을 코드화하는 뉴클레오티드 서열(들)을 포함하는 하나 또는 그 이상의 핵산을 포함하기 위해 유전적으로 변형되고; 추가로 내인성 DXP 생합성 경로 유전자가 기능적으로 무능해지도록 유전적으로 변형된 것이다. 다른 구체예에서, 본 발명의 유전적으로 변형된 숙주세포는 DXP 생합성 경로 유전자 생성물(들)을 코드화하는 뉴클레오티드 서열(들)을 포함하는 하나 또는 그 이상의 핵산을 포함하기 위해 유전적으로 변형되고; 추가로 내인성 MEV 생합성 경로 유전자가 기능적으로 무능해지도록 유전적으로 변형된 것이다.
어떤 구체예에서, 본 발명의 유전적으로 변형된 숙주세포가 하나 또는 그 이상의 MEV 경로 유전자 생성물을 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산(들)로 유전자 변형된 원핵 숙주세포인 경우에, 숙주세포는 추가로 하나 또는 그 이상의 내인성 DXP 경로 유전자가 기능적으로 무능해지도록 유전적으로 변형될 것이다. 기능적으로 무능해질 수 있는 DXP 경로 유전자는 다음의 DXP 유전자 생성물 중 어느 것을 코드화하는 유전자를 하나 또는 그 이상 포함한다: 1-데옥시-D-크실룰로오스-5-포스페이트 합성효소, 1-데옥시-D-크실룰로오스-5-포스페이트 환원성 이소메라제, 4-디포스포시티딜-2-C-메틸-D-에리트리톨 합성효소, 4-디포스포시티딜-2-C-메틸-D-에리트리톨 키나제, 2C-메틸-D-에리트리톨 2,4-시클로디포스페이트 합성효소, 및 1-히드록시-2-메틸-2-(E)-부테닐 4-디포스페이트 합성효소.
내인성 DXP 경로 유전자는 다양한 방법, 이를테면 이동성 유전자 요소 (예컨대 트랜스포존 등)의 삽입; 유전자 생성물이 생성되지 못하게 하거나 절단되어 아세틸-CoA가 아세테이트로 전환되는 데 비-기능적이 되도록 하는 유전자 전부 또는 일부의 결실; 유전자 생성물이 생성되지 않거나 절단되어 아세틸-CoA가 아세테이트로 전환되는 데 비-기능적이 되도록 하는 유전자의 돌연변이; 유전자 생성물이 생성되지 못하도록 pta 유전자의 발현을 제어하는 하나 또는 그 이상의 제어 요소의 결실 또는 돌연변이 등의 방법 중 하나로 기능적으로 무능해질 수 있다.
다른 구체예에서, 본 발명의 유전적으로 변형된 숙주세포가 하나 또는 그 이상의 DXP 경로 유전자 생성물을 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산(들)로 유전자 변형된 원핵 숙주세포인 경우에, 숙주세포는 추가로 하나 또는 그 이상의 내인성 MEV 경로 유전자가 기능적으로 무능해지도록 유전적으로 변형될 것이다. 기능적으로 무능해질 수 있는 MEV 경로 유전자는 다음의 MEV 유전자 생성물 중 어느 것을 코드화하는 유전자를 하나 또는 그 이상 포함한다: HMGS, HMGR, MK, PMK, MPD, 및 IDI. 내인성 MEV 경로 유전자는 다양한 방법, 이를테면 이동성 유전자 요소 (예컨대 트랜스포존 등)의 삽입; 유전자 생성물이 생성되지 못하게 하거나 절단되어 아세틸-CoA가 아세테이트로 전환되는 데 비-기능적이 되도록 하는 유전자 전부 또는 일부의 결실; 유전자 생성물이 생성되지 않거나 절단되어 아세틸-CoA가 아세테이트로 전환되는 데 비-기능적이 되도록 하는 유전자의 돌연변이; 유전자 생성물이 생성되지 못하도록 pta 유전자의 발현을 제어하는 하나 또는 그 이상의 제어 요소의 결실 또는 돌연변이 등의 방법 중 하나로 기능적으로 무능해질 수 있다.
본 발명의 유전적으로 변형된 숙주세포를 포함하는 조성물
본 발명은 추가로 본 발명의 유전적으로 변형된 숙주세포를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물은 본 발명의 유전적으로 변형된 숙주세포를 포함하며, 어떤 구체예에서는 부분적으로는 유전적으로 변형된 숙주세포의 의도된 사용을 토대로 하여 선택된 하나 또는 그 이상의 추가의 성분을 포함할 것이다. 적당한 성분으로는, 그것들에 한정되는 것은 아니지만, 염; 완충제; 안정화제; 프로테아제-억제제; 뉴클레아제-억제제; 세포막- 및/또는 세포벽-보존 화합물, 예컨대 글리세롤, 디메틸술폭시드 등; 세포에 적절한 영양 배지; 등을 포함한다. 어떤 구체예에서, 세포는 동결건조된다.
유전자도입 식물
어떤 구체예에서, 본 발명의 핵산 또는 본 발명의 발현 벡터 (예컨대 본 발명의 이소프레노이드-변형 효소 핵산 또는 본 발명의 이소프레노이드-변형 효소 핵산을 포함하는 발현 벡터)는 코드화된 이소프레노이드-변형 효소를 생성하는 유전자도입 식물을 생성하기 위해 트랜스유전자로서 사용된다. 그러므로 본 발명은 상술된 것과 같이 테르펜 수산화효소 및/또는 테르펜 산화효소 활성을 나타내는 효소를 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 본 발명의 핵산을 포함하는 트랜스유전자를 포함하는 유전자도입 식물을 추가로 제공한다. 어떤 구체예에서, 유전자도입 식물의 게놈은 본 발명의 핵산을 포함한다. 어떤 구체예에서, 유전자도입 식물은 유전자 변형에 대하여 동종성 접합체이다. 어떤 구체예에서, 유전자도입 식물은 유전자 변형에 대하여 이종성 접합체이다.
어떤 구체예에서, 본 발명의 유전자도입 식물은 테르펜 수산화효소 및/또는 산화효소 활성을 나타내는 트랜스유전자-코드화된 폴리펩티드를, 대조 식물, 예컨대 동일한 종의 비-유전자도입 식물 (폴리펩티드를 코드화하는 트랜스유전자를 포함하지 않는 식물)에 의해 생성된 폴리펩티드의 양보다 최소한 약 50%, 최소한 약 2배, 최소한 약 5배, 최소한 약 10배, 최소한 약 25배, 최소한 약 50배, 최소한 약 100배, 또는 그 이상의 양으로 생성한다.
어떤 구체예에서, 본 발명의 유전자도입 식물은 테르펜 수산화효소 및/또는 산화효소 활성을 나타내는 트랜스유전자-코드화된 폴리펩티드에 의해 생성되는, 또는 그것의 하류 생성물인 이소프레노이드 화합물을 정상적으로 생성하는 대조, 비비-유전자도입 식물의 유전자도입 버전이며; 이때에 유전자도입 식물은 테르펜 수산화효소 및/또는 산화효소 활성을 나타내는 트랜스유전자-코드화된 폴리펩티드를, 대조 식물, 예컨대 동일한 종의 비-유전자도입 식물 (폴리펩티드를 코드화하는 트랜스유전자를 포함하지 않는 식물)에 의해 생성된 폴리펩티드의 양보다 최소한 약 50%, 최소한 약 2배, 최소한 약 5배, 최소한 약 10배, 최소한 약 25배, 최소한 약 50배, 최소한 약 100배, 또는 그 이상의 양으로 생성한다.
외재성 핵산을 식물세포 안으로 도입시키는 방법은 당해 기술분야에 잘 알려져 있다. 그러한 식물세포는 상기에서 정의한 바와 같이 "형질전환된" 것으로 간주된다. 적당한 방법으로는 바이러스 감염 (예컨대 이중 가닥의 DNA 바이러스), 형질전환, 포합, 원형질체 융합, 일렉트로포레이션, 입자 총 기법, 칼슘 포스페이트 침전, 직접 마이크로주사, 탄화 규소 휘스커스 기법, 아그로박테리움-중재된 형질전환 등이 있다. 방법의 선택은 일반적으로 형질전환될 세포의 유형 및 형질전환이 일어나는 상황 (즉 시험관 내, 생체 외, 또는 생체 내)에 따라 좌우된다.
토양 박테리아인 아그로박테리움 튜메파시엔스를 토대로 한 형질전환 방법이 특히 외재성 핵산 분자를 도관 식물에 도입시키는 데 유용하다. 아그로박테리움의 야생형 형태는 숙주 식물에서 종양 형성 크라운 골 성장의 생성을 지시히는 Ti (종양-유도) 플라스미드를 함유한다. Ti 플라스미드의 종양-유도 T-DNA 영역을 식물 게놈에 전달하는 것은 T-DNA 경계뿐만 아니라 Ti 플라스미드-코드화된 병독성 유전자를 필요로 하며, 그것들은 전달될 영역을 설명하는 직접적인 DNA 반복 세트이다. 아그로박테리움-기초 벡터는 Ti 플라스미드의 변형된 형태이고, 그 안에서 종양 유도 기능은 식물숙주에 도입될 관심의 핵산 서열에 의해 교체된다.
아그로박테리움-중재된 형질전환은 일반적으로 공통합 벡터, 또는 바람직하게는 이원 벡터 시스템을 사용하고, 그 안에서 Ti 플라스미드의 성분들은 아그로박테리움 숙주에 영구적으로 존재하고 병독성 유전자를 운반하는 헬퍼 벡터와, T-DNA 서열에 의해 결합된 관심의 유전자를 함유하는 셔틀 벡터 사이에 나누어진다. 다양한 이원 벡터는 당해 기술분야에 잘 알려져 있고, 상업적으로, 예를 들면 Clontech사 (Palo Alto, Calif.)로부터 활용할 수 있다. 아그로박테리움을 배양된 식물 세포 또는 상처입은 조직, 예컨대 잎 조직, 뿌리 외식편, 하이포코틸레돈(hypocotyledon), 줄기 단편 또는 덩이줄기와 함께 배양하는 방법들도 당해 기술분야에 잘 알려져 있다 (Glick and Thompson, (eds.), Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Boca Raton, FIa.: CRC Press (1993)).
아그로박테리움-중재된 형질전환은 최소한 하나의 유칼립투스 종 및 콩류 목초사료용 작물, 예컨대 알팔파 (자주개자리); 버드풋 트레포일(birdsfoot trefoil), 화이트 클로버(white clover), 스타일로산스(Stylosanthes), 로토노니스 바이네시이(Lotononis bainessii) 및 세인포인(sainfoin)을 포함하여 다양한 유전자도입 도관 식물을 생성하는 데 유용하다 (Wang et al., 상기동일, 1995).
마이크로발사체-중재된 형질전환 또한 본 발명의 유전자도입 식물을 생성하기 위해 사용될 수 있다. 이 방법은 클라인 등에 의해 처음 설명되었는데 (Klein et al., Nature 327:70-73 (1987)), 염화 칼슘, 스퍼미딘 또는 폴리에틸렌 글리콜로 침전시킴으로써 원하는 핵산 분자로 코팅되는 금이나 텅스텐과 같은 마이크로발사체에 의존한다. 마이크로발사체 입자는 BIOLISTIC PD-1000 (Biorad; Hercules Calif.)과 같은 장치를 사용하여 속씨식물의 조직 안으로 고속으로 가속화되어 들어간다.
본 발명의 핵산은 핵산이 식물세포(들) 안으로 예를 들어 생체 내 또는 생체 외 프로토콜을 통하여 들어갈 수 있는 방식으로 식물에 도입될 수 있다. "생체 내"라는 것은 핵산이 살아있는 식물체에 투여되는 것을 말하는 것으로, 예컨대 침투이다. "생체 외"라는 것은 세포 또는 외식편이 식물 밖에서 변형된 후, 그러한 세포 또는 기관이 식물로 재생되는 것을 말한다. 식물세포의 안정한 형질전환 또는 유전자도입 식물의 수립에 적당한 많은 벡터들이 문헌에 설명되어 있다 (Weissbach and Weissbach, (1989) Methods for Plant Molecular Biology Academic Press, and Gelvin et al., (1990) Plant Molecular Biology Manual, Kluwer Academic Publishers). 구체적인 실례로는 아그로박테리움 튜메파시엔스의 Ti 플라스미드로부터 유도된 것들과, 문헌에 소개되어 있는 것들이 있다 (Herrera-Estrella et al. (1983) Nature 303: 209, Bevan (1984) Nucl Acid Res. 12:8711-8721, Klee (1985) Bio/Technolo 3: 637-642).또는 달리 비-Ti 벡터도 유리 DNA 전달 기법을 사용함으로써 DNA를 식물과 세포 안에 전달하기 위해 사용될 수 있다. 이들 방법을 사용함에 의해 유전자도입 식물, 예컨대, 밀, 쌀 (Christou (1991) Bio/Technology 9:957-962) 및 옥수수 (Gordon-Kamm (1990) Plant Cell 2:603-618)가 생성될 수 있다. 미성숙한 배도 또한 입자 총을 사용함으로써 직접적인 DNA 전달을 위한 (Weeks et al. (1993) Plant Physiol 102: 1077-1084; Vasil (1993) Bio/Technolo 10: 667-674; Wan and Lemeaux (1994) Plant Physiol 104: 37-48) 그리고 아그로박테리움-중재된 DNA 전달을 위한 (Ishida et al. (1996) Nature Biotech 14: 745-750) 단자엽식물에 대한 좋은 표적 조직이 될 수 있다. DNA를 엽록체에 도입하기 위한 예시적인 방법은 생물학적 비행물체의 폭발(biolistic bombardment), 원형질체의 폴리에틸렌 글리콜 형질전환, 및 마이크로주사법이다 (Danieli et al Nat. Biotechnol 16:345-348, 1998; Staub et al Nat. Biotechnol 18:333-338, 2000; O'Neill et al Plant J. 3:729-738, 1993; Knoblauch et al Nat. Biotechnol 17: 906-909; 미국 특허 5,451,513호, 5,545,817호, 5,545,818호, 및 5,576,198호; 국제 출원 WO 95/16783; 및 Boynton et al., Methods in Enzymology 217: 510-536 (1993), Svab et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 913-917 (1993), and McBride et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91: 7301-7305 (1994)). 생물학적 비행물체의 폭발, 원형질체의 폴리에틸렌 글리콜 형질전환, 및 마이크로주사법에 적당한 어떠한 벡터는 엽록체 형질전환에 대한 표적화 벡터로서도 적당할 것이다. 어떠한 이중 가닥 DNA 벡터든지, 특히 도입 방법이 아그로박테리움을 사용하지 않을 때 형질전환 벡터로서 사용될 수 있다.
유전적으로 변형될 수 있는 식물로는 곡물, 사료작물, 과일, 채소, 유지작물, 야자나무, 삼림, 및 덩굴식물이 포함된다. 변형될 수 있는 식물의 구체적인 실례는 다음과 같다: 옥수수, 바나나, 땅콩, 필드피스(완두류), 해바라기, 토마토, 카놀라, 담배, 밀, 보리, 귀리, 감자, 대두, 목화, 카네이션, 사탕수수, 루핀 및 쌀. 다른 실례로는 아르테미시아 안뉴아와, 관심의 이소프레노이드 화합물을 생성하는 것으로 알려져 있는 다른 식물들이 있다.
또한 본 발명에는 형질전환된 식물 세포, 조직, 식물 및 그 형질전환된 식물세포를 함유하는 생성물이 제공된다. 본 발명의 형질전환된 세포, 및 조직 및 그것을 포함하는 생성물의 특징은 본 발명의 핵산이 게놈 안에 통합되어 존재하는 것과, 테르펜 수산화효소 및/또는 테르펜 산화효소 활성, 예컨대 세스퀴테르펜 산화효소 활성을 나타내는 폴리펩티드를 식물 세포가 생성한다는 것이다. 본 발명의 재조합 식물세포는 재조합 세포의 집단으로서, 또는 조직, 씨앗, 전체 식물, 줄기, 과실, 잎, 뿌리, 꽃, 도관, 곡물, 동물 사료, 식물 분야 등으로서 유용하다.
또한 본 발명에는 씨앗, 자손 식물 및 클론성 물질을 포함하는 본 발명의 유전자도입 식물의 재생 물질이 제공된다.
이소프레노이드 화합물의 제조방법
본 발명은 이소프레노이드 화합물의 제조방법을 제공한다. 어떤 구체예에서, 방법은 일반적으로 적당한 배지에서 유전적으로 변형된 숙주세포를 배양하는 것을 포함하며, 이때 상기 숙주세포는 이소프레노이드-변형 효소를 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 본 발명의 핵산으로 유전적으로 변형된다. 다른 구체예에서, 방법은 일반적으로 코드화된 이소프레노이드-변형 효소의 생성을 선호하는 조건 하에서 본 발명의 유전자도입 식물을 유지하는 것을 포함한다. 이소프레노이드-변형 효소의 생성은 이소프레노이드 화합물의 생성을 유발한다. 예를 들어 어떤 구체예에서, 방법은 일반적으로 유전적으로 변형된 숙주세포를 적당한 배지에서 배양하는 것을 포함하며, 이때 상기 숙주세포는 테르펜 산화효소를 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 본 발명의 핵산으로 유전적으로 변형된다. 테르펜 산화효소의 생성은 이소프레노이드 화합물의 생성을 유발한다. 전형적으로 방법은 시험관 내에서 수행되지만, 이소프레노이드 화합물의 생체 내 생성도 또한 포함된다. 이들 구체예 중 어떤 것에서 숙주세포는 진핵세포, 예컨대 효모 세포이다. 다른 구체예에서, 숙주세포는 원핵세포이다. 이들 구체예 중 어떤 것에서 숙주세포는 식물세포이다. 어떤 구체예에서 방법은 본 발명의 유전자도입 식물에서 수행된다.
세포는 전형적으로 이소프레노이드 또는 이소프레노이드 전구체 (예컨대 IPP, 폴리프레닐 디포스페이트 등)를 생성하기 위한 두 가지 경로 중 하나를 사용한다. 도 13 내지 15는 이소프레노이드 화합물, 또는 폴리프레닐 디포스페이트와 같은 전구체를 생성하기 위해 세포에 의해 사용된 경로들을 예시한다.
도 13은 이소프레닐 디포스페이트 (IPP) 및/또는 그것의 이성질체인 디메틸알릴 디포스페이트 (DMAPP)가 프레닐 트랜스페라제에 의해 변형되어 폴리프레닐 디포스페이트 제라닐 디포스페이트 (GPP), 파르네실 디포스페이트 (FPP), 및 제라닐제라닐 디포스페이트 (GGPP)가 생성되는 것을 포함하는 이소프레노이드 경로를 도시한다. GPP와 FPP는 추가로 테르펜 합성효소에 의해 변형되어 모노테르펜과 세스퀴테르펜을 각각 생성하며, GGPP는 추가로 테르펜 합성효소에 의해 변형되어 디테르펜과 카로테노이드가 생성된다. IPP 및 DMAPP는 두 가지 경로: 메발로네이트 (MEV) 경로와 1-데옥시-D-크실룰로오스-5-포스페이트 (DXP) 경로 중 한 가지에 의해 생성된다.
도 14는 일련의 IPP에 대한 반응을 통하여 아세틸 CoA가 전환되는 MEV 경로를 개략적으로 도시한다.
도 15는 DXP 경로를 개FIR적으로 도시하는데, 도면에서 피루베이트와 D-글리세르알데히드-3-포스페이트는 일련의 반응을 통하여 IPP 및 DMAPP로 전환된다. 식물세포 이외의 진핵세포는 아세틸-조효소 A (아세틸-CoA)를 IPP로 전환하기 위하여 배타적으로 MEV 이소프레노이드 경로를 사용하며, IPP는 계속해서 DMAPP로 이성질체로 된다. 식물은 이소프레노이드 합성을 위해 MEV와 메발로네이트-무관한, 또는 DXP 경로를 둘 다 사용한다. 약간의 예외는 있지만 원핵세포는 분기점을 통해 별도로 IPP 및 DMAPP를 생성하기 위하여 DXP 경로를 사용한다.
어떤 구체예에서, 숙주세포는 세스퀴테르펜 산화효소를 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 본 발명의 핵산으로 유전적으로 변형되고, 숙주세포는 세스퀴테르펜을 포함하는 배지에서 배양된다. 세스퀴테르펜은 세포에 들어가고, 세포 안에서 그것은 세스퀴테르펜 산화효소에 의해 변형된다. 많은 구체예에서, 세스퀴테르펜은 아모르파디엔, 알로이소론지폴렌, (-)-α-트랜스-베르가모텐, (-)-β-엘레멘, (+)-게르마크렌 A, 게르마크렌 B, (+)-γ-구르유넨, (+)-레덴, 네오인터메데올, (+)-β-셀리넨, 및 (+)-발렌센으로부터 선택된다. 어떤 구체예에서, 세스퀴테르펜 산화효소는 아모르파디엔 산화효소이고, 숙주세포는 아모르파-4,11-디엔 산화효소를 포함하는 배지에서 배양된다.
다른 구체예에서, 숙주세포는 추가로 테르펜 합성효소를 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산으로 유전적으로 변형된다. 그러므로 예를 들어 숙주세포는 테르펜 합성효소와 이소프레노이드-변형 효소 (예컨대 세스퀴테르펜 산화효소)를 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 하나 또는 그 이상의 핵산으로 유전적으로 변형된다. 그러한 숙주세포를 적당한 배양 배지에서 배양하는 것은 테르펜 합성효소와 이소프레노이드-변형 효소 (예컨대 세스퀴테르펜 산화효소)의 생성을 제공한다. 예를 들어 테르펜 합성효소는 파르네실 피로포스페이트를 변형하여 상기 세스퀴테르펜 산화효소에 대한 세스퀴테르펜 기질을 생성한다.
숙주세포가 배양되는 배양 배지에 따라, 그리고 숙주세포가 DXP 경로를 통하여 또는 메발로네이트 경로를 통하여 IPP를 합성하는가에 따라, 어떤 구체예에서 숙주세포는 추가로 유전자 변형을 포함할 것이다. 예를 들어 어떤 구체예에서, 숙주세포는 내인성 메발로네이트 경로를 갖지 않는 것, 예컨대 숙주세포는 메발로네이트 경로를 통하여 IPP 또는 메발로네이트를 정상적으로 합성하지 못하는 것이다. 예를 들어 어떤 구체예에서, 숙주세포는 정상적으로 메발로네이트 경로를 통하여 IPP를 합성하지 못하고, 숙주세포는 메발로네이트 경로의 둘 또는 그 이상의 효소들, IPP 이소메라제, 프레닐트랜스페라제, 테르펜 합성효소, 및 이소프레노이드-변형 효소 (예컨대 본 발명의 핵산에 의해 코드화된 이소프레노이드-변형 효소)를 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 하나 또는 그 이상의 핵산으로 유전적으로 변형된다. 그러한 숙주세포를 배양하는 것은 메발로네이트 경로 효소들, IPP 이소메라제, 프레닐트랜스페라제, 테르펜 합성효소, 및 이소프레노이드-변형 효소 (예컨대 세스퀴테르펜 산화효소)의 생성을 제공한다. 메발로네이트 경로 효소들, IPP 이소메라제, 프레닐트랜스페라제, 테르펜 합성효소, 및 이소프레노이드-변형 효소 (예컨대 세스퀴테르펜 산화효소)의 생성은 이소프레노이드 화합물의 생성을 유발한다. 많은 구체예에서, 프레닐트랜스페라제는 FPP 합성효소이고, 그것은 본 발명의 핵산에 의해 코드화된 세스퀴테르펜 산화효소에 대한 세스퀴테르펜 기질을 생성하며, 세스퀴테르펜 산화효소의 생성은 숙주세포에서 세스퀴테르펜 기질의 산화를 초래한다. 메발로네이트 경로 효소, IPP 이소메라제, 프레닐트랜스페라제, 테르펜 합성효소를 코드화하는 어떠한 핵산이든지 사용하기에 적당하다. 예를 들어 적당한 핵산은 문헌에 설명되어 있다 (Martin et al(2003) 상기동일).
상술된 구체예 중 어떤 것에서, 숙주세포는 둘 또는 그 이상의 메발로네이트 경로 효소를 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 하나 또는 그 이상의 핵산으로 유전적으로 변형되고, 둘 또는 그 이상의 메발로네이트 경로 효소는 MK, PMK, 및 MPD를 포함하며, 숙주세포는 메발로네이트를 포함하는 배지에서 배양된다. 다른 구체예에서, 둘 또는 그 이상의 메발로네이트 경로 효소는 아세토아세틸 CoA 티올라제, HMGS, HMGR, MK, PMK, 및 MPD를 포함한다.
어떤 구체예에서, 숙주세포는 메발로네이트 경로를 통하여 정상적으로 IPP를 합성하지 못하는 것이고, 숙주세포는 상기에서 설명된 것과 같이 유전적으로 변형되며, 숙주세포는 나아가 기능적으로 무능해진 DXP 경로를 포함한다.
어떤 구체예에서, 숙주세포는 시토크롬 P450 환원효소 (CPR)를 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산으로 유전적으로 변형된다. CPR의 광범위한 뉴클레오티드 서열이 알려져 있으며, 어떠한 공지된 CPR-코드화 핵산이든지 코드화된 CPR이 NADPH로부터 전자를 전달하는 데 활성을 나타내기만 한다면 사용될 수 있다. 어떤 구체예에서, CPR-코드화 핵산은 NADPH로부터의 전자를 본 발명의 이소프레노이드-변형 효소-코드화 핵산에 의해 코드화된 이소프레노이드-변형 효소, 예컨대 세스퀴테르펜 산화효소에 전달하는 CPR을 코드화한다. 어떤 구체예에서, CPR-코드화 핵산은 본 발명의 CPR 핵산이다.
본 발명의 방법은 다양한 이소프레노이드 화합물, 예를 들면 그것들에 한정되는 것은 아니지만, 아르테미신산 (예컨대 세스퀴테르펜 기질이 아모르파-4,11-디엔인 경우), 알로이소론지폴렌 알코올 (예컨대 기질이 알로이소론지폴렌인 경우), (E)-트랜스-베르가모타-2,12-디엔-14-올 (예컨대 기질이 (-)-α-트랜스-베르가모텐인 경우), (-)-엘레마-1,3,11(13)-트리엔-12-올 (예컨대 기질이 (-)-β-엘레멘인 경우), 게르마크라-1(10),4,11(13)-트리엔-12-올 (예컨대 기질이 (+)-게르마크렌 A인 경우), 게르마크렌 B 알코올 (예컨대 기질이 게르마크렌 B인 경우), 5,11(13)-구아이아디엔-12-올 (예컨대 기질이 (+)-γ-구르유넨인 경우), 레덴 알코올 (기질이 (+)-레덴인 경우), 4β-H-에우데슴-11(13)-엔-4,12-디올 (예컨대 기질이 네오인테르메데올인 경우), (+)-β코스톨 (예컨대 기질이 (+)-β-셀리넨인 경우) 등; 및 추가로 전술한 것들 중 어느 것의 유도체의 생성에 유용하다.
어떤 구체예에서, 본 발명의 유전적으로 변형된 숙주세포는 적당한 배지 (예컨대 하나 또는 그 이상의 추가의 제제, 예컨대 유도제 (예컨대 이소프레노이드-변형 효소-코드화 뉴클레오티드 서열이 유도성 프로모터의 제어하에 있는 경우) 등이 임의로 보충되어 있는 루리아-베르토니 육즙)에서 배양되고; 배양 배지는 유기층을 형성하는 유기 용매, 예컨대 도데칸으로 덮인다. 유전적으로 변형된 숙주세포에 의해 생성된 이소프레노이드 화합물은 유기층 안으로 분배되어, 그곳으로부터 정제될 수 있다. 어떤 구체예에서, 이소프레노이드-변형 효소-코드화 뉴클레오티드 서열이 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있는 경우, 유도 인자는 배양 배지에 첨가되고, 적당한 시간이 지난 후, 이소프레노이드 화합물은 배양 배지상에 덮여있는 유기층으로부터 분리된다.
어떤 구체예에서, 이소프레노이드 화합물은 유기층에 존재할 수 있는 다른 생성물로부터 분리될 것이다. 유기층에 존재할 수 있는 다른 생성물로부터 이소프레노이드 화합물의 분리는 예컨대 표준 크로마토그래피 기법을 사용하여 쉽게 이루어진다.
어떤 구체예에서, 본 발명의 방법에 의해 합성된 이소프레노이드 화합물은 추가로 세포-유리 반응으로 화학적으로 변형된다. 예를 들어 어떤 구체예에서는, 아르테미신산이 배양 배지 및/또는 세포 용해물로부터 분리되고, 아르테미신산은 추가로 세포-유리 반응으로 화학적으로 변형되어 아르테미시닌이 생성된다.
어떤 구체예에서, 이소프레노이드 화합물은 순수하다. 예컨대 최소한 약 40% 순수, 최소한 약 50% 순수, 최소한 약 60% 순수, 최소한 약 70% 순수, 최소한 약 80% 순수, 최소한 약 90% 순수, 최소한 약 95% 순수, 최소한 약 98% 순수, 또는 98% 이상 순수하며, 이때 이소프레노이드 화합물에 대해 "순수한"은 이소프레노이드 화합물이 다른 이소프레노이드 화합물, 거대분자, 오염물 등이 없다는 것을 말한다.
[ 실시예 ]
다음의 실시예는 본 발명을 이루고 사용하는 방법에 대한 완전한 개시와 설명을 당업자에게 제공하기 위해 제공되며, 본 발명자들이 그들의 발명으로 여기는 것의 범주를 제한하려는 의도가 있거나 그들이 아래의 실험이 전부 수행되거나 또는 일부 실험만이 수행되는 것을 나타내려는 의도가 있는 것은 아니다. 사용된 숫자 (예컨대 양, 온도 등)에 관해서는 정확성을 기해야 하지만 일부 실험적인 오류나 편차는 고려되어야 한다. 다른 언급이 없는 한, 부는 중량부이고, 분자량은 중량 평균 분자량이며, 온도는 섭씨 온도이고, 압력은 대기압이거나 거의 대기압이다. 표준 약어가 사용될 수 있는데, 예를 들면 bp는 염기쌍(들)이고; kb는 킬로염기(들)이며; pl은 피코리터이고; s 또는 sec는 초이며; min은 분이고; h 또는 hr은 시간이며; aa는 아미노산이고; nt는 뉴클레오티드이며; i.m.은 근육내이고; i.p.는 복강내이며; s.c.는 피하를 나타낸다.
실시예1 : 이소프레노이드 변형 효소의 클로닝 및 서열화
테르펜을 히드록실화하는 것으로 알려져 있는 대부분의 효소는 시토크롬 P450이다. 테르펜 수산화효소의 활용될 수 있는 모든 아미노산 서열을 해바라기와 상추로부터의 시토크롬 P450의 아미노산 서열과 일렬배열하였다. 이들 2가지 식물 종은 아스테라세아에 과(family)에 속하며, 아르테미시아 안뉴아도 여기에 속한다. 이소프레노이드-변형 효소, 예컨대 CYP71D 과는 함께 클러스터를 형성하며, 그것은 통상적인 조상을 시사한다. 축퇴성 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 프라이머를 디자인하였고, 그 프라이머는 아스테라세아에 CYP71D 과의 유전자를 증폭한다.
CYP71AV1 (또한 CYP71D -A4, 또는 AMO 로도 언급됨) 및 CPR cDNA 의 클로닝
cDNA 푸울을 슈퍼 SMART PCR cDNA 합성 키트 (BD Bioscience)에 의해, A. 안뉴아 트리콤-풍부화된 세포로부터 정제된 총 RNA 50ng을 사용하여 제조하였다. 축퇴성 P450 프라이머를 상추와 해바라기 CYP71 하위과의 보존된 아미노산 모티프로부터 디자인하였다: [Y/Q]G[E/D][H/Y]WR로부터 프라이머 1 (전방) 및 FIPERF로부터 프라이머 2 (역) (하기 표 1은 프라이머에 대한 서열 정보를 제공한다).
플라스미드의 구성을 위해 사용된 프라이머
프라이머
번호		 서열 (5'에서 3')
1 TCCGACCA(C/T)ANGGNGAN(C/T)A(C/T)TGGAG; SEQ ID NO:14
2 TCCGACCAAANC(G/T)(C/T)TCNGG(A/G/T)AT(A/G)AA; SEQ ID NO:15
3 CCAGCACA(A/G)TA(C/T)GA(A/G)CA(C/T)TT(C/T)AA(C/T)AA(A/G)AT; SEQ ID NO:16
4 CCAGCAGCCATNCC(C/T)TTNGC(A/G)TCNCC(A/G)CA; SEQ ID NO:17
5 ACGTCTAGA ATGAAGAGTATACTAAAAGCAATG; SEQ ID NO:18
6 ACGTCTAGAGCGAAACTTGGAACGAGTAACAACT; SEQ ID NO:19
7 ATGGATCCTATGCAATCAACAACTTCCGTTAAGTTAT; SEQ ID NO:20
8 TATGTCGACCCATACATCACGGAGATATCTTCCT; SEQ ID NO:21
9 GGACTAGTAAAACAATGGCCCTGACCGAAGAG; SEQ ID NO:22
10 CCAAGCTT TCAGATGGACATCGGGTAAAC; SEQ ID NO:23
11 CTGCCGCGGGGCCGCAAATTAAAGCCTTC; SEQ ID NO:24
12 CTGCCGCGGTAGTACGGATTAGAAGCCGC; SEQ ID NO:25
13 CGGGATCCAAAACAATGGCTGCAGACCAATTGGTG; SEQ ID NO:26
14 GCGTCGAC TTAGGATTTAATGCAGGTGACG; SEQ ID NO:27
15 CGGGATCCAAAACAATGAGCGAAGTCGGTATACAG; SEQ ID NO:28
16 GCGTCGAC TCATAACGAAAAATCAGAGAAATTTG; SEQ ID NO:29
17 GGACTAGTAAAACAATGGCTTCAGAAAAAGAAATTAG; SEQ ID NO:30
18 TCCCCCGGG CTATTTGCTTCTCTTGTAAAC; SEQ ID NO:31
이들 프라이머와 A. 안뉴아 cDNA를 사용한 중합효소 연쇄 반응 (PCR)으로 1kb의 DNA 단편이 생성되었다. 사용한 PCR-프로그램은 48℃ 아닐링 온도의 7 사이클과 추가로 55℃의 아닐링 온도를 사용하는 27 사이클이었다. 증폭된 유전자 단편으로부터 추론된 아미노산은 해바라기 (QH_CA_Contig1442)와 상추 (QG_CA_Contig7108) 콘티그(contig)에 대해 각각 85%와 88%의 아미노산 동일성을 나타냈다. 혼성 EST-데이터베이스는 cgpdb.ucdavis.edu에서 찾아볼 수 있다. A. 안뉴아 단편을 보존된 QYEHFNKI (SEQ ID NO:32) 및 CGDAKGMA (SEQ ID NO:33) 모티프로부터 각각 디자인한 전방 프라이머 (프라이머 3), 및 역 프라이머 (프라이머 4)를 사용하여 분리하였다. CYP71AV1 ("CYP71D-A4")에 대한 5'-과 3'- 단부 서열을 둘 다 RLM-RACE 키트 (Ambion)를 사용한 후, A. 안뉴아 잎의 cDNA로부터 전 길이의 cDNA를 회수함으로써 측정하였다. CYP71AV1과 CPR의 오픈 리딩 프레임을 PCR에 의하여 증폭하고, 그것을 각각 FLAG와 cMyc 태깅에서 pESC-URA (Stratagene)의 SpeI과 BamHI/SalI 부위에 결찰하였다. CYP71AV1의 PCR-증폭을 위해, 프라이머 5와 6을 사용하였다; CPR의 PCR-증폭을 위해 프라이머 7과 8을 사용하였다. 사용한 PCR-프로그램은 55℃의 아닐링 온도를 사용하는 35 사이클이었다. 모든 클론을 서열화하여 서열을 확인하였다.
식물 추출물 분석. A. 안뉴아 잎 (100 내지 200mg의 새로운 중량)을 내부 표준으로서 5.8μM 옥타데칸을 섞은 1mL의 헥산에서 2시간 동안 격렬하게 흔들어주었다. 헥산올 추출물을 200μL로 농축하고, 1μL의 샘플을 DB-XLB 칼럼 (0.25mm i.d.×0.25㎛×30m, J&W Scientific)을 사용하는 GC-MS 분석에 사용하여 설명한 것과 같은 14가지 식물 샘플로부터 아르테미시닌 함량을 측정하였다 (Woerdenbag et al. (1991) Phytochem . Anal ., 2, 215-219). 사용한 GC 오븐 프로그램은 100℃에서 250℃까지 분당 5℃씩 증가하는 것이었다. 식물 헥산올 추출물을 TMS-디아조메탄에 의해 유도하여 DB5 칼럼 (n=8)이 장착된 GC-FID에 의해 아르테미신산 함량을 측정하였다. 사용한 GC 오븐 프로그램은 80℃ (2분 보유)에서 140℃까지 분당 20℃씩 증가하는 것이었고, 생성물은 220℃까지 분당 5℃씩 증가시켜 분리하였다. 믿을만한 아르테미시닌 표준을 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)사로부터 구입하였다.
아르테미신 알코올의 합성. 아르테미신산 (100.0mg, 0.43mmol)을 THF (10.0mL)에 녹이고, LiAlH4 (17.0mg, 0.45mmol)를 첨가하였다. 이종성 혼합물을 환류 온도 (70℃)에서 15시간 동안 유지하였다. 그것을 냉각한 후, 반응물을 물 (3.0mL) 및 15%의 수성 NaOH (3.0mL)로 퀀치하고, 10분 동안 교반한 후, 셀라이트를 통해 여과하였다. 유기층을 분리하고, MgSO4 상에서 건조한 다음, 회전 증발기를 사용하여 농축하였다. 생성물을 칼럼 크로마토그래피 (2:1의 헥산/EtOAc)에 의해 정제함으로써 61.0mg (65% 수율)의 알코올을 무색 오일로서 얻었다. 소량의 아르테미신산 오염물을 추가로 중성 알루미나 (Brockman 활성 1) 상에서의 칼럼 크로마토그래피에 의해 제거하였다. 특성확인 데이터는 문헌의 값과 일치하였다.
아르테미신 알데하이드의 합성. 아르테미신 알코올을 문헌에 보고된 과정을 따라 아르테미신 알데하이드로 산화하였다 (Sharpless et al. Tetrahedron Letters 17, 2503-2506 (1976)). 아르곤 대기 하에서 RuCl2(PPh3)3 (17.0mg, 0.018mmol)과 N-메틸 모르폴린 N-옥사이드 (60.0mg, 0.51mmol)을 함유하고 있는 불꽃-건조된 10-mL 플라스크에 아세톤 (4.0mL)을 첨가하였다. 그 용액에 아세톤 (1.0mL)중의 아르테미신 알코올 (55.0mg, 0.25mmol)을 주사기를 통하여 첨가하였다. 그 혼합물을 23℃에서 2시간 동안 교반하고, 진공 농축하였다. 미정제 생성물을 칼럼 크로마토그래피 (4:1의 헥산/EtOAc)에 의해 정제하여 32.0mg (59% 수율)의 아르테미신 알데하이드를 무색 오일로서 얻었다. 특성확인 데이터는 문헌의 보고와 일치하였다.
EFY 균주 생성 및 특성확인
화학약품. 도데칸과 카리오필렌을 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)사로부터 구입하였다. 5-플루오로오르트산 (5-FOA)을 Zymo Research (Orange, CA)사로부터 구입하였다. 합성 규정 (SD) 배지의 제형을 위한 완전 보충물 혼합물을 Qbiogene (Irvine, CA)사로부터 구입하였다. 다른 모든 배지 성분들을 Sigma-Aldrich사 또는 Becton (Franklin Lakes, NJ)사로부터 구입하였다.
균주 및 배지. 이 연구에 사용된 발현 플라스미드의 구성에서 박테리아 형질전환과 플라스미드 증폭을 위해 대장균 균주 DH10B와 DH5α를 사용하였다. 균주를 100mg/L의 암피실린이 첨가된 루리아-베르타니 배지에서 37℃에서 배양하고, 단 pδ-UB-기초 플라스미드는 DH5α를 사용하여 50mg/L의 암피실린과 함께 배양하였다.
S288C의 유도체인, 사카로마이세스 세레비시아에 균주 BY4742 (Brachmann et al. Yeast 14, 115-132 (1998))를 모든 효모 균주에 대한 모 균주로서 사용하였다. 이 균주를 풍부한 YPD 배지에서 성장시켰다. (Burke et al. Methods in yeast genetics: a Cold Spring Harbor laboratory course manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, NY, 2000)). 공학 제조된 효모 균주를 필요에 따라 로이신, 우라실, 히스티딘, 및/또는 메티오닌이 적하된 SD 배지 (Burke et al.,상기동일)에서 성장시켰다. GAL1 프로모터로부터 발현된 유전자의 유도를 위해, S. 세레비시아에를 단독 탄소 공급원으로서 2%의 갈락토오스에서 성장시켰다.
플라스미드 구성. GAL1 프로모터를 포함한 ADS의 발현을 위한 플라스미드 pRS425ADS를 제조하기 위하여, ADS를 프라이머 쌍 9와 10 (표 1)을 사용하여 pADS (Martin et al. Nat . Biotechnol . 21, 796-802 (2003))로부터 PCR 증폭시켰다. 이들 프라이머를 사용하여 뉴클레오티드 서열 5'-AAAACA-3'을 ADS의 출발 코돈 바로 위에 클론하였다. 이 일치 서열을 이 연구에서 사용한 ADS 및 다른 갈락토오스-유도성 유전자의 효과적인 번역을 위해 사용하였다. 증폭된 생성물을 SpeI과 HindIII로 절단하여 SpeI 및 HindIII로 소화시킨 pRS425GAL1 (Mumberg et al. Nucleic Acids Research 22, 5767-5768 (1994))에 클론하였다.
tHMGR에 대한 발현 카세트의 통합을 위해, 플라스미드 pδ-HMGR을 구성하였따. 첫 번째 SacII 제한 부위를 pRS426GAL1 (Mumberg et al., 상기동일)에 GAL1 프로모터의 5' 단부와 CYC1 터미네이터의 3' 단부에 도입하였다. 이것을 이루기 위하여 pRS426GAL1의 프로모터-다중 클로닝 부위-터미네이터 카세트를 프라이머 쌍 11 및 12를 사용하여 PCR 증폭하였다. 증폭된 생성물을 직접 PvuII-소화된 pRS426GAL1에 클론하여 벡터 pRS426-SacII를 구성하였다. HMG1의 촉매 도메인을 플라스미드 pRH127-3 (Donald et al. Appl . Environ . Microbiol . 63, 3341-3344 (1997))로부터 프라이머 쌍 13과 14를 사용하여 PCR 증폭하였다. 증폭된 생성물을 BamHI과 SalI으로 절단하고, amHI 및 SalI으로 소화된 pRS426-SacII안에 클론하였다. pRS-HMGR을 SacII로 절단하고, 발현 카세트 단편을 겔 추출한 다음 SacII 소화된 pδ-UB (Lee et al. Biotechnol . Prog . 13, 368-373 (1997)) 안에 클론하였다.
UPC2의 upc2-1 대립형질을 프라이머 쌍 15와 16을 사용하여 플라스미드 pBD33으로부터 PCR 증폭하였다. 증폭된 생성물을 BamHI 및 SalI으로 절단하고, BamHI 및 XhoI 소화된 pRS426-SacII 안에 클론하여 플라스미드 pRS-UPC2를 생성하였다. upc2-1의 통합을 위해 pδ-UPC2를, 동일한 방식으로 pRS-UPC2를 SacII로 소화시키고 적절한 단편을 pδ-UB로 이동시킴으로써 생성하였다.
MET3프로모터로 ERG9프로모터를 대체하기 위하여, 플라스미드 pRS-ERG9를 구성하였다. 플라스미드 pRH973 (Gardner et al. J. Biol . Chem . 274, 31671-31678 (1999))는 MET3 프로모터 뒤에 놓여있는 ERG9의 절단된 5' 절편을 함유하였다. pRH973을 ApaI 및 ClaI으로 절단하고, HIS3 선택 마커를 가지고 있는, ApaI 및 ClaI 소화된 pRS403 (Sikorski et al. Genetics 122, 19-27 (1989))안에 클론하였다.
ERG20의 발현을 위해, 플라스미드 pδ-ERG20을 구성하였다. 플라스미드 pRS-SacII를 먼저 SalI 및 XhoI으로 소화하여 부합하는 결합력 있는 단부를 생성하였다. 그런 다음 플라스미드를 자체-결찰하여 SalI 및 XhoI 부위를 제거함으로써 플라스미드 pRS-SacII-DX를 생성하였다. ERG20을 BY4742의 게놈 DNA로부터 프라이머 쌍 17과 18을 사용하여 PCR 증폭하였다. 증폭된 생성물을 SpeI 및 SmaI으로 절단하고, SpeI 및 SmaI 소화된 pRS-SacII-DX에 클론하였다. 그런 다음 pRS-ERG20을 SacII로 절단하고, 발현 카세트 단편을 겔 추출하고, SacII 소화된 pδ-UB에 클론하였다.
효모 형질전환 및 균주 구성. S288C의 유도체인 S. 세레비시아에 균주 BY4742 (Brachmann et al., 상기동일)를 모든 S. 세레비시아에 균주에 대한 모균주로서 사용하였다. S. 세레비시아에의 모든 균주의 형질전환을 표준 리튬 아세테이트 방법에 의해 수행하였다 (Gietz, R. D. & Woods, R. A. in Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology, Part B, 87-96 (Academic Press Inc, San Diego, 2002)). 각 형질전환으로부터 3 내지 10개의 콜로니를 가장 높은 아모르파디엔을 생성하는 형질전환체의 선택을 위해 선별하였다. 균주 BY4742를 플라스미드 pRS425ADS로 형질전환하고 SD-LEU 플레이트 상에서의 선택에 의해 균주 EPY201을 구성하였다. 플라스미드 pδ-HMGR을 XhoI으로 소화한 후 DNA를 균주 EPY201에 형질전환하였다. SD-LEU-URA 플레이트상에서의 초기 선택 후에, 형질전환체를 배양하고, URA3 마커의 손실에 대한 선택으로서 1g/L의 5-FOA를 함유하고 있는 SD-LEU 플레이트 상에 플레이트하였다. 그 결과의 우라실 영양 요구체인 EPY208을 그런 다음 XhoI-소화된 pδ-UPC2 플라스미드 DNA로 형질전환하였다. SD-LEU-URA 플레이트 상에서의 초기 선택 후에, 형질전환체를 배양하고 EPY210의 구성을 위해 1g/L의 5-FOA를 함유하고 있는 SD-LEU 플레이트 상에 플레이트하였다. 플라스미드 pRS-ERG9를, 각각 EPY213 및 EPY225의 구성을 위해 EPY208 및 EPY210의 ERG9 유전자좌에 PMET3-ERG9 융합의 통합을 위해 HindII로 절단하였다. 이들 균주를 SD-LEU-HIS-MET 플레이트 상에서 선택하였다. 그런 다음 EPY213을 XhoI 소화된 pδ-HMGR 플라스미드 DNA로 형질전환하였다. SD-LEU-URA-HIS-MET 플레이트 상에서의 초기 선택 후에 형질전환체를 배양하고, EPY219의 구성을 위해 1g/L의 5-FOA를 함유하고 있는 SD-LEU-HIS-MET 플레이트 상에 플레이트하였다.
pRS-ERG9의 통합은 2세트의 프라이머를 사용하여 PCR 분석을 함으로써 증명하였다. 각 세트는 삽입된 DNA에 결합하기 위해 하나의 올리고와, 삽입 주변의 게놈 DNA에 결합하기 위한 한 올리고를 함유하였다. 모든 다른 통합을 GAL1 프로모터의 5'-단부와 융합된 유전자의 3'-단부에 결합하는 프라이머를 사용하여 전 길이의 삽입에대해 증명하였다.
효모 배양. 600nM (OD600) 측정에서의 모든 광학 밀도를 벡크만 DU-640 분광계를 사용하여 얻었다. 아모르파디엔 생성을 측정하기 위하여, 5mL의 SD (2% 갈락토오스) 배지 (상술된 것과 같은 적절한 아미노산 생략)를 함유하는 배양 튜브를 관심의 균주로 접종하였다. 이들 접종물을 30℃에서 OD600이 1과 2 사이에 올 때까지 성장시켰다. 50mL의 SD배지를 함유하고 있는, 배플이 달려있지 않은 배양 플라스크 (250mL)를 이들 씨앗 배양물로 OD600이 0.05가 될 때까지 접종하였다. 아모르파디엔 생성을 성장하기 시작한 6일 후에 측정하였다. ERG9 유전자좌에서의 PMET3-ERG9 융합의 억제를 위해 각 배양물에 1mM의 메티오닌을 존재하게 했다. 모든 플라스크는 또한 5mL의 도데칸을 함유하였다. 이 도데칸 층을 샘플화하고, GC-MS에 의한 아모르파디엔 생성의 측정을 위해 에틸 아세테이트로 희석하였다.
결과
아르테미시닌은 특수한 식물세포인 선성(glandular) 트리콤에서 생성된다. 선성 트리콤 세포를 A. 안뉴아로부터 분리하고; RNA를 세포로부터 추출하였다. 축퇴성 프라이머를 사용하여, CYP71D -A4로 명명된 신규한 유전자의 부분적인 cDNA를 분리하였다. cDNA 단부의 신속한 증폭(RACE)을 수행함으로써 전 길이의 유전자를 회수하였다. cDNA의 코딩 영역의 뉴클레오티드 서열을 도 1에 도시하고 (SEQ ID NO:1), 번역된 아미노산 서열은 도 2에 제공한다 (SEQ ID NO:2).
전 길이의 CYP71D -A4 cDNA를 효모 세포에서 발현시켰다. 아모르파디엔 산화효소 활성을 분석하기 위하여, CYP71D -A4를 A. 안뉴아로부터의 CPR 유전자 (AACPR, 도 3; 코드화된 단백질의 아미노산 서열은 도 4에 제시된다)가 Gal1 프로모터로부터 발현되는 pESC-URA (Stratagene) 골격 플라스미드의 Gal10 프로모터의 전사 제어 하에 놓았다. AACPR 유전자를 상기에서 설명한 것과 같이 축퇴성 프라이머 PCR과 RACE를 사용하여 A. 안뉴아 선성 트리콤 mRNA로부터 얻었다.
아모르파-4,11-디엔 산화효소 활성에 대한 생체 내 분석을 수행하기 위하여, 이 플라스미드 (p71D-A4/CPR:pESC-URA)와 CYP71D -A4가 없는 대조 플라스미드를 공학적으로 제조된 S. 세레비시아에 세포 안에 형질전환하여 아모르파-4,11-디엔을 생성하였다. 간단히 설명하면, 이들 세포는 효모에서 녹을 수 있는 절단된 HMG CoA 환원효소를 코드화하는 통합된 유전자를 운반하는 균주 BY4742이다. 이들 세포는 GAL1 프로모터의 제어 하에 코돈-최적화된 ADS 유전자를 가지는 pRS425ADS를 운반한다. 형질전환된 세포를 합성 로이신과 우라실이 없는 배지에서 배양하여 29시간 동안 2% 갈락토오스를 유도하였고, 배지를 에테르로 추출하였다. 추출물을 농축하고 1㎕를 EXL 칼럼이 장착된 가스 크로마토그래피-질량 분광학 (GC-MS)에 의해 50℃ 부터 250℃까지 분당 5℃씩 증가하는 온도 프로그램을 사용하여 분석하였다. 신뢰할만한 아르테미신산을 사용하여 아르테미신 알코올과 아르테미신 알데하이드를 합성하였고, 그것들을 표준으로서 사용하였다. 이 방법에 의하여, 두 개의 피크를 CPR과 CYP71D -A4를 발현하는 세포로부터 검출하였지만, CPR만을 발현하는 대조 세포에서는 검출하지 못하였다. 반응 시간과 질량 스펙트럼을 신뢰할만한 표준과 비교함으로써, 이들 피크가 아르테미신 알코올과 아르테미신 알데하이드에 상응하는 것으로 측정하였다. 아르테미신산을 검출하지 못하였는데, 정당한 그것의 낮은 휘발성으로 유도되는 일 없이 GC를 사용하여 나타날 것으로는 예상하지 않았다.
아모르파-4,11-디엔 산화효소 활성에 대한 생체 내 공급 분석을 수행하였는데, 이때 동일한 2개의 플라스미드를 개별적으로 S. 세레비시아에의 야생형 균주인 YPH499 안으로 형질전환하였다. 효모 세포를 50mL의 2% 덱스트로오스 및 우라실 결핍 배지에서 배양하고, 24시간 동안 2% 갈락토오스에 의해 유도하였다. 5mL의 유도된 효모 세포를 원심분리에 의해 수집하고, 150μM 아모르파-4,11-디엔, 아르테미신 알코올, 또는 아르테미신 알데하이드를 함유하는 신선한 배지를 사용하여 효모 세포를 재현탁하였다. 그런 다음 효모 세포를 30℃에서 5시간 동안 배양하였다. 배지를 에테르로 추출한 후 N-(tert-부틸디메틸실릴0-N-메틸트리플루오로아세트아미드를 사용하여 추출함으로써 GC-MS를 사용하여 어떠한 아르테미신산을 검출하는 것을 가능하게 하였다. 확실한 아르테미신 알코올 및 아르테미신산 표준을 또한 유사하게 유도하였다. 각 유도된 대조표준 및 샘플의 1μL를 GC-MS에 의해 분석하였다. 사용한 온도 프로그램은 50℃에서 250℃까지 분당 5℃씩 증가하는 것이었다.
세포에 아모르파-4,11-디엔을 공급하였을 때, 아르테미신산의 상당한 축적과 함께 소량의 아르테미신 알코올 및 알데하이드 화합물이 CPR과 CYP71D -A4를 모두 발현하는 효모 세포로부터만 검출되었다 (도 5a). 세포에 아르테미신 알코올 또는 아르테미신 알데하이드를 공급했을 때, 아르테미신산의 상대적인 축적은 CPR만으로 형질전환된 대조 균주의 그것보다 CPR / CYP71D -A4 형질전환된 효모 세포의 배양 배지에서 더 높았다 (도 5b 및 5c).
도 5a 내지 5c. 아모르파디엔 (도 5a) 및 두 개의 다른 아르테미시닌 중간체 - 아르테미신 알코올 (도 5b) 및 아르테미신 알데하이드 (도 5c)-를 CPR만으로 형질전환된 (상부 크로마토그래프) 또는 CPR과 CYP71D -A4 둘 다로 형질전환된 (하부 크로마토그래프) 효모 세포가 배양되고 2% 갈락토오스에 의해 유도된 배지에 150μM로 첨가하였다. 아모르파디엔(1), 아르테미신 알코올(2), 아르테미신 알데하이드(3) 및 아르테미신산(4)을 화살표로 표시한다. 아르테미신 알코올(2)과 아르테미신산(4)를 N-(tert-부틸디메틸실릴)-N-메틸트리플루오로아세트아미드에 의해 유도화 후에 검출하였다. 별표는 배지에 첨가된 기질을 나타낸다.
샘플 중의 유도된 아르테미신산의 확실성을 확실한 아르테미신산 표준에 의해 확인하였다 (도 6a 및 6b). 이들 데이터는 첫 번째 히드록실화가 CYP71D -A4 클론에 코드화된 시토크롬 P450 효소에 의해 촉매되고, 계속되는 아르테미신 알코올의 아르테미신 알데하이드로 및 아르테미신 알데하이드의 아르테미신산으로의 산화성 전환은 효모 내인성 산화 활성을 함께 가지고 있는 CYP71D -A4 재조합 효소에 의해 촉매되는 가능성이 높다는 것을 가리킨다.
도 6a 및 6b. CPR/71D-A4 형질전환된 효모 세포에 아모르파디엔이 공급된 후에 생성된 신규한 화합물의 질량 스펙트럼 및 보유 시간을 도 6a에 나타내고, 아르테미신산의 확실한 표준의 그것들을 도 6b에 나타낸다. 두 가지 생성물과 표준을 유도화 후에 GC-MS에 의해 검출하였고, 그것은 염기 분자량에 114 질량 유닛을 첨가하였다.
갈락토오스와 같은 단순한 당으로부터 공학적으로 제조된 효모의 아르테미신산의 새로운 합성을 CPR ("AACPR") 및 AMO ("CYP17D-A4")(pESC-URA::AACPR/AMO) 둘 다를 은닉하고 있는 pESC-URA로 EPY224를 유전적으로 변형함으로써 나타냈다. 절단된 효모 HMGCoA 환원효소를 코드화하는 구성물을 효모 균주 BY4742에 2회 통합시켰다. 전사 인자 upc2-1을 과잉발현시켜서 에르고스테롤 생합성 경로에 있는 여러 유전자의 전사 수준을 상승시켰다. 스쿠알렌 합성효소 유전자 (ERG9)를 메티오닌 억제성 프로모터, MET3에 의해 하향-조절하였다. EPP 합성효소를 Gal1 프로모터에 의해 과잉발현시켰고, ADS를 또한 pRS425 골격에 있는 Gal 프로모터에 의해 과잉발현시켰다. pESC-URA::AACPR/AMO를 은닉하고 있는 효모 EPY224 균주를 1.8%의 갈락토옷, 및 0.2%의 글루코오스를 함유하고 있는 합성 배지에서 5일 동안 30℃에서 배양하였다. 효모 세포를 펠릿화하고, 펠릿을 알칼리성 완충액 (트리스 완충액 pH 9)으로 세척하였다. 완충액을 HCl을 첨가함으로써 pH 2로 산성화하고, 산성화된 완충액을 에틸 아세테이트로 추출하였다. TMS-디아조메탄과 메탄올을 에틸 아세테이트 분획에 첨가하여 아르테미신산을 유도하였다. 아르테미신산의 메틸 에스테르 형태를 GC-MS에 의하여 검출하였다.
도 7a 내지 7c는 AACPR과 AMO가 발현될 때 효모에서 아르테미신산이 새롭게 생성되는 것을 도시한다. 대조적으로 AACPR만을 발현하는 대조 효모에서는 아르테미신산이 검출되지 않았다. 13.62분에서의 신규한 피크 (도 7a, 피크1)는 식물, 아르테미시아 안뉴아로부터의 확실한 아르테미신산으로서의 동일한 질량 단편화 패턴을 나타냈다 (도 7b 및 7c).
도 8a 내지 8c는 시험관 내 AMO 효소 분석을 도시한다. 마이크로솜을 AACPR 또는 CPR/AMO를 발현하는 S. 세레비시아에 YPH499로부터 분리하였다. 사용한 기질에 대한 크로마토그래피 피크는 별표로 표시한다. 각 효소 분석에 대하여, 10μM의 아모르파디엔 (a), 25μM의 아르테미신 알코올 (b), 또는 25μM의 아르테미신 알데하이드 (c)를 사용하였다. 에테르로 추출할 수 있는 분획을 유도하였고, 선택적 이온 모드로 GC-MS에 의해 분석하였다 (m/z:121, 189, 204, 218, 220, 및 248). 효소에 의한 생성물을 표시하였다: 1, 아르테미신 알코올 [보유 시간(Rt)=13.20]; 2, 아르테미신 알데하이드 (Rt=11.79); 3, 아르테미신산 (Rt=13.58, 메틸 에스테르로서 검출됨).
도 9는 71D-B1로서 표시된 (또한 아모르파디엔 수산화효소에 대하여 "AMH"로도 언급됨), 테르펜 수산화효소를 코드화하는 cDNA 클론의 뉴클레오티드 서열을 도시한다.
도 10은 71D-B1 (AMH)에 의해 코드화된 단백질의 아미노산 서열을 도시한다.
도 11a 내지 11c는 AMH 클론 (71D-B1)에 코드화된 재조합 효소의 히드록실화 활성을 도시한다. A에서 16.82분에서의 피크는 AMO가 HMGCoA-과잉발현 효모에서 발현되었을 때 아르테미신산이고, B에서 18.50분에서의 피크는 AMH 및 AACPR이 HMGCoA 과잉발현된 효모에서 과잉발현되었을 때 히드록실화된 아모르파디엔이다. 히드록실화된 아모르파디엔의 질량 단편화 패턴은 도 11c에 제공하였다. 히드록실화된 아모르파디엔의 원래 이온에 대한 피크 (220)가 도시되며 세스퀴테르펜 및 테르펜에 대한 다른 전형적인 이온 단편화 패턴도 도시된다 (예컨대 93, 119, 132, 145, 159, 및 177).
도 12는 테르펜 수산화효소/산화효소를 코드화하는 게놈 DNA의 뉴클레오티드 서열을 도시한다.
본 발명을 발명의 구체적인 구체예와 관련하여 설명하였지만, 당업자들은 본 발명의 확실한 사상 및 범주로부터 벗어남이 없이 다양한 변화가 이루어지고 동등물이 치환될 수 있음을 인지해야 한다. 또한 많은 변형이 본 발명의 특정 상황, 물질, 물질의 조성물, 방법, 방법의 단계 또는 단계들에, 목적, 사상, 및 범주에 적용하기 위해 이루어질 수 있다. 그러한 모든 변형은 첨부되는 청구범위의 범주 내에 있는 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> RO, DAE-KYUN NEWMAN, KARYN PARADISE, ERIC M. KEASLING, JAY D. OUELLET, MARIO EACHUS, RACHEL HO, KIMBERLY HAM, TIMOTHY <120> POLYNUCLEOTIDES ENCODING ISOPRENOID MODIFYING ENZYMES AND METHODS OF USE THEREOF <130> BERK-049WO <150> 60/697,067 <151> 2005-07-05 <160> 33 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 1488 <212> DNA <213> Artemisia annua <400> 1 atgaagagta tactaaaagc aatggcactc tcactgacca cttccattgc tcttgcaacg 60 atccttttgt tcgtttacaa gttcgctact cgttccaaat ccaccaaaaa aagccttcct 120 gagccatggc ggcttcccat tattggtcac atgcatcact tgattggtac aacgccacat 180 cgtggggtta gggatttagc cagaaagtat ggatctttga tgcatttaca gcttggtgaa 240 gttccaacaa tcgtggtgtc atctccgaaa tgggctaaag agattttgac aacgtacgac 300 attacctttg ctaacaggcc cgagacttta actggtgaga ttgttttata tcacaatacg 360 gatgttgttc ttgcacctta tggtgaatac tggaggcaat tacgtaaaat ttgcacattg 420 gagcttttga gtgttaagaa agtaaagtca tttcagtcac ttcgtgaaga ggagtgttgg 480 aatttggttc aagagattaa agcttcaggt tcagggagac cggttaacct ttcagagaat 540 gttttcaagt tgattgcaac gatacttagt agagccgcat ttgggaaagg gatcaaggac 600 cagaaagagt taacggagat tgtgaaagag atactgaggc aaactggtgg ttttgatgtg 660 gcagatatct ttccttcaaa gaaatttctt catcatcttt cgggcaagag agctcggtta 720 actagccttc gcaaaaagat cgataattta atcgataacc ttgtagctga gcatactgtt 780 aacacctcca gtaaaactaa cgagacactc ctcgatgttc ttttaaggct caaagacagt 840 gctgaattcc cattaacatc tgataacatt aaagccatca ttttggatat gtttggagca 900 ggcacagaca cttcctcatc cacaatcgaa tgggcgattt cggaactcat aaagtgtccg 960 aaagcaatgg agaaagtaca agcggaattg aggaaagcat tgaacggaaa agaaaagatc 1020 catgaggaag acattcaaga actaagctac ttgaacatgg taatcaaaga aacattgagg 1080 ttgcaccctc cactaccctt ggttctgcca agagagtgcc gccaaccagt caatttggct 1140 ggatacaaca tacccaataa gaccaaactt attgtcaacg tctttgcgat aaatagggac 1200 cctgaatatt ggaaagacgc tgaagctttc atccctgaac gatttgaaaa tagttctgca 1260 actgtcatgg gtgcagaata cgagtatctt ccgtttggag ctgggagaag gatgtgtcct 1320 ggagccgcac ttggtttagc taacgtgcag ctcccgctcg ctaatatact atatcatttc 1380 aactggaaac tccccaatgg tgtgagctat gaccagatcg acatgaccga gagctctgga 1440 gccacgatgc aaagaaagac tgagttgtta ctcgttccaa gtttctag 1488 <210> 2 <211> 495 <212> PRT <213> Artemisia annua <400> 2 Met Lys Ser Ile Leu Lys Ala Met Ala Leu Ser Leu Thr Thr Ser Ile 1 5 10 15 Ala Leu Ala Thr Ile Leu Leu Phe Val Tyr Lys Phe Ala Thr Arg Ser 20 25 30 Lys Ser Thr Lys Lys Ser Leu Pro Glu Pro Trp Arg Leu Pro Ile Ile 35 40 45 Gly His Met His His Leu Ile Gly Thr Thr Pro His Arg Gly Val Arg 50 55 60 Asp Leu Ala Arg Lys Tyr Gly Ser Leu Met His Leu Gln Leu Gly Glu 65 70 75 80 Val Pro Thr Ile Val Val Ser Ser Pro Lys Trp Ala Lys Glu Ile Leu 85 90 95 Thr Thr Tyr Asp Ile Thr Phe Ala Asn Arg Pro Glu Thr Leu Thr Gly 100 105 110 Glu Ile Val Leu Tyr His Asn Thr Asp Val Val Leu Ala Pro Tyr Gly 115 120 125 Glu Tyr Trp Arg Gln Leu Arg Lys Ile Cys Thr Leu Glu Leu Leu Ser 130 135 140 Val Lys Lys Val Lys Ser Phe Gln Ser Leu Arg Glu Glu Glu Cys Trp 145 150 155 160 Asn Leu Val Gln Glu Ile Lys Ala Ser Gly Ser Gly Arg Pro Val Asn 165 170 175 Leu Ser Glu Asn Val Phe Lys Leu Ile Ala Thr Ile Leu Ser Arg Ala 180 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tgattatgct 420 gctgaagatg atgagtatga ggagaagtta aagaaagaat ctcttgcttt tttcttttta 480 gctacgtatg gagatggtga gccgacagat aatgctgcta gattctataa atggtttacc 540 gagggtgaag agaaaggtga atggcttgac aagcttcaat acgcagtgtt tggacttggt 600 aacagacagt atgagcattt caacaagatt gcgaaggtgg tcgatgaaaa acttgtggag 660 cagggtgcaa agcgccttgt tcctgttggc atgggagacg atgatcaatg tatcgaagac 720 gacttcactg catggaaaga gttggtgtgg cctgagttgg atcaattact tcgtgatgag 780 gatgatacat ctgttgccac tccatacaca gctgctgttg gagaataccg tgttgtgttc 840 catgacaaac cagagacata tgatcaggat caactgacaa atggccatgc tgttcatgat 900 gctcaacatc catgcagatc caatgtcgct gtcaaaaagg agctccattc ccctctatct 960 gaccggtctt gcactcattt ggaatttgat atctctaata ctggattatc gtatgaaact 1020 ggggaccatg ttggagtcta cgttgagaat ctaagtgaag ttgtggacga agctgaaaaa 1080 ttaataggtt taccgccgca cacttatttc tcagtacata ctgataacga agacgggaca 1140 ccacttggtg gagcctcttt gccacctcct ttccctccat gcactttaag aaaagcattg 1200 gcttcctatg ccgatgtttt gagctctcct aaaaagtcag ctttgcttgc tttagctgct 1260 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cgtgatgtat gggtcgacat ggaacagaag ttgatttccg aagaagacct cgagtaa 2157 <210> 4 <211> 718 <212> PRT <213> Artemisia annua <400> 4 Met Gln Ser Thr Thr Ser Val Lys Leu Ser Pro Phe Asp Leu Met Thr 1 5 10 15 Ala Leu Leu Asn Gly Lys Val Ser Phe Asp Thr Ser Asn Thr Ser Asp 20 25 30 Thr Asn Ile Pro Leu Ala Val Phe Met Glu Asn Arg Glu Leu Leu Met 35 40 45 Ile Leu Thr Thr Ser Val Ala Val Leu Ile Gly Cys Val Val Val Leu 50 55 60 Val Trp Arg Arg Ser Ser Ser Ala Ala Lys Lys Ala Ala Glu Ser Pro 65 70 75 80 Val Ile Val Val Pro Lys Lys Val Thr Glu Asp Glu Val Asp Asp Gly 85 90 95 Arg Lys Lys Val Thr Val Phe Phe Gly Thr Gln Thr Gly Thr Ala Glu 100 105 110 Gly Phe Ala Lys Ala Leu Val Glu Glu Ala Lys Ala Arg Tyr Glu Lys 115 120 125 Ala Val Phe Lys Val Ile Asp Leu Asp Asp Tyr Ala Ala Glu Asp Asp 130 135 140 Glu Tyr Glu Glu Lys Leu Lys Lys Glu Ser Leu Ala Phe Phe Phe Leu 145 150 155 160 Ala Thr Tyr Gly Asp Gly Glu Pro Thr Asp Asn Ala Ala Arg Phe Tyr 165 170 175 Lys Trp Phe Thr Glu Gly Glu Glu Lys Gly Glu Trp 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tatcgcaata caaatattgc tgctgcacct 360 tatggtgaat actggaggcg attacgtaaa ctttgcacat cggagcttat gagtgttaag 420 aaagtaaagt catatcagtc gcttcgtgaa gaggagtgtt ggaatttggt tcaagagatt 480 aaagcttcag gttcagggat accggttaac ctttcagaga acattttcaa gttgattgca 540 acgatacttt gtagagccgc gtttggaaaa ggagtcaagg accagaagga gtgtacggag 600 attatgaaag agatgttgag ggaagttggt ggttttgatg tggcagatat ctttccttcg 660 aagaaatttc ttcatcatct ttcaggcaag agagccaggt taactagcat tcataagaag 720 ctcgataatt ttatcaataa ccttgttgct gagcatactt tcaaaacttc aagtaaaact 780 gaggagacac ttcttgatgt tcttctaagg ctcaaagata gcgctgaatt cccattaaca 840 gctgacaatg ttaaagccat cattttggat atatttgcag cagggacaga cacttcatca 900 accacaatcg aatgggcgat ttcggaactc ataaagtgtc cgagagcgat ggagaaagta 960 caagcagaac tgaggaaagc acttaacgga aaagaaaaga tccatgagga agatattcaa 1020 ggactaagct acttaaactt ggtaatcaaa gaaacattaa ggttgcaccc tccactaccc 1080 ttgttgccaa gagagtgccg tgaaccagtc aatttggctg gatacgacat acccaataag 1140 acaagactta ttgtcaacgt ctttgcgata aatagggacc cagaatactg gaaagacgct 1200 gaaattttca tccccgaacg atttgaaaat agttctacaa ctctcatggg tgcagaatat 1260 gagtatcttc cgtttggagc tgggagaagg atgtgtcctg gagccgcact tggtttagcc 1320 aacgtgcagc taccgctcgc taatatacta tatcatttca actggaaact ccccaacggt 1380 gcgagctatg atcagatcga catgaccgag aggtttggaa tctcggttga aagaaagact 1440 cagttgttac tcgtaccaag tttctag 1467 <210> 6 <211> 488 <212> PRT <213> Artemisia annua <400> 6 Met Ala Leu Ser Leu Thr Thr Ser Ile Ala Leu Ala Thr Ile Leu Phe 1 5 10 15 Phe Val Ile Tyr Lys Phe Ala Thr Arg Ser Lys Ser Thr Lys Asn Ser 20 25 30 Leu Pro Glu Pro Trp Arg Leu Pro Ile Ile Gly His Met His His Leu 35 40 45 Ile Gly Thr Ile Pro His Arg Gly Leu Met Asp Leu Ala Arg Lys Tyr 50 55 60 Gly Ser Leu Met His Leu Gln Leu Gly Glu Val Ser Thr Ile Val Val 65 70 75 80 Ser Ser Pro Lys Trp Ala Lys Glu Ile Leu Thr Thr Tyr Asp Ile Ala 85 90 95 Phe Ala Asn Arg Pro Trp Thr Leu Ala Gly Glu Ile Val Val Tyr Arg 100 105 110 Asn Thr Asn Ile Ala Ala Ala Pro Tyr Gly Glu Tyr Trp Arg Arg Leu 115 120 125 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caagttggtt gcaatgatac ttagtagagc tgcgtttggg aaaagaatca aggaccataa 240 ggagtttacg gagcttgtgg aacagatgtt gagggaactt ggtggttttg atgtggcaga 300 tatctttcct tcgcagaaat ttctacatca tatttcgggc aagagatcta ggttaactag 360 cattcacaaa aagctcgata atttaatcaa taaccttgtt gctgagcata ttgttgaagc 420 ctcaagtaaa actaaggaga cgctccttga tgttcttcta aggcacaaag atagccttga 480 attcccattg acagctgata acgttaaagc catcattttg gtatgaatta atccaatata 540 tttttttttt caaaaggcca taatagtgtt aaacaagctt gaaatttttt ataactaagt 600 acatgcacta actttagtac tcgtgaaaat ataatgagtc atcatagggg ttccatgaaa 660 tatacaggac atgtttacag caggcacaga cacttcgtca accacaatcg aatgggtgat 720 ttcggaactc ataaagtgtc cgagagctat ggagaaaata caagcggaac tgaggaaagc 780 acttaacgga aaagaaaaga tccacgagga agacatccaa gaactaagct acttaaactt 840 ggtaatcaaa gaaacattaa ggttgcaccc tccactaccc ttggttttgc cacgagagtg 900 ccgtcaacca gtcaatttgg ctggatatga catacccaat aagaccaaac ttattgtcaa 960 cgtctttgcg ataaataggg accctgaata ctggaaagac gctgaatctt tcatcccaga 1020 gcgcttctta actctggt 1038 <210> 8 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker peptide <400> 8 Ala Ala Ala Gly Gly Met 1 5 <210> 9 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker peptide <400> 9 Ala Ala Ala Gly Gly Met Pro Pro Ala Ala Ala Gly Gly Met 1 5 10 <210> 10 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker peptide <400> 10 Ala Ala Ala Gly Gly Met 1 5 <210> 11 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker peptide <400> 11 Pro Pro Ala Ala Ala Gly Gly Met 1 5 <210> 12 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker peptide <400> 12 Ile Glu Gly Arg 1 <210> 13 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker peptide <400> 13 Gly Gly Lys Gly Gly Lys 1 5 <210> 14 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> 9, 18, 20 <223> N = C or T <220> <221> misc_feature <222> 11, 14, 17 <223> n = A,T,C or G <400> 14 tccgaccana nggngannan tggag 25 <210> 15 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (13)...(13) <223> N = G or T <220> <221> misc_feature <222> (14)...(14) <223> N = C or T <220> <221> misc_feature <222> (20)...(20) <223> N = A, G or T <220> <221> misc_feature <222> (23)...(23) <223> N = A or G <220> <221> misc_feature <222> 11,17 <223> n = A,T,C or G <400> 15 tccgaccaaa ncnntcnggn atnaa 25 <210> 16 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (9)...(9) <223> N = A or G <220> <221> misc_feature <222> (12)...(12) <223> N = C or T <220> <221> misc_feature <222> (15)...(15) <223> N = A or G <220> <221> misc_feature <222> (18)...(18) <223> N = C or T <220> <221> misc_feature <222> (21)...(21) <223> N = C or T <220> <221> misc_feature <222> (24)...(24) <223> N = C or T <220> <221> misc_feature <222> (27)...(27) <223> N = A or G <400> 16 ccagcacant angancantt naanaanat 29 <210> 17 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (15)...(15) <223> N = C or T <220> <221> misc_feature <222> (21)...(21) <223> N = A or G <220> <221> misc_feature <222> (27)...(27) <223> N = A or G <220> <221> misc_feature <222> 12, 18, 24 <223> n = A,T,C or G <400> 17 ccagcagcca tnccnttngc ntcnccnca 29 <210> 18 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <400> 18 acgtctagaa tgaagagtat actaaaagca atg 33 <210> 19 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <400> 19 acgtctagag cgaaacttgg aacgagtaac aact 34 <210> 20 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <400> 20 atggatccta tgcaatcaac aacttccgtt aagttat 37 <210> 21 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <400> 21 tatgtcgacc catacatcac ggagatatct tcct 34 <210> 22 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <400> 22 ggactagtaa aacaatggcc ctgaccgaag ag 32 <210> 23 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <400> 23 ccaagctttc agatggacat cgggtaaac 29 <210> 24 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <400> 24 ctgccgcggg gccgcaaatt aaagccttc 29 <210> 25 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <400> 25 ctgccgcggt agtacggatt agaagccgc 29 <210> 26 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <400> 26 cgggatccaa aacaatggct gcagaccaat tggtg 35 <210> 27 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <400> 27 gcgtcgactt aggatttaat gcaggtgacg 30 <210> 28 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <400> 28 cgggatccaa aacaatgagc gaagtcggta tacag 35 <210> 29 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <400> 29 gcgtcgactc ataacgaaaa atcagagaaa tttg 34 <210> 30 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <400> 30 ggactagtaa aacaatggct tcagaaaaag aaattag 37 <210> 31 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <400> 31 tcccccgggc tatttgcttc tcttgtaaac 30 <210> 32 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> motif <400> 32 Gln Tyr Glu His Phe Asn Lys Ile 1 5 <210> 33 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> motif <400> 33 Cys Gly Asp Ala Lys Gly Met Ala 1 5

Claims (20)

  1. SEQ ID NO:4의 아미노산 서열을 가지는 시토크롬 P450 환원효소(CPR)를 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리된 폴리뉴클레오티드로서, 상기 CPR은 NADPH에서 아모르파-4,11-디엔 산화효소로 전자를 운반하는 것을 특징으로 하는, 분리된 폴리뉴클레오티드.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제 1 항의 분리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 뉴클레오티드 서열은 프로모터에 작동가능하게 연결되는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
  7. 제 5 항에 있어서, SEQ ID NO:2의 아미노산 서열을 가지는 아모르파-4,11-디엔 산화효소를 코드화하는 핵산을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
  8. 제 1 항의 분리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주세포.
  9. 제 5 항의 재조합 벡터를 포함하는 숙주세포.
  10. 제 7 항의 재조합 벡터를 포함하는 숙주세포.
  11. 제 8 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 숙주세포는 원핵 세포, 효모 세포 또는 식물 세포인 것을 특징으로 하는 숙주세포.
  12. 숙주세포에서 이소프레노이드 화합물을 변형하는 방법으로서, 시토크롬 P450 환원효소(CPR)를 생산하기 위하여 적합한 배지에서 제 8 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항의 숙주세포를 배양하는 단계를 포함하고, 이소프레노이드 화합물의 존재 하에서, 상기 CPR은 NADPH에서 이소프레노이드-변형 효소로 전자를 운반하고, 상기 이소프레노이드-변형 효소는 아모르파-4,11-디엔 산화효소인 것을 특징으로 하는, 숙주세포에서 이소프레노이드 화합물을 변형하는 방법.
  13. 제 12 항에 있어서, 상기 이소프레노이드-변형 효소는 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열을 가지는 아모르파-4,11-디엔 산화효소이고, 아모르파-4,11-디엔 산화효소의 생성은 아모르파-4,11-디엔의 효소적 변형을 유발하는 것을 특징으로 하는 숙주세포에서 이소프레노이드 화합물을 변형하는 방법.
  14. 제 12 항에 있어서, 상기 숙주세포는 메발로네이트 경로를 통해 이소펜테닐 피로포스페이트(IPP)를 정상적으로 합성하지 않는 것이고, 숙주세포는 메발로네이트 경로의 둘 이상의 효소, IPP 이소메라제, 및 프레닐트랜스퍼라제를 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 하나 이상의 핵산을 더 포함하고, 상기 배양하는 단계는 메발로네이트 경로 효소의 생성을 위해 제공되는 것을 특징으로 하는 숙주세포에서 이소프레노이드 화합물을 변형하는 방법.
  15. 제 13 항에 있어서, 상기 숙주세포는 메발로네이트 경로를 통해 이소펜테닐 피로포스페이트(IPP)를 정상적으로 합성하지 않는 것이고, 숙주세포는 메발로네이트 경로의 둘 이상의 효소, IPP 이소메라제, 및 프레닐트랜스퍼라제를 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 하나 이상의 핵산을 더 포함하고, 상기 배양하는 단계는 메발로네이트 경로 효소의 생성을 위해 제공되는 것을 특징으로 하는 숙주세포에서 이소프레노이드 화합물을 변형하는 방법.
  16. 제 14 항에 있어서, 상기 둘 이상의 메발로네이트 경로 효소는 메발로네이트 키나제, 포스포메발로네이트 키나제, 및 메발로네이트 피로포스페이트 디카르복실라제를 포함하고, 숙주세포는 메발로네이트 존재 하에 배양되는 것을 특징으로 하는 숙주세포에서 이소프레노이드 화합물을 변형하는 방법.
  17. 제 15 항에 있어서, 상기 둘 이상의 메발로네이트 경로 효소는 메발로네이트 키나제, 포스포메발로네이트 키나제, 및 메발로네이트 피로포스페이트 디카르복실라제를 포함하고, 숙주세포는 메발로네이트 존재 하에 배양되는 것을 특징으로 하는 숙주세포에서 이소프레노이드 화합물을 변형하는 방법.
  18. SEQ ID NO:4의 아미노산 서열을 가지는 시토크롬 P450 환원효소(CPR)를 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자도입 식물로서, 상기 CPR은 NADPH에서 아모르파-4,11-디엔 산화효소로 전자를 운반하는 것을 특징으로 하는, 유전자도입 식물.
  19. 제 18 항에 있어서, 상기 유전자도입 식물은 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열을 가지는 아모르파-4,11-디엔 산화효소를 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자도입 식물.
  20. 제 18 항 또는 제 19 항에 있어서, 식물은 토바코(tobacco) 또는 아르테미시아 안뉴아(Artemisia annua)인 것을 특징으로 하는 유전자도입 식물.
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