PL224377B1 - Szczep Trichoderma atroviride, sposób otrzymywania i zastosowanie szczepu Trichoderma atroviride jako środka biobójczego - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest nowy szczep Trichoderma atroviride o aktywności biobójczej, zwłaszcza mykopasożytniczej (przeciwgrzybowej) oraz sposób otrzymywania tego szczepu, a także jego zastosowanie jako środka biobójczego, zwłaszcza przeciwgrzybowego. W szczególności szczep według wynalazku ma zastosowanie w rolnictwie jako biofungicyd. Przedmiotem wynalazku jest także kompozycja biobójcza do biologicznego zwalczania niepożądanych organizmów.

Grzyby z rodzaju Trichoderma wykazują naturalne właściwości przeciwgrzybowe. Wiele z nich pasożytuje na grzybach patogennych dla roślin. W wyniku zastosowania metod inżynierii genetycznej opisanych dalej uzyskano przeciwgrzybowe nowe szczepy Trichoderma o wyjątkowych właściwościach przeciwgrzybowych. Znane są również grzyby z rodzaju Trichoderma o naturalnych właściwościach owadobójczych. Na przykład zmodyfikowane metodami inżynierii genetycznej szczepy Trichoderma asperellum mające wyjątkowe właściwości owadobójcze również są objęte wynalazkiem

Trichoderma konstytutywnie wydziela do środowiska niewielkie ilości enzymów hydrolitycznych. Gdy w środowisku wzrostu Trichoderma pojawi się inny grzyb, lub owad, posiadający w ścianie komórkowej polimery cukrowe mogą stać się one substratem dla enzymów hydrolitycznych wydzielanych przez Trichoderma. Ponadto uważa się, Trichoderma wydziela konstytutywnie niewielką ilość egzochitynaz, które natrafiając na ścianę komórkową innego grzyba lub owada odtrawiają cukry od chityny co staje się sygnałem do wzmożonej ekspresji trichodermowych genów kodujących hydrolazy takie jak chitynazy, glukanazy i proteazy, przy czym rodzaj wydzielanych enzymów hydrolitycznych jest zależny od obiektu ataku. W konsekwencji zachodzi hydroliza polimerów ściany obcego grzyba lub owada i dochodzi do jego unicestwienia. W ten sposób Trichoderma atakuje wiele grzybów patogennych dla roślin albo owadów pozostając jednocześnie w symbiozie z rośliną.

Hydrolazy wydzielane przez Trichoderma stanową ważny element ataku Trichoderma na grzyby patogenne dla roślin. Hydrolazy są glikoproteinami i wydajność ich glikozylacji wpływa na ich wydajną produkcję i wydzielanie. Poprzez zwiększenie aktywności syntazy dolichylo fosfomannozy (DPM), kluczowego enzymu procesu O-glikozylacji uzyskano bardziej wydajną, szybszą glikozylację hydrolaz i co za tym idzie zwiększone wydzielanie tych enzymów co spowodowało aktywniejsze trawienie ścian komórkowych organizmu patogennego uzyskując lepsze właściwości biokontrolne. Syntaza DPM nie ma jednak umiejscowienia w szlaku mewalonowym lecz bezpośrednio w procesach glikozylacji białek.

W stanie techniki opisano wykorzystanie właściwości Trichoderma do kontrolowania niepożądanych grzybów niszczących produkcję rolniczą z wykorzystaniem nadekspresji genów kodujących poszczególne enzymy hydrolityczne. W zgłoszeniu patentowym P393021 przedstawiono sposób aktywacji właściwości biokontrolnych Trichoderma, zwłaszcza szczepu biokontrolnego T. atroviride poprzez uaktywnienie procesu O-glikozylacji, pozornie niezwiązanego z wydzielaniem białek sekrecyjnych. Rozwiązanie opisane w zgłoszeniu P393021 oparto na związku między procesem O-glikozylacji i sekrecją enzymów hydrolitycznych (Kruszewska i wsp. 1999).

Modyfikacje eukariotycznej komórki gospodarza, zwłaszcza Saccharomyces cerevisiae, które prowadzą do zwiększonego wytwarzania prekursorów wykorzystywanych przez enzymy szlaku mewalonowego opisano w US2009053797 i W02006014837. Według przytoczonych opisów komórki te są przydatne do wytwarzania różnych produktów, w tym związków izoprenoidowych. Opisane zostały również sposoby wytwarzania izoprenoidów lub prekursorów izoprenoidu w genetycznie zmodyfikowanej komórce gospodarza.

W opisie wynalazku W02006014837 przedstawiono zmodyfikowane genetycznie komórki drożdży Saccharomyces cerevisiae poprzez nadekspresję genu ADS syntazy amorfodienu celem podniesienia aktywności transferazy prenylowej i obniżenia aktywności syntazy skwalenu. W szczególności rozwiązanie to dotyczy transformacji drożdży S. cerevisiae BY4742 plazmidem zawierającym gen ADS a następnie powstały szczep EPY201 transformowano domeną katalityczną HMGR pod prom otorem GAL1 indukowanym galaktozą lub zmutowanymi genami upc2-1 lub ECM22 i ERG20. Ekspresję odnogi sterolowej ograniczono poprzez ekspresje genu ERG9 pod promotorem MET3 regulowanym metioniną. W opisie W02006014837 wymieniono również inne przykładowe organizmy eukariotyczne, których komórki mogą być zmodyfikowane genetycznie. Uzyskane według przytoczonych opisów izoprenoidy izoluje się z komórek rozpuszczalnikami organicznymi, po czym mogą być one dalej oczyszczone metodami chromatograficznymi.

Podobnie, praca A. Janik i wsp. Biochemistry, Genetics and Molecular Biology „Glycosylation” red. S.Petrescu, rozdział 11, publikacja 26 września 2012 r, „Impat of Yeast Glycosylation Pathway on

PL 224 377 B1

Cell Integrity and Morphology”: Biochemistry, Genetics and Molecular Biology „Glycosylation”, s. 261, dotyczy drożdży, a w szczególności szlaków glikozylacji. W pracy tej opisano szlak mewalonowy i udział syntetyzowanych tam związków (dolicholi) w procesach glikozylacji białek i integralności ściany komórkowej drożdży. Zwłaszcza praca dotyczy syntezy fosforanu dolicholu i regulacji tej syntezy. Fosforan dolicholu bierze udział zarówno w glikozylacji jak i w syntezie kotwicy do mocowania białek w ścianie komórkowej, w szlaku mewalonowym. Jednym z intermediatów jest difosforan farnezylu (FPP), który jeżeli ulegnie defosforylacji, hamuje wzrost komórek drożdży S. cerevisiae i C. albicans. Jednym z produktów szlaku jest ergosterol, którego synteza jest hamowana przez niektóre leki przeciwgrzybowe.

Publikacja A.Schuster i in. w Appl. Microbiol. Biotechnol. 2010, 87:787-799 odnosi się ogólnie do zastosowania grzybów strzępkowych jako środków biokontrolnych, lecz nie zawiera żadnej wzmianki, ani nie sugeruje zastosowania T. atroviride.

Żaden z dokumentów ze stanu techniki nie ujawnia, ani nie sugeruje sposobu zwiększania plonów z użyciem Trichoderma.

Wiele roślin użytkowych i ozdobnych co roku ulega uszkodzeniu przez zakażenia grzybowe oraz inne organizmy patogenne. Zakażenia te zwalcza się przy pomocy fungicydów i pestycydów chemicznych, i co za tym idzie wprowadza się do środowiska związki chemiczne. Tego można uniknąć lub ograniczyć stosując rozwiązanie według wynalazku.

Zakażenia Fusarium, Pythium, Botritis cinerea Phytophthora infestans są jednymi z bardziej rozpowszechnionych i prowadzących do całkowitego zamierania roślin. Celem ataku tych grzybów są warzywa, owoce, rośliny ozdobne, drzewa i krzewy. Obok związków chemicznych służących do ochrony roślin można wspomagająco stosować zabiegi biokontrolne. Stwierdzono, że dzięki jedn oczesnemu zastosowaniu preparatów na bazie Trichoderma i tradycyjnych fungicydów można ograniczyć ilość tych drugich nawet o ponad 20%.

Zatem nadal istnieje potrzeba opracowania nowych, bardziej skutecznych, sposobów biologic znej kontroli przeciwgrzybowej upraw i plonów a także biofungicydów, które byłyby nieszkodliwe dla środowiska.

Ponadto nieoczekiwanie stwierdzono, że dzięki zastosowaniu rozwiązania według wynalazku nie tylko opracowano nowy, bardziej skuteczny sposób biokontroli upraw i plonów, ale również uzyskano lepszy wzrost roślin. Niespodziewanie stwierdzono także, że szczep Trichoderma asperellum zmodyfikowany według wynalazku, może mieć zastosowanie jako środek owadobójczy, również jednocześnie poprawiający wzrost roślin.

Zgodnie z wynalazkiem przedstawiono nowy sposób otrzymania szczepów Trichoderma o lepszych właściwościach przeciwgrzybowych i biokontrolnych. Sposób ten opiera się na zwiększeniu syntezy produktów szlaku mewalonowego. Istotą rozwiązania jest zastosowanie modyfikacji Trichroderma atroviride w celu uzyskania zwiększenia właściwości biokontrolnych jednocześnie bez ograniczenia wzrostu rośliny.

Przedmiotem wynalazku jest zmutowany szczep Trichoderma atroviride zawierający dodatkowo rekombinowaną cząsteczkę DNA obejmującą gen ERG20 kodujący syntazę pirofosforanu farnezylu. Korzystnie gen kodujący syntazę pirofosforanu farnezylu pochodzi z Saccharomyces cerevisiae i gen kodujący koduje syntazę pirofosforanu farnezylu o sekwencji nukleotydowej nr 2. Sekwencja aminokwasowa kodowana przez sekwencję nukleotydową nr 1 ma co najmniej 75%, co najmniej 80%, co najmniej 85%, co najmniej 90%, co najmniej 95%, lub 100% identyczności z sekwencją nr 2. W korzystnym rozwiązaniu gen ERG20 z S. cerevisiae jest zintegrowany z genomem Trichoderma atroviride. Korzystnie, gen ERG20 jest zintegrowany z genomem i szczep wykazuje nadekspresję tego enzymu.

Przedmiotem wynalazku jest także sposób otrzymywania szczepu transgenicznego Trichoderma atroviride według wynalazku, w którym wyodrębnia się DNA kodujący syntazę pirofosforanu farnezylu, następnie transformuje się szczep Trichoderma atroviride uzyskanym genem, po czym uzyskuje się nadekspresję syntazy pirofosforanu farnezylu w otrzymanym szczepie transgenicznym. Korzystnie prowadzi się do integracji rekombinowanego DNA kodującego syntazę pirofosforanu farnezylu z genomem Trichoderma atroviride.

Przedmiotem wynalazku jest również sposób zwalczania niepożądanych organizmów w którym stosuje się szczep Trichoderma atroviride z nadeskpresją DNA kodującego syntazę pirofosforanu farnezylu. Korzystnie w sposobie według wynalazku stosuje się szczep Trichoderma atroviride w którym występuje nadeskpresja heterologicznego DNA kodującego syntazę pirofosforanu farnezylu

PL 224 377 B1 z Saccharomyces cerevisiae. Korzystniej zwalcza się choroby grzybowe roślin i plonów. Szczególnie korzystnie zwalcza się Pythium ultimum.

W innej odmianie przedmiotem wynalazku jest sposób zwiększania wzrostu rośliny i/lub wydajności plonów, w którym stosuje się szczep Trichoderma atroviride według wynalazku, z nadeskpresją DNA kodującego syntazę pirofosforanu farnezylu.

Przedmiotem wynalazku jest ponadto kompozycja biobójcza, która zawiera szczep Trichoderma atroviride według wynalazku z nadeskpresją DNA kodującego syntazę pirofosforanu farnezylu. Co więcej, przedmiotem wynalazku jest kompozycja do zwiększania plonów, która zawiera szczep Trichoderma atroviride według wynalazku, w którym występuje nadeskpresja DNA kodującego syntazę pirofosforanu farnezylu.

Szczegółowy opis wynalazku

W szlaku mewalonowym wykorzystywanym przez szczepy według wynalazku produkowany jest między innymi dolichol, który w formie ufosforylowanej bierze udział w procesach glikozylacji a także ergosterol związek wchodzący w skład błon komórkowych i pęcherzyków sekrecyjnych co jest istotne z punktu widzenia sekrecji białek. Ponadto w szlaku mewalonowym produkowane są związki terpenowe o działaniu bakterio- i grzybostatycznym takie jak trichodermin, harzianum A, mycotoxin T2, lignoren, ergokonin A i B czy viridin (Sivasithamparam i Ghisalberti 1998).

Substratem dla powstania wszystkich tych związków w szlaku mewalonowym jest pirofosforan farnezylu (FPP), który jest syntetyzowany przy udziale enzymu syntazy pirofosforanu farnezylu kodowanej przez gen ERG20. Enzym ten ma dwie aktywności: katalizuje reakcję pirofosforanu dimetyloallilu (5-węglowy) z pirofosforanem izopentenylu (5-węglowy) prowadzącą do powstania pirofosforan geranylu, a następnie przeniesienia następnej cząsteczki pirofosforanu izopentenylu na pirofosforan geranylu z utworzeniem pirofosforanu farnezylu (15-węglowy). Pirofosforan farnezylu jest substratem dla wszystkich odnóg szlaku mewalonowego.

Zgodnie z wynalazkiem zwiększenie aktywności przeciwgrzybowej i biokontrolnej Trichoderma atroviride polega na zwiększeniu aktywności syntazy pirofosforany farnezylu. Zwiększenie aktywności syntazy pirofosforany farnezylu osiąga się poprzez nadekspresję w Trichoderma atroviride P1 drożdżowego genu ERG20 kodującego ten enzym. Gen ERG20 jest zintegrowany z genomem T. atroviride w sposób przypadkowy przy użyciu metody transformacji.

W sposobie według wynalazku, korzystnie, przed wprowadzeniem do genomu Trichoderma, gen ERG20 z Saccharomyces cerevisiae powiela się metodą PCR stosując starter ERGBam-U o sekwencji: CGGGATCCATGGCTTCAGAA i starter ERGBam-L o sekwencji: CGGGATCCCTATTTGCTTCTC.

Zastosowana metoda PCR umożliwia uzyskanie odpowiednich końców w powielanym fragmencie DNA, dzięki czemu można go wklonować w konkretne miejsce w plazmidzie. Gen klonuje się pod promotor gpdA (dehydrogenaza aldehydu 3-fosfoglicerynowego) i terminator trpC (syntaza fosforanu indolo-3-glicelolowego) do plazmidu pAN521N. Wybrany promotor i terminator, korzystnie, pochodzi z grzybów nitkowatych, zwłaszcza Aspergillus czyli z grzyba nitkowatego blisko spokrewnionego z Trichoderma. Aby uzyskać wymaganą ekspresję genu klonuje się go pod promotor rozpoznawany przez komórki gospodarza. Grzyby nitkowate są pod tym względem bardzo elastyczne i są w stanie rozpoznać również promotory np. drożdżowe.

Korzystnie, plazmid pAN521N przecina się enzymem restrykcyjnym BamHI, wkleja wstawkę ERG20 (produkt PCR) stosując ligazę T₄ a następnie przecina konstrukt enzymem Ncol, uzyskuje tępe końce działając nukleazą Mung Bean lub nukleazą S1 i dokonuje samoligacji. W sposobie według wynalazku do transformacji T.atroviride, korzystnie, stosuje się metodę kotransformacji mieszanką plazmidów: plazmidem pAN521N niosącym gen ERG20 oraz plazmidem pRMLex_30 niosącym gen oporności na higromycynę B.

Zastosowanie plazmidu pAN521N determinuje użycie enzymu BamHI do cięcia w miejscu gdzie gen zostanie wklonowany. Powstałe dodatkowe miejsce ATG musimy usunąć tnąc plazmid enzymem Ncol i usuwając wolny koniec przy pomocy nukleazy Mung Bean lub nukleazy S1.

Do otrzymania transformantów użyto metody kotransformacji polegającej na użyciu do transformacji mieszaniny dwóch plazmidów, plazmidu zawierającego gen, którego nadekspresję chcemy uzyskać i plazmidu helperowego zawierającego gen markerowy. W tym przypadku korzystnie, pierwszy plazmid zawiera gen ERG20, a drugi gen oporności na Higromycynę B. Plazmidy, korzystnie, stosuje się w stosunku ilościowym 10-15:1 odpowiednio pierwszego plazmidu:plazmidu helperowego.

PL 224 377 B1

Ponieważ stosowanie mieszaniny plazmidów do transformacji ułatwia wchodzenie DNA do komórki grzybów nitkowatych. Transformację, korzystnie, wykonuje się w ten sposób, że transformanty selekcjonuje się na pożywkach z Higromycyną B i 0.1% Tritonem Χ-100. Pożywka powinna zawierać higromycynę B gdyż poszukiwane są transformanty, które nie są na nią wrażliwe i wyrosną na zawierającej ją pożywce. Triton Χ-100 jest natomiast związkiem zapobiegającym rozchodzeniu się kolonii grzyba po całej płytce co umożliwia wyselekcjonowanie pojedynczych transformantów.

Wśród transformantów opornych na higromycynę B wyszukuje się tych z genem ERG20. W tym celu otrzymuje się DNA z transformantów i na tak przygotowanej matrycy metodą PCR namnaża się fragment DNA stosując startery homologiczne do sekwencji drożdżowego genu ERG20. Następnie produkty PCR poddaje się analizie na żelu agarozowym, prążek o wielkości ok. 1200 par zasad izoluje się z żelu a następnie sekwencjonuje. Wykonuje się również dwie kontrolne reakcje PCR: kontrolę pozytywną wykonuje się na matrycy genomowego DNA z S.cerevisiae i kontrolę negatywną na matrycy DNA z rodzicielskiego szczepu T. atroviride P1 (szczep nietransformowany). Sekwencje otrzymane w wyniku sekwencjonowania porównuje się z sekwencją genu ERG20.

DNA z transformantów można również analizować metodą Southern blotting lecz taka analiza jest dłuższa i bardziej kosztowna. Wtedy DNA tnie się enzymem restrykcyjnym, korzystnie EcoRI, poddaje elektroforezie na żelu agarozowym, denaturuje, zobojętnia, przenosi na membranę nylonową i hybrydyzuje z sondą syntetyzowaną na matrycy z genu ERG20 (produkt PCR jak wyżej).

Genomowe DNA można ciąć również innymi enzymami restrykcyjnymi, które nie tną wewnątrz genu ERG20 np. BamHI, Clal, Hpal, Hpall, Ndel, Notl, Pvul, Pvull, Sall, Smal, Sphl, Xbal.

Z transformantów zawierających gen ERG20 otrzymano również całkowite RNA i metodą Northern blotting stwierdzono, że zawierają one transkrypt ERG20 czyli, że doszło do ekspresji wprowadzonego genu. Tak otrzymane i sprawdzone transformanty ERG20 nazwane, SGUL20/10, SGUL59/10, SGUL104/10, SGUL125/10 i SGUL133/10 stosuje się do dalszych badań.

Wynalazek został zilustrowany na rysunku, na którym

Fig. 1. Przedstawia ciąg reakcji w szlaku mewalonowym;

Fig. 2. Przedstawia wpływ ekspresji genu ERG20 kodującego syntazę pirofosforanu farnezylu (FPP) na aktywność enzymu. P1 -szczep kontrolny T.atroviride P1; 20, 59, 104, 125, 133 - transformanty SGUL20/10, SGUL59/10, SGUL104/10, SGUL125/10 i SGUL133/10;

Fig. 3A Przedstawia wzrost szczepów na płytce zawierającej pożywkę minimalną z karboksymetylocelulozą. P1-szczep kontrolny T.atroviride P1; 20, 59, 104, 125, 133 - transformanty SGUL20/10, SGUL59/10, SGUL104/10, SGUL125/10 i SGUL133/10;

Fig. 3B Przedstawia wyniki halo wkoło kolonii rosnącej na płytce z pożywką minimalną z karboksymetylocelulozą. P1-szczep kontrolny T.atroviride P1; 20, 59, 104, 125, 133 - transformanty SGUL20/10, SGUL59/10, SGUL104/10, SGUL125/10 i SGUL133/10;

Fig. 4A Przedstawia aktywność celulaz w pożywce po hodowli grzybów. P1- szczep kontrolny T.atroviride P1; 20, 59, 104, 125, 133 - transformanty SGUL20/10, SGUL59/10, SGUL104/10, SGUL125/10 i SGUL133/10ł

Fig. 4B Przedstawia aktywność N-acetyl-3-D-glukozaminidazy w pożywce po hodowli grzybów. P1-szczep kontrolny T.atroviride P1; 20, 59, 104, 125, 133 - transformanty SGUL20/10, SGUL59/10, SGUL104/10, SGUL125/10 i SGUL133/10

Fig. 5 Przedstawia wydzielanie białek do pożywki podczas hodowli grzybów na pożywce z laktozą. P1-szczep kontrolny T.atroviride P1; 20, 59, 104, 125, 133 - transformanty SGUL20/10, SGUL59/10, SGUL104/10, SGUL125/10 i SGUL133/10;

Fig. 6 Przedstawia wzrost Pythium ultimum na płytkach po hodowli Trichoderma. Pythium wzrost kolonii P. ultimum na czystej płytce, P1- wzrost kolonii P. ultimum na płytkach na których uprzednio hodowano szczep kontrolny T. atroviride P1; 20, 59, 104, 125, 133-wzrost kolonii P. ultimum na płytkach na których uprzednio hodowano szczepy transformowane SGUL20/10, SGUL59/10, SGUL104/10, SGUL125/10 i SGUL133/10

Fig. 7 Przedstawia wzrost Rhizoctonia solani w atmosferze substancji lotnych wydzielanych przez Trichoderma. Rhizoctonia - R. solani hodowana bez Trichoderma; P1 - R. solani hodowana w atmosferze substancji lotnych wydzielanych przez szczep kontrolny P1; 20, 59, 104, 125, 133 - R. solani hodowana w atmosferze substancji lotnych wydzielanych przez transformanty SGUL20/10, SGUL59/10, SGUL104/10, SGUL125/10 i SGUL133/10

Fig. 8 Przedstawia wzrost fasoli Phaseolus vulgaris L. (var: nanus L.) w ziemi zakażonej Pythium ultimum. Kontrola pozytywna (kontrola) oznacza hodowlę roślin w ziemi, która nie była zakażona

PL 224 377 B1 ani Pythium ani Trichoderma. (Pyth) - kontrola negatywna hodowla w ziemi zakażonej tylko Pythium ultimum. Pozostałe słupki pokazują wzrost roślin w ziemi zakażonej Pythium ultimum i szczepami Trichoderma P1 (szczep kontrolny) i transformantami (SGUL20/10, SGUL59/10, SGUL104/10, SGUL125/10 i SGUL133/10) (szare słupki) lub tylko zakażonej szczepami Trichoderma (czarne słupki)

Fig. 9 Przedstawia procent wykiełkowanych nasion Phaseolus vulgaris L. (van nanus L.) obliczony po 10 dniach wzrostu roślin. Kontrola pozytywna (Kontrola) oznacza hodowlę roślin w ziemi, która nie była zakażona ani Pythium ultimum ani Trichoderma. (Pyth) - kontrola negatywna - hodowla w ziemi zakażonej tylko Pythium ultimum. Pozostałe słupki pokazują wzrost roślin w ziemi zakażonej Pythium ultimum i szczepami Trichoderma P1 (szczep kontrolny) i transformantami (SGUL20/10, SGUL59/10, SGUL104/10, SGUL125/10 i SGUL133/10) (szare słupki) lub tylko zakażonej szczepami Trichoderma (czarne słupki)

Fig. 10 Przedstawia wzrost fasoli Phaseolus vulgaris L. (var. nanus L.) w ziemi zakażonej Pythium ultimum. Kontrola pozytywna (kontrola) oznacza hodowlę roślin w ziemi, która nie była zakażona ani Pythium ani Tnichoderma. (Pyth) - kontrola negatywna hodowla w ziemi zakażonej tylko Pythium ultimum. Pozostałe słupki pokazują wzrost roślin w ziemi zakażonej Pythium ultimum i szczepami Trichoderma P1 (szczep kontrolny) i transformantami PZ/06, PZ6/06 i PZ19/06 przedstawione w zgłoszeniu patentowym P393021

Fig. 11 przedstawia sekwencję nukleotydową i aminokwasową syntazy FPP z S. cerevisiae.

Poniżej przedstawiono przykłady wykonania wynalazku.

P r z y k ł a d I. Gen ERG20 z S.cerevisiae powielano metodą PCR stosując starter ERGBam-U o wzorze CGGGATCCATGGCTTCAGAA i starter ERGBam-L o wzorze CGGGATCCCTATTTGCTTCTC

Metoda PCR łańcuchowa reakcja polimerazy polega na wykorzystaniu oligonukleotydowych starterów zaprojektowanych do obu końców DNA, które będzie się powielać i na zastosowaniu cykli temperaturowych ogrzewania - chłodzenia, podczas których zachodzi łączenie starterów z homologicznym DNA i dobudowanie łańcucha nukleotydowego pomiędzy starterami. Podczas następnych cykli temperaturowych nowo zsyntetyzowane DNA staje się matrycą do dalszej syntezy. Uzyskany w ten sposób gen klonowano pod promotor gpdA (dehydrogenaza aldehydu 3-fosfo glicerynowego) i terminator trpC (syntaza fosforanu indolo-3-glicelolowego) do plazmidu pAN521N (Accession number Z32697).

Plazmid pAN521N przecięto enzymem restrykcyjnym BamHI a następnie wligowano wstawkę ERG20 (produkt PCR) stosując T₄ ligazę (Promega). Następnie plazmid przecięto Ncol, wytępiono końce nukleazą Mung Bean (Promega) i poddano selfligacji. Plazmid użyto do transformacji T.atroviride P1. Transformację wykonano według opisu Kubicek-Pranz, E.M., Gruber, F., Kubicek, C.P. (1991) Transformation of Trichoderma reesei with the cellobiohydrolase II gene as a means for obtaining strains with increased cellulase production and specific activity. J.Biotechnol. 20, 83-94 i Mach, R.L., Schindler, M., Kubicek, C.P. (1994) Transformation of Trichoderma reesei based on hygromycin B resistance using homologous expression signals. Curr. Genet. 25, 567-570. Transformanty selekcjonowano na pożywkach z higromycyną B i 0.1% Tritonem X-100.

Wśród transformantów poszukiwano tych z kopią genu ERG20. W tym celu otrzymywano z nich DNA przy użyciu zestawu odczynników „Wizard Genomie DNA purification kit” firmy Promega. Na matrycy DNA z transformantów, przy użyciu primerów ERGBam-U i ERGBam-L otrzymano fragment DNA, który po elektroforezie na żelu agarozowym, poddano sekwencjonowaniu potwierdzając, że otrzymaliśmy DNA ERG20 z drożdży. Tak otrzymane transformanty oznaczone SGUL20/10, SGUL59/10, SGUL104/10, SGUL125/10 i SGUL133/10 użyto do dalszych badań.

Z transformantów niosących kopie genu ERG20 otrzymano również całkowite RNA i kropelkową metodą Northern blotting stwierdzono, że zawierają one transkrypt ERG20 czyli, że doszło do ekspresji wprowadzonego genu. Tak otrzymane i sprawdzone transformanty ERG20 nazwane SGUL20/10, SGUL59/10, SGUL104/10, SGUL125/10 i SGUL133/10 stosowano do dalszych badań.

Dokonana sposobem według wynalazku nadekspresja genu ERG20 spowodowała wzrost aktywności syntazy FPP w komórkach T.atroviride (fig. 2). Fig. 2 pokazuje, że nadekspresja genu ERG20 spowodowała podniesienie aktywności syntazy FPP we frakcjach rozpuszczalnych wszystkich szczepów dochodząc do około 100 % wzrostu w szczepieSGUL104 (104) i SGUL125 (125).

P r z y k ł a d II. Celem rozstrzygnięcia czy transformanty aktywniej hydrolizują polisacharydy, a więc wydzielają więcej hydrolaz lub wydzielane hydrolazy są bardziej aktywne, transformanty poddano wstępnej analizie na pożywkach zawierających złożone źródło węgla karboksymetylocelulozę. Szczepy posiano na środek płytek i każdego dnia mierzono przyrost grzybni. Wyniki pomiarów pokazane

PL 224 377 B1 na wykresie 3A, potwierdzają wzrost grzybów na podłożach zawierających złożone źródła węgla oraz że transformanty rosną intensywniej niż szczep rodzicielski (nietransformowany) co sugeruje, że w ydzielają więcej hydrolaz lub hydrolazy o podwyższonej aktywności.

Zmierzono również halo powstałe wokół kolonii grzybów rosnących na płytce z karboksymetyl ocelulozą. Wielkość halo świadczy o hydrolizie substratu wkoło kolonii. Czym więcej hydrolaz wydziela grzyb tym większe halo wkoło kolonii (fig. 3B).

P r z y k ł a d III. W celu stwierdzenia, czy transformanty wydzielają więcej celulaz czy bardziej aktywne enzymy, oznaczono aktywność celulolityczną w pożywce w czasie hodowli. Wyniki przedstawiono na wykresie 4 A. Zbadano również aktywność N-acetyl-3-D-glukozaminidazy (fig. 4B) obrazującej chitynolityczną aktywność wydzielanych hydrolaz. Aktywność celulaz jak i N-acetyl-3-D-glukozaminidazy w pożywce po hodowli transformantów (SGUL20/10, SGUL59/10, SGUL104/10, SGUL125/10 i SGUL133/10) i szczepu kontrolnego (P1) oznaczano w różnych okresach wzrostu grzybów. Stwierdzono, że celulazy i N-acetyl-3-D-glukozaminidaza wydzielane przez transformanty wykazują wyższą aktywność niż te wydzielane przez szczep dziki P1. Szczepy Trichoderma o wysokiej aktywności chitynolitycznej mogą być stosowane jako bioinsektycydy przeciwko owadom niszczącym plony. Ponieważ zewnętrzny szkielet owadów (kutikula) jest zbudowany w dużej części z chityny hydroliza chityny może zwiększać skuteczność działania bioinsektycydu.

P r z y k ł a d IV. Oznaczono również ilość białka wydzielanego do pożywki przez transformanty i szczep kontrolny. Wyniki wydzielania białka przez transformanty (SGUL20/10, SGUL59/10, SGUL104/10, SGUL125/10 i SGUL133/10) i szczep kontrolny (P1) do pożywki w czasie hodowli przedstawiono na wykresie 5. Na tej podstawie stwierdzono, że ilość wydzielanych białek przez transformanty jest nawet 29% wyższa w porównaniu ze szczepem kontrolnym P1.

P r z y k ł a d V. Sprawdzono, jak wpływają na grzyby patogenne związki wydzielane przez Trichoderma. W tym celu Trichoderma była hodowana na płytkach pokrytych folią celulozową a następnie po zdjęciu folii na tych samych płytkach hodowano Pythium ultimum Wzrost Pythium był poważnie zahamowany przez metabolity wydzielane przez wszystkie szczepy lecz dużo większe hamowanie obserwowane na płytkach na których uprzednio rosły transformanty (fig. 6).

P r z y k ł a d VI. W szlaku mewalonowym powstaje wiele lotnych związków o działaniu przeciwgrzybowym. Hodowano więc patogen roślinny Rhizoctonia solani w atmosferze substancji lotnych wydzielanych przez szczep kontrolny P1 i transformanty. Stwierdzono zwiększone właściwości przeciwgrzybowe związków wydzielanych przez transformanty co spowodowało większe zahamowanie wzrostu patogena fig. 7.

P r z y k ł a d VII Na koniec sprawdzono właściwości biokontrolne otrzymanych szczepów w stosunku do patogena roślin Pythium ultimum. Doświadczenie wykonano na fasoli Phaseolus vulgaris L. (var. nanus L.). Sterylna ziemia była mieszana z grzybnią Pythium ultimum i z grzybnią Trichoderma po 2.g grzybni /1l ziemi. Do tak przygotowanej ziemi wsadzano nasiona fasoli. Po 10 dniach dokonano pomiaru wzrostu roślin (fig. 8) oraz zanotowano ile nasion wykiełkowało (fig. 9). Zakażenie gleby Pythium prawie całkowicie zahamowało wzrost roślin. Rośliny są wyraźnie chronione przed zakażeniem przez wszystkie szczepy Trichoderma lecz w obecności transformantów fasola lepiej rosła w porównaniu do szczepu rodzicielskiego P1.

Poza tym szczepy transformowane w obecności patogena wyraźnie podnosiły procent wykiełkowanych nasion w stosunku do szczepu kontrolnego P1 (fig. 9). Zaobserwowano dodatkowo korzystny wpływ samych szczepów Trichoderma na promocję wzrostu roślin czego nie obserwowano dla szczepów objętych zgłoszeniem P393021. Szczepy według wynalazku powodują nawet o 20% wyższy wzrost roślin w porównaniu do szczepu kontrolnego P1. W obecności patogena (Pythium ultimum) wzrost roślin dorównuje a w przypadku szczepów SGUL20/11, SGUL104/11 i SGUL125/11 przewyższa wzrost niczym nie zakażonych roślin kontrolnych co zanotowano tylko dla jednego szczepu (fig. 10) objętego zgłoszeniem P393021.

Przedstawione tu szczepy zapewniają kompleksowe zwiększenia produkcji wszystkich związków o działaniu przeciwgrzybowym produkowanych w szlaku mewalonowym i jednocześnie inną drogę zwiększenie aktywności procesów glikozylacji niż znane dotychczas w stanie techniki, np. w zgłoszeniu P393021.

Uzyskany nowy szczep T. atroviride zapewnia zwiększenie aktywności syntazy pirofosforany farnezylu prowadzące do zwiększenia aktywności N-acetylo-3-D-glukozaminidazy wydzielonej do podłoża. Ponadto zwiększenie aktywności syntazy pirofosforany farnezylu powoduje zwiększenie aktywności przeciwgrzybowej metabolitów wydzielanych do podłoża. Również zwiększenie aktywności

PL 224 377 B1 syntazy pirofosforany farnezylu powoduje zwiększenie aktywności przeciwgrzybowej związków lotnych wydzielanych podczas wzrostu. Co więcej zwiększenie aktywności syntazy pirofosforany farnezylu powoduje zwiększenie aktywności biokontrolnej przeciwko Pythium ultimum.

Podsumowując, najbardziej spektakularną korzyścią jaką niesie wynalazek jest, zwiększone wydzielanie związków lotnych o charakterze przeciwgrzybowym, zwiększone wydzielanie białek hydro litycznych, zwiększona aktywność celulaz, zwiększone wydzielanie metabolitów wtórnych osiągnięty u transformantów oraz znaczące podniesienie właściwości biokontrolnych transformowanych szczepów w porównaniu do kontroli P1.

Jednocześnie uzyskanie lepszej ochrony roślin przy pomocy szczepów transformowanych nie wiąże się z żadnymi dodatkowymi kosztami związanymi z hodowlą grzyba ani też z żadnymi dodatk owymi manipulacjami.

Claims (14)

1. Zmutowany szczep Trichoderma atroviride zawierający wprowadzoną rekombinowaną cząsteczkę DNA obejmującą gen ERG20 kodujący syntazę pirofosforanu farnezylu.

2. Szczep Trichoderma według zastrz. 1, znamienny tym, że gen kodujący syntazę pirofosforanu farnezylu pochodzi z Saccharomyces cerevisiae.

3. Szczep Trichoderma według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że gen kodujący koduje syntazę pirofosforanu farnezylu o sekwencji nukleotydowej nr 2.

4. Szczep Trichoderma według zastrz. 3, znamienny tym, że sekwencja aminokwasowa kodowana przez sekwencję nukleotydową nr 1 ma co najmniej 75%, co najmniej 80%, co najmniej 85%, co najmniej 90%, co najmniej 95%, lub 100% identyczności z sekwencją nr 2.

5. Szczep Trichoderma według zastrz. 4, znamienny tym, że gen ERG20 z S. cerevisiae jest zintegrowany z genomem Trichoderma atroviride.

6. Szczep Trichoderma według zastrz. 5, znamienny tym, że gen ERG20 jest zintegrowany z genomem i szczep wykazuje nadekspresję tego enzymu.

7. Sposób otrzymywania szczepu transgenicznego Trichoderma atroviride określonego w dowolnym z zastrz. 1-6, znamienny tym, że transformuje się szczep Trichoderma wyodrębnioną cząsteczką DNA kodującą syntazę pirofosforanu farnezylu i uzyskuje się nadekspresję syntazy pirofosforanu farnezylu w otrzymanym szczepie transgenicznym.

8. Sposób wytwarzania szczepu według zastrz. 7, znamienny tym, że prowadzi się do integracji rekombinowanego DNA kodującego syntazę pirofosforanu farnezylu z genomem Trichoderma atroviride.

9. Sposób zwalczania niepożądanych organizmów, znamienny tym, że stosuje się szczep Trichoderma atroviride określony w dowolnym z zastrz. 1-6, w którym występuje nadekspresja DNA kodującego syntazę pirofosforanu farnezylu.

10. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że zwalcza się choroby grzybowe roślin i plonów.

11. Sposób według zastrz. 9-10, znamienny tym, że zwalcza się Pythium ultimum.

12. Sposób zwiększania wzrostu rośliny i/lub wydajności plonów, znamienny tym, że stosuje się szczep Trichoderma atroviride określony w dowolnym z zastrz. 1-6, w którym występuje nadeskpresja DNA kodującego syntazę pirofosforanu farnezylu.

13. Kompozycja biobójcza, znamienna tym, że zawiera szczep Trichoderma atroviride określony w dowolnym z zastrz. 1 -6, w którym występuje nadeskpresja DNA kodującego syntazę pirofosforanu farnezylu.

14. Kompozycja do zwiększania plonów, znamienna tym, że zawiera szczep Trichoderma atroviride określony w dowolnym z zastrz. 1-6, w którym występuje nadekspresja DNA kodującego syntazę pirofosforanu farnezylu.