UA127526C2

UA127526C2 - Спосіб одержання рослини або частини рослини, що характеризується підвищеною стійкістю до твердокрилих комах

Info

Publication number: UA127526C2
Application number: UAA201905492A
Authority: UA
Inventors: Кларенс Майкл РЕЙНОЛДС
Original assignee: Сінгента Партісіпейшнс Аг; Сингента Партисипейшнс Аг
Priority date: 2016-10-27
Filing date: 2017-10-25
Publication date: 2023-09-27
Also published as: PT3531824T; US20200087677A1; MX2019004710A; RU2019115468A; CA3037948A1; CL2019001128A1; AR109844A1; EP3531824B1; ES2929770T3; CN109890201A; RU2019115468A3; EP3531824A1; WO2018081194A1; US11130965B2; CN109890201B; RU2765722C2; EP3531824A4; BR112019008284A2

Abstract

Винахід стосується касети експресії, яка містить промотор, функціонально пов'язаний із гетерологічною молекулою нуклеїнової кислоти. Також винахід стосується молекули нуклеїнової кислоти, трансгенної рослини або її насіниння, вектора, клітини-хазяїна. Крім того, винахід стосується способу одержання рослини або частини рослини, що характеризуються підвищеною стійкістю до твердокрилих комах, способу підвищення стійкості до твердокрилих комах у рослини або частини рослини, способу одержання рослини, яка характеризується підвищеною стійкістю до твердокрилих комах, способу ідентифікації рослини або частини рослини, що характеризуються підвищеною стійкістю до твердокрилих комах, способу здійснення контролю популяції лускокрилих або твердокрилих шкідників.

Description

нуклеїнової кислоти, трансгенної рослини або її насіниння, вектора, клітини-хазяїна.

Крім того, винахід стосується способу одержання рослини або частини рослини, що характеризуються підвищеною стійкістю до твердокрилих комах, способу підвищення стійкості до твердокрилих комах у рослини або частини рослини, способу одержання рослини, яка характеризується підвищеною стійкістю до твердокрилих комах, способу ідентифікації рослини або частини рослини, що характеризуються підвищеною стійкістю до твердокрилих комах, способу здійснення контролю популяції лускокрилих або твердокрилих шкідників.

ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ

Перелік послідовностей у текстовому форматі АЗСІЇ, наданий відповідно до 5 1.821 37

С.Р.К. під назвою "81151 5Т254х" розміром 23 кілобайти, створений 14 вересня 2017 року та поданий за допомогою ЕЕ5-Мер, наданий замість паперової копії. Цей перелік послідовностей у

Б такий спосіб включено за допомогою посилання в опис даного документа для його розкриття.

ГАЛУЗЬ ТЕХНІКИ, ДО ЯКОЇ НАЛЕЖИТЬ ВИНАХІД

Даний винахід стосується галузей білкової інженерії, молекулярної біології рослин і контролю шкідників. Конкретніше даний винахід стосується нового білку і його варіантів, що характеризуються інсектицидною активністю, нуклеїнових кислот, експресія яких зумовлює утворення інсектицидних білків, а також способів одержання і способів застосування інсектицидних білків і відповідних нуклеїнових кислот для контролю комах.

ПЕРЕДУМОВИ ВИНАХОДУ

Комахи-шкідники є головною причиною втрат урожаю. Лише у США щорічні втрати, спричинені зараженням різними видами комах, становлять мільярди доларів. Додатково до втрат врожаю польових культур, комахи-шкідники також є негативним фактором для плантаторів, які вирощують овочі та фрукти, фахівців із вирощування декоративних квітів, і вони є неприємністю для садівників і домовласників.

Найбільш згубними шкідниками кукурудзи вважаються різні види кукурудзяного кореневого жука. У Сполучених Штатах трьома важливими видами є Оіабгоїфса мігдітега мігдіїега, західний кукурудзяний кореневий жук, 0. Іопдісогттів Бабе"гі, північний кукурудзяний кореневий жук, і р. ипаесітрипсіаїа Ппоагаї, південний кукурудзяний кореневий жук. Основними шкідниками кукурудзи у кукурудзяному поясі США вважаються лише західний і північний кукурудзяні кореневі жуки. Додатково важливим кореневим жуком-шкідником кукурудзи в південних штатах

США є мексиканський кукурудзяний кореневий жук Оіарбгоїїса мігуїтега 7еае. Найбільш істотну шкоду рослині спричиняють личинки кукурудзяного кореневого жука, оскільки вони поїдають фактично лише корені кукурудзи. Це ураження виражається у збільшенні вилягання рослин, зниженні врожаю зерна і рослинної маси, а також у зміні вмісту поживних речовин у зерні.

Поїдання личинками також опосередковано впливає на кукурудзу через те, що в результаті в коренях відкриваються ходи для заражень бактеріями та грибами, що призводить до

Зо захворювань, які виражаються у гнитті кореня й стебла. Дорослі особини кукурудзяного кореневого жука активні на кукурудзяних полях пізно влітку, коли вони поїдають качани, рильця і пилок, що заважає нормальному запиленню.

Кукурудзяних кореневих жуків контролюють здебільшого шляхом посиленого застосування хімічних пестицидів, які проявляють активність, пригнічуючи ріст комах, запобігаючи поїданню комахами або їх розмноженню або спричиняючи загибель. Таким чином можна досягти належного контролю кукурудзяного кореневого жука, однак іноді ці хімічні речовини також можуть впливати й на інші, корисні організми. Іншою проблемою, що виникає в результаті широкого застосування хімічних пестицидів, є виникнення стійких видів комах. Ще одна проблема спричинена тим фактом, що личинки кукурудзяного кореневого жука харчуються під землею, що ускладнює нанесення "рятувальних" обробок інсектицидами. Через це нанесення інсектицидів здебільшого здійснюється профілактично під час посіву. Результатом такої практики є велике навантаження на навколишнє середовище. Частково це навантаження послаблюють завдяки застосуванню різних способів ведення фермерського господарства, однак існує зростаюча потреба в альтернативних механізмах контролю шкідників.

Біологічні засоби для контролю шкідників, такі як штами Васійи5 Іпигіпдіепвів (ВО, що експресують пестицидні токсини, як, наприклад, б-ендотоксини (дельта-ендотоксини; які також називають кристалічними токсинами або білками Сгу), були застосовані до сільськогосподарських культур із задовільними результатами щодо комах-шкідників. б- ендотоксини являють собою білки, що містяться у кристалічній матриці, які, як відомо, характеризуються інсектицидною активністю під час поглинання деякими комахами. Декілька нативних білків Сгу із Васійи5 (игіпдіепзі5 або сконструйованих білків Сту було експресовано у трансгенних сільськогосподарських культурах і використовувалося з комерційною метою для контролю певних лускокрилих і твердокрилих комах-шкідників. Наприклад, починаючи з 2003 року, У США комерційно доступні трансгенні гібриди кукурудзи, які контролюють кукурудзяного кореневого жука за допомогою експресії білка СгузвьЬ1, СтуЗз4АрІТ/Стуз5АБІ або модифікованого білка СтгузА (тсСтгузА) або СтузАБ (еСтгузЗ.1АБ).

Хоча було показано, що використання трансгенних рослин, що експресують білки Сгу, є надзвичайно ефективним, відомі комахи-шкідники, які тепер характеризуються стійкістю до білків Сгу, що експресуються у деяких трансгенних рослинах. Отже, і надалі існує необхідність в бо ідентифікації нових і ефективних засобів для контролю шкідників, які забезпечують економічну вигоду фермерам і є екологічно прийнятними. Особливо необхідними є білки, які токсичні щодо видів Юіабгоїїса, головного шкідника кукурудзи, спосіб дії яких відрізняється від наявних продуктів для контролю комах як засобів для ослаблення розвитку стійкості. Крім того, необхідна доставка засобів для контролю комах за допомогою продуктів, які мінімізують навантаження на навколишнє середовище, як і за допомогою трансгенних рослин. стислии опис

З огляду на ці потреби даний винахід передбачає нові інсектицидні білки, а саме

НтавзсСМу, і білки, які значною мірою ідентичні Нтаб5х5СЕМУ і його варіантам. Білки за даним винаходом характеризуються токсичністю щодо кукурудзяного кореневого жука (Оіаргоїйїса 5рр).

Білки за даним винаходом також можуть характеризуватися токсичністю щодо інших твердокрилих та/або лускокрилих. Даний винахід додатково стосується молекул нуклеїнової кислоти, які кодують Нтазх5СЕМу або його варіанти, комплементарних їм послідовностей або молекул, які значною мірою ідентичні Нтаз5зСЕМУ і його варіантам.

Даний винахід також передбачає вектори, що містять такі рекомбінантні (або комплементарні їм) нуклеїнові кислоти; рослину або мікроорганізм, які містять і забезпечують експресію таких нуклеїнових кислот; рослини, трансформовані такими нуклеїновими кислотами, наприклад трансгенні рослини кукурудзи; потомство таких рослин, яке містить нуклеїнові кислоти, стабільно вбудовані і успадковувані за менделівським принципом, і/або насіння таких рослин і такого потомства. Даний винахід також передбачає способи селекції для введення трансгена, що містить молекулу нуклеїнової кислоти за даним винаходом, у потомство рослини і у різні зародкові плазми.

Даний винахід також передбачає композиції та склади, що містять Нітає5СКУМ або його варіанти, які можуть пригнічувати здатність комах-шкідників виживати, рости та/або розмножуватись або обмежувати пов'язані з комахами шкоду або втрату врожаю сільськогосподарських культур, наприклад, застосовуючи Нітаз5СЕМУ або його варіанти як частину композицій або складів щодо заражених комахами зон або рослин або для профілактичної обробки чутливих до комах зон або рослин для забезпечення захисту від комах- шкідників.

Даний винахід додатково стосується способу одержання Нітаз5СКУМ або його варіантів і способів застосування нуклеїнових кислот, наприклад, у мікроорганізмах для контролю комах або в трансгенних рослинах для забезпечення захисту від шкоди, якої завдають комахи.

Описані в даному документі нові білюи є активними щодо комах. Наприклад, у варіантах здійснення білки за даним винаходом можуть застосовуватись для контролю економічно важливих комах-шкідників, зокрема твердокрилих комах, таких як західний кукурудзяний кореневий жук (МУСК), північний кукурудзяний кореневий жук (МОСК), південний кукурудзяний кореневий жук (ЗСК) і/або мексиканський кукурудзяний кореневий жук (О. мігдіїега 7еає).

Інсектицидні білки за даним винаходом можуть застосовуватись окремо або у комбінації з іншими стратегіями для контролю комах, щоб забезпечити підвищену ефективність контролю шкідників щодо тих самих комах-шкідників і/або розширити спектр цільових комах із мінімальним впливом на навколишнє середовище.

Інші аспекти та переваги за даним винаходом стануть очевидними для фахівців у даній галузі в результаті розгляду наступного опису даного винаходу та необмежувальних прикладів.

СТИСЛИЙ ОПИС ПОСЛІДОВНОСТЕЙ У ПЕРЕЛІКУ ПОСЛІДОВНОСТЕЙ

ЗЕО ІЮ МО: 1 являє собою нативну нуклеотидну послідовність НіпаззСЕМУ.

ЗЕО ІЮ МО: 2 являє собою оптимізовану нуклеотидну послідовність Нітаз5СЕМУ Е. соїї.

ЗЕО ІО МО: З являє собою нуклеотидну послідовність Нітахз5СЕМУ, кодон-оптимізовану для маїсу.

ЗЕО ІЮ МО: 4 являє собою амінокислотну послідовність Нтаз5СЕМУ.

ЗЕО ІЮ МО: 5 являє собою фрагмент амінокислотної послідовності Нтаз5СЕМУ.

ЗЕО ІЮ МО: 6 являє собою альтернативну нативну нуклеотидну послідовність Нтаз5СЕМУ.

ЗЕО ІЮ МО: 7 являє собою оптимізовану нуклеотидну послідовність Е. соїї під ЗХЕО ІЮ МО: 6.

ЗЕО ІЮО МО: 8 являє собою нуклеотидну послідовність, оптимізовану для маїсу, під 5ЕО ІЮ

МО: 6.

ЗЕО ІЮ МО: 9 являє собою амінокислотну послідовність під ЗЕО ІЮ МО: 6.

ВИЗНАЧЕННЯ

Для ясності певні терміни, застосовувані в даному описі, визначено й представлено, як указано далі. "Активність" інсектицидних білків за даним винаходом означає, що інсектицидні білки функціонують як активні під час перорального поглинання засоби для контролю комах, бо характеризуються токсичним ефектом і/або здатні порушувати або стримувати поїдання комахами, що може спричиняти або не спричиняти смерть комахи. У разі, якщо інсектицидний білок за даним винаходом доставляється в організм комахи, то результатом зазвичай є загибель комахи або ж комаха не поїдає джерело, яке робить інсектицидний білок доступним для комахи. "Пестицидною" називається токсична біологічна активність, здатна здійснювати контроль шкідника, такого як комаха, нематода, гриб, бактерії або вірус, переважно шляхом їхнього знищення або руйнування. "Інсектицидною" називають токсичну біологічну активність, здатну до контролю комах, переважно шляхом їхнього знищення. "Пестицидний засіб" являє собою засіб, який характеризується пестицидною активністю. "Інсектицидний засіб" являє собою засіб, який характеризується інсектицидною активністю.

Термін "асоційована з/функціонально пов'язана" стосується двох нуклеїнових кислот, які пов'язані фізично або функціонально. Наприклад, говорять, що промотор або регуляторна послідовність ДНК "асоційовані з" послідовністю ДНК, яка кодує РНК або білок, якщо ці дві послідовності функціонально пов'язані або розташовані таким чином, що регуляторна послідовність ДНК буде впливати на рівень експресії кодувальної або структурної послідовності

ДНК. "Кодувальна послідовність" являє собою послідовність нуклеїнової кислоти, яка транскрибується в РНК, таку як тЕМА, геЕМА, їКМА, 5пЕМА, сенсова РНК або антисенсова РНК.

Переважно РНК потім транслюється в організмі з продукуванням білка. "Контролювати" комах означає пригнічувати за допомогою токсичного ефекту здатність комах-шкідників до виживання, росту, поїдання і/або розмноження або обмежувати пов'язані з комахами шкоду або втрату врожаю сільськогосподарських культур. "Контроль" комах може означати або може не означати знищення комах, хоча переважно означає знищення комах. "Доставляти" інсектицидний білок означає, що інсектицидний білок вступає в контакт із комахою, що зумовлює токсичний ефект і контроль комахи. Інсектицидний білок може бути доставлений багатьма відомими шляхами, наприклад, за допомогою трансгенної рослини, що експресує інсектицидний білок, складеної(-их) композиції(-й) з білком, розпилюваної(-их) композиції(-й) з білюом, матриці з приманкою або за допомогою будь-якої іншої відомої з рівня техніки системи для доставки токсину. "Ефективна для контролю комах кількість" означає концентрацію інсектицидного білка, яка пригнічує за допомогою токсичного ефекту здатність комах виживати, рости, поїдати і/або розмножуватись або обмежує пов'язані з комахами шкоду або втрату врожаю сільськогосподарських культур. "Ефективна для контролю комах кількість" може означати або може не означати знищення комах, хоча переважно воно означає знищення комах. "Касета експресії", використовувана у даному документі, означає послідовність нуклеїнової кислоти, здатну спрямовувати експресію конкретної нуклеотидної послідовності у відповідну клітину-хазяїна, що містить промотор, функціонально пов'язаний із нуклеотидною послідовністю, що становить інтерес, яка функціонально пов'язана із сигналами термінації.

Вона також зазвичай містить послідовності, необхідні для правильної трансляції нуклеотидної послідовності. Щонайменше один із компонентів касети експресії, що містить нуклеотидну послідовність, яка становить інтерес, може бути гетерологічним щодо щонайменше одного з інших її компонентів. Касета експресії може також являти собою послідовність, яка існує в природі, але була одержана в рекомбінантній формі, придатній для гетерологічної експресії.

Однак зазвичай касета експресії є гетерологічною щодо хазяїна, тобто конкретна послідовність нуклеїнової кислоти в касеті експресії не наявна в клітині-хазяїні в природі, та її необхідно було ввести в клітину-хазяїна або предка клітини-хазяїна за допомогою події трансформації.

Експресія нуклеотидної послідовності у касеті експресії може перебувати під контролем конститутивного промотора або індуковного промотора, який індукує транскрипцію лише тоді, коли клітина-хазяїн зазнає впливу деякого певного зовнішнього стимулу. У випадку багатоклітинного організму, такого як рослина, промотор також може бути специфічним щодо конкретної тканини, або органа, або стадії розвитку.

Касета експресії, яка містить нуклеотидну послідовність, що становить інтерес, може бути химерною, а це означає те, що принаймні один з її компонентів є гетерологічним щодо щонайменше одного з інших її компонентів. Касета експресії також може являти собою таку, яка містить нативний промотор, що керує її нативним геном, однак вона була одержана в рекомбінантній формі, застосовній для гетерологічної експресії. Таке використання касети експресії забезпечує те, що вона не трапляється в природі в клітині, в яку була введена.

Касета експресії також може необов'язково містити ділянку термінації транскрипції та/або трансляції (тобто ділянку термінації), що функціонує у рослин. Різноманітні термінатори транскрипції доступні для застосування в касетах експресії, і вони відповідають за термінацію бо транскрипції за межами гетерологічної нуклеотидної послідовності, що становить інтерес,

і правильне поліаденілювання ткМА. Ділянка термінації може бути нативною щодо ділянки ініціації транскрипції може бути нативною щодо функціонально пов'язаної нуклеотидної послідовності, що становить інтерес, може бути нативною щодо рослини-хазяїна або може бути одержаною від іншого джерела (тобто бути чужорідною або гетерологічною щодо промотора, нуклеотидної послідовності, що становить інтерес, рослини-хазяїна або будь-якої їх комбінації).

Відповідні термінатори транскрипції включають без обмеження термінатор 355 Саму, термінатор гена іті, термінатор гена нопалінсинтази і/або термінатор гена грс5-Е9 гороху.

Їх можна застосовувати як в однодольних, так і у дводольних рослин. Додатково можна застосовувати нативний термінатор транскрипції кодувальної послідовності. У контексті даного винаходу може застосовуватись будь-який доступний термінатор, щодо якого відомо, що він функціонує у рослинах.

Термін "експресія" у разі використання із посиланням на полінуклеотид, такий як ген, ОКЕ або її частину або трансген у рослинах, стосується процесу перетворення генетичної інформації, кодованої геном, на РНК (наприклад, теМА, геМА, їЕМА або зпеЕМА) за допомогою "транскрипції" гена (тобто завдяки ферментативній дії РНК-полімерази) і на білок, якщо це застосовується (наприклад, якщо ген кодує білок), за допомогою "трансляції" тЕМА. Експресія гена може регулюватися на багатьох стадіях під час цього процесу. Наприклад, у випадку антисенсових конструкцій або конструкцій а5КМА відповідно, експресія може стосуватися транскрипції лише антисенсової РНК або лише а5еЕМА. У варіантах здійснення "експресія" стосується транскрипції та стійкого накопичення сенсової (пЕМА) або функціональної РНК. "Експресія" може також стосуватися продукування білка. "Ген" являє собою певну ділянку, яка розташована всередині генома та містить кодувальну послідовність нуклеїнової кислоти і зазвичай також містить інші, передусім регуляторні, нуклеїнові кислоти, відповідальні за контроль експресії, інакше кажучи транскрипції та трансляції, кодувальної частини. Ген може також містити інші 5- їі 3'-нетрансльовані послідовності й послідовності термінації. Додатковими елементами, які можуть бути наявними, є, наприклад, інтрони. Регуляторна послідовність нуклеїнової кислоти гена в нормі може не бути функціонально пов'язаною з асоційованою послідовністю нуклеїнової кислоти, як це трапляється в природі, й у такому разі ген буде химерним геном.

Зо "Ген, що становить інтерес" стосується будь-якої молекули нуклеїнової кислоти, яка у разі переносу в рослину надає рослині необхідної ознаки, такої як стійкість до антибіотиків, стійкість до вірусів, стійкість до комах, стійкість до захворювань або стійкість до інших шкідників, толерантність до гербіцидів, толерантність до абіотичного стресу, чоловіча стерильність, модифікований метаболізм жирних кислот, модифікований метаболізм вуглеводів, поліпшена харчова цінність, поліпшені характеристики щодо промислового способу або змінена репродуктивна здатність. "Ген, що становить інтерес" також може бути таким, який переносять у рослини для одержання комерційно цінних ферментів або метаболітів у рослині. "Гетерологічна" послідовність нуклеїнової кислоти або молекула нуклеїнової кислоти являє собою послідовність нуклеїнової кислоти або молекулу нуклеїнової кислоти, яка в природі не асоційована з клітиною-хазяїном, у яку її вводять, зокрема множинні копії, що не існують у природі, послідовності нуклеїнової кислоти, що існує в природі. Гетерологічна послідовність нуклеїнової кислоти або молекула нуклеїнової кислоти може містити химерну послідовність, таку як химерна касета експресії, де промотор і кодувальна ділянка одержані з декількох вихідних організмів. Послідовність промотора може являти собою послідовність конститутивного промотора, послідовність тканиноспецифічного промотора, послідовність хімічно індуковного промотора, послідовність індуковного ушкодженням промотора, послідовність індуковного стресом промотора або послідовність специфічного для стадії розвитку промотора. "Гомологічна" послідовність нуклеїнової кислоти являє собою послідовність нуклеїнової кислоти, у природних умовах пов'язану з клітиною-хазяїном, в яку її вводять. "Гомологічна рекомбінація" являє собою взаємний обмін фрагментами нуклеїнової кислоти між гомологічними молекулами нуклеїнової кислоти. "Ідентичність" або "відсоток ідентичності" стосується ступеня подібності між двома послідовностями нуклеїнових кислот або послідовностями білка. Під час порівняння послідовностей одна послідовність зазвичай виступає як еталонна послідовність, з якою порівнюють тестовані послідовності. Під час використання алгоритму порівняння послідовностей тестовану і еталонну послідовності вводять у комп'ютер, за необхідності задають координати підпослідовності і задають програмні параметри алгоритму порівняння послідовностей. Потім за допомогою алгоритму порівняння послідовностей на основі заданих бо програмних параметрів обчислюють відсоткову ідентичність послідовностей для тестованої(-их)

послідовності(-ей) щодо еталонної послідовності. Фраза "значною мірою ідентичні" у контексті двох послідовностей нуклеїнових кислот або двох амінокислотних послідовностей стосується двох або більше послідовностей або підпослідовностей, які характеризуються щонайменше приблизно 5095 ідентичністю за нуклеотидами або амінокислотними залишками під час порівняння та вирівнювання для максимальної відповідності, що визначають із застосуванням одного з наступних алгоритмів порівняння послідовностей або шляхом візуального огляду. У певних варіантах здійснення значною мірою ідентичні послідовності характеризуються щонайменше приблизно 60 95, або щонайменше приблизно 70 95, або щонайменше приблизно 80 95, або щонайменше приблизно 85 95, або навіть щонайменше приблизно 90 95 або 95 95 ідентичністю за нуклеотидами або амінокислотними залишками. У певних варіантах здійснення значний ступінь ідентичності наявний у межах ділянки послідовностей, довжина якої становить щонайменше приблизно 50 залишків, або в межах ділянки, що складається із щонайменше приблизно 100 залишків, або послідовності значною мірою ідентичні в межах щонайменше приблизно 150 залишків. У додаткових варіантах здійснення послідовності є значною мірою ідентичними, якщо вони ідентичні по всій довжині кодувальних ділянок.

Оптимальне вирівнювання послідовностей для порівняння можна проводити, наприклад, за допомогою алгоритму пошуку локальної гомології із Зтіййп 8 УМаїегтап, Адм. Аррі. Маф. 2: 482 (1981), за допомогою алгоритму гомологічного вирівнювання згідно з МееаІєтап 8 УмМип5сй, 9.

МОЇ. Віої. 48: 443 (1970), за допомогою способу пошуку схожості згідно з Реагхоп 8. І іртап, Ргос. маг. Асад. 5сі. ОБА 85: 2444 (1988), за допомогою програмної реалізації цих алгоритмів (САР,

ВЕЗТРЕЇТ, ЕА5ЗТА ії ТЕА5ТА із УмМізсопзіп Сепеїіс5 Зопймаге РасКаде, Сепеїййс5 Сотршег сгоир, 575 Зсієпсе Ог., Медісон, Вісконсин, США) або за допомогою візуального огляду (див. загалом

А!Їйзибеї ет аїЇ. нижче).

Одним із прикладів алгоритму, придатного для визначення відсоткової ідентичності послідовностей і схожості послідовностей, є алгоритм ВІ А5Т, описаний в Аїйї5БспиЇ еї аї.,.. Мо).

Віої. 215: 403-410 (1990). Програмне забезпечення для проведення аналізів ВІ А5Т загальнодоступне через Національний центр біотехнологічної інформації (пер:/Лумли. порі. піт.пій.дом/). Даний алгоритм передбачає спочатку ідентифікацію пар послідовностей із високим показником подібності (НОР) шляхом ідентифікації коротких "слів"

Зо довжиною МУ у запитуваній послідовності, які або збігаються, або задовольняють деякий позитивний граничний показник Т під час вирівнювання зі "словом" такої ж довжини в послідовності з бази даних. Т називається граничним значенням показника сусіднього "слова" (Ай5спиц! еї аї., 1990). Ці первинні збіги сусідніх "слів" слугують як затравка, щоб ініціювати пошуки для виявлення Н5оР більшої довжини, які їх містять. Збіги "слів" потім продовжуються в обох напрямках уздовж кожної послідовності настільки, наскільки може бути збільшений сукупний показник вирівнювання. Сукупні показники розраховують із застосуванням для нуклеотидних послідовностей параметрів М (бал-нагорода, що нараховують за пару залишків, які збігаються; завжди »0) і М (штрафний бал, що нараховують за залишки, які не збігаються; завжди «0). Для амінокислотних послідовностей для розрахунків сукупного показника використовують матрицю замін. Продовження збігів "слів" у кожному напрямку припиняється, якщо сукупний показник вирівнювання знижується на величину Х від свого максимального досягнутого значення, при цьому сукупний показник падає до нуля або нижче внаслідок накопичення одного або декількох вирівнювань залишків із від'ємними показниками або в разі досягнення кінця однієї з послідовностей. Параметри алгоритму ВГАБ5Т МУ, Т ї Х визначають чутливість і швидкість вирівнювання. Програма ВГА5ТМ (для нуклеотидних послідовностей) стандартно використовує довжину "слова" (М/), що становить 11, очікуване значення (Е), що становить 10, граничне значення, що становить 100, М-5, М- -4, а також порівняння обох ниток.

Для амінокислотних послідовностей програма ВІАБТР використовує за замовчуванням довжину "слова" (М/), що становить 3, очікуване значення (Е), яке становить 10, і матрицю замін

БО ВГОБИМВбАІ2 (див. Непікоїї 4. Непікоїї, Ргос. Маї!. Асад. 5сі. ОБА 89: 10915 (1989)).

Додатково до розрахунків відсоткової ідентичності послідовностей алгоритм ВІГА5ЗТ також виконує статистичний аналіз подібності між двома послідовностями (див., наприклад, Кагіїп 8.

АБС, Ргос. Магі. Асай. Зсі. ОБА 90: 5873-5787 (1993)). Одним показником подібності, наданим алгоритмом ВІ А5Т, є найменша сумарна ймовірність (Р(М)), яка передбачає показник імовірності, згідно з яким збіги між двома нуклеотидними або амінокислотними послідовностями будуть спостерігатися випадковим чином. Наприклад, тестована послідовність нуклеїнової кислоти вважається подібною до еталонної послідовності, якщо найменша сумарна ймовірність у разі порівняння тестованої послідовності нуклеїнової кислоти з еталонною послідовністю нуклеїнової кислоти становить менше від приблизно 0,1, більш переважно менше від приблизно 60 0,01 і найбільш переважно менше від приблизно 0,001.

Іншою широко використовуваною і поширеною комп'ютерною програмою для виконання вирівнювань послідовностей є С ОБЗТАГ МУ м1.6 (Тпотрзоп, еї аІ. Мис. Асіаз Вез., 22: 4673-4680, 1994). Кількість основ, які збігаються, або амінокислот ділять на загальну кількість основ або амінокислот і множать на 100 з одержанням відсотка ідентичності. Наприклад, якщо б дві послідовності із 580 пар основ збігалися на 145 основ, тоді вони були б ідентичними на 25 відсотків. Якщо дві порівнювані послідовності мають різну довжину, тоді число збігів ділять на більш коротку з двох довжин. Наприклад, якщо було 100 амінокислот, що збігаються, у білках із 200 і 400 амінокислот, тоді вони ідентичні на 50 відсотків щодо більш короткої послідовності.

Якщо довжина більш короткої послідовності становить менше від 150 основ або 50 амінокислот, тоді число збігів ділять на 150 (у разі нуклеїнових основ) або 50 (у разі амінокислот) і множать на 100 з одержанням відсотка ідентичності.

Іншим показником того, що дві нуклеїнові кислоти є значною мірою ідентичними, слугує те, що ці дві молекули гібридизуються одна з одною у жорстких умовах. Фраза "гібридизується специфічно з" стосується зв'язування, утворення дуплекса або гібридизації молекули лише з певною нуклеотидною послідовністю у жорстких умовах, коли така послідовність наявна у складній суміші (наприклад, спільних клітинних) ДНК або РНК. "Значною мірою зв'язується" стосується комплементарної гібридизації між нуклесовою кислотою-зондом і цільовою нуклеїновою кислотою і охоплює незначні розбіжності, які можуть бути виправлені завдяки зниженню жорсткості середовища для гібридизації, щоб домогтися необхідного виявлення цільової послідовності нуклеїнової кислоти. "Жорсткі умови гібридизації" і "жорсткі умови відмивання під час гібридизації" у контексті експериментів із гібридизації нуклеїнових кислот, таких як саузерн- і нозерн-гібридизації, залежать від послідовності і відрізняються за різних параметрів навколишнього середовища.

Довші послідовності специфічно гібридизуються за вищих температур. Докладний посібник із гібридизації нуклеїнових кислот можна знайти в Тібб5еп (1993) Іабогаїогу Тесппідцев5 іп

Віоспетівігу апа Моїіесшіаг Віоіоду-Нурвгіадігацоп м/йп Мисієїс Асій Ргоре5 частина І, глава 2 "Омегмієм ої ргіпсірієв ої пубгідіганоп апа Ше вігаіеду ої писієїс асіа ргобе аззауз" ЕІбемівг, Мем/

Уогк. Зазвичай умови гібридизації і відмивання високої жорсткості вибирають таким чином, щоб температура була приблизно на 59С нижче від точки плавлення (Тт) для конкретної

Зо послідовності за визначеної іонної сили та значення рН. Зазвичай за "жорстких умов" зонд буде гібридизуватись зі своєю цільовою послідовністю, але не буде з жодними іншими послідовностями.

Значення Тт являє собою температуру (за визначеної іонної сили та значення рН), за якої 50 95 цільової послідовності гібридизується із зондом, що абсолютно збігається. Для дуже жорстких умов вибирають температуру, рівну Тя для конкретного зонда. Прикладом жорстких умов гібридизації для гібридизації комплементарних нуклеїнових кислот, які мають більш ніж 100 комплементарних залишків на фільтрі у саузерн- або нозерн-блоті, є 50 95 формамід з 1 мг гепарину за 422С, при чому гібридизація проводиться протягом ночі. Прикладом умов відмивання високої жорсткості є 0,15 М Масі за 7229С протягом приблизно 15 хвилин.

Прикладом жорстких умов відмивання є відмивання за допомогою 0,2х 55С за 65 "С протягом 15 хвилин (див. БатргоокК нижче щодо опису буфера 550). Часто для позбавлення від фонового сигналу зонда відмиванню за умов високої жорсткості передує відмивання за умов низької жорсткості. Прикладом умов відмивання середньої жорсткості для дуплекса, наприклад, із більш ніж 100 нуклеотидами є їх 55С за 4529С протягом 15 хвилин. Прикладом умов відмивання низької жорсткості для дуплекса, наприклад, із більш ніж 100 нуклеотидами є 4-6бх 5БЗС за 40 "С протягом 15 хвилин. Для коротких зондів (наприклад, довжиною від приблизно 10 до 50 нуклеотидів) жорсткі умови зазвичай передбачають концентрації солей, що становлять менш ніж приблизно 1,0 М іонів Ма, зазвичай концентрацію, що становить приблизно 0,01-1,0 М іонів Ма (або інших солей), за рН 7,0-8,3, а також температуру, що зазвичай становить щонайменше приблизно 30 9С. Жорсткі умови також можуть бути досягнуті з додаванням дестабілізуючих засобів, таких як формамід. Загалом співвідношення сигнал-шум, що у 2 (або більше) рази перевищує спостережуване для незв'язаного зонда під час конкретного гібридизаційного аналізу, вказує на виявлення специфічної гібридизації. Нуклеїнові кислоти, які не гібридизуються одна з одною у жорстких умовах, усе ще є значною мірою ідентичними, якщо білки, які вони кодують, значною мірою ідентичні. Наприклад, це відбувається в тому випадку, коли копію нуклеїнової кислоти створюють із застосуванням максимальної виродженості кодонів, що допускається генетичним кодом.

Приклади наборів умов гібридизації/відмивання, які можна застосовувати для клонування гомологічних нуклеотидних послідовностей, що значною мірою ідентичні еталонним 60 нуклеотидним послідовностям за даним винаходом, є наступними: еталонна нуклеотидна послідовність переважно гібридизується з еталонною нуклеотидною послідовністю в 7 95 додецилсульфаті натрію (505), 0,5 М МаРо», 1 мМ ЕОТА за 50 "С із відмиванням у 2Х 555, 0,196 505 за 50 "С, більш бажано в 7 95 додецилсульфаті натрію (505), 0,5 М МарРох, 1 мМ

ЕОТА за 50"С із відмиванням у 1Х 55С, 0,195 5ЮО5 за 50 С, ще більш бажано в 7 95 додецилсульфаті натрію (505), 0,5 М МаРох, 1 мМ ЕОТА за 50 "С із відмиванням у 0,5Х 555, 0,1 956 505 за 50 "С, переважно в 7 95 додецилсульфаті натрію (505), 0,5 М МаРох, 1 мМ ЕОТА за 50"С із відмиванням в 0,1Х 55С, 0,195 505 за 50"С, більш переважно в 795 додецилсульфаті натрію (505), 0,5 М МаРох, 1 мМ ЕОТА за 50 "С із відмиванням в 0,1Х 555, 0,1 96 505 за 65 70.

Додатковим свідченням того, що дві нуклеїнові кислоти або два білки є значною мірою ідентичними, є те, що білок, кодований першою нуклеїновою кислотою, є імунологічно перехресно реактивним із білком, закодованим другою нуклеїновою кислотою, або специфічно зв'язується з ним. Отже, білок зазвичай є значною мірою ідентичним другому білку, наприклад, якщо два білки відрізняються лише консервативними замінами.

Послідовність нуклеїнової кислоти є "іїізокодонною з" еталонною послідовністю нуклеїнової кислоти, якщо послідовність нуклеїнової кислоти кодує поліпептид, що має таку ж амінокислотну послідовність, як і поліпептид, що кодує еталонна послідовність нуклеїнової кислоти. "Виділена" молекула нуклеїнової кислоти або виділений токсин являють собою молекулу нуклеїнової кислоти або токсин, які, коли є одержаними людиною, існують незалежно від свого природного середовища, а отже, не є природним продуктом. Виділені молекула нуклеїнової кислоти або токсин можуть існувати в очищеній формі або можуть існувати у неприродному середовищі, наприклад, без обмеження такому як рекомбінантна мікробна клітина, рослинна клітина, рослинна тканина або рослина. "Молекула нуклеїнової кислоти" або "послідовність нуклеїнової кислоти" являє собою сегмент одно- або двониткової ДНК або РНК, який може бути виділений із будь-якого джерела.

У контексті даного винаходу молекула нуклеїнової кислоти зазвичай являє собою сегмент ДНК.

У деяких варіантах здійснення молекули нуклеїнової кислоти за даним винаходом являють собою виділені молекули нуклеїнової кислоти.

Терміни "білок", "пептид" і "поліпептид" використовуються у даному документі

Зо взаємозамінно.

Використовуваний у даному документі вираз "кодон-оптимізована" послідовність означає нуклеотидну послідовність рекомбінантного, трансгенного або синтетичного полінуклеотиду, у якому кодони вибрані таким чином, щоб відображати схильність до певних кодонів, яка може спостерігатись у клітині-хазяїні. Це виконується таким чином, щоб зберегти амінокислотну послідовність поліпептиду, кодованого кодон-оптимізованим полінуклеотидом. У деяких варіантах здійснення нуклеотидна послідовність рекомбінантної ДНК-конструкції містить послідовність, яка була кодон-оптимізованою для клітини (наприклад, клітини тварини, рослини або гриба), у якій конструкція буде експресуватись. Наприклад, у конструкції, яка буде експресуватись у рослинній клітині, можуть бути кодон-оптимізовані для експресії в рослині вся послідовність або її частини (наприклад, перший елемент для супресії гена або елемент для експресії гена). Див., наприклад, патент США Мо 6121014, включений у даний документ за допомогою посилання. "Рослина" являє собою будь-яку рослину на будь-якій стадії розвитку, зокрема насіннєву рослину. "Рослинна клітина" являє собою структурну й фізіологічну одиницю рослини, що містить протопласт і клітинну стінку. Рослинна клітина може перебувати у формі виділеної окремої клітини, або культивованої клітини, або як частина більш високоорганізованої одиниці, такої як, наприклад, рослинна тканина, орган рослини або ціла рослина. "Культура рослинних клітин" означає культури одиниць рослини, такі як, наприклад, протопласти, клітини в клітинній культурі, клітини в рослинних тканинах, пилок, пилкові трубки, насіннєві зачатки, зародкові мішки, зиготи й зародки на різних стадіях розвитку. "Рослинний матеріал" стосується листя, стебел, коренів, квітів або частин квітів, плодів, пилку, яйцеклітин, зигот, насіння, живців, клітинних або тканинних культур або будь-яких інших частин або продуктів рослини. "Орган рослини" являє собою окрему та візуально структуровану та диференційовану частину рослини, таку як корінь, стебло, листок, квіткова брунька або зародок. "Рослинна тканина", використовувана в даному документі, означає групу рослинних клітин, організованих у структурну й функціональну одиницю. Включена будь-яка тканина рослини іп ріапіа або в культурі. Даний термін включає без обмеження цілі рослини, органи рослин, бо насіння рослин, тканинну культуру та будь-які групи рослинних клітин, організовані у структурні та/або функціональні одиниці. Використання даного терміна разом із будь-яким специфічним типом рослинної тканини, наведеним вище або іншим чином охопленим даним визначенням, або без нього не призначене для виключення будь-якого іншого типу рослинної тканини. "Промотор" являє собою нетрансльовану послідовність ДНК вище від кодувальної ділянки, яка містить сайт зв'язування для РНК-полімерази і індукує транскрипцію ДНК. Промоторна ділянка може також містити інші елементи, які виступають як регулятори експресії генів. "Регуляторні елементи" стосуються послідовностей, залучених до контролю експресії нуклеотидної послідовності. Регуляторні елементи передбачають промотор, функціонально пов'язаний із нуклеотидною послідовністю, що становить інтерес, і сигнали термінації. Зазвичай вони охоплюють також послідовності, необхідні для належної трансляції нуклеотидної послідовності. "Трансформація" являє собою процес уведення гетерологічної нуклеїнової кислоти в клітину- або організм-хазяїна. У конкретних варіантах здійснення "трансформація" означає стабільну інтеграцію молекули ДНК у геном (ядерний або пластидний) організму, що становить інтерес. У деяких варіантах здійснення введення в рослину, частину рослини та/або рослинну клітину здійснюється за допомогою опосередкованої бактеріями трансформації, трансформації шляхом бомбардуванням частинками, трансформації, опосередкованої фосфатом кальцію, трансформації, опосередкованої циклодекстрином, електропорації, трансформації, опосередкованої ліпосомами, трансформації, опосередкованої наночастинками, трансформації, опосередкованої полімерами, доставки нуклеїнових кислот, опосередкованої вірусами, доставки нуклеїнових кислот, опосередкованої віскерами, мікроїін'єкції обробки ультразвуком, інфільтрації, трансформації, опосередкованої поліетиленгліколем, трансформації протопласту або будь-якого іншого електричного, хімічного, фізичного та/або біологічного механізму, який забезпечує введення нуклеїнової кислоти в рослину, частину рослини та/або її клітину, або їх комбінації.

Процедури здійснення трансформації рослин є добре відомими та загальноприйнятими у даній галузі та докладно описані в літературі Необмежувальні приклади способів трансформації рослин включають трансформацію за допомогою доставки нуклеїнових кислот, опосередкованої бактеріями (наприклад, за допомогою бактерій з роду Адгобасіегійт), доставки нуклеїнових кислот, опосередкованої вірусами, доставки нуклеїнових кислот, опосередкованої віскерами з карбіду кремнію, доставки нуклеїнових кислот, опосередкованої ліпосомами, мікроіїн'єкцію, бомбардування мікрочастинками, трансформацію, опосередковану фосфатом кальцію, трансформацію, опосередковану циклодекстринами, електропорацію, трансформацію, опосередковану наночастинками, обробку ультразвуком, інфільтрацію, поглинання нуклеїнових кислот, опосередковане РЕС, а також будь-який інший електричний, хімічний, фізичний (механічний) та/або біологічний механізм, який забезпечує введення нуклеїнової кислоти в рослинну клітину, у тому числі будь-яку їх комбінацію. Загальні посібники щодо різноманітних способів трансформації рослин, відомих з рівня техніки, включають Мікі еї аї. ("Ргоседигев ог

Іпігодисіпд Рогеідп ОМА іпю Ріапів" у Меїнодвз іп Ріапі Моїесшіаг Віоіоду апа Віоїесппоіоду, СсіЇїскК,

В. А. апа Тпотрзоп, 9. Е., Едв. (СВО Ргевв5, Іпс., Воса Найоп, 1993), сторінки 67-88) і Вакожосгу-

ТгодапомузКа (2002, Сеї! Мої Віо! ГІ ейї 7:849-858 (2002)). "Трансформований/трансгенний/рекомбінантний" стосується організму-хазяїна, такого як бактерія або рослина, в який було введено гетерологічну молекулу нуклеїнової кислоти.

Молекулу нуклеїнової кислоти можна стабільно інтегрувати в геном хазяїна, або ж молекула нуклеїнової кислоти також може бути наявною як позахромосомна молекула. Така позахромосомна молекула може бути такою, що аутореплікується. Передбачається, що трансформовані клітини, тканини або рослини охоплюють не тільки кінцевий продукт процесу трансформації, але також і їхнє трансгенне потомство. "Нетрансформований", "нетрансгенний" або "нерекомбінантний" хазяїн стосується організму дикого типу, наприклад бактерії або рослини, які не містять гетерологічну молекулу нуклеїнової кислоти.

Нуклеотиди позначені за їхніми основами за допомогою наступних стандартних скорочень: аденін (А), цитозин (С), тимін (Т) ї гуанін (5). Аналогічним чином амінокислоти позначені за допомогою наступних стандартних скорочень: аланін (Аїа; А), аргінін (Аго; К), аспарагін (Авп; М), аспарагінова кислота (Ар; 0), цистеїн (Сув; С), глутамін (Сп; СО), глутамінова кислота (Сім; Е), гліцин (Су; с), гістидин (Нів; Н), ізолейцин (Пе; 1), лейцин (І еи; У), лізин (Гуз; К), метіонін (Меб

М), фенілаланін (Ре; Е), пролін (Рго; Р), серин (Зег; 5), треонін (Тпг; Т), триптофан (Тгр; УМ), тирозин (ТуУг; ХУ) і валін (Маї; М).

ДОКЛАДНИЙ ОПИС

Даний винахід стосується нових інсектицидних білків, які характеризуються активністю щодо бо твердокрилих, наприклад Оіабгоїїса мігдітега мігуїтега (західного кукурудзяного кореневого жука;

МС), Оіабгоїїса Багрегі (північного кукурудзяного кореневого жука; МОСК) і/або біабгоїйїса ипаєсітрипсіаїа поуагаії (південного кукурудзяного кореневого жука; 5СК) і/або інших видів

Оіабгоїіса, у тому числі Оіаргоїйса мігудітега 7еае (мексиканського кукурудзяного кореневого жука), та/або колорадського жука. У варіантах здійснення новий інсектицидний білок за даним винаходом може характеризуватися активністю щодо видів лускокрилих. Даний винахід також стосується нуклеїнових кислот, експресія яких зумовлює утворення інсектицидних білків за даним винаходом, а також одержання і застосування інсектицидних білків для контролю комах- шкідників. У варіантах здійснення експресія нуклеїнових кислот зумовлює утворення інсектицидних білків, які можуть застосовуватись для контролю твердокрилих комах, таких як західний, північний і/або південний кукурудзяний кореневий жук, зокрема у випадку експресії у трансгенній рослині, такій як трансгенна рослина кукурудзи.

Даний винахід додатково охоплює молекулу нуклеїнової кислоти, що містить нуклеотидну послідовність, яка кодує інсектицидний білок за даним винаходом. Нуклеотидна послідовність може бути оптимізована для експресії в бактеріях, таких як Езспегіспіа соїї, або для експресії у рослині, такій як 2еа тауб5. Нуклеотидна послідовність, оптимізована для експресії у гетерологічному організмі, такому як види бактерій, відмінні від тих, з яких вона одержана, або рослина, не існує в природі. В одному аспекті даного варіанта здійснення молекула нуклеїнової кислоти містить нуклеотидну послідовність під ЗЕО ІЮ МО: 2, 3, 7 або 8. Зокрема, ілюстративні рекомендації щодо способів одержання молекул нуклеїнової кислоти, які кодують інсектицидні білки за даним винаходом, можуть бути знайдені у прикладах даної заявки. Фахівцям у даній галузі буде зрозуміло, що в ілюстративних способах одержання інсектицидних білків, охоплених даним винаходом, можуть бути виконані модифікації.

Фахівцю у даній галузі буде зрозуміло, що трансген для комерційного застосування, такий як молекула нуклеїнової кислоти, яка містить будь-яку із ФЕО ІЮ МО: 1-3 або 5ЕО ІО МО: 6-8, може характеризуватись порівняно незначними модифікаціями щодо послідовності нуклеїнової кислоти, щоб відповідати вимогам державних регуляторних норм. Такі модифікації не будуть впливати на функцію одержаної молекули, яка буде значною мірою ідентичною ЗЕО ІЮО МО: 1-3 або ЗЕО ІЮ МО: 6-8. Фахівцю в даній галузі буде зрозуміло, що молекула модифікованої нуклеїнової кислоти буде фактично такою самою, як і вихідна молекула, та охоплена даним винаходом.

Даний винахід охоплює молекулу нуклеїнової кислоти, яка містить (а) нуклеотидну послідовність під ЗЕО ІЮ МО: 2, 3, 7 або 8; (Б) нуклеотидну послідовність, яка на щонайменше 80956, щонайменше 8595, щонайменше 9095, щонайменше 9195, щонайменше 92 95, щонайменше 93 95, щонайменше 94 95, щонайменше 95 95, щонайменше 96 9565, щонайменше 97956, щонайменше 9895, щонайменше 9995 або на 10095 ідентична нуклеотидній послідовності під ЖЕО ІЮО МО: 2, 3, 7 або 8; (с) нуклеотидну послідовність, яка кодує поліпептид, при цьому амінокислотна послідовність поліпептиду містить зЗЕО ІЮ МО: 4, 5ЕО ІЮ МО: 5 або

ЗБО ІЮО МО: 9, ії характеризується активністю щодо контролю комах; (4) нуклеотидну послідовність, яка кодує поліпептид, при цьому амінокислотна послідовність поліпептиду на щонайменше 80 9о, щонайменше 85 956, щонайменше 90 956, щонайменше 91 95, щонайменше 9295, щонайменше 9395, щонайменше 9495, щонайменше 9595, щонайменше 96 95, щонайменше 9795, щонайменше 9895, щонайменше 9995 або на 10095 ідентична амінокислотній послідовності під 5ЕО ІЮ МО: 4, 5БО ІЮ МО: 5 або 5ЕБЕО ІЮО МО: 9; або (є) нуклеотидну послідовність, яка комплементарна нуклеотидній послідовності будь-якого з (а) - (4), наведених вище.

Даний винахід додатково охоплює касету експресії, що містить промотор, функціонально пов'язаний із гетерологічною нуклеотидною послідовністю, яка містить (а) нуклеотидну послідовність під будь-яким із ЗЕБЕО ІЮ МО: 1-3 або 5ЕБО ІЮ МО: 6-8; (6) нуклеотидну послідовність, яка на щонайменше 80 95, щонайменше 85 95, щонайменше 90 956, щонайменше 9195, щонайменше 9295, щонайменше 9395, щонайменше 9495, щонайменше 95 95, щонайменше 96 95, щонайменше 97 95, щонайменше 98 95, щонайменше 99 95 або на 100 95 ідентична нуклеотидній послідовності під будь-яким із «ЕО ІЮ МО: 1-3 або 5ЕО ІЮ МО: 6-8; (с) нуклеотидну послідовність, яка кодує поліпептид, при цьому амінокислотна послідовність поліпептиду містить ЗЕО І МО: 4, 5ЕО ІО МО: 5 або 5ЕО ІЮ МО: 9, і характеризується активністю щодо контролю комах; (4) нуклеотидну послідовність, яка кодує поліпептид, при цьому амінокислотна послідовність поліпептиду на щонайменше 80 9о, щонайменше 85 95, щонайменше 90 95, щонайменше 91 95, щонайменше 92 95, щонайменше 93 9565, щонайменше 9495, щонайменше 9595, щонайменше 9695, щонайменше 9795, щонайменше 98 95, щонайменше 99 95 або на 100 95 ідентична амінокислотній послідовності під 5ЕО ІЮО МО: 4, ЗЕО 60 ІЮ МО: 5 або 5ЕО ІО МО: 9; або (є) нуклеотидну послідовність, яка комплементарна нуклеотидній послідовності будь-якого з (а) - (4), наведених вище. Касета експресії містить промотор, який є функціонально пов'язаним із гетерологічною нуклеотидною послідовністю і який не існує в природі.

Даний винахід також охоплює рекомбінантні вектори або конструкції, які також можуть називатись векторами або конструкціями, що містять касети експресії і/або молекули нуклеїнової кислоти за даним винаходом. У таких векторах нуклеїнові кислоти переважно знаходяться в касетах експресії, що містять регуляторні елементи для експресії нуклеотидних молекул у клітині-хазяїні, що здатна експресувати нуклеотидні молекули. Такі регуляторні елементи зазвичай містять промотор і сигнали термінації і переважно також містять елементи, що надають можливість виконувати ефективну трансляцію поліпептидів, кодованих нуклеїновими кислотами за даним винаходом. Вектори, що містять нуклеїнові кислоти, можуть бути здатні до реплікації у конкретних клітинах-хазяїнах, переважно як позахромосомні молекули, і таким чином використовуються для ампліфікації нуклеїнових кислот за даним винаходом у клітинах-хазяїнах. Даний винахід також охоплює клітину-хазяїна, яка містить касету експресії або молекулу нуклеїнової кислоти за даним винаходом. В одному варіанті здійснення клітинами-хазяїнами для таких векторів є мікроорганізми, такі як бактерії, зокрема Васйив5

Іигіпдієпвіз або Е. сої, або такі як гриби, як, наприклад, дріжджі. В іншому варіанті здійснення клітини-хазяїни для таких рекомбінантних векторів являють собою ендофіти або епіфіти. У ще одному варіанті здійснення такі вектори є вірусними векторами і застосовуються для реплікації нуклеотидних послідовностей у конкретних клітинах-хазяїнах, наприклад у клітинах комах або рослинних клітинах. Рекомбінантні вектори також використовуються для трансформації нуклеотидних молекул за даним винаходом у клітини-хазяїни, внаслідок чого нуклеотидні молекули стабільно інтегруються в ДНК трансгенного хазяїна. В одному варіанті здійснення трансгенним хазяїном є рослина, наприклад однодольна рослина, така як рослина кукурудзи.

У варіантах здійснення трансгенна рослина-хазяїн являє собою дводольну рослину, таку як рослина сої або рослина бавовнику.

В іншому варіанті здійснення щонайменше одна з нуклеїнових кислот за даним винаходом вводиться у відповідну касету експресії, що містить промотор і сигнал термінації. Експресія нуклеїнової кислоти може бути конститутивною, або може застосовуватись індуцибельний

Зо промотор, що відповідає на різні типи стимулів для ініціації транскрипції. В іншому варіанті здійснення клітина, у якій експресується інсектицидний білок за даним винаходом, являє собою мікроорганізм, такий як вірус, бактерії або гриб. У ще одному варіанті здійснення вірус, такий як бакуловірус, містить у своєму геномі нуклеїнову кислоту за даним винаходом і експресує великі кількості відповідного інсектицидного білка після зараження відповідних еукаріотичних клітин, які придатні для реплікації вірусу і експресії нуклеїнової кислоти. Одержаний таким чином інсектицидний білок застосовується як інсектицидний засіб. Альтернативно бакуловіруси, сконструйовані з можливістю містити нуклеїнову кислоту, застосовуються для інфікування комах іп мімо, і вони знищують їх або за допомогою експресії інсектицидного токсину, або за допомогою комбінації вірусної інфекції і експресії інсектицидного токсину. У додатковому варіанті здійснення даний винахід також охоплює спосіб одержання поліпептиду з інсектицидною активністю, який передбачає культивування клітини-хазяїна за умов, за яких експресується молекула нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептид.

Бактеріальні клітини також є клітинами-хазяїнами для експресії нуклеїнових кислот за даним винаходом. В одному варіанті здійснення застосовуються непатогенні симбіотичні бактерії, здатні жити і розмножуватись у рослинних тканинах, так звані ендофіти, або непатогенні симбіотичні бактерії, здатні колонізувати філосферу або ризосферу, так звані епіфіти. Такі бактерії включають бактерії родів Адгобасієгійт, АїІсаїїдепев, АгозріпШит, Агоїобасівг, ВасіПсв,

Сіамібасієї, Епіегобасієг, Егміпіа, Ніамобасієг, КіІебзієїа, Резепдотопа5, ВПі2гобрійт, 5е!таїйа, зігеріотусев і Хапіпотопа5. Симбіотичні гриби, такі як Т/ісподепта і Сіосіадійт, також є можливими хазяїнами для експресії нуклеїнових кислот за даним винаходом для тієї ж мети.

Методики для цих генетичних маніпуляцій є спеціальними для різних доступних хазяїнів і відомі з рівня техніки. Наприклад, вектори експресії ркК223-3 і ркК223-2 можуть використовуватись для експресії гетерологічних генів у Е. соїї або у транскрипційному, або трансляційному злитті під дією промотора їас або ігсо. Для експресії оперонів, що кодують декілька ОКЕ, найпростішою процедурою є введення оперона у вектор, такий як рккК223-3, у вигляді транскрипційного злиття, що дає можливість застосовувати когнатний сайт зв'язування рибосом гетерологічних генів. Методики для надмірної експресії у грампозитивних видів, таких як Васіїїш5, також відомі з рівня техніки і можуть використовуватись у контексті даного винаходу (Оцах еї аї. в Іпаивіга! Місгоогдапібзтв5: Вазіс апа Арріїей МоїІесшіаг Сепеїісв, бо Еа5. Ваїї: єї аІ., Атегісап 5осієїу Тог Місгобіоіоду, Умазпіпдіоп (1993)). Альтернативні системи надмірної експресії базуються, наприклад, на дріжджових векторах і включають використання

Ріспіа, засспаготусез і Кісумеготусез (Згеекгізппа в Іпдизігіа! тісгоогдапізтв: Бавзіс апа арріїей тоїесшіаг депеїїсв, Вай;, Недетап, апа БКаїга ейв., Атегісап БЗосієїу ог Місгобіоіоду,

Ммазпіпдаюоп (1993); ЮОедиіп є Ваїте, Віоїесппоїоду 12:173-177 (1994); мап деп Вегу есеї аї,

Віотесппоіоду 8:135-139 (1990)).

Інсектицидні білки за даним винаходом характеризуються активністю щодо контролю комах під час тестування щодо комах-шкідників у біоаналізах В одному варіанті здійснення інсектицидні білки за даним винаходом активні щодо твердокрилих і/або лускокрилих комах.

Комахи ряду Іерідоріеєга включають без обмеження будь-яку відому нині або ідентифіковану пізніше комаху, яка класифікується як лускокрила, зокрема ті види комах, які віднесені до підрядів 7еидіоріега, Сіоб5б5айа і Неїегораїйтіпа і будь-яких їх комбінацій. Ілюстративні лускокрилі комахи включають без обмеження Оз5ігіпіа 5рр., такий як О. пибійайїйє (вогнівка кукурудзяна); Рішеїа 5рр., такий як Р. хуїозієПа (капустяна міль); Зродоріега 5рр., такий як 5.

Тїпидірегча (совка трав'яна), 5. огпійодаїйй (совка смугаста жовта), 5. ргаеїйса (західна совка смугаста жовта), 5. егідапіа (південна совка) і 5. ехідца (совка мала); Адгоїї 5рр., такий як А. ірзіюп (совка-іпсилон), А. зедешт (озима совка звичайна), А. діадіагіа (озима совка роду Адгоїїі5) і А. огііподопіа (совка прямокутна); 5ігіасовіа 5рр., такий як 5. аіІрісовіа (західна бобова совка);

Неїїсомегра 5рр., такий як Н. леа (совка кукурудзяна), Н. рипсіїдега (совка бавовникова австралійська), 5. ІШогаїїх (совка бавовнику єгипетського) і Н. аптідега (совка бавовникова);

Неїйоїпіз 5рр., такий як Н. мігезсеп5 (тютюнова листокрутка); Оіайгаєа з5рр., такий як 0. дгападіозеїЇІа (вогнівка кукурудзяна південно-західна) і О. зассНагаїї5 (точильник стебел цукрової тростини); Тгіспоріизіа 5рр., такий як Т. пі (совка капустяна); Зезатіа 5рр., такий як 5. попадгоїдеє (метелик кукурудзяний середземноморський); Ресіпорпога 5рр., такий як Р. до55зурієїа (рожевий коробковий хробак); Соспуїїє в5рр., такий як С. Позре5 (смугаста соняшникова міль); Мападиса 5рр., такий як М. зехіа (тютюновий бражник) і М. диіпдоетасшиіага (бражник п'ятикрапковий); ЕіІазтораїриз» 5рр., такий як Е. ІдпозеїПш5 (точильник стебел кукурудзи малий); Рзешадоріизіа 5рр., такий як Р. іпсійдеп5 (соєва совка); Апіісагзіа 5рр., такий як А. деттаїгаїїє (совка оксамитових бобів); Ріаїйурепа 5рр., такий як Р. 5сабга (совка конюшинова);

Ріегіє 5рр., такий як Р. Бргаззісає (білянка капустяна), Рараірета 5рр., такий як Р. пебгі5

Зо (точильник Рараїрета пебгіз); Рзецдаїейна 5рр., такий як Р. ипірипсіа (совка лугова звичайна);

Регідгота 5рр., такий як Р. заийсіа (совка стокроткова); Кеїїегіа 5рр., такий як К. ІусорегвісейПа (томатна гостриця); Аподеїа 5рр., такий як А. гарає (білянка ріпна); Ріїпогітаєа 5рр., такий як Р. орегсціейа (картопляна міль); Стутодез 5рр., такий як С. демазіаг (скляниця); РеШа 5рр., такий як РЕ. дисеп5 (гусінь совки Рейа 5!йбБодоїйіса), і будь-яку комбінацію вищевказаних. В одному аспекті даного варіанта здійснення інсектицидні білки за даним винаходом активні щодо совки- іпсилон, вогнівки цукрової тростини та/або вогнівки кукурудзяної південно-західної.

Комахи ряду СоІеорієга включають без обмеження будь-яку твердокрилу комаху, яка відома на сьогодні або яка буде ідентифікована пізніше, зокрема комах із підрядів Агспо5іетаїйа,

Мухорнада, Адерпада і Роїурпада, а також будь-якої їх комбінації.

В одному аспекті даного варіанта здійснення інсектицидні білки за даним винаходом активні щодо Оіарбгоїйса 5рр. Оіабгоїїса являє собою рід жуків ряду СоіІеорієга, що зазвичай називається "кукурудзяними кореневими жуками" або "огірковими жуками". Типові види Оіабгоїїса включають без обмеження Оіабгоїїса Багбегі (північного кукурудзяного кореневого жука), 0. мігдітега мігдітега (західного кукурудзяного кореневого жука), 0. ипаесітрипсіаїа Поучагаїй (південного кукурудзяного кореневого жука), Ю. Бакеага (жука-блішку облямованого), Ю. ипаесітрипсіага ипаесітрипсіага (жука-блішку одинадцятикрапкового), ОО. в5ідпіїйсайга (З-крапкового листоїда), р. 5ресіоза (діабротику особливу), О. мігдіїега 7еаеє (мексиканського кукурудзяного кореневого жука), О. Бепієпвті5, Ю. сгієтага, О. сигміріиєїаіата, О. аїіввітійв5, О. еІедапіша, О. етогейапв,

Ор. агатіпеа, О. Ніврапіоє, 0. Іетпівсаїа, О. Іп5ієуї, О. тійей, О. питтпшиіагв, О. оссійвзаї, р. роітесеа, 0. зсцшіеїІана, О. йріаїїв, ОЮ. ігігабсіана і Ю. мігдиа і будь-яку їх комбінацію.

Інші необмежувальні приклади твердокрилих комах-шкідників відповідно до даного винаходу включають ГГ ерііпоїаг:за 5рр., такий як Г.. Зесетіїпеайа (колорадський жук); Спгузотеїа 5рр., такий як С. з5согіріа (листоїд тополевий); Нуроїпепети5 5рр., такий як Н. патреї (жук кавовий); зпорпйи5 5рр., такий як 5. 7еатаїй5 (маїсовий довгоносик); Еріїгіх 5рр., такий як Е. Пігпіреппів (жук-блішка шорстка) і Е. сиситегі5 (блішка картопляна); Рпуїоїгеїга 5рр., такий як Р. сгисітегає (блішка хрестоцвітна) і Р. рихзійа (західна чорна блішка); Апіпопотих 5рр., такий як А. ецдепії (перцевий довгоносик); Нептісгеріди5 5рр., такий як Н. тетпопіи5 (дротяники); МеїІапоїи5 5рр., такий як М. соттипів (дротяник); Сешогпуспиз 5рр., такий як С. азвітіїї5 (ріпаковий насіннєвий скритнохоботник); РпуПоїгеїа 5рр., такий як Р. сгисітегає (блішка хрестоцвітна); Аеои5 5рр., такий бо як А. теййив5 (дротяник); АеоЇи5 5рр., такий як А. тапси5 (пшеничний дротяник); Ногізіопоїи5

5рр., такий як Н. ийіегії (піщаний дротяник); Зрпепорпогиз 5рр., такий як 5. таїйдів (довгоносик маїсовий), 5. 7еає (довгоносик тимофіївський), 5. рагмшіи5 (довгоносик тонконогу лучного) і

З. сайобзиє (довгоносик бульбочковий еспарцетовий); РПупорпада з5рр. (личинки хрущів);

Спаеїоспета 5рр., такий як С. риїїсага (блішка стеблова хлібна); Рорійа 5рр., такий як

Р. Їаропіса (японський жук); Еріаснпа 5рр., такий як Е. магімевії5 (мексиканський бобовий жук);

Сегоїота зрр., такий як С. ігйигсаге (жук-листоїд); Ерісаша в5рр., такий як Е. резійега і

Е. Іетпізсайа (наривники), і будь-яку комбінацію вищевказаних.

Інсектицидні білки за даним винаходом також можуть бути активними щодо напівтвердокрилих, двокрилих, І удив 5рр. і/або інших колючих і сисних комах, наприклад із ряду

Оппоріега або Тпузапорієга. Комахи у ряді Оіріега включають без обмеження будь-яку двокрилу комаху, відому нині або ідентифіковану пізніше, зокрема без обмеження (І іпотуа 5рр., такий як І. їгІТоїїї (листовий мінер) і Г. займає (листовий мінер овочів); ЗсгобіраІрша 5рр., такий як 5. архоЇша (листовий мінер томатів); Оеїїа 5рр., такий як 0. ріайшга (личинка росткової мухи), 0. Бгаззісає (личинка весняної капустяної мухи) і ОЮ. гадісчт (муха капустяна весняна);

Рзіїа 5рр., такий як Р. гозає (муха морквяна); Тегапорз 5рр., такий як Т. туораеютптів (личинка попелиці бурякової), і будь-яку комбінацію вищевказаних.

Комахи у ряді Огіпорієга включають без обмеження будь-яку відому нині або ідентифіковану пізніше прямокрилу комаху, зокрема без обмеження Меїапоріи5 5рр., такий як М. айегепіаїї5 (кобилка відмітна), М. Тетитибгит (кобилка червононога), М. ріміНайшв5 (кобилка двосмугова) і будь-яку їх комбінацію.

Комахи у ряді Тпузапоріеєга включають без обмеження будь-яку відому нині або ідентифіковану пізніше бахромчатокрилу комаху, зокрема без обмеження РЕгапкКіїпіеМйа 5рр., такий як РЕ. оссідепіаїїє (західний квітковий трипс) і Е. Тиса (тютюновий трипс); і ТНгір5 5рр., такий як Т. їарасі (цибулевий трипс), Т. раїті (пальмовий трипс), і будь-яку комбінацію вищевказаних.

Інсектицидні білюи за даним винаходом також можуть бути активними щодо нематод.

Використовуваний у даному документі термін "нематода" охоплює будь-який відомий нині або ідентифікований пізніше організм, який класифікований у царстві тварин, тип нематоди, зокрема без обмеження нематоди у межах класу Адепорпогеа (зокрема, наприклад, ряди Епоріїда,

Зо ІбоЇайтіда, Мопопспіда, Оогуїаіїтіда, Тиіспосернаїйда, Мептіїйіда, Мизрісеїда, Агаєоїіаітіда,

Спготадогіда, Оезтоз5соїесіда, Оехітодогіда і Моппузіегіда) і/або класу Зесегпепієа (зокрема, наприклад, ряди КПпарайа, Зігопдуїїда, Абвсагідіда, Зрігигіда, Сатайапіда, Оіріодаєіегіда,

Туіепспіда і АрпеІепспіда).

Нематоди включають без обмеження паразитичні нематоди, такі як бульбочкові нематоди, цистоутворюючі нематоди і/або ранячі нематоди. ілюстративні роди нематод відповідно до даного винаходу включають без обмеження МеїПІоідодупе (бульбочкові нематоди), Неїегодега (цистоутворюючі нематоди), (СІободега (цистоутворюючі нематоди), Кадорпоїн5 (риючі нематоди), Коїуепспшіи5 (брунькоподібні нематоди), Ргайуіепспиє (ранячі нематоди),

АрпеїІепспоїдез5 (нематоди листові), Неїїсоїуїюепспих (нематоди спіральні), НоріоЇайїтив (ланцетоподібні нематоди), Рагаїгісподогих5 (нематоди, що спричиняють тупокінцевість коренів),

Гопдідогих, Масоббри5 (несправжні бульбочкові нематоди), Зибрапдиіпа, ВеїІопіайти5 (жалячі нематоди), СтісопетейПа, Стісопетоїде5 (кільцеві нематоди), ЮОйуепспив5, Ооїїсподогив,

Нетістісопетоїіде5, Нетісусіюорнпога, НігзспПтапієїїа, Нурзорегіпе, Масгоровзіпопіа, Меїпіив,

Рипсіодега, Опіпізцісіциє, ЗсщшейПйопета, Хірпіпета (кинджальні нематоди), Туіепспогпупспи5 (карликові нематоди), Туіепспшіи5, Вигзарпеіелпспи5 (круглі кишкові черви) і будь-яку їх комбінацію.

Типові паразитичні нематоди рослин відповідно до даного винаходу включають без обмеження Веїопоїаїйтиє дгасіїє, Веїопоїайти5 Іопдісацдай5, Вигхарпеіепспи5 хуїорпйи5 (нематоду деревини хвойних порід), Стісопетоїде5 огпаїа, Ойуіепспи5 аевзігисіог (нематоду коренів картоплі), Ойуепспив аірзасі (стеблову і цибулеву нематоду), Сіородега раїЇїда (картопляну цистоутворюючу нематоду), Сіородега го5іоспіепзіз (золотисту картопляну нематоду), Неїегодега діусіпез (соєву цистоутворюючу нематоду), Неїегодега зспаспйіії (цистоутворюючу нематоду цукрового буряка); Неїегодега 7еае (кукурудзяну цистоутворюючу нематоду), Неїегодега амепає (цистоутворюючу нематоду злакових культур), Неїегодега сагоїгає,

Неїегодега ної, Норіоіайтиє соїштрив, Норіоїайтив даїєайшв, Норіоіайїтиє тадпівіув,

Гопдідогиє Бгеміаппшціац5, Меїіоідодупе агепагіа, МеїпІоідодупе спібхосаді, Меїіоідодупе Паріа,

Меїоідодупе іпсодпіта, Меїоідодупе |амапіса, Мезосгіісопета хепоріах, Масорри5 абве!їтапв,

Массорив аогзаїї5, Рагайнісподоги5 спгівіїєї, Рагайісподогиб5 тіпог, Ргаїмуепспив Бгаспуигив,

Ргагуепспив степаїшв5, РгаїуІепспи5 Пехіпсівив5, Ргамуепспив5 педієсіи5, Ргаїуіепспив5 репеїгапв, 60 Ргагуіепспив рго|есіи5, РгаїуІепспив зсегпібрпеті, РгаїуІепспив їепиїсацдаїив5, Ргаїуепспив Шогпеї,

Ргаїуіеєпспив 7є6ає, Рипсіодега снассоепвів, Оціпівцісіиє асшив, Вадорносшзв вітіїїв, Воїуіїеєпспшив5 гепітоттів, Ту'епсопогпупспиз аибіи5, Туіепспии5 зетірепеїгап5 (цитрусову нематоду), Зірпіпета атегісапит, Х. Меаійегтапешт і будь-яку комбінацію вищевказаних.

В іншому варіанті здійснення даний винахід охоплює спосіб одержання інсектицидного білка, який є активним щодо комах, що передбачає (а) одержання клітини-хазяїна, що містить ген, який сам містить касету експресії і/або молекулу нуклеїнової кислоти за даним винаходом; і (б) вирощування трансгенної клітини-хазяїна таким чином, щоб експресувати інсектицидний білок, який є активним щодо комах.

У ще одному додатковому варіанті здійснення даний винахід охоплює спосіб здійснення контролю комах, який передбачає доставку комахам ефективної для контролю комах кількості інсектицидного білка за даним винаходом.

В одному варіанті здійснення щонайменше один з інсектицидних білків за даним винаходом експресується у вищому організмі, такому як рослина. У даному випадку трансгенні рослини експресують ефективні для контролю комах кількості інсектицидного білка для самозахисту від комах-шкідників. У разі, якщо комаха починає поїдати таку трансгенну рослину, вона також поглинає експресований інсектицидний білок. Це буде стримувати комаху від подальшого вгризання у рослинну тканину і/або навіть може спричиняти шкоду комасі або знищувати її.

Нуклеїнова кислота за даним винаходом вводиться в касету експресії, яка потім може бути стабільно інтегрована в геном рослини. В іншому варіанті здійснення нуклеїнову кислоту включають у непатогенний вірус, що самореплікується. Рослини, трансформовані відповідно до даного винаходу, можуть бути однодольними або дводольними і включають без обмеження кукурудзу, пшеницю, овес, газонну траву, пасовищну траву, льон, ячмінь, жито, солодку картоплю, квасолю, горох, цикорій, салат-латук, капусту, цвітну капусту, броколі, ріпу, редьку, шпинат, спаржу, цибулю, часник, перець, селеру, гарбуз великоплідний, гарбуз, коноплі, цукіні, яблуню, грушеве дерево, айву, диню, сливове дерево, вишню, персикове дерево, нектарин, абрикосове дерево, полуницю, виноград, малину, ожину, ананас, авокадо, папаю, манго, бананове дерево, сою, томат, сорго, цукрову тростину, цукровий буряк, соняшник, ріпак, конюшину, тютюн, моркву, бавовник, люцерну, рис, картоплю, баклажан, огірок, арабідопсис і деревні рослини, такі як хвойні і листяні дерева.

В іншому варіанті здійснення даний винахід охоплює спосіб одержання рослини або частини рослини з підвищеною стійкістю до комах порівняно з контрольними рослиною або частиною рослини, що передбачає (а) введення молекули нуклеїнової кислоти, що містить касету експресії за даним винаходом; і (б) вирощування частини рослини з одержанням рослини, яка експресує гетерологічну молекулу нуклеїнової кислоти касети експресії і яка характеризується підвищеною стійкістю до комах порівняно з контрольними рослиною або частиною рослини, які не були трансформовані молекулою нуклеїнової кислоти, що містить касету експресії. У переважному варіанті здійснення касета експресії може кодувати поліпептид, що містить амінокислотну послідовність, яка на щонайменше 80 95, щонайменше 85 95, щонайменше 90 95, щонайменше 91 95, щонайменше 92 95, щонайменше 93 95, щонайменше 94 9565, щонайменше 95965, щонайменше 96 95, щонайменше 97 95, щонайменше 9895, щонайменше 99 95 або на 100 95 ідентична або подібна до 5ЕО ІЮО МО: 4, ЗЕО ІО МО: 5 або 5ЕО ІЮ МО: 9. У переважному варіанті здійснення касета експресії може кодувати поліпептид, що містить амінокислотну послідовність, яка на щонайменше 80 95 ідентична 5ЕО ІО МО: 4 або 5ЕО ІЮ МО: 9. "Підвищена" стійкість до комах може бути виміряна як збільшена інсектицидна активність. Підвищена стійкість до комах може бути більшою за 0 956, на щонайменше 1 95, на щонайменше 2 95, на щонайменше З 95, на щонайменше 495, на щонайменше 595, на щонайменше 10 95, на щонайменше 1595, на щонайменше 20 95, на щонайменше 2595, на щонайменше 30 95, на щонайменше 40 95, на щонайменше 50 956, на щонайменше 60 95, на щонайменше 70 95, на щонайменше 80 95, на щонайменше 90 956, на щонайменше 100 95, на щонайменше 125 95, на щонайменше 150 95, на щонайменше 200 95, на щонайменше 300 95, на щонайменше 400 95, на щонайменше 500 95, на щонайменше 600 95, на щонайменше 700 95, на щонайменше 800 95, на щонайменше 90095 або на щонайменше 100095 більшою від інсектицидної активності порівняно з контрольною рослиною. Рослина або частина рослини, що характеризуються підвищеною стійкістю до комах порівняно з контрольними рослиною або частиною рослини, можуть бути одержані за допомогою способів трансформації рослини, культивування рослинної тканини або селекції. Рослина або частина рослини можуть бути одержані за допомогою способів статевого або безстатевого розмноження. Можуть використовуватись будь-які придатні контрольні рослина або частина рослини, наприклад рослина з таким самим або аналогічним генетичним фоном, вирощена в тому самому середовищі. У варіантах здійснення контрольні бо рослина або частина рослини мають той самий генетичний фон і ростуть у тому самому середовищі, що й описана рослина, однак вони не містять молекулу за даним винаходом, водночас описана рослина містить молекулу за даним винаходом.

В іншому варіанті здійснення даний винахід охоплює спосіб підвищення стійкості до комах у рослини або частини рослини порівняно з контрольною рослиною або частиною рослини, який передбачає забезпечення експресії в рослині або частині рослини молекули нуклеїнової кислоти або касети експресії за даним винаходом, де експресія гетерологічної нуклеїнової кислоти касети експресії зумовлює підвищену стійкість до комах у рослини або частини рослини порівняно з контрольною рослиною або частиною рослини. У варіантах здійснення касета експресії або молекула нуклеїнової кислоти містить промотор, функціонально пов'язаний із гетерологічною молекулою нуклеїнової кислоти, що містить нуклеотидну послідовність, яка містить (а) нуклеотидну послідовність під будь-яким із БЕО ІЮ МО: 1-3 або 5ЕО ІЮ МО: 6-8; (р) нуклеотидну послідовність, яка на щонайменше 80 95, щонайменше 85 95, щонайменше 90 95, щонайменше 91 95, щонайменше 92 95, щонайменше 93 95, щонайменше 94 9565, щонайменше 95965, щонайменше 96 95, щонайменше 97 95, щонайменше 9895, щонайменше 99 95 або на 100 95 ідентична нуклеотидній послідовності під будь-яким із ФЕО ІЮ МО: 1-3 або 5ЕО ІЮ МО: 6- 8; (с) нуклеотидну послідовність, яка кодує поліпептид, при цьому амінокислотна послідовність поліпептиду містить 5ЕО ІЮО МО: 4, 5ЕБЕО ІО МО: 5 або 5ЕО ІО МО: 9, і характеризується активністю щодо контролю комах; (4) нуклеотидну послідовність, яка кодує поліпептид, при цьому амінокислотна послідовність поліпептиду на щонайменше 80 9о, щонайменше 85 95, щонайменше 90 9о, щонайменше 91 96, щонайменше 92 956, щонайменше 93 96, щонайменше 9495, щонайменше 9595, щонайменше 9695, щонайменше 9795, щонайменше 98 95, щонайменше 99 95 або на 100 95 ідентична амінокислотній послідовності під 5ЕО ІЮО МО: 4, ЗЕО

ІЮ МО: 5 або 5ЕО ІО МО: 9; або (є) нуклеотидну послідовність, яка комплементарна нуклеотидній послідовності будь-якого з (а) - (4), наведених вище. Молекула нуклеїнової кислоти або касета експресії може бути введена в рослину. У деяких варіантах здійснення молекула нуклеїнової кислоти або касета експресії може бути введена в частину рослини, і при цьому рослина, що містить молекулу нуклеїнової кислоти або касету експресії, може бути одержана з частини рослини.

В іншому варіанті здійснення даний винахід охоплює спосіб одержання рослини з

Зо підвищеною стійкістю до комах порівняно з контрольною рослиною, який передбачає виявлення в частині рослини гетерологічної нуклеїнової кислоти, що передбачає молекулу нуклеїнової кислоти або касету експресії за даним винаходом, і одержання рослини з частини рослини, завдяки чому забезпечується одержання рослини з підвищеною стійкістю до комах порівняно з контрольною рослиною. У додатковому варіанті здійснення даний винахід охоплює спосіб ідентифікації рослини або частини рослини, що характеризується підвищеною стійкістю до комах порівняно з контрольною рослиною або частиною рослини, який передбачає виявлення в рослині або частині рослини молекули нуклеїнової кислоти або касети експресії за даним винаходом, завдяки чому забезпечується ідентифікація рослини або частини рослини з підвищеною стійкістю до комах. У додатковому варіанті здійснення касету експресії або її діагностичний фрагмент виявляють у продукті ампліфікації зі зразка нуклеїнової кислоти з рослини або частини рослини. Діагностичний фрагмент може являти собою молекулу нуклеїнової кислоти довжиною щонайменше 10 суміжних нуклеотидів, яка є унікальною для касети експресії за даним винаходом. Способи виявлення добре відомі з рівня техніки та включають способи на основі ПЛР, способи секвенування та способи гібридизації, в яких застосовують праймери або зонди до унікальних діагностичних послідовностей нуклеїнової кислоти. У деяких варіантах здійснення одержують праймери або зонди до щонайменше 10 суміжних нуклеотидів під 5ЕО І МО: 1-3 або 5ЕБЕО ІЮ МО: 6-8 або їх комплементарної послідовності та вони є придатними для способу виявлення молекули нуклеїнової кислоти за даним винаходом.

У ще одному варіанті здійснення даний винахід охоплює спосіб одержання рослини, що характеризується підвищеною стійкістю до комах порівняно з контрольною рослиною або частиною рослини, що передбачає схрещування першої батьківської рослини з другою батьківською рослиною, де щонайменше перша батьківська рослина містить у своєму геномі гетерологічну нуклеїнову кислоту, яка передбачає молекулу нуклеїнової кислоти або касету експресії за даним винаходом, і одержання покоління потомства, де покоління потомства містить щонайменше одну рослину, яка містить гетерологічну нуклеїнову кислоту у своєму геномі і яка проявляє підвищену стійкість до комах порівняно з контрольною рослиною.

У переважних варіантах здійснення способи за даним винаходом надають підвищеної стійкості до комах рослині або частині рослини щодо твердокрилої та/або лускокрилої комахи- бо шкідника. Контроль комах як лускокрилих, так і твердокрилих комах-шкідників продемонстровано у прикладах. У додаткових варіантах здійснення способи за даним винаходом надають підвищеної стійкості до комах рослині або частині рослини щодо видів

Оіабгоїїса, зокрема Оіаргоїїса мігдітега мігдітега, Оіабгоїїса Багбегі, Оіабгоїйса ипдаесітрипсіаїа помагаї, Оіабгоїйса мігдітега 7еае та/або Оіабгоїїйса 5ресіоза і/або споріднених видів.

У переважних варіантах здійснення способи за даним винаходом надають підвищеної стійкості до комах однодольній рослині.

Даний винахід додатково охоплює трансгенну рослину, що містить гетерологічну молекулу нуклеїнової кислоти або касету експресії за даним винаходом, яка під час транскрибування та трансляції надає підвищеної стійкості до комах. У переважних варіантах здійснення гетерологічна молекула нуклеїнової кислоти містить послідовність, на щонайменше 80 95, щонайменше 85 95, щонайменше 90 95, щонайменше 91 95, щонайменше 92 9565, щонайменше 9395, щонайменше 9495, щонайменше 9595, щонайменше 9695, щонайменше 97 95, щонайменше 98 95, щонайменше 99 95 або 100 95 ідентичну будь-якій із 5ЕО ІЮ МО: 1-3 або

ЗЕО ІО МО: 6-8. У додатковому варіанті здійснення трансгенна рослина містить гетерологічну молекулу нуклеїнової кислоти, що містить послідовність, на щонайменше 80 9о, щонайменше 8595, щонайменше 9095, щонайменше 9195, щонайменше 9295, щонайменше 93 95, щонайменше 94 95, щонайменше 95 95, щонайменше 96 95, щонайменше 97 965, щонайменше 98 95, щонайменше 99 95 або 100 95 ідентичну ЗЕО ІЮ МО: З або 5ЗЕО ІЮ МО: 8. У варіантах здійснення трансгенна рослина являє собою дводольну рослину. У переважних варіантах здійснення трансгенна рослина являє собою однодольну рослину. У додаткових варіантах здійснення трансгенна рослина являє собою люцерну, кріп, яблуню, абрикосове дерево, артишок, руколу, спаржу, авокадо, бананове дерево, бобові, буряк, ожину, чорницю, броколі, брюссельську капусту, качанну капусту, канолу, мускусну диню, моркву, касаву, цвітну капусту, селеру, вишню, кінзу, цитрусову рослину, клементин, кавове дерево, кукурудзу, бавовник, огірок, Дугласову ялицю, баклажан, цикорій салатний, салат ескаріоль, евкаліпт, фенхель, різновиди фігового дерева, пляшковий гарбуз, виноград, грейпфрут, диню мускатну білу, хікаму, ківі, салат-латук, різновиди цибулі-порею, лимон, лайм, сосну ладанну, мангове дерево, диню, гриб, горіх, окру, цибулю, апельсин, декоративну рослину, папаю, петрушку, горох, персикове дерево, земляний горіх, грушеве дерево, перець, хурму, сосну, ананас, плантайн, сливове дерево, гранатове дерево, тополю, картоплю, гарбуз, айву, сосну променисту, радікіо, редис, малину, рис, жито, сорго, південну сосну, сою, шпинат, гарбуз великий столовий, полуницю, цукровий буряк, соняшник, солодку картоплю, ліквідамбар, танжерин, чай, тютюн, томат, газонну траву, виноград культурний, кавун, ямс або цукіні. У переважних варіантах здійснення трансгенна рослина являє собою просо, просо лозоподібне, маїс, сорго, пшеницю, овес, газонну траву, пасовищну траву, льон, рис, цукрову тростину, олійний ріпак або ячмінь.

У ще одному варіанті здійснення трансгенна рослина за даним винаходом містить гетерологічну молекулу нуклеїнової кислоти, що містить послідовність промотора. У ще одному варіанті здійснення трансгенна рослина за даним винаходом може містити гетерологічну молекулу нуклеїнової кислоти, яка кодує щонайменше одну додаткову необхідну ознаку.

Додаткова ознака може бути закодована у тій самій гетерологічній молекулі нуклеїнової кислоти, що і молекула за даним винаходом, або вона може бути закодована у другій гетерологічній молекулі нуклеїнової кислоти. Додаткова необхідна ознака може надавати стійкості до комах стосовно другої комахи-шкідника, стійкості до комах стосовно тієї самої комахи-шкідника, толерантності до абіотичного стресу, чоловічої стерильності, стійкості до гербіцидів, стійкості до бактеріальних захворювань, стійкості до грибкових захворювань, стійкості до вірусних захворювань, стійкості до нематод, модифікованого метаболізму жирних кислот, модифікованого метаболізму вуглеводів, поліпшеної харчової цінності, поліпшених характеристик щодо промислового способу або зміненої репродуктивної здатності. Додаткова необхідна ознака також може стимулювати продукування в рослині цінного з комерційного погляду ферменту або метаболіту.

У варіантах здійснення необхідна додаткова ознака являє собою другий пестицидний засіб.

Другий пестицидний засіб може бути активним щодо будь-якого шкідника рослини, який включає комах, нематод, гриби, віруси або бактерії. Приклади комах-шкідників рослин включають без обмеження Міїарагмага 5рр. (наприклад, М. Ішдеп5 (буру рисову цикадку));

Іаодеірпах 5рр. (наприклад, 1/. вігіаїенйи5 (малу буру рисову цикадку)); Мерпоїейіх 5рр. (наприклад, М. мігех5сеп5 або М. сіпсіїсер5 (зелену цикадку) або М.підгоріссїи5 (рисову цикадку));

БЗодаїеНа 5рр. (наприклад, 5. Тшгсіїега (цикадку білоспинну)); Віїз5и5 5рр. (наприклад, В.

Іенисоріеги5 Іеисоріеги5 (блощицю постільну)); Зсоїпорпога 5рр. (наприклад, 5. мегтідиіаге (рисового довгоносика)); Асгозіегпит зрр. (наприклад, А. ПпПаге (зеленого жука-смердюка)); бо Рагпага 5рр. (наприклад, Р. дицайа (рисову товстоголовку)); Спо 5рр. (наприклад, С.

зирргеззаїйє (рисового смугастого стеблоїда), С. ашгісййш5 (золотистого стеблоїда) або б. роїуспгузи5 (чорноголового стеблоїда)); Спіїоїгаєа 5рр. (наприклад, С. роїуспгуза (рисового стеблоїда)); Зезатіа 5рр. (наприклад, 5. іп'егеп5 (рожевого рисового точильника)); Тгурогу;а 5рр. (наприклад, Т. іппоїадйа (білого рисового точильника) або Т. іпсегпішав (жовтого рисового точильника)); Спарпа|посгосі5 5рр. (наприклад, С. теаіпаїї5 (листокрутку рисову)); Адготула 5рр. (наприклад, А. огу/ає (листового мінера) або А. рагмісогпі5 (кукурудзяного крапкового листового мінера)); Оіайаєа б5рр. (наприклад, О. 5асспагайє (точильника цукрової тростини) або р. дгапаїозеПа (вогнівку кукурудзяну південно-західну)); Магтпада 5рр. (наприклад, М. аепеб5сеп5 (зелену рисову гусінь)); Хапіподез 5рр. (наприклад, Х. ігапзмегза (зелену гусінь)); Ззродоріега 5рр. (наприклад, 5. їтидірегда (совку трав'яну), 5. ехідча (совку малу), 5. ІШогаїї5 (єгипетську бавовникову совку) або 5. ргаєїйса (гусінь західної молі з жовтими смугами)); Муїпітпа 5рр. (наприклад, Муттпа (Рзецааї!еціа) зерегаїа (гусінь)); Неїїсомегра 5рр. (наприклад, Н. 7єа (гусінь совки бавовникової)); Соіазріє 5рр. (наприклад, С. Бгиппеа (листоїда виноградного));

Гіввотпоріги5 5рр. (наприклад, Ї. огулорпйи5 (довгоносика рисового водяного)); Еспіпоспетив 5рр. (наприклад, Е. зацпатоз (довгоносика рослин рису)); Рісіодізра 5рр. (наприклад, 0. аптідега (рисову шипоноску)); Ошепта 5рр. (наприклад, 0. огулає (листогриза); зпйорпіЇи5 5рр. (наприклад, 5. огулає (рисового довгоносика)); Распуаїіріовзіз 5рр. (наприклад, Р. огулає (рисову галицю));

НуагеїІа 5рр. (наприклад, Н. дгізеоїа (малого рисового листяного мінера) або Н. завзакії (личинку, що поїдає рисові стебла)); Спіогор5 5рр. (наприклад, С. огулає (личинку, що поїдає стебла));

Оіаргоїїса 5рр. (наприклад, О. мігдіїега мігудіїїега (західного кукурудзяного кореневого жука), 0. Багрегі (північного кукурудзяного кореневого жука), ОЮ. ипдаесітрипсіага Ппоуагаї (південного кукурудзяного кореневого жука), О. мігуїега 7еає (мексиканського кукурудзяного кореневого жука); 0. ракеаїа (жука-блішку облямованого)); О5ігіпіа 5рр. (наприклад, О. пибіїаїї5 (вогнівку кукурудзяну)); Адгоїі5 5рр. (наприклад, А. ірзіюп (совку-іпсилон)); Еіазтораїриз 5рр. (наприклад,

Е. ІдпобеПйи5 (малого точильника кукурудзяного стебла)); Меїапоїш5 5рр. (дротяників);

Сусіосерпаіа 5рр. (наприклад, С. Богеаїї5 (північного хруща) або С. іттасціага (південного хруща)); Роріййа взрр. (наприклад, Р. іаропіса (хрущика японського)); Спаєїоспета 5зрр. (наприклад, С. риїїсагіа (кукурудзяного жука-блішку)); 5рпепорпоги5 5рр. (наприклад, 5. таїаів (довгоносика маїсового)); КПпораІозірпит 5рр. (наприклад, К. таїді5 (попелицю кукурудзяну

Зо листяну)); Апигарпіз 5рр. (наприклад, А. таїдігадісіз (попелицю кукурудзяну кореневу));

Меїапоріи5 5рр. (наприклад, М. Тептиггибгит (кобилку червононогу) М. айегепйаїй5 (кобилку відмітну) або М. запдиіпіре5 (мігруючу кобилку)); Нуіетуа 5рр. (наприклад, Н. ріашга (личинку мухи росткової)); АпарпоїНгір5 5рр. (наприклад, А. ор5сгиги5 (трипса злакового)); ЗоІепорвів 5рр. (наприклад, 5. тіїезїа (мураху-крадія)); або 5рр. (наприклад, Т. ипісає (звичайного павутинного кліща), Т. сіппабагіпиз (червоного павутинного кліща); Неїїсомегра 5рр. (наприклад, Н. 76а (коробкового хробака) або Н. аптідега (совку бавовникову)); Ресііпорпога 5рр. (наприклад, Р. до55уріейа (рожевого коробкового хробака)); Еагіаз 5рр. (наприклад, Е. міцеМПйа (крапкового коробкового хробака бавовни)); Неїїоїпі5 5рр. (наприклад, Н. міге5сеп5 (тютюнову листокрутку));

Апіпопотих 5рр. (наприклад, А. дгапаї5 (довгоносика бавовникового)); Рзецйдайтобзсеїї5 5рр. (наприклад, Р. 5егіаш5 (марокканську кобилку)); Тгіаіеигоде5 5рр. (наприклад, Т. арийШопеив5 (білокрилку зі смугами на крилах), Т. марогагіогит (білокрилку тепличну)); Ветівсіа 5рр. (наприклад, В. агдепійоїйї (білокрилку срібнокрилу)); Арпів 5рр. (наприклад, А. доззурії (попелицю бавовникову)); Гуди5 5рр. (наприклад, ГІ. Ііпеоїагі5 (клопа польового) або ГІ. Ппезрегив5 (західного клопа лугового)); Еизспібти5 5рр. (наприклад, Е. соп5регзи5 (жука-смердюка, що маскується));

СПіогоспгоа 5рр. (наприклад, С. зауї (жука-смердюка Зау)); Мегага 5рр. (наприклад, М. мігідша (південного зеленого жука-смердюка)); ТПгір5 5рр. (наприклад, Т. їабрасі (трипса цибулевого));

ЕгапкіїпіеНа 5рр. (наприклад, Р. їи5са (трипса тютюнового) або Р. оссідепіаїї5 (західного трипса звичайного)); І ерііпоїагза 5рр. (наприклад, ГІ. десептіїпеага (жука колорадського картопляного),

Г. фипсіа (несправжнього картопляного жука) або /. їехапа (техаського несправжнього картопляного жука)); Гета 5рр. (наприклад, І. ігіїпеага (картопляного жука з трьома смугами));

Еріїгіх 5рр. (наприклад, Е. сиситегіх (картопляного жука-блішку), Е. Ппігіреппів5 (жука-блішку) або

Е. шбегі5 (жука-блішку бульбочкового)); Ерісаша 5рр. (наприклад, Е. мага (шпанку смугасту));

Рпаєдоп 5рр. (наприклад, Р. соспієагіає (гірчичного листогриза)); Еріаснпа 5рр. (наприклад,

Е. мапмеїїв (мексиканського жука бобового)); АсНеїа 5рр. (наприклад, А. дотевіїсив5 (цвіркуна домового)); Етроазса 5рр. (наприклад, Е. Табає (цикадку картопляну)); Муиз 5рр. (наприклад,

М. регзісае (попелицю персикову зелену)); Рагаїйіола 5рр. (наприклад, Р. соскКегеїЇ (листоблішку)); Соподеги5 5рр. (наприклад, С. Таїїї (південного картопляного дротяника) або б. мезрепіпи5 (тютюнового дротяника)); Рійшпогітаєа 5рр. (наприклад, Р. орегсціейа (личинку виїмчастокрилої молі)); Масгозірпит 5рр. (наприклад, М. еирпогріае (попелицю картопляну бо звичайну)); ТПпуапіа 5рр. (наприклад, Т. раїйадомігеп5 (червоноплечого жука-смердюка));

РІіївогітаєа 5рр. (наприклад, Р. орегсшеїйа (личинку виїмчастокрилої молі)); Неїїсомегра 5рр. (наприклад, Н. 7е6а (совку томатну); Кеїйїегпа 5рр. (наприклад, К. ІусорегзісеМПа (гострицю томатну)); Гітопіцв5 5рр. (дротяників); Мапаиса 5рр. (наприклад, М. зехіа (тютюнового бражника) або М. диіпдоетасціага (томатного бражника)); Гігіотуа 5рр. (наприклад, Г. заїїмає, Г. їгітоїЇї або

Ппиїдобгепвзіз (листового мінера)); ОгозорпіПа врр. (наприклад, О. теїаподавієг, 0. уакива, р. рвендоорвсига або 0. вітціапе); Сагабив зрр. (наприклад, С. дгапиіацв5); Спігопотив з5рр. (наприклад, С. їепіапи5); СтепосерпНаїїдез рр. (наприклад, С. Геїї (блоху котячу)); Оіаргерез 5рр. (наприклад, О. арргеміай5 (скосаря люцернового)); Ір5 5рр. (наприклад, !. ріпі (короїда соснового)); Тіроїїшт врр. (наприклад, Т. савіапеит (хрущака малого булавовусого)); Сіовзвіпа врр. (наприклад, Сї. тог5йапе (муху цеце)); Апорпеєїе5 5рр. (наприклад, А. датбріає (комара малярійного)); Неїїсомегра 5рр. (наприклад, Н. аптідега (африканську совку бавовникову));

Асупповірноп 5рр. (наприклад, А. рівзит (попелицю горохову)); Арі5 5рр. (наприклад, А. теїПега (медоносну бджолу)); Нотаїодієса 5рр. (наприклад, Н. соадшіайє (цикадку з дзеркальними крилами)); Аєде5 5рр. (наприклад, Ає. аєдурії (жовтолихоманкового комара)); Вотбрух 5рр. (наприклад, В. тогї (шовковичного хробака)); ІГосивіа 5рр. (наприклад, І. тідгаюгіа (мігруючу сарану)); Воорпійш5 5рр. (наприклад, В. тісторіиє (кліща кільчастого)); Асапіпозситіа 5рр. (наприклад, А. дотевзіапа (рудого шоколадного птахоїда)); Оіріорієта 5рр. (наприклад, 0. рипсіаїа (тихоокеанського жука-таргана)); Неїїсопіи5 5рр. (наприклад, Н. ега (червоного метелика-листоношу) або Н. теїротепе (метелика-листоношу)); Сигсшіо врр. (наприклад, б. діапат (плодожила дубового)); РішеїМа 5рр. (наприклад, Р. хуїовієїа (міль капустяну));

Атбріуотта 5рр. (наприклад, А. магпедайт (кліща кільчастого)); Апієгтаєа 5рр. (наприклад,

А. уататаї (шовкопряда)) і Аппідегез 5рр. (наприклад, А. зибаїраїив).

Інсектицидні білюи за даним винаходом можуть використовуватись у комбінації з іншими пестицидними засобами (наприклад, білками Сту ВІ) з розширенням цільового діапазону шкідників. Крім того, застосування інсектицидних білків за даним винаходом у комбінації з інсектицидним засобом, який характеризується відмінним механізмом дії або цілеспрямовано впливає на інший рецептор у кишківнику комахи, характеризується особливою корисністю щодо попередження появи стійкості у комах і/або керування нею.

Другий пестицидний засіб може являти собою інсектицидний білок, одержаний із Васіши5

Ішгіпдієпвіз. Інсектицидний білок В. ІШигіпдієпбіз може являти собою будь-який із декількох інсектицидних білків, зокрема без обмеження білок Стуї, білок СтуЗ, білок Сту7, білок Стув8, білок

Сту!1, білок Сту22, білок Сту23, білок СтуЗб, білок СтуЗ37, білок Сту34 разом із білком Стуз5, бінарний інсектицидний білок СТУЕТЗЗ і СтТуЕТЗ34, бінарний інсектицидний білок ТІС100 ї ТІСТО, бінарний інсектицидний білок РО149В1, МІР (вегетативний інсектицидний білок, розкритий у патентах США 5849870 і 5877012, включених у даний документ за допомогою посилання),

ТІС900 або споріднений білок, ТІС901, ТІС1201, ТІС407, ТІС417, модифікований білок СтуЗА або гібридні білки або химери, одержані з будь-яких вищевказаних інсектицидних білків. В інших варіантах здійснення інсектицидний білок В. Іпигпдіепвіз вибраний із групи, що складається з

СтузвВЬт, СтуЗзаАВІ разом із СтузБАбІ, тСтузА (патент США Мо 7276583, включений у даний документ за допомогою посилання), естуЗ.1АЬ (патент США Мо 8309516, включений у даний документ за допомогою посилання) і білки МірзА, зокрема МірзЗАа (патент США Мо 6137033, включений у даний документ за допомогою посилання).

В інших варіантах здійснення трансгенна рослина за даним винаходом може містити другий пестицидний засіб, який може бути одержаний із джерел, відмінних від В. (пигіпдіепві5. Другий інсектицидний засіб може являти собою засіб, вибраний із групи, що складається з а-амілази, пероксидази, холестеролоксидази, пататину, протеази, інгібітора протеази, уреази, інгібітора альфа-амілази, пороутворювального білка, хітинази, лектину, сконструйованих антитіл або фрагмента антитіла, інсектицидного білка Васійц5 сегеи5, інсектицидного білка Хепотпараиз 5рр. (такого як Х. петаїйорпйа або Х. Бомієпії), інсектицидного білка Рпоїогпарадив 5рр. (такого як

Р. Іштіпезсеп5 або Р. авзуторбіоїіса), інсектицидного білка ВгемібасйШиє5 5рр. (такого як

В. Іаїегозрогои5), інсектицидного білка І узіпірасійи5 5рр. (такого як Г.. 5рпеєагіси5), інсектицидного білка Спготобрасіегішт 5рр. (такого як С. 5,иБрізидає або С. різсіпає), інсектицидного білка

Уегвіпіа 5рр. (такого як У. епіоторпада), інсектицидного білка РаєпірасіШи5 5рр. (такого як

Р. ргоруїіаєа), інсектицидного білка Сіовігідішт 5рр. (такого як С. Бітеппепіап5), Рзендотопав 5рр. (такого як Р. Пиогезсепв) і лігніну. В інших варіантах здійснення другий засіб може являти собою щонайменше один інсектицидний білок, одержаний з інсектицидного токсинового комплексу (Тс) з Рпоїогпарац», Хепогпарив, 5еїтайа або МУегвзіпіа. В інших варіантах здійснення інсектицидний білок може являти собою АЮР-рибозилтрансферазу, одержану з інсектицидних бактерій, таких як Рпоїогпараи» 55р. У ще інших варіантах здійснення інсектицидний білок може 60 являти собою Ахіті205 або бути одержаний з Ахті205 (патент США Мо 8575425 і Мо 9394345,

кожний включений у даний документ за допомогою посилання). В інших варіантах здійснення інсектицидний білок може являти собою МІР-білок, такий як МІР1 і/або МІР, із В. сегеи5. У ще одних варіантах здійснення інсектицидний білок може являти собою бінарний токсин, одержаний з інсектицидних бактерій, такий як ІРА і ІЗРІ2А з В. Іагегозрогоцз або ВіпА і ВіпВ з

Ї.5рпаегісих. У ще одних варіантах здійснення інсектицидний білок може бути сконструйованим, або може бути гібридним, або химерою з будь-яких попередніх інсектицидних білків.

У деяких варіантах здійснення трансгенна рослина за даним винаходом може містити та/або експресувати щонайменше другий пестицидний засіб, який є відмінним від молекул білкової природи. У деяких варіантах здійснення другий пестицидний засіб може бути присутнім на поверхні рослини, наприклад, як місцеве застосування. У переважних варіантах здійснення другий пестицидний засіб являє собою молекулу інтерферувальної РНК. Зазвичай інтерферувальна РНК містить щонайменше фрагмент РНК, що відповідає цільовому гену, спейсерну послідовність і другий фрагмент РНК, який є комплементарним першому, завдяки чому може утворюватись двониткова структура РНК. РНК-інтерференція (КМАЇ) відбувається тоді, коли організм розпізнає молекули двониткової РНК (а5КМА) і гідролізує їх. Одержані продукти гідролізу являють собою невеликі фрагменти РНК довжиною приблизно 19- 24 нуклеотидів, що називаються малими інтерферувальними РНК (5ікМА). Потім 5ікМА поширюються або розносяться по всьому організму, зокрема через клітинні мембрани, де вони гіобридизуються з теМА (або іншими РНК) і спричинюють гідроліз РНК. Інтерферувальні РНК розпізнаються комплексом сайленсингу РНК-інтерференції (КІЗС), в який уводиться ефекторна нитка (або "спрямовувальна нитка") РНК. Ця спрямовувальна нитка діє як матриця для розпізнавання й руйнування дуплексних послідовностей. Цей процес повторюється щоразу, коли 5іЕМА гібридизується з комплементарною їй цільовою РНК, ефективно запобігаючи трансляції таких теЕМА, і в такий спосіб "сайленсингу" зазнає експресія специфічних генів, з яких були транскрибовані теМА. Інтерферувальні РНК відомі з рівня техніки як застосовувані для контролю комах (див., наприклад, публікацію МО 2013/192256, включену у даний документ за допомогою посилання). Інтерферувальна РНК, призначена для застосування у контролі комах, забезпечує одержання двониткової РНК, що не існує в природі, яка користується

Зо нативними шляхами КМАЇї у комахи для запуску знижуючої регуляції цільових генів, що може зумовлювати припинення поїдання і/або росту і може зумовлювати загибель комахи-шкідника.

Молекула інтерферувальної РНК може надавати стійкості до комах щодо того самого цільового шкідника, що і білок за даним винаходом, або може цілеспрямовано впливати на іншого шкідника. Цільова комаха-шкідник рослини може живитися шляхом жування, смоктання або проколювання. Інтерферувальні РНК відомі з рівня техніки як застосовні для контролю комах.

У варіантах здійснення аД5КМА, придатна для контролю комах, описана в заявках на патент згідно з РСТ МоМо РСТ/О517/044825; РСТ/О517/044831; РСТ/О517/044832, включених у даний документ за допомогою посилання. У варіантах здійснення а5КЕМА, придатна для контролю комах, описана в патентах США МоМо 92388223, 9340797 або 8946510, включених у даний документ за допомогою посилання. У варіантах здійснення а5КЕМА, придатна для контролю комах, описана в заявках на патент США МоМо 12/868994, 13/831230, 14/207313 або 14/207318, включених у даний документ за допомогою посилання. В інших варіантах здійснення інтерферувальна РНК може надавати стійкості щодо шкідника рослин, відмінного від комахи, такої як нематода-шкідник або вірус-шкідник.

Спільна експресія більш ніж одного пестицидного засобу в одній трансгенній рослині може бути досягнута шляхом одержання одинарного рекомбінантного вектора, що містить кодувальні послідовності більш ніж одного пестицидного засобу у так званому молекулярному стеку, і генетичного конструювання рослини, яка б містила і експресувала всі ці пестицидні засоби у трансгенній рослині. Такі молекулярні стеки також можуть бути одержані із застосуванням міні- хромосом, які описані, наприклад, у патенті США 7235716. Альтернативно трансгенна рослина, яка містить одну нуклеїнову кислоту, яка кодує перший пестицидний засіб, може бути повторно трансформована за допомогою іншої нуклеїнової кислоти, що кодує другий пестицидний засіб, тощо. Альтернативно рослина, батьківська форма 1, може бути одержана за допомогою способів генної інженерії для експресії генів за даним винаходом. Друга рослина, батьківська форма 2, може бути одержана за допомогою способів генної інженерії для експресії другого пестицидного засобу. Шляхом схрещування батьківської форми 1 із батьківською формою 2 одержують рослини-потомки, які експресують усі гени, введені у батьківські форми 1 і 2.

Трансгенні рослини або насінина, що містять та/або експресують інсектицидний білок за даним винаходом, також можуть бути оброблені інсектицидом або інсектицидним покриттям для 60 насіння, яке описане в патентах США МоМо 5849320 і 5876739, включених у даний документ за допомогою посилання. У варіантах здійснення, якщо як інсектицид або інсектицидне покриття для насіння, так і трансгенна рослина або насінина за даним винаходом активні щодо однієї цільової комахи, наприклад твердокрилого шкідника або цільового шкідника Оіабгоїїса, то ця комбінація застосовна (ї) у способі додаткового посилення активності композиції за даним винаходом щодо цільової комахи, та/або (ії) у способі попередження розвитку стійкості до композиції за даним винаходом шляхом забезпечення ще одного механізму дії щодо цільової комахи. Таким чином, у варіантах здійснення даний винахід передбачає спосіб підвищення контролю популяції комах Оіаргоїїса, що передбачає забезпечення трансгенної рослини або насінини за даним винаходом і застосування щодо рослини або насінини інсектициду або інсектицидного покриття для насіння, призначеного для трансгенної рослини або насінини за даним винаходом.

Навіть у тому випадку, якщо інсектицид або інсектицидне покриття для насіння є активними щодо іншої комахи, інсектицид або інсектицидне покриття для насіння придатні для розширення діапазону контролю комах, наприклад, за допомогою додавання інсектициду або інсектицидного покриття для насіння, яке характеризується активністю щодо лускокрилих комах, до трансгенної насінини за даним винаходом, що в деяких варіантах здійснення характеризується активністю щодо твердокрилих і деяких лускокрилих комах, при цьому одержана покрита трансгенна насінина забезпечує контроль як лускокрилих, так і твердокрилих комах-шкідників.

Приклади таких інсектицидів та/або інсектицидних покриттів для насіння включають без обмеження карбамат, піретроїд, фосфорорганічну сполуку, фрипрол, неонікотиноїд, хлорорганічну сполуку, нереїстоксин або їх комбінацію. В іншому варіанті здійснення інсектицид або інсектицидне покриття для насіння вибрані з групи, що складається з карбофурану, карбарилу, метомілу, біфентрину, тефлутрину, перметрину, цифлутрину, лямбда-цигалотрину, циперметрину, дельтаметрину, хлорпірифосу, хлоретоксифосу, диметоату, етопрофосу, малатіону, метил-паратіону, форату, тербуфосу, тебупіриміфосу, фіпронілу, ацетаміприду, імідаклоприду, тіаклоприду, тіаметоксаму, ендосульфану, бенсултапу та їх комбінації.

Комерційні продукти, що містять такі інсектициди й інсектицидні покриття для насіння, включають без обмеження ЕРигадап?б (карбофуран), І апает (мезоміл, метоміл, месоміл), бЗеміпФ (карбарил), Таїєтакю (біфентрин), БРогсе??ж |(тефлутрин), АттофФ (циперметрин),

Зо Сутри5пФ (циперметрин), Оейка СоїЇдФе (дельтаметрин), Кагагетф (лямбда-цигалотрин), АтривзпФ (перметрин), РошпсеФ (перметрин), ВгідадетФ (біфентрин), Саріиге?Ф (біфентрин), РгозпівеїдйФ (тефлутрин), УМагтіог (лямбда-цигалотрин), бБигерапФ (хлорпірифос), Еопігеб55Ф (хлоретоксифос), Мосарф (етопроп), Тпітеке (форат), Аазіагю (форат, флуцитинат), Катран (форат), Соипіекю (тербуфос), СудопФ (диметоат), Оісарійоп, КедепіФ (фіпроніл), Стиїбегк (тіаметоксам), Сайспоф (імідаклоприд), Ргезсогіреє (імідаклоприд), РопспоФ (клотіанідин) і

Адесф (цифлутрин, тебупіримфос).

Даний винахід також охоплює композицію, що містить ефективну для контролю комах кількість інсектицидного білка відповідно до даного винаходу. У додаткових варіантах здійснення композиція містить придатний сільськогосподарський носій і поліпептид за даним винаходом з інсектицидною активністю. Сільськогосподарський носій може передбачати допоміжні речовини, речовини, що полегшують змішування, посилюючі засоби тощо, доцільні для застосування активного інгредієнта, такого як поліпептид за даним винаходом, зокрема поліпептид, що містить амінокислотну послідовність, яка на щонайменше 80 95, щонайменше 85 965, щонайменше 90 95, щонайменше 95 95 або 100 95 ідентична будь-якій із БЕО ІЮ МО: 4,

ЗЕО ІЮ МО: 5 або 5ЕО ІЮО МО: 9. Придатні носії не повинні бути фітотоксичними щодо цінних культур, зокрема за концентрацій, використовуваних для застосування композицій за наявності культур, і не повинні вступати у хімічну реакцію зі сполуками активного інгредієнта, описаного у даному документі, а саме поліпептидом за даним винаходом або іншими інгредієнтами композиції. Такі суміші можуть бути розроблені для безпосереднього застосування щодо культур або можуть являти собою концентрати або склади, які зазвичай розводять додатковими носіями й допоміжними засобами перед застосуванням. Вони можуть включати інертні або активні компоненти і можуть являти собою тверді речовини, такі як, наприклад, дусти, порошки, гранули, дисперговні у воді гранули або змочувані порошки, або рідини, такі як, наприклад, здатні до емульгування концентрати, розчини, емульсії або суспензії. Придатні сільськогосподарські носії можуть включати рідкі носії, наприклад воду, толуол, ксилол, лігроїн, рослинну олію, ацетон, метилетилкетон, циклогексанон, трихлоретилен, перхлоретилен, етилацетат, амілацетат, бутилацетат, монометиловий етер пропіленгліколю та монометиловий етер діетиленгліколю, метанол, етанол, ізопропанол, аміловий спирт, етиленгліколь, пропіленгліколь, гліцерин тощо. Загалом вода є переважним носієм для розведення бо концентратів. Придатні тверді носії можуть включати тальк, пірофілітову глину, кремнезем,

атапульгітову глину, кізельгур, крейду, діатомову землю, вапно, карбонат кальцію, бентонітову глину, фулерову землю, лушпиння насіння бавовнику, пшеничне борошно, соєве борошно, пемзу, деревне борошно, борошно зі шкаралупи волоського горіха, лігнін тощо. В іншому варіанті здійснення поліпептид за даним винаходом може бути інкапсульованим у синтетичній матриці, такій як полімер, і нанесеним на поверхню хазяїна, такого як рослина. Поїдання комахою клітин-хазяїв забезпечує доставку у комаху засобів для контролю комах і зумовлює токсичний ефект у комахи-шкідника.

У додаткових варіантах здійснення композиція за даним винаходом може являти собою порошок, дуст, пелету, гранулу, рідину для розпилення, емульсію, колоїдну речовину або розчин. Композиція за даним винаходом може бути одержана шляхом зневоднення, ліофілізації, гомогенізації, екстракції, фільтрації, центрифугування, осадження або концентрації культури бактеріальних клітин. Композиція за даним винаходом може містити щонайменше 1 95, щонайменше 595, щонайменше 1095, щонайменше 20 95, щонайменше 2595, щонайменше 3095, щонайменше 3595, щонайменше 4095, щонайменше 5095, щонайменше 60 95, щонайменше 70 9о, щонайменше 80 96, щонайменше 90 956, щонайменше 95 9565, щонайменше 97 95 або щонайменше 99 95 за вагою поліпептиду за даним винаходом.

У варіантах здійснення композиція за даним винаходом може містити щонайменше другий пестицидний засіб (наприклад, який може бути експресований трансгенним шляхом із рослини та/або включений у композицію), що може бути інсектицидним, нематоцидним, фунгіцидним або бактерицидним. Щонайменше другий пестицидний засіб може бути інсектицидним щодо тієї ж комахи, що і поліпептид за даним винаходом, або щодо іншої комахи. Другий пестицидний засіб може являти собою поліпептид. Пестицидний засіб може являти собою інтерферувальну РНК (наприклад, а45Е2ЕМА). Другий пестицидний засіб може являти собою мікроорганізм, такий як бактерії, який містить молекулу нуклеїнової кислоти, що кодує пестицидний засіб, і/або містить пестицидний засіб, такий як поліпептид або інтерферувальна РНК. Мікроорганізм може бути атенуйованим, інактивованим нагріванням або ліофілізованим. Мікроорганізм може бути мертвим або не здатним до відтворення. Другий пестицидний засіб може являти собою інсектицид, наприклад, карбофуран, карбарил, метоміл, біфентрин, тефлутрин, перметрин, цифлутрин, лямбда-цигалотрин, циперметрин, дельтаметрин, хлорпірифос, хлоретоксифос,

Зо клотіанідин, диметоат, етопрофос, малатіон, метил-паратіон, форат, тербуфос, тебупіриміфос, фіпроніл, ацетаміприд, імідаклоприд, тіаклоприд, тіаметоксам, ендосульфан, бенсултап або їх комбінацію або комерційний продукт, що містить такі інсектициди й інсектицидне покриття для насіння, як описані вище.

Композиція за даним винаходом, наприклад композиція, що містить поліпептид за даним винаходом і прийнятний із погляду сільського господарства носій, може застосовуватись у традиційних агротехнічних способах. Прийнятний із погляду сільського господарства носій являє собою склад, застосовний для нанесення на рослину або насінину композиції, що містить поліпептид за даним винаходом. Наприклад, композиції за даним винаходом можна змішувати з водою та/або добривами і можна застосовувати щодо бажаного місця зростання/існування до появи сходів та/або після появи сходів будь-яким способом, як, наприклад, за допомогою розпилювальних баків літаків, зрошувального обладнання, розпилювального обладнання безпосереднього впорскування, ранцевих розпилювальних баків, бочок для купання худоби, фермерського обладнання, застосовуваного в наземному розпиленні (наприклад, штангові розпилювачі, ручні розпилювачі), тощо. Бажане місце зростання/снування може являти собою грунт, рослини тощо.

Композицію за даним винаходом можна застосовувати щодо насінини або частини рослини для вегетативного розмноження в будь-якому фізіологічному стані у будь-який час між збиранням насінини й посівом насінини, під час або після посіву і/або після проростання.

Переважно, щоб насінина або частина рослини для вегетативного розмноження перебували в достатньо стійкому стані, щоб у процесі обробки вони не зазнавали або зазнавали мінімального ушкодження, зокрема фізичного ушкодження або біологічного ушкодження. Склад можна застосовувати щодо насіння або частин рослини для вегетативного розмноження із застосуванням традиційних методик і пристроїв для нанесення покриття, таких як методики з використанням псевдозрідженого шару, спосіб із використанням вальцьового млина, ротостатичні протравлювачі насіння і барабани для нанесення покриттів.

Даний винахід також передбачає спосіб контролю популяції лускокрилих і/або твердокрилих шкідників, що передбачає приведення вказаної популяції в контакт з ефективною для контролю комах кількістю поліпептиду за даним винаходом з інсектицидною активністю, де поліпептид на щонайменше 80 95, щонайменше 85 95, щонайменше 90 95, щонайменше 91 9565, щонайменше 60 9295, щонайменше 9395, щонайменше 9495, щонайменше 9595, щонайменше 96 95,

щонайменше 97 96, щонайменше 98 95, щонайменше 99 95 або на 100 95 ідентичний ЗЕО ІЮ

МО:4, 5ЕБЕО ІО МО: 5 або 5ЕО ІО МО: 9. Приведення в контакт передбачає представників популяції шкідників, що поїдають або поглинають поліпептид. Поліпептид може бути введений у раціон комахи або може експресуватись у рослинній тканині, яку комаха потім поїдає, або бути наявним на ній. У додаткових варіантах здійснення здійснення контролю популяцій лускокрилих іабо твердокрилих шкідників включає знищення комах шляхом приведення комах у контакт з ефективною для контролю комах кількістю поліпептиду за даним винаходом.

Даний винахід також передбачає спосіб захисту рослини від комахи-шкідника, що передбачає забезпечення експресії у рослині або рослинній клітині нуклеотидної послідовності або касети експресії, яка кодує інсектицидний поліпептид за даним винаходом. У варіантах здійснення нуклеотидна послідовність на щонайменше 80 9565, щонайменше 85 9565, щонайменше 9095, щонайменше 9195, щонайменше 9295, щонайменше 9395, щонайменше 94 95, щонайменше 95 95, щонайменше 96 95, щонайменше 97 95, щонайменше 98 95, щонайменше 99 95 або на 100 95 ідентична нуклеотидній послідовності під 5ЕО ІЮ МО: 1-3 або 5ЕО ІЮО МО: 6-8 або кодує поліпептид, що містить амінокислотну послідовність, яка на щонайменше 80 95, щонайменше 85 9о, щонайменше 90 96, щонайменше 91 956, щонайменше 92 965, щонайменше 9395, щонайменше 9495, щонайменше 9595, щонайменше 9695, щонайменше 97 95, щонайменше 98 95, щонайменше 99 95 або на 100 95 ідентична ЗЕО ІЮ МО: 4, 5ЕО ІЮО МО: 5 або

ЗЕО ІО МО: 9. У додаткових варіантах здійснення рослина або рослинна клітина продукують інсектицидний поліпептид з інсектицидною активністю щодо лускокрилого та/або твердокрилого шкідника.

Даний винахід також передбачає спосіб підвищення врожайності у рослини, який передбачає вирощування в полі рослини або її насінини, що містять стабільно вбудовану в її геном молекулу нуклеїнової кислоти касети експресії за даним винаходом, і де вказане поле інфіковане шкідником, щодо якого вказаний поліпептид характеризується інсектицидною активністю.

Після того як необхідна нуклеїнова кислота трансформована у конкретний вид рослини, вона може поширюватись у цьому виді або переходити в інші сорти цього ж виду за допомогою традиційних технологій розведення, особливо, зокрема, комерційно важливі сорти.

Зо У варіантах здійснення нуклеїнова кислота за даним винаходом експресується в трансгенних рослинах, зумовлюючи таким чином біосинтез відповідного інсектицидного білка у трансгенних рослинах. Таким чином створюються трансгенні рослини з підвищеною стійкістю до комах, зокрема кукурудзяного кореневого жука. Для їх експресії у трансгенних рослинах нуклеїнові кислоти за даним винаходом необов'язково можуть бути модифіковані та оптимізовані. Хоча у багатьох випадках гени з мікробних організмів можуть експресуватись у рослинах на високих рівнях без модифікації, у трансгенних рослинах може відбуватися низька експресія мікробних нуклеїнових кислот, що містять кодони, які не є переважними у рослинах. Із рівня техніки відомо, що всі організми мають специфічні переваги щодо використання кодонів, і при цьому кодони нуклеїнових кислот, описаних у даному винаході, можуть бути змінені відповідно до характерних для рослин переваг з одночасним збереженням кодованих ними амінокислот. Крім того, високий рівень експресії в рослинах найліпше досягається у випадку кодувальних послідовностей із вмістом СС, що становить щонайменше приблизно 35 95, переважно більш ніж приблизно 45 95, більш переважно більш ніж приблизно 50 95 і найбільш переважно більш ніж приблизно 60 95. Нуклеїнові кислоти мікроорганізмів із низьким вмістом С можуть недостатньо експресуватись у рослинах у зв'язку з наявністю мотивів АТТТА, які можуть дестабілізувати транскрипти, та мотивів ААТААА, що можуть зумовлювати неналежне поліаденілювання. У варіантах здійснення послідовності можна модифікувати з урахуванням певних переваг щодо кодонів і переваг щодо вмісту С для однодольних або дводольних рослин, оскільки було показано, що ці переваги відрізняються (Мигтау єї аї. Мисі. Асійд5 Вев. 17:477-498 (1989)). Крім того, здійснюється скринінг нуклеїнових кислот щодо наявності нестандартних сайтів сплайсингу, які можуть спричиняти усічення транскрипту. Усі зміни, які необхідно виконати всередині нуклеїнових кислот, такі як описані вище, можуть бути виконані із застосуванням широко відомих методик сайт-спрямованого мутагенезу, ПЛР ії конструювання синтетичних генів, наприклад, із застосуванням способів, описаних в опублікованих патентних заявках ЕР 0385962, ЕР 0359472 і УМО 93/07278.

В одному варіанті здійснення даного винаходу кодувальна послідовність інсектицидного білка за даним винаходом одержана відповідно до процедури, розкритої у патенті США 5625136, включеному у даний документ за допомогою посилання. У цій процедурі застосовують переважні для маїсу кодони, тобто один кодон, який найчастіше кодує дану амінокислоту у 60 маїсі. Переважний для маїсу кодон для конкретної амінокислоти може бути одержаний,

наприклад, із відомої генної послідовності маїсу. Частота використання кодонів для маїсу для 28 генів рослин маїсу наявна у Миггау еї аї., Мисієвїс Асіа5 Кезеагсй 17:477-498 (1989), розкриття якого включене у даний документ за допомогою посилання.

Так само нуклеотидні послідовності можуть бути оптимізовані для експресії в будь-якій рослині. Зрозуміло, що вся послідовність гена або будь-яка її частина можуть бути оптимізованими або синтетичними. Тобто також можуть застосовуватись синтетичні або частково оптимізовані послідовності.

Для більш ефективної ініціації трансляції можна модифікувати послідовності, які прилягають до ініціювального метіоніну. Наприклад, вони можуть бути модифіковані шляхом включення послідовностей, які, як відомо, є ефективними в рослинах. до5Ппі запропонував придатну консенсусну послідовність для рослин (МАК 15:6643-6653 (1987)), а Сіопіесп пропонує додаткову консенсусну послідовність, яка є ініціатором трансляції (каталог 1993/1994, с. 210). Ці консенсусні послідовності придатні для використання з нуклеїновими кислотами за даним винаходом. У варіантах здійснення послідовності вбудовані у конструкції, що містять нуклеїнові кислоти, аж до АТО і включно (при цьому друга амінокислота залишається немодифікованою) або в альтернативному варіанті - аж до СТС, наступної за АТО (із можливістю модифікування другої амінокислоти даного трансгена), і включно.

Експресія нуклеїнових кислот у трансгенних рослинах керується промоторами, які функціонують у рослинах. Вибір промотора буде змінюватись залежно від часових і просторових вимог для експресії, а також залежно від цільового виду. Таким чином переважною є експресія нуклеїнових кислот за даним винаходом у листі, стеблах або стовбурах, у качанах, у суцвіттях (наприклад, у шипах, мітлицях, кісточках тощо), у коренях і/або саджанцях. Однак у багатьох випадках потрібен захист від більш ніж одного типу комахи-шкідника, і, відповідно, бажаною є експресія в декількох тканинах. Хоча, як було показано, багато промоторів із дводольних рослин функціонують в однодольних рослинах, і навпаки, у міру можливості промотори дводольних вибирають для експресії у дводольних рослинах, а промотори однодольних вибирають для експресії в однодольних рослинах. Однак не існує яких-небудь обмежень щодо походження вибраних промоторів; достатньо, щоб вони ефективно керували експресією нуклеїнових кислот у необхідній клітині.

Зо В одному варіанті здійснення застосовуються промотори з конститутивною експресією, у тому числі актин або убіквітин, або промотори СМР, або промотори Самм 355 і 195. Нуклеїнові кислоти за даним винаходом також можуть експресуватись під контролем промоторів, які регулюються хімічним шляхом. Переважна технологія для хімічної індукції експресії генів докладно викладена в опублікованій заявці ЕР 0332104 (Сіра-Сеїду) і патенті США Мо 5614395.

Переважним промотором для хімічної індукції є промотор тютюну РЕ-та.

В іншому варіанті здійснення може застосовуватись категорія промоторів, індуковних ушкодженням. Були описані численні промотори, які експресуються у ділянках поранення, а також у ділянках інфікування фітопатогеном. Оптимально такий промотор повинен бути активним лише локально у місцях інфекції, і таким чином інсектицидні білки за даним винаходом накопичуються лише у клітинах, в яких необхідно синтезувати білки для знищення інвазивних комах-шкідників. Переважні промотори цього типу включають такі, які описані в «Зіапіога еї аї. Мої. Сеп. Сепеї. 215:200-208 (1989), Хи вї а. Ріапі Моїеєс. Віої. 22:573-588 (1993),

Ї одетапп єї аї. Ріапі СеїЇ 1:1151-158 (1989), Вопгтеїієг 8 І епіє, Ріапі Моїес. Вісі. 22:783-792 (1993), Рігек єї а. Ріапі Моїес. Віої. 22:129-142 (1993) та Матег евї а. Ріапі 9. 3:191-201 (1993).

Тканиноспецифічними або переважними для тканини промоторами, застосовними для експресії генів, що кодують інсектицидні білюи за даним винаходом у рослинах, зокрема кукурудзі, є промотори, які керують експресією в корені, серцевині, листі або пилку, зокрема в корені. Такі промотори, наприклад виділені з РЕРС або ІГтрА, розкриті у патенті США Мо 5625136, або МТІ, розкритого у патенті США Мо 5466785. Обидва патенти США включені у даний документ за допомогою посилання у повному своєму обсязі.

Окрім того, можна застосовувати промотори, що функціонують у пластидах.

Необмежувальні приклади таких промоторів включають промотор 5'-0ТЕ. гена 9 бактеріофага

ТЗ ї інші промотори, розкриті у патенті США Мо 7579516. Інші промотори, придатні відповідно до даного винаходу, включають без обмеження промотор малої субодиниці 5-Е9 ВиврР- карбоксилази і промотор гена інгібітора трипсину Кунітца (КІЗ).

У додаткових аспектах нуклеотидні послідовності за даним винаходом можуть бути функціонально пов'язані з промотором, індуковним завданням пошкодження або індуковним інфікуванням шкідниками або патогенами (наприклад, комахою- або нематодою-шкідником рослини). Були описані численні промотори, які забезпечують експресію у місцях пошкодження бо мМабо у ділянках нападу шкідників (наприклад, у місцях живлення комах/нематод) або фітопатогенної інфекції. Оптимально такий промотор повинен бути активним лише локально у ділянках нападу або поряд із ними, і таким чином експресія нуклеотидних послідовностей за даним винаходом буде зосереджена на клітинах, які зазнають проникнення в них або поїдання їх. Такі промотори включають без обмеження описані в Зіапіога еї аї!., МоїЇ. Сеп. Сепеї. 215:200- 208 (1989), Хи еї аї. Ріапі Моїєс. ВіоІ. 22:573-588 (1993), | одетапп єї аї. Ріапі Сеї! 1:151-158 (1989), НоПпгитвеїіег апа І епіє, Ріапі Моїес. Віої. 22:783-792 (1993), Рігек еї аї. Ріапі Моїес. Віо!. 22:129-142 (1993), Матег еї аї. Ріапі 9. 3:191-201 (1993), патенті США Ме 5750386, патенті США

Мо 5955646, патенті США Мо 6262344, патенті США Мо 6395963, патенті США Мо 6703541, патенті

США Мо 7078589, патенті США Мо 7196247, патенті США Мо 7223901 і публікації заявки на патент США 2010043102.

У деяких варіантах здійснення даного винаходу застосовують "мінімальний промотор" або "основний промотор". Мінімальний промотор може залучати та зв'язувати комплекс РНК- полімерази ІЇ та її допоміжних білків для забезпечення ініціації транскрипції й елонгації. У деяких варіантах здійснення мінімальний промотор конструюють таким чином, що він містить лише нуклеотиди/нуклеотидні послідовності з вибраного промотора, які потрібні для зв'язування транскрипційних факторів і для транскрипції нуклеотидної послідовності, що становить інтерес, яка функціонально пов'язана з мінімальним промотором, зокрема без обмеження послідовностей ТАТА-боксу. В інших варіантах здійснення в мінімальному промоторі відсутні послідовності, що діють у цис-положенні, які залучають і зв'язують транскрипційні фактори, що модулюють транскрипцію (наприклад, підсилюють, пригнічують, надають тканиноспецифічності, надають здатності до індукування або здатності до пригнічення). Мінімальний промотор, як правило, розташовуються вище (тобто в напрямку 5) від нуклеотидної послідовності, що підлягає експресії. Отже, для застосування як мінімального промотора можна вибирати нуклеотиди/нуклеотидні послідовності з будь-якого промотора, який можна застосовувати відповідно до даного винаходу.

В описані в даному винаході касети експресії можна вбудовувати багато інших послідовностей. Вони передбачають послідовності, які, як показано, посилюють експресію, як, наприклад, інтронні послідовності (наприклад, з АапПІ ї Бгоп7еї) і вірусні лідерні послідовності (наприклад, із ТММ, МСММ і АММ).

Зо Може бути переважним спрямовувати експресію нуклеїнових кислот за даним винаходом у різні клітинні локалізації в рослині. У деяких випадках може бути бажаною локалізація у цитозолі, тоді як в інших випадках переважною може бути локалізація в певній субклітинній органелі. Субклітинна локалізація ферментів, кодованих трансгеном, виконується за допомогою методик, добре відомих із рівня техніки. Зазвичай ДНК, що кодує цільовий пептид із відомого продукту гена, спрямованого на органелу, обробляють і піддають злиттю вище від нуклеїнової кислоти. Більшість таких цільових послідовностей відомі для хлоропласта, і було показано їх функціонування у гетерологічних конструкціях. Експресія нуклеїнових кислот за даним винаходом також спрямована в ендоплазматичний ретикулум або у вакуолі клітин-хазяїв.

Методики для досягнення цього добре відомі з рівня техніки.

Вектори, придатні для трансформації рослин, широко відомі з рівня техніки. Для опосередкованої Адгобасіегішт трансформації придатні бінарні вектори або вектори, що несуть щонайменше одну Т-ДНК граничну послідовність, тоді як для прямого переносу генів придатний будь-який вектор, і переважною може бути лінійна ДНК, що містить лише конструкцію, що становить інтерес. У разі прямого перенесення генів можна застосовувати трансформацію за допомогою одного виду ДНК або спільну трансформацію (Зспоспег еї аї. Віоїєсппоіоду 4:1093- 1096 (1986)). Як у разі прямого перенесення генів, так і в разі опосередкованого Адгорасіегійт перенесення трансформацію зазвичай (але не обов'язково) здійснюють із селектовним маркером, який може забезпечувати стійкість до антибіотика (канаміцину, гігроміцину або метотрексату) або гербіциду (баста). Вектори трансформації рослин, що містять молекули нуклеїнової кислоти за даним винаходом, можуть також містити гени (наприклад, ізомеразу фосфоманози; РМІ), що забезпечують позитивну селекцію трансгенних рослин, як описано у патентах США 5767378 і 5994629, включених у даний документ за допомогою посилання. Вибір селективного маркера не є, однак, визначальним для даного винаходу.

У варіантах здійснення нуклеїнова кислота може бути трансформована у ядерний геном.

Віншому варіанті здійснення нуклеїнова кислота за даним винаходом безпосередньо трансформується у геном пластид. Великою перевагою трансформації пластид є те, що пластиди зазвичай здатні до експресії бактеріальних генів без суттєвої оптимізації кодонів, і при цьому пластиди здатні до експресії множинних відкритих рамок зчитування під контролем одного промотора. Технологія трансформації пластид докладно описана в патентах США бо МоМо 5451513, 5545817 і 5545818, у заявці згідно з РСТ Мо МО 95/16783 і в МеВгіаде еї а. (1994)

Ргос. Маїї. Асад. З5сі. ОБА 91, 7301-7305. Основна методика трансформації хлоропластів передбачає введення ділянок клонованої пластидної ДНК, що фланкують селектовний маркер, разом із геном, що становить інтерес, у придатну цільову тканину, наприклад, із застосуванням біолістики або трансформації протопластів (наприклад, трансформації, опосередкованої хлоридом кальцію або РЕС). Фланкувальні ділянки розміром 1-1,5 т.о., які називаються націлювальними послідовностями, сприяють гомологічній рекомбінації з геномом пластид і таким чином забезпечують заміщення або модифікацію специфічних ділянок пластому.

Спочатку як селектовні маркери для трансформації використовують точкові мутації в 165 гЕМА і генах гр512 хлоропластів, що надають стійкості до спектиноміцину і/або стрептоміцину (Змаб, 2.,

На|дикієміс, Р., апа Маїїда, Р. (1990) Ргос. Маїї. Асад. 5сі. ОБА 87, 8526-8530; їацйб, .. М., апа

Маїїда, Р. (1992) Ріапі Се! 4, 39-453. Це зумовило одержання стабільних гомоплазмічних трансформантів із частотою, що становить приблизно одна трансформація на 100 бомбардувань цільових листів. Наявність сайтів клонування між даними маркерами забезпечило можливість створення вектора, що націлюється на пластиди, для введення чужорідних генів (5(аицб, 5. М., апа Маїда, Р. (1993) ЕМВО .. 12, 601-606). Суттєвого підвищення частоти трансформації досягали шляхом заміщення рецесивних генів ТЕМА або г-білка, що забезпечують стійкість до антибіотиків, на домінантний селектовний маркер, бактеріальний ген аадА, що кодує фермент аміноглікозид-3'-аденілтрансферазу, що знешкоджує спектиноміцин (Змар, 7., апа Маїїда, Р. (1993) Ргос. Маї). Асад. сі. ОБА 90, 913-917). Раніше цей маркер успішно застосовувався для трансформації пластидного геному зеленої водорості

Спіатудотопазх геіппагайії із високою частотою (соїд5сптіаї-Сієптопі, М. (1991) Мисі. Асіаз Везв. 19:4083-4089). Інші селектовні маркери, які використовують для трансформації пластид, відомі з рівня техніки, і вони включені в обсяг даного винаходу. Як правило, для досягнення гомопластидного стану необхідно близько 15-20 циклів поділу клітин після трансформації. Під час експресії в пластидах, за якої за допомогою гомологічної рекомбінації гени вбудовані в усі декілька тисяч копій кільцевого геному пластид, наявних у кожній рослинній клітині, застосовують перевагу великої кількості копій порівняно з генами, що експресуються в ядрі, із забезпеченням рівнів експресії, які легко можуть перевищувати 10 95 від загальної кількості розчинного рослинного білка. У переважному варіанті здійснення нуклеїнову кислоту за даним

Зо винаходом вводять у спрямований на пластиди вектор, і при цьому вона трансформується у геном пластид необхідної рослини-хазяїна. Одержують рослини, гомопластичні щодо геномів пластид, що містять нуклеїнову кислоту за даним винаходом, і при цьому вони переважно здатні до високої експресії нуклеїнової кислоти.

ПРИКЛАДИ

Даний винахід далі буде описаний за допомогою посилання на наступні докладні приклади.

Ці приклади надані лише для ілюстрації та не призначені для обмеження, якщо не зазначено інше. Стандартні методики з використанням рекомбінантної ДНК і молекулярного клонування, застосовувані у даному документі, добре відомі з рівня техніки і описані У. батргоок, 6ї аї.,

Моїесшіаг Сіопіпд: А Гарогаїюту Мапиаї!ї, За Еа., Со бргіпд Натог, ММ: Соїй ргіпд Нагброг

І арогаїогу Ргезв (2001); Т.9У. 5іНаму, М.І. Вептап, апа І М/. Епдиіві, Ехрегітепів м/йй Сьепе

Еивіопв, Со ріпу Наттотг І абогаїюгу, Соїа ріпа Нагброг, МУ (1984) і Аизибреї, Е.М. еї а!., Ситепі

Ргогосоїв5 іп Моїесшіаг Віоіоду, Мем Моїк, дойп Уміїєу апа 5опз Іпс., (1988), Веїїег, еї а!., Меїподв іп

Агабідорзіх Везєагсіп, УУопа бсіепійіс Ргев5 (1992), і спи! еї а!ї., Ріапі МоіІєсшаг Віооду Мапиаї,

Кіижег Асадетіс Рибріїєпегз (1998).

Приклад 1. Ідентифікація білка з інсектицидною активністю щодо західного кукурудзяного кореневого жука

Інсектицидний білок (ЗЕО ІЮ МО: 4; що кодується ЗЕО ІО МО: 1), і альтернативний варіант з подовженням за М-кінцем (ЗЕО ІО МО: 9; що кодується БО ІЮ МО: 6), ідентифікували з

НоІдетапіа таввзіїепвзіз. Синтезували варіанти цього гена, оптимізовані для Е. соїї (ЗЕО ІЮ

МО:2 і ЗЕО І МО: 7), і клонували у вектори рЕТ259а з утворенням конструкцій рЕТ29а(Нтазв5) і рЕТ29а(Нтаз5 м2). Конструкції РЕТ29а(Нтавзвз) і рЕТ29а(Нітав55 м2) трансформували в штами

УМ109 (ОЗ) або ВІ210ОЕ3) Е. сої й експресію білка здійснювали в середовищі для автоіндукції 2УР-5052 за 252С протягом 24 годин. Лізати одержували з таких культур і тестували щодо бісактивності на західному кукурудзяному кореневому жуку. Коротко кажучи, лізати Е. соїї змішували з рівним об'ємом нагрітого штучного раціону для комах (Віозегм, Іпс., Френчтаун,

Нью-Джерсі, США) у центрифужних пробірках об'ємом 1,5 мл, а потім наносили на невеликі чашки Петрі. Після охолодження та затвердіння суміші зразка та раціону у кожний планшет додавали по 12 личинок М/СК. Планшети запечатували і витримували за умов навколишнього середовища лабораторії з урахуванням температури, освітлення і відносної вологості. Як бо негативні контролі застосовували лізати з культур Е. соїї /М109 (ОЕЗ), що несуть пустий вектор рЕТ29а. Смертність оцінювали в день 4 та день 6.

Як показано в таблиці 1, лізат із культури, що експресує рЕТ29а(Нтав5) або рЕТ29а(Нтавз5 мг), демонстрував сильну біоактивність щодо МСЕ. Білок Нтаз5 Н. тавззіїепвів був перейменований у Нтаз5зСЕму.

Таблиця 1

Інсектицидна активність щодо західного кукурудзяного кореневого жука 1 День4 | /// Деньб///// | -- (

Обробка Кількість. | 1 Кількість | й . ую смертності ую смертності! Примітки мертвих мертвих 5ОмМкРІрН?О,БОмМ масі! 0 1 0 | 2 | 77 | 6 7М109/рЕТ29а (пустий) 7118 ЇЇ 2 | 17 16

УМ109/рЕТ29а(Нтавв 779 | 75 | 712 | лою

ВН217/рЕТ28а (пустий) 7118 1 1 | 8 6

ВІ-217/рЕТ29а(Нтавв уг2 10 | 83 | 712 | ло 5 - невелика личинка, т - середня личинка, Б - велика личинка, мб - дуже велика личинка

Приклад 2. Очищений Нітаз5СкКУуУ характеризується інсектицидною активністю щодо західного кукурудзяного кореневого жука

Конструкцію рЕТ-6піз-5БОМО, що містить 5ЕО ІЮ МО: 2, одержували для НтаззсСгУМУ.

Конструкцію рЕТ-6піЗ-БОМО-Нтаз5зСЕМУу трансформували в ВІ 217(0ЕЗ) Е. соїї для одержання білка. Білок, мічений БОМО, очищували за допомогою стандартних методик для білка, міченого

Ні, і потім розщеплювали за допомогою протеази ЗОМО з вивільненням білка Нтаз5СЕМу, який не містить їад. Очищений білок тестували щодо ефективності щодо М/СЕК. у біологічному аналізі з включенням у раціон, що здійснюється, як описано у прикладі 1, за винятком того, що очищений білок змішували з нагрітим штучним раціоном замість бактеріальних лізатів. Як показано в таблиці 2, очищений Нтабзх5СЕМуУ показав сильну біоактивність щодо УМУСК у діапазоні тестованих концентрацій (560-900 мкг/мл).

Таблиця 2

Інсектицидна активність Нтаз5СКУМ щодо УУСЕК й мертвих мертвих їхРВЗ | (0 ЇЇ 0 ЇЇ Ї! 0 ЇЇ 0 | 6 60 | 4 | 3 !/| її 9 | 7 | з 150 Її 73 725. | Й ..1....7.712... | ло | Ж 9300, щЮЦЮ9 ЇЇ 5 щющ75 | | 712 | 700 900, що ЇЇ 5 щющ75 | | 712 | лю 460 | 7 | 9 | щБмБ 712 | ло 600 | 71792 | щМБ 1 712. | ло | ХЄ 900 | т | 9 | щБФ її л12 | л00 5 - невелика личинка, т - середня личинка, Б - велика личинка, мб - дуже велика личинка

Приклад 3. Нітаз5СКУУ характеризується інсектицидною активністю щодо північного кукурудзяного кореневого жука

Нтаз5сСкУуУ очищували як у прикладі 2 і тестували щодо ефективності щодо північного кукурудзяного кореневого жука (МОСК) в аналізі із включенням у раціон, що здійснюється фактично як описано в прикладі 1, за винятком того, що смертність оцінювали в день З і день 7.

НтаззсСМУ тестували за концентрації 0,2 мг/мл. Негативний контроль містив лише 1 х РВ5. Як показано в таблиці 3, Нтаз5СЕМу демонструє інсектицидну активність щодо МСЕ.

Таблиця З

Інсектицидна активність НтаззСКМу щодо МСК

Обробка Кількість о й . Кількість о й . ую смертності | Примітки ую смертності | Примітки мертвих мертвих 1х РВЗ - невелика личинка, 5т - невелика/середня личинка, т - середня личинка, тр - середня/велика личинка, 5 - велика личинка, мо - дуже велика личинка

Приклад 4. Нтаз5сСкУуУ характеризується інсектицидною активністю щодо південного кукурудзяного кореневого жука 5 НтаззсСфМу очищували як у прикладі 2 і тестували щодо ефективності щодо південного кукурудзяного кореневого жука (ЗСК) в аналізі із включенням у раціон, що здійснюється фактично як описано в прикладі 1, за винятком того, що смертність оцінювали в дні 2, 5 ів.

Нітаз5СтКУУ тестували за двох різних концентрацій, що становлять 0,5 мг/мл і 0,25 мг/мл.

Негативний контроль містив лише 1 х РВ5. Як показано в таблиці 4, Нта55СКУУу демонструє інсектицидну активність щодо ЗСК.

Таблиця 4

Інсектицидна активність НтаззСКМу щодо ЗСК

Обробка Кількість до Кількість до Кількість до Примітки мертвих | смертності! мертвих | смертності | мертвих | смертності Р

ІХРВ5 | 0 | 096 / 0 | 09 | 0 | 096 | р бо5м/мл | 0 5 юЮщ | 095 | З | 2595 | 4 | 3395 | в б25мимл| 0 | 096 | 0 | 095 | 2 | 17956 | то 5 - невелика личинка, 5т - невелика/середня личинка, т - середня личинка, тр - середня/велика личинка, 5 - велика личинка, мб - дуже велика личинка

Приклад 5. Нтавз5СтфМУу характеризується інсектицидною активністю щодо західного кукурудзяного кореневого жука, стійкого до Сту

Щоб визначити, чи реалізується токсичність Нітаз5СЕМуУ за допомогою способу дії, не пов'язаного з білками, спорідненими з Сгу3, Нтаз5СКУМ очищували як у прикладі 2 і тестували щодо ефективності щодо штаму МУСК, який є стійким до токсину тСгузА (тсСгузА-К), і щодо штаму МУСК, що є стійким до токсину еСтуЗз1АбЬ (еСтуЗ.1АБ-К). Аналізи із включенням у раціон здійснювали фактично як описано в прикладі 1, за винятком того, що смертність оцінювали в день 4 та день 6. НтаззСтМуУ тестували за двох різних концентрацій, що становлять 0,6 мг/мл і 0,3 мг/мл. Негативний контроль містив лише 1 х РВ5. Також аналізували М/СК, який не був стійким до тсСтгузА або еСтуЗ.1АБ (5и5 - сприйнятливий). Як показано в таблиці 5, Нтаз5СЕмМу/ демонструє інсектицидну активність щодо штамів М/СЕК, стійких до Сгу.

Таблиця 5

Інсектицидна активність НітаззСКУМ щодо Сту-А МСА - |Примітки - | Примітки мертвих | смертності мертвих | смертності вив,ббм/мл | 5 | 4295 | 7т | 9 | 7595 | Зт вив,б,Зм/мл | 6 | 5096 | бт | 10 | 8395 | гт вив, їх РВЗ | 0 | 095 | ато 1 | 896 | 11ть отпсузА-В,Обм/мл | З | 2595 | вт | 9 | 7595 | Зт отпсузА-В,О,Змомл | 6 | 506 | бт | 12 | обо отсузА-в.їхРВ5 | 0 | 095 | ато З | 2595 | ть есСтузлАр-Н.О,бму/имл! 5 | 4295 | 7т | 9 | 7595 | Зт есСтузлАр-Н.ІхРВ5 | 0 | 095 | Тгть | 0 | 0956 | їгть - невелика личинка, 5т - невелика/середня личинка, т - середня личинка, тр - середня/велика личинка, 5 - велика личинка, мо - дуже велика личинка

Приклад 6. Нтаз5СЕМу не характеризується інсектицидною активністю щодо совки трав'яної

Щоб визначити, чи характеризується Нітаз5СКМу інсектицидною активністю щодо совки 5 трав'яної, очищений білок Нітаз5СКУУ тестували щодо біоактивності щодо совки трав'яної (ГАМУ) у біологічному аналізі з нашаровуванням на предмети раціону із застосуванням стандартних біологічних аналізів зі штучним раціоном. Для кожного експерименту тестували 12 личинок 1 за концентрації Нітаз5СЕМУ, що становить 0,2 мг/мл. Як негативний контроль застосовували 1Х РВ5. Група позитивного контролю складалася з личинок, що зазнавали впливу лізатів ВІ21" (ОЕЗ) Е. соїї, що експресують Ммірзо. Смертність оцінювали в день 5 і день 7. Щодо личинок, які досягали стадії 3, обробка не здійснювала значного впливу. Якщо личинки досягали тільки стадії І 2, то можливо, що обробка спричиняла пригнічення росту. Якщо личинки залишались на стадії 11 протягом всієї обробки, то відбувалося пригнічення росту. Це також може вважатися "ефективною смертністю", оскільки личинки не будуть розвиватися після стадії І 1, навіть якщо вони залишаються живими. Нітаз5СКУМ не був активним щодо ЕАМУ у даних експериментальних умовах (таблиця 6).

Таблиця 6

Інсектицидна активність Нтаз5зСтУМ щодо совки трав'яної 1-1-а личинкова стадія, І 2-2-а личинкова стадія, І 3-3-я личинкова стадія

Приклад 7. Нта55СКМу не характеризується інсектицидною активністю щодо тестованих лускокрилих

Очищений білок Нітаз5СКУМ тестували щодо біоактивності на панелі лускокрилих комах- шкідників із застосуванням біологічних аналізів з нашаровуванням на предмети раціону. Кожне з вогнівки кукурудзяної (ЕСВ), совки-іпсилон (ВСУМ) і гусіні совки бавовникової (СЕМ) тестували щодо інсектицидної активності Ніта55СЕМУ за допомогою аналізу на основі раціону, подібного такому з прикладу 6. Для кожного експерименту тестували 12 личинок 1 за концентрації

НітаззСтУМУ, що становить 0,2 мг/мл. Група позитивного контролю складалася з личинок, що зазнавали впливу лізатів ВІ21" (ОЕЗ) Е. соїї, що експресують МірзЗО. Як негативний контроль застосовували 1Х РВЗ5. Як і в прикладі 6, лізати з бактеріальних культур ВІ21" (ОЕЗ), що несуть пустий вектор рЕТ29, також застосовували як негативні контролі. Смертність оцінювали в день і день 7. Щодо личинок, які досягали стадії І 3, обробка не здійснювала значного впливу. Якщо личинки досягали тільки стадії І 2, то можливо, що обробка спричиняла пригнічення росту. Якщо личинки залишались на стадії 11 протягом всієї обробки, то відбувалося пригнічення росту. Це 5 також може вважатися "ефективною смертністю", оскільки личинки не будуть розвиватися після стадії 11, навіть якщо вони залишаються живими. Ніта55СКУМ не був активним щодо тестованих лускокрилих комах-шкідників у даних експериментальних умовах (таблиця 7).

Таблиця 7

Інсектицидна активність щодо лускокрилих

Чомаха обро ЖиеієТ рити КИНЕ Я отити

Примітки -|Примітки мертвих | смертності мертвих |смертності

СЕМ |ВІ21УрЕТ2ЗамрЗзо) | 9 | 7595 | зії | 9 | 7595 | ЗП

СЕМ (ХР 77777 | 0 | 095 | 12 | 0 | 095 | ІЗ

СЕМ |бамимл 7 | 0 | 096 (|12лІз3Ї 0 | 095 | ІЗ

СВ |ВІ217рЕТ2ба(пустий| 0 | 095 | | 0 | 095

СВ |ВІ21УрЕТ2ЗамрЗо) | 9 | 7595 | зії | 71 | 9295 | 1

СВ (ХР 7777 | 0 | 09 | щ Б | 0 | 095

ЕСВ |боамимл | 0 | 095 | щ | 0 | 095 вВСУУ |ВІ217рЕТ2ба(пустий| 0 | 095 | | 0 | 095 | ІЗ

ВСУ | ХР 777777 | 0 | 09 | | 0 | 095 | ІЗ

ВСУ |бамимл 7 | 0 | 095 | | 0 | 095 | із 1-1-а личинкова стадія, І 2-2-а личинкова стадія, І 3-3-я личинкова стадія

Приклад 8. Трансформація маїсу за допомогою Нтаз5зСтКУМ

Конструкцію 23474 одержували для експериментів із трансформації маїсу за допомогою

Нітаз5СтУМУ. Конструкція 23474 містила касету експресії, що містить СсРМІ, який кодує селектовний маркер, що являє собою фосфоманозоіїзомеразу (РМІ)), яка надає здатність до метаболізму манози (патенти США МоМео 5767378 і 5994629), і касету експресії, що містить нуклеотидну послідовність, кодон-оптимізовану для маїсу, яка кодує Нтаб55зСЕМУ, кодон- оптимізований для маїсу (ЗЕО ІЮ МО: 3).

Конструкцію 23474 трансформували в Адгобасіегішт їШштеїасіеп5 із застосуванням стандартних методик молекулярної біології, відомих фахівцю у даній галузі техніки. Для одержання агробактерій для трансформації клітини культивували у рідкому середовищі УРС за 280 і 220 об/хв. протягом ночі. Опосередковану Адгобасіегішт трансформацію незрілих зародків маїсу здійснювали фактично, як описано в Медгойно еї аї!., 2000 (Ріапі Сеї! Керогів 19: 798-803). У випадку даного прикладу всі компоненти середовищ являли собою компоненти, переважно описані в МедгоНо еї а. вище. Однак їх можна заміняти різними компонентами раціону, відомими з рівня техніки.

Після трансформації, відбору та регенерації рослини аналізували на наявність гена рті і кодувальної послідовності Нтабз5САМУ, кодон-оптимізованої для маїсу (ЗЕО ІО МО: 3) із застосуванням аналізу ТадМапФ. Рослини також тестували на наявність остова вектора.

У теплицю переносили 27 рослин, негативних щодо остова вектора, і таких, що містять одну копію трансгена з конструкції 23474, і тестували щодо стійкості до шкоди, спричиненої МУСВ.

Зо Приклад 9. Рослини маїсу, що експресують НітаззСКММ, характеризуються інсектицидною активністю щодо УУСЕК

Наявність Нтаз5СВМуУ виявляли за допомогою ЕЇГІ5А в нг/мг загального розчинного білка (ТОР) у тканині листа та кореня від кожного трансформанта. Зразки тканини кореня маїсу відбирали у кожного трансформанта, коли трансформанти маїсу, що експресують Нтаз5зСВМУ, досягали стадії М3-М4. Тканину кореня маїсу поміщали в чашку Петрі, а потім інфікували за допомогою 12 личинок М/СА в біологічному аналізі кореневого сегмента. Два зразки тканини кореня (повт. 1 і повт. 2) оцінювали щодо отворів, утворених внаслідок поїдання личинками (ЕН), і пошкоджень у вигляді рубців у день 3. Тканина кореня з нетрансформованого (нульового) маїсу слугувала як негативний контроль. Тканину кореня з трансгенної рослини з трансформаційною подією МІНбО4 (патенти США МоМо 7361803 і 7897748), що містить тСтгузА, використовували як позитивний контроль. Експресія Нтаз5СВМУ в об'єктах маїсу забезпечувала захист від М/СА у більшості трансгенних тканин кореня, що містять Нтаз5САМУ, порівняно з нульовим зразком тканини кореня (таблиця 8).

Таблиця 8

Інсектицидна активність маїсу з трансгенним Нтаз5СкУМУ щодо МУСК

ЕПЗА .

Унікальний ІЮ активності о 6бг2539 | 895 | 642 | З | її | 01 - | з | чз- о бг2538 | 950 | 1274 | З | її | 51 - | 8 | -- о бг2537 | 1109 | 780 | 4 | її 41 - | 8 | - о бг2536 | 1061 | 1210 | 5 | її 81 м | 13 | - о бг2534 | 1291 | 1345 | З | її | 61 - | 9 | -- о бг2533 | 1320 | 1лЛІЗ | 2 | її 61 - | 8 | - о бг2532 | 1213 | 1536 | 6 | М | | 6 | - о бр2531 | 2183 | 903 | 4 | її 21 - | 6 | ч- о бг2528 | 1489 | 1383 | З | ГГ | з - | 6 | ч- о бг2527 | 1086 | 760 | 6 | її | 51 - | м | - о бг252в6 | 913 | 1871 | 0 | - 81 м | 18 | - о бр2бг4 | 1178 | 802 | 8 | її 6 | м | 14 | - о бг2523 | 966 | 884 | 2 | ГГ | 21 - | 4 | з о бр2бг2 | 899 | 1468 | 6 | її | 81 - | 14 | - о бг2б52о | 1500 1088 | 0 | її 21 - | 2 | чз- о бг2519 | 1394 | 995 | З | її | з | - | 6 | ч- о бр2518 | 825 | 1522 | 9 | ГГ | 7 | мМ | 16 | - о бг2516 | 1203 | 1028 | 6 | її 81 м | 14 | - о бр2515 | 956 | 962 | 6 | м | 6 | м | 12 | - о бг2514 | 78 | Нв | 8 | м | 7 м | 19 | - о бр2бт2 | 1664 | 1916 | З | її 51 - | 8 | - брат | 12205 | 1248 | 2 | її | 61 - | 8 | - о бг2б1о0 | 1700 | 916 | з | - 51 - | 8 | -- о бг2509 | 1079 | 666 | З | її 21 - | 5 | з омІНбО | 77/77 175 4 161 | їж

Нульовий | (| (хМЕ| 12 | м | 16 н | 28 | -

ЕН : отвори, утворені внаслідок поїдання; І. - слабке рубцювання; М - середнє рубцювання;

Не сильне рубцювання « - об'єкт з відмінною ефективністю; ж/- - об'єкт з гарною ефективністю; - - об'єкт з низькою ефективністю

Приклад 10. Нітазх5СЕМУуУ в комбінації з інтерферувальною РНК характеризується інсектицидною активністю щодо М/СЕК

НтаззсСткУУу очищували як в прикладі 2. Одержували а5КМА, що націлена проти основної мішені, і, як відомо, характеризується інсектицидною активністю. У необмежувальних прикладах а5зКМА може націлюватися на ген, що кодує вакуолярну АТФ-синтазу, бета-тубулін, 265 протеосомну субодиницю білка р28, ЕЕТа 480, тропонін І, тетраспанін, важкий ланцюг клатрину, гамма-коатомер, бета-коатомер і/або епоксидгідролазу ювенільного гормона (заявки на патент згідно з РСТ МоМо РСТ/О5З17/044825; РСТ/О517/044831;. РСТ/О517/044832; патент США

Мо 7812219; кожний включений у даний документ за допомогою посилання). Очищений білок і а5КМА тестували щодо ефективності щодо М/СК в аналізі із включенням у раціон, що здійснюється фактично як описано в прикладі 1.

Слід розуміти, що приклади і варіанти здійснення, описані в даному документі, наведено лише для ілюстративної мети і що різні модифікації або змінювання з урахуванням цього опису будуть передбачатися фахівцями в даній галузі техніки та підлягають включенню до суті та вмісту даної заявки й обсягу доданої формули винаходу.

Усі публікації та патентні заявки, згадані в даному описі, показують рівень компетентності фахівців у галузі техніки, до якої належить даний винахід. Усі публікації і патентні заявки включені у даний документ за допомогою посилання такою ж мірою, як якби кожна окрема публікація або патентна заявка була конкретно і окремо включена за допомогою посилання.

ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ

«13» Бупоепта Рагкісіраєіоп», АБ йеупоїб5, С. Місвде! «120» хХмсектицндні білки «і40» 81151 а- ведених «Оз п2у43457 «іі» 2016-10-57 «їбО» З «70» РатентІв версія 3.5 «0» ії «211» 1578 «21й» ДНК «»їЗ3» Наїдетавід шщаб55іїівпків «00» 1 і асордаасвоа сстасзаєчо загоссоссо сутозсссти ссвасоєте дзасавссо 0 цесасоатос создааззаЗу сопдасадасс аавсстовос свсцчюссза асаааоссса 130 асвзатсасєїт ахдасавоцда стасоасоує тасттуоост аховстасаз соакзаттаса іо зааспосаїт асвастетсЕ зоатттасса їсаооаосас созтсісаа ксосавессю 240 цдесосазацо соссустрау засжксосох пажхазодаз ссбвзсосооа азкозсажне 300 аседссосоує тотатоссва адазхасзох сазоазоосат седковзацоє зує оовЕ 350 зтасацісся зсЯстттсваа зоссвастте аасатодсту єсассасуда овасвазотс 420 адстсттсса зааосЕекос чсчасссосаца сахуаветоз соєстоазосу Зузатаксї 450 чЧчасссувухо адажхсассос Созодатста вЗадсовстє аїстдаєссске ас екоє 540 заодчасусда зївасуасся засозикосо дадовосіст ссасуавата содпазсосах ОВ стастсоо втахссастЄ адосодасос зсодазахоод астссатоса созоававоє 550 зусвзатоваа садзаєлатс астоуассуст їсЯсіздаво сеїсстатає пасок 725 поуваасчсте суссзовата тазазасаса оствадоссх їсЄтбаткс саокасоєес 780 састасоусс тобсавзосву сусодтзаЗс ассватаєсу созсратоЗа асазвосссво йо аЕсусстако асасотоцат свеаздадссто дасссвассї сдассксава дсстссвете за дсскесассо зсасавастс сстодаєаах єсавсєтсво тостссвях стадасоско БО

Зсврасзос саззссосса ЗосЯВсвтта яадостраиє стосозсасх остдвссазо 3059 аасоосувст астуктааяза сстасаЗуає вадососстс соосутатах заводатаєс 1089 тої совсї асоосдатає дсккевзакост Ззсавзозосоо зізстатає дсазатовес Мо зсстабуасс ссазавстсс соаосесвЕс зкстєсавао зестсзастя стетасссоа 1500 позанастасту аатвсскцоЗ статасаціо ассзсодаєх гозадоаваос застсосооа 1250 ч«кШепсовар савстватсс сзасуатсов сосадтовса сстаїзасух зуадсодакос 1320 асстассяхс пдстосоєсо водасстсавзс саїоососсо зсботсакта хатах ко 1380 тастозаєса зззахуєкос посзосвав «стос сезсуоатях созовосвах 14493 хастсводас ссзвісаєса тозссвЯсса зоссдавсс зозсасассх зассазезає 1590 зчзасоцсдаєс ксзасассаз ссосозсасс зосадсвова сстаєдатає стос 1550

Чісватавоз застотай 1578

Ф1х 1578

ЗІ йо на послідовність

І одержаний з послідовності Неійетавій тазвіїівпзів5 «400» 2 асоровасаца сстагсвасєои сахохтассю страту х сесвососст озагуаассо 50 сдасоакус соозававод совасаадсє ваассссаде соїтовссда осадесассо 120 асаатсаксї аспасазаЗа ствсвотозс гахсбоооУє ахядстаєза сягуактасес 186 зазсеоствст зізватазсст сзасттвтсв ствоЗсвсяс сбатсЕтцтс всуковасев 250 дсозсазава сассессссз тзжессосасз оахозазуса статуса засазставя 300 астустосасє сотасуссоа дазатаєсваї сСаазававає стостзааує осика 360 фосазвасо асусстттва водсассткиЕ засасоЗст гсзссассоз азасаззуєс хо адстсстста азтсстісос сасссутсяє сасозастіїа састравасо доватастсе 450 чассковото азаєсвссос зоздазисто сетоссоусах асєстсастск Тесс 54о заадасутаа зсзасозссо датосстсс дадовастах тсассвадія сорзаєтсах БО ттаскостоз зтатсссекст сдоводасає аїоразаєод зссксвсоса сузазаааде БО сссзасдада спдзасазад сскоастоса тссітаЗадо саєсотасат дассоксадс 729 цусазсусоа дсеосозаса тавоувавасо дстаавосат їсттсраттс ттстасссте 780 састосостос тосстоосуо состатаєсх зссаататсо сазсдатоса асависхсво 840 зїтосотаху асассстодаї саазазесту дакссрассс содсстссва ассутсоєко 20 дсоетсасси сассодоаїс пстодахтаає ссадсстсаз гсстассоаї ссопатосто обо псозастсос созассоєса сустосоастс завоссеост тхостасттє аттавостава 1020 засуовзопех асстсаззаа сстрсзавас зазвотостос соосвтасаї савобасахх 7050 кесотаоосє асозодатсамс оссодасосо осзсосусаз зсокататос асадатоЗся 150 дсахасдактс совзадссссо ззааїстако зсссттаваз зкстзааєто есе мов сптаакато заєдтстодо атавквссзго зсуаксозасс тсзаацдазоє пасссосавс 1250 зсусосуосо сазссоассс давтратсос сесессрата сстатавбсої озосодакоє 1350 а«сттассасс дустосотсу сзасстоаас сасодвосою оїтовосаєта сохотатсто 1380 тастоцрасса задасостос сосососаао ссастуссто ссосозакої создастаах 1440 тасхсвЯосу ссвдаєсатта ходосвуєсс одосодтстс охотссокть озссватавх 1500 чзаїзуЗнасс ссватясуза ссотодваса зостсссоса сстазсрасає скЕсЗсацоВ 1550

Яхсссавазоа ззїсогаз 1578 «М» 3 чі» 1578

В: тична пюспідовність б Одержаний з ноїдеталій шазві!ївпзі5

Од» сідав тстасаязстоо сатоссосся сесодостоа оссвососсх дзаєдавессс бо отозсчатос годасазооо позосадосс ааяссасаує ссскристов деаовссееа 120 ассатсакст асдасвадда сеасоосоуус тасссезасх асоустаєсза сотозтсасу 189 аадсустаст зсаасвнясст здасстістсс стЗоасоссє саатсстсказ сацууавсса 240 вдетуставцо стссассосо саксадозсо Язссаоодса сстасуксов дасзассває що зесдєсусЯс весвсессЧа дузосасадє садавоукус ссуставозс козсссводе 350 цпрессауіссо ососостсва воставусттс засасоосст їсаєсасова дзаєвацуєв 425 тссадстсєса артосттсяс тассадузоЗ сасуаостов состувачао одовУуасесе «50 зЗзассссовсо зоаїсвссяс зазоЗасєсте аацостастху асстуасосе Вася ссЯЄ 540 азуЗасоєса асазсуасво сасовосєвсс дачозоскаї сассавота содсасвсве 500 стсстастсо асатсацоєт одасодсвод абсодаоахтоо астссатоса сововацксс 580 їтссазсзаця седяодсацво сехсасувех гессстзаза стсактзсвх засада 720

Ччосвасусся ястссеаата сааовацаєс дсозаоцессх сссісовсв ссссассс 75О састосясас состсоосЯЗ соссекстсє зссазсатсо ствсоауода зсзодсосяа о зажсдсстаса асзсстодат сапозасстс зпасссдассс созсоаосва дссатскстс що осстксаєсо асасоуастс сетодасяае сспоїдадса кестсссаох стодаКУуєто збо усідасаЗсс сазасводса дастосвстіс задосооасе їсдссассст здсссоссвад 1020 засддсоост астссвиоаа сстссвазас задоаїтассос совсасасає здазодасас 1080 тссоссоост зсозсуасВс вссзовсосі Ззскаовосто асототакас тсвозіовсї М шестасоасс саазодессс супактсвес оісттсааобо асстазста сессосовоа 1209

ЯЗсСазосасв адтзесксцу стасассоєс ассасодаєс бозводавос таєсаводас 1260 атазуЗасо стасодассс даасозссес босзосваса сссасвасої зЗосодстоє 1320 асукассаса пусссясозо Зспасстцавс сасоососто Зсасскаєта сукстассс і3859 тастдзасса зозасостос остдосваад ссвстзстса стоассоваецх зойватсвас 1455 тастесдасЕ тсозосасста сзуссзоаєса ззстодавсс деоссвоосх свесавсаВс 1508 часасаасс совзасассва тсородоасе зсозосзвоз ссізсрасах: тес стоЗ 1560 істсаазаза зстатав 1598

«ее 4 «211» 525 «ійх Білою и, «іЗ» ної йеталів мваз5і1їісепхів «4005 4 мех бі: зій хів туг дха б1у Мей сви рРГа бе біу іви бег обіп Аг 1 5 10 15 цем Азп сін Рго ма1ї мех Мет цечз сім Муз «1у із зів Аїв Суз рРго зо сів без без Аа бін біп бек бго тВг їі Ї1е Туг АБО ув АБЮ тує

Су б1у тТук сез Ф1у тут біу Туг Ап уві Хі тТВг Суб Аг тТуг туг бо

Ап обег іяц Ахробез заг огау біу дів Рго хів Бву Бег Ага М вго 55 70 75 о

А1іа Аз уз АТа Рго це аАго їі Аго Ууаї Азр бій Фіу тпг отТуг Уа!

У вх У я чо е у В о тис о тТиг оляп 21 Аїд Аа ме Туг аїа бів іш Ту Бек бів був 100 105 1

УВІ баг Аа уз АТа 01у щеи 5х узі біп баг б1у Аїа РБе Му Аа це 12 125

Бек Ре АБИ Мет Аїа РЕ тТигК ТВг Осій Авп цу маї баб Зег Баг цув зо 135 140

Заг вне А1а ТВг Аго Аг ніх оц іви тб ореи бух Ага Яін Тук вла 145 5 155 1650

АБроієи б1у бі ІЇє ТИг о АТа бін дероіец дго Аїд Аза Туг о беу ТАг 165 170 175

Рсо аїа пе вс ух Ар о Уві Аа АВ А5р АгГО мес бег Ата сі бів 18 Т85 190 щен рле Тс був Тук біу тТігоніз зей їеб це др о їіе Аг мен О1у 195 200 27505

СУ Аго Мех бій меж Ар впе мех ніх бів ух баг Бек Ап 10 ТВ 210 215 728 сі бій бек йец ТМг АТ Бег омеи біу Аїа 5ег Туг Меї Аїда у! вер 225 230 235 230

Є1У Ап АВ Зег 5ег біц Туг уз фуб Тег Аза бух АЇв вве ре дер 245 250 255

Бег бБег Тиг пе ні сСух маї Сец іо біу біу Аа Уа бег ТВг АБп 260 255 279

Хеаів таг мех бу бій Аза бій тів А1а Ту Ах тТАг тр о ї1а сук 275 289 285 аег іФи а5в РКО Тег оіїео Твгобеаг губ ро Бек фе Аїв пе хів 1у 290 235 зо

ТвВг ЗіУ Заг цец а5р Аа ко Уві Баг маї сей ро уві Ткр Меї ви 305 310 315 320

Аа Ар оБег РРО АЗп АРО біл Аїа Аза ем муз аа віу Рв АТа твг 325 330 335 цец цем Аїа уз Ап о сіу біу Ту" рне цуз Ап Бей бій Азр Муз Уві 340 ХУ изд 359

Гец вго АТа Туг Ме бух Аавор ув вив ува! біу тТуг біу Ажр тТАг Рго 355 ЗО у 355

Авр АЇз дів Аг Аза Ар Уа! Тук Аа сів мех А АЇа тує Ар оРго 370 375 Зо хе Аїд его біз Ре їі16 маї Ре губ АБр о їац Ажи Суб бег Аїд Ин 355 зай 535 49

Оу фу туго бій Ту" це сту туго тнг Уа! ТНг Тиг Ар іви губ 1 410 5

Аа Ї1е Ага біу Меї Агу сСіу АТ Тнг оАхр рРгО АБп Авр Аго Суб баг 420 425 а

Ар таб о тТук дп Уві щіу с1у Суб тЬг тус нії вагу цей Ага Аг Ав 455 440 у З 445 па те ів деп нів Щіу діа б1у біу ні тук уві Туг іву Тут тРротВе Куб 450 у 455 у ту 450 ТУ Р У

Азв діа А1в дів 01У ку Бк Бен їец Аза Аза Ар Уві бі 116 АБИ 485 чо 425 ча туг Заг бу вна Бр Ні туг Біу бід Рго б1Уу Тгр о Звг АгО Уві АгО ча 490 495 цен ї1е Абп деп Ар Ту Ар цем Аа Тс о АЗп Ага с1у те сту бвг щЮ 505 мо

Аг ТВ ЦЕ Ар тів рпе уд Те Уаї Баг ув 16 ее «210 5 2; ох «33» Нозїденанвія таз5іїіієтвіз «400» 5

Тут у Твг ніх чи іїви сви Азр хе де Кен Фу Ф1у «230» б

ПІ днк. «213» Ноідетапія шаззі1івпзів «00» в ахозаассаз зоазЗсасоаза зоадзасззасс зааасодааєс зуасстасаз здався 5 сеосттвусс сізоссваасо сттбазтова ссобітатоа спссодавав зоосовасво ї2а дссазасссс адстустаос сузасавацх ссазсайкса сстатуасаяа позстасуае 180 постасстов дссакцроста саатоутаатт асавазаєдої астатаатсс ссбруаскка 280 тсассадоду сассуаттст саоссосова ссодссосяв зоосЯссвсї дазпаакссос ЗОВ

Чхтпасозаз паясстатух доадасзаса засаксуссу состЯтатоєсє соваозусає ЗО воссадаздо сахссосоаа Зосодоаксо посоїтасау сеоусасЕКе сзвадссяоєс 420 тстзасатод стттсассає дозазасазяо оїсвзостстх ссавовасте Сосовсссоє 455 ауасясазоє сазсастова зсоозатах сеспатсО псбазасєсас состояодах 54й стваздвосро сттатстває сссодстссс сосазораєо тозахазсоа тсовасової БО вспззоадвас сстссасоаа атасозаасу саїстостех тодагатссо стсвоасода БО сосатзуаза тооасттсає дсатововаа здсаврсавсо завсаоваса ассастовсс 720 дстксвстов вавсстсста тасоосоото тссоозавсо стссоїсада ахаїзазаво 280 зсззстзацо ссттсстов ссссаовасо тсссастоса сестоктаоо соососодта 845 вусассваха ссосдасзає здазсавасс сзаатсЯссе зсзатзсяса застазааоє 0 стдчасссва ссхтовссес звавсеттсв сісвестєта ссозтасаоо сіссттодає з50 затссацтт: соптостуєс звссхозати ссодсоцаса діссазассо ссадосооса 20 ктязвачиссту зЕтскослас остеставсс ааоаасоосо остассттза задхстосаЗ 1050

Часвачихос стссоусоата тасозацуах аестттоксо вктасватов тасоссправе 1340 ястосзадцаз соЗасдтста сососаавто ассастсаку аксссаввоє сестозами 1200 ассяхсстся зватстсва стстастстосс создозазат агозагатстї одастатаса 1259 оквассаєсов асттвавода аЗсоаттсус зозасососо дзосавсстоз ссстазсдаї 1350 сезчкасадео абасстатза сукадоасода сосзсстаєє зсспастса ссдадасстс 1389 зассзсєдас ссозсочіса стасатттас стостастова ссзадозсос сзсодсавоє їі4а9 зачсстссос соЗссосода тоссдадате ааскзсїсаЗ дастізаєса стасодтсая 1500 ссвддссоЗа Яссоовтасо сетовссває зассасодіз зссссаатає савссоасоаце 1559 ассзасзоса ЗавсстасЗа тасствтотЕ тооувсаута аЗаастукта я Ми

Ву» їБи ще Но детапіа тахвіїівпвів «Нюх 7 У асосукстіс втхстастза зопсоваатс заовтзовас взасттатаз твсатасєта бо ссустодаск тЗїсссаЗсЯ ссхозасоаа ссоотоатоа тостодааана зЗосчаавевя о ссавасссс засос созусвотса ссозсаатта сстатвасаз здаствсоції ї8о постаєство засос сазсозсзахи вссзвасусї астасазізеа сетсовсека «40 їсяастопося соссоаїсс пїсасосраз ссааоасоуєсза аззсассссх кепка тесЯс з00 зсацдасдаро осасотасох содазсраєт закаєсосто свстутасос сузонавтах ЗБО зуссазазає сохстоства зоастоустта оїасосаза дгоосцсетх бзавосаксх 420 тукаасаєза сстксвссасє судалзазсзав зссацетест ставакссккЕ свсеасьсех о сессасозває ссасастоза асопозасає ісвасстоо зсаваассвс сосаоаоваЄ ай стдсипсоєсо сатасстсвс тсестосоктс сусавадасо тазасазсра ссодаковсх БО зссаповат саїтсаєсза устасовазсе саєттассоє содасасксо ссесудоода бо сусахасаза хозатуткат зсабозаяая зестссвато адасардзаса задсетовех 720 осатссттво збасатсоса сатозссоєс зосоусайсо созосавсоа акатазозаз 785 асдостаазо састсттсуа есткстаєсх сстсзЕтосо состосттов собсвеато що кстассвата ссдсазсозаї Здазсзаосх саваїсасоє зтовсаєсто зассзазації 900 скдовтссора сестовссте свазссотсо стпосокоса їсоосассоо зесвстовах 5 азжхссацзкст садтжстосс оосссЗЗако стозсозакт соссозаско ссиВастосо 1020 стсазачсєсв пстттостаєс сссахктвост заззасоває оса тсаз зааїстосай їо8а асавазчкос хЯссовката сабзаводчас асттєсахао ЯссахтоооЗа тасоссудає 1150 дсозчсасосо садасотата тасасадасо осоосасаса атссовацує сссодаоЕх 1200 асттссстз аздзсстуава ЄсУКкІсаЗсЕ сосоуєаяає асовакатст додоабасасх 1260 зсдасязссо асстсазаза пдсзасссяс досасосос чзсосаассоа сссдавсх 13250 сЯстУскссо зсасствсва котавохоцпо соїасстасс ассоостсо ссВовассто 350 аассасузаз спротуоясз тЕвсососат стостаскода ссязачцаєсдє госвасадос в задссакхук теВссосецуа куссдачасе заїтасєтсвзо пссхсавсса ттатопосао 1506 сесдовсяус стсетакесо сстозІтааЕ забдасодуо зсстсаасає озаєсяатуоо 1565 зсаЗстссе осесстатов сатктїісоса содоєстсза зззаактока з 18511

Зб и» ми

З: Но деталі махаііівпвів «00» 8 зсасосстсс дозосасаза зооззадатс звозсодазс зодасссасвза сода БО скастсруєє хуадссабко ссхозатову сссосдахоз хустодаоза здобоаосао їз0 зЗзссзаяссає азстсстооєс товЗзсвяссс севясевесСа їтстасзаєсаа зЗастасває зво застасстяу зстасувсстя сзвсоховіс акоавасуєт астасваєву секс 249 тссстовасо сессаатсст садсадвоао ссвостостя адшессесасе пдсосахсаоо 300 осодзассацду зсасстасох созазссвсо вагатсуссо сясестасосє соводадтає 360 авссаозаці оїссесєтаа доссоЗссто одсотссвех ссеуоссокх савоЗствос 29 тЕсзасатоя сестсассас позовасвау отасссвцєє ссавотесих состассаоо 989 адосасузас тЯзсоктаза озодоацтас стсзасстесо Зсоаузексаєс састовадаєс 540 ктсацосто сттясскоас Зсезасосс суусавоаваєо ссвасзаєсуа савоадатовиє що чссдадувас тостсассая Зтасоосасо сасстсстосє кодасатсво Ястодсоає бо зоЗасодаса созастссах всасозоаау ксссссвасо збассовоса паЗсстсвєВ 759

Ясктсссіво апостаостз сасодсоосу ссудсваєд ссеаустссва охасавовад тво ассосазаяу сектсксов сазсіссвсо стссастосо костосксоя спас сесоес що тесассяаса ксостаєзаї цозосадосо свозссосс асзасаєсте даєсзаЗзвоус за6 сесозсссда сестазсово сзадссактсс стсосстся тсдосасода сесестодає 959 аасссудіоз зсутестессе зохстодака стовстоаса дсссззасаз всадустосо 1020 стсавросуа дсеттсвссає сстцетсусс ваозасвцсо остасттсва двасстесво 10850 сзсазуаОс тоссоусота сатозазорає атстсссовсо зстзсвосуа сасоссачає 112о детостаюз стдасУуМуста состсвоатз пстосттаса зсссазацає ссссовакие 100

Іжа вуоасстова стостссосо апооосазу: зссаодсаєсст соостазсвсе 1550 чЕсассасло асстзавоцча доастатсаов досасоводо зсостасова сссозасувє 4320 сустЗсацся асасстасаа сутоцосодс сосасотаєс асавостсво садодаєсто ї1380 зассасодсо стозсудсса стасатстає стстастоса ссазодасас састастоде 1540 чадссзссс ссозссвесЗа сесооздасс вастастссо зссозсса стасазссає 159 ссауустодя дссосоксяву остсахтсавс засузсрасо асссдзасає сазаєсдодео 1560 астоповося Ячасстасоа сасскисоєс тоовсстсва зодаозстота й 1611

СИХ зв

Зх по напів тазвіїівпві5 «А» З мес Ага меч Аго его тнг бух с1у бі ті сух Меє біз бів ї1е тус 1 5 10 15 азп біу Мех їец РгОо цеу Біу Беу баг? бій Аг цей Ажап бін Рго Уві 20 25 30 меж меж ви шій ув Ф1у 6іш бій Аїа ух РгОо біп Гей еу Аа іч 35 50 «5 шій бБег рго Тег тів ї16 г АБр іук лев тТуг вБіУ біу Тус ви «і1у 50 5 60

Тук Фіу туго А5п мМа1 їі тйг обу Аго Туг туг А5и баг Бей АБО гей

БЕ У 70 у У 75 во

Бек іо б1у Аза Рго Ії бен бег Аго 51 Рго Аа АТа був А1а вго 85 за 95 мем АгЯ І1е аго Уаі Авр бін аіу твкотук Узі Фі) тТАиг о твге аа ів 105 що

АТа Аїз цем Тук Аа би бі Тук бек бій бує Уа! Заг Ав ух Аа 115 120 125 сіу ву 51у уві біп Зак су АіВ Ра бух Аза бек вне А5п Мей Аа 139 їз ї1х0 вне Тпг о ТВг бій Аа щуе чаї бер к«ег 5ег Гуз час рве АТа таг со 145 150 155 16

Агв нів біц ей ТВКогец ув АгО бі туго Ре Аярокеи біу би їв 165 5 170 175

ТВг Аїа біб АБО бац Аго АТЗ АїВ На цей ТВг орго АТ Рае АгО ув 180 155 130

АБр чаї Меп Ап АБО АкО Мет Бег Аіа бів бі іву РАБ ТВгОГуб Ту 195 200 205

Сіу Тк нНі5 Сем кеш ей дер Її Ага бен бі ву Ага мех сш мех іо 215 22 пев РНе маї нів 51ц ці Бек баг Ави бій тТагобЇн сій бек гей тТве ва 230 235 250

Аїа дек це бів Аа Зег Туг Меїб діЗ уаії 5ег с01у Аза АЇїв ер заг 7545 250 235

Ти тут ух цкв ТВг АтТа Муз АЇЗ РПЄ Не Абр хег хег тВг о РНе Ні 250 283 220 сСух Уа! сец беш бБіу сіу Аїд Узі его тВг Ап їв Аа Твг мет с19 7 288 285 «іп аїа бій ще АВ Туг Ар оте тТерожів цух бег беи Ахр о рро тВг 250 255 00 цем тк обек о кух вго Зак без Аза РЕ те Фу Те біу бек Кей Ар 305 310 З ' 320

Ап го ма! Заг уді їеи рРго Уа) Тер оМеї ци АВ АБр оБег бго АБ заз 330 335 го бій Аїа АТ їво вух АТа сіу Бпе дів тВК овен сей АТ Ку АЙ 340 345 350

ФУ біу Тук РП уз Ал іє біп Ар цу Уаії мец ро Аїа Туг Мах 355 350 365 іу5 дар Ті Ре ма)! біу тує біу Абр о Тиг о Бго Ахр Аза Аа Ага Аа 378 375 353

АБ омаї тТук Аїз сій мех а1а Аа Туг Ар РКО ух АТа вго 1 вна 355 359 395 00

Тіе Уа! бе цу5 АБО Мен Аби бух бег Аїз Ага біу Суз тТуг бів туг 405 410 455 це) біу тут Тайг УТ тТВт ТВг АБріву уз їм Аїд 18 асВ сіу мех 423 425 43 агУ Бу Аїа ТИР АБр РКО АБ Або Ага бух бек АбрОтТВг о туг Ав Уа 435 44) 445

Ф1у біу Суб так о Туг нів Ага без АгО Аг Або іви Ахп о нів в1у АТа 45В 455 тя 00 біу біу нНі5 тТук уаї Туг бе Туг ТгроТйг губ Ар АЇв АТа АТа бі ав дод я 48 цуз Рго це цео А1їз Аа А5ОВ Маї бі) ї1е Аа тує яег 01у Ре дер 455 490 295 ніз Тут Фу іп о Рго біу ткро5ег дго УВі Агу о гвей 16 АБ Ави Абр 500 ве еої 9 510

Ф1у АБріву Ап ТВР АВ ага Сіу Тнг о фіу баг АРО ТВгРОТук йхр хів 515 525 525

Ре ма! Тер уз! бег суб оц ву

Claims

530 535 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ

1. Касета експресії, яка містить промотор, функціонально пов'язаний із гетерологічною молекулою нуклеїнової кислоти, яка містить: (а) нуклеотидну послідовність під будь-яким із ЕО ІЮ МО: 1-3; (р) нуклеотидну послідовність, яка на щонайменше 95 95 ідентична нуклеотидній послідовності під будь-яким із ФЕО ІЮ МО: 1-3; (с) нуклеотидну послідовність, яка кодує поліпептид, при цьому амінокислотна послідовність поліпептиду містить ЗЕО ІЮ МО: 4; (4) нуклеотидну послідовність, яка кодує поліпептид, при цьому амінокислотна послідовність поліпептиду на щонайменше 95 95 ідентична амінокислотній послідовності під зЕО ІЮ МО: 4; (є) нуклеотидну послідовність, яка є комплементарною нуклеотидній послідовності будь-якого з (а)-«4), наведених вище.

2. Молекула нуклеїнової кислоти, яка містить послідовність нуклеїнової кислоти під зБЕО ІЮ МО: 2 або БЕО ІЮО МО: 3.

3. Трансгенна рослина або її насінина, що містить поліпептид, який містить амінокислотну послідовність під ЗЕО ІЮО МО: 4.

4. Вектор, який містить касету експресії за п. 1.

5. Клітина-хазяїн, яка містить касету експресії за п. 1.

6. Спосіб одержання рослини або частини рослини, що характеризується підвищеною стійкістю до твердокрилих комах порівняно з контрольною рослиною або частиною рослини, який передбачає: (а) введення в частину рослини молекули нуклеїнової кислоти, яка містить касету експресії за п. 1;і (Б) вирощування частини рослини з одержанням рослини, яка експресує молекулу нуклеїнової кислоти і характеризується підвищеною стійкістю до комах порівняно з контрольною рослиною або частиною рослини, яка не містить молекули нуклеїнової кислоти, яка містить касету експресії за п. 1.

7. Спосіб підвищення стійкості до твердокрилих комах у рослини або частини рослини порівняно з контрольною рослиною або частиною рослини, який передбачає забезпечення експресії в рослині або частині рослини касети експресії за п. 1, де експресія касети експресії зумовлює підвищену стійкість до комах у рослини або частини рослини порівняно з контрольною рослиною або частиною рослини.

8. Спосіб одержання рослини, яка характеризується підвищеною стійкістю до твердокрилих комах порівняно з контрольною рослиною, який передбачає виявлення, в частині рослини, нуклеїнової кислоти, яка містить касету експресії за п. 1, та одержання рослини з частини рослини, таким чином забезпечуючи одержання рослини з підвищеною стійкістю до комах Зо порівняно з контрольною рослиною.

9. Спосіб ідентифікації рослини або частини рослини, що характеризується підвищеною стійкістю до твердокрилих комах порівняно з контрольною рослиною або частиною рослини, який передбачає виявлення, в рослині або частині рослини, нуклеїнової кислоти за п. 2, завдяки чому забезпечується ідентифікація рослини або частини рослини з підвищеною стійкістю до комах.

10. Спосіб за п. 9, де підвищена стійкість до комах спрямована щодо О/абгоїса мігоїега мігуїПега, Піабгоїса рагбрегі та/або ріабгоїїса ипаесітрипсіаїа поуагаі.

11. Спосіб за п. 6, де рослина являє собою просо, просо лозоподібне, маїс, сорго, пшеницю, овес, газонну траву, пасовищну траву, льон, рис, цукрову тростину, олійний ріпак або ячмінь.

12. Трансгенна рослина, яка містить молекулу нуклеїнової кислоти, яка надає підвищеної стійкості до твердокрилих комах, де вказана молекула нуклеїнової кислоти містить касету експресії за п. 1.

13. Трансгенна рослина за п. 12, яка являє собою просо, просо лозоподібне, маїс, сорго, пшеницю, овес, газонну траву, пасовищну траву, льон, рис, цукрову тростину, олійний ріпак або ячмінь.

14. Спосіб здійснення контролю популяції лускокрилих або твердокрилих шкідників, який передбачає згодовування вказаній популяції ефективної для контролю комах кількості поліпептиду з інсектицидною активністю, де поліпептид вибраний із групи, що складається з: а) поліпептиду, який містить амінокислотну послідовність під ЗЕО ІЮ МО: 4; та р) поліпептиду, який містить амінокислотну послідовність, яка характеризується щонайменше 95 95 ідентичністю послідовності з амінокислотною послідовністю під ЗЕО ІЮ МО: 4.