MX2011002477A - Composiciones y metodos para la expresion de una secuencia de nucleotidos heterologa en plantas. - Google Patents

Abstract

La presente invención proporciona composiciones y métodos para dirigir polipéptidos a los cloroplastos de plantas superiores; las composiciones incluyen casetes de expresión que poseen una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido de tránsito al cloroplasto (CTP) unido operativamente a una secuencia de nucleótidos de interés, en donde el CTP se deriva de Chlamydomonas sp.; los vectores de transformación de la planta, las plantas y las células vegetales que poseen las secuencias CTP también están comprendidos, así como las variantes y fragmentos de las secuencias CTP; también se proporcionan los métodos para expresar una secuencia de nucleótidos heteróloga en una planta usando las secuencias CTP reveladas en la presente.

Description

COMPOSICIONES Y MÉTODOS PARA LA EXPRESIÓN DE UNA SECUENCIA DE NUCLEÓTIDOS HETERÓLOGA EN PLANTAS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con el campo de la biología molecular vegetal, más concretamente con la identificación y el uso de elementos regulatorios en plantas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La biogénesis de los cloroplastos en las plantas depende de la actividad coordinada de dos sistemas genéticos independientes localizados en el cloroplasto y el núcleo (ver Cline y Henry (1996), Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 12, 1-26). Las cuantiosas proteínas cloroplásticas constituyentes están codificadas por los genes nucleares y se sintetizan citoplásmicamente como formas precursoras que contienen extensiones aminoterminales conocidas como péptidos de tránsito. El péptido de tránsito es fundamental en el reconocimiento específico de la superficie del cloroplasto y en la mediación de la translocación postraduccional de las pre-proteínas a través de la envoltura del cloroplasto y de allí, a los diferentes subcompartimientos dentro del cloroplasto (como por ejemplo, el estroma, el tilacoide y la membrana tilacoidal).

Según diferentes informes, los genes que poseen secuencias de péptidos de tránsito codificadas naturalmente en su extremo N incluyen la subunidad pequeña del cloroplasto de la ribulosa-1 ,5-bisfosfatocarboxilasa (RuBisCo), de Castro Silva Filho et al. (1996) Plant Mol. Biol. 30: 769- 780; Schnell, D. J. et al. (1991) J. Biol. Chem. 266 (5): 3335-3342; la 5-(enolpiruvil) siquimato-3-fosfato sintasa (EPSPS), Archer et al. (1990) J. Bioenerg. and Biomemb. 22 (6):789-810; la triptófano sintasa, Zhao, J. et al. (1995) J. Biol. Chem. 2 70 ( 1):6081-6087; la plastocianina, Lawrence et al. (1997) J. Biol. Chem. 272 (33):20357-20363; la corismato sintasa, Schmidt et al. (1993) J. Biol. Chem. 268 (36):27477-27457; y la proteína de unión a la clorofila a/b captadora de luz (LHBP), Lamppa et al. (1988) J. Biol. Chem. 263: 14996-14999, aunque no todas estas secuencias han sido útiles en la expresión heteróloga de las proteínas cloroplásticas deseadas en plantas superiores.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Se proporcionan composiciones y métodos para dirigir polipéptidos a los cloroplastos de una planta. Las composiciones comprenden casetes de expresión que incluyen una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de péptidos que se dirigen al cloroplasto (o péptido de tránsito al cloroplasto, "CTP") derivada de un alga, unida operativamente a la secuencia de nucleótidos de interés. Estas construcciones de expresión son útiles en la expresión y el direccionamiento correcto de la secuencia de nucleótidos de interés en una planta monocotiledónea o dicotiledónea. La invención proporciona también vectores que comprenden los casetes de expresión, y plantas y células vegetales que poseen incorporado de forma estable o expresan provisoriamente en sus genomas un cásete de expresión como se describió anteriormente. Además, las composiciones incluyen las semillas transgénicas de esas plantas.

También se proporcionan los métodos para expresar una secuencia de nucleótidos en una planta o célula vegetal, así como los métodos para identificar las secuencias CTP de algas para usar en una planta.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 muestra la expresión de TagGFP en los protoplastos del tabaco.

La Figura 2 muestra la expresión y procesamiento del péptido de tránsito al cloroplasto del Chlamydomonas EPSPS en células de maíz. Senda 1 : línea de maíz no transgénico Hi-ll; Sendas 2 - 6: eventos T0 individuales transformados con la construcción Chlamydomonas EPSPS CTP/GRG23(ace3)(R173K); Senda 7: Marcador de peso molecular de la proteína; Senda 8: Proteína GRG23(ace3)(R173K) purificada (4 ng).

La Figura 3 muestra los cálculos del peso molecular de la proteína Chlamydomonas EPSPS - GRG-23(ace3)(R173K) procesada expresada en maíz.

Se usó una regresión lineal de la curva Log. peso molecular respecto de la distancia recorrida de los patrones de peso molecular de proteínas de la Figura 2 para calcular el peso molecular aparente de la proteína GRG23(ace3)(R173K) patrón y de la Chlamydomonas EPSPS -GRG-23(ace3)(R173K) procesada detectada en el extracto vegetal.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN A menudo en la producción de plantas transgénicas es útil dirigir proteínas exógenas a componentes subcelulares específicos, por ejemplo, el cloroplasto, la vacuola, la mitocondria o el retículo endoplasmático. En trabajos anteriores se han fusionado secuencias de ADN que codifican los péptidos de tránsito de diferentes plantas con los genes de interés. Cuando se traduce el gen, la proteína resultante posee el péptido de tránsito de la planta fusionado al extremo amínico de la proteína de interés y de esa manera, la proteína se dirige, con eficacia variable, hacia el compartimiento subcelular deseado.

De esta forma, la presente invención describe composiciones y métodos para dirigir los polipéptidos a los cloroplastos de plantas superiores o células vegetales. Las composiciones de la presente invención comprenden casetes de expresión que incluyen una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido de tránsito al cloroplasto (CTP) derivado de una alga unida operativamente a una secuencia de nucleótidos de interés. En otra realización, el CTP se deriva de la Chlamydomonas sp. En otra realización, el CTP comprende la secuencia de aminoácidos indicada en las SEQ ID NO:3, 5 ó 7, o una secuencia de aminoácidos codificada por las SEQ ID NO:1 , 2, 4 ó 6, así como las variantes, fragmentos o derivados del mismo. Además, se proporcionan plantas, células vegetales y semillas transformadas.

Las secuencias de la invención que codifican el CTP, cuando se les ensambla dentro de una construcción de ADN de forma tal que la secuencia que codifica el CTP está unida operativamente a la secuencia de nucleótidos de interés, facilitan el transporte cotraduccional o postraduccional del péptido de interés al cloroplasto de una célula vegetal transformada establemente con esa construcción de ADN. Los métodos para expresar una secuencia de nucleótidos en una planta comprenden introducir en las células vegetales un cásete de expresión que incluye una secuencia de nucleótidos que codifica el CTP de la invención unida operativamente a una secuencia de nucleótidos de interés y regenerar una planta transformada a partir de la célula vegetal.

Los artículos "un" y "una" se utilizan en la presente para referirse a uno o más ejemplares (es decir, a por lo menos uno) del objeto gramatical del artículo. A modo de ejemplo, "un elemento" significa uno o más elementos.

Como se usa en la presente, el término "molécula de ácido nucleico" incluye moléculas de ADN (por ejemplo, ADNc o ADN genómico) y moléculas de ARN (por ejemplo, ARNm) y análogos de ADN o ARN generados usando análogos de nucleótidos. La molécula de ácido nucleico puede ser mono o bicatenaria, pero preferentemente, es ADN bicatenario.

Péptidos de tránsito al cloroplasto Los cloroplastos son organelos que se encuentran en las células vegetales y algas eucanotas y llevan a cabo la fotosíntesis. El cloroplasto es un organelo celular complejo compuesto por tres membranas: la membrana interna, la membrana externa y la membrana tilacoidal. Estas membranas envuelven tres compartimientos acuosos denominados espacio intermembranario, estroma y lumen tilacoidal. Aunque los cloroplastos contienen su propio genoma circular, muchas proteínas de los cloroplastos son codificadas por los genes nucleares y se sintetizan citoplasmáticamente como formas precursoras que contienen extensiones aminoterminales conocidas como péptidos de tránsito al cloroplasto (CTP). El péptido de tránsito al cloroplasto es fundamental en el reconocimiento específico de la superficie del cloroplasto y en la mediación de la translocación postraduccional de las pre-proteínas a través de la envoltura del cloroplasto y hacia los diferentes subcompartimientos dentro del cloroplasto (como por ejemplo, el estroma, el tilacoide y la membrana tilacoidal).

Se han identificado por lo menos dos dominios funcionales distintos en los péptidos de tránsito al cloroplasto: el dominio de entrada al estroma (STD) y el dominio de entrada al lumen (LTD). Los STD gobiernan el acceso a la ruta de importación general y son necesarios y suficientes para importar la proteína pasajera al estroma. Los precursores de la proteina estromal poseen péptidos de tránsito que contienen solo un STD mientras que los precursores de la proteína del lumen tilacoidal poseen un STD y un LTD.

Los STD varían en longitud de unos 30 a 120 residuos y son ricos en residuos hidroxilados y deficientes en residuos ácidos. Tienden a compartir varios motivos de composición: 10-15 residuos aminoterminales desprovistos de Gly, Pro y residuos cargados; una región media variable rica en Ser, Thr, Lys y Arg; y una región carboxiproximal con una secuencia laxamente conservada (I le/Va l-X-Ala/Cys- Ala; SEQ ID NO:17) para el procesamiento proteolítico. Sin embargo, no hay grandes bloques de secuencias conservadas ni ningún motivo estructural secundario conservado. Los análisis teóricos sugieren que los STD adoptan conformaciones espirales predominantemente aleatorias.

Según diferentes informes, los genes que poseen secuencias de péptidos de tránsito codificadas naturalmente en su extremo N incluyen la subunidad pequeña del cloroplasto de la ribulosa-1 ,5-bisfosfatocarboxilasa (RuBisCo), de Castro Silva Filho et al. (1996) Plant Mol. Biol. 30: 769- 780; Schnell, D. J. et al. (1991) J. Biol. Chem. 266 (5): 3335-3342; la 5-(enolpiruvil) siquimato-3-fosfato sintasa (EPSPS), Archer et al. (1990) J. Bioenerg. and Biomemb. 22 (6):789-810; la triptofano sintasa, Zhao, J. et al. (1995) J. Biol. Chem. 2 70 (11):6081-6087; la plastocianina, Lawrence et al. (1997) J. Biol. Chem. 272 (33):20357-20363; la corismato sintasa, Schmidt et al. (1993) J. Biol. Chem. 268 (36):27477-27457; y la proteína de unión a la clorofila a/b captadora de luz (LHBP), Lamppa et al. (1988) J. Biol. Chem. 263: 14996-14999. Aunque se han descrito varios CTP, solo unos pocos se han utilizado con éxito en los experimentos para dirigir moléculas híbridas a los cloroplastos de plantas superiores.

La presente invención revela el uso de CTP derivados de algas, particularmente del tipo Chlamydomonas sp., en plantas superiores. A los efectos de esta invención, las "plantas superiores" se consideran integrantes del subreino Embryophytae. En una realización, el CTP útil en los métodos y composiciones que se revelan se deriva de Chlamydomonas. En otra realización, el CTP se expone en las SEQ ID NO:3, 5 ó 7, o está codificado por las SEQ ID NO:1 , 2, 4 ó 6, incluidas las variantes, fragmentos o derivados de las mismas. Sin embargo, el entendido en la materia comprenderá cómo identificar otros péptidos de tránsito al cloroplasto diferentes a los divulgados en la presente, por ejemplo, en GENBANK® se listan varios CTP (o secuencias de proteínas que incluyen los CTP).

Los CTP divulgados en la presente son útiles para dirigir un polipéptido hacia el cloroplasto de una célula vegetal. En una realización, los CTP divulgados en la presente proporcionan una mejor translocación en comparación con los CTP derivados de, por ejemplo, plantas superiores. Los CTP divulgados en la presente pueden proporcionar una translocación del polipéptido en el cloroplasto por lo menos un 20% aproximadamente, por lo menos un 30% aproximadamente, por lo menos un 40% aproximadamente, por lo menos un 50% aproximadamente, por lo menos un 60% aproximadamente, por lo menos un 70% aproximadamente, por lo menos un 80% aproximadamente, por lo menos un 90% aproximadamente, por lo menos un 100% aproximadamente, o más, o por lo menos aproximadamente 2 veces, por lo menos aproximadamente 3 veces, o por lo menos aproximadamente 4 veces, o más, mejor que la de un CTP de referencia. La mejoría se puede medir en términos de la cantidad de polipéptido que se transloca en el cloroplasto, de la cantidad de polipéptido activo que se transloca en el cloroplasto o ambos. La mejoría también puede medirse en términos de una mejoría en el fenotipo de un organismo transformado con la proteína dirigida al cloroplasto de interés. Por ejemplo, cuando se usa el CTP de la invención para dirigir al cloroplasto de la planta una proteína resistente a un herbicida, la mejoría en la actividad se puede medir en términos de la mejoría en la resistencia al herbicida.

Casetes de expresión Las secuencias que codifican el CTP de la invención pueden proporcionarse en un cásete de expresión que le permite impulsar la expresión y localización de un polipéptido codificado por la secuencia de nucleótidos de interés en el cloroplasto de las células vegetales. Por "cásete de expresión" se entiende una construcción de ADN capaz de resultar en la expresión de una proteína a partir de un marco de lectura abierto en una célula. El cásete incluirá en la dirección 5'-3' de transcripción, una región de inicio de transcripción que preferentemente comprende un promotor adecuado para la expresión en una célula vegetal de interés, unida operativamente a una secuencia que codifica el CTP de la invención, que posteriormente se une operativamente a una secuencia de nucleótidos de interés, y una región de terminación de transcripción y de traducción (es decir, una región de terminación) funcional en plantas. La secuencia de nucleótidos que codifica el CTP y la secuencia de nucleótidos de interés pueden estar separadas entre sí por secuencias de nucleótidos que codifican uno o más aminoácidos "de unión" como se describe en otra parte de la presente.

Además, el cásete puede contener por lo menos un gen adicional que se cotransformará en el organismo, como por ejemplo, un gen marcador seleccionable. De manera alternativa, se puede proporcionar el gen adicional en múltiples casetes de expresión. Tal cásete de expresión se proporciona con una pluralidad de sitios de restricción para que la inserción de la secuencia de nucleótidos de interés se lleve a cabo bajo el control transcripcional de las regiones reguladoras.

El cásete de expresión puede comprender también regiones 3' y/o 5' no traducidas. Por "región 3' no traducida" se entiende una secuencia de nucleótidos localizada en dirección 3' respecto de una secuencia de codificación. Las secuencias señal de la poliadenilación y otras secuencias que codifican las señales reguladoras capaces de afectar la adición de los tramos poliadenílicos en el extremo 3' del precursor ARNm son regiones 3' no traducidas. Por "región 5' no traducida" se entiende una secuencia de nucleótidos localizada en dirección 5' respecto de una secuencia de codificación. Otros elementos en dirección 5' ó 3' no traducidos incluyen a los potenciadores. Los potenciadores son secuencias de nucleótidos que actúan para aumentar la expresión de una región promotora. En la materia, los potenciadores son elementos ampliamente conocidos e incluyen, sin limitación, la región potenciadora SV40 y el elemento potenciador 35S.

La región de terminación puede ser originaria de la secuencia de nucleótidos que codifica el CTP de la presente invención, puede ser originaria de la secuencia de nucleótidos de interés o puede derivarse de cualquier otra fuente. A partir del plásmido Ti de A. tumefaciens se pueden obtener regiones de terminación convenientes como las regiones de finalización de la nopalina-sintasa y la octopina-sintasa. Ver también Guerineau et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 262:141-144; Proudfoot (1991) Ce// 64:671-674; Sanfacon et al. (1991) Genes Dev. 5:141-149; Mogen et al. (1990) Plant Cell 2:1261-1272; Munroe et al. (1990) Gene 91 :151-158; Bailas ef al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:7891-7903; y Joshi et al. (1987) Nucleic Acid Res. 15:9627-9639.

Los casetes de expresión descritos en la presente pueden contener además uno o más elementos reguladores aparte del CTP, así como CTP adicionales conocidos en la materia. Por "elemento regulador" o "región reguladora" se entiende una porción de ácido nucleico ubicada en dirección 5' ó 3' respecto de un gen que puede estar compuesta por ADN o ARN, o ADN y ARN, y que participa en la expresión del gen. Los elementos reguladores pueden mediar en la especificidad del órgano o controlar la activación temporal del gen o su desarrollo, e incluyen elementos promotores, elementos promotores centrales, elementos que responden a un estímulo externo, elementos activados constitutivamente, terminadores de transcripción, señales de poliadenilación y elementos que disminuyen o aumentan la actividad del promotor como elementos reguladores negativos o potenciadores de transcripción, respectivamente. Por "que actúa en cis" se entiende una secuencia físicamente contigua a la secuencia transcripta. Generalmente, las secuencias que actúan en cis interactúan con proteínas u otras moléculas para llevar a cabo la transcripción (iniciar, finalizar, regular, modular, etc.). Por "potenciador de transcripción" se entiende una secuencia de ácido nucleico que, cuando está en una posición próxima al promotor y presente en un medio de transcripción capaz de apoyar la transcripción, confiere una mayor actividad de transcripción en comparación con la que tendría lugar a partir del promotor en ausencia del potenciador. Los potenciadores pueden funcionar dentro de un gen o en dirección 5' o dirección 3' respecto de él, incluso tan lejos como a 50 kilobases del sitio de inicio de transcripción. Los potenciadores también pueden funcionar independientemente de su orientación. Por "terminador de transcripción" se entiende una secuencia de ADN que incluye un par de bases de nucleótidos necesaria para reducir o eliminar la transcripción. Por "señal de poliadenilación" se entiende una secuencia que controla la terminación de la transcripción y la traducción.

En un aspecto de la invención, se diseñan secuencias de ADN artificial para un polipéptido dado, como por ejemplo, los polipéptidos dirigidos al cloroplasto útiles en los métodos que se describen en la presente. La expresión del marco de lectura abierto de la secuencia de ADN artificial en una célula resulta en la producción del polipéptido. Las secuencias de ADN artificiales pueden ser útiles simplemente para eliminar los sitios de reconocimiento de la endonucleasa de restricción no deseados, facilitar las estrategias de clonación de ADN, alterar o eliminar cualquier preferencia codónica potencial, alterar o mejorar el contenido de GC, eliminar o alterar los marcos de lectura alternos y/o alterar o eliminar los sitios de reconocimiento de empalme intrón/exón, sitios de poliadenilación, secuencias de Shine-Delgarno, elementos promotores no deseados y similares que puedan estar presentes en una secuencia de ADN natural. También es posible que las secuencias de ADN artificiales puedan utilizarse para introducir otras mejoras en la secuencia de ADN, como por ejemplo, introducir una secuencia de intrón, crear una secuencia de ADN que se expresa como una proteína fusionada a secuencias dirigidas al organelo, como péptidos de tránsito al cloroplasto, péptidos dirigidos al apoplasto/vacuola, o secuencias peptídicas que resulten en la retención del péptido resultante en el retículo endoplasmático. También se pueden sintetizar genes artificiales usando codones preferidos de células anfitrionas para mejorar la expresión, o usando codones en una frecuencia de uso de codón preferido del anfitrión. Ver, por ejemplo, Campbell y Gowri (1990) Plant Physiol. 92:1-1 1 ; las patentes estadounidenses n.° 6,320,100, 6,075,185, 5,380,831 y 5,436,391 , las solicitudes estadounidenses publicadas n.° 20040005600 y 20010003849, y Murray et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:477-498, que se incorporan a la presente a modo de referencia.

Los ácidos nucleicos de interés a ser direccionados al cloroplasto también pueden optimizarse para su expresión en el cloroplasto para poner de relieve las diferencias de uso de codón entre el núcleo de la planta y este organelo. De esta manera, los ácidos nucleicos de interés se pueden sintetizar usando codones preferidos por el cloroplasto. Ver por ejemplo, la patente estadounidense n.° 5,380,831 , la que se incorpora a la presente a modo de referencia.

Variantes y fragmentos Las moléculas de ácido nucleico que son fragmentos de las secuencias CTP reveladas también están comprendidas en la presente invención. Por "fragmento" se entiende una porción de la secuencia CTP. Un fragmento de una secuencia de nucleótidos puede ser biológicamente activo y de esta forma, capaz de facilitar la translocación de un péptido de interés dentro del cloroplasto de una planta, o puede ser un fragmento que se puede usar como sonda de hibridación o cebador de RCP, usando los métodos divulgados en la presente. Los estudios para determinar si tales fragmentos tienen actividad CTP son bien conocidos en la materia.

Las moléculas de ácido nucleico que son fragmentos de una secuencia de nucleótidos que codifica el CTP revelada en la presente pueden comprender por lo menos, unos 90, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300 nucleótidos contiguos, o hasta el número de nucleótidos presentes en una secuencia CTP completa revelada en la presente (por ejemplo, 306 nucleótidos para la SEQ ID NO:1) en función del uso deseado. Por nucleótidos "contiguos" se entiende residuos de ácido nucleico inmediatamente adyacentes unos de otros. Los fragmentos biológicamente activos de las secuencias que codifican el CTP de la presente invención codificarán un CTP que conserva la actividad. Por "conserva la actividad CTP" se entiende que el fragmento dirigirá la translocación en el cloroplasto de por lo menos aproximadamente un 30%, por lo menos aproximadamente un 50%, por lo menos aproximadamente un 70% o por lo menos aproximadamente un 80% del polipéptido codificado por la secuencia de nucleótidos de interés. En una realización, un fragmento de una secuencia de nucleótidos que codifica el CTP revelada en la presente puede comprender una o más eliminaciones de las SEQ ID NO:1 , 2, 4 ó 6, inclusive hasta aproximadamente 2, aproximadamente 3, aproximadamente 4, aproximadamente 5, aproximadamente 6, aproximadamente 7, aproximadamente 8, aproximadamente 9, aproximadamente 10, aproximadamente 12, aproximadamente 15, aproximadamente 18, aproximadamente 21, aproximadamente 24, aproximadamente 27, aproximadamente 30 ó más eliminaciones. En una realización, un fragmento de una secuencia de nucleótidos que codifica el CTP revelada en la presente, puede codificar un aminoácido que comprende una o más eliminaciones de las SEQ ID NO:3, 5 ó 7, inclusive aproximadamente 2, aproximadamente 3, aproximadamente 4, aproximadamente 5, aproximadamente 6, aproximadamente 7, aproximadamente 8, aproximadamente 9, aproximadamente 10 o más eliminaciones de aminoácidos.

Se puede preparar una porción biológicamente activa de un CTP aislando una porción de una de las secuencias CTP de la invención y evaluando la actividad de esa porción del CTP. En la técnica se conocen ampliamente los métodos para medir la actividad CTP. Para ejemplos de métodos apropiados, consultar la sección titulada "Evaluación de la actividad CTP".

Las variantes de las secuencias de nucleótidos que codifican el CTP o de las secuencias de aminoácidos del CTP reveladas en la presente también están comprendidas dentro del alcancé de la presente. Por "variante" se entiende una secuencia suficientemente idéntica o una secuencia que difiere de un péptido de tránsito al cloroplasto natural en por lo menos un aminoácido. Las secuencias que codifican el CTP comprendidas dentro de la presente invención son suficientemente idénticas a la secuencia de nucleótidos de las SEQ ID NO:1 , 2, 4 ó 6. Las secuencias de CTP comprendidas en la presente son suficientemente idénticas a la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO:3, 5 ó 7. Por "suficientemente idéntica" se entiende una secuencia de nucleótidos que posee por lo menos aproximadamente un 70% o un 75%, aproximadamente un 80% o un 85% de identidad de secuencia, aproximadamente un 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia en comparación con una secuencia de referencia usando uno de los programas de alineación que se describen en la presente.

En una realización, las variantes reveladas en la presente incluyen sustituciones, eliminaciones, truncaciones e inserciones de uno o más nucleótidos de las SEQ ID NO:1 , 2, 4 ó 6 o de uno o más aminoácidos de las SEQ ID NO:3, 5 ó 7, incluidas hasta aproximadamente 2, aproximadamente 3, aproximadamente 4, aproximadamente 5, aproximadamente 6, aproximadamente 7, aproximadamente 8, aproximadamente 9, aproximadamente 10, aproximadamente 15, aproximadamente 20, aproximadamente 25, aproximadamente 30 o más sustituciones, eliminaciones o inserciones de aminoácidos.

Las variantes naturales se pueden identificar usando las técnicas de biología molecular conocidas, como técnicas de reacción en cadena de la polimerasa (RCP) e hibridación como se describe en líneas generales más adelante. Las variantes de secuencias de nucleótidos también incluyen las secuencias de nucleótidos derivadas sintéticamente generadas por ejemplo, mediante mutagenia dirigida al sitio, pero que aún conservan actividad CTP como se define en la presente.

Las variantes comprendidas en la presente invención son biológicamente activas, es decir, siguen teniendo la actividad biológica deseada de la secuencia natural, es decir, conserva su actividad CTP (es decir, facilita la traslocación del polipéptido expresado al cloroplasto). Por "conserva la actividad CTP" se entiende que la variante dirigirá la translocación al cloroplasto de por lo menos aproximadamente un 30%, por lo menos aproximadamente un 50%, por lo menos aproximadamente un 70% o por lo menos aproximadamente un 80% del polipéptido codificado por la secuencia de nucleótidos de interés. En la técnica se conocen ampliamente los métodos para medir la actividad CTP. Para ejemplos de métodos apropiados, consultar la sección titulada "Evaluación de la actividad CTP".

El entendido en la materia comprenderá además que se pueden introducir cambios en el CTP mediante mutaciones en la secuencia de nucleótidos que codifica los CTP de la invención sin alterar la capacidad del CTP para dirigir la traslocación de un polipéptido en el cloroplasto de una célula vegetal. Así, se pueden crear variantes de moléculas de ácido nucleico aisladas introduciendo una o más sustituciones, adiciones o eliminaciones de nucleótidos en la correspondiente secuencia de nucleótidos revelada en la presente. Las mutaciones se pueden introducir mediante técnicas estándares como mutagenia dirigida al sitio o mutagenia mediada por RCP. Esas secuencias de nucleótidos variantes también están comprendidas dentro de la presente invención.

De manera alternativa, se pueden obtener secuencias de nucleótidos variantes introduciendo mutaciones aleatorias en toda o parte de la secuencia CTP, por ejemplo, mediante mutagenia de saturación, y las secuencias mutantes obtenidas se pueden analizar para determinar su capacidad para dirigir la translocación de una secuencia de polipéptidos unidos operativamente al cloroplasto de una célula vegetal.

Por "unido operativamente" se entiende una unión funcional entre un elemento regulatorio (por ejemplo, un CTP) y una segunda secuencia, en donde la secuencia CTP dirige la traslocación del polipéptido de interés al cloroplasto de la célula vegetal. Generalmente, pero no siempre, unido operativamente significa que las secuencias de ácido nucleico que se unen son contiguas y, cuando es necesario unir dos regiones codificantes de proteínas, contiguas y en el mismo marco de lectura.

Para determinar el porcentaje de identidad de dos ácidos nucleicos, las secuencias se alinean para poder compararlas de manera óptima. El porcentaje de identidad entre dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es decir, porcentaje de identidad = número de posiciones idénticas/número total de posiciones (por ejemplo, posiciones que se superponen) x 100). En una realización, las dos secuencias tienen el mismo largo. En una realización, la comparación se realiza tomando toda la secuencia de referencia (por ejemplo, SEQ ID NO:1 , 2, 4 ó 6). El porcentaje de identidad entre dos secuencias se puede determinar usando técnicas similares a las descritas más adelante, considerando o no las faltas de coincidencia. Para calcular el porcentaje de identidad habitualmente se cuentan las coincidencias exactas.

El porcentaje de identidad entre dos secuencias se puede determinar usando un algoritmo matemático. Un ejemplo no restrictivo de un algoritmo matemático utilizado para comparar dos secuencias es el algoritmo de Karlin y Altschul (1990) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87:2264, modificado según Karlin y Altschul (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:5873-5877. El programa BLASTN de Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403, incorpora ese algoritmo. Las búsquedas de nucleótidos BLAST se pueden llevar a cabo con el programa BLASTN, puntuación = 100, longitud de onda = 12, para obtener secuencias de nucleótidos homologas a las secuencias de la invención. Para obtener una alineación de las faltas de coincidencia con fines comparativos, se puede utilizar el programa Gapped BLAST como se describe en Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389. De manera alternativa, se puede utilizar el PSI-Blast para realizar una búsqueda repetida que detecte relaciones distantes entre las moléculas. Ver Altschul et al. (1997) supra. Cuando se utilizan los programas BLAST, Gapped BLAST y PSI-Blast, se pueden utilizar los parámetros de defecto de los respectivos programas (por ejemplo, BLASTN). Ver www.ncbi.nlm.nih.gov. Otro ejemplo no restrictivo de algoritmo matemático utilizado para comparar secuencias es el algoritmo ClustalW (Higgins et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22:4673-4680). ClustalW compara secuencias y alinea toda la secuencia del ADN y de esta forma, proporciona datos sobre la conservación de secuencia de toda la secuencia de nucleótidos. El algoritmo ClustalW se usa en varios paquetes de software de análisis de ADN de venta comercial, como el módulo ALIGNX del NTi Program Suite (Informax, Inc). Un ejemplo no restrictivo de un programa informático útil para el análisis de las alineaciones del ClustalW es el GeneDoc™. El GeneDoc™ (Karl Nicholas) permite evaluar la similitud de ADN y la identidad entre múltiples genes. Otro ejemplo no restrictivo preferido de algoritmo matemático utilizado para comparar secuencias es el algoritmo de Myers y Miller (1988) CABIOS 4:11-17. El programa ALIGN (versión 2.0), que es parte del paquete de software de alineación de secuencias GCG (vendido por Accelrys, Inc., 9865 Scranton Rd., San Diego, California, EE. UU.), incorpora este algoritmo.

A menos que se indique lo contrario, se usará el programa GAP versión 10 (que usa el algoritmo de Needleman y Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48(3):443-453) para determinar la similitud o identidad de secuencia, usando los siguientes parámetros: % de identidad y % de similitud para una secuencia de nucleótidos usando una ponderación de falta de coincidencia de 50 y una ponderación de longitud de 3, y la matriz de puntuación nwsgapdna.cmp; % de identidad o % de similitud para una secuencia de aminoácidos usando una ponderación de falta de coincidencia de 8 y una ponderación de longitud de 2, y el programa de puntuación BLOSUM62. También se pueden utilizar programas equivalentes. Por "programa equivalente" se entiende cualquier programa de comparación de secuencias que, para cualquier par de secuencias en cuestión, genere un alineamiento con una coincidencia de residuos de nucleótidos idéntica y un porcentaje de identidad de secuencia idéntico en comparación con el alineamiento correspondiente generado con el GAP versión 10.

Usando modelos como RCP, hibridación y similares, se pueden identificar las secuencias correspondientes pertenecientes a otros organismos, particularmente algas, secuencias que son sustancialmente idénticas a las secuencias de la invención. Ver, por ejemplo, Sambrook J., y Russell, D.W. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. (Coid Spring Harbor Laboratory Press, Coid Spring Harbor, NY) e Innis, et al. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, NY). Las secuencias identificadas por su identidad con las secuencias CTP establecidas en la presente están comprendidas dentro de la presente invención.

En otra realización, los CTP se pueden identificar en función de la identificación de secuencias conocidas que incluyen los CTP. Por ejemplo, las secuencias dirigidas al cloroplasto se pueden identificar en función de la similitud de las proteínas dirigidas al cloroplasto reveladas en la presente o conocidas en la materia (por ejemplo, acetolactato sintasa (AHAS), subunidad pequeña (SSU) y EPSPS). La secuencia CTP de estas proteínas se puede identificar usando los métodos conocidos en la materia. Ver, por ejemplo, Emanuelsson y von Heijne (2001) Biochimica et Biophysica Acta 1541 :1 14-1 19; Nielson et al. (1997) Protein Eng. 10:1-6; y Nielson y Krogh (1998) Intell. Syst. Mol. Biol. 6:122-130, cada una de las cuales se incorpora en su totalidad a la presente a modo de referencia. También hay disponibles numerosos programas informáticos para la identificación. Ver, por ejemplo, ChloroP (disponible en la dirección web www.cbs.dtu.dk/services/ChloroP/); Predotar (disponible en la dirección web www.inra.fr/lnternet/Produits/Predotar/); y SignalP (disponible en la dirección web www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/).

Se pueden diseñar cebadores oligonucleótidos para usar en las reacciones en cadena de la polimerasa (RCP) para amplificar las secuencias de ADN correspondientes a partir del ADNc o ADN genómico extraído de cualquier organismo de interés. Los métodos para diseñar cebadores RCP y clonación RCP son conocidos en la materia y se revelan en Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2.a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). Ver también Innis et al., eds. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, Nueva York); Innis y Gelfand, eds. (1995) PCR Strategies (Academic Press, Nueva York); e Innis y Gelfand, eds. (1999) PCR Methods Manual (Academic Press, Nueva York). Los métodos conocidos de RCP incluyen, sin limitación, los métodos que usan cebadores emparejados, cebadores anidados, cebadores de secuencia específica, cebadores redundantes, cebadores específicos para un gen, cebadores específicos para un vector y cebadores parcialmente disparejos.

En un método de hibridación, se puede usar toda o parte de una secuencia de nucleótidos conocida para analizar las genotecas de ADNc o genómicas. Los métodos para la construcción de esas genotecas de ADNc o genómicas son conocidos en la materia y se revelan en Sambrook y Russell, 2001 , supra. Las sondas de hibridación pueden ser fragmentos de ADN genómico, fragmentos de ADNc, fragmentos de ARN u otros oligonucleótidos y pueden estar marcados con un grupo detectable como 32P o cualquier otro marcador detectable, como otros radioisótopos, un compuesto fluorescente, una enzima o un cofactor enzimático. Las sondas para la hibridación pueden obtenerse marcando oligonucleótidos artificiales en función de la secuencia que codifica el CTP conocida revelada en la presente o de cebadores para la proteína dirigida al cloroplasto conocida. También se pueden usar cebadores redundantes diseñados a base de nucleótidos conservados en la secuencia de nucleótidos. Generalmente, la sonda comprende una región de la secuencia de nucleótidos que híbrida, en condiciones rigurosas, hasta al menos aproximadamente 12, al menos aproximadamente 20, al menos aproximadamente 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350 ó 400 nucleótidos consecutivos de la secuencia que codifica el CTP de la invención, una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína dirigida al cloroplasto o un fragmento o variante de ellas. La manera de preparar las sondas para hibridación es, en general, conocida en la materia y se revela en Sambrook y Russell, 2001 , supra, la que se incorpora a la presente a modo de referencia.

Por ejemplo, se puede usar toda la secuencia que codifica el CTP que se revela en la presente (o la secuencia de codificación de la proteína dirigida al cloroplasto), o una o más porciones de la misma, como sonda capaz de hibridar de manera específica a las secuencias de tipo CTP correspondientes. Para lograr una hibridación específica en diferentes condiciones, esas sondas incluyen secuencias que son únicas y que poseen por lo menos aproximadamente 10 nucleótidos de longitud, o por lo menos aproximadamente 20 nucleótidos. Esas sondas pueden ser útiles para amplificar mediante RCP las correspondientes secuencias que codifican el CTP proveniente de un organismo dado. Esta técnica se puede usar para aislar otras secuencias codificantes a partir de un organismo dado o como prueba de diagnóstico para determinar la presencia de secuencias codificantes en un organismo. Las técnicas de hibridación incluyen selección de hibridación de genotecas de ADN (plaquetas o colonias; ver por ejemplo, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2.a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY).

La hibridación de tales secuencias se puede llevar a cabo en condiciones rigurosas. Por "condiciones rigurosas" o "condiciones de hibridación rigurosas" se entiende condiciones en las cuales una sonda hibridará a su secuencia objetivo en un grado detectablemente mayor que las otras secuencias (por ejemplo, por lo menos, 100% más). Las condiciones rigurosas dependen de la secuencia y serán diferentes en diferentes circunstancias. Al controlar la rigurosidad de las condiciones de hibridación y/o lavado, se pueden identificar secuencias que son 100% complementarias con la sonda (sondaje homólogo). De manera alternativa, las condiciones rigurosas se pueden ajustar para permitir algún emparejamiento incorrecto en las secuencias de forma tal de detectar grados de similitud menores (sondaje heterólogo). Generalmente, una sonda tiene de largo menos de aproximadamente 1000 nucleótidos o menos de 500 nucleótidos.

Habitualmente, las condiciones rigurosas serán aquellas en que la concentración de sal en forma de ión de sodio (u otras sales) es menor de aproximadamente 1.5 M, habitualmente, aproximadamente 0.01 a 1.0 M, pH de 7.0 a 8.3 y la temperatura es por lo menos aproximadamente 30°C para sondas cortas (por ejemplo, de 10 a 50 nucleótidos) y por lo menos aproximadamente 60°C para sondas largas (por ejemplo, de más de 50 nucleótidos). Las condiciones rigurosas también se pueden lograr agregando agentes desestabilizantes como la formamida. Los ejemplos de condiciones de baja rigurosidad incluyen la hibridación con una solución tampón de formamida del 30 al 35%, NaCI 1 M, SDS 1 % (dodecilsulfato de sodio) a 37°C, y un lavado en SSC 1X a 2X (SSC 20X = NaCI 3.0 M /citrato de trisodio 0.3 M) a 50 - 55°C. Los ejemplos de condiciones de rigurosidad moderada incluyen la hibridación en formamida del 40 al 45%, NaCI 1.0 M, SDS 1% a 37°C, y un lavado en SSC 0.5X a 1X a 55 - 60°C Los ejemplos de condiciones de rigurosidad alta incluyen la hibridación en formamida al 50%, NaCI 1 M, SDS 1 % a 37°C, y un lavado en SSC 0.1X entre 60 - 65°C Opcionalmente, los tampones de lavado pueden incluir aproximadamente 0.1 % a aproximadamente 1 % de SDS. Generalmente, la hibridación dura menos de 24 horas aproximadamente, usualmente aproximadamente de 4 a 12 horas. Opcionalmente, los tampones de lavado pueden incluir aproximadamente 0.1 % a aproximadamente 1 % de SDS.

En general, la función de los lavados poshibridación es la especificidad; los factores críticos son la concentración iónica y la temperatura de la solución de lavado final. Para los híbridos ADN-ADN, la Tm se puede aproximar a partir de la ecuación de Meinkoth y Wahl (1984) Anal. Biochem. 138:267-284: Tm = 81.5°C + 16.6 (log M) + 0.41 (%GC) - 0.61 (% form) - 500/L; en donde M es la molaridad de los cationes monovalentes, %GC es el porcentaje de nucleótidos guanosina y citosina en el ADN, % form es el porcentaje de formamida en la solución de hibridación y L es la longitud del híbrido en pares de bases. La Tm es la temperatura (a una concentración iónica y pH dada) a la cual 50% de la secuencia objetivo se híbrida a una sonda que coincide perfectamente. La Tm se reduce aproximadamente 1 °C por cada 1% de emparejamiento incorrecto; por lo tanto la Tm y las condiciones de lavado e hibridación se pueden ajustar para lograr la hibridación a las secuencias de la identidad deseada. Por ejemplo, si se buscan secuencias con una identidad > a 90%, la Tm se puede disminuir 10°C. Generalmente, las condiciones rigurosas se seleccionan de forma tal que estén aproximadamente 5°C por debajo del punto de fusión térmica (Tm) para la secuencia específica y su complemento, a una concentración iónica y pH definidos. Sin embargo, unas condiciones muy rigurosas pueden utilizar una hibridación y/o lavado a 1 , 2, 3 ó 4°C por debajo del punto de fusión térmica (Tm); unas condiciones de rigurosidad moderada pueden utilizar una hibridación y/o lavado a 6, 7, 8, 9 ó 10°C por debajo del punto de fusión térmica (Tm); unas condiciones poco rigurosas pueden utilizar una hibridación y/o lavado a 11 , 12, 13, 14, 15 ó 20°C por debajo del punto de fusión térmica (Tm). Usando la ecuación, las composiciones de lavado e hibridación y la Tm deseada, el entendido en la materia comprenderá que quedan comprendidas inherentemente diferentes variaciones en la rigurosidad de la hibridación y/o soluciones de lavado. Si el grado de emparejamiento incorrecto deseado resulta en una Tm de menos de 45°C (solución acuosa) o 32°C (solución de formamida), la concentración de SSC se puede aumentar de forma tal que se puede usar una temperatura mayor. Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology— Hybridization with Nucleic Acid Probes, parte I, capítulo 2 (Elsevier, Nueva York); y Ausubel et al., eds. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, capítulo 2 (Greene Publishing and Wiley-Interscience, Nueva York) proporcionan una extensa guía para la hibridación de los ácidos nucleicos. Ver Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2.a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY).

La presente invención comprende las secuencias aisladas que tengan actividad CTP y que se hibriden en condiciones rigurosas a las secuencias CTP reveladas en la presente, o fragmentos de ellas.

Métodos de uso Los métodos de la presente invención están dirigidos a la expresión, traslocación y procesamiento adecuado de secuencias dirigidas al cloroplasto en plantas superiores y células vegetales bajo el control de las secuencias CTP de la presente invención. A los efectos de la presente invención, una proteína dirigida al cloroplasto "procesada" es una proteína en donde se ha eliminado el CTP. Al momento de la traslocación de una proteína dirigida al cloroplasto en el cloroplasto de una célula vegetal, el CTP se elimina de la proteína deseada mediante escisión en un "sitio de escisión" determinado entre el CTP y la proteína madura. El sitio de escisión se puede determinar de manera experimental o se puede predecir basándose en la estructura de la secuencia (por ejemplo, alineando la proteína no procesada con proteínas dirigidas al cloroplasto con sitio de escisión conocido, analizando la secuencia para establecer la presencia de dominios CTP característicos, etc.) o usando uno o más algoritmos de predicción de sitio de escisión como se describe en otras partes de la presente (por ejemplo, SignalP).

Las plantas transgénicas pueden experimentar cambios en su fenotipo, inclusive, sin limitación, un mecanismo de defensa contra insectos o patógenos alterado, una mayor resistencia a uno o más herbicidas, una mayor capacidad para soportar condiciones medioambientales desfavorables, una capacidad modificada para producir almidón, un nivel de producción de almidón modificado, un contenido y/o composición oleosa modificado, una capacidad modificada para usar, distribuir y/o almacenar nitrógeno, y similares. Estos resultados se pueden lograr mediante la expresión y dirección de un polipéptido de interés al cloroplasto de la planta, en donde el polipéptido de interés funciona en el cloroplasto. Las secuencias CTP de la invención son útiles para dirigir secuencias naturales y secuencias heterólogas (artificiales) en plantas superiores. A los efectos de esta invención, las "plantas superiores" se consideran integrantes del subreino Embryophytae. En una realización, la planta es monocotiledónea. En una realización, la planta es dicotiledónea.

Generalmente, la secuencia de nucleotidos que codifica el CTP de la invención se proporciona en un cásete de expresión con una secuencia de nucleotidos de interés para la expresión en la planta de interés. En una realización, las secuencias que codifican el CTP de la invención son útiles para mejorar la translocación de las secuencias naturales en una planta. En otras realizaciones, las secuencias que codifican el CTP son útiles en la expresión y traslocación de polipéptidos codificados por secuencias de nucleotidos heterólogas. Por "secuencia de nucleotidos heterologa" se entiende una secuencia que no está naturalmente unida de forma operativa a la secuencia que codifica el CTP de la invención, e incluye copias múltiples que no se dan en la naturaleza de una secuencia de ADN natural. Aunque esta secuencia de nucleotidos es heterologa en relación a la secuencia que codifica el CTP, puede ser homologa o "natural", o heterologa o "exógena" en relación a la planta anfitriona. En algunos casos, la planta transformada puede experimentar cambios en su fenotipo. Generalmente, "heterólogo" se refiere a secuencias de ácidos nucleicos que no son endógenos de la célula o parte del genoma natural en el que están presentes, y que fueron agregadas a la célula mediante infección, transfección, microinyección, electroporación, microproyección y métodos similares.

Se puede usar cualquier secuencia de nucleotidos de interés con las secuencias que codifican el CTP de la invención siempre que el polipéptido codificado por la secuencia de nucleotidos de interés (en otras palabras, el "polipéptido de interés") sea funcional en el cloroplasto. Esas secuencias de nucleótidos incluyen, sin limitación, secuencias codificantes con tolerancia a herbicidas, secuencias codificantes insecticidas, secuencias codificantes nematicidas, secuencias codificantes antibióticas, secuencias codificantes antifúngicas, secuencias codificantes antivirales, secuencias codificantes resistentes al estrés abiótico y biótico o secuencias que modifican las características de la planta como su rendimiento, la calidad del grano, el contenido nutricional, la calidad y cantidad del almidón, la fijación y/o uso de nitrógeno y el contenido y/o composición oleosa. Otros genes más específicos de interés para la presente invención incluyen, sin limitación, genes que mejoran el rendimiento del cultivo, genes que mejoran la conveniencia del cultivo, genes que codifican proteínas que confieren resistencia al estrés abiótico como sequías, temperaturas, salinidad, metales tóxicos u oligoelementos, o aquellos que confieren resistencia a las toxinas tales como pesticidas y herbicidas, o al estrés biótico como ataques de hongos, virus, bacterias, insectos y nematodos, y el desarrollo de enfermedades asociadas con tales organismos. Se entiende que cualquier gen de interés se puede unir operativamente a las secuencias que codifican el CTP de la invención y expresarse en una planta siempre que el polipéptido codificado por el gen sea funcional en los cloroplastos.

Estas secuencias de nucleótidos de interés pueden codificar proteínas involucradas en proporcionar resistencia a las enfermedades o pestes. Por "resistencia a enfermedades" o "resistencia a pestes" se entiende que las plantas evitan los síntomas dañinos que son el resultado de las interacciones planta-patógeno. Los genes de resistencia a las enfermedades y resistencia a insectos como lisosimas o cecropinas para protección antibacterial o proteínas como las defensinas, glucanasas o citinasas para protección antifúngica, o endotoxinas Bacillus thuringiensis, inhibidores de la proteasa, colagenasas, lectinas o glucosidasas para controlar nematodos o insectos son todos ejemplos de productos génicos útiles. Los ejemplos de genes de interés se pueden encontrar, por ejemplo, en www.nbiap.vt.edu/cfdocs/fieldtests2.cfm.

"Peste" incluye, sin limitación, insectos, hongos, bacterias, virus, nematodos, ácaros, garrapatas y similares. Las plagas de insectos incluyen insectos seleccionados entre los órdenes Coleóptera, Díptera, Hymenoptera, Lepidoptera, Mallophaga, Homoptera, Hemiptera, Orthroptera, Thysanoptera, Dermaptera, Isoptera, Anoplura, Siphonaptera, Trichoptera, etc., en particular, los órdenes Coleóptera, Lepidoptera y Díptera. Los virus incluyen, sin limitación, el virus del mosaico del tabaco o del pepino, el virus del ringspot, el virus de la necrosis, el virus del mosaico enanizante del maíz, etc. Los nematodos incluyen, sin limitación, los nematodos parásitos como los anguilulosis, los cecidios y nematodos de lesión, incluidos Heterodera spp., Meloidogyne spp., y Globodera spp.; particularmente, los integrantes de los nematodos cecidios, incluidos sin limitación, Heterodera glycines (nematodo cecidio de la soja); Heterodera schachtii (nematodo cecidio de la remolacha); Heterodera avenae (nematodo cecidio del cereal); y Globodera rostochiensis y Globodera pailida (nematodo cecidio de la papa). Los nematodos de lesión incluyen, sin limitación, el Pratylenchus spp. Las plagas fúngicas incluyen las que causan roya foliar, roya de tallo, roya amarilla y roya lineal.

Una "proteína resistente al herbicida" o una proteína resultado de la expresión de una "molécula de ácido nucleico codificante resistente al herbicida" incluye proteínas que confieren a la célula la capacidad para tolerar una mayor concentración de herbicida que las células que no expresan la proteína o para tolerar una cierta concentración de herbicida por un período de tiempo más largo que las células que no expresan la proteína. Se pueden introducir en las plantas características de resistencia al herbicida por medio de genes que codifican la resistencia a los herbicidas que actúan inhibiendo la acción de la acetolactato sintasa (ALS), en particular, los herbicidas a base de sulfonilurea, genes que codifican la resistencia a los herbicidas que actúan inhibiendo la acción de la glutamina sintasa, como la fosfinotricina o basta (por ejemplo, el gen bar), glifosfato (por ejemplo, el gen EPSP sintasa y el gen GAT) u otros genes conocidos en la materia.

Los genes que mejoran el rendimiento del cultivo incluyen los genes enanizantes como Rht1 y Rht2 (Peng et al. (1999) Nature 400:256-261), y los que aumentan el crecimiento de la planta, como la deshidrogenasa de glutamato amónico inducible. Los genes que mejoran la conveniencia del cultivo incluyen por ejemplo, los que hacen posible que las plantas posean un contenido de grasa saturada reducido, los que aumentan el valor nutricional de las plantas y los que aumentan la proteína del grano. Los genes que mejoran la tolerancia salina son los que aumentan o posibilitan el crecimiento de la planta en un medioambiente con mayor salinidad que el medioambiente natural de la planta en la cual se han introducido genes de tolerancia a la sal.

Vectores de transformación de las plantas Habitualmente, el cásete de expresión de la planta se insertará en un "vector de transformación vegetal". Por "vector de transformación" se entiende una molécula de ADN necesaria para la transformación eficiente de una célula. Esa molécula puede estar compuesta por uno o más casetes de expresión y puede estar organizada en más de una molécula de ADN "vector". Por ejemplo, los vectores binarios son vectores de transformación vegetal que utilizan dos vectores de ADN no contiguos para codificar todas las funciones de actuación en cis y trans para transformar las células vegetales (Hellens y Mullineaux (2000) Trends in Plant Science 5:446-451). "Vector" se refiere a una construcción de ácido nucleico para realizar transferencias entre diferentes células anfitrionas. "Vector de expresión" se refiere a un vector que posee la capacidad para incorporar, integrar y expresar secuencias de ADN heterólogas o fragmentos de las mismas, en una célula foránea. Por "introducir" se entiende presentar al organismo que se está transformando la construcción nucleotídica de tal manera que la construcción logra acceder al interior de por lo menos una célula del organismo.

Este vector de transformación vegetal puede estar compuesto por uno o más vectores de ADN necesarios para lograr la transformación de la planta. Por ejemplo, es una práctica habitual en la materia utilizar vectores de transformación vegetal compuestos por más de un segmento de ADN contiguo. A menudo, en la materia se refiere a estos vectores como "vectores binarios". Los vectores binarios así como los vectores con plásmidos colaboradores se usan más comúnmente para la transformación mediada por Agrobacteríum, donde el tamaño y la complejidad de los segmentos de ADN necesarios para lograr una transformación eficiente son bastante grandes y resulta conveniente separar funciones entre moléculas de ADN separadas. Generalmente, los vectores binarios contienen un vector plásmido que contiene las secuencias que actúan en cis necesarias para transferir ADN-T (como extremo izquierdo y extremo derecho), un marcador seleccionable diseñado para ser capaz de expresarse en una célula vegetal y un "gen de interés" (un gen diseñado para ser capaz de expresarse en una célula vegetal para la cual se desea generar plantas transgénicas). Este vector plásmido también incluye las secuencias necesarias para la replicación bacteriana.

Estas secuencias que actúan en cis están dispuestas de manera de permitir una transferencia eficiente hacia las células vegetales y la expresión en las mismas. Por ejemplo, el gen marcador seleccionable y el gen de interés están ubicados entre el extremo izquierdo y el derecho. A menudo, un segundo vector plásmido contiene los factores que actúan en trans que median la transferencia T-ADN desde la Agrobacterium a las células vegetales. Este plásmido contiene frecuentemente las funciones de virulencia (genes Vir) que permiten que la Agrobacterium infecte las células vegetales y permiten la transferencia de ADN mediante escisión en las secuencias marginales y la transferencia de ADN mediada por los genes vir, como se entiende en la materia (Hellens y Mullineaux (2000) Trends ¡n Plant Science, 5:446-451). Se pueden usar varios tipos de cepas Agrobacterium (por ejemplo, LBA4404, GV3101 , EHA101 , EHA105, etc.) para transformar las plantas. El segundo vector plásmido no es necesario para transformar las plantas mediante otros métodos como la microproyección, microinyección, electroporación, polietilenglicol, etc.

Transformación de la planta Los métodos de la invención involucran introducir una construcción de nucleótidos en una planta. Por "introducir" se entiende presentar a la planta la construcción nucleotídica de tal manera que la construcción logra acceder al interior de una célula de la planta. Los métodos de la invención no requieren que se use un método determinado para introducir una construcción de nucleótidos en una planta, solo que la construcción nucleotídica logre acceder al interior de por lo menos una célula de la planta. Los métodos para introducir construcciones de nucleótidos en las plantas son conocidos en la técnica e incluyen, sin limitación, métodos de transformación estable, métodos de transformación pasajera y métodos mediados por virus.

La transformación de las células vegetales se puede llevar a cabo por medio de una de varias técnicas conocidas en la materia. Por "planta" se entiende plantas enteras, órganos de plantas (por ejemplo, hojas, tallos, raíces, etc.), semillas, células vegetales, propágulos, embriones y progenie de ellas. Las células vegetales pueden ser diferenciadas o indiferenciadas (por ejemplo, callos, células de cultivo en suspensión, protoplastos, células de hojas, células de raíces, células de floema, polen). Los términos "plantas transgénicas" o "plantas transformadas" o plantas o células o tejidos "transformados establemente" hacen referencia a plantas que han incorporado o integrado secuencias de ácido nucleico o fragmentos de ADN exógeno en las células vegetales. Por "transformación estable" se entiende que la construcción de nucleótidos introducida en la planta integra el genoma de la planta y puede ser heredada por la progenie de la planta.

En general, los métodos de transformación de plantas involucran la transferencia de ADN heterólogo a las células vegetales objetivo (por ejemplo, embriones inmaduros o maduros, cultivos de suspensión, callos indiferenciados, protoplastos, etc.), seguida de la aplicación de un nivel umbral de selección máximo apropiado (según el gen marcador seleccionable) para recuperar las células vegetales transformadas a partir de una masa de células no transformadas. Habitualmente, los explantes se transfieren a una provisión fresca del mismo medio y se cultivan de la manera habitual. Posteriormente, las células transformadas se diferencian en los brotes después de colocarlas en un medio de regeneración complementado con un nivel de umbral máximo del agente de selección. Los brotes se transfieren a un medio de arraigo selectivo para recuperar las plántulas o los brotes que echaron raíces. Luego, la plántula transgénica crece y se convierte en una planta madura y produce semillas fértiles (por ej. Hiei et al. (1994) The Plant Journal 6:271-282; Ishida eí al. (1996) Nature Biotechnology 14:745-750). En Ayres y Park (1994) Critica! Reviews in Plant Science 13:219-239 y Bommineni y Jauhar (1997) Maydica 42:107-120 se describen de forma general las técnicas y métodos para generar plantas transgénicas. Dado que el material transformado contiene muchas células, en cualquier trozo del callo, tejido o grupo de células tratado habrá células transformadas y células no transformadas. La capacidad para matar las células no transformadas y permitir la reproducción de las células transformadas da como resultado cultivos de plantas transformadas. A menudo, la capacidad para eliminar las células no transformadas es una limitación para la recuperación rápida de las células vegetales transformadas y la generación exitosa de las plantas transgénicas. Se pueden usar métodos moleculares y bioquímicos para confirmar la presencia del gen heterólogo de interés integrado en el genoma de la planta transgénica.

La generación de plantas transgénicas se puede llevar a cabo mediante varios métodos, inclusive, sin limitación, la introducción de ADN heterólogo de Agrobacterium en las células vegetales (transformación mediada por Agrobacterium), el bombardeo de las células vegetales con ADN exógeno heterólogo adherido a partículas, y otros varios métodos mediados por otros elementos (por ejemplo, Hiei et al. (1994) The Plant Journal 6:271-282; Ishida et al. (1996) Nature Biotechnology 14:745-750; Ayres y Park (1994) Critical Reviews in Plant Science 13:219-239; Bommineni y Jauhar (1997) Maydica 42:107-120) para transferir ADN.

Los métodos para transformar cloroplastos se conocen en la materia. Ver por ejemplo, Svab et al. (1990) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87:8526-8530; Svab y Maliga (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:913-917; Svab y Maliga (1993) EMBO J. 12:601-606. El método se basa en la transferencia de ADN que contiene un marcador seleccionare mediante bombardeo de partículas y direccionamiento del ADN al genoma del plástido mediante recombinación homologa. Además, la transformación del plástido se puede lograr mediante la transactivación de un transgén transportado por un plástido silencioso mediante expresión tisular de una ARN-polimerasa dirigida al plástido y codificada en el núcleo. Este sistema se describe en McBride et al. (1994) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91 :7301-7305.

Se puede lograr que las células transformadas proliferen en las plantas siguiendo los métodos convencionales. Ver, por ejemplo, McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5:81-84. Luego, estas plantas se pueden cultivar y polinizar con la misma cepa transformada o con cepas diferentes y el híbrido resultante expresará constitutivamente la característica fenotípica identificada deseada. Se pueden cultivar dos o más generaciones para garantizar que la expresión de la característica fenotípica deseada se mantiene y hereda de forma estable y luego, se cosechan las semillas para garantizar que se ha logrado la expresión de la característica fenotípica deseada. De esta manera, la presente invención proporciona semillas transformadas (denominadas también "semillas transgénicas") que poseen una construcción nucleotídica de la invención, por ejemplo, un cásete de expresión de la invención, incorporada establemente en su genoma.

Plantas La presente invención puede usarse para transformar cualquier especie de planta superior, incluidas sin limitación, monocotiledóneas y dicotiledóneas. En una realización, el CTP comprendido en la presente es activo tanto en monocotiledóneas como en dicotiledóneas. En otra realización, el CTP es activo solo en monocotiledóneas o solo en dicotiledóneas. Los ejemplos de plantas de interés incluyen, sin limitación, maíz, sorgo, trigo, girasol, tomate, cruciferas, pimiento, papa, algodón, arroz, soja, remolacha azucarera, caña de azúcar, tabaco, cebada, colza, Brassica sp., alfalfa, centeno, mijo, cártamo, maní, batata, mandioca, café, coco, piña, citrus, cacao, té, banana, aguacate, higo, guayaba, mango, aceituna, papaya, castaña de cajú, nuez de macadamía, almendra, avena, vegetales, plantas ornamentales y coniferas.

Los vegetales incluyen, sin limitación, tomate, lechuga, judías verdes, judías blancas, arvejas, y miembros del género Curcumis como pepino, cantalupo y melón. Las ornamentales incluyen, sin limitación, azalea, hortensia, hibisco, rosa, tulipán, narciso, petunia, clavel, estrella federal (flor de pascua) y crisantemo. Preferentemente, las plantas de la presente invención son plantas de cultivo (por ejemplo, maíz, sorgo, trigo, girasol, tomate, cruciferas, pimiento, papa, algodón, arroz, soja, remolacha azucarera, caña de azúcar, tabaco, cebada, colza, etc.).

Esta invención es particularmente apropiada para cualquier integrante de la familia de plantas monocotiledóneas, inclusive, sin limitación, maíz, arroz, cebada, avena, trigo, sorgo, centeno, caña de azúcar, piña, ñame, cebolla, banana, coco y dátiles.

Evaluación de la transformación de la planta Después de introducir el ADN exógeno heterólogo en las células vegetales, la transformación o integración del ADN heterólogo en el genoma de la planta se confirma por medio de diferentes métodos como análisis de ácidos nucleicos o proteínas y metabolitos asociados con el ADN integrado.

El análisis RCP es un método rápido para analizar las células, tejidos o brotes transformados para detectar la presencia de ADN incorporado en las primeras etapas antes de transplantar a tierra (Sambrook y Russell, 2001. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Coid Spring Harbor Laboratory Press, Coid Spring Harbor, NY). La RCP se lleva a cabo utilizando cebadores oligonucleotídicos específicos para el gen de interés o vector Agrobacterium, etc.

La transformación de la planta se puede confirmar mediante la técnica de Southern para ADN genómico (Sambrook y Russell, 2001 , supra). En general, se extrae el ADN total de la planta transformada, se digiere con las enzimas de restricción apropiadas, se fracciona en gel de agarosa y se transfiere a una membrana de nitrocelulosa o nailon. La membrana o "mancha" se híbrida luego con una sonda de, por ejemplo, fragmentos de ADN radiomarcados con 32P para confirmar la integración del ADN introducido en el genoma de la planta de acuerdo con técnicas estándares (Sambrook y Russell, 2001 , supra).

En el análisis con el método Northern, el ARN se aisla a partir de tejidos específicos de la planta transformada, se fracciona en gel de agarosa y formaldehído y se transfiere a la membrana de filtro de nailon siguiendo procedimientos estándares de uso habitual en la técnica (Sambrook y Russell, 2001 , supra). La expresión del ARN codificado por un gen heterólogo unido operativamente a la secuencia que codifica el CTP se detecta por hibridación del filtro con una sonda radioactiva derivada del gen heterólogo, siguiendo métodos conocidos en la técnica (Sambrook y Russell, 200 , supra).

Evaluación de la actividad CTP Los ensayos para determinar la eficiencia de las secuencias CTP de la invención para dirigir una proteína de interés al cloroplasto son ensayos conocidos. Ver por ejemplo, Mishkind et al. (1985) J of Cell Biol 100:226-234, que se incorpora a la presente en su totalidad por referencia. Se une operativamente un gen indicador como glucuronidasa (GUS), cloranfenicol acetiltransferasa (CAT) o proteína verde fluorescente (GFP) a la secuencia CTP. Esta fusión se realiza bajo el control de un promotor apropiado, ligado en un vector de transformación y transformado en una planta o célula vegetal. Después de un período de tiempo apropiado para permitir la expresión y localización dentro del cloroplasto, se extrae una fracción del cloroplasto y se analiza para detectar la actividad. La capacidad de las secuencias aisladas para dirigir y entregar la proteína indicadora en el cloroplasto se puede comparar con otras secuencias CTP conocidas. Ver Castro Silva Filho et al. (1996) Plant Mol. Biol. 30: 769-780. La importación de la proteína también se puede verificar in vitro mediante la adición de proteasas a la fracción de cloroplasto aislada. Las proteínas importadas con éxito al cloroplasto son resistentes a las proteasas agregadas externamente mientras que las proteínas que permanecen en el citosol son susceptibles a ser digeridas. La importación de la proteína también se puede verificar mediante la presencia de la proteína funcional en el cloroplasto usando técnicas moleculares de detección estándares o evaluando el fenotipo resultante de la expresión de una proteína dirigida al cloroplasto.

Los siguientes ejemplos se proporcionan a modo de ilustración y no constituyen limitación alguna.

Estudios experimentales EJEMPLO 1 CTP de Chlamvdomonas AHAS Se identificó el CTP de Chlamydomonas AHAS (SEQ ID NO:3) comparando el péptido Chlamydomonas AHAS ("ChIamyAHAS") completo (GENBANK - número de acceso: AF022816; SEQ ID NO:8) con varios péptidos AHAS provenientes de plantas, bacterias, levaduras y hongos. Esta alineación muestra que el CTP de ChIamyAHAS conserva muy poco de las secuencias CTP de la planta, mientras que las proteínas maduras muestran elementos conservados. De esta forma, comparando las múltiples proteínas AHAS con la proteína ChIamyAHAS se dedujo que los aminoácidos 1-99 de la proteína Chlamydomonas AHAS comprendían el CTP. El sitio de procesamiento pronosticado para este CTP después de su importación al cloroplasto de la Chlamydomonas se ubica aproximadamente en el aminoácido 92 de la SEQ ID NO:8.

EJEMPLO 2 CTP de subunidad pequeña (SSU) de Chlamydomonas RuBisCo Se identificó el CTP de Chlamydomonas SSU (SEQ ID NO:5) comparando el péptido Chlamydomonas SSU ("ChlamySSU") completo (GENBANK - número de acceso: CAA28160; SEQ ID NO:9) con varios péptidos de la subunidad pequeña de la RuBisCo de varias plantas. Esta alineación muestra que el CTP de ChlamySSU conserva muy poco de las secuencias CTP de la planta, mientras que las proteínas maduras muestran elementos conservados. De esta forma, comparando los sitios de procesamiento conocidos de las proteínas RuBisCo de varias plantas con la proteína ChlamySSU, se dedujo que los aminoácidos 1-45 de la proteína Chlamydomonas SSU (SEQ ID NO:9) comprendían el CTP.

Se determinó empíricamente que el sitio de escisión del precursor de subunidad pequeña de la Chlamydomonas RuBisCO ("ChlamySSU") está entre los residuos 44 y 45 de la SEQ ID NO:9 (Schmidt et al 1979, Journal of Cell Biology 83:615-662).

EJEMPLO 3 CTP de Chlamydomonas EPSPS Se identificó el CTP de Chlamydomonas EPSPS (SEQ ID NO:7) comparando el péptido Chlamydomonas EPSPS completo (GENBANK -número de acceso: XP_001702942; SEQ ID NO: 10) con varios EPSPS de plantas y bacterias. Esta alineación muestra que el CTP de ChlamyEPSPS conserva muy poco de las secuencias CTP de la planta, mientras que las proteínas maduras muestran elementos conservados. De esta forma, comparando varias proteínas EPSPS con la proteína ChlamyEPSPS se dedujo que los aminoácidos 1 -75 de la proteína Chlamydomonas EPSPS (SEQ ID NO:10) comprendían el CTP. El sitio de procesamiento pronosticado para este CTP después de su importación al cloroplasto de la Chlamydomonas se ubica aproximadamente en el aminoácido 61 de la SEQ ID NO:10.

CUADRO 1 CTP de Chlamydomonas EJEMPLO 4 Construcciones de ADN usando los CTP de Chlamydomonas para dirigir proteínas Un elemento de ADN que utiliza el CTP de Chlamydomonas, incluidos los CTP de Chlamydomonas AHAS, Chlamydomonas SSL) o Chlamydomonas EPSPS, para generar múltiples construcciones para dirigir las proteínas a los cloroplastos puede involucrar la inclusión de sitios de reconocimiento de la endonucleasa de restricción convenientes (por ejemplo, un sitio de restricción Bam Hl) así como pequeños conectores peptídicos entre el CTP del cloroplasto y la proteína (por ejemplo, un CTP tripeptídico Gly-Ser-Gly; SEQ ID NO: 18). Además, esos elementos de ADN pueden diseñarse y sintetizarse de forma tal que la secuencia de ADN es diferente de la secuencia de ADN original pero codifica el mismo péptido idéntico.

De manera alternativa, se pueden diseñar construcciones de ADN de forma tal que no se necesiten sitios de enzimas de restricción, y la fusión CTP/proteína se puede lograr mediante síntesis total de la región codificante combinada o mediante estrategias basadas en RCP, como "SOEing PCR".

También se puede diseñar la fusión CTP/proteína de tal manera que cualquiera de las proteínas quede truncada. Por ejemplo, se puede eliminar uno o más aminoácidos del extremo N de una proteína expresada en una bacteria y aún así lograr una fusión funcional con un CTP de Chlamydomonas.

Se diseñó un cásete que contenía una secuencia de ADN diseñada artificialmente que codifica el CTP de Chlamydomonas AHAS que incorpora un sitio de restricción BamHI y un conector Gly-Ser-Gly. Estas construcciones de ADN contienen (de 5' a 3') (1 ) un sitio de clonación Pst I, (2), las bases ACC para proporcionar un contexto "Kozak" para una traducción eficiente, (3) la porción del gen que codifica la metionina aminoterminal a través del sitio de escisión del péptido de tránsito conocido del ChlamyAHAS, y que incluye una pequeña región ADN que codifica los aminoácidos del extremo C al sitio de escisión, (4) bases de ADN que codifican los residuos Gly - Ser - Gly con un sitio de clonación BamH I incorporado, y (5) la región que codifica el gen de interés.

Se diseñó un cásete que contenía una secuencia de ADN diseñada artificialmente que codifica el CTP de Chlamydomonas SSU que incorpora un sitio de restricción BamHI y un conector Gly-Ser-Gly. Estas construcciones de ADN contienen (de 5' a 3') (1) un sitio de clonación Pst I, (2), las bases ACC para proporcionar un contexto "Kozak" para una traducción eficiente, (3) la porción del gen que codifica la metionina aminoterminal a través del sitio de escisión del péptido de tránsito conocido de la ChlamySSU, y que incluye una pequeña región ADN que codifica los aminoácidos del extremo C al sitio de escisión, (4) bases de ADN que codifican los residuos Gly - Ser - Gly con un sitio de clonación BamH I incorporado, y (5) la región que codifica el gen de interés.

Se diseñó un cásete que contenía una secuencia de ADN diseñada artificialmente y que codificaba el CTP de Chlamydomonas EPSPS que incorpora un sitio de restricción BamHI y un conector Gly-Ser-Gly. Estas construcciones de ADN contienen (de 5' a 3') (1) un sitio de clonación Pst I, (2), las bases ACC para proporcionar un contexto "Kozak" para una traducción eficiente, (3) la porción del gen que codifica la metionina aminoterminal a través del sitio de escisión del péptido de tránsito conocido del ChIamyEPSPS, y que incluye una pequeña región ADN que codifica los aminoácidos del extremo C al sitio de escisión, (4) bases de ADN que codifican los residuos Gly - Ser - Gly con un sitio de clonación BamH I incorporado, y (5) la región que codifica el gen de interés.

EJEMPLO 5 Fusión de un péptido de tránsito de una especie que no es una planta con una proteína heteróloga, y localización correcta y escisión en monocotiledóneas: funcionamiento del CTP de Chlamvdomonas AHAS en monocotiledóneas o Se diseñaron construcciones de ADN de forma tal que la proteína resultante codifica el péptido de tránsito Chlamydomonas AHAS ("ChlamyAHAS") en el extremo N, seguido de la fusión de la proteína a un gen que confiere resistencia a los herbicidas en células (GRG-1 ; patente estadounidense n.° 7,405,347). Para el precursor ChlamyAHAS, se dedujeron los sitios de escisión del péptido de tránsito a partir de alineamientos de las secuencias de la proteína con proteínas ALS de bacterias, hongos y levaduras.

Estas construcciones de ADN contienen (de 5' a 3') (1) un sitio de clonación Pst I, (2), las bases ACC para proporcionar un contexto "Kozak" para una traducción eficiente, (3) la porción del gen que codifica la metionina aminoterminal a través del sitio de escisión del péptido de tránsito conocido del ChlamyAHAS CTP, y que incluye una pequeña región ADN que codifica los aminoácidos del extremo C al sitio de escisión, (4) bases de ADN que codifican los residuos Gly - Ser - Gly con un sitio de clonación BamH I incorporado, y (5) la región que codifica el gen de interés (en este caso, GRG- 1)· Estas moléculas de ADN se obtuvieron artificialmente (DNA 2.0 de Menlo Park, CA). La secuencia de ADN de la región que contiene esta construcción se proporciona como la SEQ ID NO:1 1 y la secuencia de aminoácidos resultante se proporciona como la SEQ ID NO: 12.

Se fabricó una construcción de referencia (pAG250) que contenía GRG-1 expresado a partir del promotor TrpPro5, en donde la proteína GRG-1 no posee un CTP de cloroplasto.

Esta construcción CTPfaltante/GRG-1 se insertó en un vector para usar en la transformación mediada por Agrobacterium de embriones de maíz y se generaron plantas de maíz transgénicas que contenían esta construcción. Las plantas T0 transformadas se analizaron mediante RCP para confirmar la presencia de la construcción en las líneas del maíz y luego, estas plantas T0 se cruzaron con una línea no transgénica para generar una progenie Ti hemicigótica. Las plantas transgénicas Ti resultantes producen grandes cantidades de proteína GRG-1. Sin embargo, las plantas transformadas con pAG250 y que expresan el GRG-1 no localizado no son resistentes al glifosfato.

La construcción CTP ChlamyAHAS/GRG-1 de alga se insertó en un vector para usar en la transformación mediada por Agrobacterium de embriones de maíz y se generaron plantas de maíz transgénicas que contenían esta construcción.

Las plantas To transformadas se analizaron mediante RCP para confirmar la presencia de la construcción en las líneas del maíz y luego, estas plantas To se cruzaron con una línea no transgénica para generar una progenie Ti hemicigótica. Las plantas transgénicas Ti resultantes son resistentes a las pulverizaciones con glifosfato (en comparación con las plantas no transgénicas de referencia).

Los análisis de inmunotransferencia realizados al tejido folial de las plantas de maíz transgénico muestran que estas plantas expresan la proteína GRG-1. Es más, el tamaño de la proteína identificada por inmunotransferencia es coherente con la importación de la proteína al cloroplasto y el procesamiento de la proteína ChlamyAHAS/GRG-1 en el sitio de escisión o cerca de él.

De esta forma, el CTP de ChlamyAHAS es suficiente para dirigir la GRG-1 al cloroplasto del maíz, y da como resultado un fenotipo (resistencia a herbicida) no conferido por la GRG-1 en ausencia de la importación al cloroplasto.

EJEMPLO 6 Fusión de un péptido de tránsito de una especie que no es una planta con una proteína heteróloqa, y localización correcta y escisión en monocotiledóneas: funcionamiento del CTP de Chlamydomonas SSU en monocotiledóneas Para analizar si un CTP de cloroplasto de alga es funcional en las monocotiledóneas, se generaron plantas monocotiledóneas transgénicas y se evaluó la expresión y escisión de un CTP de alga mediante un análisis de inmunotransferencia.

Las construcciones de ADN se diseñaron de forma tal que la proteína resultante codifica el péptido de tránsito del alga en el extremo N, fusionado a una proteina que confiere resistencia a herbicidas en células (en este caso, la proteína GRG-8; publicación de patente estadounidense n.° 20060150270).

Estas construcciones de ADN contienen (de 5' a 3') (1) un sitio de clonación Pst I, (2), las bases ACC para proporcionar un contexto "Kozak" para una traducción eficiente, (3) la porción del gen que codifica la metionina aminoterminal a través del sitio de escisión del péptido de tránsito conocido del ChlamySSU, y que incluye una pequeña región ADN que codifica los aminoácidos del extremo C al sitio de escisión, (4) bases de ADN que codifican los residuos Gly - Ser - Gly con un sitio de clonación BamH I incorporado, y (5) la región que codifica el gen de interés (en este caso, GRG-8).

La secuencia de ADN de la región que contiene esta construcción se proporciona como la SEQ ID NO:13 y la secuencia de aminoácidos resultante se proporciona como la SEQ ID NO: 14.

Esta construcción CTP/GRG-8 (pAG1675) se insertó en un vector para usar en la transformación mediada por Agrobacterium de embriones de maíz y se generaron e identificaron plantas de maíz transgénicas.

Las plantas To transformadas con pAG1675 se analizaron mediante RCP para confirmar la presencia de la construcción en las líneas del maíz y luego, estas plantas To se cruzaron con una línea no transgénica para generar una progenie T-i hemicigótica. Las plantas transgénicas Ti resultantes mostraron resistencia a las pulverizaciones con glifosfato, en comparación con las plantas no transgénicas de referencia.

EJEMPLO 7 Expresión y procesamiento de la proteína GRG-8 fusionada a CTP de cloroplasto de Chlamydomonas SSU en células de maíz Los análisis de inmunotransferencia realizados al tejido folial de las plantas de maíz transgénico muestran que estas plantas expresan la proteína CTP/GRG-8. Se extrajo la proteína folial total de las hojas del maíz (tampón de extracción de proteína Pierce P-PER) y se separó sobre gel Bis-Tris 4-12%. La proteína GRG-8 se visualizó usando anticuerpos policlonales caprinos contra la GRG8. Se comparó un extracto de maíz no transgénico, lado a lado (senda 3). Para evaluar el procesamiento del CTP, se purificó una proteína GRG-8 marcada con HIS estándar, a partir una cepa de E. coli. El tamaño de la proteína identificada por inmunotransferencia es coherente con la importación de la proteína al cloroplasto y el procesamiento de la proteína CTP/GRG-8 dentro del ChIamySSU CTP en el sitio de escisión pronosticado o cerca de él.

EJEMPLO 8 Evaluación de la tolerancia al glifosfato de una planta de maíz que expresa la proteína Chlamydomonas SSU-GRG8 La tolerancia a la pulverización con glifosfato de una planta de maíz transgénico que expresa la proteína Chlamydomonas SSU-GRG8 se comparó con varias plantas T0 no transgénicas de referencia. Las plantas individuales se transfirieron al invernadero y se les dejó crecer durante 10 días. Después de 10 días, se aplicó glifosfato en una concentración semejante a una velocidad de pulverización en el campo de 1x (7 mM complementado con Tween 20 0.1% como surfactante). El glifosfato se aplicó usando una tabla de pulverización para aplicar el herbicida de forma consistente en todas las plantas. Después de 3 semanas, se evaluaron las plantas para determinar si las plantas habían tolerado la pulverización con glifosfato (hojas mayormente verdes: <50% de daño) o si no habían tolerado la pulverización con glifosfato (>75% de daño o planta muerta). Las plantas transgénicas mostraron tolerancia al glifosfato mientras que cada una de las plantas de referencia no lo toleraron.

EJEMPLO 9 Fusión de un péptido de tránsito de una especie que no es una planta con una proteína heteróloga, y localización correcta y escisión en monocotiledóneas: funciones de Chlamydomonas EPSPS CTP en monocotiledóneas Se obtuvieron las secuencias de ADN y aminoácidos del precursor Chlamydomonas EPSPS de una base de datos pública. El sitio de escisión del péptido de tránsito se pronosticó basándose en el alineamiento de las secuencias de proteínas con las proteínas EPSPS de bacterias, hongos y levaduras. Se construyó un gen artificial que codificaba el CTP de la metionina aminoterminal mediante el sitio de escisión pronosticado. Este ADN se ligó para crear una fusión en el marco con el codón de inicio de un gen GRG-23(ace3)(R173K) artificial (publicación de patente estadounidense n.° 20080127372). Este cásete CTP-GRG-23(ace3)(R173K) se ligó posteriormente en un vector de transformación vegetal.

Se diseñaron construcciones de ADN de forma tal que la proteína resultante codifica el péptido de tránsito Chlamydomonas EPSPS ("ChlamyEPSPS") en el extremo N, seguido de la fusión a una proteína que confiere resistencia a los herbicidas en células (GRG-23(ace3)(R173K)).

Estas moléculas de ADN se obtuvieron artificialmente (DNA 2.0 de Menlo Park, CA). La secuencia de ADN de la región que contiene esta construcción se proporciona como la SEQ ID NO:15 y la secuencia de aminoácidos resultante se proporciona como la SEQ ID NO: 16.

Estas construcciones de ADN contienen (de 5' a 3') (1 ) un sitio de clonación Pst I, (2), las bases ACC para proporcionar un contexto "Kozak" para una traducción eficiente, (3) la porción del gen que codifica la metionina aminoterminal a través del sitio de escisión del péptido de tránsito conocido del ChIamyEPSPS, y que incluye una pequeña región ADN que codifica los aminoácidos del extremo C al sitio de escisión, (4) la región que codifica el gen de interés (en este caso, GRG-23(ace3)(R173K)).

Esta construcción Chlamydomonas EPSPS CTP/ GRG-23(ace3)(R173K) se insertó en un vector para usar en la transformación mediada por Agrobacteríum de embriones de maíz y se identificaron plantas transgénicas.

Las plantas T0 transformadas se analizaron mediante RCP para confirmar la presencia de la construcción en las líneas del maíz y luego, estas plantas T0 se cruzaron con una línea no transgénica para generar una progenie Ti hemicigótica. Las plantas transgénicas Ti resultantes son resistentes a las pulverizaciones con glifosfato (en comparación con las plantas no transgénicas de referencia). Los análisis de inmunotransferencia realizados al tejido folial de las plantas de maíz transgénico muestran que estas plantas expresan la proteína Chlamydomonas EPSPS CTP/GRG-23(ace3)(R173K) . La proteína detectada en los tejidos de la planta es más pequeña que la proteína Chlamydomonas EPSPS - GRG-23(ace3)(R173K) completa, y es similar en tamaño a la proteína GRG-23(ace3)(R173K) natural (Figura 2). La capacidad de la proteína Chlamydomonas EPSPS CTP/GRG-23(ace3)(R173K) para conferir resistencia a herbicidas y el tamaño de la proteína GRG-23(ace3)(R173K) madura resultante en las plantas resistentes a herbicidas son coherentes con la importación de la proteína al cloroplasto y con el procesamiento de la proteína Chlamydomonas EPSPS CTP/GRG-23(ace3)(R173K) en el sitio de escisión o cerca de él.

EJEMPLO 10 Análisis del peso molecular de la proteína Chlamydomonas EPSPS - GRG-23(ace3)(R173K) expresada en el maíz A partir de una prueba de ¡nmunotransferencia en líneas de maíz transgénicas que expresan la proteína Chlamydomonas EPSPS - GRG-23(ace3)(R173K), se gráfico la distancia recorrida de los patrones de peso molecular de proteínas moleculares para generar una curva lineal de Log peso molecular respecto de distancia recorrida (figura 3). La ecuación de regresión lineal de esta curva se usó para calcular el peso molecular aparente de la proteína GRG23(ace3)(R173K) (figura 2, senda 8) patrón y de la proteína Chlamydomonas EPSPS - GRG-23(ace3)(R173K) procesada detectada en el extracto vegetal. Por este método, se determinó que el peso molecular aparente de la proteína GRG23(ace3)(R173K) purificada era 45.347 g/mol, y que el peso molecular aparente de la proteína Chlamydomonas EPSPS -GRG-23(ace3)(R173K) procesada (senda 6, distancia recorrida = 48.5 mm) era 46,227 g/mol. Los pesos moleculares estimados de las proteínas procesadas son coherentes con el procesamiento de los numerosos aminoácidos del CTP de Chlamydomonas en dirección 5' respecto de su unión con la GRG-23(ace3)(R173K) (el peso molecular de la GRG23(ace3)(R173K) se estimó en 45,570 g/mol). No se detectó ninguna proteína que tuviera un tamaño consistente con el de la proteína Chlamydomonas EPSPS - GRG-23(ace3)(R173K) (peso molecular = 52.012 g/mol) mediante el análisis de ¡nmunotransferencia. De esta forma, el CTP de Chlamydomonas EPSPS se procesa en el maíz en un sitio de reconocimiento discreto dentro del CTP de Chlamydomonas. La purificación y el análisis del aminoácido aminoterminal de esta proteína por métodos conocidos en la materia permitirían una determinación inequívoca del sitio de escisión exacto dentro del CTP de Chlamydomonas.

EJEMPL0 11 Evaluación de secuencias CTP de algas en dicotiledóneas Para evaluar la capacidad de los CTP de cloroplastos de algas para funcionar en células de dicotiledóneas, se colocó el CTP de cloroplasto de Chlamydomonas AHAS (SEQ ID NO:3) en el marco 5' del gen TagGFP (Evrogen, Moscú, Rusia). Un vector de referencia contenía el gen TagGFP sin un péptido de tránsito al cloroplasto. La construcción ChlamyAHAS CTP (pAX3517) y la construcción de referencia (pAX3521 ) se organizaron para iniciar la transcripción a partir del promotor Arabidopsis UBQ3 (Norris et. al, 1993, Plant Molecular Biology 21 :895-906). Las construcciones utilizaron los terminadores de transcripción 35S o Pinll.

Se usaron aproximadamente 12 microgramos de cada plásmido purificado en experimentos de transformación de protoplasto de tabaco mediada por polietilenglicol. Después de la transformación, los protoplastos se incubaron en una cámara de crecimiento a 25°C durante 23 horas. La expresión y localización de la proteína TagGFP después de la expresión transitoria se controló en un microscopio fluorescente invertido.

La construcción que expresa la TagGFP sin un CTP de cloroplasto se detectó solo en el citoplasma de los protoplastos. Sin embargo, la construcción Chlamydomonas AHAS CTP entregó correctamente la TagGFP en el cloroplasto lo que dio como resultado una acumulación de fluorescencia en el cloroplastos de esos protoplastos (Figura 1).

EJEMPLO 12 Evaluación de una secuencia CTP de alga en células de soja Para evaluar la capacidad de los CTP de cloroplasto de alga para funcionar en células de soja, se usaron la construcción ChlamyAHAS CTP (pAX3517), la construcción ChlamyEPSPS (pAX4562) y una construcción de referencia (pAX3521) que contenía el gen TagGFP sin un péptido de tránsito al cloroplasto, en una transformación de protoplastos de soja mediada por polietilenglicol. La expresión y localización de la proteína TagGFP después de la expresión transitoria se controló en un microscopio fluorescente invertido.

Para la construcción de referencia que no tenía un CTP de cloroplasto, la fluorescencia de la TagGFP se observó solo en el citoplasma. De manera similar, no se observó ninguna expresión en los cloroplastos de dos construcciones independientes que expresaban la TagGFP con el CTP de cloroplasto de ChlamyEPSPS. Sin embargo, se detectó TagGFP en el cloroplasto de los protoplastos que habían sido transformados con la construcción de CTP de cloroplasto de ChlamyAHAS. De esta forma, este CTP funciona en las células de la soja y del tabaco.

CUADRO 2 Localización de proteínas unidas a CTP de cloroplasto de alga en células de dicotiledóneas CUADRO 3 Resumen de la función de los CTP de Chlamvdomonas en células vegetales Todas las publicaciones y solicitudes de patentes mencionadas en esta memoria descriptiva son indicativas del nivel de especialización del entendido en la materia al cual se relaciona esta invención. Todas las publicaciones y solicitudes de patentes quedan incorporadas a la presente a modo de referencia en la misma medida en que si indicara específicamente la incorporación por referencia de cada publicación o solicitud de patente individual.

Aunque se describió la invención anterior con cierto grado de detalle mediante ejemplos e ilustraciones a efectos de mejorar su comprensión, resultará obvio que se podrán realizar ciertos cambios y modificaciones dentro del alcance de las reivindicaciones anexadas.

Claims (18)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Una célula vegetal que posee incorporado de forma estable en su genoma un cásete de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido de tránsito al cloroplasto (CTP), en donde dicha secuencia de nucleótidos que codifica dicho CTP está unida operativamente a una secuencia de nucleótidos de interés y en donde dicha secuencia de nucleótidos que codifica dicho CTP se selecciona entre el grupo formado por: a) la secuencia de nucleótidos establecida en las SEQ ID NO:1, 2 ó 4; b) una secuencia de nucleótidos que tiene por lo menos un 90% de identidad de secuencia con las SEQ ID NO:1 , 2 ó 4, en donde dicha secuencia de nucleótidos codifica un péptido de tránsito al cloroplasto; c) una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos establecida en las SEQ ID NO:3 ó 5; y d) una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 90% de identidad de secuencia con las SEQ ID NO:3 ó 5, en donde dicha secuencia de aminoácidos es un péptido de tránsito al cloroplasto.

2.- La célula vegetal de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque dicha célula vegetal pertenece a una monocotiledónea.

3. - La célula vegetal de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque dicha célula vegetal pertenece a una dicotiledónea.

4. - Una planta que comprende la célula vegetal de la reivindicación .

5. - La planta de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada además porque dicha planta es monocotiledónea.

6. - La planta de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada además porque dicha planta es dicotiledónea.

7.- Una semilla derivada de una planta de la reivindicación 4, en donde dicha semilla comprende la secuencia de nucleótidos que codifica dicho péptido de tránsito al cloroplasto.

8. - La célula vegetal de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque la secuencia de nucleótidos de interés codifica un producto génico que confiere resistencia a herbicidas, patógenos o insectos.

9. - Una célula vegetal de una monocotiledónea que posee incorporado de forma estable en su genoma un cásete de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido de tránsito al cloroplasto (CTP), en donde dicha secuencia de nucleótidos que codifica dicho CTP está unida operativamente a una secuencia de nucleótidos de interés y en donde dicha secuencia de nucleótidos que codifica dicho CTP se selecciona entre el grupo formado por: a) la secuencia de nucleótidos establecida en la SEQ ID N0:6; b) una secuencia de nucleótidos que tiene por lo menos un 90% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:6, en donde dicha secuencia de nucleótidos codifica un péptido de tránsito al cloroplasto; c) una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO:7¡ y d) una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 90% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:7, en donde dicha secuencia de aminoácidos es un péptido de tránsito al cloroplasto.

10. - Una planta que comprende la célula vegetal de la reivindicación 9.

11. - Una semilla derivada de una planta de la reivindicación 10, en donde dicha semilla comprende la secuencia de nucleótidos que codifica dicho péptido de tránsito al cloroplasto.

12. - La célula vegetal de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada además porque la secuencia de nucleótidos de interés codifica un producto génico que confiere resistencia a herbicidas, patógenos o insectos.

13. - Un método para expresar una secuencia de nucleótidos de interés en una planta, que comprende: a) introducir en una célula vegetal un cásete de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido de tránsito al cloroplasto (CTP), donde dicha secuencia de nucleótidos que codifica dicho CTP está unida operativamente a dicha secuencia de nucleótidos de interés y en donde dicha secuencia de nucleótidos que codifica dicho CTP se selecciona entre el grupo formado por: i) la secuencia de nucleótidos establecida en las SEQ ID NO:1 , 2 ó 4; ii) una secuencia de nucleótidos que tiene por lo menos un 90% de identidad de secuencia con las SEQ ID NO:1 , 2 ó 4, donde dicha secuencia de nucleótidos codifica un péptido de tránsito al cloroplasto; iii) una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos establecida en las SEQ ID NO:3 ó 5; y iv) una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 90% de identidad de secuencia con las SEQ ID NO:3 ó 5, en donde dicha secuencia de aminoácidos es un péptido de tránsito al cloroplasto; y b) regenerar una planta transformada a partir de dicha célula vegetal; donde esa planta posee incorporado establemente en su genoma dicho cásete de expresión.

14.- El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado además porque dicha planta es dicotiledónea.

15.- El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado además porque dicha planta es monocotiledónea.

16.- El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado además porque la secuencia de nucleótidos de interés codifica un producto génico que confiere resistencia a herbicidas o plagas.

17.- Un método para expresar una secuencia de nucleótidos de interés en una planta monocotiledónea, que comprende: a) introducir en una célula vegetal un cásete de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido de tránsito al cloroplasto (CTP), en donde dicha secuencia de nucleotidos que codifica dicho CTP está unida operativamente a dicha secuencia de nucleotidos de interés y en donde dicha secuencia de nucleotidos que codifica dicho CTP se selecciona entre el grupo formado por: i) la secuencia de nucleotidos establecida en la SEQ ID NO:6; ii) una secuencia de nucleotidos que tiene por lo menos un 90% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:6, en donde dicha secuencia de nucleotidos codifica un péptido de tránsito al cloroplasto; iii) una secuencia de nucleotidos que codifica la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO:7; y iv) una secuencia de nucleotidos que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 90% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:7, en donde dicha secuencia de aminoácidos es un péptido de tránsito al cloroplasto; y b) regenerar una planta transformada a partir de dicha célula vegetal; donde esa planta posee incorporado establemente en su genoma dicho cásete de expresión.

18 - El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado además porque la secuencia de nucleotidos de interés codifica un producto génico que confiere resistencia a herbicidas o pestes.