CN102144034B - 用于在植物中表达异源核苷酸序列的组合物和方法 - Google Patents

用于在植物中表达异源核苷酸序列的组合物和方法 Download PDF

Info

Publication number
CN102144034B
CN102144034B CN200980134479.5A CN200980134479A CN102144034B CN 102144034 B CN102144034 B CN 102144034B CN 200980134479 A CN200980134479 A CN 200980134479A CN 102144034 B CN102144034 B CN 102144034B
Authority
CN
China
Prior art keywords
ctp
plant
sequence
nucleotide sequence
dna
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CN200980134479.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN102144034A (zh
Inventor
P·E·汉默
V·贝林松
T·K·辛森
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
BASF SE
BASF Agricultural Solutions Seed US LLC
Original Assignee
Athenix Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Athenix Corp filed Critical Athenix Corp
Publication of CN102144034A publication Critical patent/CN102144034A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN102144034B publication Critical patent/CN102144034B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8214—Plastid transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8274—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for herbicide resistance

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明提供了用于将多肽靶向到高等植物的叶绿体的组合物以及方法。组合物包含表达盒，所述表达盒具有可操作地连接到感兴趣的核苷酸序列上的对叶绿体靶向肽(CTP)进行编码的核苷酸序列，其中该CTP是从衣藻(Chlamydomonas sp.)衍生的。还包括具有所述CTP序列的植物转化载体、植物和植物细胞，以及所述CTP序列的变体和片段。还提供了使用在此披露的CTP序列用于在植物中表达异源核苷酸序列的方法。

Description

用于在植物中表达异源核苷酸序列的组合物和方法
技术领域
本发明涉及植物分子生物学领域，更具体地涉及在植物中鉴定和使用调节元件。
发明背景
植物中叶绿体的生物发生取决于位于叶绿体与细胞核中的两个独立的遗传系统的协调的活动(参见Cline和Henry(1996)，Annu.Rev.CellDev.Biol.12，1-26)。大量的组分叶绿体蛋白是由核基因编码的并且是细胞质合成的-作为包含称为转运肽的N-端延伸的前体形式。转运肽在特异性识别叶绿体表面并且介导前蛋白质翻译后转运跨过叶绿体被膜并且因此进入叶绿体内的各种不同亚区室(例如，基质、类囊体以及类囊体膜)的方面起作用。
所报告的在其N端具有自然编码的转运肽序列的基因包括核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶(RuBisCo)的叶绿体小亚基(de Castro Silva Filho等人(1996)Plant Mol.Biol.30：769-780；Schnell，D.J.等人(1991)J.Biol.Chem.266(5)：3335-3342)；5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)(Archer等人(1990)J.Bioenerg.and Biomemb.22(6)：789-810)；色氨酸合酶(Zhao，J.等人(1995)J.Biol.Chem.270(11)：6081-6087)；质体蓝素(Lawrence等人(1997)J.Biol.Chem.272(33)：20357-20363)；分支酸合酶(Schmidt等人(1993)J.Biol.Chem.268(36)：27477-27457)；以及捕光叶绿素a/b结合蛋白(LHBP)(Lamppa等人(1988)J.Biol.Chem.263：14996-14999)，虽然并不是所有这些序列在高等植物中在叶绿体靶向蛋白的异源表达中是有用的。
发明概述
在此提供了用于植物中多肽的叶绿体靶向的组合物和方法。组合物包含表达盒，所述表达盒包含可操作地连接到感兴趣的核苷酸序列上的对从藻类生物衍生的叶绿体靶向肽(或叶绿体转运肽，“CTP”)序列进行编码的核苷酸序列。这些表达构建体对于单子叶植物或双子叶植物中感兴趣的核苷酸序列的表达以及正确的靶向是有用的。本发明进一步提供了包含表达盒的载体、以及具有已稳定地掺入或瞬时表达在其基因组中的上述表达盒的植物和植物细胞。另外，组合物包括此类植物的转基因种子。
还提供了用于在植物或植物细胞中表达核苷酸序列的方法，以及鉴定用于植物的藻类CTP序列的方法。
附图说明
图1表示TagGFP在烟草原生质体中的表达。
图2表示在玉米细胞中衣藻(Chlamydomonas)EPSPS叶绿体转运肽的表达以及加工。泳道1：非转基因玉米系Hi-II；泳道2-6：用衣藻EPSPSCTP/GRG23(ace3)(R173K)构建体转化的各个To转植项；泳道7：蛋白分子量标准标记物；泳道8：纯化的GRG23(ace3)(R173K)蛋白(4ng)。
图3表示玉米中表达的经加工的衣藻EPSPS-GRG-23(ace3)(R173K)蛋白的分子量的计算。使用对数分子量对来自图2的蛋白分子量标准品的迁移距离的图的线性回归来计算GRG23(ace3)(R173K)蛋白标准品以及植物提取物中检测到的经加工的衣藻EPSPS-GRG-23(ace3)(R173K)的表观分子量。
详细说明
在生产转基因植物中，将外源蛋白导向至特定的亚细胞位置(例如，叶绿体、液泡、线粒体或ER)通常是有用的。以前的工作人员已经将来自不同植物基因的编码转运肽的DNA序列融合到感兴趣的基因上。当翻译该基因时，得到的蛋白质具有融合到感兴趣的蛋白质的氨基末端上的植物转运肽，并且因此以不同的效率将该蛋白质导向至所希望的亚细胞的区室。
因此，本发明是针对用于在高等植物或植物细胞中多肽的叶绿体靶向的组合物以及方法。本发明的组合物包含表达盒，所述表达盒包含可操作地连接至感兴趣的核苷酸序列上的对从藻类生物衍生的叶绿体转运肽(CTP)进行编码的核苷酸序列。在一个实施方案中，该CTP是从衣藻衍生的。在另一个实施方案中，该CTP包含SEQ ID NO：3、5或7中所列出的氨基酸序列或由SEQ ID NO：1、2、4或6所编码的氨基酸序列，及其变体、片段以及衍生物。此外，提供了转化的植物、植物细胞和种子。
当在DNA构建体中进行组装从而将编码CTP的序列可操作地连接到感兴趣的核苷酸序列上时，本发明的编码CTP的序列有助于将感兴趣的肽共翻译地或翻译后地转运到用该DNA构建体稳定转化的植物细胞的叶绿体中。在植物中用于表达核苷酸序列的方法包括将表达盒引入植物细胞中(该表达盒包含可操作地连接到感兴趣的核苷酸序列上的本发明的编码CTP的核苷酸序列)并且从该植物细胞再生转化的植物。
在这里使用冠词“一个”以及“一种”是指一个或一个以上(即至少一个)的该冠词的语法对象。例如，“一个元件”是指一个或多个元件。
如在此使用的，术语“核酸分子”旨在包括DNA分子(例如，cDNA或基因组DNA)以及RNA分子(例如，mRNA)以及使用核苷酸类似物生成的DNA或RNA类似物。所述核酸分子可以是单链的或双链的，但优选地是双链的DNA。
叶绿体转运肽
叶绿体是在进行光合作用的植物细胞以及真核藻类中发现的细胞器。叶绿体是由三个膜组成的复杂的细胞器，即内被膜、外被膜、以及类囊体膜。这些膜一起封闭了三个水性区室称为中间部、基质、以及类囊体腔。虽然叶绿体包含其自己的环形基因组，许多组分叶绿体蛋白是由核基因编码的并且是细胞质合成的，作为包含称为叶绿体转运肽(CTP)的N-端延伸的前体形式。该CTP在特异性识别叶绿体表面并且介导前蛋白质翻译后转运跨过叶绿体被膜并且进入叶绿体内的多种不同亚区室中(例如，基质、类囊体以及类囊体膜)的方面起作用。
已经在叶绿体转运肽中鉴定出了至少两个独特的功能域：基质靶向结构域(stromal targeting domain；STD)以及内腔靶向结构域(lumentargeting domain；LTD)。STD控制进入普通的导入途径并且对于将过客蛋白(passenger protein)导入到基质中不但是必要的而且是充分的。基质蛋白前体具有转运肽，这些转运肽仅包含STD，然而类囊体内腔蛋白前体具有STD和LTD两者。
STD长度范围从约30个残基至120个残基，并且富含羟基化的残基并且缺少酸性残基。它们倾向于共享几种组成性基序：缺少Gly、Pro以及带电荷的残基的10至15个残基的氨基末端；富含Ser、Thr、Lys以及Arg的可变的中间区；以及具有用于蛋白酶解加工的宽松地保守的序列(Ile/Val-X-Ala/Cys-Ala；SEQ ID NO：17)的邻近羧基的区域。然而，既不存在广泛的序列保守的嵌段，也没有任何保守的二级结构基序。理论分析表明STD主要地采用了无规卷曲的构象。
所报告的在其N端具有自然编码的转运肽序列的基因包括核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶的叶绿体小亚基(RuBisCo)(de Castro Silva Filho等人(1996)Plant Mol.Biol.30：769-780；Schnell，D.J.等人(1991)J.Biol.Chem.266(5)：3335-3342)；5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)(Archer等人(1990)J.Bioenerg.and Biomemb.22(6)：789-810)；色氨酸合酶(Zhao，J.等人(1995)J.Biol.Chem.270(11)：6081-6087)；质体蓝素(Lawrence等人(1997)J.Biol.Chem.272(33)：20357-20363)；分支酸合酶(Schmidt等人(1993)J.Biol.Chem.268(36)：27477-27457)；以及捕光叶绿素a/b结合蛋白(LHBP)(Lamppa等人(1988)J.Biol.Chem.263：14996-14999)。虽然已经描述了一些CTP，仅有几个已经被成功地用于试图在高等植物中将嵌合分子靶向到叶绿体中。
本发明披露了从藻类物种特别是衣藻衍生的CTP在高等植物中的用途。为了本发明的目的，“高等植物”被认为是有胚植物(Embryophytae)亚界的成员。在一个实施方案中，在此处披露的方法以及组合物中有用的CTP是从衣藻中衍生的。在另一实施方案中，该CTP被列于SEQ ID NO：3、5或7中或由SEQ ID NO：1、2、4或6所编码，包括及其变体、片段以及衍生物。然而，本领域普通技术人员应当了解如何鉴别除了在此披露的那些肽之外的叶绿体转运肽。例如，许多CTP(或包含CTP的蛋白序列)被列于中。
在此披露的CTP对于将多肽靶向到植物细胞的叶绿体中是有用的。在一个实施方案中，与从例如高等植物生物中衍生的CTP相比，在此披露的CTP提供了改进的转运。当与参照CTP相比较时，在此披露的CTP可以导致多肽转运到叶绿体中至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约100％或更多或至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍或更多的提高。能够以得以转移进入叶绿体中的多肽的量，得以转移进入叶绿体中的活性多肽的量或这两者的方式测量提高值。也能够以用感兴趣的叶绿体靶向的蛋白转化的生物的表型方面的提高量的方式测量提高。例如，当使用本发明的CTP来将除草剂抗性蛋白靶向到植物的叶绿体中时，能够以除草剂抗性方面提高的方式测量活性的提高。
表达盒
可以将本发明的编码CTP的序列提供于表达盒中，该表达盒允许它来驱动由感兴趣的核苷酸序列所编码的多肽表达并定位于植物细胞的叶绿体中。“表达盒”是指DNA构建体，该DNA构建体能够导致蛋白在细胞中从可读框进行表达。该盒在转录的5′-3′方向包括转录起始区，所述转录起始区优选地包含适合用于在感兴趣的植物细胞中表达的启动子，其可操作地连接到本发明的编码CTP的序列上，它被进一步可操作地连接到感兴趣的核苷酸序列上；以及在植物中有功能的翻译和转录终止区(即，终止区)。可以通过如在此其他地方所讨论的对一个或多个“接头”氨基酸进行编码的核苷酸序列将编码CTP的核苷酸序列与感兴趣的核苷酸序列彼此分离。
该盒可以另外包含至少一个另外的有待共转化入生物体内的基因，例如选择性标记基因。作为替代方案，可以将一个或多个另外的基因提供于多个表达盒上。将多个限制性位点提供于这类表达盒以用于将感兴趣的核苷酸序列插入在这些调节区的转录调节之下。
该表达盒可以进一步包含一个或多个3′和/或5′非翻译区。“3′非翻译区”是指位于编码序列的下游的核苷酸序列。聚腺苷酸化信号序列以及对能够影响聚腺苷酸束加入到该mRNA前体的3′端上的调节信号进行编码的其他序列是3′非翻译区。“5′非翻译区”是指位于编码序列的上游的核苷酸序列。其它上游或下游的非翻译元件包括增强子。增强子是发挥作用以增加启动子区域的表达的核苷酸序列。增强子在本领域中是熟知的并且包括但不限于SV40增强子区以及35S增强子元件。
终止区可以是与本发明的编码CTP的核苷酸序列固有的，可以是与感兴趣的核苷酸序列固有的，或可以是从另一种来源衍生的。方便的终止区可以从根癌农杆菌(A.tumefaciens)的Ti质粒得到，例如章鱼碱合酶终止区和胭脂氨酸合酶终止区。也参见Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet.262：141-144；Proudfoot(1991)Cell 64：671-674；Sanfacon等人(1991)Genes Dev.5：141-149；Mogen等人(1990)Plant Cell 2：1261-1272；Munroe等人(1990)Gene 91：15l-158；Ballas等人(1989)Nucleic Acids Res.17：7891-7903；以及Joshi等人(1987)Nucleic Acid Res.15：9627-9639。
在此描述的表达盒可以进一步包含除了CTP以及本领域已知的另外的CTP以外的一个或多个调节元件。“调节元件”或“调节区”是指在基因的上游或下游处所发现的核酸的一部分，它可以包含DNA或RNA，或DNA和RNA两者以及在基因表达中所涉及的物质。调节元件可以能够介导器官特异性或控制发展的或暂时的基因活化并且包括启动子元件、核心启动子元件、应答于外部刺激可诱导的元件、被组成型地激活的元件、转录终止子、聚腺苷酸化信号、以及减少或增加启动子活性的元件(对应地例如负调节元件或转录增强子)。“顺式作用”是指物理地与转录序列邻接的序列。顺式作用序列一般地与蛋白或其他分子相互作用以实现(开/关、调节、调制等)转录。“转录增强子”是指核酸序列，当置于启动子附近并且存在于能够支持转录的转录介质中时，与在缺少该增强子下该启动子得到的结果相比该核酸序列提供增加的转录活性。增强子可以在基因的上游、之中或下游，甚至距离该转录起始位点远达50千碱基处起作用。增强子还可以独立于它们的方向起作用。“转录终止子”是指包括对减少或消除转录必需的核苷酸碱基对序列的DNA序列。“聚腺苷酸化信号”是指控制转录和翻译终止的序列。
本发明的一个方面，对给定的多肽设计了合成的DNA序列，该多肽例如在此披露的方法中有用的靶向叶绿体的多肽。在细胞中该合成的DNA序列的可读框的表达导致该多肽的生成。合成的DNA序列对于简单地去除不想要的限制性内切核酸酶识别位点、对于有利于DNA克隆策略、对于改变或去除任何潜在的密码子偏爱、对于改变或改进GC含量、对于去除或改变可替代的阅读框、和/或对于改变或去除内含子/外显子剪接识别位点、聚腺苷酸化位点、SD序列、不想要的启动子元件以及在天然DNA序列中可能存在的序列可能是有用的。还可能的是可以使用合成的DNA序列来将其他改进引入DNA序列中，例如引入内含子序列、生成作为与细胞器靶向序列(例如叶绿体转运肽、质外体/液泡靶向肽或导致生成的肽在内质网中滞留的肽序列)的蛋白融合物表达的DNA序列。合成基因还可以使用宿主细胞优选的用于提高表达的密码子来合成或可以使用密码子在宿主优选的密码子使用频率下合成。参见，例如Campbell和Gowri(1990)Plant Physiol.92：1-11；美国专利号6,320,100；6,075,185；5,380,831；以及5,436,391，美国公开申请号20040005600以及20010003849，以及Murray等人(1989)Nucleic Acids Res.17：477-498，通过引用并入本文作为参考。
还可以将有待靶向到叶绿体的感兴趣的核酸进行优化用于在叶绿体中表达从而说明了植物细胞核与细胞器之间密码子使用方面的差异。以这种方式，可以使用叶绿体优选的密码子来合成感兴趣的核酸。参见，例如美国专利号5,380,831，将其通过引用并入本文作为参考。
变体以及片段
本发明还包括所披露的CTP序列的片段的核酸分子。“片段”是指该CTP序列的一部分。核苷酸序列的片段可以是生物学活性的并且因此能够有助于将感兴趣的多肽转运到植物的叶绿体中，或它可以是能够使用以下披露的方法被用作杂交探针或PCR引物的片段。确定是否这类片段具有CTP活性的测定法在本领域中是熟知的。
是在此披露的编码CTP的核苷酸序列的片段的核酸分子可以包含至少约90、100、125、150、175、200、225、250、275、300个邻接的核苷酸，或取决于想要的用途高达在此披露的全长CTP序列中的核苷酸数(例如对于SEQ ID NO：1为306个核苷酸)。“邻接的”核苷酸是指彼此紧接的核酸残基。本发明的编码CTP的序列的生物活性片段将编码保留了活性的CTP。“保留了CTP活性”是指该片段将指导至少约30％、至少约50％、至少约70％或至少约80％的由感兴趣的核苷酸序列编码的多肽转运进入叶绿体中。在一个实施方案中，在此披露的编码CTP的核苷酸序列的片段包含SEQ ID NO：1、2、4或6的一个或多个缺失，包括高达约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约12、约15、约18、约21、约24、约27、约30或更多个缺失。在另一个实施方案中，在此披露的编码CTP的核苷酸序列的片段可以编码包含SEQ ID NO：3、5或7的一个或多个缺失的氨基酸，包括高达约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10或更多个氨基酸缺失。
可以通过分离本发明的CTP序列之一中的一部分并且对该CTP的该部分的活性进行评估来制备CTP的生物学活性部分。用于测量CTP活性的方法在本领域中是熟知的。对于适合的方法的实例参见名称为“CTP活性的评估”的章节。
还包括在此披露的编码CTP的核苷酸序列或CTP氨基酸序列的变体。“变体”是指十分相同的序列，或与天然叶绿体转运肽相差至少一个氨基酸的序列。本发明所包括的编码CTP的序列是与SEQ ID NO：1、2、4或6的核苷酸序列十分相同的。在此包括的CTP序列是与SEQ ID NO：3、5或7的氨基酸序列十分相同的。“十分相同的”是指使用如在此描述的比对程序与参照序列相比较，核苷酸序列具有至少约70％或75％、约80％或85％序列同一性，约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。
在一个实施方案中，在此披露的变体包括SEQ ID NO：1、2、4或6的一个或多个核苷酸或SEQ ID NO：3、5或7的一个或多个氨基酸的核苷酸或氨基酸的替代、缺失、截短以及插入，包括高达约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约15、约20、约25、约30或更多个氨基酸替代、缺失或插入。
通过使用熟知的分子生物学技术(例如以下描述的聚合酶链式反应(PCR)和杂交技术)可以鉴定天然存在的变体。变体核苷酸序列还包括合成地衍生的核苷酸序列，该合成地衍生的核苷酸序列是例如通过使用位点定向诱变生成的，但它仍然具有如在此定义的CTP活性。
本发明所包括的变体是生物学活性的，即它们继续具有天然序列的所希望的生物学活性，即保留了CTP活性(即有助于所表达的多肽转运到叶绿体中)。“保留了CTP活性”是指该变体将指导至少约30％、至少约50％、至少约70％或至少约80％的由感兴趣的核苷酸序列编码的多肽转运到叶绿体中。用于测量CTP活性的方法在本领域中是熟知的。对于适合的方法的实例参见名称为“CTP活性的评估”的章节。
普通技术人员应当进一步理解的是可以将对CTP的改变通过突变引入到本发明的编码CTP的核苷酸序列中而不改变CTP的驱动将多肽转运到植物细胞的叶绿体中的能力。因此，可以通过引入一个或多个核苷酸替代、添加或缺失至在此披露的相应的核苷酸序列中而生成分离的核酸分子的变体。可以通过标准技术(例如定点诱变以及PCR介导的诱变)引入突变。本发明也包括这类变体核苷酸序列。
作为替代方案，可以通过将突变随机地沿该CTP序列的全部或部分进行引入而制备变体核苷酸序列(例如通过饱和诱变)，并且可以筛选得到的突变体的驱动将可操作连接的多肽序列转运到植物细胞的叶绿体中的能力。
“可操作地连接的”是指在调节元件(例如CTP)与第二序列之间的功能性连接，其中该CTP序列指导将感兴趣的多肽转运到植物细胞的叶绿体中。总体上，但并非总是如此，可操作地连接是指被连接的核酸序列是邻接的，并且根据需要连接两个蛋白编码区，从而是邻接的并且在同一个阅读框内。
为了确定两个核苷酸的同一性百分数，为了最佳比较的目的将这些序列进行比对。两个序列之间的同一性百分数是由这些序列所共有的相同位置的数量的函数(即同一性百分数＝相同位置的数量/位置的总数量(例如，重叠位置)x100)。在一个实施方案中，这两个序列是具有相同长度的。在另一个实施方案中，该比较是在参比序列的整体上进行的(例如，SEQ ID NO：1、2、4或6)。可以使用与以下描述的那些类似的技术(允许或不允许缺口)确定两个序列之间的同一性百分数。在计算同一性百分数时，一般计数精确的配对。
可以使用数学算法来实现两个序列之间的同一性百分数的确定。用于比较两个序列的数学算法的非限制性实例是Karlin和Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：2264提出的，在Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5877中进行修改的算法。将这类算法结合到Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215：403的BLASTN程序中。使用BLASTN程序，得分＝100，词长＝12可以进行BLAST核苷酸检索从而得到与本发明的序列同源的核苷酸序列。出于比较的目的为了得到有缺口的比对，可以如Altschul等人(1997)Nucleic Acids Res.25：3389中所述使用Gapped BLAST。作为替代方案，可以使用PSI-Blast来进行检测分子间远近关系的重复检索。参见以上Altschul等人(1997)。当使用BLAST、GappedBLAST、以及PSI-Blast程序时，还可以使用这些对应的程序(例如，BLASTN)的默认的参数。参见，www.ncbi.nlm.nih.gov。用于比较序列的数学算法的另一个非限制性实例是ClustalW算法(Higgins等人(1994)Nucleic Acids Res.22：4673-4680)。ClustalW比较了序列并且与该DNA序列的整体进行比对，并且因此可以提供关于该整体核苷酸序列的序列保守性的数据。将该ClustalW算法用于几个可以商购的DNA分析软件包中，例如载体NTi程序套件的ALIGNX模块(Informax公司)。对于分析ClustalW比对有用的软件程序的非限制性的实例是GeneDocTM。GenedocTM(Karl Nicholas)允许对多个基因之间DNA相似性以及同一性进行评估。用于比较序列的数学算法的另一个优选的非限制性实例是Myers和Miller(1988)CABIOS 4：11-17的算法。将这类算法结合到ALIGN程序(版本2.0)中，该程序是GCG序列比对软件包(可以从美国加利福尼亚州圣地亚哥市9865斯克兰顿路Accelrys公司(Accelrys，Inc.，9865Scranton Rd.，San Diego，California，USA)得到)的一部分。
除非另行说明，GAP版本10(它使用Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48(3)：443-453的算法)将被用于使用以下参数来确定序列同一性或相似性：对于核苷酸序列的％同一性和％相似性使用50的缺口权重和3的长度权重，以及nwsgapdna.cmp计分矩阵；对于氨基酸序列的％同一性或％相似性使用8的缺口权重以及2的长度权重，以及BLOSUM62计分程序。还可以使用等效的程序。“等效的程序”是指任何序列比较程序，该程序对于任何两个所讨论的序列产生比对，当与GAP版本10所产生的对应的比对相比较时，该比对具有相同的核苷酸残基配对以及相同的序列同一性百分数。
使用多种方法(例如，PCR、杂交等)可以鉴定来自其他生物、具体地其他藻类生物的相应的序列，例如具有与本发明的序列基本上同一性的序列。参见例如Sambrook J.和Russell，D.W.(2001)Molecular Cloning：ALaboratory Manual.(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，NY)以及Innis等人(1990)PCR Protocols：A Guide to Methods andApplications(Academic Press，NY)。本发明包括通过它们与在此列出的CTP序列的同一性所鉴定的序列。
在另一个实施方案中，可以基于鉴定已知包含CTP的序列来鉴定CTP。例如，可以基于与在此披露的或本领域已知的靶向叶绿体的蛋白(例如乙酰乳酸合酶(AHAS)、小亚基(SSU)、以及EPSPS)的相似性来鉴定靶向叶绿体的序列。可以使用本领域已知方法来鉴定来自这些靶向蛋白的CTP序列。参见例如Emanuelsson和von Heijne(2001)Biochimica etBiophysica Acta 1541：114-119；Nielson等人(1997)Protein Eng.10：1-6；以及，Nielson和Krogh(1998)Intell.Syst.Mol.Biol.6：122-130，将它们每一个通过引用以其全部内容并入本文作为参考。还可以得到多种计算机程序用于鉴定。参见，例如ChloroP(它可以在国际互联网地址www.cbs.dtu.dk/services/ChloroP/处找到)；Predotar(它可以在国际互联网地址www.inra.fr/Internet/Produits/Predotar/处找到)；以及SignalP(它可以在国际互联网地址www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/处找到)。
可以设计寡核苷酸引物用于PCR反应中以扩增相应的来自感兴趣的生物的cDNA或基因组DNA的DNA序列。用于设计PCR引物以及PCR克隆的方法在本领域中是普遍已知的并且披露于Sambrook等人(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第二版，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY)中。也参见Innis等人编著(1990)PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications(AcademicPress，New York)；Innis和Gelfand编著(1995)PCR Strategies(AcademicPress，New York)；以及Innis和Gelfand编著(1999)PCR Methods Manual(Academic Press，New York)。已知的PCR方法包括但不限于使用配对引物、嵌套引物、单个的特异性引物、简并的引物、基因特异性引物、载体特异性引物、以及部分错配的引物的方法。
在杂交方法中，可以使用已知核苷酸序列的全部或部分来筛选cDNA或基因组文库。用于构建这类cDNA或基因组文库的方法在本领域中是普遍已知的并且在以上的Sambrook和Russell，2001中进行了披露。这些杂交探针可以是基因组DNA片段、cDNA片段、RNA片段或其他寡核苷酸，并且可以用可检出的基团例如32P或任何其他可检出的标志物例如其他的放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅因子进行标记。可以基于已知的在此披露的编码CTP的序列或引物通过将合成的寡核苷酸标记到已知的叶绿体靶向蛋白上来制造用于杂交的探针。可以另外地使用基于核苷酸序列中保守的核苷酸所设计的简并的引物。该探针一般地包含核苷酸序列的区域(该核苷酸序列在严格条件下杂交到本发明的编码CTP的序列的至少约12、至少约20、至少约25、30、35、40、45、50、55、60、75、100、125、150、175、200、250、300、350或400个连续核苷酸上)、编码叶绿体靶向蛋白的核苷酸序列或其片段或变体。用于杂交的探针的制备在本领域中是普遍已知的并且在以上Sambrook和Russell，2001中进行了披露，将其通过引用并入本文作为参考。
例如，可以将在此披露的编码CTP的全长序列(或对于叶绿体靶向蛋白的编码序列)或其一个或多个部分用作能够特异性地与相应的CTP样序列杂交的探针。为了实现在多种条件下的特异性杂交，这类探针包括序列，所述序列是独特的并且是至少约10个核苷酸长度或至少约20个核苷酸长度。可以通过PCR使用这类探针来扩增相应的来自所选择的生物的编码CTP的序列。可以使用这种技术来从所希望的生物中分离另外的编码序列，或作为用于确定生物中存在编码序列的诊断测定法。杂交技术包括杂交筛选铺板的(plated)DNA文库(或者是菌斑或者是集落；参见例如Sambrook等人(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Man ual(第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY)。
在严格条件下可以进行这类序列的杂交。“严格条件”或“严格的杂交条件”是指这些条件，在这些条件下与其他序列相比探针将与其目标序列杂交达到可检出的更大的程度(例如，比背景高至少2倍)。严格条件是序列依赖性的并且在不同的环境中是不同的。通过控制杂交和/或洗涤条件的严格性，可以鉴定与该探针100％互补的目标序列(同源探测)。作为替代方案，可以对严格条件进行调节以允许一些错配存在于序列中，从而检测到更低程度的相似性(异源探测)。总体上，探针是小于约1000个核苷酸长度的，或小于500个核苷酸长度的。
一般地，严格条件应该是下面的那些，其中在pH 7.0至8.3下盐浓度是小于约1.5M Na离子，一般地约0.01至1.0M Na离子浓度(或其他盐类)并且对于短的探针(例如10至50个核苷酸)温度是至少约30℃并且对于长的探针(例如，大于50个核苷酸)是至少约60℃。通过加入去稳定试剂(例如，甲酰胺)也可以实现严格条件。示例性的低严格条件包括在37℃用30％至35％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS(十二烷基硫酸钠)的缓冲液进行杂交，并且在50℃至55℃用1X至2X SSC(20X SSC＝3.0M NaCl/0.3M柠檬酸三钠)进行洗涤。示例性的中等的严格条件包括在37℃在40％至45％甲酰胺、1.0M NaCl、1％SDS中进行杂交并且在55℃至60℃在0.5X至1X SSC中进行洗涤。示例性的高严格条件包括在37℃在50％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中进行杂交，并且在60℃至65℃在0.1X SSC中进行洗涤。任选地，洗涤缓冲液可以包含约0.1％至约1％的SDS。杂交的持续时间通常是小于约24小时，通常是约4至约12小时。任选地，洗涤缓冲液可以包含约0.1％至约1％的SDS。
特异性一般地是杂交后洗涤的函数，关键的因素是离子强度以及最终洗涤液的温度。对于DNA-DNA杂交，该Tm可以近似地是Meinkoth和Wahl(1984)Anal.Biochem.138：267-284：Tm＝81.5℃+16.6(log M)+0.41(％GC)-0.61(％form)-500/L的方程式；其中M是一价阳离子的体积摩尔浓度，％GC是DNA中鸟嘌呤核苷酸与胞嘧啶核苷酸的百分比，％form是该杂交溶液中甲酰胺的百分数，并且L是碱基对杂交的长度。Tm是温度(在定义的离子强度以及pH下)，在该温度下50％的互补目标序列杂交到完全配对的探针上。对于每1％的错配Tm降低约1℃；因此，可以对Tm、杂交条件和/或洗涤条件进行调节从而杂交到所希望的同一性的序列上。例如，如果寻找具有≥90％同一性的序列，Tm可以被降低10℃。总体上，选择的严格条件是在定义的离子强度以及pH下比特定序列和其互补序列的热熔点(Tm)低约5℃。然而，严格的严格条件下可以在比热熔点(Tm)低1、2、3或4℃进行杂交和/或洗涤；中等严格条件可以在比热熔点(Tm)低6、7、8、9或10℃进行杂交和/或洗涤；低严格条件可以在比热熔点(Tm)低11、12、13、14、15或20℃进行杂交和/或洗涤。使用该方程式、杂交以及洗涤组合物、以及所希望的Tm，普通的技术人员应当理解的是在杂交和/或洗涤液的严格性方面的变化是被内在的描述的。如果所希望的错配程度导致Tm低于45℃(水溶液)或32℃(甲酰胺溶液)，可以增加SSC浓度，从而可以使用更高的温度。对于核酸杂交的广泛的指导见Tijssen(1993)Laboratory Techniques in Biochemistry and MolecularBiology-Hybridization with Nucleic Acid Probes，Part I，Chapter 2(Elsevier，New York)；以及Ausubel等人编著(1995)Current Protocols in MolecularBiology，Chapter 2(Greene Publishing and Wiley-Interscience，New York)中。参见Sambrook等人(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY)。
本发明包括多种分离的序列，这些序列具有CTP活性并且在严格条件下与在此披露的CTP序列杂交，或其片段。
使用方法
本发明的方法涉及在高等植物以及植物细胞中在本发明的CTP序列的控制下正确表达、转运、以及加工叶绿体靶向的序列。为了本发明的目的，“经加工的”叶绿体靶向的蛋白是其中已经去除CTP的蛋白。在将叶绿体靶向的蛋白转运到植物细胞的叶绿体中时，通过在CTP与成熟蛋白之间的特定“切割位点”进行切割将CTP从靶向蛋白中去除。能够以实验确定该切割位点，或可以基于序列结构进行预测(例如，通过将未加工的蛋白与其中切割位点是已知的叶绿体靶向的蛋白进行比对，通过分析序列中特征性CTP结构域的存在等)或通过使用一种或多种如在此其他地方所讨论的用于切割位点预测的算法(例如SignalP)。
这些转基因植物可以具有表型上的改变，包括但不限于改变的病原体或昆虫防御机制、对一种或多种除草剂增加的抗性、对耐受胁迫环境条件增加的能力、对于生产淀粉改进的能力、改进水平的淀粉生产、改进的油含量和/或组分、对于利用、分配和/或存储氮的改进的能力等。这些结果可以通过将感兴趣的多肽表达并且靶向到植物中的叶绿体中来实现，其中该感兴趣的多肽在叶绿体中发挥作用。本发明的CTP序列对于在高等植物中靶向天然序列和异源(非天然)序列是有用的。为了本发明的目的，“高等植物”被认为是有胚植物亚界的成员。在一个实施方案中，该植物是单子叶植物。在另一个实施方案中，该植物是双子叶植物。
通常，将编码本发明的CTP的核苷酸序列提供于具有感兴趣的核苷酸序列的表达盒中用于在感兴趣的植物中进行表达。在一个实施方案中，本发明的编码CTP的序列对于提高天然序列在植物中的转运是有用的。在其他实施方案中，这些编码CTP的序列对于表达和转运由异源核苷酸序列所编码的多肽是有用的。“异源核苷酸序列”是指这样的序列，该序列没有天然地可操作地与本发明的编码CTP的序列连接，包括天然存在的DNA序列的非天然存在的多个拷贝。当该核苷酸序列对于编码CTP的序列是异源的时，它对于植物宿主可以是同源的或“天然的”或异源的或“外来的”。在一些情况下，经转化的植物可以具有表型上的改变。“异源的”通常是指核酸序列，这些核酸序列对于它们存在于其中的细胞或天然基因组的部分不是内源的，并且已经通过感染、转染、微注射、电穿孔、微弹轰击等被加入到该细胞中。
可以将感兴趣的任何核苷酸序列与本发明的编码CTP的序列一起使用，只要由感兴趣的核苷酸序列编码的多肽(即“感兴趣的多肽”)在叶绿体中发挥作用。这类核苷酸序列包括但不限于除草剂抗性编码序列、杀虫编码序列、杀线虫的编码序列、抗微生物的编码序列、抗真菌的编码序列、抗病毒的编码序列、非生物和生物的胁迫抗性编码序列或修饰植物性状例如产量、谷物品质、营养物含量、淀粉质与量、氮固定和/或利用、以及油含量和/或组成的序列。对于本发明感兴趣的更特定的基因包括但不限于提高作物产量的基因、提高作物希求的基因、编码提供对非生物胁迫(例如，干旱、温度、盐度、有毒金属或痕量元素)抗性的蛋白的基因，或提供对毒素(例如杀虫剂或除草剂)或对生物性胁迫(例如被真菌、病毒、细菌、昆虫、以及线虫攻击以及与这些生物相关的疾病的发展)抗性的那些基因。应当理解的是可以将任何感兴趣的基因可操作地连接到本发明的编码CTP的序列上并且在植物中进行表达，只要由该基因所编码的多肽在叶绿体中发挥作用。
这些感兴趣的核苷酸序列可以编码参与提供疾病抗性或害虫抗性的多种蛋白。“疾病抗性”或“害虫抗性”是指植物避免了有害的症状，这些症状是植物-病原体相互作用的结果。疾病抗性基因以及昆虫抗性基因(例如用于抗细菌保护的溶菌酶或天蚕素)或多种蛋白(例如用于抗真菌保护的防御素、葡聚糖酶或甲壳酶)或用于控制线虫或昆虫的苏云金芽孢杆菌内毒素、蛋白酶抑制剂、胶原酶、凝集素或糖苷酶都是有用的基因产品的实例。例如可以在www.nbiap.vt.edu/cfdocs/fieldtests2.cfm处找到感兴趣的基因的实例。
“害虫”包括但不限于昆虫、真菌、细菌、病毒、线虫、螨、蜱等。昆虫害虫包括选自以下目的昆虫：鞘翅目(Coleoptera)、双翅目(Diptera)、膜翅目(Hymenoptera)、鳞翅目(Lepidoptera)、食毛目(Mallophaga)、同翅目(Homoptera)、半翅目(Hemiptera)、直翅目(Orthroptera)、缨翅目(Thysanoptera)、革翅目(Dermaptera)、等翅目(Isoptera)、虱目(Anoplura)、蚤目(Siphonaptera)、毛翅目(Trichoptera)等，特别是鞘翅目、鳞翅目以及双翅目。病毒包括但不限于烟草花叶病毒或黄瓜花叶病毒、环斑病毒、坏死病毒、玉米矮花叶病毒等。线虫包括但不限于寄生性线虫例如根结线虫、孢囊线虫、以及腐线虫，包括胞囊类线虫(Heterodera spp)、根结线虫(Meloidogyne spp)、以及球形胞囊线虫(Globodera spp)；特别是孢囊线虫的成员，包括但不限于大豆胞囊线虫(Heterodera glycines)；甜菜胞囊线虫(Heterodera schachtii)；禾谷孢囊线虫(Heterodera avenae)；以及马铃薯金线虫(Globodera rostochiensis)和马铃薯包囊线虫(Globoderapailida)。腐线虫包括但不限于短体线虫(Pratylenchus spp.)。真菌性害虫包括引起叶锈病、黄锈病、条锈病以及茎锈病的那些。
“除草剂抗性蛋白”或从“编码除草剂抗性的核酸分子”表达得到的蛋白包括以下这些蛋白，与没有表达该蛋白的细胞相比这些蛋白提供给细胞耐受更高浓度的除草剂的能力，或与不表达该蛋白的细胞相比，提供耐受某一浓度的除草剂持续更长一段时间的能力。可以通过编码对抑制乙酰乳酸合酶(ALS)的除草剂特别是磺酰脲类除草剂具有抗性的基因、编码对抑制谷氨酰胺合酶的除草剂例如草胺膦(Phosphinothricin)或basta具有抗性的基因(例如，bar基因)、对草甘膦(glyphosate)具有抗性的基因(例如EPSP合酶基因和GAT基因)或本领域中已知的其他这类基因将除草剂抗性性状引入植物中。
提高作物产量的基因包括矮化基因，例如Rht1和Rht2(Peng等人(1999)Nature 400：256-261)，以及增加植物生长的基因，例如铵诱导的谷氨酸脱氢酶。提高作物希求的基因包括例如允许植物具有减少的饱和脂肪含量的那些基因、提高植物的营养值的那些基因以及增加谷物蛋白的那些基因。提高盐耐受性的基因是增加或允许植物在比植物的天然环境更高的盐度的环境中生长的那些基因，其中已经将一个或多个盐耐受性基因引入到该植物中。
植物转化载体
一般地将植物表达盒插入到“植物转化载体”中。“转化载体”是指DNA分子，该DNA分子对于有效地转化细胞是必要的。这类分子可以由一个或多个表达盒构成，并且可以被组织成一个以上的“载体”DNA分子。例如，二元载体是植物转化载体，该载体利用两个非邻近的DNA载体来编码用于转化植物细胞的所有必要的顺式作用和反式作用功能团(Hellens和Mullineaux(2000)Trends in Plant Science 5：446-451)。“载体”是指设计的用于在不同宿主细胞之间转移的核酸构建体。“表达载体”是指载体，该载体具有在外来细胞中掺入、整合以及表达异源DNA序列或片段的能力。“引入”是指以这样方式将该核苷酸构建体提供于有待转化的生物中，即该构建体得以进入该生物的至少一个细胞的内部。
该植物转化载体可以包含一个或多个对于实现植物转化所需要的DNA载体。例如，使用包括一个以上邻近的DNA片段的植物转化载体在本领域中是普通的实践。在本领域中这些载体通常被称为‘二元载体’。二元载体以及具有辅助质粒的载体被最通常地用于农杆菌介导的转化，其中对于实现有效转化所需要的DNA片段的大小以及复杂度是相当大的，并且将多种功能团分到分离的DNA分子上是有利的。二元载体一般地包含质粒载体，该质粒载体包含对于T-DNA转移所需要的顺式作用序列(例如，左边界和右边界)、被设计能够在植物细胞中表达的选择性标志物、以及“感兴趣的基因”(设计的能够在植物细胞中表达的基因，对于该植物细胞，产生转基因植物是所希望的)。在该质粒载体上还存在的是对于细菌复制所需要的序列。
将这些顺式作用序列以允许有效转移到植物细胞中并且在其中表达的方式进行排放。例如，将该选择性标志基因以及感兴趣的基因置于左边界与右边界之间。通常第二质粒载体包含反式作用因子，这些反式作用因子介导T-DNA从农杆菌属转移到植物细胞。该质粒通常包含有毒力的功能团(Vir基因)，如本领域中所理解的这些有毒力的功能团允许由农杆菌属感染植物细胞，并且通过在边界序列处进行切割转移DNA以及vir介导的DNA转移(Hellens和Mullineaux(2000)Trends in Plant Science，5：446-451)。几种类型的农杆菌菌株(例如，LBA4404、GV3101、EHA101、EHA105等)可以用于植物转化。该第二质粒载体对于通过其他方法(例如微弹轰击、微注射、电穿孔、聚乙二醇等)转化植物不是必要的。
植物转化
本发明的方法涉及将核苷酸构建体引入植物中。“引入”是指以这样方式将该核苷酸构建体提供于该植物中，即该构建体得以进入该植物的细胞的内部。本发明的方法不要求使用用于将核苷酸构建体引入植物中的特定的方法，只要该核苷酸构建体得以进入该植物的至少一个细胞的内部即可。用于将核苷酸构建体引入植物中的方法是本领域中已知的，包括但不限于稳定转化方法、瞬时转化方法、以及病毒介导的方法。
可以通过本领域中已知的几种技术中的一种技术实现植物细胞的转化。“植物”是指整个植物、植物器官(例如，叶、茎、根等)、种子、植物细胞、繁殖体、胚以及其后代。植物细胞可以是分化的或未分化的(例如，愈伤组织、悬浮的培养细胞、原生质体、叶细胞、根细胞、韧皮部细胞、花粉)。“转基因植物”或“转化的植物”或“稳定转化的”植物或细胞或组织是指具有掺入或整合到植物细胞中的外源核酸序列或DNA片段的植物。“稳定转化”是指被引入植物中的核苷酸构建体整合到该植物的基因组中并且能够由其后代继承。
一般而言，植物转化方法涉及将异源DNA转移到目标植物细胞中(例如，未成熟的或成熟的胚、悬浮培养物、未分化的愈伤组织、原生质体等)，随后使用最大阈值水平的适当选择(取决于选择性标记基因)来从一组未转化的细胞物质中回收转化的植物细胞。一般地将外植体转移到新鲜供应的相同培养基上并且进行常规地培养。随后，在置于补充有最大阈值水平的选择试剂的再生培养基上之后这些转化的细胞被分化成嫩枝。然后将这些嫩枝转移到选择性的生根培养基中用于回收生根的嫩枝或小植株。然后将转基因的小植株生长成成熟的植物并且生产能育的种子(例如Hiei等人(1994)The Plant Journal 6：271-282；Ishida等人(1996)NatureBiotechnology14：745-750)。用于生产转基因植物的技术以及方法的一般性描述见Ayres和Park(1994)Critical Reviews in Plant Science 13：219-239以及Bommineni和Jauhar(1997)Maydica 42：107-120中。因为该转化的物质包含许多细胞；转化的和未转化的细胞两者都存在于受试的目标愈伤组织或组织或细胞群的任何部分中。杀死未转化的细胞并且允许转化的细胞繁殖的能力导致了转化的植物培养物。通常地，去除未转化的细胞的能力是对于快速回收转化的植物细胞并且成功地生产转基因植物的限制。可以使用分子的以及生化的方法来证实整合的感兴趣的异源基因存在于转基因植物的基因组中。
可以通过几种方法中的一种方法来进行生产转基因植物，包括但不限于通过农杆菌将异源的DNA引入植物细胞中(农杆菌介导的转化)，用粘合到粒子上的异源的外来DNA轰击植物细胞，以及多种其他的非粒子直接介导的方法(例如Hiei等人(1994)The Plant Journal 6：271-282；Ishida等人(1996)Nature Biotechnology 14：745-750；Ayres和Park(1994)CriticalReviews in Plant Science 13：219-239；Bommineni和Jauhar(1997)Maydica42：107-120)来转移DNA。
用于转化叶绿体的方法是本领域已知的。参见例如Svab等人(1990)Proc.Natl.A cad.Sci.USA 87：8526-8530；Svab和Maliga(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：913-917；Svab和Maliga(1993)EMBO J.12：601-606。该方法依赖于粒子枪递送包含选择性标志物的DNA并且通过同源重组将该DNA靶向到质体基因组中。另外，通过组织偏好地表达核编码的并且质体导向的RNA聚合酶通过反式激活沉默的质体来源的转基因可以实现质体转化。这类系统已经报告于McBride等人(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：7301-7305中。
可以根据常规方法将已经被转化的细胞生长成植物。参见例如McCormick等人(1986)Plant Cell Reports 5：81-84。然后可以将这些植物进行生长，并且用同一转化的品系进行授粉亦或用不同的品系进行授粉，并且对得到的具有组成型表达所希望的表型特征的杂交体进行鉴定。可以生长两个或更多个世代来确保所希望的表型特征的表达是被稳定地保持和遗传的，并且然后收获种子以确保所希望的表型特征的表达已经被实现。以这种方式，本发明提供了具有本发明的核苷酸构建体(例如稳定地掺入其基因组中的本发明的表达盒)的转化种子(也称为“转基因种子”)。
植物
本发明可以用于转化任何高等植物物种，包括但不限于单子叶植物以及双子叶植物。在一个实施方案中，在此包括的CTP在单子叶植物和双子叶植物两者中都是有活性的。在另一个实施方案中，该CTP仅在单子叶植物或仅在双子叶植物中是有活性的。感兴趣的植物的实例包括但不局限于：玉黍蜀(玉米)、高粱、小麦、向日葵、番茄、十字花科植物、胡椒、马铃薯、棉花、稻、大豆、甜菜、甘蔗、烟草、大麦、以及油菜籽油菜、芸薹属、苜蓿、黑麦、粟、红花、花生、甘薯、木薯、咖啡、椰子、菠萝、柑桔树、可可、茶、香蕉、鳄梨、无花果、番石榴、芒果、橄榄、番木瓜、腰果树、澳洲坚果树、扁桃、燕麦、蔬菜、观赏植物、以及松类。
蔬菜包括但不局限于：番茄、莴苣、青豆(green bean)、利马豆、豌豆、以及甜瓜属(Curcumis)的成员如黄瓜、香瓜、以及甜瓜。观赏植物包括但不局限于：杜鹃花、八仙花、木槿、玫瑰、郁金香、水仙花、喇叭花、康乃馨、猩猩木、以及菊花。优选地，本发明的植物是作物植物(例如玉米、高粱、小麦、向日葵、番茄、十字花科植物、胡椒、马铃薯、棉花、稻、大豆、甜菜、甘蔗、烟草、大麦、油菜籽油菜等)。
本发明特别适合用于单子叶植物科的任何成员，包括但不局限于：玉米、稻、大麦、燕麦、小麦、高粱、黑麦、甘蔗、菠萝、山药、葱头、香蕉、椰子、以及枣椰树。
植物转化的评估
将异源的外来的DNA引入到植物细胞中之后，通过各种方法(例如与该整合的DNA相关的核酸或蛋白以及代谢产物的分析)证实了植物基因组中异源DNA的转化或整合。
PCR分析是在移植到土壤中之前在早期阶段用于筛选转化的细胞、组织或嫩枝检测整合的DNA的存在的快速的方法(Sambrook和Russell，2001.Molecular Cloning：A Laboratory Manual.Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY)。使用对感兴趣的基因或农杆菌载体背景等特异性的寡核苷酸引物实现PCR。
可以通过基因组DNA的DNA印迹分析来证实植物转化(Sambrook和Russell，2001，上述)。总体上，从该转化体中提取总DNA，用适当的限制性酶进行消化，在琼脂糖凝胶中进行分级并且转到硝酸纤维素或尼龙膜上。然后用例如放射性标记的32P目标DNA片段来探测该膜或“印迹”以证实根据标准技术所引入到植物基因组中的DNA的整合(Sambrook和Russell，2001，上述)。
在RNA印迹分析中，从转化体的特定组织中分离出RNA，在甲醛琼脂糖凝胶中进行分级，根据本领域中常规地使用的标准步骤印迹到尼龙过滤器上(Sambrook和Russell，2001，上述)。然后通过本领域中已知的方法通过将该过滤器与从异源基因衍生的放射性探针进行杂交来测试由可操作地连接到编码CTP的序列上的异源基因所编码的RNA的表达(Sambrook和Russell，2001，上述)。
CTP活性的评估
用于确定本发明的CTP序列将感兴趣的蛋白靶向到叶绿体中的有效性的测定法已知的。参见，例如Mishkind等人(1985)J of Cell Biol100：226-234，将它通过引用以全部内容并入本文作为参考。将报告基因(例如葡萄糖醛酸酶(GUS)、氯霉素乙酰基转移酶(CAT)或绿色荧光蛋白(GFP))可操作地连接到该CTP序列上。将该融合物置于适合的启动子的控制的后面，连接到转化载体中，并且转化到植物或植物细胞中。在表达和定位于叶绿体中足够的时间期间之后，对叶绿体组分进行提取并且进行报告基因活性测定。可以将该分离的序列的靶向以及递送报告基因蛋白到叶绿体中的能力与其他已知的CTP序列进行比较。参见de Castro SilvaFilho等人(1996)Plant Mol.Biol.30：769-780。通过将蛋白酶加入到该分离的叶绿体部分中还可以体外证实蛋白导入。被成功地导入叶绿体中的蛋白是对外部加入的蛋白酶耐受的，然而，胞质溶胶中保留的蛋白是对消化敏感的。通过使用标准的分子技术来检测叶绿体中功能性蛋白的存在，或通过对从叶绿体靶向的蛋白的表达所得到的表型进行评估，也可以证实蛋白导入。
以下实施例是通过说明的方式但不是通过限制的方式来提供的。
实验
实施例1衣藻AHAS CTP。
通过将全长的衣藻AHAS(“ChlamyAHAS”)肽(GENBANK登录号AF022816；SEQ ID NO：8)与来自植物、细菌、酵母以及真菌的几种AHAS肽进行比较鉴定出衣藻AHAS CTP(SEQ ID NO：3)。该比对显示ChlamyAHAS CTP显示了与植物CTP非常小的序列保守性，然而，成熟蛋白显示了多个保守的元件。因此，通过将多个AHAS蛋白与该ChlamyAHAS蛋白进行比较，可以推断出衣藻AHAS蛋白的氨基酸1-99包含该CTP。对于该CTP在导入到衣藻叶绿体中时所预测的加工位点是SEQ ID NO：8的近似地氨基酸92处。
实施例2衣藻RuBisCo小亚基(SSU)CTP。
通过将全长的衣藻SSU(“ChlamySSU”)肽(GENBANK登录号CAA28160；SEQ ID NO：9)与几种植物RuBisCo小亚基肽进行比较鉴定出衣藻SSU CTP(SEQ ID NO：5)。该比对显示ChlamySSU CTP显示了与植物CTP非常小的序列保守性，然而，成熟蛋白显示了多个保守的元件。因此，通过将几种植物RuBisCo蛋白的已知的加工位点与该ChlamySSU蛋白进行比较，可以推断出该衣藻SSU蛋白(SEQ ID NO：9)的氨基酸1-45包含该CTP。
已经经验地确定衣藻RuBisCO小亚基前体(“ChlamySSU”)的切割位点为SEQ ID NO：9的残基44与45之间(Schmidt等人1979，Journal ofCell Biology 83：615-662)。
实施例3衣藻EPSPS CTP
通过将全长的衣藻EPSPS肽(GENBANK登录号XP_001702942；SEQID NO：10)与几种植物以及细菌的EPSPS进行比较鉴定出衣藻EPSPSCTP(SEQ ID NO：7)。该比对显示ChlamyEPSPS CTP显示了与植物CTP非常小的序列保守性，然而，成熟蛋白显示了多个保守的元件。因此，通过将几种EPSPS蛋白与该ChlamyEPSPS蛋白进行比较，可以推断出该衣藻EPSPS蛋白(SEQ ID NO：10)的氨基酸1-75包含该CTP。对于该CTP在导入到衣藻叶绿体中时所预测的加工位点是SEQ ID NO：10的近似地氨基酸61处。
表1.衣藻CTP
实施例4 使用用于蛋白靶向的衣藻CTP的DNA构建体
利用该衣藻CTP(包括衣藻AHAS CTP、衣藻SSU CTP或衣藻EPSPSCTP)来生成用于将蛋白靶向叶绿体的多个构建体的DNA元件可以涉及包含多个方便的限制性内切核酸酶识别位点(例如，Bam HI限制性位点)以及该叶绿体CTP与蛋白之间的小肽接头(例如Gly-Ser-Gly三肽CTP；SEQ ID NO：18)。此外，能够将这类DNA元件以方式进行设计以及合成地制造，即该DNA序列与初始DNA是不同的，但是编码相同的肽。
作为替代方案，人们可以设计多种DNA构建体从而不需要限制性酶切位点，并且通过全合成该结合编码区或通过基于PCR的策略(包括“sewing PCR”等)可以实现CTP/蛋白融合物。
人们还能够以一种方式设计CTP/蛋白融合物，其中两个蛋白之一中的一些氨基酸被截短了。例如，人们能够从细菌表达的蛋白的N端去除一个或多个氨基酸，但仍然实现与衣藻CTP的功能性融合。
设计了盒子，该盒子包含合成地设计的对衣藻AHAS CTP进行编码的DNA序列，该序列掺入了BamHI限制性位点和Gly-Ser-Gly接头。这些DNA构建体包含(从5’至3’)(1)Pst I克隆位点，(2)提供用于有效翻译的“Kozak”环境的碱基ACC，(3)对氨基末端蛋氨酸至ChlamyAHAS的已知转运肽切割位点进行编码的基因部分，并且包括对C端至切割位点的氨基酸进行编码的小的DNA区域，(4)对具有植入的BamH I克隆位点的Gly-Ser-Gly残基进行编码的DNA碱基，以及(5)感兴趣的基因的编码区。
设计了盒子，该盒子包含合成地设计的对衣藻SSU CTP进行编码的DNA序列，该序列掺入了BamHI限制性位点和Gly-Ser-Gly接头。这些DNA构建体包含(从5’至3’)(1)Pst I克隆位点，(2)提供用于有效翻译的“Kozak”环境的碱基ACC，(3)对氨基末端蛋氨酸至ChlamySSU的已知转运肽切割位点进行编码的基因部分，并且包括对C端至切割位点的氨基酸进行编码的小的DNA区域，(4)对具有植入的BamH I克隆位点的Gly-Ser-Gly残基进行编码的DNA碱基，以及(5)感兴趣的基因的编码区。
设计了盒子，该盒子包含合成地设计的对衣藻EPSPS CTP进行编码的DNA序列，该序列掺入了BamHI限制性位点和Gly-Ser-Gly接头。这些DNA构建体包含(从5’至3’)(1)PstI克隆位点，(2)提供用于有效翻译的“Kozak”环境的碱基ACC，(3)对氨基末端蛋氨酸至ChlamyEPSPS的已知转运肽切割位点进行编码的基因部分，并且包括对C端至切割位点的氨基酸进行编码的小的DNA区域，(4)对具有植入的BamH I克隆位点的Gly-Ser-Gly残基进行编码的DNA碱基，以及(5)感兴趣的基因的编码区。
实施例5 将来自非植物物种的转运肽融合到异源蛋白上，并且在单 子叶植物中正确地定位并且切割：在单子叶植物中衣藻AHAS CTP起作 用。
设计了多种DNA构建体从而使得到的蛋白在N端编码该衣藻AHAS转运肽(“ChlamyAHAS”)，随后将蛋白融合到对细胞提供除草剂抗性的基因上(GRG-1；美国专利号7,405,347)。对于ChlamyAHAS前体，通过将蛋白序列与来自细菌、真菌以及酵母的ALS蛋白进行比对推断出这些转运肽切割位点。
这些DNA构建体包含(从5’至3’)(1)Pst I克隆位点，(2)提供用于有效翻译的“Kozak”环境的碱基ACC，(3)对氨基末端蛋氨酸至ChlamyAHAS CTP的已知转运肽切割位点进行编码的基因部分，并且包括对C端至切割位点的氨基酸进行编码的小的DNA区域，(4)对具有植入的BamH I克隆位点的Gly-Ser-Gly残基进行编码的DNA碱基，以及(5)感兴趣的基因(在这个情况下是GRG-1)的编码区。
这些DNA分子是合成制造的(Menlo Park，CA的DNA 2.0)。提供了包含该构建体的区域的DNA序列，为SEQ ID NO：11，并且提供了生成的氨基酸序列，为SEQ ID NO：12。
制造了对照构建体(pAG250)，该构建体包含从TrpPr05启动子表达的GRG-1，其中该GRG-1蛋白不具有叶绿体CTP。
将这种无CTP/GRG-1构建体设计到用于农杆菌介导的玉米胚的转化的载体中，并且生成包含这种构建体的转基因玉米植物。通过PCR分析这些T0转化的植物以确定该构建体存在于这些玉米系中，并且然后将这些T0植物与非转基因系进行异型杂交从而生成半合子的T1子代。得到的T1转基因植物生产大量的GRG-1蛋白。但是，用pAG250转化的以及非定位地表达GRG-1的植物是对草甘膦不耐受的。
将藻类CTP ChlamyAHAS/GRG-1构建体设计到用于农杆菌介导的玉米胚的转化的载体中，并且生成包含这种构建体的转基因玉米植物。
通过PCR分析这些T0转化的植物以确定该构建体存在于这些玉米系中，并且然后将这些T0植物与非转基因系进行异型杂交从而生成半合子的T1子代。得到的T1转基因植物对于喷射施用的草甘膦是耐受的(与非转基因的对照进行比较)。
来自转基因玉米植物的叶组织的蛋白质印迹显示这些植物表达GRG-1蛋白。此外，通过蛋白质印迹鉴定的蛋白的大小与将该蛋白导入叶绿体中，并且在或邻近切割位点处对ChlamyAHAS/GRG-1蛋白进行加工的情况一致。
因此，该ChlamyAHAS CTP足以将GRG-1靶向到玉米叶绿体，并且导致表型(除草剂抗性)，在缺少靶向到该叶绿体时该表型不被GRG-1所提供。
实施例6 将来自非植物物种的转运肽融合到异源蛋白上，并且在单 子叶植物中正确地定位和切割：在单子叶植物中衣藻SSU CTP起作用
为了测试是否藻类的叶绿体CTP可以在单子叶植物中起作用，生成了多个转基因单子叶植物并且通过蛋白质印迹分析对藻类CTP的表达以及切割进行评估。
设计了多个DNA构建体从而使得到的蛋白在N端编码藻类的转运肽，融合到对细胞提供除草剂抗性的蛋白上(在这个情况下是GRG-8蛋白；美国专利公开号20060150270)
这些DNA构建体包含(从5’至3’)(1)Pst I克隆位点，(2)提供用于有效翻译的“Kozak”环境的碱基ACC，(3)对氨基末端蛋氨酸至ChlamySSU的已知转运肽切割位点进行编码的基因部分，并且包括对C端至切割位点的氨基酸进行编码的小的DNA区域，(4)对具有植入的BamH I克隆位点的Gly-Ser-Gly残基进行编码的DNA碱基，以及(5)感兴趣的基因(在这个情况下是GRG-8)的编码区。
提供了包含该构建体的区域的DNA序列，为SEQ ID NO：13，并且提供了生成的氨基酸序列，为SEQ ID NO：14。
将这种CTP/GRG-8构建体(pAG1675)设计到用于农杆菌介导的玉米胚的转化的载体中，并且生成和鉴定这些转基因玉米植物。
通过PCR分析用pAG1675转化的这些T0植物以确定该构建体存在于这些玉米系中，并且然后将这些T0植物与非转基因系进行异型杂交从而生成半合子的T1子代。与非转基因的对照相比较，T1转基因植物展示对于喷射施用的草甘膦的抗性。
实施例7 在玉米细胞中衣藻SSU叶绿体CTP融合至GRG-8蛋白的 表达以及加工
来自转基因玉米植物的叶组织的蛋白质印迹发现表达该CTP/GRG-8蛋白。从玉米叶中提取总叶蛋白(Pierce P-PER蛋白提取缓冲剂)，并且在4％至12％Bis-Tris凝胶上进行分离。使用山羊抗GRG8多克隆抗体可以看到GRG-8蛋白。将非转基因的玉米提取物在旁边进行比较(泳道3)。为了对CTP加工进行评估，从大肠杆菌菌株对HIS-标记的GRG-8蛋白标准品进行纯化。通过蛋白质印迹鉴定的蛋白的大小与将该蛋白导入叶绿体中、并且在或邻近预测的切割位点处在ChlamySSU CTP内对CTP/GRG-8蛋白进行加工的情况一致。
实施例8 对表达衣藻SSU-GRG8蛋白的玉米植物的草甘膦耐受性的 评估
将表达衣藻SSU-GRG8蛋白的转基因玉米转植项的草甘膦喷洒耐受性与几种非转基因T0对照植物进行比较。将单独的植物转移到温室并且平地生长10天。10天后，将浓度约1x大田喷洒比率(7mM添加有作为表面活性剂的0.1％吐温20)的草甘膦施用于平地上。使用喷雾台来施用草甘膦从而允许将该除草剂一致地施用到单独的植物上。3周后对植物进行评价以确定是否这些植物耐受该草甘膦喷雾(大部分绿色叶子材料：＜50％损害)或不耐受该草甘膦喷雾(＞75％损害，或植物死亡)。该转基因植物显示了对草甘膦的耐受性，然而每一对照植物均没有显示出抗性。
实施例9 将来自非植物物种的转运肽融合到异源蛋白上，并且在单 子叶植物中正确地定位和切割：在单子叶植物中衣藻EPSPS CTP起作用
从公共数据库得到对于衣藻EPSPS前体的DNA以及氨基酸序列。基于这些蛋白序列与来自细菌、真菌以及酵母的EPSPS蛋白的比对，对该转运肽的切割位点进行预测。构建了合成的基因，该基因编码从氨基端蛋氨酸至所预测的切割位点的CTP。连接该DNA从而生成与合成的GRG-23(ace3)(R173K)基因(美国专利申请公开号20080127372)的起始密码子的框内的融合物。然后将该CTP-GRG-23(ace3)(R173K)盒连接到植物转化载体中。
设计了多种DNA构建体从而使得到的蛋白在N端编码衣藻EPSPS(“ChlamyEPSPS”)转运肽，随后融合到对细胞提供除草剂抗性的蛋白上(GRG-23(ace3)(R173K))。
这些DNA分子是合成制造的(Menlo Park，CA的DNA 2.0)。提供了包含该构建体的区域的DNA序列，为SEQ ID NO：15，并且提供了生成的氨基酸序列，为SEQ ID NO：16。
这些DNA构建体包含(从5’至3’)(1)Pst I克隆位点，(2)提供用于有效翻译的“Kozak”环境的碱基ACC，(3)对氨基末端蛋氨酸至ChlamyEPSPS的已知转运肽切割位点进行编码的基因部分，并且包括对C端至切割位点的氨基酸进行编码的小的DNA区域，(4)感兴趣的基因的编码区(在这个情况下是GRG-23(ace3)(R173K))。
将这种衣藻EPSPS CTP/GRG-23(ace3)(R173K)构建体设计到用于农杆菌介导的玉米胚的转化的载体中，并且鉴定这些转基因转植项。
通过PCR分析这些T0转化的植物以确定该构建体存在于这些玉米系中，并且然后将这些T0植物与非转基因系进行异型杂交从而生成半合子的T1子代。得到的T1转基因植物对于喷射施用的草甘膦是耐受的(与非转基因的对照进行比较)。来自转基因玉米植物的叶组织的蛋白质印迹发现表达该衣藻EPSPS CTP/GRG-23(ace3)(R173K)蛋白。在植物组织中检测到的蛋白小于全长衣藻EPSPS-GRG-23(ace3)(R173K)蛋白，并且大小类似于天然GRG-23(ace3)(R173K)蛋白(图2)。衣藻EPSPSCTP/GRG-23(ace3)(R173K)蛋白的提供除草剂抗性的能力以及在除草剂抗性植物中得到的成熟GRG-23(ace3)(R173K)蛋白的大小这两者都与将该蛋白导入叶绿体、并且在或邻近切割位点处加工衣藻EPSPSCTP/GRG-23(ace3)(R173K)蛋白的情况一致。
实施例10 在玉米中表达的衣藻EPSPS-GRG-23(ace3)(R173K)蛋 白的分子量分析。
从表达衣藻EPSPS-GRG-23(ace3)(R173K)蛋白的转基因玉米系的蛋白质印迹，绘出蛋白分子量标准品的迁移距离从而生成对数分子量对迁移距离的线性图(图3)。使用该图的线性回归方程式来计算GRG23(ace3)(R173K)蛋白标准品的表观分子量(图2，泳道8)以及植物提取物中所检测到的加工的衣藻EPSPS-GRG-23(ace3)(R173K)蛋白的表观分子量。通过这种方法，测定该纯化的GRG23(ace3)(R173K)蛋白的表观分子量为45,347克/摩尔，并且测定加工的衣藻EPSPS-GRG-23(ace3)(R173K)(泳道6，迁移距离＝48.5mm)的表观分子量为46,227克/摩尔。这些加工的蛋白的所估计的分子量与在衣藻CTP与GRG-23(ace3)(R173K)连接处的上游处对衣藻CTP的几个氨基酸进行加工的情况一致(估计GRG23(ace3)(R173K)的分子量为45,570克/摩尔)。通过蛋白质印迹检测到没有蛋白大小与未加工的衣藻EPSPS-GRG-23(ace3)(R173K)蛋白(MW＝52,012克/摩尔)一致。因此，衣藻EPSPS CTP是在玉米中在衣藻CTP内的分离的识别位点处进行加工的。通过本领域中已知的方法对该蛋白进行纯化以及N端氨基酸分析将允许毫无疑义的确定衣藻CTP内的精确的切割位点。
实施例11 双子叶植物中藻类CTP序列的评估
为了对藻类叶绿体CTP在双子叶植物细胞中起作用的能力进行评估，将衣藻AHAS叶绿体CTP(SEQ ID NO：3)框内置于TagGFP基因(俄国莫斯科Evrogen)的5’。对照载体包含无叶绿体转运肽的TagGFP基因。将该ChlamyAHAS CTP构建体(pAX3517)与对照构建体(pAX3521)进行组织以起始从拟南芥UBQ3启动子开始的转录(Norris等人，1993，Plant Molecular Biology 21：895-906)。构建体利用35S或PinII转录终止子。
在聚乙二醇介导的烟草原生质体转化实验中使用约十二微克的每个纯化的质粒。转化之后，将这些原生质体在生长箱中在25℃孵化23小时。在倒置荧光显微镜下监测瞬时表达后TagGFP蛋白的表达以及定位。
仅在原生质体的细胞质中检测到表达无叶绿体CTP的TagGFP的构建体。然而，衣藻AHAS CTP构建体正确地将TagGFP递送到叶绿体中，导致在这些原生质体的叶绿体中荧光的积聚(图1)。
实施例12 大豆细胞中藻类CTP序列的评估
为了对藻类叶绿体CTP在大豆细胞中起作用的能力进行评估，将ChlamyAHAS CTP构建体(pAX3517)、ChlamyEPSPS构建体(pAX4562)、以及包含无叶绿体转运肽的TagGFP基因的对照构建体(pAX3521)用于聚乙二醇介导的大豆原生质体的转化中。在倒置荧光显微镜下监测瞬时表达后TagGFP蛋白的表达以及定位。
对于缺少叶绿体CTP的对照构建体，仅在细胞质中观察到TagGFP荧光。类似地，从两个独立的表达具ChlamyEPSPS叶绿体CTP的TagGFP的构建体在叶绿体中没有观察到表达。然而，在已经用ChlamyAHAS叶绿体CTP构建体转化的原生质体的叶绿体中检测到TagGFP。因此，该CTP在大豆以及烟草细胞中起作用。
表2.在双子叶植物细胞中藻类叶绿体CTP连接的蛋白的定位。
表3.植物细胞中衣藻CTP的功能的总结
在本说明书中提及的所有公开文件以及专利申请都是表示本发明涉及的领域的普通技术人员的技术水平。所有公开文件以及专利申请都通过引用以就像各单独的公开文件或专利申请被确切地并且个别地指出通过引用被并入本文的相同的程度并入本文作为参考。
虽然以上专利已经通过出于清楚理解的目的的说明和举例的方式进行了一些详细的描述，应该清楚的是在随附的权利要求的范围内可以进行某些改变以及变更。

Claims (10)

1.制备转基因植物的方法，所述方法包括：在植物细胞中引入稳定地掺入到其基因组中的表达盒和从所述植物细胞再生转化的植物，其中所述表达盒包含对叶绿体转运肽(CTP)进行编码的核苷酸序列，其中对所述CTP进行编码的所述核苷酸序列被可操作地连接到感兴趣的核苷酸序列上，并且其中对所述CTP进行编码的所述核苷酸序列是编码SEQ ID NO:3所列出的氨基酸序列的核苷酸序列。
2.权利要求1所述的方法，其中对所述CTP进行编码的所述核苷酸序列是SEQ ID NO:1或2中所列出的核苷酸序列。
3.权利要求1或2所述的方法，其中所述转基因植物是单子叶植物。
4.权利要求1或2所述的方法，其中所述转基因植物是双子叶植物。
5.权利要求1或2所述的方法，其中感兴趣的核苷酸序列编码基因产物，该基因产物提供除草剂抗性、病原体抗性或昆虫抗性。
6.用于在植物中表达感兴趣的核苷酸序列的方法，所述方法包括：
a)将表达盒引入到植物细胞中，该表达盒包含对叶绿体转运肽(CTP)进行编码的核苷酸序列，其中对所述CTP进行编码的所述核苷酸序列被可操作地连接到感兴趣的所述核苷酸序列上，并且其中对所述CTP进行编码的所述核苷酸序列是编码SEQ ID NO:3所列出的氨基酸序列的核苷酸序列；和
b)从所述植物细胞再生转化的植物；其中所述植物具有稳定地掺入到其基因组中的所述表达盒。
7.权利要求6所述的方法，其中对所述CTP进行编码的所述核苷酸序列是SEQ ID NO:1或2中所列出的核苷酸序列。
8.权利要求6或7所述的方法，其中所述植物是双子叶植物。
9.权利要求6或7所述的方法，其中所述植物是单子叶植物。
10.权利要求6或7所述的方法，其中感兴趣的所述核苷酸序列编码基因产物，该基因产物提供除草剂抗性或害虫抗性。
CN200980134479.5A 2008-09-08 2009-09-08 用于在植物中表达异源核苷酸序列的组合物和方法 Expired - Fee Related CN102144034B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US9513408P 2008-09-08 2008-09-08
US61/095,134 2008-09-08
PCT/US2009/056165 WO2010028331A1 (en) 2008-09-08 2009-09-08 Compositions and methods for expression of a heterologous nucleotide sequence in plants

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN102144034A CN102144034A (zh) 2011-08-03
CN102144034B true CN102144034B (zh) 2014-11-26

Family

ID=41383406

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN200980134479.5A Expired - Fee Related CN102144034B (zh) 2008-09-08 2009-09-08 用于在植物中表达异源核苷酸序列的组合物和方法

Country Status (12)

Country Link
US (2) US8426204B2 (zh)
EP (1) EP2334795B1 (zh)
CN (1) CN102144034B (zh)
AR (1) AR073555A1 (zh)
AU (1) AU2009289505B2 (zh)
BR (1) BRPI0918617A2 (zh)
CA (1) CA2736244C (zh)
ES (1) ES2480665T3 (zh)
MX (1) MX2011002477A (zh)
PL (1) PL2334795T3 (zh)
WO (1) WO2010028331A1 (zh)
ZA (1) ZA201101693B (zh)

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2736244C (en) * 2008-09-08 2018-01-16 Athenix Corp. Compositions and methods for expression of a heterologous nucleotide sequence in plants comprising a chloroplast targeting peptide (ctp)
AU2009333021B2 (en) * 2008-12-31 2015-09-10 Sapphire Energy, Inc. Genetically engineered herbicide resistant algae
US9994863B2 (en) * 2011-07-28 2018-06-12 Genective Glyphosate tolerant corn event VCO-O1981-5 and kit and method for detecting the same
US9540654B2 (en) * 2012-02-01 2017-01-10 Dow Agrosciences Llc Synthetic brassica-derived chloroplast transit peptides
AU2013205557B2 (en) 2012-04-17 2016-04-21 Corteva Agriscience Llc Synthetic brassica-derived chloroplast transit peptides
MX2018001867A (es) * 2015-08-20 2018-06-19 Dow Agrosciences Llc Peptidos de transito al cloroplasto.
WO2017044372A1 (en) * 2015-09-11 2017-03-16 AgBiome, Inc. Chloroplast transit peptides and methods of their use
CN105586353A (zh) * 2016-01-29 2016-05-18 四川天豫兴禾生物科技有限公司 抗草甘膦epsps基因的筛选方法及其应用
AR109844A1 (es) 2016-10-27 2019-01-30 Syngenta Participations Ag Proteínas insecticidas
EP3708669A1 (en) 2019-03-13 2020-09-16 Genective Pesticidal genes and methods of use

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008039450A2 (en) * 2006-09-25 2008-04-03 James Weifu Lee Designer organisms for photosynthetic production of ethanol from carbon dioxide and water

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5380831A (en) 1986-04-04 1995-01-10 Mycogen Plant Science, Inc. Synthetic insecticidal crystal protein gene
US20010003849A1 (en) 1989-08-07 2001-06-14 Kenneth A. Barton Expression of genes in plants
US6803499B1 (en) * 1989-08-09 2004-10-12 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof
UA48104C2 (uk) 1991-10-04 2002-08-15 Новартіс Аг Фрагмент днк, який містить послідовність,що кодує інсектицидний протеїн, оптимізовану для кукурудзи,фрагмент днк, який забезпечує направлену бажану для серцевини стебла експресію зв'язаного з нею структурного гена в рослині, фрагмент днк, який забезпечує специфічну для пилку експресію зв`язаного з нею структурного гена в рослині, рекомбінантна молекула днк, спосіб одержання оптимізованої для кукурудзи кодуючої послідовності інсектицидного протеїну, спосіб захисту рослин кукурудзи щонайменше від однієї комахи-шкідника
TW261517B (zh) 1991-11-29 1995-11-01 Mitsubishi Shozi Kk
US6091002A (en) * 1996-03-13 2000-07-18 Monsanto Company Polyhydroxyalkanoates of narrow molecular weight distribution prepared in transgenic plants
US6570005B1 (en) 1996-07-01 2003-05-27 Mycogen Corporation Toxins active against pests
US6906245B1 (en) * 1998-04-30 2005-06-14 Sumitomo Chemical Company, Limited Method for producing transgenic plants resistant to weed control compounds which disrupt the porphyrin pathways of plants
AU2001287862B2 (en) 2000-09-29 2006-12-14 Syngenta Limited Herbicide resistant plants
EP1490494A1 (en) 2002-04-01 2004-12-29 Walter Reed Army Institute of Research Method of designing synthetic nucleic acid sequences for optimal protein expression in a host cell
WO2006015376A2 (en) 2004-08-04 2006-02-09 Basf Plant Science Gmbh Monocot ahass sequences and methods of use
WO2008021543A2 (en) * 2006-08-17 2008-02-21 Monsanto Technology, Llc Transgenic plants with enhanced agronomic traits
EP2201030A2 (en) * 2007-10-16 2010-06-30 Athenix Corporation Axmi-066 and axmi-076: delta-endotoxin proteins and methods for their use
CA2736244C (en) * 2008-09-08 2018-01-16 Athenix Corp. Compositions and methods for expression of a heterologous nucleotide sequence in plants comprising a chloroplast targeting peptide (ctp)

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008039450A2 (en) * 2006-09-25 2008-04-03 James Weifu Lee Designer organisms for photosynthetic production of ethanol from carbon dioxide and water

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ACCESSION NO:O22547;Funke R.P et al;《EBI》;19980101 *
Funke R.P et al.ACCESSION NO:O22547.《EBI》.1998, *

Also Published As

Publication number Publication date
WO2010028331A1 (en) 2010-03-11
US20130198903A1 (en) 2013-08-01
AU2009289505B2 (en) 2014-01-09
ZA201101693B (en) 2013-06-26
PL2334795T3 (pl) 2014-09-30
ES2480665T3 (es) 2014-07-28
CA2736244A1 (en) 2010-03-11
MX2011002477A (es) 2011-07-28
BRPI0918617A2 (pt) 2015-08-25
EP2334795A1 (en) 2011-06-22
US20100071090A1 (en) 2010-03-18
AR073555A1 (es) 2010-11-17
US8426204B2 (en) 2013-04-23
AU2009289505A1 (en) 2010-03-11
CN102144034A (zh) 2011-08-03
CA2736244C (en) 2018-01-16
EP2334795B1 (en) 2014-04-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102144034B (zh) 用于在植物中表达异源核苷酸序列的组合物和方法
CN1745173B (zh) 能赋予除草剂抗性的基因
CA2678603C (en) Chloroplast transit peptides for efficient targeting of dmo and uses thereof
CA2997793C (en) Plant regulatory elements and uses thereof
JP6463724B2 (ja) 構成ダイズプロモーター
CA2348755A1 (en) Polypeptide compositions toxic to diabrotica insects, obtained from bacillus thuringiensis; cryet70, and methods of use
CA2654812A1 (en) Grg33, grg35, grg36, grg37, grg38, grg39, and grg50: novel epsp synthase genes conferring herbicide resistance
CN104812901A (zh) 赋予植物抗病性的组合物和系统及其使用方法
US20150096070A1 (en) Chimeric promoters and their uses in plants
US7317146B2 (en) Production of cereal grain with reduced starch granule size and uses thereof
WO2009129162A2 (en) Methods and compositions for increasing plant disease resistance and yield
EP1869188B1 (en) Cis-acting regulatory elements from tripsacum dactyloides
WO2006023560A2 (en) Eukaryotic translation initiation factor gene regulatory elements for use in plants
CA2452131C (en) Use of untranslated region of osmotin gene to enhance transgene expression in plants
US20110023179A1 (en) Plastid transit peptides derived from lower photosynthetic eukaryotes and methods
CN116635522A (zh) 新型羟基苯丙酮酸双加氧酶多肽及其使用方法
KR20160025822A (ko) 식물의 질소 이용 능력을 향상시키는 벼 유래 OsNRT1 유전자 및 이의 용도
AU2016203332A1 (en) Compositions and methods for expression of a heterologous nucleotide sequence in plants
AU2013203394A1 (en) Compositions and methods for expression of a heterologous nucleotide sequence in plants
KR20160025824A (ko) 식물의 질소 이용 능력을 향상시키는 벼 유래 OsNRT4 유전자 및 이의 용도
BR112015022495B1 (pt) Promotores de feijão-soja constitutivos

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
TR01 Transfer of patent right
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20200323

Address after: New jersey, USA

Patentee after: BASF Agricultural Solutions Seeds US LLC

Address before: Ludwigshafen, Germany

Patentee before: BASF SE

Effective date of registration: 20200323

Address after: Ludwigshafen, Germany

Patentee after: BASF SE

Address before: North Carolina, USA

Patentee before: ATHENIX Corp.

CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20141126

Termination date: 20210908