KR20160025824A

KR20160025824A - 식물의 질소 이용 능력을 향상시키는 벼 유래 OsNRT4 유전자 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20160025824A
Application number: KR1020140113181A
Authority: KR
Inventors: 김도훈; 양원태
Original assignee: 동아대학교 산학협력단
Priority date: 2014-08-28
Filing date: 2014-08-28
Publication date: 2016-03-09

Abstract

본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 벼 유래의 질소 수송체 유전자 OsNRT4 (Oryza sativa nitrate transporter 4), OsNRT4 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 비형질전환체에 비해 식물체의 질소 이용 능력을 증가시키는 방법, OsNRT4 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환하여 비형질전환체에 비해 식물체의 질소 이용 능력이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법, 상기 방법에 의해 제조된 비형질전환체에 비해 식물체의 질소 이용 능력이 증가된 형질전환 식물체 및 이의 종자 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 OsNRT4 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는, 식물체의 질소 이용 능력을 증가시키기 위한 조성물에 관한 것이다.

Description

식물의 질소 이용 능력을 향상시키는 벼 유래 OsNRT4 유전자 및 이의 용도{OsNRT4 gene from Oryza sativa for improving nitrogen availability of plant and uses thereof}

본 발명은 식물의 질소 이용 능력을 향상시키는 벼 유래 OsNRT4 유전자 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 벼 유래의 질소 수송체 유전자 OsNRT4 (Oryza sativa nitrate transporter 4), OsNRT4 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 비형질전환체에 비해 식물체의 질소 이용 능력을 증가시키는 방법, OsNRT4 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환하여 비형질전환체에 비해 식물체의 질소 이용 능력이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법, 상기 방법에 의해 제조된 비형질전환체에 비해 식물체의 질소 이용 능력이 증가된 형질전환 식물체 및 이의 종자 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 OsNRT4 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는, 식물체의 질소 이용 능력을 증가시키기 위한 조성물에 관한 것이다.

식물의 생장과 발달에 가장 중요한 필수영양소인 질소는 식물의 건물중 당 2-4% 비율을 차지하고 있으며, 아미노산, 단백질, 핵산, 효소 등의 유기화합물의 구성 성분이기 때문에 인산과 함께 식물체가 가장 많이 필요로 하는 영양원소이다. 세계적으로 매년 약 10억 톤 가량의 질소비료가 작물재배에 투입되고 있으나, 비료 성분 중 질소가 가장 비싼 영양성분이기 때문에 투입되는 비료의 양은 곧 농업 생산 비용을 증가시키는 원인이 된다. 뿐만 아니라 비료의 과다 사용으로 인해 미쳐 흡수되지 못한 비료는 유실되어 흙이나 강물의 오염원이 되고, 과도하게 사용될 경우 불완전 환원으로 지구 온난화의 원인이 되는 일산화질소(NO)를 생산한다. 농업환경의 오염은 농산물 생산에 있어서 양적 및 질적 저하를 가져올 뿐만 아니라, 생활 환경도 오염시켜 국민 건강을 위협하므로 그 오염원의 제거는 매우 중요한 문제이다. 이러한 문제는 투입되는 비료의 양을 줄임으로써 해결할 수 있는데, 이러한 문제의 근본적인 해결 방안은 식물의 질소 흡수력을 향상시킴으로써 비료의 사용량을 줄이는 것이다. 따라서 질소 결핍 조건에서도 효율적으로 생장 가능한 작물의 개발이 요구되고 있다. 질산(nitric acid)은 식물의 주된 질소원으로서 뿌리를 통해서 흡수된 후 질산환원효소(nitrate reductase)의 활성에 의해서 아질산(nitrous acid)으로 환원되고, 연속적으로 아질산환원효소(nitrite reductase)의 활성에 의해 암모늄으로 환원되어 핵산과 단백질을 포함한 식물생장에 필요한 다양한 대사물질로 동화된다. 질소가 결핍된 조건에서 식물은 고친화성 질소수송체, 환원에 관여하는 질산 및 아질산환원효소 등 질산 동화에 관여하는 유전자의 발현을 유도한다.

본 발명은 질소 결핍 조건에서 발현하여 질소 이용 효율을 증진시켜주는 기능을 가진 것으로 알려져 있는 벼의 질소 수송체 유전자의 기능을 분석하고, 질소결핍 조건에도 적응할 수 있는 식물체를 개발하는 것이다.

한편, 한국등록특허 제1302375호에는 'AtSIZI 유전자를 이용한 식물의 질소 동화 및 질병 내성을 조절하는 방법'이 개시되어 있으나, 본 발명의 식물의 질소 이용 능력을 향상시키는 벼 유래 NRT4 유전자 및 이의 용도에 대해서는 기재된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 벼의 게노믹 DNA를 분리하고 PCR 방법을 이용하여 질소 수송체 유전자인 OsNRT4을 클로닝하고, 상기 OsNRT4 유전자를 과발현시킨 형질전환 식물체를 제조하여 야생형과 그 생육상태를 비교한 결과, OsNRT4을 과발현하는 형질전환 벼 및 애기장대 식물체가 비형질전환 야생형 식물체에 비해 질소 결핍 조건에서 그 생육이 우수한 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 벼 유래의 질소 수송체 유전자 OsNRT4 (Oryza sativa nitrate transporter 4)을 제공한다.

또한, 본 발명은 벼 유래의 질소 수송체 OsNRT4 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 비형질전환체에 비해 식물체의 질소 이용 능력을 증가시키는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 벼 유래의 질소 수송체 OsNRT4 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환하여 비형질전환체에 비해 식물체의 질소 이용 능력이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 비형질전환체에 비해 식물체의 질소 이용 능력이 증가된 형질전환 식물체 및 이의 종자를 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 OsNRT4 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는, 식물체의 질소 이용 능력을 증가시키기 위한 조성물을 제공한다.

본 발명의 OsNRT4 유전자는 식물체의 질소 이용 능력을 향상시켜 질소가 결핍된 조건에서도 식물 생육이 가능하게 하였다. 따라서, 상기 유전자를 이용하여 생명공학적 방법으로 질소 이용 능력이 향상된 새로운 작물의 개발이 가능하므로, 새로운 식물 품종 개발 분야 등에 유용하게 이용될 수 있을 것이다.

도 1은 동진벼를 이용하여 질소 결핍 조건에서 OsNRT4 유전자의 발현 양상을 조사한 것으로, 질소 충분 및 결핍 조건을 줄기와 뿌리 부위별로 실험한 결과를 나타내는 것과(A), 질소 외 다른 영양 결핍 조건에서의 OsNRT4 유전자의 발현 양상을 나타낸 것이다(B). S+, 질소 충분 조건에서의 줄기; S-, 질소 결핍 조건에서의 줄기; R+, 질소 충분 조건에서의 뿌리; R-, 질소 결핍 조건에서의 뿌리; Full, 완전 영양 조건; -N, 질소 결핍 조건; -P, 인산 결핍 조건; -K, 칼륨 결핍 조건; -Fe, 철 결핍 조건.
도 2는 야생형 벼를 이용하여 질소 결핍 조건에서 줄기와 뿌리를 통한 시간별 OsNRT4 유전자의 발현 양상을 조사한 결과로, (A)는 줄기 (B)는 뿌리에서의 결과를 나타낸다.
도 3은 OsNRT4 유전자로 형질전환된 벼와 애기장대 식물체의 PCR 결과(각각 A와 C), 노던(Northern) 결과(각각 B와 D)를 보여주는 결과이다. OsNRT4-OX: OsNRT4 유전자 과발현 벼 식물체, AtNRT4-OX: OsNRT4 유전자 과발현 애기장대 식물체, WT: 야생형 식물체.
도 4는 야생형 식물체와 OsNRT4 과발현 형질전환 벼(A) 및 애기장대(C) 식물체를 이용하여 질소 충분 및 결핍 조건에서의 생육 상태를 확인한 결과이다. (B)는 야생형과 OsNRT4 과발현 형질전환 벼 식물체에서 질소 충분과 결핍 조건에서의 줄기의 초장과 뿌리의 길이를 통한 생장 측정을 한 결과이며, (D)는 야생형과 OsNRT4 과발현 형질전환 애기장대 식물체에서 질소 충분과 결핍 조건에서의 뿌리의 길이와 생체중을 통한 생장 상태를 측정한 결과이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 벼 유래의 질소 수송체 유전자 OsNRT4 (Oryza sativa nitrate transporter 4)을 제공한다.

본 발명의 상기 OsNRT4 유전자는 바람직하게는 서열번호 1의 염기서열로 이루어질 수 있다. 또한, 상기 염기 서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 벼 유래의 질소 수송체 OsNRT4 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 OsNRT4 단백질 코딩 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 비형질전환체에 비해 식물체의 질소 이용 능력을 증가시키는 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 OsNRT4 단백질의 범위는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 2로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. "실질적으로 동질의 생리활성"이란 비형질전환체에 비해 식물체의 질소 이용 능력을 증가시키는 활성을 의미한다.

용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

본 발명에서, 상기 OsNRT4 유전자 서열은 재조합 발현 벡터 내로 삽입될 수 있다. 용어 "재조합 발현 벡터"는 세균 플라스미드, 파아지, 효모 플라스미드, 식물 세포 바이러스, 포유동물 세포 바이러스, 또는 다른 벡터를 의미한다. 대체로, 임의의 플라스미드 및 벡터는 숙주 내에서 복제 및 안정화할 수 있다면 사용될 수 있다. 상기 발현 벡터의 중요한 특성은 복제 원점, 프로모터, 마커 유전자 및 번역 조절 요소(translation control element)를 가지는 것이다.

OsNRT4 유전자 서열 및 적당한 전사/번역 조절 신호를 포함하는 발현 벡터는 당업자에 주지된 방법에 의해 구축될 수 있다. 상기 방법은 시험관 내 재조합 DNA 기술, DNA 합성 기술 및 생체 내 재조합 기술 등을 포함한다. 상기 DNA 서열은 mRNA 합성을 이끌기 위해 발현 벡터 내의 적당한 프로모터에 효과적으로 연결될 수 있다. 또한 발현 벡터는 번역 개시 부위로서 리보좀 결합 부위 및 전사 터미네이터를 포함할 수 있다.

본 발명의 재조합 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터 (EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.

발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 것이다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 재조합 벡터에서, 프로모터는 CaMV, 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "지속적(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 지속적 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 지속적 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.

본 발명의 재조합 벡터에서, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알려져 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.

식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및(또는) 조직 배양기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens, F.A. et al., 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al., June 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373), 원형질체의 전기천공법(Shillito R.D. et al., 1985 Bio/Technol. 3, 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 179-185), 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein T.M. et al., 1987, Nature 327, 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 투머파시엔스 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0 301 316호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다. 특히 바람직한 것은 EP A 120 516호 및 미국 특허 제4,940,838호에 기재된 바와 같은 소위 이원 벡터 기술을 이용하는 것이다.

또한, 본 발명은

벼 유래의 질소 수송체 OsNRT4 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환하는 단계; 및

상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 비형질전환체에 비해 식물체의 질소 이용 능력이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 OsNRT4 단백질의 범위는 전술한 바와 같다.

본 발명의 방법은 본 발명에 따른 재조합 벡터로 식물 세포를 형질전환하는 단계를 포함하는데, 상기 형질전환은 예를 들면, 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefiaciens)에 의해 매개될 수 있다. 또한, 본 발명의 방법은 상기 형질전환된 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함한다. 형질전환 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다.

형질전환된 식물세포는 전식물로 재분화되어야 한다. 캘러스 또는 원형질체 배양으로부터 성숙한 식물의 재분화를 위한 기술은 수많은 여러 가지 종에 대해서 당업계에 주지되어 있다.

본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 식물체는 애기장대, 감자, 가지, 담배, 고추, 토마토, 우엉, 쑥갓, 상추, 도라지, 시금치, 근대, 고구마, 샐러리, 당근, 미나리, 파슬리, 배추, 양배추, 갓무, 수박, 참외, 오이, 호박, 박, 딸기, 대두, 녹두, 강낭콩, 완두 등의 쌍자엽 식물 또는 벼, 보리, 밀, 호밀, 옥수수, 사탕수수, 귀리, 양파 등의 단자엽 식물일 수 있으며, 바람직하게는 쌍자엽 또는 단자엽 식물일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 애기장대 또는 벼 식물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 OsNRT4 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는, 식물체의 질소 이용 능력을 증가시키기 위한 조성물을 제공한다. 본 발명의 상기 조성물은 유효성분으로 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 OsNRT4 단백질을 코딩하는 유전자를 함유하며, 상기 유전자를 식물체에 형질전환시킴으로써 식물체의 질소 이용 능력을 증가시킬 수 있는 것이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. OsNRT4 유전자의 동정 및 분리

우리나라 재배 품종인 동진벼의 게노믹 DNA를 분리하여 벼의 전체 유전체 염기서열을 토대로 벼 유래의 질소 수송체 유전자(OsNRT4, Oryza sativa nitrate transporter 4)에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프라이머 (정방향 프라이머 5'-CACCATGGAGGCTAAGCCGGTGGCG-3' (서열번호 3) 및 역방향 프라이머 5'-TCACACCCCCGGCCGGCGACGC-3' (서열번호 4))를 제작하였고, PCR 방법을 이용하여 유전자의 코딩 영역을 증폭하였다. 증폭된 산물을 pEntr 벡터에 클로닝하여 시퀀싱을 통해 유전자의 염기서열을 확인하였다.

실시예 2. OsNRT4 유전자의 발현 양상 분석

OsNRT4 유전자의 발현 양상을 확인하기 위해서, 동진벼를 2주간 수경재배하여, 질소 충분 조건(200mM Ca(NO₃)₂·4H₂O)과 결핍 조건(0.25mM Ca(NO₃)₂·4H₂O) 처리를 한 호글랜드 용액(Hogland solution; 200mM Ca(NO₃)₂·4H₂O, 2.5mM K₂SO₄, 2mM MgSO₄·7H₂O, 0.5mM KH₂PO₄, 9mM KCl, 0.25mM MnSO₄, 0.25mM H₃BO₃, 0.25mM ZnSO₄, 0.25mM CuSO₄, 0.25mM Na₂MoO₄, 20mM Fe-Sequestrate 및 0.5mM K₂SO₄, pH 5.5)에서 각각 7일간 배양하고 트리졸 시약(Invitrogen, 미국)을 이용하여 총 RNA를 분리하였다. 20㎍의 RNA를 1.2%(w/v) 변성 포름알데히드 아가로스 겔(denaturing formaldehyde agarose gel)에서 전기 영동하여 나일론 멤브레인(Amersham, 영국)에 RNA를 부착시켰다. RNA가 부착된 나일론 멤브레인은 [³²P]dCTP로 표지된 프로브를 20%(w/v) SDS, 20X SSPE, 100g/L PEG(8,000mwt), 250mg/L 헤파린 및 10ml/L Hering sperm DNA(10mg/ml)가 포함된 용액과 함께 65℃에서 하루 밤 동안 반응시켜 유전자의 발현 양상을 확인하였다. 그 결과, 동진벼에서의 OsNRT4 유전자의 발현은 질소 결핍(0.25mM Ca(NO₃)₂·4H₂O) 조건에서 뿌리 부위에서 강하게 발현 유도되는 것을 확인하였다(도 1A). 또한, 벼의 생육에 많은 영향을 미치는 질소, 인산, 칼륨과 철 결핍처리를 하여 발현양을 확인한 결과 OsNRT4 유전자는 질소 결핍 조건과 철 결핍 조건에서 강하게 발현되었으나, 질소 결핍 조건에서의 발현양이 가장 높은 것으로 확인되었다(도 1B).

동진벼에서 발현 양상을 기초로 동진벼를 2주간 수경재배를 한 후 질소 결핍(0.25mM Ca(NO₃)₂·4H₂O) 처리를 7일간 처리하여 OsNRT4 유전자의 식물체 내에서 조직 특이적인 발현을 조사한 결과, 줄기의 경우 질소 결핍 조건 초기부터 발현양이 증가하여 5일째 가장 강하게 발현하다 점자 감소한 반면, 뿌리의 경우는 질소 결핍 조건 초기부터 5일째까지 발현양이 비슷하였고, 7일째 가장 강하게 발현하는 양상을 보였다(도 2).

실시예 3. 형질전환 식물체의 제조 및 발현 분석

벼에서 분리한 질소 수송체 유전자(OsNRT4)의 식물체 내에서의 기능을 조사하기 위해 동진벼와 애기장대(Arabidopsis thalania)에 OsNRT4을 과발현하는 형질전환체를 만들었다. 그 방법은 간단하게, OsNRT4 유전자의 코딩 영역을 데스티네이션 벡터(destination vector; pH7WG2D,1)에 클로닝하여 OsNRT4 유전자가 항상 강하게 발현하는 CaMV 35S 프로모터에 의해서 조절되는 구조를 만들었고 triparental mating 방법으로 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) EHA105 균주로 옮겼다. 동진벼 캘러스에 상기 아그로박테리움 튜메파시엔스 EHA105 균주를 처리하여 벼 캘러스를 형질전환 하였다. 애기장대의 경우 동일한 방법으로 야생형(Col-0) 화기에 상기 OsNRT4 유전자를 포함하는 벡터가 포함된 아그로박테리움 튜메파시엔스 GV3301 균주를 사용하여 형질전환 하였다. T₀ 식물체에서 OsNRT4 유전자의 도입 여부와 유전자 발현량을 PCR 분석(도 3A 및 C)과 RNA 블랏 방법(도 3B 및 D)으로 확인한 후에 형질전환체를 선발하였다.

실시예 4. OsNRT4 과발현 형질전환 식물체의 생육 분석

과발현 벼 식물체의 경우 수확한 종자를 대조군과 함께 2주간 수경재배 한 후, 질소 결핍(0.25mM Ca(NO₃)₂·4H₂O)과 충분(200mM Ca(NO₃)₂·4H₂O) 조건에서 7일간 처리하여 배양하면서 식물생육 상태를 야생형과 비교하였다. 질소 충분 조건에서는 형질전환체의 생육이 대조군인 야생형 식물체와 비교하여 줄기의 경우 생육이 더 좋았으나 뿌리의 경우 길이가 감소하였다. 질소 결핍 조건에서는 형질전환체의 생육이 대조군인 야생형 식물체와 비교하여 줄기와 뿌리 생육 모두 더 좋은 것을 확인하였다(도 4A). 정량적인 조사 결과에서도 야생형 식물체와 비교하여 형질전환체에서 질소 충분 및 결핍 조건에서 줄기의 경우 생육이 더 좋은 것을 확인하였고, 질소 충분 조건의 뿌리의 경우 야생형과 비슷하거나 약간 감소하였으나 결핍 조건에서는 뿌리 생장이 좋은 것을 확인하였다(도 4B). 과발현 애기장대 식물체의 경우 수확한 종자를 대조군과 함께 MS배지에 치상하고 5일후, 질소결핍(0.25mM NH₄NO₃, KNO₃)과 충분(200mM NH₄NO₃, KNO₃) 조건의 MS 배지(200mM NH₄NO₃, 200mM KNO₃, 3mM MgSO₄·7H₂O, 1.25mM KH₂PO₄, 6mM CaCl₂·2H₂O, 10mM Na₂-EDTA, 10mM FeSO₄·7H₂O, 1mM H₃BO₃, 1.5mM MnSO₄·4H₂O, 0.3mM ZnSO₄·7H₂O, 0.5mM KI, 10μM Na₂MoO₄·2H₂O, 55μM Myoinositol, 3μM Tiamin-HCl, 0.8μM Nicotinic acid, 0.5μM Pyridoxine HCl, 0.01μM CuSO₄·5H₂O, 0.01μM CoCl₂·6H₂O, 2.3mM MES, 1.2% Sucrose, 6% Agar; pH 5.7)로 옮겨 7일간 처리하여 배양하면서 생육 상태를 야생형과 비교하였다. 질소 충분 및 결핍 조건에서 형질전환체의 생육이 대조군인 야생형 식물체와 비교하여 더 좋은 것을 확인하였다(도 4C). 정량적인 조사 결과에서도 야생형 식물체와 비교하여 형질전환체에서 줄기와 뿌리생장이 좋은 것을 확인하였다(도 4D).

<110> Dong-A University Research Foundation For Industry-Academy Cooperation <120> OsNRT4 gene from Oryza sativa for improving nitrogen availability of plant and uses thereof <130> PN14212 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1551 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 1 atggaggcta agccggtggc gatggaggtg gagggggtcg aggcggcggg gggcaagccg 60 cggttcagga tgccggtgga ctccgacctc aaggcgacgg agttctggct cttctccttc 120 gcgaggccac acatggcctc cttccacatg gcgtggttct ccttcttctg ctgcttcgtg 180 tccacgttcg ccgcgccgcc gctgctgccg ctcatccgcg acaccctcgg gctcacggcc 240 acggacatcg gcaacgccgg gatcgcgtcc gtgtcgggcg ccgtgttcgc gcgtctggcc 300 atgggcacgg cgtgcgacct ggtcgggccc aggctggcct ccgcgtctct gatcctcctc 360 accacaccgg cggtgtactg ctcctccatc atccagtccc cgtcggggta cctcctcgtg 420 cgcttcttca cgggcatctc gctggcgtcg ttcgtgtcgg cgcagttctg gatgagctcc 480 atgttctcgg cccccaaagt ggggctggcc aacggcgtgg ccggcggctg gggcaacctc 540 ggcggcggcg ccgtccagct gctcatgccg ctcgtgtacg aggccatcca caagatcggt 600 agcacgccgt tcacggcgtg gcgcatcgcc ttcttcatcc cgggcctgat gcagacgttc 660 tcggccatcg ccgtgctggc gttcgggcag gacatgcccg gcggcaacta cgggaagctc 720 cacaagactg gcgacatgca caaggacagc ttcggcaacg tgctgcgcca cgccctcacc 780 aactaccgcg gctggatcct ggcgctcacc tacggctaca gcttcggcgt cgagctcacc 840 atcgacaacg tcgtgcacca gtacttctac gaccgcttcg acgtcaacct ccagaccgcc 900 gggctcatcg ccgccagctt cgggatggcc aacatcatct cccgccccgg cggcgggcta 960 ctctccgact ggctctccag ccggtacggc atgcgcggca ggctgtgggg gctgtggact 1020 gtgcagacca tcggcggcgt cctctgcgtg gtgctcggaa tcgtcgactt ctccttcgcc 1080 gcgtccgtcg ccgtgatggt gctcttctcc ttcttcgtcc aggccgcgtg cgggctcacc 1140 ttcggcatcg tgccgttcgt gtcgcggagg tcgctggggc tcatctccgg gatgaccggc 1200 ggcgggggca acgtgggcgc cgtgctgacg cagtacatct tcttccacgg cacaaagtac 1260 aagacggaga ccgggatcaa gtacatgggg ctcatgatca tcgcgtgcac gctgcccgtc 1320 atgctcatct acttcccgca gtggggcggc atgctcgtag gcccgaggaa gggggccacg 1380 gcggaggagt actacagccg ggagtggtcg gatcacgagc gcgagaaggg tttcaacgcg 1440 gccagcgtgc ggttcgcgga gaacagcgtg cgcgagggcg ggaggtcgtc ggcgaatggc 1500 ggacagccca ggcacaccgt ccccgtcgac gcgtcgccgg ccggggtgtg a 1551 <210> 2 <211> 516 <212> PRT <213> Oryza sativa <400> 2 Met Glu Ala Lys Pro Val Ala Met Glu Val Glu Gly Val Glu Ala Ala 1 5 10 15 Gly Gly Lys Pro Arg Phe Arg Met Pro Val Asp Ser Asp Leu Lys Ala 20 25 30 Thr Glu Phe Trp Leu Phe Ser Phe Ala Arg Pro His Met Ala Ser Phe 35 40 45 His Met Ala Trp Phe Ser Phe Phe Cys Cys Phe Val Ser Thr Phe Ala 50 55 60 Ala Pro Pro Leu Leu Pro Leu Ile Arg Asp Thr Leu Gly Leu Thr Ala 65 70 75 80 Thr Asp Ile Gly Asn Ala Gly Ile Ala Ser Val Ser Gly Ala Val Phe 85 90 95 Ala Arg Leu Ala Met Gly Thr Ala Cys Asp Leu Val Gly Pro Arg Leu 100 105 110 Ala Ser Ala Ser Leu Ile Leu Leu Thr Thr Pro Ala Val Tyr Cys Ser 115 120 125 Ser Ile Ile Gln Ser Pro Ser Gly Tyr Leu Leu Val Arg Phe Phe Thr 130 135 140 Gly Ile Ser Leu Ala Ser Phe Val Ser Ala Gln Phe Trp Met Ser Ser 145 150 155 160 Met Phe Ser Ala Pro Lys Val Gly Leu Ala Asn Gly Val Ala Gly Gly 165 170 175 Trp Gly Asn Leu Gly Gly Gly Ala Val Gln Leu Leu Met Pro Leu Val 180 185 190 Tyr Glu Ala Ile His Lys Ile Gly Ser Thr Pro Phe Thr Ala Trp Arg 195 200 205 Ile Ala Phe Phe Ile Pro Gly Leu Met Gln Thr Phe Ser Ala Ile Ala 210 215 220 Val Leu Ala Phe Gly Gln Asp Met Pro Gly Gly Asn Tyr Gly Lys Leu 225 230 235 240 His Lys Thr Gly Asp Met His Lys Asp Ser Phe Gly Asn Val Leu Arg 245 250 255 His Ala Leu Thr Asn Tyr Arg Gly Trp Ile Leu Ala Leu Thr Tyr Gly 260 265 270 Tyr Ser Phe Gly Val Glu Leu Thr Ile Asp Asn Val Val His Gln Tyr 275 280 285 Phe Tyr Asp Arg Phe Asp Val Asn Leu Gln Thr Ala Gly Leu Ile Ala 290 295 300 Ala Ser Phe Gly Met Ala Asn Ile Ile Ser Arg Pro Gly Gly Gly Leu 305 310 315 320 Leu Ser Asp Trp Leu Ser Ser Arg Tyr Gly Met Arg Gly Arg Leu Trp 325 330 335 Gly Leu Trp Thr Val Gln Thr Ile Gly Gly Val Leu Cys Val Val Leu 340 345 350 Gly Ile Val Asp Phe Ser Phe Ala Ala Ser Val Ala Val Met Val Leu 355 360 365 Phe Ser Phe Phe Val Gln Ala Ala Cys Gly Leu Thr Phe Gly Ile Val 370 375 380 Pro Phe Val Ser Arg Arg Ser Leu Gly Leu Ile Ser Gly Met Thr Gly 385 390 395 400 Gly Gly Gly Asn Val Gly Ala Val Leu Thr Gln Tyr Ile Phe Phe His 405 410 415 Gly Thr Lys Tyr Lys Thr Glu Thr Gly Ile Lys Tyr Met Gly Leu Met 420 425 430 Ile Ile Ala Cys Thr Leu Pro Val Met Leu Ile Tyr Phe Pro Gln Trp 435 440 445 Gly Gly Met Leu Val Gly Pro Arg Lys Gly Ala Thr Ala Glu Glu Tyr 450 455 460 Tyr Ser Arg Glu Trp Ser Asp His Glu Arg Glu Lys Gly Phe Asn Ala 465 470 475 480 Ala Ser Val Arg Phe Ala Glu Asn Ser Val Arg Glu Gly Gly Arg Ser 485 490 495 Ser Ala Asn Gly Gly Gln Pro Arg His Thr Val Pro Val Asp Ala Ser 500 505 510 Pro Ala Gly Val 515 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 caccatggag gctaagccgg tggcg 25 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 tcacaccccc ggccggcgac gc 22

Claims

서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 벼 유래의 질소 수송체 유전자 OsNRT4 (Oryza sativa nitrate transporter 4).
벼 유래의 질소 수송체 OsNRT4 (Oryza sativa nitrate transporter 4) 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 OsNRT4 단백질 코딩 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 비형질전환체에 비해 식물체의 질소 이용 능력을 증가시키는 방법.
제2항에 있어서, 상기 OsNRT4 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 식물체의 질소 이용 능력을 증가시키는 방법.
벼 유래의 질소 수송체 OsNRT4 (Oryza sativa nitrate transporter 4) 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환하는 단계; 및
상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 비형질전환체에 비해 식물체의 질소 이용 능력이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법.
제4항에 있어서, 상기 OsNRT4 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는식물체의 질소 이용 능력이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법.
제4항 또는 제5항의 방법에 의해 제조된 비형질전환체에 비해 식물체의 질소 이용 능력이 증가된 형질전환 식물체.
제6항에 있어서, 상기 식물체는 쌍자엽 또는 단자엽 식물인 것을 특징으로 하는 형질전환 식물체.
제6항에 따른 식물체의 종자.
서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 OsNRT4 (Oryza sativa nitrate transporter 4) 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는, 식물체의 질소 이용 능력을 증가시키기 위한 조성물.