CN102884195A - 调节植物中ω酰胺酶表达以增加植物生长 - Google Patents

调节植物中ω酰胺酶表达以增加植物生长 Download PDF

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Abstract

本公开涉及通过调节ω酰胺酶的水平以提高氮利用效率，来增加植物中所述信号代谢物2-氧代缩环戊酸单酰胺（2-oxoglutaramate）和相关脯氨酸分子的叶-根比率的组合物和方法，产生增强的生长、更快的生长速率、更多的种子和果实/荚产量，更早和更多产的开花，对高盐条件的耐受性增加和提高的生物量产量。

Description

调节植物中ω酰胺酶表达以增加植物生长
相关申请
本申请要求2010年2月28日提交的美国临时专利申请第61/308,971号的权益，其公开通过引用全文纳入本文。
联邦资助的研究或开发下完成发明的权利声明
本发明是在美国能源部授予洛斯阿拉莫斯国家安全有限公司（Los AlamosNational Security,LLC）的第DE-AC52-06NA25396合同号的政府资助下进行的。政府享有本发明的某些权利。
以ASCII文本文件提交序列表
下面以ASCII文本文件提交的内容通过引入全文纳入本文：序列表的计算机可读形式(CRF)(文件名：686522000440SEQLISTING.txt，记录日期：2011年2月28日，大小：158KB)。
技术背景
因为世界范围内人口增加并且可用耕地持续被毁坏或者被损坏，对更有效和可持续农业系统的需求是人类的重要利益。提高农作物产量，蛋白含量和植物生长速率代表了能应对现有挑战的更有效农业系统发展的主要目标。
近些年，由于很多发展良好的农作物的产量已经达到平台期，仅增加了改善作物生产技术的重要性。很多农业活动对时间敏感，成本和利润依赖于农作物的快速周转或上市时间。因此，快速农作物生长对很多涉及高价值作物（例如谷物、植物、浆果和其他水果）的农业企业是经济上重要的目标。
遗传工程改造在发展可持续农业技术上已经并且继续发挥越来越重要但是有争议的作用。近年来已经开发出很多遗传改良植物和相关技术，其中很多目前已广泛使用，(Factsheet：Genetically Modified Crops in the United States(情况说明书：美国的遗传改良农作物)，皮氏食品与生物科技资讯基金会（PewInitiative on Food and Biotechnology），2004年8月，http://pewagbiotech.org/resources/factsheets)。采用转基因植物变种目前非常重要并且呈上升趋势，2006年约2.5亿英亩种植转基因植物。
尽管接受转基因植物技术特别在美国、加拿大和澳大利亚逐渐增加，世界上很多地区特别是欧洲在接受农业遗传改良植物上仍然缓慢。因此，与遵循负责的和可持续农业的目标一致，对发展不向植物和/或环境引入毒素或其他潜在问题物质的遗传工程改造植物有强烈兴趣。对实现如提高除草剂耐受性、虫害和疾病抗性和整体农作物产量等目标的成本最小化也有强烈兴趣。因此，仍需要能符合这些目标的转基因植物。
通过对多个植物调节系统的很多研究寻求快速植物生长的目标，其中很多调节系统尚未完全理解。特别地，没有完全阐明协调碳和氮代谢的植物调节机制。假定这些调节机制对植物生长和发育有根本性影响。
光合生物中碳和氮的代谢必须以协调的方式调节以确保有效利用植物资源和能量。目前对碳和氮代谢的理解包含作为更大系统的子系统的一些步骤和代谢通路的细节。在光合生物中，碳代谢开始于CO2固定，其通过两个主要过程完成，名为C-3和C-4代谢。C-3代谢的植物中，酶核酮糖二磷酸羧化酶（RuBisCo）催化CO2和核酮糖二磷酸的组合以生成3-磷酸甘油酸，其是植物用于合成含碳化合物的三碳化合物(C-3)。C-4代谢的植物中，CO2和磷酸烯醇丙酮酸结合，在由酶磷酸烯醇丙酮酸羧化酶催化的反应中形成含4碳的酸(C-4)。所述酸转移到维管束鞘细胞，脱羧释放CO2，然后在与C-3植物使用的相同反应中结合核酮糖二磷酸。
许多研究发现多个代谢物在植物调节氮代谢中重要。这些化合物包含有机酸苹果酸和氨基酸谷氨酸和谷氨酰胺。通过光合生物经酶谷氨酰胺合成酶（GS）作用来进行氮同化，所述谷氨酰胺合成酶催化氨和谷氨酸结合形成谷氨酰胺。
通过催化添加氨到谷氨酸以在ATP依赖性反应中形成谷氨酰胺，GS对植物中氮同化起重要作用(Miflin和Habash，2002，Journal of ExperimentalBotany，第53卷第370期，第979-987页)。GS也再同化作为光呼吸和蛋白及氮运转化合物降解的结果而释放出的氨。GS酶可以分成两大类，一个代表胞质形式（GS1）而另一个代表质体（即叶绿体）形式（GS2）。
尽管报道不一致，前面的工作已经显示GS1表达水平增加造成GS活性和植物生长的水平增加。例如，Fuentes等报道CaMV S35启动子驱动的烟草中苜蓿（Alfalfa）GS1过表达(胞质形式)造成叶组织中GS表达和GS活性水平的增加，氮饥饿下的生长增加，但是对最优氮施肥条件下的生长没有影响(Fuentes等，2001，J.Exp.Botany 52:1071-81)。Temple等报道过量表达全长苜蓿GS1编码序列的转基因烟草植物包含水平大幅提高的GS转录物，和组装成活性酶的GS多肽，但是没有报道生长的表型效果(Temple等，1993,Molecular and General Genetics 236:315-325)。Corruzi等已经报道在CaMV S35启动子控制下过量表达豌豆胞质GS1转基因的转基因烟草显示GS活性增加，胞质GS蛋白增加和生长特性提高(美国专利号6,107,547)。Unkefer等更近期报道叶部组织中过量表达苜蓿GS1的转基因烟草植物按照通过自花授精实现GS1转基因拷贝数目增加的遗传分离就叶-根（leaf-to-root）GS活性增加进行筛选，发现所述转基因烟草植物在其叶部生成2-羟基-5-氧脯氨酸水平增加，发现引起生长率显著高于野生型烟草植物(见美国专利号6,555,500；6,593,275和6,831,040)。
Unkefer等进一步描述了使用2-羟基-5-氧脯氨酸(也称为2-氧代缩环戊酸单酰胺（2-oxoglutaramate）)提高植物生长(美国专利号6,555,500；6,593,275；6,831,040)。
特别地，Unkefer等公开了叶部组织中2-羟基-5-氧脯氨酸浓度的增加(相对于根组织)产生造成植物生长特性增加的级联事件。Unkefer等描述某些方法，所述方法可以增加2-羟基-5-氧脯氨酸的叶部浓度以引起植物生长特性的增加，特定通过向植物的叶部直接应用2-羟基-5-氧脯氨酸和优先在叶组织中过量表达谷氨酰胺合成酶。
发明内容
本发明是基于增加植物根组织中ω酰胺酶(Ω酰胺酶)表达造成植物的信号代谢物2-氧代缩环戊酸单酰胺和相关脯氨酸分子的叶-根比率增加的惊人发现。另外，植物根组织中ω酰胺酶表达的增加造成叶组织中ω酰胺酶表达的下降。有利地，调节植物中ω酰胺酶的表达产生氮利用效率提高的植物，进而造成生长和其他农艺学特性的提高，包含更快的生长速率，更多的种子和果实/荚产量，更早和更多产的开花，对高盐条件的耐受性增加和提高的生物量产量。
因此，本发明一方面涉及包含ω酰胺酶转基因的转基因植物，其中所述ω酰胺酶转基因与根优先性启动子操作性连接。
本发明的另一方面提供叶组织中内源性ω酰胺酶表达被抑制的转基因植物。
本发明的另一方面涉及使某一植物相对于相同种的野生型或未转化植物的氮利用效率提高的方法，通过：(a)向植物中引入ω酰胺酶，其中所述ω酰胺酶转基因与根优先性启动子操作性连接；(b)在所述植物根组织或所述植物后代中表达ω酰胺酶转基因；和(c)选择相对于不含ω酰胺酶转基因的相同种植物中2-氧代缩环戊酸单酰胺的叶-根比率增加的植物，其中所述2-氧代缩环戊酸单酰胺的叶-根比率增加使得氮利用效率提高。
本发明的另一方面涉及使某一植物相对于相同种的野生型或未转化植物的氮利用效率提高的方法，通过：(a)抑制植物的叶组织中内源性ω酰胺酶的表达；和(b)选择相对于不抑制叶组织中内源性ω酰胺酶表达的相同种植物内2-氧代缩环戊酸单酰胺的叶-根比率增加的植物，其中所述2-氧代缩环戊酸单酰胺的叶-根比率增加使得氮利用效率提高。
附图简要说明
图1显示氮同化和2-氧代缩环戊酸单酰胺生物合成的代谢通路的示意图。
图2显示拟南芥（Arabidopsis thaliana）ω酰胺酶与其他推定的植物ω酰胺酶的氨基酸序列比对。
图3显示拟南芥（Arabidopsis thaliana）ω酰胺酶与其他推定的动物ω酰胺酶的氨基酸序列比对。
图4图示植物鲜重值对2-氧代缩环戊酸单酰胺浓度的作图。
图5显示比较ω酰胺酶转基因和对照苜蓿植物的照片。
发明详述
定义
除非另外定义，本文使用的所有术语、符号和其它科学术语旨在具有与本发明所属领域的技术人员通常所理解的相同含义。在一些情况中，本文出于阐明和/或便于引用对具有常规理解含义的术语加以限定，本文中包括此类限定不应理解为表示与本领域常规理解的显著差异。本文所述或所引用的技术和过程通常已充分了解并常采用本领域技术人员的常规方法，例如，广泛应用的分子克隆方法描述在Sambrook等，Molecular Cloning:A Laboratory Manual（分子克隆：实验室手册）第三版(2001)纽约冷泉港的冷泉港实验室出版社（ColdSpring Harbor Laboratory Press）；Current Protocols in Molecular Biology（新编分子生物学实验指南）(Ausbel等编，约翰韦利森公司（John Wiley & Sons,Inc）2001；Transgenic Plants:Methods and Protocols（转基因植物：方法和方案）(Leandro Pena编，胡马纳出版社（Humana Press）第一版，2004)；和Agrobacterium Protocols（农杆菌属实验指南）(Wan编，胡马纳出版社，第二版，2006)。适用时，除非另有说明，涉及使用市售可得的试剂盒和试剂的过程通常按生产商给出的方案和/或参数进行。
本文引用的每个文献、参考文献、专利申请或专利通过引用全文纳入本文，并且各应作为本说明书的一部分解读或视为其中一部分。本说明书引用的所述文献、参考文献、专利申请或专利在本文没有重复只是为了简明。
术语“核酸”指脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其单链或双链形式的聚合物（“多核苷酸”）。除非明确限定，术语“多核苷酸”涵盖的核酸含有结合特性与参照核酸类似且以与天然存在核苷酸相似方式代谢的已知天然核苷酸类似物。除非另有说明，具体核酸序列也包括其保守修饰变体(如，简并密码子取代)和互补序列，以及明确指出的序列。具体说，可通过产生一个或多个选定(或所有)密码子的第三个位置被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来获得简并密码子取代(Batzer等，1991，Nucleic Acid Res.19:5081；Ohtsuka等，1985，J.Biol.Chem.260:2605-2608；和Cassol等，1992；Rossolini等，1994，Mol.Cell.Probes 8:91-98)。术语核酸与基因、cDNA、基因编码的mRNA互换使用。
术语“启动子”指指导与核酸转录的一个或多个核酸控制序列操作性连接。本文使用的“植物启动子”是植物中有功能的启动子。启动子包含转录起始位点附近的必需核酸序列，例如，聚合酶II型启动子示例中的TATA元件。本文使用的启动子可以包含全部核苷酸序列，或可以只包含指导与核酸转录的核心结构域或序列操作性连接。启动子也可选包含能定位在距离转录起始位点的远至几千碱基对的远端增强子或抑制子元件。“组成型”启动子是在大部分环境和发育条件下有活性的启动子。“诱导型”启动子是在环境或发育调节下有活性的启动子术语“操作性连接”指核酸表达控制序列（如启动子，或转录因子结合位点阵列）和第二核酸序列之间的功能连接，其中所述表达控制序列指导所述核酸响应所述第二序列的转录。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中互换使用，指氨基酸残基的聚合物。该术语可应用于其中一个或多个氨基酸残基是相应天然产生氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸聚合物，以及天然产生的氨基酸聚合物和非天然产生的氨基酸聚合物。
术语“氨基酸”指天然产生的和合成的氨基酸，以及作用方式类似于天然产生氨基酸的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然产生的氨基酸是由遗传密码编码的氨基酸，以及随后修饰的氨基酸，如羟基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物指与天然产生的氨基酸具有相同基本化学结构的化合物，即结合于氢、羧基、氨基和R基的α碳，如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。这种类似物具有修饰的R基(如正亮氨酸)或修饰的肽主链，但与天然产生的氨基酸的基本化学结构保持相同。氨基酸模拟物指结构不同于氨基酸的普通化学结构，但作用方式类似于天然产生氨基酸的化合物。
在本文中，氨基酸可用IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的通用三字母符号或单字母符号表示。同样，核苷酸可用其普遍接受的单字母代码表示。
术语“植物”包含全植物、植物器官（如叶、茎、花、根、生殖器官、胚胎和其部分等）、幼苗、种子和植物细胞和其后代。本发明所述方法可用的植物种类通常宽泛到可适于转化技术的高等植物，包括被子植物(单子叶和双子叶植物)和裸子植物。其包括各倍体水平的植物，包括多倍体、二倍体、单倍体和半合子。
术语“GPT多核苷酸”和“GPT核酸”在本文中可互换使用，指编码涉及催化合成2-氧代缩环戊酸单酰胺的多肽的基因多核苷酸序列的全长或部分长度，并且包含含有翻译（编码）和非翻译序列的多核苷酸，和其互补物。术语“GPT编码序列”指转录和编码GPT蛋白的基因部分。术语“靶向序列”和“转运肽”可互换使用，指指导蛋白进入细胞的亚细胞成分，例如植物细胞中叶绿体的蛋白的氨基末端部分。GPT多核苷酸还通过其在确定条件下与本文特定公开的所述GPT多核苷酸或来自其的PCR产物杂交的能力来定义。
GPT转基因是包含GPT多核苷酸的核酸分子，所述多核苷酸对含有所述核酸分子的转基因植物、或植物胚胎、器官或种子为外源性，或所述多核苷酸对有GPT多核苷酸的转基因植物的植物祖先、或植物胚胎、器官或其种子为外源性。
“GPT转基因”可以包含编码全长GPT蛋白或截断GPT蛋白（包括但不限于缺少叶绿体转运肽的GPT蛋白）的多核苷酸。更特别地，外源GPT转基因与GPT基因插入的野生型植物、或植物胚胎、器官或种子中存在的任何GPT多核苷酸序列异质。此种程度上，所需的异质性范围仅需为单个核酸差异。然而，优选所述异质性顺序为选自下述相同性的序列之间相同性：0.01%、0.05%、0.1%、0.5%、1%、5%、10%、15%和20%。
术语“GS多核苷酸”和“GS核酸”在本文中可互换使用，指编码谷氨酰胺合成酶蛋白的基因多核苷酸序列的全长或部分长度，并且包含含有翻译（编码）和非翻译序列的多核苷酸，和其互补物。术语“GS编码序列”指转录和编码GS蛋白的基因部分。术语“GS1多核苷酸”和“GS1核酸”在本文中可互换使用，指编码谷氨酰胺合成酶同种型1蛋白的基因多核苷酸序列的全长或部分长度，并且包含含有翻译（编码）和非翻译序列的多核苷酸，和其互补物。术语“GS1编码序列”指转录和编码GS1蛋白的基因部分。
“GS转基因”是包含GS多核苷酸的核酸分子，所述多核苷酸对含有所述核酸分子的转基因植物、或植物胚胎、器官或种子为外源性，或所述多核苷酸对有GS多核苷酸的转基因植物的植物祖先、或植物胚胎、器官或其种子为外源性。“GS转基因”可以包含编码全长GS蛋白或截断GS蛋白（包括但不限于缺少转运肽的GS蛋白）的多核苷酸。“GS1转基因”是包含GS1多核苷酸的核酸分子，所述多核苷酸对含有所述核酸分子的转基因植物、或植物胚胎、器官或种子为外源性，或所述多核苷酸对有GS1多核苷酸的转基因植物的植物祖先、或植物胚胎、器官或其种子为外源性。“GS1转基因”可以包含编码全长GS蛋白或截断GS1蛋白（包括但不限于缺少转运肽的GS1蛋白）的多核苷酸。更特别地，外源GS或GS1转基因与GS或GS1基因插入的野生型植物、或植物胚胎、器官或种子中存在的任何GS或GS1多核苷酸序列异质。此程度上，所需的异质性范围仅需为单个核酸差异。然而，优选所述异质性顺序为选自下述相同性的序列之间相同性：0.01%、0.05%、0.1%、0.5%、1%、5%、10%、15%和20%。
术语“ω酰胺酶(Ω酰胺酶)多核苷酸”和“ω酰胺酶核酸”在本文中可互换使用，指编码涉及酶分解2-氧代缩环戊酸单酰胺的多肽的基因多核苷酸序列，并且包含含有翻译（编码）和非翻译序列的多核苷酸，和其互补物。术语“ω酰胺酶编码序列”指转录和编码ω酰胺酶蛋白的基因部分。ω酰胺酶多核苷酸还通过其在确定条件下与本文特定公开的所述ω酰胺酶多核苷酸或来自其的PCR产物杂交的能力来定义。
“ω酰胺酶转基因”是包含ω酰胺酶多核苷酸的核酸分子，所述多核苷酸对含有所述核酸分子的转基因植物、或植物胚胎、器官或种子为外源性，或所述多核苷酸对有ω酰胺酶多核苷酸的转基因植物的植物祖先、或植物胚胎、器官或其种子为外源性。“ω酰胺酶”可以包含编码全长ω酰胺酶蛋白或截断ω酰胺酶蛋白（包括但不限于缺少叶绿体转运肽的ω酰胺酶蛋白）的多核苷酸。更特别地，外源ω酰胺酶转基因与ω酰胺酶基因插入的野生型植物、或植物胚胎、器官或种子中存在的任何ω酰胺酶多核苷酸序列异质。此程度上，所需的异质性范围仅需为单个核酸差异。然而，优选所述异质性顺序为选自下述相同性的序列之间相同性：0.01%、0.05%、0.1%、0.5%、1%、5%、10%、15%和20%。
术语“保守修饰变体”可应用于氨基酸和核酸序列。对于特定的核酸序列，保守修饰变体指编码相同或基本相同的氨基酸序列的核酸，或者当核酸不编码氨基酸序列时，指基本相同的序列。由于遗传密码的简并性，大量功能相同的核酸编码任何给定的蛋白质。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU都编码氨基酸丙氨酸。因此，在密码子指定丙氨酸的每个位置上，可将所述密码子改变成所述的任何相应密码子而不改变编码的多肽。这类核酸变异是“沉默变异”，这是保守修饰变异的一种。本文编码多肽的每种核酸序列也描述该核酸的每种可能的沉默变异。本领域技术人员应认识，可修饰核酸中的各个密码子(除了AUG和TGG，AUG通常是甲硫氨酸的唯一密码子，TGG通常是色氨酸的唯一密码子)，以产生功能相同的分子。因此，在所述的各序列中隐含了编码多肽的各核酸沉默变异。
至于氨基酸序列，本领域技术人员将认识到，在编码序列中改变、加入或删除一个氨基酸或较少百分数氨基酸的某一核酸、肽、多肽或蛋白质序列单独取代、缺失或添加是“保守修饰变体”，其中所述改变导致氨基酸被化学上相似的氨基酸所取代。提供功能上相似氨基酸的保守取代表是本领域熟知的。这类保守修饰的变体是本发明的多态性变体、种间同源物和等位基因的补充且并不排除它们。
以下八组各自含有可互相保守取代的氨基酸：1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；和8)半胱氨酸(C)甲硫氨酸(M)(参见例如Creighton，Proteins(《蛋白质》)(1984))。
大分子结构例如多肽结构能以多个构成水平的形式描述。此构成的一般讨论参见例如Alberts等，Molecular Biology of the Cell (细胞分子生物学)(第三版1994)和Cantor和Schimmel，Biophysical Chemistry Part I：TheConformation of Biological Macromolecules(生物物理化学第I部分：生物大分子的构型)(1980)“初级结构”指特定肽的氨基酸序列。“二级结构”指多肽内的局部有序、三维结构。这些结构通常称为结构域。结构域是形成多肽的紧凑型单元并且通常为25-约500氨基酸长度的多肽部分。通常结构域由较小构成（如β-片层和α-螺旋）部分组成。“三级结构”指多肽单体的完全三维结构。“四级结构”指独立三级单位的非共价连接形成的三维结构。各向异性术语也称为能量术语。
术语“分离的”指基本或主要没有通常伴随所述材料的如在其初始或天然状态下发现的成分。然而，术语“分离的”不意在指在电泳凝胶或其他分离介质中出现的成分。分离成分不含所述分离介质并且采用的形式易用于另一应用或已经用于一个新的应用/环境中。"分离"抗体是已从其天然环境的组成中鉴定并分离和/或回收的抗体。其自然环境的污染成分是会干扰抗体的诊断或治疗应用的材料，并可以包含酶、激素和其他蛋白质或非蛋白质的溶质。在优选实施方式中，抗体纯化至(1)按罗氏（Lowry）法确定超过95%抗体重量，最优选超过99%重量；(2)纯化程度足以获取N-末端或内部氨基酸序列的至少15个残基，通过使用转杯式测序仪获取；或者(3)通过还原或非还原条件下的SDS-PAGE趋于均质，用考马斯蓝或优选银染。分离的抗体包含重组细胞内的原位抗体，因为该抗体天然环境中的至少一种组分将不存在。然而，通常分离的抗体由至少一个纯化步骤制备。
用于核酸部分时，术语“异源”指该核酸包含在天然情况下彼此不存在于同一关系中的两个或更多子序列。例如，核酸一般是重组产生的，具有两个或多个来自无关基因的序列，它们经排列组成新的功能性核酸，例如编码蛋白的核酸来自一个来源而编码肽序列的核酸来自另一来源。相似地，异源蛋白表示该蛋白包含天然情况下彼此不存在于同一关系中的两个或多个子序列(如融合蛋白)。
在两种或多种核酸或多肽序列中，术语“相同”或“相同性”百分数指在比较窗口或指定区域上采用序列比较算法测定或通过手工比对和目测检查来比较和比对最大对应性时，某特定区域上相同或具有特定百分数的氨基酸残基或核苷酸相同(即，约70%相同性，优选75%、80%、85%、90%或95%相同性)的两个或多个序列或子序列。这个定义也指检测序列的互补物，当所述检测序列与参照序列基本相同时，所述互补物有显著的序列或子序列互补性。这个定义也指检测序列的互补物，当所述检测序列与参照序列基本相同时，所述互补物有显著的序列或子序列互补性。
序列相同性百分比涉及多肽使用时，认为不同的残基位置通常由于保守氨基酸取代而不同，其中氨基酸残基被具有相似化学性质（如电荷或疏水性）的其他氨基酸残基取代，因此不改变多肽的功能性质。当序列由于保守取代而不同时，序列相同性百分比可上调以根据该取代的保守性质校正。
对于序列比较，一般将一种序列用作与测试序列比较的参照序列。使用序列比较算法时，测试和参照序列均输入计算机，必要时指定子序列坐标，指定序列算法程序参数。可使用默认的程序参数，或者可指定另外的参数。然后，该序列比较算法根据程序参数计算出测试序列相对于参照序列的序列相同性百分数。
本文所用的“比较窗口”包括参考任意数量的连续位置的区段，选自约20-600，通常约50-约200，更常是约100-约150，其中对两个序列进行最优比对后，可将该序列与具有相同数量连续位置的参照序列作比较。比对序列的比较方法是本领域熟知的。可通过，例如Smith和Waterman的局部同源性算法，1981，Adv.Appl.Math.2:482，通过Needleman和Wunsch的同源性比对算法，1970，J.Mol.Biol.48:443，通过Pearson和Lipman的相似性搜索法，1988，Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 85:2444，通过计算机执行这些算法(威斯康星遗传学软件包(Wisconsin Genetics Software Package)中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，威斯康星州麦迪逊科学大道575号的遗传学计算机组(GeneticsComputer Group))，或通过手工比对和目测(参见例如，《新编分子生物学实验指南》(Current Protocols in Molecular Biology)(Ausubel等编，1995增刊))进行最优序列比对以便比较。
适合测定序列相同性和序列相似性百分数的算法的优选例子分别是BLAST和BLAST 2.0算法，参见Altschul等，1977，Nuc.Acids Res.25:3389-3402和Altschul等，1990，J.Mol.Biol.215:403-410。使用BLAST和BLAST 2.0，通常用本文所述的默认参数，以确定本发明核酸和蛋白质的序列相同性百分数。进行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心(National Center forBiotechnology Information)从公开渠道获得。此算法包括：首先通过鉴定查询序列中长度为W的短字来鉴定高评分序列对(HSP)，与数据库序列中长度相同的字比对时它们能匹配或满足一些正值的阈值评分T。T称为相邻字评分阈值(Altschul等，同上)。这些初始相邻字命中用作启动搜索的种子，以便找到含有它们的较长HSP。只要可提高累积比对评分，该字命中在沿各序列的两个方向上延伸。就核苷酸序列而言，采用参数M(一对匹配残基的奖励评分；总是>0)和N(错配残基的罚分；总是<0)计算累积评分。就氨基酸序列而言，用评分矩阵计算累积评分。出现以下情况时中止字命中在各个方向上的延伸：累积比对评分比其最大获得值降低X；由于一个或多个负评分残基比对的累积，累积评分变为零或零以下；或者达到任一序列的末端。BLAST算法参数W、T和X决定比对的灵敏度和速率。BLASTN程序(对核苷酸序列而言)采用的默认值如下：字长(W)1，期望值(E)10，M=5，N=-4，以及比较两条链。对氨基酸序列而言，BLASTP程序使用的默认值为：字长3，期望值(E)10，BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff和Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915(1989))比对(B)50，期望值(E)10，M=5，N=-4，以及比较两条链。
BLAST算法也对两种序列间的相似性进行统计学分析(参见例如，Karlin和Altschul，1993，Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 90:5873-5787)。BLAST算法提供的一种相似性测量是最小概率和(P(N))，它表明两个核苷酸或氨基酸序列之间偶尔发生匹配的概率。例如，如果测试核酸与参照核酸比较时的最小概率和小于约0.2，更优选小于约0.01，最优选小于约0.001，那么认为该核酸与参照序列相似。
术语“严谨杂交条件”指通常在核酸的复杂混合物中，探针与其目标子序列杂交，但不与其他序列杂交的条件。严谨条件是序列依赖性的，在不同情况下不同。较长的序列在较高温度下特异性杂交。有关核酸杂交的广泛指南参见Tijssen，Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization withNucleic Probes(《生物化学和分子生物学技术与核酸探针杂交》)，“Overviewof principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays(核酸测定的杂交原理和方案概览)”(1993)。通常，高严谨条件选择为比特定序列在确定离子强度、pH下的热解链温度(Tm)低约5-10°C。通常低严谨条件选择为低于Tm约15-30°C。Tm是50%靶标互补探针与靶序列杂交平衡时的温度(在确定离子强度、pH和核酸浓度下)(由于靶序列过量存在，在Tm时50%探针被平衡地占据)。严谨条件是盐浓度小于约0.1M钠离子，一般约0.01至1M钠离子浓度(或其它盐)，pH7.0至8.3，对短探针(例如，10-50个核苷酸)而言温度至少约为30℃、对长探针(例如大于50个核苷酸)而言至少约60°C的条件。也可加入去稳定剂如甲酰胺以获得严谨条件。在选择性或特异性杂交中，阳性信号至少是背景杂交的两倍，优选10倍。
如果核酸编码的多肽基本相同，那么在严谨条件下彼此不杂交的核酸仍基本相同。例如，用遗传密码所允许的最大密码子简并性产生核酸拷贝时可能发生这种情况。在这种情况下，核酸一般在中等严谨的杂交条件下杂交。
包含GPT多核苷酸的基因组DNA或cDNA可以在使用本文公开的GPT多核苷酸序列的严谨条件下于标准Southern印迹中鉴定。为此目的，这种杂交的合适严谨条件是包含在40%甲酰胺、1M NaCI、1%SDS的缓冲液中37°C杂交，和至少一次在0.2X SSC中于至少约50°C（通常约55°C–约60°C）洗涤20分钟的那些条件，或等同的条件。阳性杂交至少是背景的两倍。本领域普通技术人员不难认识到，可利用替代的杂交和洗涤条件提供相似严谨性的条件。
两个多核苷酸基本相同的进一步指示是如果一对寡核苷酸引物扩增的参照序列随后能用作严谨杂交条件下的探针，以从cDNA或基因组文库中分离检测序列，或在如northern或Southern印迹中鉴定所述测试序列。
Ω酰胺酶表达水平改变的转基因植物:
本公开提供在相对于根或地下部分组织，在叶部组织中包含更高水平的信号代谢物2-氧代缩环戊酸单酰胺和其类似物的转基因植物，和提高植物生成性植物的氮利用效率的方法。2-氧代缩环戊酸单酰胺是一种代谢物，是基因表达、代谢和植物生长的极为有效的效应物（美国专利号6,555,500），并且可以在协同碳和氮代谢系统中起关键作用（Lancien等，2000，EnzymeRedundancy and the Importance of 2-Oxoglutarate in Higher Plants AmmoniumAssimilation(在高等植物铵同化中酶过量和2-氧代戊二酸的重要性)，PlantPhysiol.123:817-824）。
增加2-氧代缩环戊酸单酰胺的生物合成可以增加叶组织中2-氧代缩环戊酸单酰胺的水平。叶组织中2-氧代缩环戊酸单酰胺的生物合成可以优选例如通过降低催化2-氧代缩环戊酸单酰胺降解的酶活性而增加到足够超过降解速率的水平（图1）。另外，增加2-氧代缩环戊酸单酰胺的降解可以降低根组织中2-氧代缩环戊酸单酰胺的水平。根组织中2-氧代缩环戊酸单酰胺的降解速率可以优选通过例如增加催化2-氧代缩环戊酸单酰胺降解的酶活性来增加（图1）。
本文所公开的方法用于生成与野生型或祖先植物相比，显示更高2-氧代缩环戊酸单酰胺的叶-根比率的转基因植物。在本公开方法的实践中，叶和根组织中2-氧代缩环戊酸单酰胺的浓度可以通过本文公开的任何一种或几种方案组合来调节。例如，2的叶-根比率可以通过增加根组织中ω酰胺酶活性或抑制叶组织中ω酰胺酶活性来增加。
植物中所述Ω酰胺酶通路的调节：
本发明基于以下惊人的发现，即植物中所述2-氧代缩环戊酸单酰胺的叶-根比率通过调节植物的根和/或叶组织中ω酰胺酶表达来增加。另外，2-氧代缩环戊酸单酰胺的叶-根比率增加使得氮利用效率提高。
申请人已经鉴定可以调节实现增加2-氧代缩环戊酸单酰胺的相对叶-根浓度目标的ω酰胺酶通路，因此，引起更高的氮同化和碳代谢动态（metabolismdynamics），使得生长速率和农艺学特性提高。这个通路中唯一的中间产物即2-氧代缩环戊酸单酰胺，表面上作为反映氮同化流量的信号代谢物。2-氧代缩环戊酸单酰胺水平增加引起资源获取速率、碳和氮代谢和整体生长显著增加。用2-氧代缩环戊酸单酰胺处理或工程改造以生成叶中2-氧代缩环戊酸单酰胺水平增加的植物显示更高叶氮和介质氮利用效率。2-氧代缩环戊酸单酰胺存储的叶-根比率的增加伴随所得到的整体生长增加，所述2-氧代缩环戊酸单酰胺存储的叶-根比率进而由谷氨酰胺合成酶、谷氨酰胺苯丙酮酸转氨酶和ω酰胺酶活性，和以复杂、相关和组织特异方式通过氮可用性来控制。另外，2-氧代缩环戊酸单酰胺的叶-根比率的增加造成氮利用效率提高。本文使用的“提高的氮利用效率”和“氮利用效率提高”指有生长提高和更好农艺学特性的植物。农艺学特性包括但不限于，由通过2-氧代缩环戊酸单酰胺叶-根比率增加调节的氮利用增加而产生的更快生长速率、更多种子和果实/荚产量、更早和更多产的开花，对高盐条件的耐受性增加，和/或提高的生物量产量。
如实施例1所述，同上，工程改造以过量表达GS和/或GPT的转基因植物显示在叶中更低的ω酰胺酶活性和根中更高的ω酰胺酶活性。GPT和GS+GPT转基因植物显示根ω酰胺酶活性的增加最大。这些植物通过改变其ω酰胺酶活性响应转基因的表达，从而趋向于增加所述叶2-氧代缩环戊酸单酰胺存储和维持所述根2-氧代缩环戊酸单酰胺存储。在GS+GPT过量表达植物中，这些响应组合以生成最高的叶和最低的根2-氧代缩环戊酸单酰胺存储，以及最高的叶和最低的GS+GPT活性。
不希望受理论限制，认为所述信号代谢物2-氧代缩环戊酸单酰胺根据所述组织，提供两个不同的信息。叶中增加的2-氧代缩环戊酸单酰胺有刺激性（表2-4）并且看来有效传递信息显示所述氮过量和碳必需固定以利用氮增加。叶-根2-氧代缩环戊酸单酰胺存储的增加伴随着所述氮供给增加驱动的更快生长。叶2-氧代缩环戊酸单酰胺存储的增加显然对所述刺激重要。不希望受理论限制，认为在根中维持接近正常或降低的2-氧代缩环戊酸单酰胺存储的所述植物策略是某种机制，所述机制可以用于克服明显的矛盾，即当用施氮肥时植物如何更快生长但是根中显示长期观察到硝酸盐吸收和同化的抑制，通过"Nmetabolite downstream of NH3（NH3下游的N代谢物）"(Foyer等，2002,荷兰的克鲁学术出版社（Kluwer Academic Publishers）)。如果所述抑制氮代谢物是2-氧代缩环戊酸单酰胺，那么所述机制当氮充足以使植物繁荣时可以控制其向下的浓度，和当氮缺乏并且所述植物试图保持有限资源以存活繁殖时，反向保持更高的2-氧代缩环戊酸单酰胺。
不希望受理论限制，认为本文公开的所述结果指示植物中调节ω酰胺酶活性对推动叶的2-氧代缩环戊酸单酰胺水平相对根增加有用。以下描述两个方案：(1)通过上调根组织中ω酰胺酶活性来提高2-氧代缩环戊酸单酰胺的降解，和(2)通过减弱、下调或灭活叶的ω酰胺酶活性来减弱2-氧代缩环戊酸单酰胺的降解。
通过上调根组织中Ω酰胺酶活性来提高2-氧代缩环戊酸单酰胺的降解：
本发明某些方面涉及包含ω酰胺酶转基因的转基因植物，其中所述ω酰胺酶转基因与根优先性启动子操作性连接。
原先显示植物中ω酰胺酶样通路可能涉及2-氧代缩环戊酸单酰胺的降解(Von Gusgtav Schwab 1936,Planta Archiv fur wissenschaftliche botanik（植物学科学的植物档案）25册（Band），4期（Heft），第579-606页[德国出版]；Olenicheva，LS 1955，Biokhimiia 20(2):165-172.[俄罗斯出版]；和Yamamoto,Y.1955,Journal of Biochemistry 42:763-774)。然而，这些研究都没有鉴定出ω酰胺酶蛋白。
因此，认为ω酰胺酶通路涉及植物中2-氧代缩环戊酸单酰胺和其类似物的降解（图1）。另外，ω酰胺酶已经显示能通过打开2-氧代缩环戊酸单酰胺的环和除去氮以产生酮酸来催化动物细胞中2-氧代缩环戊酸单酰胺降解（Cooper和Meister，1977,CRC Critical Reviews in Biochemistry（CRC生物化学评论），第281-303页；Meister,1952,J.Biochem.197:304）。
申请人鉴定推定的植物ω酰胺酶基因和蛋白（拟南芥（Arabidopsisthaliana）基因AT5g12040，F14F18 210 imRNA）。推定的植物ω酰胺酶的鉴定是基于对来自其他生物（包含人和大鼠）的ω酰胺酶基因序列的序列同源性分析。所述其核苷酸编码和翻译氨基酸序列在下面显示。
拟南芥ω酰胺酶核苷酸编码序列(Genbank登录号AY075592.1，GI19715573，对应于蛋白NP445766)[SEQ ID NO:2]:
AAAGTGAAATGAAGTCAGCAATTTCATCGTCACTCTTCTTCAATTCGAAGAATCTTTTAAACCCTAATCCTCTTTCTCGCTTCATTTCTCTCAAATCTAACTTCCTCCCTAAATTATCTCCGAGATCGATCACTAGTCACACCTTGAAGCTCCCATCTTCGTCAACCTCAGCTTTAAGATCCATTTCCTCTTCCATGGCTTCTTCTTTCAACCCTGAACAAGCTAGAGTTCCCTCTGCTCTTCCTCTCCCAGCTCCTCCGTTGACCAAATTCAACATCGGATTGTGTCAGCTATCTGTTACATCTGACAAAAAGAGAAACATCTCTCATGCTAAAAAAGCCATTGAAGAAGCTGCTTCTAAAGGAGCTAAGCTTGTTCTCTTACCCGAAATTTGGAACAGTCCGTATTCCAATGATAGTTTTCCAGTTTATGCGGAGGAGATTGATGCAGGTGGTGATGCTTCTCCTTCAACGGCAATGCTTTCTGAAGTTTCCAAACGTCTCAAGATTACAATCATTGGTGGATCTATACCAGAAAGAGTTGGAGATCGTTTGTATAACACTTGCTGTGTCTTTGGTTCCGATGGAGAGCTAAAAGCTAAGCATCGGAAGATACATTTATTTGATATAGACATTCCCGGGAAGATTACTTTTATGGAATCCAAAACTCTTACTGCTGGAGAGACACCAACAATCGTTGACACAGATGTAGGGCGTATTGGAATAGGCATCTGTTATGATATCAGGTTCCAGGAGTTAGCTATGATATATGCTGCAAGAGGGGCTCATTTGCTGTGCTACCCGGGAGCCTTTAACATGACAACTGGACCATTGCATTGGGAATTACTACAAAGGGCCAGGGCTACGGATAATCAGTTATATGTGGCGACATGCTCACCTGCCAGAGATTCAGGAGCTGGCTACACTGCTTGGGGGCACTCAACACTCGTTGGGCCTTTTGGAGAAGTACTAGCAACGACTGAGCATGAGGAGGCCATTATCATAGCAGAGATTGATTACTCTATCCTTGAACAACGAAGGACTAGCCTTCCATTGAATAGGCAGCGGCGGGGAGATCTTTACCAGCTTGTAGACGTACAGCGCTTAGACTCTAAATGAACGCAGCAGTAACTGTATATCTGAGAGATATTGCGAGTTGAGCACGATTTGGTTACTTACAACTTCATGCATGATCAGTCATTTCTCCACAACTTTGCTGAGATATGTAAAAGAATAAAAATCAAACTTTTGAGTTAAAATCGAACAAAGGCAAGTAAATTCTGCTTAGATAATGTGAACTCCACCCACTTGCCATGTGTTTGTTGTTTATAAACTTCAATGCATTCTGATAACG
成熟的拟南芥ω酰胺酶氨基酸序列；和衍生自SEQ ID NO:2的翻译产物，如上（Genbank登录号AAL91613.1）[SEQ ID NO:3]：
MASSFNPEQARVPSALPLPAPPLTKFNIGLCQLSVTSDKKRNISHAKKAIEEAASKGAKLVLLPEIWNSPYSNDSFPVYAEEIDAGGDASPSTAMLSEVSKRLKITIIGGSIPERVGDRLYNTCCVFGSDGELKAKHRKIHLFDIDIPGKITFMESKTLTAGETPTIVDTDVGRIGIGICYDIRFQELAMIYAARGAHLLCYPGAFNMTTGPLHWELLQRARATDNQLYVATCSPARDSGAGYTAWGHSTLVGPFGEVLATTEHEEAIIIAEIDYSILEQRRTSLPLNRQRRGDLYQLVDVQRLDSK
基于Genbank中的起始BLAST分析，所述拟南芥ω酰胺酶具有在其他植物种和细菌、真菌、蛙、鱼和哺乳动物中的同源物。所鉴定的同源物都没有标注为ω酰胺酶。然而，不希望受理论限制，认为这些序列也编码ω酰胺酶。鉴定的推定ω酰胺酶的氨基酸序列在下面显示。
葡萄(Vitis vinifera)氨基酸序列（Genbank登录号XP_002279687.1）[SEQID NO:4]：
MKSAALSALLSSTLSYASPPHLNLLRPATAVLCRSLLPTSTPNPFHTQLRTAKISASMSSSFKPEQARVPPAIPPPTPPLSKFKIGLCQLSVTADKERNIAHARKAIEEAVEKGAQLVLLPEIWNSPYSNDSFPVYAEDIDAGSDASPSTAMLSEVSHALKITIVGGSIPERCGDQLYNTCCVFGSDGKLKAKHRKIHLFDINIPGKITFMESKTLTAGGSPTIVDTEVGRIGIGICYDIRFSELAMLYAARGAHLICYPGAFNMTTGPLHWELLQRARAADNQLYVATCSPARDAGAGYVAWGHSTLVGPFGEVLATTEHEEAIIISEIDYSLIELRRTNLPLLNQRRGDLYQLVDVQRLDSQ
玉米(Zea mays)氨基酸序列（Genbank登录号ACN30911.1）[SEQ ID NO:5]：
MVAAAAAAAAATATAAALLAPGLKLCAGRARVSSPSGLPLRRVTAMASAPNSSFRPEEARSPPALELPIPPLSKFKVALCQLSVTADKSRNIAHARAAIEKAASDGAKLVVLPEIWNGPYSNDSFPEYAEDIEAGGDAAPSFSMLSEVARSLQITLVGGSIAERSGNNLYNTCCVFGSDGQLKGKHRKIHLFDIDIPGKITFKESKTLTAGQSPTVVDTDVGRIGIGICYDIRFQELAMLYAARGAHLLCYPGAFNMTTGPLHWELLQRARAADNQLFVATCAPARDTSAGYVAWGHSTLVGPFGEVIATTEHEEATIIADIDYSLIEQRRQFLPLQHQRRGDLYQLVDVQRLGSQ
毛果杨(Populus trichocarpa)氨基酸序列（Genbank登录号XP_002309478.1）[SEQ ID NO:6]：
MKSAISSTTTLLSSKNLSLKLHLNHSPLSRLPSSLFRSKSNTHFPSLLPRNNSTHNQKSQIHTPIMASSFMPEQARAPPALPLPVPPFKIGLCQLSVTADKERNIAHARKAIEEAAAKGAKLVMLPEIWNSPYSNDCFPVYAEDIDAGGEASPSTAMLSEAAGLLKVTIVGGSIPERSGDRLYNTCCVFDSDGKLKAKHRKIHLFDIDIPGKITFIESKTLTAGETPTIVDTEVGRIGIGICYDIRFQELAIIYAARGAHLICYPGAFNMTTGPLHWELLQRARAADNQLYVATCSPARDVAAGYVAWGHSTLVGPFGEVLATTEHEEDIIIAEIDYSLLEVRRTNLPLTKQRRGDLYQLVDVQRLKSDS
北美云杉(Picea sitchensis)氨基酸序列（Genbank登录号ABK22312.1）[SEQID NO:7]：
MTPLLSYSLRVVASALRPKSSIASAVGRLSATPKRFPANRLRISYRNYNAAMAKPEDARSPPALPLPSAPNGGKFKIALCQLSVTENKERNIAHARDAIEAAADNGAQLVVLPEIWNGPYSNASFPVYAEDIDAGGSASPSTSMLSEVARSKGITIVGGSISERSGDHLYNTCCIFGKDGELKAKHRKIHLFDIDIPGKISFMESKTLTAGNTPTIVDTDVGRIGIGICYDIRFQELAMLYAARGAHLICYPGAFNMTTGPLHWELLQRARAIDNQLYVATCSPARDINAGYVAWGHSTLVAPFGEIVATTEHEEATVIADIDYSRIEERRMNMPLEKQRHGDLYQLVDV SRLDTAKH
水稻（Oryza sativa）氨基酸序列（Genbank登录号NP_001049134.1）[SEQID NO:8]：
MATAASFRPEAARSPPAVQPPAPPLSKFKVALCQLSVTADKARNIARAREAIEAAAAGGAKLVLLPEIWNGPYSNDSFPEYAEDIEAGGDAAPSFSMMSEVARSLQITLVGGSISERSGNKLYNTCCVFGSDGELKGKHRKIHLFDIDIPGKITFKESKTLTAGQDLTVVDTDVGRIGIGICYDIRFQELAMLYAARGAHLLCYPGAFNMTTGPLHWELLQRARAADNQLFVATCAPARDTSAGYIAWGHSTLVGPFGEVIATAEHEETTIMAEIDYSLIDQRRQFLPLQYQRRGDLYQLVDVQRSGSDE
高粱(Sorghum bicolor)氨基酸序列（Genbank登录号XP_002468410.1）[SEQID NO:9]：
MRAAAAAAATSTAAALLAPGLKLCAGRARVSSCRLPLRRVAAMASAPNSSFRPEEARSPPALELPTPPLSKFKVALCQLSVTADKSRNIAHARAAIEKAASDGAKLVLLPEIWNGPYSNDSFPEYAEDIEAGGDAAPSFSMMSEVARSLQITLVDGQLKGKHRKIHLFDIDIPGKITFKESKTLTAGQSPTVVDTDVGRIGIGICYDIRFQELAMLYAARGAHLLCYPGAFNMTTGPLHWELLQRARQPAVCCNVRSSSRYQCRLCCLGTLHACWTFWRGDCNN
蓖麻(Ricinus communis)氨基酸序列（Genbank登录号XP_002516116.1）[SEQ ID NO:10]：
MSASFNPEQARSPPALPLPTPPLTKAQFLLTSYLTILIYMIFKIGLCQLLVTPDKAKNIAHARKAIEEAAAKGAKLVLLPEIWNSPYSNDSFPVYAEDIDAGHVASPSTAMLSQLARLLNITIVGGSIPERSGDRLYNTCCVFDTQGNLIAKHRKIHLFDIDIPGKITFIESKTLTAGETPNIVDTEVGRIGIGICYDIRFQELAVLYAARGAHLICYPGAFNMTTGPLHWELLQRARAADNQLYVATCSPARDVGAGYVAWGHSTLVGPFGEILATTEHEQDIIIAEIDYSLIELRSQLSTTHLPLPTPTTTRDSTIEEEDDLVYIYI
小立碗藓藓亚种(Physcomitrella patens subsp.patens)氨基酸序列（Genbank登录号XP_001766085.1）[SEQ ID NO:11]：
MASDFQPHMARQPPSESLPNAPNGGKYKLAVCQLSVTSDKAANIAHARQKIEAAADSGAQLIVLPEMWNCPYSNDSFPTYAEDIDAGLEASPSSHMLSEVARKKKVTIVGGSIPERNDGKLYNTCCVFDKNGELKAKFRKIHLFDIDIPGKITFKESDTLTPGEGLCVVDTDVGRIAVGICYDIRFPEMAMLYSARGAHIICYPGAFNMTTGPLHWELLQKARAVDNQIFVVTCSPARDTEAGYIAWGHSTVVGPFGEILATTEHEEATIFADIDYSQLD TRRQNMPLESQRRGDLYHLIDVTRKDTVKSS
江南卷柏(Selaginella moellendorffii)氨基酸序列（Genbank登录号XP_002969787.1）[SEQ ID NO:12]：
MPSSRYFWFLWQFKLAVCQLSICADKEQNIRHAREAIQTAADGGSKLVLLPEMWNCPYSNASFPIYAEDIDAGDSPSSKMLSDMAKSKEVTIIGGSIPERSGNHLYNTCCIYGKDGSLKGKHRKVHLFDIDIPGKIQFKESDTLTPGDKYTVVDTDVGRIGVGICYDIRFPEMAMTYAARGVHMICYPGAFNMTTGPAHWELLQKARAVDNQLFVATCSPARNPSAGYVAWGHSSVIGPFGEILASTGREEAIFYADIDYAQIKERRMNMPLDHQRRGDLYQLVDLTFTT
截形苜蓿（Medicago truncatula）氨基酸序列（Genbank登录号ACJ85250.1）[SEQ ID NO:13]：
MAASSINSELARSPPAIPLPTPPLTNFKIGLCQLSVTSDKDKNIAHARTAIQDAAAKGAKLILLPEIWNSPYSNDSFPVYAEDIDAGGDASPSTAMLSELSSLLKITIVGGSIPERSGDRLYNTCCVFGTDGKLKAKHRKIHLFDIDIPGKITFIESLTLTAGDTPTIVDTEVGRIGIGICYDIRFPELAMIYAARGAHLLCYPGAFNMTTGPLHWELLQRARATDNQLYVATCSPARDTTGWLCGLGVTPLLLVLLEKFWLLQNARRQPL
小球藻(Chlorella variabilis)氨基酸序列（Genbank登录号EFN54567.1）[SEQ ID NO:14]：
MQALAKGMALVGVAGLSAAAGRRAACLRPLSSYTSATADVIDPPPPQKVPPPLPCCRCRHCCHRLASNQQLARPLLAGPSAQIKVALCQLAVGADKQANLTTARSAIEEAATAGADLVVLPEMWNCPYSNDSFPTYAEDVEAGDSPSTSMLSAAAAANRVVLVGGSIPERANGGRLYNTCFVYGRDGRLLGRHRKVHLFDIDIPGKITFKESLTLTPGEGLTVVGRLGIGICYDIRFPELALLYAARGVQLIVYPGAFNMTTGPVHWELLQRARAVDGQLFVATCSPARSEGTGYIAWGHSTAVGPFAEVLATTDEKAGIVYCHMDFAQLGERRANMPLRHQKRADLYSLLDLTRPNSLSNAGLHNGPVQRTLAGSSGIVGSGITRQLLMEGAKVVALLRKVDQKAGLLRDCQGAPIENLYPAVVEDVSKEEQCAAFVHEVVEQHGAIDHAVSCFGAWWQGGLLTEQSYAEFSRVLANFAGSHFTFVKYILPAMRQSHTSSMLFVTGGVGKRVLSADSGLATVGGAALYGIVRAAQAQYQGRPPRINELRIFALVTRHGEMPRSHSSIVEGLRAHSNRKVGNLAAEALAAAADDELLEVTSERLDGVMLMVGD
团藻（Volvox carteri f.nagariensis）氨基酸序列（Genbank登录号XP_002948137.1）[SEQ ID NO:15]：
MHVTADKAQNLQTAKRAIEDAAAQGAKLVVLPEMWNCPYSNDSFPTYAEDIEGGASGSVAMLSAAAAAACVTLVAGSIPERCGDRLYNTCCVFNSRGELLAKHRKVHLFDIDIPGKITFKESLTLSPGPGPTVVDTEAGRLGIGICYDIRFPELAQLYAARGCQVLIYPGAFNMTTGPVHWELLARARAVDNQIFVITCSPARNPSSSYQ AWGHSTVVGPFAEILATTDHQPGTIYTELDYSQLAERRANMPLRQQKRHDLYVLLDKTA
莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)氨基酸序列（Genbank登录号XP_001690839.1）[SEQ ID NO:19]：
KVALCQLHVTADKEQNLRTARKAIEDAAAAGAKLVVLPEMFNCPYSNDSFPTYAEDIEGGASGSVAALSAAAAAARVTLVAGSIPERCQGKLYNTCCVFDSSGKLLAKHRKVHLFDIDIPGKITFKESLTLSPGPGPTVVDTEAGRLGIGICYDIRFPELAQIYAARGCQVLIYPGAFNMTTGPVHWELLAKARAVDNQVFVLTCSPARNPDSSYQAWGHSTALGPFAEVLATTEHSPATVFAELDYAQLDERRAAMPLRQQKRHDLYLLLDKTA
细小微胞藻(Micromonas pusilla)CCMP1545氨基酸序列（Genbank登录号XP_003064056.1）[SEQ ID NO:20]：
MRATKTTAAAAAAAAASSSGAGAPVPFARVPAPWSASGASASDAATPTPTPAPRVVKVALCQLACPTADKVANIARAREAIRNAAEGGAALVVLPEMWNCPYANESFPAHAETIGANDPTPSVTMLSEAAAAHDIVLVGGSIPERGVGVGGGGGADEEDVLYNACCVFDGKRGLIARHRKTHLFDVDIPGEISFRESDTLTEGEGLTVVDTAVGRVGVGICFDVRFGEMAAAMANRGADVLIYPGAFNTVTGPHHWELLQRARAVDNQARSIHWSPYDRCFVLTCSPARNTTGEGYQAWGHSTAVGPFAEVLATTDERPGIVFADLDLGEVTRRRRNMPLATQRRGDLYA LHDLGAVRGDA
长囊水云(Ectocarpus siliculosus)氨基酸序列（Genbank登录号CBJ25483.1）[SEQ ID NO:21]：
MFLAAARRASPILLSLAVKTSTTAAFCSPRLANARTNTAAGATRTAYAACSISRNISLLSRPLSSMSASGASEGATAGAGSRRFVVAACQILCGSDKLANIATAESAVRDAAAAGAQVVVLPECWNGPYDTASFPVYAEPVPDPQGDETAADMPSAEQSPSAAMLCRAAAENKVWLVGGSVPEAGKDGGVYNTCIVVGPSGRIVAKHRKVHLFDIDVPGGITFKESDTLSPGDSITTVETPFGTIGVGICYDMRFPELSMAMRAAGSVLLCFPGAFNMTTGPAHWELLQRARALDNQCFVVTASPARNPDSKYQAWGHSSIVDPWGTVVATTEHEEAMLVAEVDVGRVAE VRTSIPVSLQKRPDLYRLELP
三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)CCAP 1 055/1 氨基酸序列（Genbank登录号XP_002183613.1）[SEQ ID NO:22]：
MSASRQNDDDDDDDPSVLRVALCQLPVTNDKAQNHQTAREYLNRAANQGARLVVLPEIWNSPYATAAFPEYAEQLPDVLAQDGDGHTGVYESPSADLLRESAKEHKLWIVGGSIPERDDDDKIYNTSLVFDPQGNLVAKHRKMHLFDIDVPGGITFFESDTLSPGNTVSHFATPWGNIGLGICYDIRFPEYAMLLAKEHDCGILIYPGAFNLTTGPAHWELLQRGRAVDNQCFVLTASPARTEPPSKAGLYPHYTAWGHSTAVSPWGEVIATTNEKAGIV FADLDLSKVTEMRTSIPIGKQKRTDLYQLVGKS
粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）972h氨基酸序列（Genbank登录号NP_594154.1）[SEQ ID NO:23]：
MNSKFFGLVQKGTRSFFPSLNFCYTRNIMSVSASSLVPKDFRAFRIGLVQLANTKDKSENLQLARLKVLEAAKNGSNVIVLPEIFNSPYGTGYFNQYAEPIEESSPSYQALSSMAKDTKTYLFGGSIPERKDGKLYNTAMVFDPSGKLIAVHRKIHLFDIDIPGGVSFRESDSLSPGDAMTMVDTEYGKFGLGICYDIRFPELAMIAARNGCSVMIYPGAFNLSTGPLHWELLARARAVDNEMFVACCAPARDMNADYHSWGHSTVVDPFGKVIATTDEK PSIVYADIDPSVMSTARNSVPIYTQRRFDVYSEVLPALKKEE
米曲霉(Aspergillus oryzae)RIB40氨基酸序列（Genbank登录号XP_001819629.1）[SEQ ID NO:24]：
MAALLKQPLKLALVQLASGADKAVNLAHARTKVLEAAQAGAKLIVLPECFNSPYGTQYFPKYAETLLPSPPTEDQSPSYHALSAIAAEAKAYLVGGSIPELEPTTKKYYNTSLVFSPTGSLIGTHRKTHLFDIDIPGKITFKESEVLSPGNQLTIVDLPDYGKIGLAICYDIRFPEAAMIAARKGAFALIYPGAFNMTTGPMHWSLLARARAVDNQLYVGLCSPARDMEATYHAWGHSLIANPAAEVLVEAEDKETIVYADLDNDTIQSTRKGIPVYT QRRFDLYPDVSAEK
粗糙链孢霉(Neurospora crasa)OR74A氨基酸序列（Genbank登录号XP_960906.1）[SEQ ID NO:25]：
MASSTKHPILLKKPVKLACIQLASGADKSANLSHAADKVREAASGGANIVVLPECFNSPYGCDFFPSYAEQLLPSPPTVEQSPSFHALSAMARDNGIYLVGGSIPELAIEEGTEDKKTYYNTSLVFGPDGKLLASHRKVHLFDIDIPGKIKFKESDVLSPGNSVTLVDLPDYGRIAVAICYDIRFPELAMIAARKGCFALVYPGAFNTTTGPLHWRLQGQARAMDNQIYVALCSPARDISASYHAYGHSLIVDPMARVLVEAEESETIVSAELDGTKI EEARSGIPLRDQRRFDIYPDVSQAKPFF
豌豆根瘤菌蚕豆生物型（Rhizobium leguminosarum bv.viciae）3841氨基酸序列（Genbank登录号YP_769862.1）[SEQ ID NO:26]：
MSFKAAAVQMCSGVDPVRNAAAMARLVREAAGQGAIYVQTPEMTGMLQRDRAAARAVLADEAHDIIVKTGSDLARELGIHMHVGSTAIALADGKIANRGFLFGPDGRILNRYDKIHMFDVDLDNGESWRESAAYTAGSEARVLSLPFAEMGFAICYDVRFPALFRAQAMAGAEVMTVPAAFTKQTGEAHWEILLRARAIENGVFVIAAAQAGRHEDGRESFGHSMIIDPWGTVLASAGATGEAVIVAEIDPSAVKAAHDKIPNLRNGREFSVEKIAGAIAGGVAA
埃特里根瘤菌（Rhizobium etli）CFN 42氨基酸序列（Genbank登录号YP_471237.1）[SEQ ID NO:27]：
MSFKAAAIQMCSGVDPVKNAASMARLVREAAAQGATYVQTPEMTGMLQRDRAAARAVLADEAHDIIVKTGSELARELGIHVHVGSTAIALSDGKIANRGFLFGPDGRILNRYDKIHMFDVDLDNGESWRESAAYTAGSEARVLSLPFAEMGFAICYDVRFPALFRAQAVAGAEVMTVPSSFSRQTGEAHWEILLRARAIENGVFVIAAAQAGRHEDGRETFGHSIIIDPWGTVLASAGATGEAVILAEIDPGAVKAAHDKIPNLRDGREFSVEKIAGAVAGGVAA
豌豆根瘤菌三叶草生物型（Rhizobium leguminosarum bv.trifolii）WSM1325氨基酸序列（Genbank登录号YP_002977603.1）[SEQ ID NO:28]：
MSFKAAAVQMCSGVDPVKNAAAMARLVREAAGQGATYVQTPEMTGMLQRDRTAARAVLADEAHDIIVKTGSELAIELGIHMHVGSTAIALADGKIANRGFLFGPDGRVLNRYDKIHMFDVDLDNGESWRESAAYTAGSEARVLSLPFAEMGFAICYDVRFPALFCAQAVAGAEVMTVPAAFTKQTGEAHWEILLRARAIENGVFVIAAAQAGRHEDGRETFGHSMIIDPWGTVLASAGATGEAVIVAEIDPAAVKAAHDKIPNLRNGREFSVEKIAGAIAGGVAA
慢生根瘤菌菌株ORS278（Bradyrhizobium sp.ORS278）氨基酸序列（Genbank登录号YP_001202760.1）[SEQ ID NO:29]：
MSNDRSFTAAMVQMRTALLPEPSLEQGTRLIREAVAQGAQYVQTPEVSNMMQLNRTALFEQLKSEEEDPSLKAYRALAKELNIHLHIGSLALRFSAEKAVNRSFLIGPDGQVLASYDKIHMFDIDLPGGESYRESANYQPGETAVISDLPWGRLGLTICYDVRFPALYRALAESGASFISVPSAFTRKTGEAHWHTLLRARAIETGCFVFAAAQCGLHENKRETFGHSLIIDPWGEILAEGGVEPGVILARIDPSRVESVRQTIPSLQHGRRFGIADPKGGPDYLHLVRGSA
苜蓿根瘤菌（Sinorhizobium meliloti）BL225C氨基酸序列（Genbank登录号ZP_07592670.1）[SEQ ID NO:30]：
MPSSRYFWFLWQFKLAVCQLSICADKEQNIRHAREAIQTAADGGSKLVLLPEMWNCPYSNASFPIYAEDIDAGDSPSSKMLSDMAKSKEVTIIGGSIPERSGNHLYNTCCIYGKDGSLKGKHRKVHLFDIDIPGKIQFKESDTLTPGDKYTVVDTDVGRIGVGICYDIRFPEMAMTYAARGVHMICYPGAFNMTTGPAHWELLQKARAVDNQLFVATCSPARNPSAGYVAWGHSSVIGPFGEILASTGREEAIFYADIDYAQIKERRMNMPLDHQRRGDLYQLVDLTFTT
苜蓿根瘤菌（Sinorhizobium meliloti）1021氨基酸序列（Genbank登录号NP_386723.1）[SEQ ID NO:31]：
MTFKAAAVQICSGVDPAGNAETMAKLVREAASRGATYVQTPEMTGAVQRDRTGLRSVLKDGENDVVVREASRLARELGIYLHVGSTPIARADGKIANRGFLFGPDGAKICDYDKIHMFDVDLENGESWRESAAYHPGNTARTADLPFGKLGFSICYDVRFPELFRQQAVAGAEIMSVPAAFTRQTGEAHWEILLRARAIENGLFVIAAAQAGTHEDGRETFGHSMIVDPWGRVLAEAGATGEEIIVAEIDVAAVHAARAKIPNLRNARSFVLDEVVPVGK GGAAA
致病疫霉(Phytophthora infestans)T30-4氨基酸序列（Genbank登录号XP_002999170.1）[SEQ ID NO:32]：
MLGRTIRSQARHLRSPFLRLSSPMSTTAPKFKLALCQIAVGDDKQKNIATATAAVTEAAQNAAQVVSLPECWNSPYATTSFPQYAEEIPEKKAALNEKEHPSTFALSQLAAKLQIFLVGGSIPEKDATGKVYNTSVIFSPEGEILGKHRKVHLFDIDVPGKITFKESDTLSPGNSMTLFDTPYGKMGVGICYDIRFPELSMLMKKQGAKVLLFPGAFNLTTGPAHWELLQRARAVDNQLYVAATSPARGPEGGYQAWGHSTVISPWGEVVATCGHGESIVYAEVDLEKVEEMRRNIPTTNQTRSDLYELVQK
智人（Homo sapiens）氨基酸序列（Genbank登录号NP_064587.1）[SEQ IDNO:33]：
MTSFRLALIQLQISSIKSDNVTRACSFIREAATQGAKIVSLPECFNSPYGAKYFPEYAEKIPGESTQKLSEVAKECSIYLIGGSIPEEDAGKLYNTCAVFGPDGTLLAKYRKIHLFDIDVPGKITFQESKTLSPGDSFSTFDTPYCRVGLGICYDMRFAELAQIYAQRGCQLLVYPGAFNLTTGPAHWELLQRSRAVDNQVYVATASPARDDKASYVAWGHSTVVNPWGEVLAKAGTEEAIVYSDIDLKKLAEIRQQIPVFRQKRSDLYAVEMKKP
家马（Equus caballus）氨基酸序列（Genbank登录号XP_001502234.1）[SEQ ID NO:34]：
MAAHSILDLSGLDRESQIDLQRPLKARPGKAKDLSSGSACTFRLALIQLQVSSVKSDNLTRACGLVREAAAQGAKIVCLPECFNSPYGTNYFPQYAEKIPGESTQKLSEVAKECSIYLIGGSIPEEDAGKLYNTCAVFGPDGALLVKHRKLHLFDIDVPGKITFQESKTLSPGDSFSTFDTPYCRVGLGICYDLRFAELAQIYAQRGCQLLVYPGAFNLTTGPAHWELLQRGRAVDNQVYVATASPARDDKASYVAWGHSTVVTPWGEVLATAGTEEMIV YSDIDLKKLAEIRQQIPIFSQKRLDLYAVEAKKP
热带爪蟾（Xenopus(Silurana）tropicalis）氨基酸序列（Genbank登录号NP_001016633.1）[SEQ ID NO:35]：
MAKFRLSLVQFLVSPVKSENLNRACKLIKEAAQKGAQIVALPECFNSPYGTKYFPEYAEKIPGESTERLSQVAKECGIYLIGGSIPEEDSGKLYNTCAVFGPDGTLLVKHRKIHLFDIDVPGKIRFQESETLSPGDSFSVFETPYCKVGVGICYDIRFAELAQLYSKKGCQLLVYPGAFNMTTGPAHWELLQRARALDNQVYVATASPARDEKASYVAWGHSTIVSPWGEVIAKAGSEETVISADIDLEYLAEIREQIPIRRQRRHDLYSVEEKKN
斑马鱼(Danio rerio)氨基酸序列（Genbank登录号AAQ97821.1）[SEQ IDNO:36]：
MSKFRLAVVQLHVSKIKADNLGRAQTLVTEAAGQGAKVVVLPECFNSPYGTGFFKEYAEKIPGESTQVLSETAKKCGIYLVGGSIPEEDGGKLYNTCSVFGPDGTLLVTHRKIHLFDIDVPGKIRFQESETLSPGKSLSMFETPYCKVGVGICYDIRFAELAQIYAKKGCQLLVYPGAFNMTTGPAHWELLQRGRAVDNQVYVATASPARDETASYVAWGHSSVINPWGEVISKAGSEESVVYADIDLQYLADVRQQIPITKQRRNDLYSVNSVQEG
海葵(Nematostella vectensis)氨基酸序列（Genbank登录号XP_001622809.1）[SEQ ID NO:37]：
MAVPILVFRIGLVQLAVTANKLQNLQRAREKIKEAVAAGAKIVALPECFNSPYGTQYFKDYAEEIPGESSNMLAEVAKETGAYIVGGSIPERASNGKLYNTSLSYDPSGNLMGKHRKIHLFDIDVPGKIRFQESEVLSPGENLTILDTEYCKIGIGICYDMRFPELAQLYAKKGCHLLLYPGAFNMTTG PAHWELLTRARALDNQLYVATISPARDDNATYIAWGHSTVVNPWGKIVSKADHTEQILYAEIDLKYLNEVRSQIPVQFQKRDDVYELQVK
家鼠（Mus musculus）氨基酸序列（Genbank登录号NP_075664.1）[SEQID NO:38]：
MSTFRLALIQLQVSSIKSDNLTRACSLVREAAKQGANIVSLPECFNSPYGTTYFPDYAEKIPGESTQKLSEVAKESSIYLIGGSIPEEDAGKLYNTCSVFGPDGSLLVKHRKIHLFDIDVPGKITFQESKTLSPGDSFSTFDTPYCKVGLGICYDMRFAELAQIYAQRGCQLLVYPGAFNLTTGPAHWELLQRARAVDNQVYVATASPAR DDKASYVAWGHSTVVDPWGQVLTKAGTEETILYSDIDLKKLAEIRQQIPILKQKRADLYTVESKKP
拟南芥ω酰胺酶氨基酸序列与其他推定植物ω酰胺酶和其他推定动物ω酰胺酶的氨基酸序列比对以鉴定保守区域。所述序列比对的结果示于图2和图3。同源性区域以色差且在共有序列中显示（图2的SEQ ID NO:44和图3的SEQ ID NO:45）。
拟南芥ω酰胺酶的其他同源物列于下表1。
表1
Figure BDA00002313716900251
Figure BDA00002313716900261
Figure BDA00002313716900271
因此，在某些实施方式中，所述ω酰胺酶转基因编码的多肽有与选自下列多肽所编码氨基酸序列至少75%、至少80%、至少85%、至少（at last）90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的氨基酸序列：
AAL91613.1,ACN30911.1,ABK22312.1,ACJ85250.1,AAQ97821.1,CBJ25483.1,EFN54567.1,NP_196765.2,XP_002871509.1,NP_974769.1,XP_002309478.1,XP_002279687.1,NP_001146676.1,NP_001146295.1,NP_001049134.1,XP_002516116.1,XP_001766085.1,XP_001756522.1,XP_002969787.1,XP_002985119.1,XP_002948137.1,XP_001690839.1,NP_001057093.1,XP_002468410.1,NP_064587.1,XP_001089575.2,XP_001502234.1,XP_002502298.1,XP_526254.2,XP_535718.2,XP_002716659.1,NP_001033222.1,NP_001029298.1,NP_001016633.1,NP_001085409.1,XP_002758928.1,XP_003064056.1,NP_001135127.1,XP_001622809.1,NP_991174.2,XP_002594716.1,NP_075664.1,XP_001370849.1,NP_001090454.1,XP_002999170.1 XP_002917137.1,XP_002741281.1,XP_002131764.1,NP_594154.1,XP_001742101.1,XP_416604.2,XP_002194275.1,XP_001599587.1 XP_002410555.1,XP_003035898.1,XP_002183613.1,XP_001875493.1 XP_002112209.1,XP_636983.1,XP_002158547.1,XP_002839272.1,XP_307722.3,XP_001819629.1,XP 001268376.1 ZP_08115581.1,YP_001320997.1,XP_369268.1,XP_002626458.1,XP_751200.1,XP_001657673.1,XP_002173486.1,XP_001212538.1,XP_001258462.1,XP_002434512.1,XP_960906.1,XP_002847679.1,XP_967861.1,XP_002426154.1,XP_003176259.1,XP_500602.1,XP_001428419.1,XP_003014235.1,XP_001393123.1,ZP_03608460.1,XP_002147261.1,ZP_03293831.1,XP_002290043.1,XP_003065597.1,XP_001588734.1,YP_001273073.1,XP_001552800.1,XP_446414.1,XP_002792830.1,XP 001998501.1YP_003780301.1,NP_013455.1,XP_002404736.1,YP_001086961.1,ZP_05328587.1,ZP_05399936.1,YP_001113615.1,XP_001247884.1,XP_390426.1,XP_003025334.1,XP_002052999.1,YP_769862.1,ZP_07325748.1,ZP_05349666.1,YP_471237.1,YP_002977603.1,YP_001202760.1,ZP_07592670.1,和NP_386723.1。在其他实施方式中，所述ω酰胺酶转基因纳入所述转基因植物的基因组。
本公开的某些方面涉及与根优先性启动子的ω酰胺酶转基因操作性连接。本文使用的“根优先性启动子”涉及与一种或多种非根细胞或组织相比，在根细胞或组织中选择性增强的启动子所驱动的表达。例如，根优先性启动子可以优先在根细胞或组织中驱动基因的高水平表达，但是在其他非根细胞或组织例如叶中仍驱动该基因的低水平表达。根组织包括但不限于根冠、顶端分生组织、原表皮、基本分生组织、原形成层、内皮、皮层、维管皮层、表皮等中的至少一种。
在某些其他实施方式中，通过增加根组织中2-氧代缩环戊酸单酰胺的天然降解，下降根组织中的2-氧代缩环戊酸单酰胺水平以增加其叶-根比率。例如，可以通过上调根中ω酰胺酶活性来增加根组织中所述2-氧代缩环戊酸单酰胺的降解。因此，在一个实施方式中，ω酰胺酶转基因包括但不限于本文公开的任何ω酰胺酶基因和编码序列，所述ω酰胺酶转基因在根优先性启动子的控制下引入到植物中，所述根优先性启动子例如毛根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）的rolD启动子（Kamo和Bowers,1999,Plant CellReports 18:809-815和其引用的参考文献）。rolD启动子控制rolD的表达，rolD的功能是增加根延长。rolD启动子控制的GUS蛋白表达显示主要产生根优先性GUS的表达(Leach和Aoyagi,1991,Plant Sci.79,69-76)。根优先性启动子可以是“组成型”或“诱导型”。
其他组成型和/或诱导型根优先性启动子包括但不限于：RolD-2启动子；富甘氨酸启动子(GRP)；ADH启动子，包含玉米ADH1启动子(Kyozuka,J等，1994,The Plant Cell 6:799-810)；PHT启动子，包含Pht1基因家族启动子(Schunmann等，2004,J.Experimental Botany 55:855-865)；金属摄取蛋白启动子，包含玉米金属硫蛋白启动子(Diehn,S,2006Maize（玉米），美国专利申请公开US 2006/0005275)；35S CaMV结构域A启动子(Elmayan,T和M.Tepfer.1995,Transgenic Research 4:388-396)；pDJ3S,SIREO和pMe1启动子(Arango等，Plant Cell Rep.2010年6月;29(6):651-9.电子公开2010年4月6日)；Sad1和Sad2启动子(美国专利申请公开US 2008/0244791)；TobRB7启动子(Yamamoto等，1991,Plant Cell 3:371-3)；RCc3启动子(Xu等，1995,Plant Mol.Biol.27:237-248)；FaRB7启动子(Vaugn等，Exp.Bot.(2006)57(14):3901-3910)；SPmads启动子(Noh等，美国植物生物学家协会（American Society ofPlant Biologists），植物生物学2005年会议（Plant Biology 2005Conference），摘要#1097)；IDS2启动子(Kobayashi等，The Plant Journal,Vol.36(6):780-793,2003年12月)；pyk10启动子(Nitz等，Plant Sci.2001年7月;161(2):337-346)；Pt2L4启动子(De Souza等，Genet.Mol.Res.8(1):334-344(2009))；Lbc3豆血红蛋白启动子(Bak,K等，1993,The Plant Journal 4(3)577-580)；PEPC启动子(Kawamura等，1990,J.Biochem 107:165-168)；Gns1葡聚糖酶根启动子(Simmons,C等，1992,Plant Molecular Biology 18:33-45)，35S2启动子(Elmayan,T和M.Tepfer.1995,Transgenic Research 4:388-396)；GI4和GI5启动子(欧洲专利EP 1862473B1；和GRP启动子。另外，任何所公开的根优先性启动子可以是只包含足以驱动根组织中表达的启动子核心结构域或功能结构域的截短形式。再者，根优先性启动子也包含本文公开的任何根优先性启动子的同种型。例如，所述RolD-2启动子是描述于Leach和Aoyagi,1991,Plant Sci.79,69-76中的RolD启动子的数个截短同种型之一。另外，Leach和Aoyagi描述所述RolD-2启动子是高度根优先性启动子。因此，根优先性启动子也包含Leach和Aoyagi描述的任何RolD异构体。
因此，在某些实施方式中，所述根优先性启动子选自RolD启动子、RolD-2启动子、富甘氨酸蛋白启动子、GRP启动子、ADH启动子、玉米ADH1启动子、PHT启动子、Pht1基因家族启动子、金属摄取蛋白启动子、玉米金属硫蛋白蛋白启动子、35S CaMV结构域A启动子、pDJ3S启动子、SIREO启动子、pMel启动子、Sad1启动子、Sad2启动子、TobRB7启动子、RCc3启动子、FaRB7启动子、SPmads启动子、IDS2启动子、pyk10启动子、Lbc3豆血红蛋白启动子、PEPC启动子、Gns1葡聚糖酶根启动子、35S2启动子、GI4启动子、GI5启动子和GRP启动子。
在稳定的转化实施方式中，ω酰胺酶转基因的一个或多个拷贝整合到转基因植物的基因组中，因此提供在植物根组织中增加的ω酰胺酶容量，用于调节2-氧代缩环戊酸单酰胺的合成，进而是代谢基因表达的信号，使得氮利用效率提高，进而引起植物生长的增加和其他农艺学特性的提高。
在其他实施方式中，相对于不含ω酰胺酶转基因的相同种植物，所述ω酰胺酶转基因的根优先性表达引起2-氧代缩环戊酸单酰胺的叶-根比率增加。在某些优选实施方式中，所述2-氧代缩环戊酸单酰胺的叶-根比率是不含ω酰胺酶转基因的相同种植物的至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍或更高。
在其他实施方式中，所述转基因植物的氮利用效率提高。氮利用效率提高的公开转基因植物还可以包含对提高氮利用效率的其他转基因，包括但不限于描述于美国专利号7,560,626中的那些。
通过抑制Ω酰胺酶活性来削弱叶组织中2-氧代缩环戊酸单酰胺的降解：
本发明的其他方面涉及叶组织中内源性ω酰胺酶表达被抑制的转基因植物。
因此，在某些实施方式中，降低ω酰胺酶活性以削弱2-氧代缩环戊酸单酰胺或其类似物的降解，以使叶中2-氧代缩环戊酸单酰胺积累，因此增加叶-根比率。更特定的，可以使用下述方法阻止2-氧代缩环戊酸单酰胺的降解通路。
在一个特定的实施方式中，通过应用化学抑制剂来抑制所公开的任何转基因植物叶组织中ω酰胺酶催化的2-氧代缩环戊酸单酰胺的正常代谢降解，包括但不限于本文公开的任何ω酰胺酶，所述化学抑制剂包括但不限于6-重氮-5-氧代-正亮氨酸、p-羟基苯甲酸汞、二异丙基氟磷酸盐、氰化钠、苯基乙酸汞化物、碘乙酸盐（lodoacetate）、硝酸银、苯磺酸氯汞、和硫酸铜。因此，在某些实施方式中，由化学抑制剂来抑制所公开的任何转基因植物叶组织中内源性ω酰胺酶的表达，所述化学抑制剂选自6-重氮-5-氧代-正亮氨酸、p-羟基苯甲酸汞、二异丙基氟磷酸盐、氰化钠、苯基乙酸汞化物、碘乙酸盐（lodoacetate）、硝酸银、苯磺酸氯汞、和硫酸铜。
在另一个实施方式中，从遗传上阻止ω酰胺酶基因的转录和/或翻译（包括但不限于本公开的ω酰胺酶基因和编码序列）可以抑制所公开的任何转基因植物叶组织中ω酰胺酶功能。阻止ω酰胺酶表达和功能的方法包括但不限于，隐性基因破坏和显性基因沉默。
本文使用的“隐性基因破坏”指突变靶标ω酰胺酶序列以消除表达或功能。突变靶标序列的方法为本领域已知，并且包括但不限于，通过化学或放射损伤产生突变且随后分离突变体。另外，可以使用降低功能表型的表达的已知分子生物学方法，包括但不限于多种敲除或敲减方法。这些方法利用所述感兴趣基因或所述基因两侧的DNA序列的序列知识。然后检测所述序列以找到能靶向以实现切割所述靶标序列或基因片段的合适序列。因此，在某些实施方式中，所公开转基因植物叶组织中的内源性ω酰胺酶表达通过隐性基因破坏来抑制，所述隐性基因破坏选自消除内源性ω酰胺酶表达的突变ω酰胺酶基因、内源性ω酰胺酶敲除突变体和内源性ω酰胺酶敲减突变体。
本文使用的“显性基因沉默”指诱导或毁坏/抑制基因的mRNA转录物，一种通过特定启动子选择来提供具有以空间或时间方式完成的益处的方法。显性基因沉默方案中，dsRNA产生的RNAi是基因沉默中最有力和最有效的方法之一，并且能增强或利用天然的调节机制，所述调节机制用对内源性ω酰胺酶基因特异的反义寡核苷酸来破坏完整的mRNA。(综述参见Behlke,2006,Molecular Therapy 13(4):644-670；也参见Tang和Galili,2004,TrendsBiotechnology 22:463-469；Rajewsky和Socci,2004,Developmental Biology267:529-535；Hamilton等，2002,EMBO J.21:4671-4679J)。在一个实施方式中，将包含叶特异性启动子（例如RuBisCo小亚基启动子）控制下合适RNAi序列的构建体引入到植物中以沉默ω酰胺酶基因的表达。因此，在某些实施方式中，所公开的任何转基因植物叶组织中所述内源性ω酰胺酶表达通过对内源性ω酰胺酶基因特异的RNAi反义寡核苷酸来抑制。
在某些实施方式中，叶组织中抑制内源性ω酰胺酶表达造成相对于不含叶组织中被抑制内源性ω酰胺酶表达的相同种植物，2-氧代缩环戊酸单酰胺的叶-根比率增加。在某些优选实施方式中，所述2-氧代缩环戊酸单酰胺的叶-根比率是不含叶组织中被抑制内源性ω酰胺酶表达的相同种植物的至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍或更高。在其他实施方式中，所述转基因植物的氮利用效率提高。
相似地，使用本文公开的任何方法可削弱根组织中底物GS和/或催化蛋白GPT的表达。
涉及根组织中Ω酰胺酶活性增加和叶组织中Ω酰胺酶活性被抑制的转基因植物的实施方式：
本公开的某些方面涉及根组织中ω酰胺酶活性表达增加和叶组织中ω酰胺酶活性表达被抑制、造成2-氧代缩环戊酸单酰胺的叶-根比率增加的转基因植物。
因此，在某些实施方式中，包含与根优先性启动子的ω酰胺酶转基因操作性连接的转基因植物还抑制叶组织中内源性ω酰胺酶表达。示例性转基因植物ω酰胺酶转基因和根优先性启动子描述于上面的部分。在其他实施方式中，所述叶组织中内源性ω酰胺酶表达通过隐性基因破坏、显性基因沉默或化学抑制剂来抑制。在其他实施方式中，叶组织中的内源性ω酰胺酶表达通过隐性基因破坏来抑制，所述隐性基因破坏选自消除内源性ω酰胺酶表达的突变ω酰胺酶基因、内源性ω酰胺酶敲除突变体和内源性ω酰胺酶敲减突变体。在其他实施方式中，叶组织中所述内源性ω酰胺酶表达通过对内源性ω酰胺酶基因特异的RNAi反义寡核苷酸来抑制。在另一些实施方式中，叶组织中所述内源性ω酰胺酶的表达通过化学抑制剂来抑制，所述化学抑制剂选自6-重氮-5-氧代-正亮氨酸、p-羟基苯甲酸汞、二异丙基氟磷酸盐、氰化钠、苯基乙酸汞化物、碘乙酸盐（lodoacetate）、硝酸银、苯磺酸氯汞、和硫酸铜。在另一些实施方式中，所述转基因植物的2-氧代缩环戊酸单酰胺叶-根比率增加。在某些优选实施方式中，所述2-氧代缩环戊酸单酰胺的叶-根比率是未改良的相同种植物的至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍或更高。在其他实施方式中，所述转基因植物的氮利用效率提高。
在某些实施方式中，相对于不含叶组织中内源性ω酰胺酶被抑制表达的相同种植物，叶组织中内源性ω酰胺酶表达被抑制的转基因植物，还包含ω酰胺酶转基因，其中所述叶组织中内源性ω酰胺酶表达通过至少一种内源性ω酰胺酶基因的隐性基因破坏或显性基因沉默来抑制，其中所述ω酰胺酶转基因与根优先性启动子操作性连接。示例性转基因植物、隐性基因破坏、显性基因沉默、ω酰胺酶转基因和根优先性启动子描述于上面的部分。在另一些实施方式中，所述转基因植物的2-氧代缩环戊酸单酰胺叶-根比率增加。在某些优选实施方式中，所述2-氧代缩环戊酸单酰胺的叶-根比率是未改良的相同种植物的至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍或更高。在其他实施方式中，所述转基因植物的氮利用效率提高。
谷氨酰胺苯丙酮酸转氨酶和谷氨酰胺合成酶的表达：
本公开的其他方面涉及根组织中ω酰胺酶表达增加和叶组织中ω酰胺酶表达抑制的转基因植物，所述转基因植物还包含增加表达的谷胺酰胺苯丙酮酸(GPT)和/或谷氨酰胺合成酶(GS)。
在特定的实施方式中，本文公开的任何转基因植物还过量表达所述GPT蛋白，其直接涉及2-氧代缩环戊酸单酰胺的合成，产生更高的2-氧代缩环戊酸单酰胺化合物的叶-根比率。在相关的实施方式中，本文公开的任何转基因植物还过量表达所述GPT蛋白和GS蛋白。这些还包含GPT和GS的转基因植物有甚至更高的2-氧代缩环戊酸单酰胺的叶-根比率，使得氮利用效率进一步提高。这种氮利用效率的提高也引起植物生长更快、生成更多种子和果实/荚产量、显示更早和更多产的开花、显示对高盐条件的耐受性增加和生成更优的生物量产量(参见共同拥有的、共同待审的美国专利申请号12/551,271)。
更特定地，申请人确定转基因植物中GPT和GS的过量表达造成所述叶部和地下部分组织中2-氧代缩环戊酸单酰胺相对浓度的不成比例增加。另外，地上部分组织与地下部分组织的2-氧代缩环戊酸单酰胺浓度的比率（叶-根比率）与植物生物量正相关。相较于野生型植物，更快生长、更大遗传工程改造的植物中叶组织对比根组织的2-氧代缩环戊酸单酰胺浓度比率更大。在一个特定的实施方式中，载有强组成型启动子控制下GPT和GS1转基因的转基因烟草植物与野生型烟草植物相比，显示显著更高的2-氧代缩环戊酸单酰胺叶-根比率和高生长表型。特定地，发现两个过量表达GPT和GS1转基因的转基因烟草系具有：(1)超过野生型植物鲜重2倍，(2)与野生型植物相比，2倍的2-氧代缩环戊酸单酰胺叶部浓度，和(3)野生型植物中观察到的叶-根比率的2-3倍。
在野生型或工程改造的植物中，能预期所述比率反映植物的叶对比根中所述2-氧代缩环戊酸单酰胺和谷氨酰胺（生成其的底物）的相对浓度。预期所述实际比率在不同种之间不同。这是由于这一事实，即叶和根具有氮同化机制和活性的不同部分，随着植物种的功能而变化(Pate,1980,Ann.Rev.PlantPhysiol.31:313-340)。事实上，一些植物种在其根同化大部分氮，并且因此在其根和木质部有高氨基酸浓度，而在其叶中浓度更低。其他植物在其叶中同化大部分氮，因此在其叶中有高氨基酸浓度，而在其根中浓度更低。植物种本身沿着叶和根之间连续的这种运作和氨基酸浓度来分布。
除了在转基因植物系统中天然GPT蛋白的过量表达，可以开发遗传工程改造的、增强的GPT酶并用于提高2-氧代缩环戊酸单酰胺合成动力学，因此增加叶中2-氧代缩环戊酸单酰胺积累的速率。所述GPT酶可以根据与已知良好鉴定的天冬氨酸氨基转移酶的序列同源性，广泛分类为天冬氨酸氨基转移酶类型的酶成员。所述主要的基因序列数据库包含作为其序列分析一部分的转移酶分类（例如Gen Bank）。这些特征性地为催化氨基酸和酮酸之间转氨反应的维生素B6依赖性酶。这些很多（约1000）转氨酶的动力学属性在底物特异性、结合常数、最大速率（Vmax）和单分子转换率（Kcat）等属性上不同。直接涉及所述底物二羧酸底物氢键的特异精氨酸残基高度保守（Fotheringham等，1986,Biochem J.234:593-604；Seville等，1988,Biochemistry27:8344-8349:Jager等，1992,FEBS Lett.306:234-238）并且因此其他氨基酸残基的改变经常使特异性和动力学属性改变。证明所述酶的性能对残基结构的微小改变非常灵敏，所述残基结构的改变例如在与底物或辅助因子不直接接触的残基上加入单个CH2基团(Jansonius和Vincent,1987;Seville等，1988，同上)。多个研究显示可能用野生型蛋白的定向突变改变天冬氨酸氨基转移酶的属性（Kohler等，1994,Biochemistry 33:90-97;Jager等，1994,Protein Engineering.7:605-612）。
在植物GPT序列内，所述区域NLGQGFP(SEQ ID NO:18)高度保守(并且在大豆、葡萄、大米大麦和拟南芥序列中完全保守(见美国专利申请号12/551,271和美国专利申请号12/551,193)。申请人使用所述定向突变方法通过在所述野生型序列中用V(缬氨酸)取代F(苯丙氨酸)来从所述天然拟南芥GPT生成突变GPT。所得的GPT/F:V突变体使用普通PET载体系统在大肠杆菌（E.coli）中表达，并且显示提高的最大速率和单分子转换。最大速率使用式Vmax=Kcat[E]tot测定。所述表观单分子速率常数kcat也称为转换数目，并且表示每秒催化酶反应的最大数目。
突变体的Vmax增加到6.04，比所述野生型Vmax值5.07增加20%。采取注意以保证在这些实验中使用相同数量的蛋白，并且因此能应用Vmax=Kcat[E]tot的关系以显示所述突变体的单分子转换率增加。所述突变体的谷氨酰胺Km是0.75毫摩尔，比所述野生型酶测量的0.30mM Km稍微增加。当所述底物谷氨酰胺以毫摩尔或更高数量级出现以保证所述突变体饱和时，预期所述突变GPT酶比所述野生型GPT在每个单位时间生成更多产物2-氧代缩环戊酸单酰胺。植物和农学文献的检索显示营养良好的植物包含毫摩尔的谷氨酰胺浓度(Dzuibany等，Plants 206:515-522；Knight和Weissman,1982,PlantPhysiol 70:1683-1688;Sivasankar 和Oaks,1995,Plant Physiol.107:1225-1231;Yanagisawa等，2004,Proc.Natl Acad Sci.USA 101:7833-7838;Udy和Dennison,1997,Australia J Experimental Marine Biology and Ecology 217:253-277)。
所述GPT/F:V突变蛋白的氨基酸序列如下（V取代以粗体显示）[SEQ IDNO:1]：
MYLDINGVMIKQFSFKASLLPFSSNFRQSSAKIHRPIGATMTTVSTQNESTQKPVQVAKRLEKFKTTIFTQMSILAVKHGAINLGQGVPNFDGPDFVKEAAIQAIKDGKNQYARGYGIPQLNSAIAARFREDTGLVVDPEKEVTVTSGCTEAIAAAMLGLINPGDEVILFAPFYDSYEATLSMAGAKVKGITLRPPDFSIPLEELKAAVTNKTRAILMNTPHNPTGKMFTREELETIASLCIENDVLVFSDEVYDKLAFEMDHISIASLPGMYERTVTMNSLGKTFSLTGWKIGWAIAPPHLTWGVRQAHSYLTFATSTPAQWAAVAALKAPESYFKELKRDYNVKKETLVKGLKEVGFTVFPSSGTYFVVADHTPFGMENDVAFCEYLIEEVGVVAIPTSVFYLNPEEGKNLVRFAFCKDEETLRGAIERMKQKLKRKV
在此残基处生成另两个取代突变体，并且一个也在大肠杆菌中表达和进行动力学分析（F:L突变），但是显示更高（不太需要）的Km值1.98和降低的Vmax值4.0。
在本公开此方面的另一种方法中，可以设计GPT和/或GS转基因以利用所述靶标植物种类优先的所述密码子使用。良好确立了植物中密码子使用以在单子叶植物和双子叶植物之间特定改变；通常单子叶植物看似有更高的整体GC使用，第三碱基位点有非常显著的GC优选(Kawabe和Miyashita,2003,Genes&Genetic Systems 78(5):343-52)。密码子使用偏向与蛋白表达水平相关（Hiroaka等，2009）。因此本领域技术人员能参考诸如密码子使用数据库（Codon Usage Database）或Kawabe和Miyashita的工作等来源比较数个单子叶植物和双子叶植物或其他基因组序列信息，和使用或推断所述靶标植物优先的密码子使用并且简单设计和合成所述优化基因序列。
在本公开此方面的另一种方法中，GPT和/或GS结构的一致工程改造用于生成显示蛋白稳定性大幅增加以提高植物中GPT活性数量的共有变种。在这个方法中，修饰所述天然序列以更紧密类似来自特定家族的多个蛋白比对的共有序列（Schiller等，1994,J Mol.Biol.240:188-192）。
因此，在某些实施方式中，有本文所公开ω酰胺酶表达调节的任何转基因植物还包含GPT转基因。在某些实施方式中，所述GPT转基因是由SEQ IDNO:1编码的GPT/F:L突变体。在其他实施方式中，本文公开的任何转基因植物还包含GPT转基因和GS转基因。在另一些实施方式中，所述GPT转基因和GS转基因各与叶优先性启动子操作性连接。本文使用的“叶优先性启动子”指与一种或多种非叶细胞或组织相比，在叶细胞或组织中选择性增强的启动子所驱动的表达。例如，叶优先性启动子可以优先在叶细胞或组织中驱动基因的高水平表达，但是在其他非叶细胞或组织例如根中驱动基因的低水平表达。
在其他实施方式中，任何所公开的转基因是植物中优化表达的密码子。在另一些实施方式中，所述转基因植物的2-氧代缩环戊酸单酰胺叶-根比率增加。在某些优选实施方式中，所述2-氧代缩环戊酸单酰胺的叶-根比率是未改良的相同种植物的至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍或更高。在其他实施方式中，所述转基因植物的氮利用效率提高。
叶组织中通过基因激活来增加2-氧代缩环戊酸单酰胺生物合成：
另一个方法中，参与代谢通路、生成2-氧代缩环戊酸单酰胺的蛋白编码基因（所述基因可以“沉默”并且在植物的特定细胞类型中不表达）可以通过基因激活方法来激活或打开（turn-on），例如TKT公司（TranskaryoticTherapies,Inc）开发的同源重组方法(见例如美国专利6,187,305)。这些方法中，基因的所述内源性调节区域用来自不同基因的调节序列或在细胞中出现会引起基因表达的新调节序列来取代。所述调节序列可以由启动子、增强子、支架连接区、负调节元件、转录起始位点、调节蛋白结合位点或这些序列的组合构成。因此，编码所需基因产物的内源性基因拷贝被打开和表达，并且不需要引入所述基因的外源性拷贝。
在相关实施方式中，转录因子上调或过量表达可以用于增加基因转录，有利于更高的2-氧代缩环戊酸单酰胺和/或其类似物的叶-根比率。在一个实施方式中，作为转基因引入所述Dof-1转录因子以诱导酶编码基因上调用于碳骨架生成、氨基酸含量显著增加和葡萄糖水平下降，如前面在转基因拟南芥中所报道的。Dof-1转录因子的过量表达显示改善低氮条件下的氮同化和生长（Yanagisawa等，2004,PNAS 101:7833-7838）。此报道中，所述转录因子在植物中是组成型表达。在地上部分植物组织中，预期所述Dof-1转录因子的单独过量表达或与其他测量物例如GS和GPT的过量表达（或其突变的功能性提高）联合，能增加2-氧代缩环戊酸单酰胺的所述叶-根比率。
因此，在某些实施方式中，有本文所公开ω酰胺酶表达调节的任何所述转基因植物也包含增加的内源性GPT表达，其中所述内源性GPT表达通过基因激活增加。在其他实施方式中，本文公开的任何转基因植物包含增加的内源性GS表达，其中所述内源性GS表达通过基因激活增加。在另一些实施方式中，所述转基因植物的2-氧代缩环戊酸单酰胺叶-根比率增加。在某些优选实施方式中，所述2-氧代缩环戊酸单酰胺的叶-根比率是未改良的相同种植物的至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍或更高。在其他实施方式中，所述转基因植物的氮利用效率提高。
合适的转基因植物：
本公开的某些方面涉及转基因植物。本文公开的所述转基因植物可以是所述维管植物门的任何维管植物，包含被子植物和裸子植物。裸子植物可以是单子叶的(单子叶植物)或双子叶的(双子叶植物)植物。重要的单子叶植物包含禾本科植物，例如早熟禾科（Poaceae）和禾本科（Gramineae），包含下列植物：燕麦属（Avena）(燕麦（Avena sativa），燕麦)、大麦属（Hordeum）(即大麦（Hordeum vulgare），生麦)、水稻属（Oryza）(即水稻（Oryza sativa），大米，养殖大米变种)、黍属（Panicum）(黍属，柳枝稷（Panicum virgatum），柳枝稷（Switchgrass）)、梯牧草属（Phleum）(梯牧草（Phleum pratense），猫尾草（Timothy-grass）)、甘蔗属（Saccharum）(即甘蔗（Saccharum officinarum），割手密（Saccharum spontaneum），其杂种，糖蔗（Sugarcane）)、黑麦属（Secale）(即黑麦（Secale cereale），裸麦（Rye）)、高粱属（Sorghum）(高粱（Sorghumvulgare），蜀黍)、小麦属（Triticum）(小麦，多个种类，包含普通小麦（T.aestivum）和硬粒小麦（T.durum）)、荞麦属（Fagopyrum）(荞麦，包含蓼科荞麦（F.esculentum）)、小黑麦属（Triticosecale）(黑小麦（Triticale），小麦和黑麦的多个杂种)、藜草属（Chenopodium）(藜，包含藜麦（C.quinoa）)、玉蜀黍属(即玉蜀黍（Zea mays），多个变种)和粟(即蜡烛稗(Pennisetum glaucum))包含马唐属（Digitaria）(直长马唐(D.exilis）)。
重要的双子叶植物包含：茄科（Solanaceae），例如下列植物：番茄属(Lycopersicon)(番茄（Lycopersicon esculentum），西红柿)、辣椒属（Capiscum）(甜椒（Capsicum annuum），辣椒)、茄属（Solanum）(马铃薯（Solanum tuberosum），土豆，番茄（S.lycopersicum），西红柿)；木薯（Manihot）(树薯，木薯（M.esculenta）)、蕃薯属（Ipomoea）(红薯，甘薯（I.batatas）)、木犀属（Olea）(橄榄，包含油橄榄（O.europaea）)；棉科植物（Gossypium）(即棉属（Gossypiumspp.），陆地棉（G.hirsutum），草本棉（G.herbaceum），棉花)；豆类（Legumes）(豆科（Fabaceae）)，例如豌豆(豌豆（Pisum spp），豌豆栽培品种（P.sativum）)，豆(大豆属（Glycine spp.），橹豆（Glycine max）(大豆)；菜豆（Phaseolus vulgaris），刀豆，绿豆（Vigna radiata），绿豆)，鸡豆(鹰嘴豆（Cicer arietinum）)，扁豆(小扁豆（Lens culinaris）)，花生(落花生（Arachis hypogaea）)；椰子(可可椰子（Cocos nucifera）)和多种其他重要的农作物，例如亚麻荠(亚麻荠（Camelinasativa），芸苔科（Brassicaceae）)，柑橘(柑橘属（Citrus spp），芸香科（Rutaceae）)，咖啡(咖啡属（Coffea spp），茜草科（Rubiaceae）)，瓜(甜瓜属(Cucumis spp)，葫芦科(Cucurbitaceae))，南瓜(南瓜属(Cucurbita spp)，葫芦科(Cucurbitaceae))，蔷薇(蔷薇属(Rosa spp)，蔷薇科（Rosaceae）)，向日葵(向日葵（Helianthusannuus），菊科（Asteraceae）)，甜菜(甜菜属（Beta spp），苋科（Amaranthaceae）)，包含糖甜菜，甜菜（B.vulgaris）)，胡萝卜属（Daucus）(红萝卜，包含胡萝卜（D.carota）)，欧防风属（Pastinaca）(欧洲防风草，包含欧防风（P.sativa）)，萝卜属（Raphanus）(萝卜，包含萝卜（R.sativus）)，薯蓣属(Dioscorea)(山药，包含圆薯蓣（D.rotundata）和黄薯蓣（D.cayenensis）)，辣根属（Armoracia）(辣根，包含马萝卜（A.rusticana）),油棕属（Elaeis）(油椰子，包含油棕（E.guineensis）)，亚麻属（Linum）(亚麻，包含亚麻子（L.usitatissimum）)，红花属（Carthamus）(红花，包含红花（C.tinctoriusL）)，芝麻属（Sesamum）(芝麻，包含芝麻（S.indicum）)，葡萄属（Vitis）(葡萄，包含葡萄（Vitis vinifera）)和芸苔属（Brassica）的植物(十字花科（Brassicaceae），即椰菜、芽甘蓝菜、卷心菜、蕉青甘蓝、芜箐甘蓝、菜籽油甘蓝型油菜(B.napus)和花椰菜)。
可以转化以生成本公开的转基因植物的其他特定植物包含多种其他水果和蔬菜，例如苹果、芦笋、鳄梨、香蕉、黑莓、蓝莓、抱子甘蓝、卷心菜、棉花、加拿大油菜、胡萝卜、萝卜、黄瓜、樱桃、蔓越橘、哈密瓜、茄子、葡萄柚、柠檬、酸橙、油桃、橙子、桃子、菠萝、梨、李子、橘柚、橘子、木瓜、芒果、草莓、覆盆子、莴苣、洋葱、葡萄、奇异果、羊角豆、欧洲防风草、南瓜和菠菜。除了多个有花植物以外，树和观赏植物可以用于生成转基因品种，包括但不限于，百合、康乃馨、菊花、矮牵牛花、紫罗兰、唐菖蒲、羽扇豆属植物、兰花和丁香。
在某些实施方式中，所述转基因植物选自小麦、燕麦、水稻、玉米、豆、大豆、烟草、紫花苜蓿、拟南芥、草、水果、蔬菜、有花植物和树。
本公开的其他方面也涉及本文所公开任何转基因植物的任意代的后代。另一方面涉及本文所公开转基因植物的任意代的种子。
转基因植物的生成：
本公开的某些方面涉及生成氮利用效率提高的转基因植物的方法。生成转基因植物的示例性方法在下面描述。进一步的示例描述在共同拥有的、共同待审的美国专利申请号12/551,271和12/660,501中，其都通过引用全文纳入本文。
转基因构建体/表达载体：
为了生成本公开的所述转基因植物，所需转基因的基因编码序列必需纳入核酸构建体(本文也可以互换地称为（转基因）表达载体、表达盒、表达构建体或可表达的遗传构建体)，其能在转化植物细胞中指导转基因序列的表达。所述载有感兴趣转基因的核酸构建体可以使用本领域已知的方法引入到一种或多种植物细胞中，包括但不限于，电穿孔、DNA轰击或基因射弹方法、微注射，和通过使用多个基于DNA的载体，例如根癌农根菌（Agrobacteriumtumefaciens）和毛根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）载体。一旦引入到所转化植物细胞中，所述核酸构建体可以短暂或稳定的方式指导所纳入转基因（即ω酰胺酶）的表达。优选稳定表达，并且通过使用能指导转基因构建体的染色体整合的植物转化载体来实现。一旦植物细胞成功转化，可以培养以再生转基因植物。
已知很多适于驱动插入基因在转化植物中组成型或诱导型表达的表达载体。另外，已知多种短暂表达载体和系统。很大程度上，选择合适的表达载体用在特定的基因转化方法中（见上）。宽泛而言，生成转基因植物的典型植物表达载体会包含在启动子表达调节控制下的感兴趣转基因、辅助选择转化子的选择性标记和转录终止序列。
更特定地，用于生成本公开的所述转基因植物的核酸构建体的基础元件是：能指导转化植物细胞中转基因的功能表达的合适启动子，例如根优先性启动子，与所述启动子的所述转基因(即ω酰胺酶编码序列)操作性连接，优选与所述转基因的合适转录终止序列(即胭脂碱合成酶基因终止子)操作性连接，和有时用于控制所述转基因表达的其他元件，和适于选择所需转基因产物的一个或多个选择标记基因(即抗生素抗性基因)。
因为根癌农杆菌是用于生成转基因植物的主要转化系统，有多种为农杆菌转化设计的载体。对稳定转化而言，农杆菌系统使用在大肠杆菌和农杆菌中都允许质粒操作的“二元”载体，并且通常包含一个或多个选择标记以恢复转化植物（Hellens等，2000,Technical focus:A guide to Agrobacteriumbinary Ti vectors(技术焦点：农杆菌二元Ti载体应用指南)，Trends Plant Sci5:446-451）。用于农杆菌转化系统的二元载体通常包含所述T-DNA边缘、多个克隆位点、大肠杆菌和根癌土壤杆菌的复制功能、和选择标记和报道基因。
所谓“超级二元”载体提供更高转化效率，并且通常包含其他来自Ti的毒力基因（Komari等，2006,Methods Mol.Biol.343:15-41）。超级二元载体通常用在显示更低转化效率的植物中，例如谷类。这种其他毒力基因包括但不限于virB、virE和virG(Vain等，2004,The effect of additional virulence genes ontransformation efficiency,transgene integration and expression in rice plants usingthe pGreen/pSoup dual binary vector system(使用pGreen/pSoup双重二元载体系统的其他毒力基因对水稻植物中转化效率、转基因整合和表达的影响)，Transgenic Res.13:593-603;Srivatanakul等，2000,Additional virulence genesinfluence transgene expression:transgene copy number，integration pattern andexpression(其他毒力基因影响转基因表达：转基因拷贝数目、整合模式和表达)，J.Plant Physiol.157,685-690;Park等，2000,Shorter T-DNA or additionalvirulence genes improve Agrobacterium-mediated transformation(更短的T-DNA或其他毒力基因提高农杆菌介导的转化)，Theor.Appl.Genet.101,1015-1020；Jin等，1987,Genes responsible for the supervirulence phenotype of Agrobacteriumtumefaciens A281(负责根癌农杆菌A281的超级毒力表型的基因)，J.Bacteriol.169:4417-4425)。
植物启动子：
为了生成本公开的所述转基因植物，所需转基因的基因编码序列与启动子操作性连接以驱动所述转基因的表达。在植物中有功能的大量启动子为本领域已知。在构建ω酰胺酶、GPT或GS转基因构建体和ω酰胺酶RNAi构建体中，所选启动子可以是组成型、非特异启动子例如在植物转基因表达中广泛使用的烟草蚀刻病毒35S核糖体启动子（CaMV 35S启动子）。其他强效组成型启动子的示例包括但不限于水稻肌动蛋白1启动子、CaMV 19S启动子、Ti质粒胭脂碱合成酶启动子、醇脱氢酶启动子和蔗糖合成酶启动子。
或者，在一些实施方式中，可能需要基于由转基因构建体转化的所需植物细胞、所需转基因表达水平、转基因表达的所需组织或亚细胞组分、靶标发育阶段等来选择启动子。例如，根优先性启动子可以包括但不限于RolD启动子、RolD-2启动子、富甘氨酸蛋白启动子、GRP启动子、ADH启动子、玉米ADH1启动子、PHT启动子、Pht1基因家族启动子、金属摄取蛋白启动子、玉米金属硫蛋白蛋白启动子、35S CaMV结构域A启动子、pDJ3S启动子、SIREO启动子、pMel启动子、Sad1启动子、Sad2启动子、TobRB7启动子、RCc3启动子、FaRB7启动子、SPmads启动子、IDS2启动子、pyk10启动子、Lbc3豆血红蛋白启动子、PEPC启动子、Gns1葡聚糖酶根启动子、35S2启动子、GI4启动子、GI5启动子和GRP启动子。
除了组成型启动子，在需要随着转基因植物再生、成熟、开花等调节转基因表达的示例中，可以使用多种诱导型启动子序列。所述诱导型启动子的示例包含下列基因的启动子：热激基因、保护反应（protection responding）基因(即苯丙氨酸解氨酶；见例如Bevan等，1989,EMBO J.8(7):899-906)、愈伤响应（wound responding）基因(即细胞壁蛋白基因)、化学诱导基因(即硝酸盐还原酶、几丁质酶)和暗诱导基因(即天冬酰胺合成酶；见例如美国专利号5,256,558)。同样，很多植物核基因被光激活，包含编码主要叶绿素a/b结合蛋白(cab)和核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶(rbcS)的小亚基的基因家族(见例如，Tobin和Silverthorne,1985,Annu.Rev.Plant Physiol.36:569-593;Dean等，1989,Annu.Rev.Plant Physiol.40:415-439.)。
其它诱导型启动子包含ABA-和膨压诱导型启动子、植物生长素结合蛋白基因启动子(Schwob等，1993，Plant J.4(3):423-432)、UDP葡萄糖类黄酮糖基转移酶基因启动子(Ralston等，1988，Genetics 119:185-197)、MPI蛋白酶抑制剂启动子(Cordero等，1994，Plant J.6(2):141-150)和甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因启动子(Kohler等，1995，Plant Mol.Biol.29(6):1293-1298；Quigley等，1989，J.Mol.Evol.29(5):412-421；Martinez等，1989，J.Mol.Biol.208(4):551-565)和来自豌豆的光诱导质体酶谷氨酰胺合成酶(美国专利号5,391,725；Edwards等，1990，同上)。
用于植物中转基因植物技术的植物启动子综述见Potenza等，2004,In VitroCell.Devel.Biol-Plant,40(1):1-22。合成植物启动子工程改造的综述见例如Venter,M.,2007,Trends Plant Sci.,12(3):1 18-124。
在某些实施方式中，3'转录终止序列也纳入所述转基因的下游，以指导转录的终止和使所述mRNA转录物正确聚腺苷酸化。合适的转录终止子是已知在植物中起作用的那些，包括但不限于根癌农杆菌的胭脂碱合成酶(NOS)和真蛸碱合酶(OCS)基因、真蛸碱合酶基因的T7转录物、来自土豆或番茄的蛋白酶抑制剂I和II基因的3'末端、CaMV 35S终止子、tml终止子和豌豆的rbcSE9终止子。另外，可以使用基因的天然转录终止子。在特定实施方式中，通过下面实施例方式的描述，使用胭脂碱合成酶转录终止子。
选择标记：
选择标记通常包含在转基因表达载体中以提供选择植物转化子的方法。虽然可用多个类型的标记，通常使用多个负选择标记，包含赋予对抑制或杀死未转化细胞的选择剂抗性的那些，例如给予对抗生素(例如卡那霉素、庆大霉素、卡那霉素（anamycin）、潮霉素和潮霉素B)抗性的基因或对除草剂(例如磺脲类、草丁膦（gulfosinate）、草胺磷和草甘膦)抗性的基因。可筛选标记包含，例如编码β葡糖醛酸糖苷酶的基因(Jefferson,1987,Plant Mol.Biol.Rep 5:387-405)、编码萤光素酶的基因(Ow等，1986,Science 234:856-859)和多个涉及花色苷染料生产或控制的蛋白编码基因(见例如，美国专利6,573,432)。所述大肠杆菌葡糖醛酸糖苷酶基因(gus、gusA或uidA)成为转基因植物中广泛使用的细胞标记，很大程度是由于葡糖醛酸糖苷酶的稳定性、高灵敏度和易于检测（如荧光、分光光度、多种组织化学方法）。另外，在大部分高等植物种中基本没有检测到葡糖醛酸糖苷酶。
转化方法和系统：
将本公开的所述转基因表达载体构建体引入到植物或植物细胞的多个方法对本领域技术人员已知，并且可以使用任何能转化的靶标植物或植物细胞。
农杆菌介导的转化可能是最常见的用于植物转基因的方法，并且大量植物的农杆菌介导转化方案在文献中已有充分描述(见例如AgrobacteriumProtocols (农杆菌属实验指南)，Wan编，胡马纳出版公司（Humana Press），第二版,2006)。根癌农杆菌是革兰氏阴性土壤细菌，通过插入肿瘤诱导DNA的小片段(″T-DNA",'转移DNA')到植物细胞中，其在半随机位点整合到植物基因组并且最终可以成为稳定整合，在很多双子叶植物种中造成肿瘤（根癌病）。直接重复DNA序列称为T-DNA边界，定义所述T-DNA的左侧和右侧末端。所述T-DNA能与Ti质粒的剩余部分物理分开，产生“二元载体”系统。
农杆菌转化可以用于双子叶植物、单子叶植物和其细胞的稳定转化(Rogers等，1986,Methods Enzymol.,118:627-641;Hernalsteen等，1984,EMBOJ.,3:3039-3041;Hoykass-Van Slogteren等，1984,Nature,311:763-764;Grimsley等，1987,Nature 325:167-1679;Boulton等，1989,Plant Mol.Biol.12:31-40;Gould等，1991,Plant Physiol.95:426-434)。引入DNA到农杆菌的多种方法已知，包含电穿孔、冻/融方法和三亲杂交。将外来DNA置于农杆菌中的最有效方法是通过电穿孔(Wise等，2006,Three Methods for the Introduction ofForeign DNA into Agrobacterium(引入外来DNA到农杆菌中的三种方法),Methods in Molecular Biology（《分子生物学方法》）,卷343:AgrobacteriumProtocols(农杆菌属实验指南),第2版,卷1;Wang编,新泽西州托托瓦的胡马纳出版公司（Humana Press Inc.）,第43-53页)。另外，鉴于较大百分比的T-DNA没有整合，通过未整合转基因构建体分子的转录能力，农杆菌介导的转化可以用于获得转基因的短暂表达(Helens等，2005,Plant Methods1:13)。
描述了很多农杆菌转化载体和方法(Karimi等，2002,Trends Plant Sci.7(5):193-5)，并且很多所述载体市售可得(例如加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司（Invitrogen）)。另外，可用越来越多的“开源”农杆菌转化载体（例如pCambia载体；澳大利亚堪培拉的堪比亚研究所（Cambia））。也参见本文上面的“转基因构建体”部分。在实施例中进一步描述的特定实施方式中，基于pMON316的载体用在Horsch等的叶盘转化系统中(Horsch等，1995,Science227:1229-1231)以生成生长增强的转基因烟草和番茄植物。
其他可以用于生成本公开的转基因植物的常用方法包括但不限于，微弹轰击、或生物射弹转化方法、通过钙的裸露DNA的原生质体转化、聚乙二醇(PEG)或电穿孔(Paszkowski等，1984,EMBO J.3:2727-2722;Potrykus等，1985,Mol.Gen.Genet.199:169-177;Fromm等，1985,Proc.Nat.Acad.Sci.USA82:5824-5828;Shimamoto等，1989,Nature,338:274-276。
生物射弹转化涉及使用生物射弹设备（或“基因枪”）注射几百万个DNA包被的金属颗粒到靶标细胞或组织中，所述几种设备市售可得。一旦进入所述细胞，所述DNA从颗粒释放，并且部分可以稳定整合到一种个多个细胞染色体中(综述，见Kikkert等，2005,Stable Transformation of Plant Cells byParticle Bombardment/Biolistics(通过颗粒轰击/生物射弹稳定转化植物细胞),收录于Methods in Molecular Biology（《分子生物学方法》）,卷286:Transgenic Plants:Methods and Protocols（转基因植物：方法和方案）,L.
Figure BDA00002313716900451
编，新泽西州托托瓦的胡马纳出版公司（Humana Press Inc.）)。
电穿孔是利用短暂、高强度电场来可逆透化细胞膜的脂质双层的技术(见例如Fisk和Dandekar,2005,Introduction and Expression of Transgenes inPlant Protoplasts(植物原生质体中转基因的引入和表达)，收录于Methodsin Molecular Biology（《分子生物学方法》）,卷286:Transgenic Plants:Methodsand Protocols（转基因植物：方法和方案）,L.
Figure BDA00002313716900452
编，新泽西州托托瓦的胡马纳出版公司，第79-90页;Fromm等，1987,Electroporation of DNA and RNAinto plant protoplasts(将DNA和RNA电穿孔入植物原生质体)，收录于Methods in Enzymology（《酶学方法》）,卷153,Wu和Grossman编，英国伦敦的学术出版社（Academic Press），第351-366页;Joersbo和Brunstedt,1991,Electroporation:mechanism and transient expression,stable transformation andbiological effects in plant protoplasts（电穿孔：植物原生质体中的机制和短暂表达、稳定转化和生物影响)，Physiol.Plant.81,256-264;Bates,1994,Genetictransformation of plants by protoplast electroporation(原生质体电穿孔的植物遗传转化).Mol.Biotech.2:135-145;Dillen等，1998,Electroporation-mediatedDNA tranfer to plant protoplasts and intact plant tissues for transient geneexpression assays（电穿孔介导DNA转移入植物原生质体和完整植物组织用于短暂基因表达试验),收录于Cell Biology（《细胞生物学》）,卷4,Celis编,英国伦敦的学术出版社（Academic Press），第92-99页)。所述技术通过在细胞膜中产生水性孔，其尺寸足够大以使DNA分子（和其他大分子）进入细胞，其中所述转基因表达构建体（作为T-DNA）可以稳定整合到植物基因组DNA中，导致产生转化细胞，随后再生为转基因植物。
更新的转化方法包含所谓"花浸渍"方法，其提供简单的承诺，不需要植物组织培养，而所有其他常用的转化方法通常需要(Bent等，2006,Arabidopsisthaliana Floral Dip Transformation Method(拟南芥花浸渍转化方法)，MethodsMol Biol,卷343:Agrobacterium Protocols(农杆菌属实验指南),第2版，卷1;Wang编,新泽西州托托瓦的胡马纳出版公司，第87-103页;Clough和Bent,1998,Floral dip:a simplified method for Agrobacterium-mediatedtransformation of Arabidopsis thaliana(花浸渍：拟南芥的农杆菌介导转化的简单方法)，Plant J.16:735-743)。然而，除了拟南芥以外，这些方法没有在广谱的不同植物种内广泛使用。简单说，花浸渍转化通过用合适的根癌农杆菌株浸渍或喷洒开花植物实现。从这些T0植物收集的种子然后在选择下发芽以鉴定转基因T1个体。实施例16显示拟南芥的花浸渍接种以生成转基因拟南芥植物。
其他转化方法包含发育中的种子或植物秧苗使用载体例如农杆菌载体转化的那些。例如，所述载体可以通过直接注射所述载体（即农杆菌）的悬浮液或混合物到发育中的荚（即辣椒荚、豆荚、豌豆荚等）的种子腔来用于转化发育中的种子。其他转化方法包含所述花结构靶向用于载体接种的那些。
另外，尽管转基因最常见插入到植物细胞的核DNA中，转基因也可以插入到质体DNA中（即到叶绿体的质体基因组（plastome））。在大部分开花植物中，质体在花粉细胞中不存在，并且因此质体基因组内整合的转基因DNA在繁殖中不传递，从而限制所述性状迁移到野生型植物。然而，质体转化比细胞核转化更加复杂，因为每个细胞中出现成千上万的质体基因组（高达10,000）。
只有所有质体拷贝以相同方式修饰即统一时，转质体系在遗传上稳定。这通常在某些选择条件下经重复再生以除去未转化的质体来实现，通过隔离转质体和未转化质体，从而选择载有转基因构建体和其中稳定整合选择标记的同质细胞。质体转化在多种植物种中成功实现，包含烟草、土豆、油菜、水稻和拟南芥。
为生成载有ω酰胺酶转基因的转质体系，所述转基因表达盒插入到质体基因组的两侧序列。使用同源重组，所述转基因表达盒通过自然重组过程整合到质体基因组。用于质体转化的基础DNA递送技术包含叶的颗粒轰击或原生质体的聚乙二醇介导的DNA转化。因为每个细胞有很多质体（即叶绿体）、各载有很多拷贝的质体基因组，在质体基因组中载有转基因的转质体植物可以非常高的水平表达。在叶部组织中尤其如此，其中单个成熟的叶细胞可以含有超过10,000个拷贝的质体基因组。所述质体基因组成功转化后，所述转质体事件在每个拷贝的质体遗传物质上载有转基因。这能使得所述转基因表达水平代表高达一半的所述细胞中产生的总蛋白。
质体转化方法和载体系统描述在，例如近期美国专利号7,528,292;7,371,923;7,235,711;和7,193,131。也参见美国专利号6,680,426和6,642,053。
上述植物转化方法可以用于引入至少一个转基因到很多不同的植物细胞和组织中，包括但不限于，全植物、组织和器官外植体，包含叶绿体、开花组织和细胞、原生质体、分生组织细胞、愈合组织，未成熟胚胎和配子细胞例如花粉粒、花粉、精子和卵细胞，上述任意一种的组织培养细胞，从中能生成可育再生转基因植物的任何其他细胞。愈合组织从组织来源开始，包括但不限于，愈合组织、幼苗的顶端分生组织、花粉粒等。能作为愈合组织繁殖的细胞也是遗传转化的受体细胞。
从转化植物细胞、组织或器官中再生个体植物的方法已知并且对多种植物种类都有描述。
作为例证，转化植株（从转化细胞或组织衍生而来）在补充有用于转化策略的选择试剂的根允许性生长培养基中培养。一旦生根，转化植株然后转移到土壤并且使其生长至成熟。开花时，成熟植物优选自花授精（自体授精），并且收集所得种子并用于生长后代。
T0转基因植物可以通过初级或次级转化体的自花授精，或通过初级或次级转化体与其他植物（转化或未转化）的有性杂交用于生成后代（如T1、T2等）。在成熟植物生长期中，所述植物通常就生长表型、氮利用效率、CO2固定速率等进行检查（见下面部分）。
氮利用效率提高的转基因植物的选择：
可以使用标准方法选择、筛选和鉴定转基因植物。本公开的所述优选转基因植物显示一种或多种表型特性，指示氮利用效率提高，包括但不限于，更快的生长速率、更多的种子和果实/荚产量，更早和更多产的开花，对高盐条件的耐受性增加和提高的生物量产量。转基因植物通常在选择压力下再生，以在生成后续转基因植物代前选择转化体。另外，使用的选择压力可以在T0代后使用以确保所需转基因表达构建体或盒的存在。
就用于转化的转基因表达构建体所含标记基因编码的遗传组成和/或表型特性而言，T0转化的植物细胞、愈伤组织、组织或植物可以通过选择或筛选来鉴定和分离。例如，选择可以通过在包含抑制量的抗生素或除草剂（转化遗传构建体能赋予对其的抗性）的生长培养基中培养潜在转化植物、组织或细胞来完成。另外，所述转化植物细胞、组织和植物能就所述转基因表达构建体中可出现的标记基因（即β葡糖苷酸酶）活性进行筛选来鉴定。
可以使用熟知的多个物理或生化方法以用于鉴定包含所需转基因表达构建体的植物。所述方法的示例包含鉴定所述转基因、转基因表达构建体或其元件的Southern印迹分析或多种核酸扩增方法(即PCR)，为检测和测定所述RNA转录产物的Northern印迹、S1 RNase保护、逆转录酶PCR(RT-PCR)扩增，以及蛋白凝胶电泳、Western印迹、免疫沉淀、酶免疫试验等可用于鉴定所述转基因编码和表达的蛋白。
在另一种方法中，已知由靶标植物中转基因表达来调节的基因、蛋白和/或代谢化合物的表达水平可以用于鉴定转化体。在本发明的一个实施方式中，叶组织中信号代谢物2-氧代缩环戊酸单酰胺水平的增加，或根组织中水平的降低，或更高的2-氧代缩环戊酸单酰胺叶-根比率可以用于筛选所需转化体。
最终，就氮利用效率提高可以筛选本公开的所述转化植物。氮利用效率表示为每个给定量氮的植物产量。确实，通常需要某种程度的表型筛选以鉴定有最快生长速率、最高种子产量等的转化系，特别是当就后续自花授精、杂交和回交鉴定植物时。为此能使用多种参数，包括但不限于生长速率、总鲜重、干重、种子和果实产量(数目、重量)、种子和/或种子荚大小、种子荚产量(如数目、重量)、叶大小、植物大小、增加的开花、到开花的时间、总蛋白含量(种子、果实、植物组织中)、特定蛋白含量(即ω酰胺酶)、氮含量、游离氨基酸和特定代谢化合物水平(即2-氧代缩环戊酸单酰胺)。通常，这些表型测量与获自亲本相同或相似植物系、未转化的相同或相似植物或者相同或相似野生型植物(即正常或亲本植物)的那些作比较。优选并且至少初始时，在靶标转基因植物中选定表型特性的测量在与正常或亲本植物中相同特性的测量平行完成。通常，在任何特定表型特性方面，采用多个植物建立所述转基因植物的表型期望和/或优势。
优选地，选择起始转化体并然后通过自花授精（自体授精）用于生成T1和后代，直到所述转基因表型为纯育（即所述植物对所述转基因是纯合子）。实践中，这通过在每代对所需特性筛选和自花授精所述个体完成，并且经常重复多次（如3或4代）。如本文所示例，通过至少一个有性世代繁殖的转基因植物系（烟草、拟南芥、番茄）与没有有性生殖益处和所述转基因拷贝数目伴随增加的系相比，显示更高的转基因产物活性。
稳定的转基因系可以杂交和回交以生成有任何所需特性数目的变种，包含有混合型（stacked）转基因、多拷贝转基因等的那些。多种常见的育种方法为本领域技术人员熟知(见例如Breeding Methods for Cultivar Development（栽培变种开发的育种方法）,Wilcox J.编，威斯康星州麦迪逊的美国农学会（American Society of Agronomy）(1987))。另外，稳定转基因植物可以通过用更多转基因或其他平行转基因拷贝转化所述植物来进一步遗传修饰。也考虑通过引入多拷贝给定转基因或多个转基因的单个转化事件而生成的转基因植物。
氮利用效率表示为每个给定量氮的植物产量。
提高氮利用效率的方法：
本公开的某些方面涉及提高植物氮利用效率的方法。
一个特定方面涉及使某一植物的氮利用效率相对于相同种的野生型或未转化植物提高的方法，通过：(a)向植物引入ω酰胺酶转基因，其中所述ω酰胺酶转基因与根优先性启动子操作性连接；(b)在所述植物根组织或所述植物后代中表达ω酰胺酶转基因；和(c)选择2-氧代缩环戊酸单酰胺叶-根比率相对于不含ω酰胺酶转基因的相同种植物增加的植物，其中所述2-氧代缩环戊酸单酰胺的叶-根比率增加使得氮利用效率提高。
在某些实施方式中，所述ω酰胺酶转基因编码的多肽具有与选自下列多肽的编码氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列：
AAL91613.1,ACN30911.1,ABK22312.1,ACJ85250.1,AAQ97821.1,CBJ25483.1,EFN54567.1,NP_196765.2，XP_002871509.1,NP_974769.1,XP_002309478.1,XP_002279687.1，NP_001146676.1,NP_001146295.1,NP_001049134.1,XP_002516116.1，XP_001766085.1,XP_001756522.1,XP_002969787.1,XP_002985119.1，XP_002948137.1,XP_001690839.1,NP_001057093.1,XP_002468410.1，NP_064587.1,XP_001089575.2,XP_001502234.1,XP_002502298.1，XP_526254.2,XP_535718.2,XP_002716659.1,NP_001033222.1，NP_001029298.1,NP_001016633.1,NP_001085409.1,XP_002758928.1，XP_003064056.1,NP_001135127.1,XP_001622809.1,NP_991174.2，XP_002594716.1,NP_075664.1,XP_001370849.1,NP_001090454.1，XP_002999170.1,XP_002917137.1,XP_002741281.1,XP_002131764.1，NP_594154.1,XP_001742101.1,XP_416604.2,XP_002194275.1，XP_001599587.1,XP_002410555.1,XP_003035898.1,XP_002183613.1，XP_001875493.1,XP_002112209.1,XP_636983.1,XP_002158547.1，XP_002839272.1,XP_307722.3,XP_001819629.1,XP_001268376.1，ZP_08115581.1,YP_001320997.1,XP_369268.1,XP_002626458.1,XP_751200.1，XP_001657673.1,XP_002173486.1,XP_001212538.1,XP_001258462.1，XP_002434512.1,XP_960906.1,XP_002847679.1,XP_967861.1，XP_002426154.1,XP_003176259.1,XP_500602.1,XP_001428419.1，XP_003014235.1,XP_001393123.1,ZP_03608460.1,XP_002147261.1，ZP_03293831.1,XP_002290043.1,XP_003065597.1,XP_001588734.1，YP_001273073.1,XP_001552800.1,XP_446414.1,XP_002792830.1，XP_001998501.1,YP_003780301.1,NP_013455.1,XP_002404736.1，YP_001086961.1,ZP_05328587.1,ZP_05399936.1,YP_001113615.1，XP_001247884.1,XP_390426.1,XP_003025334.1,XP_002052999.1，YP_769862.1,ZP_07325748.1,ZP_05349666.1,YP_471237.1,YP_002977603.1，YP_001202760.1,ZP_07592670.1,和NP_386723.1。在另一些实施方式中，所述ω酰胺酶转基因整合到所述植物的基因组中。在另一些实施方式中，所述根优先性启动子选自RolD启动子、RolD-2启动子、富甘氨酸蛋白启动子、GRP启动子、ADH启动子、玉米ADH1启动子、PHT启动子、Pht1基因家族启动子、金属摄取蛋白启动子、玉米金属硫蛋白蛋白启动子、35S CaMV结构域A启动子、pDJ3S启动子、SIREO启动子、pMel启动子、Sad1启动子、Sad2启动子、TobRB7启动子、RCc3启动子、FaRB7启动子、SPmads启动子、IDS2启动子、pyk10启动子、Lbc3豆血红蛋白启动子、PEPC启动子、Gns1葡聚糖酶根启动子、35S2启动子、GI4启动子、GI5启动子和GRP启动子。
在另一些实施方式中，抑制叶组织中内源性ω酰胺酶表达。在另一些实施方式中，所述叶组织中内源性ω酰胺酶表达通过隐性基因破坏、显性基因沉默或化学抑制剂来抑制。在另一些实施方式中，叶组织中的内源性ω酰胺酶表达通过隐性基因破坏来抑制，所述隐性基因破坏选自消除内源性ω酰胺酶表达的突变ω酰胺酶基因、内源性ω酰胺酶敲除突变体和内源性ω酰胺酶敲减突变体。在其他实施方式中，叶组织中所述内源性ω酰胺酶表达通过对内源性ω酰胺酶基因特异的RNAi反义寡核苷酸来抑制。在其他实施方式中，叶组织中所述内源性ω酰胺酶的表达通过化学抑制剂来抑制，所述化学抑制剂选自6-重氮-5-氧代-正亮氨酸、p-羟基苯甲酸汞、二异丙基氟磷酸盐、氰化钠、苯基乙酸汞化物、碘乙酸盐（lodoacetate）、硝酸银、苯磺酸氯汞、和硫酸铜。
在另一些实施方式中，所述2-氧代缩环戊酸单酰胺的叶-根比率是相同种的祖先植物或野生型植物的至少2倍。在另一些实施方式中，所述植物还包含GPT转基因。在另一些实施方式中，所述GPT转基因是由SEQ ID NO:1编码的GPT/F:L突变。在其他实施方式中，所述植物还包含GPT转基因和GS转基因。在另一些实施方式中，所述GPT转基因和GS转基因各自与叶优先性启动子操作性连接。在其他实施方式中，植物中内源性GPT表达通过基因激活增加。在另一些实施方式中，植物中内源性GS表达通过基因激活增加。在另一些实施方式中，每个转基因是就所述植物表达进行了密码子优化。
另一方面涉及使某一植物的氮利用效率相对于相同种的野生型或未转化植物提高的方法，通过：(a)抑制植物叶组织中内源性ω酰胺酶的表达；和(b)选择2-氧代缩环戊酸单酰胺的叶-根比率相对于叶组织中不抑制内源性ω酰胺酶表达的相同种植物增加的植物，其中所述2-氧代缩环戊酸单酰胺的叶-根比率增加使得氮利用效率提高。
在某些实施方式中，所述叶组织中内源性ω酰胺酶表达通过隐性基因破坏、显性基因沉默或化学抑制剂来抑制。在另一些实施方式中，叶组织中的内源性ω酰胺酶表达通过隐性基因破坏来抑制，所述隐性基因破坏选自消除内源性ω酰胺酶表达的突变ω酰胺酶基因、内源性ω酰胺酶敲除突变体和内源性ω酰胺酶敲减突变体。在另一些实施方式中，叶组织中所述内源性ω酰胺酶表达通过对内源性ω酰胺酶基因特异的RNAi反义寡核苷酸来抑制。在另一些实施方式中，所述化学抑制剂选自6-重氮-5-氧代-正亮氨酸、p-羟基苯甲酸汞、二异丙基氟磷酸盐、氰化钠、苯基乙酸汞化物、碘乙酸盐（lodoacetate）、硝酸银、苯磺酸氯汞、和硫酸铜。
在另一些实施方式中，所述植物还包含ω酰胺酶转基因，其中所述ω酰胺酶转基因与根优先性启动子操作性连接。在另一些实施方式中，所述2-氧代缩环戊酸单酰胺的叶-根比率是相同种的祖先植物或野生型植物的至少2倍。在另一些实施方式中，所述植物还包含GPT转基因。在其他实施方式中，所述GPT转基因是由SEQ ID NO:1编码的GPT/F:L突变体。在其他实施方式中，所述植物还包含GPT转基因和GS转基因。在另一些实施方式中，所述GPT转基因和GS转基因各自与叶优先性启动子操作性连接。在其他实施方式中，植物中内源性GPT表达通过基因激活增加。在另一些实施方式中，植物中内源性GS表达通过基因激活增加。在另一些实施方式中，每个转基因是就所述植物表达进行了密码子优化。
在提高植物氮利用效率方法的其他实施方式中，所述植物可以包含已知提高氮利用效率的其他转基因，包括但不限于美国专利号7,560,626所述的那些。
在本文提供的实施例中，所述转基因和对照植物都接受相同数量的同一营养溶液。所述转基因植物与更高产量的特性一致，并且因此有更高的氮利用效率。
实施例：
实施例1：GS和GPT表达水平增加对Ω酰胺酶通路的的影响
材料和方法：
转基因植物的生成：植物通常工程改造成通过过量表达GS和GPT转基因来过量生产2-氧代缩环戊酸单酰胺，如美国专利申请序列号12/551,271所述。评价所得的表型效果。生成三组转基因烟草系：一组过量表达GPT以增加GRMT催化容量；第二组过量表达GS以仅在叶中增加催化容量从而生成GPT的谷氨酰胺底物；和第三组过量表达GS和GPT，通过单个转基因系的快速生长后代的有性杂交而生成。
工程改造的烟草和拟南芥的生长：野生型和工程改造的烟草种子表面消毒并且在包含M&S培养基的phytotray中发芽。用于所述经工程改造植物的培养基包含卡那霉素(10ug/ml)。所述旺盛生长的幼苗在17d转移到沙基培养，由对照湿度覆盖4d以帮助适应环境条件；植物继续提供包含10mM KNO3的营养溶液(Knight和Langston-Unkefer,1988,Science 241:951)。所述生长条件如前所述（Knight和Langston-Unkefer，同上）。在移植后32-35d收集组织，除非所述植物生长用于种子生产。野生型和工程改造的拟南芥种子表面消毒并且在包含M&S培养基的phytotray中发芽。用于所述经工程改造植物的培养基包含卡那霉素(10ug/ml)。
所述幼苗使用Promix(Lehle Seeds)生长培养基转移到ArabiSystem，并且在24°C以16h光照期和8h黑暗期生长。植物生长到成熟。
结果：
烟草中所述GS的过量表达生成两类后代；只在叶中生长更快并且过量表达GS，从而增加其GS的叶-根比率的那些，和第二类以正常速率生长并且在叶和根中都过量表达GS，因此维持正常的叶-根比率。这些植物中GS和GPT表达的调节看似复杂，并且每个基因的表达看来影响另一基因（见表2和3）；在叶和根中仅GPT过量表达伴随着叶中GS活性增加和仅根中正常的GS活性。仅叶中增加GS表达伴随着叶中增加的GPT活性和根中更低的GPT活性。所述反应也在GS+GPT转基因植物中明显。GS或GPT的过量表达伴随着叶中更低的ω酰胺酶活性和根中更高的ω酰胺酶活性。GPT和GS+GPT转基因植物显示根ω酰胺酶活性的最大增加。这些植物通过改变ω酰胺酶活性响应转基因的表达，从而趋向于增加所述叶根2-氧代缩环戊酸单酰胺存储和维持所述根2-氧代缩环戊酸单酰胺存储。在GS+GPT过量表达植物中，这些响应联合以生成最高的叶和最低的根2-氧代缩环戊酸单酰胺存储，以及最高的叶和最低的GS+GPT活性。
下表2、3和4描述就更高的2-氧代缩环戊酸单酰胺(2-OGM)生物合成而言的工程改造效果。表2和3描述来自烟草植物的结果，并且表4描述来自拟南芥植物的结果。
表2：更高2-氧代缩环戊酸单酰胺生物合成能力的工程改造效果
Figure BDA00002313716900541
在上表2中，“gfwt”指克鲜重，和“nmol/gfwt/h”指每小时每克鲜重的摩尔。
表3：更高2-氧代缩环戊酸单酰胺生物合成能力的工程改造效果
Figure BDA00002313716900542
表4：工程改造以过量生产2-氧代缩环戊酸单酰胺的拟南芥
Figure BDA00002313716900543
实施例2：调节根Ω酰胺酶表达水平的植物表达载体
根组织中的Ω酰胺酶表达水平通过生成转基因植物而增加，所述转基因植物用包含ω酰胺酶编码序列（包括但不限于本文公开的任何ω酰胺酶编码序列）、在根优先性启动子控制下的表达构建体转化。认为根组织中ω酰胺酶的水平增加造成信号代谢物2-氧代缩环戊酸单酰胺的降解增加。
转化植物的构建体包含编码合适的根优先性启动子的表达盒、编码植物ω酰胺酶的序列和终止子序列。在这个实施例中，所述表达盒包含富甘氨酸蛋白（GRP）启动子(Goddemeier等，1998,Plant Mol Biol.36(5):799-802)、拟南芥ω酰胺酶编码序列和NOS终止子。GRP启动子序列如下所示[SEQ ID NO:16]：
GAAATTAAACCCAGGGTCGACAGCGCCCACTATAGAGAAAAAATTGAAATGTTTTGAGAATCGGATGATTTTTTTTAACTATTAGGTCTAGTTTGAAAACCCTATTTTCTAACAAAGGGATTTTCATTTTTATAAGAGAAAATAAACTAACTTTTCTTGAGAAAATAAAATTCTTTGGAAAAATGGATTTCTCAAACTAGCTCTTACGGCTAGTTTGGAAACCCCAATTTCACACGGGATTCTCATTTTCCCAAGGGAAAAATGAACTAATTTCCCTTAGAAAAATGAGAATCCCGTGGGAAATTGGGATTTTCAAAGTAGCCCTTATAGTGGAAATAAGTTATGGTGTCTCGCTCGTATGGTTATGTAGGGCCGCGCGTGTATTCCAGCGCCGGCCGCATGGATACCCTATCGATTCTGACTTCTCTGTCTCAGGAAAATAATACAGCCACGATTAACGGAACCTGCTGGCTGGATCCATGATTACTCACTTGACTTCACATCGATCCAAATTATCTAGCTTGCACGTTCATGGGTCGCCTCGCTCGCCCGATCGATATTACGTACACCATAGATTAGTACTATATGGAGTGGAGTGTTGAATGGATGCTCTTTATTATTCTAGCCAAGTTATCAAGCCGGGCACTTGCATCGGAAGGAGTACCAGTGTACGCATCAGATCAGACGATAATCGATCAAGATGGGTACGAGATTTGCCGCTTGCTTCCTGTTCTTGATGGGCAATCTTTTCGGGCCTTGAACGTCGGAGAATCGACTATACGAAATCCTAGGTCAACTATACATTGGTTGATGCTTCCGTGTAGTTTTACCAGTTCATCGGTCTCTAGCTTGTTGTTTGCGACGACTTCACGTGGCCACGCGTTTACTGCGCTCTGCTCAAAGAAATTGCCTACAGTGCCTGGCGTCAGCTGCAGGCGTTGAATCCGAGGTCGCGCGCCGCAGAATAAGTACGAGTCAAAGGCTGAGCTGCATGCCGTACCGGCCTTTATTAATAGCTGAGCTCTACTCGCTACGTCAGTATAGTATAGCACGGTCATATATATACTATAGCTATAGCTGTGGGGTACCGTGTCCGTATCGTGAATCTGAAGTCGAACAGTGATATGGCGTACTATCTAATAATGTCCCGTGCAGTAATATCACTGTTGCCGACGATGGGAATCTCTAGTTTTGACAGAAACCAAAGCAACTGCTAGCTAATTAATTCCAGAGAGATCGATTTCTACAGTGCTGCAACAATCAATGCAATTGGCATCAGACGATATATGCTAATGGTTTCTTTATCGATACGTGGTCAACAGAGCTCTCTCGCCCGCCCTGATCAGATCTCATCGCACATGGACACCCATCTGCCAACCCAACACGGGCGGGGGAACCACCGTGAAACATCGCGTTCATGCACGACCCCCCCGCAGGCCGCAGCTATAAATACCCATGCAATGCAATGCAGCGGGTCATCATCGACTCCACCTGGACTCGCTCACTGGCAATGGCTACCACCAGC
或者，可以使用包含所述rolD启动子的表达盒和拟南芥ω酰胺酶编码序列。此构建体的序列如下所示(ω酰胺酶的ATG起始密码子以粗体显示)[SEQID NO:17]：
GACGTCGGTACCGAATTTGTTCGTGAACTATTAGTTGCGGGCCTTGGCATCCGACTACCTCTGCGGCAATATTATATTCCCTGGGCCCACCGTGAACCCAATTTCGCCTATTTATTCATTACCCCCATTAACATTGAAGTAGTCATGATGGGCCTGCAGCACGTTGGTGAGGCTGGCACAACTCATCCATATACTTTCTGACCGGATCGGCACATTATTGTAGAAAACGCGGACCCACAGCGCACTTTCCAAAGCGGTGCCGCGTCAGAATGCGCTGGCAGAAAAAAATTAATCCAAAAGTACCCTCCAAGCAGCCCATATAAACGCGTTTACAAATCCGCTAACCTCAACAATTTGAGCAGAGAAAATTCGCACCTACAAGGCAGATGGCATCATCATTCAATCCAGAGCAGGCAAGAGTTCCTTCAGCATTACCTTTACCAGCACCACCACTTACCAAATTCAACATCGGACTTTGTCAATTGAGTGTTACTTCTGATAAGAAAAGAAACATTTCACATGCTAAGAAAGCAATCGAAGAGGCTGCTAGTAAGGGAGCTAAACTCGTTCTTTTGCCTGAAATATGGAACTCACCATACAGTAACGATTCTTTTCCTGTGTACGCAGAAGAGATCGATGCTGGAGGTGATGCATCTCCATCAACTGCTATGCTCTCAGAAGTTAGTAAGAGACTCAAGATTACAATTATCGGAGGTTCAATTCCTGAGAGAGTTGGAGATAGGTTGTATAACACATGTTGCGTGTTCGGATCTGATGGAGAGCTCAAGGCTAAGCATAGGAAGATTCACCTCTTCGATATAGATATTCCTGGAAAGATCACCTTCATGGAATCAAAAACACTTACCGCTGGAGAGACTCCAACAATTGTTGATACAG
Figure BDA00002313716900561
TGGGTAGAATCGGAATAGGTATATGTTACGATATCAGGTTCCAAGAATTGGCTATGATATATGCTGCAAGAGGAGCACATCTCTTATGCTACCCTGGAGCTTTCAATATGACTACAGGTCCATTGCACTGGGAGCTTTTGCAAAGAGCTAGGGCAACAGATAACCAGCTCTATGTTGCTACCTGCTCTCCTGCAAGAGATTCAGGAGCTGGTTACACCGCATGGGGTCATTCTACTCTTGTTGGACCATTTGGTGAAGTGTTGGCTACCACTGAGCACGAAGAGGCTATTATAATCGCAGAAATCGATTACAGTATACTTGAGCAGAGAAGGACTTCTCTCCCATTAAATAGGCAGAGGAGGGGTGATTTATACCAGTTAGTTGATGTTCAGAGATTAGATAGTAAGTGACACGTGTGAATTACAGGTGACCAGCTCGAATTTCCCCGATCGTTCAAACATTTGGCAATAAAGTTTCTTAAGATTGAATCCTGTTGCCGGTCTTGCGATGATTATCATATAATTTCTGTTGAATTACGTTAAGCATGTAATAATTAACATGTAATGCATGACGTTATTTATGAGATGGGTTTTTATGATTAGAGTCCCGCAATTATACATTTAATACGCGATAGAAAACAAAATATAGCGCGCAAACTAGGATAAATTATCGCGCGCGGTGTCATCTATGTTACTAGATCGGGGGTACCGACGTC
对植物转化而言，上述表达盒克隆到合适的载体上。对农杆菌介导的转化而言，上述构建体克隆到载有壮观霉素抗性选择标记基因的TF101.1载体中。
本说明书引用的所有发表物、专利和专利申请通过引用纳入本文，就好像各发表物或专利申请特定和单独地通过引用纳入本文那样。
本发明不局限于本文所述实施方式的范围，这些实施方式仅旨在说明本发明的单独方面，任何功能等同形式也在本发明范围内。本文所述以外的对发明模型和方法的各种改良通过以上描述和教导对本领域技术人员显而易见，所述改良同样旨在落入本发明的范围内。可以实施此类改良或其它实施方式而不偏离本发明的真实范围和精神。
实施例3：载有根优先性Ω酰胺酶转基因的转基因苜蓿植物的生长增加
在这个实施例中，苜蓿植物生长通过引入高度根优先性启动子控制下的ω酰胺酶转基因而增加。所得转基因苜蓿植物显示相对于野生型苜蓿植物，根中的2-氧代缩环戊酸单酰胺浓度降低、2-氧代缩环戊酸单酰胺叶-根比率增加、和生长提高。苜蓿植物(紫苜蓿拉达克变种（Medicago sativa,var Ladak）)用截短除去叶绿体转运肽的拟南芥ω酰胺酶编码序列在所述表达载体pTF101.1内的截短毛根农杆菌RolD启动子控制下转化。
材料和方法：
农杆菌载体：所述表达载体pTF101.1工程改造成载有所述SEQ ID NO:39的ω酰胺酶转基因表达盒(RolD启动子+ω酰胺酶+NOS终止子)并且使用标准电穿孔方法转入根癌农杆菌株LBA4404培养物(McCormac等，1998,Molecular Biotechnology 9:155-159)。使用的所述截短毛根农杆菌RolD启动子是Leach和Aoyagi，1991,Plant Sci.79,69-76所述的pD-02同种型（RolD2）。Leach和Aoyagi将RolD2启动子描述为驱动根组织高水平表达的高度根优先性启动子。转化的农杆菌在含有50μg/ml氯霉素的培养基上选择。转化的农杆菌细胞在含有25μg/ml抗生素的LB培养基上生长36小时。在36小时生长期末尾，通过离心收集细胞，并且来自每个转化的细胞在不含抗生素的100ml LB肉汤中重新悬浮。
pTF101.1载体+rolD-02启动子+拟南芥ω酰胺酶(就拟南芥优化的密码子)+nos终止子(SEQ ID NO:39)的核苷酸序列示于下面。带下划线的核苷酸=rolD-02启动子，粗体核苷酸=ω酰胺酶编码区域，斜体核苷酸包含所述nos终止子区域(和一些Cambia载体序列)，以及其他核苷酸=pTF101.1载体。
AGTACTTTAAAGTACTTTAAAGTACTTTAAAGTACTTTGATCCAACCCCTCCGCTGCTATAGTGCAGTCGGCTTCTGACGTTCAGTGCAGCCGTCTTCTGAAAACGACATGTCGCACAAGTCCTAAGTTACGCGACAGGCTGCCGCCCTGCCCTTTTCCTGGCGTTTTCTTGTCGCGTGTTTTAGTCGCATAAAGTAGAATACTTGCGACTAGAACCGGAGACATTACGCCATGAACAAGAGCGCCGCCGCTGGCCTGCTGGGCTATGCCCGCGTCAGCACCGACGACCAGGACTTGACCAACCAACGGGCCGAACTGCACGCGGCCGGCTGCACCAAGCTGTTTTCCGAGAAGATCACCGGCACCAGGCGCGACCGCCCGGAGCTGGCCAGGATGCTTGACCACCTACGCCCTGGCGACGTTGTGACAGTGACCAGGCTAGACCGCCTGGCCCGCAGCACCCGCGACCTACTGGACATTGCCGAGCGCATCCAGGAGGCCGGCGCGGGCCTGCGTAGCCTGGCAGAGCCGTGGGCCGACACCACCACGCCGGCCGGCCGCATGGTGTTGACCGTGTTCGCCGGCATTGCCGAGTTCGAGCGTTCCCTAATCATCGACCGCACCCGGAGCGGGCGCGAGGCCGCCAAGGCCCGAGGCGTGAAGTTTGGCCCCCGCCCTACCCTCACCCCGGCACAGATCGCGCACGCCCGCGAGCTGATCGACCAGGAAGGCCGCACCGTGAAAGAGGCGGCTGCACTGCTTGGCGTGCATCGCTCGACCCTGTACCGCGCACTTGAGCGCAGCGAGGAAGTGACGCCCACCGAGGCCAGGCGGCGCGGTGCCTTCCGTGAGGACGCATTGACCGAGGCCGACGCCCTGGCGGCCGCCGAGAATGAACGCCAAGAGGAACAAGCATGAAACCGCACCAGGACGGCCAGGACGAACCGTTTTTCATTACCGAAGAGATCGAGGCGGAGATGATCGCGGCCGGGTACGTGTTCGAGCCGCCCGCGCACGTCTCAACCGTGCGGCTGCATGAAATCCTGGCCGGTTTGTCTGATGCCAAGCTGGCGGCCTGGCCGGCCAGCTTGGCCGCTGAAGAAACCGAGCGCCGCCGTCTAAAAAGGTGATGTGTATTTGAGTAAAACAGCTTGCGTCATGCGGTCGCTGCGTATATGATGCGATGAGTAAATAAACAAATACGCAAGGGGAACGCATGAAGGTTATCGCTGTACTTAACCAGAAAGGCGGGTCAGGCAAGACGACCATCGCAACCCATCTAGCCCGCGCCCTGCAACTCGCCGGGGCCGATGTTCTGTTAGTCGATTCCGATCCCCAGGGCAGTGCCCGCGATTGGGCGGCCGTGCGGGAAGATCAACCGCTAACCGTTGTCGGCATCGACCGCCCGACGATTGACCGCGACGTGAAGGCCATCGGCCGGCGCGACTTCGTAGTGATCGACGGAGCGCCCCAGGCGGCGGACTTGGCTGTGTCCGCGATCAAGGCAGCCGACTTCGTGCTGATTCCGGTGCAGCCAAGCCCTTACGACATATGGGCCACCGCCGACCTGGTGGAGCTGGTTAAGCAGCGCATTGAGGTCACGGATGGAAGGCTACAAGCGGCCTTTGTCGTGTCGCGGGCGATCAAAGGCACGCGCATCGGCGGTGAGGTTGCCGAGGCGCTGGCCGGGTACGAGCTGCCCATTCTTGAGTCCCGTATCACGCAGCGCGTGAGCTACCCAGGCACTGCCGCCGCCGGCACAACCGTTCTTGAATCAGAACCCGAGGGCGACGCTGCCCGCGAGGTCCAGGCGCTGGCCGCTGAAATTAAATCAAAACTCATTTGAGTTAATGAGGTAAAGAGAAAATGAGCAAAAGCACAAACACGCTAAGTGCCGGCCGTCCGAGCGCACGCAGCAGCAAGGCTGCAACGTTGGCCAGCCTGGCAGACACGCCAGCCATGAAGCGGGTCAACTTTCAGTTGCCGGCGGAGGATCACACCAAGCTGAAGATGTACGCGGTACGCCAAGGCAAGACCATTACCGAGCTGCTATCTGAATACATCGCGCAGCTACCAGAGTAAATGAGCAAATGAATAAATGAGTAGATGAATTTTAGCGGCTAAAGGAGGCGGCATGGAAAATCAAGAACAACCAGGCACCGACGCCGTGGAATGCCCCATGTGTGGAGGAACGGGCGGTTGGCCAGGCGTAAGCGGCTGGGTTGTCTGCCGGCCCTGCAATGGCACTGGAACCCCCAAGCCCGAGGAATCGGCGTGACGGTCGCAAACCATCCGGCCCGGTACAAATCGGCGCGGCGCTGGGTGATGACCTGGTGGAGAAGTTGAAGGCCGCGCAGGCCGCCCAGCGGCAACGCATCGAGGCAGAAGCACGCCCCGGTGAATCGTGGCAAGCGGCCGCTGATCGAATCCGCAAAGAATCCCGGCAACCGCCGGCAGCCGGTGCGCCGTCGATTAGGAAGCCGCCCAAGGGCGACGAGCAACCAGATTTTTTCGTTCCGATGCTCTATGACGTGGGCACCCGCGATAGTCGCAGCATCATGGACGTGGCCGTTTTCCGTCTGTCGAAGCGTGACCGACGAGCTGGCGAGGTGATCCGCTACGAGCTTCCAGACGGGCACGTAGAGGTTTCCGCAGGGCCGGCCGGCATGGCCAGTGTGTGGGATTACGACCTGGTACTGATGGCGGTTTCCCATCTAACCGAATCCATGAACCGATACCGGGAAGGGAAGGGAGACAAGCCCGGCCGCGTGTTCCGTCCACACGTTGCGGACGTACTCAAGTTCTGCCGGCGAGCCGATGGCGGAAAGCAGAAAGACGACCTGGTAGAAACCTGCATTCGGTTAAACACCACGCACGTTGCCATGCAGCGTACGAAGAAGGCCAAGAACGGCCGCCTGGTGACGGTATCCGAGGGTGAAGCCTTGATTAGCCGCTACAAGATCGTAAAGAGCGAAACCGGGCGGCCGGAGTACATCGAGATCGAGCTAGCTGATTGGATGTACCGCGAGATCACAGAAGGCAAGAACCCGGACGTGCTGACGGTTCACCCCGATTACTTTTTGATCGATCCCGGCATCGGCCGTTTTCTCTACCGCCTGGCACGCCGCGCCGCAGGCAAGGCAGAAGCCAGATGGTTGTTCAAGACGATCTACGAACGCAGTGGCAGCGCCGGAGAGTTCAAGAAGTTCTGTTTCACCGTGCGCAAGCTGATCGGGTCAAATGACCTGCCGGAGTACGATTTGAAGGAGGAGGCGGGGCAGGCTGGCCCGATCCTAGTCATGCGCTACCGCAACCTGATCGAGGGCGAAGCATCCGCCGGTTCCTAATGTACGGAGCAGATGCTAGGGCAAATTGCCCTAGCAGGGGAAAAAGGTCGAAAAGGTCTCTTTCCTGTGGATAGCACGTACATTGGGAACCCAAAGCCGTACATTGGGAACCGGAACCCGTACATTGGGAACCCAAAGCCGTACATTGGGAACCGGTCACACATGTAAGTGACTGATATAAAAGAGAAAAAAGGCGATTTTTCCGCCTAAAACTCTTTAAAACTTATTAAAACTCTTAAAACCCGCCTGGCCTGTGCATAACTGTCTGGCCAGCGCACAGCCGAAGAGCTGCAAAAAGCGCCTACCCTTCGGTCGCTGCGCTCCCTACGCCCCGCCGCTTCGCGTCGGCCTATCGCGGCCGCTGGCCGCTCAAAAATGGCTGGCCTACGGCCAGGCAATCTACCAGGGCGCGGACAAGCCGCGCCGTCGCCACTCGACCGCCGGCGCCCACATCAAGGCACCCTGCCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCGCAGCCATGACCCAGTCACGTAGCGATAGCGGAGTGTATACTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGCATGATATATCTCCCAATTTGTGTAGGGCTTATTATGCACGCTTAAAAATAATAAAAGCA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Figure BDA00002313716900592
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Figure BDA00002313716900602
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幼苗接种：苜蓿幼苗生长到小于约1/2英寸高，然后在纸巾上浸泡，所述纸巾充满包含载有ω酰胺酶转基因表达盒的TF101.1载体的农杆菌。所述幼苗留在所述纸巾上2-3天，移除并且然后植于盆栽土壤中。所得TO和对照植物然后在生长室中生长27天，收集并且分析生化和物理特性。
生化特性：2-氧代缩环戊酸单酰胺的HPLC试验：HPLC用于测试2-氧代缩环戊酸单酰胺，按照Calderon等，1985,J Bacteriol 161(2):807-809的改良。简单说，在用HCl按重量-体积比率2:1酸化到小于pH2.0的蒸馏去离子水中从植物组织提取2-氧代缩环戊酸单酰胺。通过HPLC检测和量化2-氧代缩环戊酸单酰胺，使用ION-3007.8mm IDX30cm L柱，在40°C下用0.01NH2SO4中的流动相，流速约0.2ml/分钟。注射体积为约20μl，并且保留时间为约38-39分钟。使用210nm UV光完成检测。使用可信的2-氧代缩环戊酸单酰胺来校准所述试验。
GPT和GS活性的HPLC试验：在包含1mm乙二胺四乙酸、200mM吡哆醛磷酸和6mM巯基乙醇的冷的100mM Tris-HCI pH7.6中，按每克组织3ml的比率研磨后，从新鲜的植物组织中提取GPT。所述提取物用离心澄清并且用于所述试验。在包含10mM MgCl2和12.5mM巯基乙醇的冷的50mM咪唑pH7.5中，按照每克组织3ml的比率研磨后，从新鲜的植物组织中提取GS。所述提取物用离心澄清并且用于所述试验。GPT活性按Calderon和Mora,1985,Journal Bacteriology 161:807-809所述测试。GS活性按Shapiro和Stadtmann,1970,Methods in Enzymology 17A:910-922所述测量。两个试验都涉及在合适pH下用底物和辅助因子的孵育。用HPLC检测。
Ω酰胺酶活性的HPLC试验：Ω酰胺酶活性使用如Krasnikov等，2009,Analytical Biochemistry 391:144-150所述的96孔板试验测定。
结果：
测量野生型和转基因苜蓿植物中的植物鲜重以及叶和根2-氧代缩环戊酸单酰胺浓度和比率并且显示于下表5。性能最好的转基因苜蓿中的GS和GPT活性与野生型对照植物平均值的比较显示于表6。植物鲜重值相对2-氧代缩环戊酸单酰胺浓度的作图示于图4。比较转基因和对照苜蓿植物的照片示于图5。
载有定向用于根表达的ω酰胺酶的转基因苜蓿植物显示显著降低的根2-氧代缩环戊酸单酰胺浓度，大概是转基因引入的所添加ω酰胺酶活性的结果（表5）。GS和GPT的活性水平在根组织中都保持不变但是在转基因苜蓿中有非常显著的提高（表6）。所述转基因植物也显示更快生长、产生显著增加的生物量（表5），其与所述植物中减低的2-氧代缩环戊酸单酰胺水平以接近线性的方式相关联（图4）。所述生长最快的转基因苜蓿系显示相对于所述对照平均生物量，生物量增加274%。此品系也显示2-氧代缩环戊酸单酰胺根浓度的最大降低。
表5
TG=转基因
表6
实施例4：载有根优先性Ω酰胺酶转基因的转基因拟南芥植物的生长增加
在这个实施例中，拟南芥植物生长通过引入高度根优先性启动子控制下的ω酰胺酶转基因而增加。所得的转基因拟南芥植物显示相对于野生型拟南芥植物，根中2-氧代缩环戊酸单酰胺浓度显著下降、2-氧代缩环戊酸单酰胺叶-根比率很显著增加、叶中GS和GPT水平大幅提高、叶中ω酰胺酶水平大幅下降和生长惊人的提高。
材料和方法：
农杆菌载体：所述ω酰胺酶转基因表达载体和农杆菌制备如实施例3（同上）所述生成。
转化：拟南芥的转化使用农杆菌介导的“花浸渍”转移如所述(Harrison等，2006,Plant Methods 2:19-23;Clough和Bent,1998,Plant J.16:735-743)完成。用载有ω酰胺酶转基因表达盒的TF101.1载体转化的农杆菌在抗生素选择下生长，通过离心重悬于有抗生素的LB肉汤来收集并且用于花浸渍拟南芥花序。花浸渍拟南芥植物生长至成熟和自体授精，并且收集种子。
发芽和选择：用载有ω酰胺酶转基因表达盒的TF101.1载体转化的植物种子，在包含15mg/L BASTA或相同量的草胺膦的培养基中发芽。对实施例5-7所述的其他构建体和组合：来自谷氨酰胺合成酶构建体转化的植物的种子在包含20微克潮霉素的培养基中发芽，并且随后按照常规选择方案获得存活幼苗。来自谷氨酰胺苯丙酮酸转氨酶转化的植物的种子在包含20ug/ml卡那霉素的培养基中发芽，并且随后按照常规选择方案获得存活幼苗。对包含多于一种所述基因的幼苗而言，所述幼苗转移到包含下一个选择化学物的培养基中，并获得存活幼苗。检测所述存活幼苗。
生化特性：2-氧代缩环戊酸单酰胺、ω酰胺酶、GS和GPT的试验如实施例3（同上）所述进行。
结果：
测量野生型和转基因拟南芥植物的GPT活性和GS活性并且示于下表7。在叶和根组织中测量野生型和转基因拟南芥植物中Ω酰胺酶活性和2-氧代缩环戊酸单酰胺浓度，并且示于下表8。
表7
TG=转基因
*9个植物的平均值
**6个植物的平均值
表8
Figure BDA00002313716900632
TG=转基因
*9个植物的平均值
**6个植物的平均值
与野生型对照拟南芥植物相比，载有定向用于根表达的ω酰胺酶的所述转基因拟南芥植物显示ω酰胺酶通路内巨大的生化改变，包含增加的根ω酰胺酶活性(186%增加)、下降的根2-氧代缩环戊酸单酰胺水平(76%下降)和增加的叶-根2-氧代缩环戊酸单酰胺比率。另外，所述转基因植物也显示叶ω酰胺酶活性水平的巨大下降(88%下降)、接近2倍的叶2-氧代缩环戊酸单酰胺水平和更高的叶GS和叶GPT活性(分别是70%和533%)。所得对生长的影响令人惊讶，平均而言，所述转基因植物重量多于野生型植物重量的6倍。
实施例5：载有根优先性Ω酰胺酶转基因和叶定向GPT的转基因拟南芥植物的生长增加
在这个实施例中，拟南芥植物生长通过引入高度根优先性启动子控制下的ω酰胺酶转基因和叶定向启动子控制下的GPT转基因而增加。所得转基因拟南芥植物显示相对于野生型拟南芥植物而言，生长上的惊人增加和多个生化改变。
材料和方法：
农杆菌载体：所述ω酰胺酶转基因表达载体和农杆菌制备如实施例3（同上）所述生成。对于叶定向GPT转基因，构建表达盒并且克隆到所述Cambia2201表达载体中，所述表达盒包含所述番茄rubisco小亚基启动子和截短删除全长GPT的前45密码子的拟南芥密码子优化GPT(除去所述叶绿体转运肽)，。所得GPT转基因表达载体构建体（6c）如下所示，并且用于转化如实施例3所述的农杆菌。
有番茄rubisco SSU启动子+(-45)的所述Cambia 2201的核苷酸序列示于下面SEQ ID NO:40，所述序列截短、对拟南芥GPT+nos终止子优化。带下划线的核苷酸=番茄rubisco启动子，粗体核苷酸=GPT编码区域(对拟南芥优化的密码子)，斜体的核苷酸=nos终止子区域(和一些Cambia载体序列)，和其他核苷酸=Cambia 2201载体和其他克隆位点。
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Figure BDA00002313716900655
Figure BDA00002313716900656
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转化和选择：拟南芥的转化使用实施例4所述农杆菌介导的“花浸渍”转移来完成。转化植物在实施例4所述的选择下生长。
生化特性：2-氧代缩环戊酸单酰胺、ω酰胺酶、GS和GPT的试验如实施例3（同上）所述进行。
结果：
测量野生型和转基因拟南芥植物的GPT活性和GS活性并且示于下表9。在叶和根组织中测量野生型和转基因拟南芥植物的Ω酰胺酶活性和2-氧代缩环戊酸单酰胺浓度，并且示于下表10。
表9
Figure BDA00002313716900681
TG=转基因
GPT(6c)=-45截短GPT[SEQ ID NO:40]
*9个植物的平均值
**5个植物的平均值
表10
Figure BDA00002313716900682
TG=转基因
GPT(6c)=-45截短GPT[SEQ ID NO:40]
*9个植物的平均值
**5个植物的平均值
与野生型拟南芥植物相比，载有定向用于根表达的ω酰胺酶和定向用于叶表达的截短GPT(用于胞质表达)的所述转基因拟南芥植物显示与实施例5（同上）的转基因植物所观察相似的ω酰胺酶通路内的生化变化。更特定地，转基因GPT+ω酰胺酶植物显示增加的根ω酰胺酶活性、下降的根2-氧代缩环戊酸单酰胺浓度和增加的2-氧代缩环戊酸单酰胺叶-根比率。同样，与实施例5的转基因植物观察的结果类似，所述GPT+ω酰胺酶转基因植物显示显著下降的叶ω酰胺酶活性水平、增加的叶2-氧代缩环戊酸单酰胺和更高的叶GS和叶GPT活性。所得对生长的影响甚至比实施例5转基因植物观察的更大，平均而言，转基因植物重量多于野生型植物重量的6.7倍。
实施例6：载有根优先性Ω酰胺酶转基因和叶定向GPT和GS的转基因拟南芥植物的生长增加
在这个实施例中，拟南芥植物生长通过引入高度根优先性启动子控制下的ω酰胺酶转基因和叶定向启动子控制下的GPT和GS转基因而增加。所得转基因拟南芥植物显示相对于野生型拟南芥植物而言，生长上的惊人增加和多个生化改变。
材料和方法：
农杆菌载体：所述ω酰胺酶转基因表达载体和农杆菌制备如实施例3（同上）所述生成。对叶定向GPT转基因，构建表达盒并且克隆到所述Cambia 2201表达载体中，所述表达盒包含所述番茄rubisco小亚基启动子和截短删除全长GPT的前45密码子的拟南芥密码子优化(除去所述叶绿体转运肽)的编码序列，和包含氨基酸残基45的F-V突变。所得GPT转基因表达载体构建体（9c）示于下面SEQ ID NO:41，并且用于转化如实施例5所述的农杆菌。
有番茄rubisco SSU启动子+(-45)所述Cambia 2201的核苷酸序列示于下面SEQ ID NO:41，所述序列截短、对拟南芥GPT+nos终止子优化。带下划线的核苷酸=番茄rubisco启动子，粗体核苷酸=GPT编码区域(对拟南芥优化的密码子)，斜体的核苷酸=nos终止子区域(和一些Cambia载体序列)，和其他核苷酸=Cambia 2201载体和其他克隆位点。
CCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCC
Figure BDA00002313716900691
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Figure BDA00002313716900701
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TGAATTACAGGTGACCAGCTCGAATTTCCCCGAT
Figure BDA00002313716900704
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Figure BDA00002313716900706
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对叶定向GS转基因而言，构建包含番茄rubisco小亚基启动子和拟南芥GS 1编码序列的表达盒，并且克隆到有所述番茄rubisco小亚基启动子(rbcS3C)的Cambia 1305.1表达载体中。所得GS转基因表达载体构建体（4c）示于SEQID NO:43，并且用于转化如实施例5所述的农杆菌。
有rubisco小亚基启动子(rbcS3C)+ARGS(拟南芥GS1)的Cambia 1305.1的核苷酸序列示于下面SEQ ID NO:43。带下划线的核苷酸=番茄rubisco启动子，双下划线的核苷酸=Cambia 1305.1载体中catl内含子的前10个氨基酸来自GUSplus酶并且克隆到1305.1载体中的位点，粗体核苷酸=拟南芥GS1编码区域(克隆到Spel-pmll位点)，斜体的核苷酸=nos终止子区域(和一些Cambia载体序列)，和其他核苷酸=Cambia 2201载体和其他克隆位点。
Figure BDA00002313716900731
GTTTGAATCCTCCTTAAAGTTTTTCTCTGGAGAAACTGTAGTAATTTTACTTTGTTGTGTT CCCTTCATCTTTTGAATTAATGGCATTTGTTTTAATACTAATCTGCTTCTGAAACTTGTAATGTATGT ATATCAGTTTCTTATAATTTATCCAAGTAATATCTTCCATTCTCTATGCAATTGCCTGCATAAGCTC GACAAAAGAGTACATCAACCCCTCCTCCTCTGGACTACTCTAGCTAAACTTGAATTTCCCCTTAAG ATTATGAAATTGATATATCCTTAACAAACGACTCCTTCTGTTGGAAAATGTAGTACTTGTCTTTCTT CTTTTGGGTATATATAGTTTATATACACCATACTATGTACAACATCCAAGTAGAGTGAAATGGATAC ATGTACAAGACTTATTTGATTGATTGATGACTTGAGTTGCCTTAGGAGTAACAAATTCTTAGGTCAA TAAATCGTTGATTTGAAATTAATCTCTCTGTCTTAGACAGATAGGAATTATGACTTCCAATGGTCCA GAAAGCAAAGTTCGCACTGAGGGTATACTTGGAATTGAGACTTGCACAGGTCCAGAAACCAAAGT TCCCATCGAGCTCTAAAATCACATCTTTGGAATGAAATTCAATTAGAGATAAGTTGCTTCATAGCAT AGGTAAAATGGAAGATGTGAAGTAACCTGCAATAATCAGTGAAATGACATTAATACACTAAATACT TCATATGTAATTATCCTTTCCAGGTTAACAATACTCTATAAAGTAAGAATTATCAGAAATGGGCTCA TCAAACTTTTGTACTATGTATTTCATATAAGGAAGTATAACTATACATAAGTGTATACACAACTTTAT TCCTATTTTGTAAAGGTGGAGAGACTGTTTTCGATGGATCTAAAGCAATATGTCTATAAAATGCATT GATATAATAATTATCTGAGAAAATCCAGAATTGGCGTTGGATTATTTCAGCCAAATAGAAGTTTGTA CCATACTTGTTGATTCCTTCTAAGTTAAGGTGAAGTATCATTCATAAACAGTTTTCCCCAAAGTACT ACTCACCAAGTTTCCCTTTGTAGAATTAACAGTTCAAATATATGGCGCAGAAATTACTCTATGCCC AAAACCAAACGAGAAAGAAACAAAATACAGGGGTTGCAGACTTTATTTTCGTGTTAGGGTGTGTTT TTTCATGTAATTAATCAAAAAATATTATGACAAAAACATTTATACATATTTTTACTCAACACTCTGGG TATCAGGGTGGGTTGTGTTCGACAATCAATATGGAAAGGAAGTATTTTCCTTATTTTTTTAGTTAAT ATTTTCAGTTATACCAAACATACCTTGTGATATTATTTTTAAAAATGAAAAACTCGTCAGAAAGAAA AAGCAAAAGCAACAAAAAATTGCAAGTATTTTTTAAAAAAGAAAAAAAAAACATATCTTGTTTGTC AGTATGGGAAGTTTGAGATAAGGACGAGTGAGGGGTTAAAATTCAGTGGCCATTGATTTTGTAAT GCCAAGAACCACAAAATCCAATGGTTACCATTCCTGTAAGATGAGGTTTGCTAACTCTTTTTGTCC GTTAGATAGGAAGCCTTATCACTATATATACAAGGCGTCCTAATAACCTCTTAGTAACCAATTATTT CAGCACCATGGTAGATCTGAGG
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Figure BDA00002313716900747
AATTAAACTATCAGTGTTTGACAGGATATATTGGCGGGTAAACCTAAGAGAAAAGAGCGTTTATTAGAATAACGGATATTTAAAAGGGCGTGAAAAGGTTTATCCGTTCGTCCATTTGTATGTGCATGCCAACCACAGGGTTCCCCTCGGGATCAAAGTACTTTGATCCAACCCCTCCGCTGCTATAGTGCAGTCGGCTTCTGACGTTCAGTGCAGCCGTCTTCTGAAAACGACATGTCGCACAAGTCCTAAGTTACGCGACAGGCTGCCGCCCTGCCCTTTTCCTGGCGTTTTCTTGTCGCGTGTTTTAGTCGCATAAAGTAGAATACTTGCGACTAGAACCGGAGACATTACGCCATGAACAAGAGCGCCGCCGCTGGCCTGCTGGGCTATGCCCGCGTCAGCACCGACGACCAGGACTTGACCAACCAACGGGCCGAACTGCACGCGGCCGGCTGCACCAAGCTGTTTTCCGAGAAGATCACCGGCACCAGGCGCGACCGCCCGGAGCTGGCCAGGATGCTTGACCACCTACGCCCTGGCGACGTTGTGACAGTGACCAGGCTAGACCGCCTGGCCCGCAGCACCCGCGACCTACTGGACATTGCCGAGCGCATCCAGGAGGCCGGCGCGGGCCTGCGTAGCCTGGCAGAGCCGTGGGCCGACACCACCACGCCGGCCGGCCGCATGGTGTTGACCGTGTTCGCCGGCATTGCCGAGTTCGAGCGTTCCCTAATCATCGACCGCACCCGGAGCGGGCGCGAGGCCGCCAAGGCCCGAGGCGTGAAGTTTGGCCCCCGCCCTACCCTCACCCCGGCACAGATCGCGCACGCCCGCGAGCTGATCGACCAGGAAGGCCGCACCGTGAAAGAGGCGGCTGCACTGCTTGGCGTGCATCGCTCGACCCTGTACCGCGCACTTGAGCGCAGCGAGGAAGTGACGCCCACCGAGGCCAGGCGGCGCGGTGCCTTCCGTGAGGACGCATTGACCGAGGCCGACGCCCTGGCGGCCGCCGAGAATGAACGCCAAGAGGAACAAGCATGAAACCGCACCAGGACGGCCAGGACGAACCGTTTTTCATTACCGAAGAGATCGAGGCGGAGATGATCGCGGCCGGGTACGTGTTCGAGCCGCCCGCGCACGTCTCAACCGTGCGGCTGCATGAAATCCTGGCCGGTTTGTCTGATGCCAAGCTGGCGGCCTGGCCGGCCAGCTTGGCCGCTGAAGAAACCGAGCGCCGCCGTCTAAAAAGGTGATGTGTATTTGAGTAAAACAGCTTGCGTCATGCGGTCGCTGCGTATATGATGCGATGAGTAAATAAACAAATACGCAAGGGGAACGCATGAAGGTTATCGCTGTACTTAACCAGAAAGGCGGGTCAGGCAAGACGACCATCGCAACCCATCTAGCCCGCGCCCTGCAACTCGCCGGGGCCGATGTTCTGTTAGTCGATTCCGATCCCCAGGGCAGTGCCCGCGATTGGGCGGCCGTGCGGGAAGATCAACCGCTAACCGTTGTCGGCATCGACCGCCCGACGATTGACCGCGACGTGAAGGCCATCGGCCGGCGCGACTTCGTAGTGATCGACGGAGCGCCCCAGGCGGCGGACTTGGCTGTGTCCGCGATCAAGGCAGCCGACTTCGTGCTGATTCCGGTGCAGCCAAGCCCTTACGACATATGGGCCACCGCCGACCTGGTGGAGCTGGTTAAGCAGCGCATTGAGGTCACGGATGGAAGGCTACAAGCGGCCTTTGTCGTGTCGCGGGCGATCAAAGGCACGCGCATCGGCGGTGAGGTTGCCGAGGCGCTGGCCGGGTACGAGCTGCCCATTCTTGAGTCCCGTATCACGCAGCGCGTGAGCTACCCAGGCACTGCCGCCGCCGGCACAACCGTTCTTGAATCAGAACCCGAGGGCGACGCTGCCCGCGAGGTCCAGGCGCTGGCCGCTGAAATTAAATCAAAACTCATTTGAGTTAATGAGGTAAAGAGAAAATGAGCAAAAGCACAAACACGCTAAGTGCCGGCCGTCCGAGCGCACGCAGCAGCAAGGCTGCAACGTTGGCCAGCCTGGCAGACACGCCAGCCATGAAGCGGGTCAACTTTCAGTTGCCGGCGGAGGATCACACCAAGCTGAAGATGTACGCGGTACGCCAAGGCAAGACCATTACCGAGCTGCTATCTGAATACATCGCGCAGCTACCAGAGTAAATGAGCAAATGAATAAATGAGTAGATGAATTTTAGCGGCTAAAGGAGGCGGCATGGAAAATCAAGAACAACCAGGCACCGACGCCGTGGAATGCCCCATGTGTGGAGGAACGGGCGGTTGGCCAGGCGTAAGCGGCTGGGTTGTCTGCCGGCCCTGCAATGGCACTGGAACCCCCAAGCCCGAGGAATCGGCGTGACGGTCGCAAACCATCCGGCCCGGTACAAATCGGCGCGGCGCTGGGTGATGACCTGGTGGAGAAGTTGAAGGCCGCGCAGGCCGCCCAGCGGCAACGCATCGAGGCAGAAGCACGCCCCGGTGAATCGTGGCAAGCGGCCGCTGATCGAATCCGCAAAGAATCCCGGCAACCGCCGGCAGCCGGTGCGCCGTCGATTAGGAAGCCGCCCAAGGGCGACGAGCAACCAGATTTTTTCGTTCCGATGCTCTATGACGTGGGCACCCGCGATAGTCGCAGCATCATGGACGTGGCCGTTTTCCGTCTGTCGAAGCGTGACCGACGAGCTGGCGAGGTGATCCGCTACGAGCTTCCAGACGGGCACGTAGAGGTTTCCGCAGGGCCGGCCGGCATGGCCAGTGTGTGGGATTACGACCTGGTACTGATGGCGGTTTCCCATCTAACCGAATCCATGAACCGATACCGGGAAGGGAAGGGAGACAAGCCCGGCCGCGTGTTCCGTCCACACGTTGCGGACGTACTCAAGTTCTGCCGGCGAGCCGATGGCGGAAAGCAGAAAGACGACCTGGTAGAAACCTGCATTCGGTTAAACACCACGCACGTTGCCATGCAGCGTACGAAGAAGGCCAAGAACGGCCGCCTGGTGACGGTATCCGAGGGTGAAGCCTTGATTAGCCGCTACAAGATCGTAAAGAGCGAAACCGGGCGGCCGGAGTACATCGAGATCGAGCTAGCTGATTGGATGTACCGCGAGATCACAGAAGGCAAGAACCCGGACGTGCTGACGGTTCACCCCGATTACTTTTTGATCGATCCCGGCATCGGCCGTTTTCTCTACCGCCTGGCACGCCGCGCCGCAGGCAAGGCAGAAGCCAGATGGTTGTTCAAGACGATCTACGAACGCAGTGGCAGCGCCGGAGAGTTCAAGAAGTTCTGTTTCACCGTGCGCAAGCTGATCGGGTCAAATGACCTGCCGGAGTACGATTTGAAGGAGGAGGCGGGGCAGGCTGGCCCGATCCTAGTCATGCGCTACCGCAACCTGATCGAGGGCGAAGCATCCGCCGGTTCCTAATGTACGGAGCAGATGCTAGGGCAAATTGCCCTAGCAGGGGAAAAAGGTCGAAAAGGTCTCTTTCCTGTGGATAGCACGTACATTGGGAACCCAAAGCCGTACATTGGGAACCGGAACCCGTACATTGGGAACCCAAAGCCGTACATTGGGAACCGGTCACACATGTAAGTGACTGATATAAAAGAGAAAAAAGGCGATTTTTCCGCCTAAAACTCTTTAAAACTTATTAAAACTCTTAAAACCCGCCTGGCCTGTGCATAACTGTCTGGCCAGCGCACAGCCGAAGAGCTGCAAAAAGCGCCTACCCTTCGGTCGCTGCGCTCCCTACGCCCCGCCGCTTCGCGTCGGCCTATCGCGGCCGCTGGCCGCTCAAAAATGGCTGGCCTACGGCCAGGCAATCTACCAGGGCGCGGACAAGCCGCGCCGTCGCCACTCGACCGCCGGCGCCCACATCAAGGCACCCTGCCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCGCAGCCATGACCCAGTCACGTAGCGATAGCGGAGTGTATACTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGCATTCTAGGTACTAAAACAATTCATCCAGTAAAATATAATATTTTATTTTCTCCCAATCAGGCTTGATCCCCAGTAAGTCAAAAAATAGCTCGACATACTGTTCTTCCCCGATATCCTCCCTGATCGACCGGACGCAGAAGGCAATGTCATACCACTTGTCCGCCCTGCCGCTTCTCCCAAGATCAATAAAGCCACTTACTTTGCCATCTTTCACAAAGATGTTGCTGTCTCCCAGGTCGCCGTGGGAAAAGACAAGTTCCTCTTCGGGCTTTTCCGTCTTTAAAAAATCATACAGCTCGCGCGGATCTTTAAATGGAGTGTCTTCTTCCCAGTTTTCGCAATCCACATCGGCCAGATCGTTATTCAGTAAGTAATCCAATTCGGCTAAGCGGCTGTCTAAGCTATTCGTATAGGGACAATCCGATATGTCGATGGAGTGAAAGAGCCTGATGCACTCCGCATACAGCTCGATAATCTTTTCAGGGCTTTGTTCATCTTCATACTCTTCCGAGCAAAGGACGCCATCGGCCTCACTCATGAGCAGATTGCTCCAGCCATCATGCCGTTCAAAGTGCAGGACCTTTGGAACAGGCAGCTTTCCTTCCAGCCATAGCATCATGTCCTTTTCCCGTTCCACATCATAGGTGGTCCCTTTATACCGGCTGTCCGTCATTTTTAAATATAGGTTTTCATTTTCTCCCACCAGCTTATATACCTTAGCAGGAGACATTCCTTCCGTATCTTTTACGCAGCGGTATTTTTCGATCAGTTTTTTCAATTCCGGTGATATTCTCATTTTAGCCATTTATTATTTCCTTCCTCTTTTCTACAGTATTTAAAGATACCCCAAGAAGCTAATTATAACAAGACGAACTCCAATTCACTGTTCCTTGCATTCTAAAACCTTAAATACCAGAAAACAGCTTTTTCAAAGTTGTTTTCAAAGTTGGCGTATAACATAGTATCGACGGAGCCGATTTTGAAACCGCGGTGATCACAGGCAGCAACGCTCTGTCATCGTTACAATCAACATGCTACCCTCCGCGAGATCATCCGTGTTTCAAACCCGGCAGCTTAGTTGCCGTTCTTCCGAATAGCATCGGTAACATGAGCAAAGTCTGCCGCCTTACAACGGCTCTCCCGCTGACGCCGTCCCGGACTGATGGGCTGCCTGTATCGAGTGGTGATTTTGTGCCGAGCTGCCGGTCGGGGAGCTGTTGGCTGGCTGGTGGCAGGATATATTGTGGTGTAAACAAATTGACGCTTAGACAACTTAATAACACATTGCGGACGTTTTTAATGTACTGAATTAACGCCGAATTAATTCGGGGGATCTGGATTTTAGTACTGGATTTTGGTTTTAGGAATTAGAAATTTTATTGATAGAAGTATTTTACAAATACAAATACATACTAAGGGTTTCTTATATGCTCAACACATGAGCGAAACCCTATAGGAACCCTAATTCCCTTATCTGGGAACTACTCACACATTATTATGGAGAAACTCGAGCTTGTCGATCGACAGATCCGGTCGGCATCTACTCTATTTCTTTGCCCTCGGACGAGTGCTGGGGCGTCGGTTTCCACTATCGGCGAGTACTTCTACACAGCCATCGGTCCAGACGGCCGCGCTTCTGCGGGCGATTTGTGTACGCCCGACAGTCCCGGCTCCGGATCGGACGATTGCGTCGCATCGACCCTGCGCCCAAGCTGCATCATCGAAATTGCCGTCAACCAAGCTCTGATAGAGTTGGTCAAGACCAATGCGGAGCATATACGCCCGGAGTCGTGGCGATCCTGCAAGCTCCGGATGCCTCCGCTCGAAGTAGCGCGTCTGCTGCTCCATACAAGCCAACCACGGCCTCCAGAAGAAGATGTTGGCGACCTCGTATTGGGAATCCCCGAACATCGCCTCGCTCCAGTCAATGACCGCTGTTATGCGGCCATTGTCCGTCAGGACATTGTTGGAGCCGAAATCCGCGTGCACGAGGTGCCGGACTTCGGGGCAGTCCTCGGCCCAAAGCATCAGCTCATCGAGAGCCTGCGCGACGGACGCACTGACGGTGTCGTCCATCACAGTTTGCCAGTGATACACATGGGGATCAGCAATCGCGCATATGAAATCACGCCATGTAGTGTATTGACCGATTCCTTGCGGTCCGAATGGGCCGAACCCGCTCGTCTGGCTAAGATCGGCCGCAGCGATCGCATCCATAGCCTCCGCGACCGGTTGTAGAACAGCGGGCAGTTCGGTTTCAGGCAGGTCTTGCAACGTGACACCCTGTGCACGGCGGGAGATGCAATAGGTCAGGCTCTCGCTAAACTCCCCAATGTCAAGCACTTCCGGAATCGGGAGCGCGGCCGATGCAAAGTGCCGATAAACATAACGATCTTTGTAGAAACCATCGGCGCAGCTATTTACCCGCAGGACATATCCACGCCCTCCTACATCGAAGCTGAAAGCACGAGATTCTTCGCCCTCCGAGAGCTGCATCAGGTCGGAGACGCTGTCGAACTTTTCGATCAGAAACTTCTCGACAGACGTCGCGGTGAGTTCAGGCTTTTTCATATCTCATTGCCCCCCGGGATCTGCGAAAGCTCGAGAGAGATAGATTTGTAGAGAGAGACTGGTGATTTCAGCGTGTCCTCTCCAAATGAAATGAACTTCCTTATATAGAGGAAGGTCTTGCGAAGGATAGTGGGATTGTGCGTCATCCCTTACGTCAGTGGAGATATCACATCAATCCACTTGCTTTGAAGACGTGGTTGGAACGTCTTCTTTTTCCACGATGCTCCTCGTGGGTGGGGGTCCATCTTTGGGACCACTGTCGGCAGAGGCATCTTGAACGATAGCCTTTCCTTTATCGCAATGATGGCATTTGTAGGTGCCACCTTCCTTTTCTACTGTCCTTTTGATGAAGTGACAGATAGCTGGGCAATGGAATCCGAGGAGGTTTCCCGATATTACCCTTTGTTGAAAAGTCTCAATAGCCCTTTGGTCTTCTGAGACTGTATCTTTGATATTCTTGGAGTAGACGAGAGTGTCGTGCTCCACCATGTTATCACATCAATCCACTTGCTTTGAAGACGTGGTTGGAACGTCTTCTTTTTCCACGATGCTCCTCGTGGGTGGGGGTCCATCTTTGGGACCACTGTCGGCAGAGGCATCTTGAACGATAGCCTTTCCTTTATCGCAATGATGGCATTTGTAGGTGCCACCTTCCTTTTCTACTGTCCTTTTGATGAAGTGACAGATAGCTGGGCAATGGAATCCGAGGAGGTTTCCCGATATTACCCTTTGTTGAAAAGTCTCAATAGCCCTTTGGTCTTCTGAGACTGTATCTTTGATATTCTTGGAGTAGACGAGAGTGTCGTGCTCCACCATGTTGGCAAGCTGCTCTAGCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTC
转化和选择：拟南芥的转化使用实施例4所述农杆菌介导的“花浸渍”转化来完成。转化植物在实施例4所述的选择下生长。
生化特性：2-氧代缩环戊酸单酰胺、ω酰胺酶、GS和GPT的试验按实施例3（同上）所述进行。
结果：
测量野生型和转基因拟南芥植物的GPT活性和GS活性并且示于下表11。在叶和根组织中测量野生型和转基因拟南芥植物中Ω酰胺酶活性和2-氧代缩环戊酸单酰胺浓度，并且示于下表12。
表11
Figure BDA00002313716900771
TG=转基因
GPT(9c)=-45截短GPT变体[SEQ ID NO:41]
GS 4c=SEQ ID NO:43
*9个植物的平均值
**5个植物的平均值
表12
TG=转基因
GPT(9c)=-45截短GPT变体[SEQ ID NO:41]
*9个植物的平均值
**5个植物的平均值
与野生型拟南芥植物相比，载有定向用于根表达的ω酰胺酶和定向用于叶表达的截短GPT(用于胞质表达)和定向用于叶表达的GS1的所述转基因拟南芥植物显示与实施例4和5（同上）的转基因植物所观察相似的ω酰胺酶通路内的生化变化。更特定地，转基因GPT+ω酰胺酶植物显示增加的根ω酰胺酶活性、下降的根2-氧代缩环戊酸单酰胺浓度和增加的2-氧代缩环戊酸单酰胺叶-根比率。同样，与实施例5和6的转基因植物观察的结果类似，所述GPT+GS+ω酰胺酶转基因植物显示显著下降的叶ω酰胺酶活性水平、增加的叶2-氧代缩环戊酸单酰胺和更高的叶GS和叶GPT活性。所得对生长的影响甚至比实施例4或者5实施例的转基因植物观察的更大，平均而言，转基因植物重量多于野生型植物重量的9倍。
实施例7：载有根优先性Ω酰胺酶转基因的转基因拟南芥基因型的比较
平行进行的实施例4、5和6的研究所产生的数据，在下表13和14中一起显示以用于比较。
表13
Figure BDA00002313716900781
*9个植物的平均值
**6个植物的平均值
***5个植物的平均值
表14
Figure BDA00002313716900782
*9个植物的平均值
**6个植物的平均值
***5个植物的平均值
实施例8：叶和根组织中Ω酰胺酶活性的化学抑制和2-氧代缩环戊酸单酰胺的叶-根比率的调节
这个实施例显示2-氧代缩环戊酸单酰胺浓度变化如何响应6-重氮-5-氧代-正亮氨酸(DON)处理叶部和根，DON是降解2-氧代缩环戊酸单酰胺的ω酰胺酶的抑制剂(Duran和Calderon,1995,Role of the glutaminetransaminase-ω-amidase pathway and glutaminase in glutamine degradation inRhizobium etli.（谷氨酰胺转氨酶-ω酰胺酶通路和谷氨酰胺酶在埃特里根瘤菌(Rhizobium etli）谷氨酰胺降解中的作用）Microbiology 141:589-595)。
材料和方法：
营养溶液：使用Columbia营养溶液（Knight和Weissman,1982,PlantPhysiol.70:1683）。
叶处理：植物在24°C沙中生长，使用每天16小时光照和每天8小时黑暗的光周期。种子在沙中发芽并且使其在幼苗出现后生长9-14天。每天提供给幼苗（每3英寸罐1株）营养。每个罐顶覆盖Saran塑料膜，有裂纹切口使所述幼苗有形成的空间，以防止处理溶液接触土壤。每天两次喷洒DON处理/营养溶液来处理叶。所述DON处理/营养溶液包含1微克/ml DON、50微升/升SILWET L77(表面活性剂)和0.02体积/体积%甘油(湿润剂)，pH6.3，溶解在营养溶液中。对照植物每天喷洒没有DON的相同溶液。用喷雾器以使用所述溶液直到滴落。开始处理14天后，杀死植物并且分析鲜重、叶和根组织中的ω酰胺酶活性和2-氧代缩环戊酸单酰胺浓度。
根处理：植物在24°C水栽培中生长，使用每天16小时光照和每天8小时黑暗的光周期。种子先发芽，并且幼苗生长9天，其间单个幼苗的根悬浮在800ml烧杯内的所述营养溶液中(600ml营养液,pH6.3)，所述烧杯用铝箔（有用于种子的裂缝）覆盖以防止海藻生长。所述烧杯用小泵提供的空气通气，并且通过玻璃巴斯德移液管（Pasteur pipette）递送入所述溶液。对于处理，加入DON到所述营养溶液至终浓度1微克/ml。因此持续提供DON以处理幼苗。所述对照在没有DON的所述相同营养溶液中生长。每三天更新所述溶液。开始处理14天后，杀死植物并且分析鲜重、叶和根组织中的ω酰胺酶活性和2-氧代缩环戊酸单酰胺浓度。
结果：
Ω酰胺酶抑制剂处理根：甜玉米和攀缘茎类的豆植物根用上述DON处理。所述根处理的结果示于下表15和16。所述DON处理植物没有检测到ω酰胺酶活性水平，而所述对照野生型植物维持ω酰胺酶活性的正常水平。确实，与未处理的对照植物旺盛生长相反，用持续DON处理根的所有玉米和豆类植物显示严重的生长障碍。对照植物在实验时间内增加其鲜重多达接近8倍。
用ω酰胺酶抑制剂处理的玉米和豆类植物中观察到2-氧代缩环戊酸单酰胺叶-根比率的显著下降。处理的植物在其根中积累非常大量的2-氧代缩环戊酸单酰胺（玉米中增加超过30倍；豆中增加15倍），而维持其叶中的正常水平。
表15：玉米根中Ω酰胺酶的抑制
Figure BDA00002313716900801
2-OGM=2-氧代缩环戊酸单酰胺
表16：豆根中Ω酰胺酶的抑制
Figure BDA00002313716900802
2-OGM=2-氧代缩环戊酸单酰胺
Ω酰胺酶抑制剂处理叶：玉米植物叶用上述DON处理。结果示于下表17和18。DON有效抑制叶中Ω酰胺酶活性，处理植物显示只有未处理植物中观察到的约50%ω酰胺酶活性。在处理植物中观察到叶2-氧代缩环戊酸单酰胺和2-氧代缩环戊酸单酰胺叶-根比率的显著增加（表17和18）。特定地，处理植物在其叶中积累非常大量的2-氧代缩环戊酸单酰胺（比未处理植物增加超过7倍）。另外，抑制叶中ω酰胺酶活性也产生接近2倍的玉米植物鲜重（表18）。
表17：玉米叶中Ω酰胺酶的抑制引起2-氧代缩环戊酸单酰胺叶-根比率的增加
Figure BDA00002313716900811
2-OGM=2-氧代缩环戊酸单酰胺
gfwt=克鲜重
表18：玉米叶中Ω酰胺酶的抑制引起生长增加
gfwt=克鲜重
实施例9：与根优先性Ω酰胺酶联用的GPT同种型的比较
这个实施例比较拟南芥植物生长中与ω酰胺酶转基因的根优先性表达联用的三个不同GPT转基因同种型的生长增强性能。用于所有三个联用的所述ω酰胺酶表达构建体描述于实施例3[SEQ ID NO:39]。所述三个GPT转基因同种型是：(1)GPT 5c，优化的全长拟南芥GPT密码子[SEQ ID NO:42]；(2)GPT 6c，截短-45GPT(删除叶绿体靶向序列)，优化的密码子[SEQ ID NO:40]；和(3)GPT 9c，截短-45GPT(删除叶绿体靶向序列)，优化的密码子，氨基酸残基45有F-V突变[SEQ ID NO:41]。
有rbcS3C启动子+有拟南芥GPT基因的catl内含子的Cambia 1305.1的核苷酸序列示于下面SEQ ID NO:42。带下划线的ATG是起始位点，括号是catl内含子，并且带下划线的actagt是用于在拟南芥基因中剪接的spel克隆位点。
AAAAAAGAAAAAAAAAACATATCTTGTTTGTCAGTATGGGAAGTTTGAGATAAGGACGAGTGAGGGGTTAAAATTCAGTGGCCATTGATTTTGTAATGCCAAGAACCACAAAATCCAATGGTTACCATTCCTGTAAGATGAGGTTTGCTAACTCTTTTTGTCCGTTAGATAGGAAGCCTTATCACTATATATACAAGGCGTCCTAATAACCTCTTAGTAACCAATTATTTCAGCACCATGGTAGATCTGAGG(GTAAATTTCTAGTTTTTCTCCTTCATTTTCTTGGTTAGGACCCTTTTCTCTTTTTATTTTTTTGAGCTTTGATCTTTCTTTAAACTGATCTATTTTTTAATTGATTGGTTATGGTGTAAATATTACATAGCTTTAACTGATAATCTGATTACTTTATTTCGTGTGTCTATGATGATGATGATAGTTACAG)AACCGACGAACTAGTATGTACCTGGACATAAATGGTGTGATGATCAAACAGTTTAGCTTCAAAGCCTCTCTTCTCCCATTCTCTTCTAATTTCCGACAAAGCTCCGCCAAAATCCATCGTCCTATCGGAGCCACCATGACCACAGTTTCGACTCAGAACGAGTCTACTCAAAAACCCGTCCAGGTGGCGAAGAGATTAGAGAAGTTCAAGACTACTATTTTCACTCAAATGAGCATATTGGCAGTTAAACATGGAGCGATCAATTTAGGCCAAGGCTTTCCCAATTTCGACGGTCCTGATTTTGTTAAAGAAGCTGCGATCCAAGCTATTAAAGATGGTAAAAACCAGTATGCTCGTGGATACGGCATTCCTCAGCTCAACTCTGCTATAGCTGCGCGGTTTCGTGAAGATACGGGTCTTGTTGTTGATCCTGAGAAAGAAGTTACTGTTACATCTGGTTGCACAGAAGCCATAGCTGCAGCTATGTTGGGTTTAATAAACCCTGGTGATGAAGTCATTCTCTTTGCACCGTTTTATGATTCCTATGAAGCAACACTCTCTATGGCTGGTGCTAAAGTAAAAGGAATCACTTTACGTCCACCGGACTTCTCCATCCCTTTGGAAGAGCTTAAAGCTGCGGTAACTAACAAGACTCGAGCCATCCTTATGAACACTCCGCACAACCCGACCGGGAAGATGTTCACTAGGGAGGAGCTTGAAACCATTGCATCTCTCTGCATTGAAAACGATGTGCTTGTGTTCTCGGATGAAGTATACGATAAGCTTGCGTTTGAAATGGATCACATTTCTATAGCTTCTCTTCCCGGTATGTATGAAAGAACTGTGACCATGAATTCCCTGGGAAAGACTTTCTCTTTAACCGGATGGAAGATCGGCTGGGCGATTGCGCCGCCTCATCTGACTTGGGGAGTTCGACAAGCACACTCTTACCTCACATTCGCCACATCAACACCAGCACAATGGGCAGCCGTTGCAGCTCTCAAGGCACCAGAGTCTTACTTCAAAGAGCTGAAAAGAGATTACAATGTGAAAAAGGAGACTCTGGTTAAGGGTTTGAAGGAAGTCGGATTTACAGTGTTCCCATCGAGCGGGACTTACTTTGTGGTTGCTGATCACACTCCATTTGGAATGGAGAACGATGTTGCTTTCTGTGAGTATCTTATTGAAGAAGTTGGGGTCGTTGCGATCCCAACGAGCGTCTTTTATCTGAATCCAGAAGAAGGGAAGAATTTGGTTAGGTTTGCGTTCTGTAAAGACGAAGAGACGTTGCGTGGTGCAATTGAGAGGATGAAGCAGAAGCTTAAGAGAAAAGTCTGA
结果示于下表19。删除叶绿体转运肽的两种GPT同种型胜过所述野生型和全长GPT同种型植物。
表19：截短GPT同种型胜过天然GPT
Figure BDA00002313716900831
Figure IDA00002313717400011
Figure IDA00002313717400021
Figure IDA00002313717400031
Figure IDA00002313717400041
Figure IDA00002313717400051
Figure IDA00002313717400061
Figure IDA00002313717400071
Figure IDA00002313717400091
Figure IDA00002313717400111
Figure IDA00002313717400121
Figure IDA00002313717400131
Figure IDA00002313717400161
Figure IDA00002313717400171
Figure IDA00002313717400181
Figure IDA00002313717400191
Figure IDA00002313717400211
Figure IDA00002313717400231
Figure IDA00002313717400241
Figure IDA00002313717400251
Figure IDA00002313717400261
Figure IDA00002313717400271
Figure IDA00002313717400281
Figure IDA00002313717400291
Figure IDA00002313717400301
Figure IDA00002313717400311
Figure IDA00002313717400321
Figure IDA00002313717400331
Figure IDA00002313717400341
Figure IDA00002313717400361
Figure IDA00002313717400371
Figure IDA00002313717400381
Figure IDA00002313717400391
Figure IDA00002313717400401
Figure IDA00002313717400411
Figure IDA00002313717400421
Figure IDA00002313717400431
Figure IDA00002313717400441
Figure IDA00002313717400451
Figure IDA00002313717400471
Figure IDA00002313717400481
Figure IDA00002313717400491
Figure IDA00002313717400501
Figure IDA00002313717400521
Figure IDA00002313717400531

Claims (72)

1.一种转基因植物，其包含ω酰胺酶转基因，其中所述ω酰胺酶转基因与根优先性启动子操作性相连。
2.如权利要求1所述的转基因植物，其特征在于，所述ω酰胺酶转基因编码的多肽有与选自下组多肽所编码氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列：
AAL91613.1,ACN30911.1,ABK22312.1,ACJ85250.1,AAQ97821.1,CBJ25483.1,EFN54567.1,NP_196765.2，XP_002871509.1,NP_974769.1,XP_002309478.1,XP_002279687.1，NP_001146676.1,NP_001146295.1,NP_001049134.1,XP_002516116.1，XP_001766085.1,XP_001756522.1,XP_002969787.1,XP_002985119.1，XP_002948137.1,XP_001690839.1,NP_001057093.1,XP_002468410.1，NP_064587.1,XP_001089575.2,XP_001502234.1,XP_002502298.1，XP_526254.2,XP_535718.2,XP_002716659.1,NP_001033222.1，NP_001029298.1,NP_001016633.1,NP_001085409.1,XP_002758928.1，XP_003064056.1,NP_001135127.1,XP_001622809.1,NP_991174.2，XP_002594716.1,NP_075664.1,XP_001370849.1,NP_001090454.1，XP_002999170.1,XP_002917137.1,XP_002741281.1,XP_002131764.1，NP_594154.1,XP_001742101.1,XP_416604.2,XP_002194275.1，XP_001599587.1,XP_002410555.1,XP_003035898.1,XP_002183613.1，XP_001875493.1,XP_002112209.1,XP_636983.1,XP_002158547.1，XP_002839272.1,XP_307722.3,XP_001819629.1,XP_001268376.1，ZP_08115581.1,YP_001320997.1,XP_369268.1,XP_002626458.1,XP_751200.1，XP_001657673.1,XP_002173486.1,XP_001212538.1,XP_001258462.1，XP_002434512.1,XP_960906.1,XP_002847679.1,XP_967861.1，XP_002426154.1,XP_003176259.1,XP_500602.1,XP_001428419.1，XP_003014235.1,XP_001393123.1,ZP_03608460.1,XP_002147261.1，ZP_03293831.1,XP_002290043.1,XP_003065597.1,XP_001588734.1，YP_001273073.1,XP_001552800.1,XP_446414.1,XP_002792830.1，XP_001998501.1,YP_003780301.1,NP_013455.1,XP_002404736.1，YP_001086961.1,ZP_05328587.1,ZP_05399936.1,YP_001113615.1，XP_001247884.1,XP_390426.1,XP_003025334.1,XP_002052999.1，YP_769862.1,ZP_07325748.1,ZP_05349666.1,YP_471237.1,YP_002977603.1，YP_001202760.1,ZP_07592670.1,和NP_386723.1。
3.如权利要求1所述的转基因植物，其特征在于，所述ω酰胺酶转基因整合到所述植物的基因组中。
4.如权利要求1所述的转基因植物，其特征在于，所述根优先性启动子选自RolD启动子、RolD-2启动子、富甘氨酸蛋白启动子、GRP启动子、ADH启动子、玉米ADH1启动子、PHT启动子、Pht1基因家族启动子、金属摄取蛋白启动子、玉米金属硫蛋白蛋白启动子、35S CaMV结构域A启动子、pDJ3S启动子、SIREO启动子、pMel启动子、Sad1启动子、Sad2启动子、TobRB7启动子、RCc3启动子、FaRB7启动子、SPmads启动子、IDS2启动子、pyk10启动子、Lbc3豆血红蛋白启动子、PEPC启动子、Gns1葡聚糖酶根启动子、35S2启动子、GI4启动子、GI5启动子和GRP启动子。
5.如权利要求1所述的转基因植物，其特征在于，所述叶组织中内源性ω酰胺酶表达被抑制。
6.如权利要求5所述的转基因植物，其特征在于，所述叶组织中内源性ω酰胺酶表达通过隐性基因破坏、显性基因沉默或化学抑制剂来抑制。
7.如权利要求5所述的转基因植物，其特征在于，所述叶组织中内源性ω酰胺酶表达通过隐性基因破坏来抑制，所述隐性基因破坏选自消除内源性ω酰胺酶表达的突变ω酰胺酶基因、内源性ω酰胺酶敲除突变体和内源性ω酰胺酶敲减突变体。
8.如权利要求5所述的转基因植物，其特征在于，所述叶组织中内源性ω酰胺酶表达通过对内源性ω酰胺酶基因特异的RNAi反义寡核苷酸来抑制。
9.如权利要求5所述的转基因植物，其特征在于，所述叶组织中内源性ω酰胺酶的表达通过化学抑制剂来抑制，所述化学抑制剂选自6-重氮-5-氧代-正亮氨酸、p-羟基苯甲酸汞、二异丙基氟磷酸盐、氰化钠、苯基乙酸汞化物、碘乙酸盐（lodoacetate）、硝酸银、苯磺酸氯汞、和硫酸铜。
10.如权利要求1所述的转基因植物，其特征在于，所述ω酰胺酶转基因的根优先性表达使得2-氧代缩环戊酸单酰胺的叶-根比率相对于不含ω酰胺酶转基因的相同种植物增加。
11.如权利要求10所述的转基因植物，其特征在于，所述2-氧代缩环戊酸单酰胺（2-oxoglutaramate）的叶-根比率高于不含ω酰胺酶转基因的相同种植物的至少2倍。
12.如权利要求1所述的转基因植物，其特征在于，所述转基因植物还包含GPT转基因。
13.如权利要求12所述的转基因植物，其特征在于，所述GPT转基因是由SEQ ID NO:1编码的GPT/F:L突变。
14.如权利要求1所述的转基因植物，其特征在于，所述转基因植物还包含GPT转基因和GS转基因。
15.如权利要求14所述的转基因植物，其特征在于，所述GPT转基因和GS转基因各自与叶优先性启动子操作性相连。
16.如权利要求1、12或14中任一项所述的转基因植物，其特征在于，所述各转基因为中所述植物中表达进行了密码子优化。
17.如权利要求1所述的转基因植物，其特征在于，所述内源性GPT的表达通过基因激活来增加。
18.如权利要求1所述的转基因植物，其特征在于，所述内源性GS的表达通过基因激活来增加。
19.如权利要求1所述的转基因植物，其特征在于，所述转基因植物的氮利用效率提高。
20.如权利要求1所述的转基因植物，其特征在于，所述转基因植物选自小麦、燕麦、水稻、玉米、豆、大豆、烟草、紫花苜蓿、拟南芥、草、水果、蔬菜、有花植物和树。
21.如权利要求1-20中任一项所述的转基因植物的任何世代的后代。
22.如权利要求1-21中任一项所述的转基因植物的任何世代的种子。
23.一种叶组织中内源性ω酰胺酶表达被抑制的转基因植物。
24.如权利要求23所述的转基因植物，其特征在于，所述叶组织中内源性ω酰胺酶表达通过隐性基因破坏、显性基因沉默或化学抑制剂来抑制。
25.如权利要求23所述的转基因植物，其特征在于，所述叶组织中内源性ω酰胺酶表达通过隐性基因破坏来抑制，所述隐性基因破坏选自消除内源性ω酰胺酶表达的突变ω酰胺酶基因、内源性ω酰胺酶敲除突变体和内源性ω酰胺酶敲减突变体。
26.如权利要求23所述的转基因植物，其特征在于，所述叶组织中内源性ω酰胺酶表达通过对内源性ω酰胺酶基因特异的RNAi反义寡核苷酸来抑制。
27.如权利要求23所述的转基因植物，其特征在于，所述叶组织中内源性ω酰胺酶的表达通过化学抑制剂来抑制，所述化学抑制剂选自6-重氮-5-氧代-正亮氨酸、p-羟基苯甲酸汞、二异丙基氟磷酸盐、氰化钠、苯基乙酸汞化物、碘乙酸盐（lodoacetate）、硝酸银、苯磺酸氯汞、和硫酸铜。
28.如权利要求23所述的转基因植物，其特征在于，所述转基因植物还包含ω酰胺酶转基因，其中所述ω酰胺酶转基因与根优先性启动子操作性相连。
29.如权利要求23所述的转基因植物，其特征在于，所述叶组织中抑制内源性ω酰胺酶表达造成相对于不含叶组织中抑制内源性ω酰胺酶表达的相同种植物，2-氧代缩环戊酸单酰胺的叶-根比率增加。
30.如权利要求29所述的转基因植物，其特征在于，所述2-氧代缩环戊酸单酰胺的叶-根比率高于不含叶组织中抑制内源性ω酰胺酶转基因的相同种植物的至少2倍。
31.如权利要求23所述的转基因植物，其特征在于，所述转基因植物还包含GPT基因。
32.如权利要求31所述的转基因植物，其特征在于，所述GPT转基因是由SEQ ID NO:1编码的GPT/F:L突变。
33.如权利要求23所述的转基因植物，其特征在于，所述转基因植物还包含GPT基因和GS转基因。
34.如权利要求33所述的转基因植物，其特征在于，所述GPT转基因和GS转基因各自与叶优先性启动子操作性连接。
35.如权利要求23、31或33中任一项所述的转基因植物，其特征在于，所述每个转基因是对所述植物中表达进行了密码子优化。
36.如权利要求23所述的转基因植物，其特征在于，所述内源性GPT的表达通过基因激活来增加。
37.如权利要求23所述的转基因植物，其特征在于，所述内源性GS的表达通过基因激活来增加。
38.如权利要求23所述的转基因植物，其特征在于，所述转基因植物的氮利用效率提高。
39.如权利要求23所述的转基因植物，其特征在于，所述转基因植物选自小麦、燕麦、水稻、玉米、豆、大豆、烟草、紫花苜蓿、拟南芥、草、水果、蔬菜、有花植物和树。
40.如权利要求23–39中任一项所述的转基因植物的任何世代的后代。
41.如权利要求23–40中任一项所述的转基因植物的任何世代的种子。
42.一种使植物的氮利用效率相对于相同种的野生型或未转化植物提高的方法，所述方法包含：
(a)向所述植物引入ω酰胺酶转基因，其中，所述ω酰胺酶转基因可操作连接到根优先性启动子；
(b)在所述植物或所述植物后代的根组织中表达所述ω酰胺酶转基因；和
(c)选择2-氧代缩环戊酸单酰胺叶-根比率相对于不含ω酰胺酶转基因的相同种植物增加的植物，
其中，所述增加的2-氧代缩环戊酸单酰胺叶-根比率使得氮利用效率提高。
43.如权利要求42所述的方法，其特征在于，所述ω酰胺酶转基因编码的多肽有与选自下组多肽所编码氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列：
AAL91613.1,ACN30911.1,ABK22312.1,ACJ85250.1,AAQ97821.1,CBJ25483.1,EFN54567.1,NP_196765.2，XP_002871509.1,NP_974769.1,XP_002309478.1,XP_002279687.1，NP_001146676.1,NP_001146295.1,NP_001049134.1,XP_002516116.1，XP_001766085.1,XP_001756522.1,XP_002969787.1,XP_002985119.1，XP_002948137.1,XP_001690839.1,NP_001057093.1,XP_002468410.1，NP_064587.1,XP_001089575.2,XP_001502234.1,XP_002502298.1，XP_526254.2,XP_535718.2,XP_002716659.1,NP_001033222.1，NP_001029298.1,NP_001016633.1,NP_001085409.1,XP_002758928.1，XP_003064056.1,NP_001135127.1,XP_001622809.1,NP_991174.2，XP_002594716.1,NP_075664.1,XP_001370849.1,NP_001090454.1，XP_002999170.1,XP_002917137.1,XP_002741281.1,XP_002131764.1，NP_594154.1,XP_001742101.1,XP_416604.2,XP_002194275.1，XP_001599587.1,XP_002410555.1,XP_003035898.1,XP_002183613.1，XP_001875493.1,XP_002112209.1,XP_636983.1,XP_002158547.1，XP_002839272.1,XP_307722.3,XP_001819629.1,XP_001268376.1，ZP_08115581.1,YP_001320997.1,XP_369268.1,XP_002626458.1,XP_751200.1，XP_001657673.1,XP_002173486.1,XP_001212538.1,XP_001258462.1，XP_002434512.1,XP_960906.1,XP_002847679.1,XP_967861.1，XP_002426154.1,XP_003176259.1,XP_500602.1,XP_001428419.1，XP_003014235.1,XP_001393123.1,ZP_03608460.1,XP_002147261.1，ZP_03293831.1,XP_002290043.1,XP_003065597.1,XP_001588734.1，YP_001273073.1,XP_001552800.1,XP_446414.1,XP_002792830.1，XP_001998501.1,YP_003780301.1,NP_013455.1,XP_002404736.1，YP_001086961.1,ZP_05328587.1,ZP_05399936.1,YP_001113615.1，XP_001247884.1,XP_390426.1,XP_003025334.1,XP_002052999.1，YP_769862.1,ZP_07325748.1,ZP_05349666.1,YP_471237.1,YP_002977603.1，YP_001202760.1,ZP_07592670.1,和NP_386723.1。
44.如权利要求42所述的方法，其特征在于，所述ω酰胺酶转基因整合到所述植物的基因组中。
45.如权利要求42所述的方法，其特征在于，所述根优先性启动子选自RolD启动子、RolD-2启动子、富甘氨酸蛋白启动子、GRP启动子、ADH启动子、玉米ADH1启动子、PHT启动子、Pht1基因家族启动子、金属摄取蛋白启动子、玉米金属硫蛋白蛋白启动子、35S CaMV结构域A启动子、pDJ3S启动子、SIREO启动子、pMel启动子、Sad1启动子、Sad2启动子、TobRB7启动子、RCc3启动子、FaRB7启动子、SPmads启动子、IDS2启动子、pyk10启动子、Lbc3豆血红蛋白启动子、PEPC启动子、Gns1葡聚糖酶根启动子、35S2启动子、GI4启动子、GI5启动子和GRP启动子。
46.如权利要求42所述的方法，其特征在于，所述叶组织中内源性ω酰胺酶表达被抑制。
47.如权利要求46所述的方法，其特征在于，所述叶组织中内源性ω酰胺酶表达通过隐性基因破坏、显性基因沉默或化学抑制剂来抑制。
48.如权利要求46所述的方法，其特征在于，所述叶组织中内源性ω酰胺酶表达通过隐性基因破坏来抑制，所述隐性基因破坏选自消除内源性ω酰胺酶表达的突变ω酰胺酶基因、内源性ω酰胺酶敲除突变体和内源性ω酰胺酶敲减突变体。
49.如权利要求46所述的方法，其特征在于，所述叶组织中内源性ω酰胺酶表达通过对内源性ω酰胺酶基因特异的RNAi反义寡核苷酸来抑制。
50.如权利要求46所述的方法，其特征在于，所述叶组织中内源性ω酰胺酶的表达通过化学抑制剂来抑制，所述化学抑制剂选自6-重氮-5-氧代-正亮氨酸、p-羟基苯甲酸汞、二异丙基氟磷酸盐、氰化钠、苯基乙酸汞化物、碘乙酸盐（lodoacetate）、硝酸银、苯磺酸氯汞、和硫酸铜。
51.如权利要求42所述的方法，其特征在于，所述2-氧代缩环戊酸单酰胺的叶-根比率高于相同种的祖先植物或野生型植物的至少2倍。
52.如权利要求42所述的方法，其特征在于，所述植物还包含GPT转基因。
53.如权利要求52所述的方法，其特征在于，所述GPT转基因是由SEQID NO:1编码的GPT/F:L突变。
54.如权利要求42所述的方法，其特征在于，所述植物还包含GPT转基因和GS转基因。
55.如权利要求54所述的方法，其特征在于，所述GPT转基因和GS转基因各自可操作连接到叶优先性启动子。
56.如权利要求42所述的方法，其特征在于，所述植物中内源性GPT的表达通过基因激活来增加。
57.如权利要求42所述的方法，其特征在于，所述植物中内源性GS的表达通过基因激活来增加。
58.如权利要求42、52或54中任一项所述的方法，其特征在于，所述每个转基因是对所述植物中表达进行了密码子优化。
59.一种使植物的氮利用效率相对于相同种的野生型或未转化植物提高的方法，所述方法包含：
(a)抑制所述植物的叶组织中内源性ω酰胺酶表达；和
(b)相对于不含抑制叶组织中内源性ω酰胺酶表达的相同种植物，选择2-氧代缩环戊酸单酰胺叶-根比率增加的植物，
其中，所述增加的2-氧代缩环戊酸单酰胺叶-根比率使得氮利用效率提高。
60.如权利要求59所述的方法，其特征在于，所述叶组织中内源性ω酰胺酶表达通过隐性基因破坏、显性基因沉默或化学抑制剂来抑制。
61.如权利要求59所述的方法，其特征在于，所述叶组织中内源性ω酰胺酶表达通过隐性基因破坏来抑制，所述隐性基因破坏选自消除内源性ω酰胺酶表达的突变ω酰胺酶基因、内源性ω酰胺酶敲除突变体和内源性ω酰胺酶敲减突变体。
62.如权利要求59所述的方法，其特征在于，所述叶组织中内源性ω酰胺酶表达通过对内源性ω酰胺酶基因特异的RNAi反义寡核苷酸来抑制。
63.如权利要求59所述的方法，其特征在于，所述化学抑制剂选自6-重氮-5-氧代-正亮氨酸、p-羟基苯甲酸汞、二异丙基氟磷酸盐、氰化钠、苯基乙酸汞化物、碘乙酸盐（lodoacetate）、硝酸银、苯磺酸氯汞、和硫酸铜。
64.如权利要求59所述的方法，其特征在于，所述植物还包含ω酰胺酶转基因，其中所述ω酰胺酶转基因可操作连接到根优先性启动子。
65.如权利要求59所述的方法，其特征在于，所述2-氧代缩环戊酸单酰胺的叶-根比率高于相同种的祖先植物或野生型植物的至少2倍。
66.如权利要求59所述的方法，其特征在于，所述植物还包含GPT转基因。
67.如权利要求66所述的方法，其特征在于，所述GPT转基因是由SEQID NO:1编码的GPT/F:L突变。
68.如权利要求59所述的方法，其特征在于，所述植物还包含GPT转基因和GS转基因。
69.如权利要求68所述的方法，其特征在于，所述GPT转基因和GS转基因各自可操作连接到叶优先性启动子。
70.如权利要求59所述的方法，其特征在于，所述植物中内源性GPT的表达通过基因激活来增加。
71.如权利要求59所述的方法，其特征在于，所述植物中内源性GS的表达通过基因激活来增加。
72.如权利要求59、66或68中任一项所述的方法，其特征在于，所述每个转基因是对所述植物中表达进行了密码子优化。
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