ES2627487T3 - Aumento del crecimiento de las plantas mediante modulación de la expresión de la amidasa omega en las plantas - Google Patents

Abstract

Una planta transgénica que comprende un transgén de la amidasa w, en la que el transgén de la amidasa w está unido operativamente a un promotor de preferencia radicular.

Description

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DESCRIPCIÓN

Aumento del crecimiento de las plantas mediante modulación de la expresión de la amidasa omega en las plantas

5 Según aumenta la población humana en todo el mundo, y según continúan siendo destruidas o comprometidas de otro modo las tierras de cultivo, la necesidad de sistemas de agricultura más eficaces y sostenibles es de un interés primordial para la raza humana. La mejora en el rendimiento de los cultivos, el contenido de proteínas y la velocidad de crecimiento de las plantas representa los principales objetivos en el desarrollo de sistemas de agricultura que puedan responder de forma más eficaz a los retos presentados.

En los últimos años, la importancia de las tecnologías mejoradas de producción de cosechas sólo ha aumentado según muchos cultivos bien desarrollados tendían a estancarse. Muchas actividades agrícolas dependen del tiempo, dependiendo el coste y las ganancias del rápido recambio de los cultivos o del tiempo hasta su comercialización. Por lo tanto, un crecimiento vegetal rápido es un objetivo económicamente importante para muchos negocios agrícolas

15 que implican cultivos de alto valor tales como granos, hortalizas, bayas y otras frutas.

La ingeniería genética ha jugado y continúa jugando un papel cada vez más importante aunque controvertido en el desarrollo de tecnologías agrícolas sostenibles. En los últimos años se han desarrollado una gran cantidad de plantas modificadas genéticamente y de tecnologías relacionadas, muchas de las cuales son de amplio uso hoy en día (Factsheet: Genetically Modified Crops in the United States, Pew Initiative on Food and Biotechnology, agosto de 2004, http://pewagbiotech.org/resoures/factsheets). La adopción de variedades de plantas transgénicas es ahora muy sustancial y está en aumento, con aproximadamente 250 millones de acres plantados con plantas transgénicas en 2006.

25 Mientras que gradualmente puede estar aumentando la aceptación de las tecnologías de plantas transgénicas, particularmente en los Estados Unidos, Canadá y Australia, muchas regiones del mundo siguen siendo lentas a la hora de adoptar plantas modificadas genéticamente en la agricultura, particularmente Europa. Por lo tanto, en consonancia con la persecución de los objetivos de una agricultura responsable y sostenible, existe un fuerte interés en el desarrollo de plantas modificadas genéticamente que no introduzcan toxinas ni otras sustancias potencialmente problemáticas en las plantas y/o en el medio ambiente. También hay un fuerte interés en minimizar el coste para conseguir los objetivos, tales como mejorar la tolerancia a los herbicidas, a las plagas y la resistencia a las enfermedades, y los rendimientos globales de los cultivos. Consecuentemente, sigue habiendo una necesidad de plantas transgénicas que puedan cumplir estos objetivos.

35 El objetivo de un rápido crecimiento vegetal ha sido perseguido a través de numerosos estudios de diversos sistemas reguladores vegetales, muchos de los cuales aún no son completamente comprendidos. En particular, los sistemas reguladores vegetales que coordinan el metabolismo del carbono y del nitrógeno no se han esclarecido completamente. Se cree que estos mecanismos reguladores tienen un impacto fundamental sobre el crecimiento y el desarrollo de la planta.

El metabolismo del carbono y del nitrógeno en los organismos fotosintéticos debe ser regulado de una forma coordinada para asegurar un uso eficiente de los recursos y la energía de la planta. La comprensión actual del metabolismo del carbono y de nitrógeno incluye detalles sobre ciertas etapas y rutas metabólicas que son subsistemas de unos sistemas mayores. En los organismos fotosintéticos, el metabolismo del carbono comienza con

45 la fijación de CO2, que se produce a través de dos procesos principales, denominado metabolismo C-3 y C-4. En las plantas con un metabolismo C-3, la enzima carboxilasa de bisfosfato de ribulosa (RuBisCo) cataliza la combinación de CO2 con bisfosfato de ribulosa para producir 3-fosfoglicerato, un compuesto de tres carbonos (C-3) que la planta utiliza para la síntesis de los compuestos que contienen carbono. En las plantas con un metabolismo C-4, el CO2 se combina con fosfoenol piruvato para formar ácidos que contienen cuatro carbonos (C-4), en una reacción catalizada por la enzima carboxilasa de fosfoenol piruvato. Después, los ácidos son transferidos a las células de la vaina fascicular, donde son descarboxilados para liberar CO2, que después se combina con el bisfosfato de ribulosa en la misma reacción empleada por las plantas C-3.

Numerosos estudios han averiguado que hay diversos metabolitos importantes en la regulación vegetal del

55 metabolismo del nitrógeno. Estos compuestos incluyen el ácido orgánico malato y los aminoácidos glutamato y glutamina. El nitrógeno es asimilado por los organismos fotosintéticos a través de la acción de la enzima sintetasa de glutamina (GS) que cataliza la combinación de amoníaco con glutamato para formar glutamina. La GS juega un papel clave en la asimilación del nitrógeno en las plantas al catalizar la adición de amonio al glutamato para formar glutamina en una reacción dependiente de ATP (Miflin y Habash, 2002, Journal of Experimental Botany, Vol. 53, nº 370, páginas 979-987). La GS también reasimila el amoníaco liberado como resultado de la fotorrespiración y la descomposición de las proteínas y de los compuestos de transporte del nitrógeno. Las enzimas GS pueden ser divididas en dos clases generales, representando una la forma citoplasmática (GS1) y representando la otra la forma plastídica (es decir, cloroplástica) (GS2).

65 Un trabajo previo ha demostrado que el aumento en los niveles de expresión de la GS1 da como resultado un aumento en los niveles de actividad de la GS y del crecimiento vegetal, aunque los informes son incoherentes. Por

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ejemplo, Fuentes et al. notificaron que la sobreexpresión de Alfalfa GS1 guiada por el promotor CaMV S35 (la forma citoplasmática) en el tabaco daba como resultado un aumento en los niveles de expresión de la GS y en la actividad de la GS en el tejido foliar, un aumento en el crecimiento en unas condiciones de agotamiento de nitrógeno, pero ningún efecto sobre el crecimiento en unas condiciones de fertilización óptimas de nitrógeno (Fuentes et al., 2001, J. 5 Exp. Botany 52: 1071-81). Temple et al. notificaron que las plantas de tabaco transgénicas que sobreexpresan la secuencia codificante completa de Alfalfa GS1 contenían unos mayores niveles del transcrito GS, y del polipéptido GS que se ensambla en una enzima activa, pero no notificaron los efectos genotípicos sobre el crecimiento (Temple et al., 1993, Molecular and General Genetics 236: 315-325). Corruzi et al. han notificado que las plantas de tabaco transgénicas que sobreexpresan un transgén citosólico de la GS1 de guisante bajo el control del promotor CaMV S35 muestran un aumento en la actividad de la GS, un aumento en la proteína citosólica de la GS y una mejora en las características de crecimiento (Patente de EE.UU. nº 6.107.547). Unkefer et al. han notificado más recientemente que se había averiguado que las plantas transgénicas de tabaco que sobreexpresan la Alfalfa GS1 en tejidos foliares, que habían sido cribadas para un aumento en la actividad de la GS entre la hoja y la raíz tras una segregación genética mediante autofecundación para conseguir un aumento en el número de copias del transgén

15 GS1, producían un aumento en los niveles de 2-hidroxi-5-oxoprolina en sus porciones foliares, lo que se averiguó que daba lugar a un notable aumento en la velocidad crecimiento con respecto a las plantas de tabaco silvestres (véanse las Patentes de EE.UU. nº 6.555.500; 6.593.275; y 6.831.040).

Unkefer et al. han descrito adicionalmente el uso de la 2-hidroxi-5-oxoprolina (también conocida como 2oxoglutaramato) para mejorar el crecimiento vegetal (Patentes de EE.UU. nº 6.555.500; 6.593.275; 6.831.040). En particular, Unkefer et al. divulgan que un aumento en las concentraciones de la 2-hidroxi-5-oxoprolina en los tejidos foliares (con respecto a los tejidos radiculares) desencadena una cascada de acontecimientos que dan como resultado un aumento en las características de crecimiento de la planta. Unkefer et al. describen métodos mediante los cuales la concentración foliar de la 2-hidroxi-5-oxoprolina puede aumentarse con objeto de desencadenar un

25 aumento en las características de crecimiento de la planta, específicamente, mediante la aplicación de una solución de 2-hidroxi-5-oxoprolina directamente en las porciones foliares de la planta y sobreexpresando la sintetasa de glutamina preferentemente en los tejidos foliares.

Sumario de la invención

La presente divulgación se basa en el sorprendente descubrimiento de que el aumento en la expresión de la amidasa ω (amidasa omega) en los tejidos radiculares de una planta da como resultado un aumento en la proporción entre las hojas y las raíces de la planta del metabolito de señalización 2-oxoglutaramato y de las moléculas de prolina relacionadas. Adicionalmente, un aumento en la expresión de la amidasa ω en los tejidos radiculares de una

35 planta da como resultado una disminución en la expresión de la amidasa ω en el tejido foliar. Ventajosamente, la modulación de la expresión de la amidasa ω en las plantas da como resultado plantas con un aumento en la eficacia de uso del nitrógeno, que a su vez da como resultado una mejora en el crecimiento y en otras características agronómicas, incluyendo unas velocidades de crecimiento más rápidas, unos mayores rendimientos de las semillas y de las frutas/vainas, una floración más temprana y productiva, un aumento en la tolerancia a unas elevadas condiciones salinas y un aumento en los rendimientos de biomasa.

En consecuencia, un aspecto de la presente divulgación se refiere a una planta transgénica que contiene un transgén de la amidasa ω, en la que el transgén de la amidasa ω está unido operativamente a un promotor de preferencia radicular.

45 Otro aspecto de la presente divulgación proporciona una planta transgénica que tiene inhibida la expresión de una amidasa ω endógena en el tejido foliar.

Otro aspecto más de la presente divulgación se refiere a un método para aumentar la eficacia de uso del nitrógeno de una planta con respecto a una planta de tipo silvestre o sin transformar de la misma especie, mediante: (a) la introducción de un transgén de la amidasa ω en la planta, en la que el transgén de la amidasa ω está unido operativamente a un promotor de preferencia radicular; (b) la expresión del transgén de la amidasa ω en el tejido radicular de la planta o de la descendencia de la planta; y (c) la selección de una planta que tiene un aumento en la proporción entre las hojas y las raíces de 2-oxoglutaramato con respecto a una planta de la misma especie que no

55 contiene un transgén de la amidasa ω, en el que el aumento en la proporción entre las hojas y las raíces del 2oxoglutaramato da como resultado un aumento en la eficacia de uso del nitrógeno.

Otro aspecto más de la presente divulgación se refiere a un método para el aumento en la eficacia de uso del nitrógeno de una planta con respecto a una planta de tipo silvestre o sin transformar de la misma especie, mediante:

(a) la inhibición de la expresión de la amidasa ω endógena en el tejido foliar de la planta; y (b) la selección de una planta que tiene un aumento en la proporción entre las hojas y las raíces del 2-oxoglutaramato con respecto a una planta de la misma especie que no tiene inhibida la expresión de la amidasa ω endógena en el tejido foliar, en el que el aumento en la proporción entre las hojas y las raíces del 2-oxoglutaramato da como resultado un aumento en la eficacia de uso del nitrógeno

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Breve descripción de los dibujos

La FIG. 1 representa un esquema de una ruta metabólica de asimilación del nitrógeno y de biosíntesis del 2oxoglutaramato.

5 La FIG. 2 representa las alineaciones en las secuencias de aminoácidos de una amidasa ω de Arabidopsis thaliana (SEQ ID NO: 3) con otras presuntas amidasas ω de la planta (las SEQ ID NO: 13, 10, 6, 4, 8, 5 y 7, respectivamente). Péptido de consenso = SEQ ID NO: 44.

10 La FIG. 3 representa las alineaciones en las secuencias de aminoácidos de una amidasa ω de Arabidopsis thaliana (SEQ ID NO: 3) con otras presuntas amidasas ω de la planta (las SEQ ID NO: 38, 34, 59, 36 y 35, respectivamente). Péptido de consenso = SEQ ID NO: 45.

La FIG. 4 representa gráficamente una representación de los valores del peso en fresco de la planta 15 representados frente a la concentración 2-oxoglutaramato.

La FIG. 5 representa una fotografía que compara la amidasa ω en plantas de alfalfa transgénicas y de control.

Descripción detallada de la invención

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Definiciones:

Salvo que se definan de otro modo, todos los términos de la técnica, notaciones y otra terminología científica usada en el presente documento pretenden tener los significados comprendidos habitualmente por los expertos en la 25 materia a la que pertenece esta invención. En algunos casos, en el presente documento se definen unos términos con unos significados comprendidos habitualmente por claridad y/o como referencia rápida, y no debería interpretarse que la inclusión de dichas definiciones en el presente documento representa necesariamente una diferencia sustancial con respecto a lo que se comprende de forma general en la materia. Las técnicas y los procedimientos descritos o referenciados en el presente documento son generalmente bien comprendidos y 30 empleados de forma habitual mediante el uso de la metodología convencional por parte de los expertos en la materia, tal como, por ejemplo, las ampliamente utilizadas metodologías de clonación molecular descritas en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3ª edición (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.; Current Protocols in Molecular Biology (Ausbel et al., eds., John Wiley & Sons, Inc. 2001; Transgenic Plants: Methods and Protocols (Leandro Pena, ed., Humana Press, 1ª edición, 2004); y, Agrobacterium

35 Protocols (Wan, ed., Humana Press, 2ª edición, 2006). Según sea apropiado, generalmente se llevan a cabo procedimientos que implican el uso de los kits y reactivos disponibles comercialmente según los protocolos y/o los parámetros definidos por el fabricante, salvo que se indique de otro modo.

Cada documento, referencia, solicitud de patente o patente citada en este texto está incorporada expresamente al

40 presente documento en su totalidad como referencia, y cada uno debería leerse y considerarse como parte de esta memoria descriptiva. El hecho de que el documento, la referencia, la solicitud de patente o la patente citada en esta memoria descriptiva no se repita en el presente documento es simplemente por concisión.

El término "ácido nucleico" se refiere a desoxirribonucleótidos o a ribonucleótidos y a los polímeros de los mismos

45 ("polinucleótidos") tanto en una forma mono-como bicatenaria. Salvo que esté específicamente limitado, el término "polinucleótido" engloba los ácidos nucleicos que contienen los análogos conocidos de los nucleótidos naturales que tienen unas propiedades de unión similares a las del ácido nucleico de referencia, y que son metabolizados de una forma similar a los nucleótidos naturales. Salvo que se indique de otro modo, una secuencia de ácidos nucleicos en particular también engloba implícitamente las variantes modificadas conservativamente de las mismas (por ejemplo,

50 sustituciones de codones degenerados) y las secuencias complementarias, así como la secuencia indicada explícitamente. Específicamente, las sustituciones de codones degenerados pueden conseguirse mediante la generación de secuencias en las que la tercera posición de uno o más de los codones seleccionados (o de todos) está sustituida con residuos de base mixta y/o de desoxiinosina (Batzer et al., 1991, Nucleic Acid Res. 19: 5081; Ohtsuka et al., 1985 J. Biol. Chem. 260: 2605-2608; y Cassol et al., 1992; Rossolini et al., 1994, Mol. Cell. Probes 8:

55 91-98). El término ácido nucleico se usa de forma intercambiable con gen, ADNc y ARNm codificado por un gen.

El término "promotor" se refiere a una secuencia o secuencias de control de ácidos nucleicos que dirigen la transcripción de un ácido nucleico unido operativamente. Según se usa en el presente documento, un "promotor vegetal" es un promotor que funciona en las plantas. Algunos promotores incluyen las secuencias necesarias de 60 ácidos nucleicos próximas al sitio de inicio de la transcripción, tal como, en el caso de un promotor de tipo polimerasa II, un elemento TATA. Según se usa en el presente documento, un promotor puede incluir la secuencia de nucleótidos completa, o puede incluir únicamente el dominio del núcleo o la secuencia que dirige la transcripción del ácido nucleico unido operativamente. Un promotor también incluye opcionalmente elementos potenciadores o represores distales, que pueden estar ubicados tan lejos como a varios miles de pares de bases del sitio de inicio de 65 la transcripción. Un promotor "constitutivo" es un promotor que es activo en la mayoría de las condiciones

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medioambientales y de desarrollo. Un promotor "inducible" es un promotor que es activo en una regulación medioambiental o de desarrollo. El término "unido operativamente" se refiere a una unión funcional entre la secuencia de control de la expresión de un ácido nucleico (tal como un promotor, o una matriz de sitios de unión de un factor de transcripción) y una segunda secuencia de ácidos nucleicos, en la que la secuencia de control de la

5 expresión dirige la transcripción del ácido nucleico correspondiente a la segunda secuencia.

Los términos "polipéptido," "péptido" y "proteína" se usan de forma intercambiable en el presente documento para referirse a un polímero de residuos de aminoácidos. Los términos se aplican a polímeros de aminoácidos en los que uno o más residuos de aminoácidos es un mimético químico artificial de un correspondiente aminoácido natural, así como de los correspondientes polímeros de aminoácidos naturales y polímeros de aminoácidos no naturales.

El término "aminoácido" se refiere a los aminoácidos naturales y sintéticos, así como a los análogos de aminoácidos y a los miméticos de aminoácidos que funcionan de una forma similar a los aminoácidos naturales. Los aminoácidos naturales son aquellos codificados por el código genético, así como aquellos aminoácidos que son modificados

15 posteriormente, por ejemplo, hidroxiprolina, γ-carboxiglutamato y O-fosfoserina. Los análogos de aminoácidos se refieren a compuestos que tienen la misma estructura química básica que un aminoácido natural, es decir, un carbono que está unido a un hidrógeno, un grupo carboxilo, un grupo amino y un grupo R, por ejemplo, homoserina, norleucina, metionina sulfóxido, metionina metilsulfonio. Dichos análogos tienen grupos R modificados (por ejemplo, norleucina) o esqueletos peptídicos modificados, pero conservan la misma estructura química básica que el aminoácido natural. Los miméticos de aminoácidos se refieren a compuestos químicos que tienen una estructura que es diferente de la estructura química general de un aminoácido, pero que funciona de una forma similar a un aminoácido natural.

En el presente documento puede hacerse referencia a los aminoácidos por sus habitualmente conocidos símbolos

25 de tres letras o por los símbolos de una letra recomendados por la IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission. Asimismo, puede hacerse referencia a los nucleótidos por sus códigos de una letra habitualmente aceptados.

El término "planta" incluye plantas completas, órganos de plantas (por ejemplo, hojas, tallos, flores, raíces, órganos reproductores, embriones y partes de los mismos, etc.), plántulas, semillas y células vegetales, y la descendencia de las mismas. Las clases de plantas que pueden usarse en el método de la invención es generalmente tan amplia como la clase de las plantas superiores susceptible de técnicas de transformación, incluyendo angiospermas (plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas), así como gimnospermas. Incluye plantas con diversos niveles de ploidía, incluyendo poliploides, diploides, haploides y hemicigotas.

35 Los términos "polinucleótido GPT" y "ácido nucleico GPT" se usan de forma intercambiable en el presente documento, y se refieren a la secuencia de polinucleótidos de longitud completa o de longitud parcial de un gen que codifica para un polipéptido implicado en la catálisis de la síntesis del 2-oxoglutaramato, e incluye polinucleótidos que contienen tanto las secuencias traducidas (codificantes) como las no traducidas, así como los complementos de las mismas. El término "secuencia codificante GPT" se refiere a la parte del gen que es transcrita y que codifica una proteína GPT. El término "secuencia de direccionamiento" y "péptido de tránsito" se usan de forma intercambiable y se refieren a la parte amino terminal de una proteína que dirige la proteína a un compartimento subcelular de una célula, tal como un cloroplasto en una célula vegetal. Los polinucleótidos GPT se definen adicionalmente por su capacidad para hibridar en unas condiciones definidas con los polinucleótidos GPT divulgados específicamente en el

45 presente documento, o con los productos de la PCR derivados de los mismos.

Un "transgén GPT" es una molécula de un ácido nucleico que comprende un polinucleótido GPT que es exógeno a una planta transgénica, o embrión, órgano o semilla vegetal portador de la molécula de ácido nucleico, o que es exógeno a un ancestro de la planta, o un embrión, órgano o semilla vegetal del mismo, de una planta transgénica portadora del polinucleótido GPT. Un "transgén GPT" puede englobar un polinucleótido que codifica bien una proteína GPT de longitud completa o bien una proteína GPT truncada, incluyendo, pero no se limita a, una proteína GPT que carece del péptido de tránsito a los cloroplastos. Más particularmente, el transgén GPT exógeno será heterogéneo de cualquier secuencia de polinucleótidos GPT presente en la planta de tipo silvestre, o embrión, órgano o semilla vegetal en el que se inserte el transgén GPT. En este sentido, el alcance de la heterogeneidad

55 requerido sólo necesita ser una diferencia en un único nucleótido. Sin embargo, preferentemente, la heterogeneidad será del orden de una identidad entre las secuencias seleccionada entre las siguientes identidades: del 0,01 %, del 0,05 %, del 0,1 %,del 0,5 %,del 1 %, del 5 %,del 10 %, del 15 % ydel 20 %.

Los términos "polinucleótido GS" y "ácido nucleico GS" se usan de forma intercambiable en el presente documento, y se refieren a una secuencia de polinucleótidos de longitud completa o de longitud parcial de un gen que codifica una proteína sintetasa de glutamina, e incluye polinucleótidos que contienen tanto las secuencias traducidas (codificantes) como las no traducidas, así como los complementos de las mismas. El término "secuencia codificante GS" se refiere a la parte del gen que es transcrita y que codifica una proteína GS. Los términos "polinucleótido GS1" y "ácido nucleico GS1" se usan de forma intercambiable en el presente documento, y se refieren a una secuencia de 65 polinucleótidos de longitud completa o de longitud parcial de un gen que codifica una isoforma de la proteína sintetasa de glutamina 1, e incluye polinucleótidos que contienen tanto las secuencias traducidas (codificantes)

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como las no traducidas, así como los complementos de las mismas. El término "secuencia codificante GS1" se refiere a la parte del gen que es transcrita y que codifica una proteína GS1.

Un "transgén GS" es una molécula de ácido nucleico que comprende un polinucleótido GS que es exógeno a la

5 planta transgénica, o al embrión, órgano o semilla vegetal, portador de la molécula de ácido nucleico, o que es exógeno a un ancestro de la planta, o al embrión, órgano o semilla vegetal de la misma, de una planta transgénica portadora del polinucleótido GS. Un "transgén GS" puede englobar un polinucleótido que codifica bien una proteína GS de longitud completa o bien una proteína GS truncada, incluyendo, pero no se limita a, una proteína GS que carece de un péptido de tránsito. Un "transgén GS1" es una molécula de ácido nucleico que comprende un polinucleótido GS1 que es exógeno a la planta transgénica, o al embrión, órgano o semilla vegetal, portador de la molécula de ácido nucleico, o que es exógeno a un ancestro de la planta, o embrión, órgano o semilla vegetal del mismo, de una planta transgénica portador del polinucleótido GS1. Un "transgén GS1" puede englobar un polinucleótido que codifica bien una proteína GS de longitud completa o bien una proteína GS1 truncada, incluyendo, pero no se limita a, una proteína GS1 que carece de un péptido de tránsito. Más particularmente, el

15 transgén GS o GS1 exógeno será heterogéneo de cualquier secuencia de polinucleótidos GS o GS1 presente en la planta de tipo silvestre, o embrión, órgano o semilla vegetal en el que se inserta el transgén GS o GS1. En este sentido, el alcance de la heterogeneidad requerido sólo necesita ser una diferencia en un único nucleótido. Sin embargo, preferentemente la heterogeneidad será del orden de una identidad entre las secuencias seleccionada entre las siguientes identidades: del 0,01 %, del 0,05 %, del 0,1 %, del 0,5 %, del 1 %, del 5 %, del 10 %, del 15 % y del 20 %.

Los términos "polinucleótido de la amidasa ω (amidasa omega)" y "ácido nucleico de la amidasa ω" se usan de forma intercambiable en el presente documento, y se refieren a una secuencia de polinucleótidos de un gen que codifica un polipéptido implicado en la degradación enzimática del 2-oxoglutaramato, e incluye polinucleótidos que contienen

25 tanto las secuencias traducidas (codificantes) como las no traducidas, así como los complementos de las mismas. El término "secuencia codificante de la amidasa ω" se refiere a la parte del gen que es transcrita y que codifica una proteína de la amidasa ω. Los polinucleótidos de la amidasa ω se definen adicionalmente por su capacidad para hibridar en unas condiciones definidas para el polinucleótido de la amidasa ω divulgado específicamente en el presente documento, o para los productos de la PCR derivados del mismo.

Un "transgén de la amidasa ω" es una molécula de ácido nucleico que comprende un polinucleótido de la amidasa ω que es exógeno a la planta transgénica, o al embrión, órgano o semilla vegetal, portador de la molécula de ácido nucleico, o que es exógeno a un ancestro de la planta, o al embrión, órgano o semilla vegetal del mismo, de una planta transgénica portadora del polinucleótido de la amidasa ω. Una "amidasa ω" puede englobar un polinucleótido

35 que codifica bien una proteína amidasa ω de longitud completa o bien una proteína amidasa ω truncada, incluyendo, pero no se limita a, una proteína amidasa ω que carece del péptido de tránsito a los cloroplastos. Más particularmente, el transgén exógeno de la amidasa ω será heterogéneo de la secuencia de polinucleótidos de la amidasa ω presente en la planta de tipo silvestre, o embrión, órgano o semilla vegetal en la que se inserta el transgén de la amidasa ω. En este sentido, el alcance de la heterogeneidad requerido sólo necesita ser una diferencia en un único nucleótido. Sin embargo, preferentemente la heterogeneidad será del orden de una identidad entre las secuencias seleccionada entre las siguientes identidades: del 0,01 %, del 0,05 %, del 0,1 %, del 0,5 %, del 1 %, del 5%,del10 %,del 15% y del 20 %.

El término "variantes modificadas conservativamente" se aplica a secuencias tanto de aminoácidos como de ácidos

45 nucleicos. Con respecto a las secuencias de ácidos nucleicos en particular, las variantes modificadas conservativamente se refieren a aquellos ácidos nucleicos que codifican secuencias de aminoácidos idénticas o esencialmente idénticas, o cuando el ácido nucleico no codifica una secuencia de aminoácidos, a secuencias esencialmente idénticas. Debido a la degeneración del código genético, un gran número de ácidos nucleicos funcionalmente idénticos codifica cualquier proteína dada. Por ejemplo, todos los codones GCA, GCC, GCG y GCU codifican el aminoácido alanina. Por lo tanto, en cualquier posición en la que haya una alanina especificada por un codón, el codón puede ser alterado a cualquiera de los correspondientes codones descritos sin alterar el polipéptido codificado. Dichas variaciones en los ácidos nucleicos son "variaciones silenciosas", que son una especie de las variaciones modificadas conservativamente. Cada secuencia de ácidos nucleicos del presente documento que codifica un polipéptido también describe cualquier posible variación silenciosa del ácido nucleico. El experto

55 reconocerá que cada codón de un ácido nucleico (excepto AUG, que habitualmente es el único codón para la metionina, y TGG, que habitualmente es el único codón para el triptófano) puede ser modificado para producir una molécula funcionalmente idéntica. Consecuentemente, cada variación silenciosa de un ácido nucleico que codifica un polipéptido está implícita en cada secuencia descrita.

Con respecto a las secuencias de aminoácidos, el experto reconocerá que las sustituciones, deleciones o adiciones individuales a una secuencia de un ácido nucleico, de un péptido, de un polipéptido o de una proteína que altera, añade o deleciona un único aminoácido o un pequeño porcentaje de aminoácidos en la secuencia codificada es una "variante modificada conservativamente" en la que la alteración da como resultado la sustitución de un aminoácido por un aminoácido químicamente similar. Las tablas de sustituciones conservativas proporcionan aminoácidos con 65 unas funcionalidades similares que son bien conocidas en la materia. Dichas variantes modificadas

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conservativamente se suman, y no excluyen, las variantes polimórficas, los homólogos interespecie y los alelos de la invención.

Cada uno de los siguientes ocho grupos contiene aminoácidos que son sustituciones conservativas de uno por otro:

5 1) Alanina (A), Glicina (G); 2) Ácido aspártico (D), Ácido glutámico (E); 3) Asparragina (N), Glutamina (Q); 4) Arginina (R), Lisina (K); 5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V); 6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptófano (W); 7) Serina (S), Treonina (T); y 8) Cisteína (C), Metionina (M) (véase, por ejemplo, Creighton, Proteins (1984)).

Las estructuras macromoleculares, tales como las estructuras de los polipéptidos, pueden ser descritas en términos de diversos niveles de organización. Para un análisis general de esta realización véase, por ejemplo, Alberts et al., Molecular Biology of the Cell (3ª ed., 1994) y Cantor y Schimmel, Biophysical Chemistry Part I: The Conformation of Biological Macromolecules (1980). “Estructura primaria" se refiere a la secuencia de aminoácidos de un péptido en particular. “Estructura secundaria" se refiere a las estructuras tridimensionales ordenadas localmente del interior de un polipéptido. Estas estructuras se conocen habitualmente como dominios. Los dominios son porciones de un

15 polipéptido que forman una unidad compacta del polipéptido, y normalmente tienen entre 25 y aproximadamente 500 aminoácidos de longitud. Los dominios típicos están formados por secciones con una organización menor, tales como tramos de láminas β y hélices α. “Estructura terciaria" se refiere a la estructura tridimensional completa del monómero de un polipéptido. “Estructura cuaternaria" se refiere a la estructura tridimensional formada por la asociación no covalente de unidades terciarias independientes. Los términos anisotrópicos también se conocen como términos de energía.

El término "aislado" se refiere a un material que está sustancialmente o esencialmente exento de los componentes que normalmente acompañan al material según se encuentra en su estado nativo o natural. Sin embargo, el término "aislado" no pretende referirse a los componentes presentes en un gel electroforético o en otro medio de separación. 25 Un componente aislado está exento de dicho medio de separación en una forma lista para su uso en otra aplicación

o ya en uso en la nueva aplicación/medio. Un anticuerpo "aislado" es aquel que se ha identificado y separado y/o recuperado a partir de un componente de su entorno natural. Los componentes contaminantes de su entorno natural son materiales que interferirían con los usos diagnósticos o terapéuticos del anticuerpo, y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteicos o no proteicos. En las realizaciones preferidas, el anticuerpo estará purificado (1) hasta más del 95 % en peso del anticuerpo según se determina mediante el método de Lowry, y lo más preferentemente más del 99 % en peso, (2) hasta un grado suficiente como para obtener al menos 15 residuos de la secuencia de aminoácidos N-terminal o interna mediante el uso de un secuenciador de taza giratoria, o (3) hasta homogeneidad mediante una SDS-PAGE en unas condiciones reductoras o no reductoras mediante el uso de azul de Coomassie, preferentemente, una tinción con plata. El anticuerpo aislado incluye el anticuerpo in situ de las

35 células recombinantes, dado que al menos un componente del entorno natural del anticuerpo no estará presente. Sin embargo, habitualmente, el anticuerpo aislado será preparado mediante al menos una etapa de purificación.

El término "heterólogo", cuando se usa con referencia a porciones de un ácido nucleico, indica que el ácido nucleico comprende dos o más subsecuencias que no se encuentran en la misma relación entre sí en la naturaleza. Por ejemplo, un ácido nucleico normalmente se produce recombinantemente, teniendo dos o más secuencias de genes no relacionados dispuestas para que formen un nuevo ácido nucleico funcional, por ejemplo, un ácido nucleico que codifica una proteína procedente de una fuente, y un ácido nucleico que codifica una secuencia peptídica procedente de otra fuente. De forma análoga, una proteína heteróloga indica que la proteína comprende dos o más subsecuencias que no se encuentran en la misma relación entre sí en la naturaleza (por ejemplo, una proteína de

45 fusión).

Los términos "idéntico" o "identidad" porcentual, en el contexto de dos o más secuencias de ácidos nucleicos o de polipéptidos, se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que son iguales o que tienen un porcentaje específico de residuos de aminoácidos o de nucleótidos que son iguales (es decir, una identidad de aproximadamente el 70 %, preferentemente del 75 %, del 80 %, del 85 %, del 90 % o del 95 %) a lo largo de una región específica, cuando se comparan y se alinean para una correspondencia máxima en una ventana de comparación, o una región designada medida mediante el uso de un algoritmo de comparación de secuencias, o mediante una alineación manual y una inspección visual. Esta definición también se refiere al complemento de una secuencia de prueba, que tiene una complementariedad en la secuencia o la subsecuencia sustancial cuando la

55 secuencia de prueba tiene una identidad sustancial con una secuencia de referencia. Esta definición también se refiere al complemento de una secuencia de prueba, que tiene una complementariedad en la secuencia o la subsecuencia sustancial cuando la secuencia de prueba tiene una identidad sustancial con una secuencia de referencia.

Cuando se usa el porcentaje de identidad en la secuencia en referencia a polipéptidos, se reconoce que las posiciones del residuo que no son idénticas a menudo difieren por sustituciones conservativas de aminoácidos, en las que los residuos de aminoácidos residuos están sustituidos por otros residuos de aminoácidos con unas propiedades químicas similares (por ejemplo, carga o hidrofobicidad), y por lo tanto no cambian las propiedades funcionales del polipéptido. Cuando las secuencias difieren en sustituciones conservativas, el porcentaje de

65 identidad de la secuencia puede ajustarse hacia arriba para corregir la naturaleza conservativa de la sustitución.

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Para una comparación de la secuencia, normalmente una secuencia actúa como la secuencia de referencia, con la que se comparan las secuencias de prueba. Cuando se usa un algoritmo de comparación de secuencias, se introducen las secuencias de prueba y de referencia en un ordenador, se indican las coordenadas de la subsecuencia, si fuera necesario, y se designan los parámetros del programa del algoritmo de la secuencia. Pueden usarse los parámetros por defecto del programa, o pueden designarse unos parámetros alternativos. El algoritmo de comparación de la secuencia calcula después el porcentaje de identidad de las secuencias para las secuencias de prueba con respecto a la secuencia de referencia, basándose en los parámetros del programa.

Una "ventana de comparación", según se usa en el presente documento, incluye una referencia a un segmento de una cualquiera de las diversas posiciones contiguas seleccionadas entre aproximadamente 20 y 600, habitualmente entre aproximadamente 50 y aproximadamente 200, más habitualmente de entre aproximadamente 100 y aproximadamente 150, en la que puede compararse una secuencia con una secuencia de referencia con el mismo número de posiciones contiguas después de que las dos secuencias se hayan alineado de forma óptima. Los métodos de alineación de secuencias para su comparación son bien conocidos en la materia. Una alineación óptima de las secuencias para su comparación puede llevarse a cabo, por ejemplo, mediante el algoritmo de homología local de Smith & Waterman, 1981, Adv. Appl. Math. 2: 482, mediante el algoritmo de alineación de homología de Needleman & Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443, mediante el método de búsqueda de similitud de Pearson & Lipman, 1988, Proc. Nat’l. Acad. Sci. EE.UU. 85: 2444, mediante implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el paquete informático Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI) o mediante una alineación manual y una inspección visual (véase, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. 1995, suplemento)).

Un ejemplo preferido de algoritmo que es adecuado para la determinación del porcentaje de identidad en la secuencia y de la similitud en la secuencia son los algoritmos BLAST y BLAST 2.0, que se describen en Altschul et al., 1977, Nuc. Acids Res. 25: 3389-3402, y en Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215: 403-410, respectivamente. Se usan BLAST y BLAST 2.0, normalmente con los parámetros por defecto descritos en el presente documento, para la determinación del porcentaje de identidad en la secuencia para los ácidos nucleicos y las proteínas de la invención. El programa informático para llevar a cabo los análisis de BLAST está disponible al público a través del National Center for Biotechnology Information. Este algoritmo implica en primer lugar la identificación de los pares de la secuencia de elevada puntuación (HSP) mediante la identificación de las palabras cortas de longitud W en la secuencia problema, que cumplen o satisfacen algunas puntuaciones de umbral con valor positivo T cuando se alinean con una palabra de la misma longitud en una secuencia de la base de datos. T se refiere al umbral de puntuación de la palabra vecina (Altschul et al., supra). Esta palabra vecina inicial actúa como semilla para el inicio de las búsquedas para encontrar HSP más largas que la contienen. Los aciertos de palabras se extienden en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia durante todo lo largo que pueda aumentarse la puntuación de alineación acumulativa. Las puntuaciones acumulativas se calculan mediante el uso, para las secuencias de nucleótidos, de los parámetros M (puntuación de recompensa para un par de residuos coincidentes; siempre > 0) y N (puntuación de penalización para residuos no coincidentes; siempre < 0). Para secuencias de aminoácidos, se usa una matriz de puntuación para calcular la puntuación acumulada. La extensión de los aciertos de palabras en cada dirección se detiene cuando: la alineación puntuación de acumulada cae en una cantidad X con respecto a su máximo valor conseguido; la puntuación acumulada llega a cero o menos, debido al acumulación de una o más alineaciones de residuos con una puntuación negativa; o se alcanza el final de alguna de las secuencias. Los parámetros del algoritmo BLAST W, T, y X determinan la sensibilidad y la velocidad de la alineación. El programa BLASTN (para secuencias de nucleótidos) usa como defecto una longitud de palabra (W) de 11, una expectativa (E) de 10, M = 5, N = -4 y una comparación de ambas hebras. Para secuencias de aminoácidos, el programa BLASTP usa como defecto una longitud de palabra de 3, y una expectativa (E) de 10, y la matriz de puntuación BLOSUM62 (véase Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 89: 10915 (1989)) unas alineaciones (B) de 50, una expectativa (E) de 10, M = 5, N = -4, y una comparación de ambas hebras.

El algoritmo BLAST también lleva a cabo un análisis estadístico de la similitud entre dos secuencias (véase, por ejemplo, Karlin & Altschul, 1993, Proc. Nat’l. Acad. Sci. EE.UU. 90: 5873-5787). Una medición de la similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la suma de probabilidad mínima (P(N)), que proporciona una indicación de la probabilidad de que se produzca por azar una coincidencia entre dos secuencias de nucleótidos o de aminoácidos. Por ejemplo, un ácido nucleico se considera similar a una secuencia de referencia si la suma de probabilidad mínima en una comparación entre el ácido nucleicos de prueba y el ácido nucleico de referencia es menor de aproximadamente 0,2, más preferentemente menor de aproximadamente 0,01, y lo más preferentemente menor de aproximadamente 0,001.

La expresión "condiciones de hibridación rigurosas" se refiere a las condiciones bajo las cuales una sonda hibridará con su subsecuencia objetivo, normalmente en una mezcla compleja de ácidos nucleicos, pero con ninguna otra secuencia. Las condiciones rigurosas dependen de la secuencia y serán diferentes en diferentes circunstancias. Las secuencias más largas hibridan específicamente a unas temperaturas más altas. Una amplia guía sobre la hibridación de ácidos nucleicos se encuentra en Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Probes, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" (1993). Generalmente, las condiciones altamente rigurosas se seleccionan para que sean de aproximadamente 510 ºC menores que el punto de fusión térmico (Tm) para la secuencia específica a un pH con una fuerza iónica definida. Las condiciones poco rigurosas se seleccionan generalmente para que estén aproximadamente 15-30 ºC por debajo de la Tm. La Tm es la temperatura (a una fuerza iónica, un pH y una concentración nucleica definidos) a la que el 50 % de las sondas complementarias del objetivo hibridan con la secuencia objetivo en equilibrio (dado que las secuencias objetivo están presentes en exceso, a la Tm, el 50 % de las sondas están ocupadas en equilibrio).

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5 Las condiciones rigurosas serán aquellas en las que la concentración salina es menor de aproximadamente 1,0 M de iones de sodio, normalmente de entre aproximadamente 0,01 y 1,0 M de concentración de iones de sodio (o de otras sales) a un pH de entre 7,0 y 8,3 y la temperatura es de al menos aproximadamente 30 ºC para las sondas cortas (por ejemplo, de entre 10 y 50 nucleótidos) al menos de aproximadamente 60 ºC para las sondas largas (por ejemplo, las mayores de 50 nucleótidos). También pueden conseguirse unas condiciones rigurosas con la adición de agentes desestabilizantes tales como formamida. Para una hibridación selectiva o específica, una señal positiva es al menos dos veces el fondo, preferentemente 10 veces la hibridación de fondo.

Los ácidos nucleicos que no hibridan entre sí en unas condiciones rigurosas todavía son sustancialmente idénticos si los polipéptidos que codifican son sustancialmente idénticos. Esto se produce, por ejemplo, cuando se crea una

15 copia de un ácido nucleico mediante el uso de la máxima degeneración de codón permitida por el código genético. En dicho caso, los ácidos nucleicos normalmente hibridan en unas condiciones de hibridación moderadamente rigurosas.

El ADN genómico o el ADNc que comprende polinucleótidos GPT puede ser identificado en una inmunotransferencia Southern estándar en unas condiciones rigurosas mediante el uso de las secuencias de polinucleótidos GPT aquí divulgadas. Con este fin, unas condiciones rigurosas adecuadas para dichas hibridaciones son aquellas que incluyen una hibridación en un tampón de formamida al 40 %, NaCl 1 M, SDS al 1 % a 37 ºC, y al menos un lavado con 0,2 X SSC a una temperatura de al menos aproximadamente 50 ºC, habitualmente de entre aproximadamente 55 ºC y aproximadamente 60 ºC, durante 20 minutos, o unas condiciones equivalentes. Una hibridación positiva es al menos

25 dos veces el fondo. Los expertos habituales apreciarán fácilmente que pueden utilizarse unas condiciones de hibridación y de lavado alternativas para proporcionar unas condiciones de rigurosidad similares.

Una indicación adicional de que dos polinucleótidos son sustancialmente idénticos es la secuencia de referencia, amplificada mediante un par de cebadores oligonucleotídicos, después pueden usarse como sonda en unas condiciones de hibridación rigurosas para aislar la secuencia de prueba a partir de una colección de ADNc o genómica, o para la identificación de la secuencia de prueba, por ejemplo, en una inmunotransferencia northern o Southern.

PLANTAS TRANSGÉNICAS CON NIVELES ALTERADOS EN LA EXPRESIÓN DE LA AMIDASA Ω:

35 La presente divulgación proporciona plantas transgénicas que contienen unos mayores niveles del metabolito de señalización 2-oxoglutaramato y de sus análogos en los tejidos foliares con respecto a los tejidos de la raíz o del subsuelo, y a métodos para aumentar la eficacia de uso del nitrógeno de una planta generadora de plantas. El 2oxoglutaramato es un metabolito que es un efector extremadamente potente de la expresión génica, el metabolismo y el crecimiento de la planta (Patente de EE.UU. nº 6.555.500), y que puede jugar un papel fundamental en la coordinación de los sistemas metabólicos del carbono y del nitrógeno (Lancien et al., 2000, Enzyme Redundancy and the Importance of 2-Oxoglutarate in Higher Plants Ammonium Assimilation, Plant Physiol. 123: 817-824).

Los niveles del 2-oxoglutaramato en el tejido foliar pueden ser aumentados mediante el aumento de la biosíntesis

45 del 2-oxoglutaramato. La biosíntesis del 2-oxoglutaramto en el tejido foliar puede aumentarse preferentemente hasta un nivel suficiente como para que exceda la tasa de degradación, por ejemplo, mediante la disminución de la actividad de la enzima que cataliza la degradación del 2-oxoglutaramato (FIG. 1). Adicionalmente, los niveles del 2oxoglutaramato en el tejido radicular pueden ser disminuidos mediante el aumento de la degradación del 2oxoglutaramato. La tasa de degradación del 2-oxoglutaramato en el tejido radicular puede aumentarse preferentemente, por ejemplo, mediante el aumento en la actividad de la enzima que cataliza la degradación del 2oxoglutaramato (FIG. 1).

Los métodos divulgados en el presente documento se usan para la generación de plantas transgénicas que muestran una elevada proporción entre las hojas y las raíces de 2-oxoglutaramato cuando se comparan con las

55 plantas silvestres o progenitoras. En la práctica de los métodos divulgados, la concentración del 2-oxoglutaramato en los tejidos foliares y radiculares puede ser modulada mediante una cualquiera de, o una combinación de, las diversas metodologías divulgadas en el presente documento. Por ejemplo, la proporción entre las hojas y las raíces del 2-oxoglutaramato puede aumentarse mediante el aumento de la actividad de las amidasas ω en los tejidos radiculares o mediante la inhibición de la actividad de las amidasas ω en los tejidos foliares.

MODULACIÓN DE LA RUTA DE LA AMIDASA Ω EN PLANTAS:

La presente divulgación se basa en el sorprendente descubrimiento de que la proporción entre las hojas y las raíces del 2-oxoglutaramato puede ser aumentada en las plantas mediante la modulación de la expresión de la amidasa ω 65 en el tejido radicular y/o foliar de las plantas. Además, el aumento de la proporción entre las hojas y las raíces del 2

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oxoglutaramato da como resultado un aumento en la eficacia de uso del nitrógeno.

Los solicitantes han identificado una ruta de la amidasa ω que puede ser modulada para conseguir el objetivo de aumentar la concentración relativa entre las hojas y las raíces del 2-oxoglutaramato, desencadenando así una mayor dinámica del metabolismo de asimilación del nitrógeno y el carbono, que da como resultado una mejora en la tasa de crecimiento y en las características agronómicas. El único intermedio de esta ruta, el 2-oxoglutaramato, funciona ostensiblemente como un metabolito de señalización que refleja el flujo del nitrógeno asimilado. Un aumento en los niveles del 2-oxoglutaramato desencadena un sorprendente aumento en las tasas de adquisición de recursos, el metabolismo del carbono y del nitrógeno y el crecimiento global de la planta. Las plantas tratadas con 2oxoglutaramato o modificadas para que produzcan unos niveles aumentados de 2-oxoglutaramato en la hoja muestran un mayor nitrógeno por hoja y una mayor eficacia de uso de nitrógeno medio. Este aumento resultante en el metabolismo de crecimiento global está acompañado por un aumento en la proporción entre las hojas y las raíces de las reservas de 2-oxoglutaramato, que a su vez son controladas por las actividades de sintetasa de glutamina, de transaminasa de fenilpiruvato de glutamina y de amidasa ω, así como por la disponibilidad del nitrógeno, en un complejo, de una forma interrelacionada y específica del tejido. Además, el aumento en la proporción entre las hojas y las raíces del 2-oxoglutaramato da como resultado un aumento en la eficacia de uso del nitrógeno. Según se usa en el presente documento, "aumento en la eficacia de uso del nitrógeno" y "eficacia de uso del nitrógeno aumentada" se refiere a plantas que tienen un crecimiento mejorado y unas mejores características agronómicas. Algunas características agronómicas incluyen, sin limitación, unas velocidades de crecimiento más rápidas, unos mayores rendimientos de las semillas y de las frutas/vainas, una floración más temprana y productiva, un aumento en la tolerancia a unas elevadas condiciones salinas y/o un aumento en los rendimientos de biomasa resultantes de un aumento en la utilización de nitrógeno mediado por un aumento en la proporción entre las hojas y las raíces del 2oxoglutaramato.

Según se describe en el Ejemplo 1, infra, las plantas transgénicas diseñadas para que sobreexpresen la GS y/o la GPT muestran unas menores actividades de amidasa ω en las hojas y una mayor actividad de amidasa ω en las raíces. Las plantas GPT y GS + GPT mostraron los mayores aumentos en la actividad radicular de la amidasa ω. Estas plantas respondieron a la expresión de los transgenes mediante una alteración en sus actividades de amidasa ω de tal forma que tendían a aumentar las reservas foliares de 2-oxoglutaramato y a mantener las radiculares de 2oxoglutaramato. Estas respuestas se combinaron en las plantas que sobreexpresan GS + GPT para generar las mayores reservas foliares y las menores radiculares de 2-oxoglutaramato y las mayores actividades foliares y las menores radiculares de GS y GPT.

Sin desear estar ligados a una teoría, se cree que el metabolito de señalización, el 2-oxoglutaramato, proporciona dos mensajes diferentes dependiendo del tejido. Un aumento en los niveles del 2-oxoglutaramato en las hojas es estimulante (Tablas 2-4) y parece que efectivamente transporta el mensaje de que el nitrógeno es abundante y debe fijarse el carbono para aprovechar el aumento en el nitrógeno. El rápido crecimiento guiado por el aumento en el suministro de nitrógeno está acompañado por un aumento en las reservas entre la hoja y la raíz de 2oxoglutaramato. El aumento en las reservas foliares de 2-oxoglutaramato aparentemente es clave para la estimulación. Sin desear estar ligados a una teoría, se cree que la estrategia de la planta para mantener unas reservas de 2-oxoglutaramato próximas a las normales o disminuidas en las raíces es un mecanismo que pueden estar usando para superar la aparente contradicción de cómo las plantas crecen más rápido cuando son fertilizadas con nitrógeno y todavía muestran una ampliamente observada inhibición de la captación de nitrato y asimilación en las raíces por parte de un "metabolito del N cascada abajo del NH3" (Foyer et al., 2002, Kluwer Academic Publishers, Holanda). Si el metabolito inhibidor de nitrógeno es el 2-oxoglutaramato, entonces el mecanismo podría ser el mantenimiento de su concentración a la baja cuando el nitrógeno es abundante para permitir que la planta prospere, y por el contrario, mantener el 2-oxoglutaramato más alto cuando el nitrógeno es escaso y la planta intenta conservar un recurso limitante para sobrevivir para reproducirse.

Sin desear estar ligados a una teoría, se cree que los resultados divulgados en el presente documento indican que la modulación de la actividad de la amidasa ω en las plantas es útil para guiar el aumento en los niveles de 2oxoglutaramato en las hojas con respecto a las raíces. En lo sucesivo en el presente documento se describen dos metodologías: (1) favorecer la degradación del 2-oxoglutaramato mediante la regulación por aumento de la actividad de la amidasa ω en los tejidos radiculares, y (2) dificultar la degradación del 2-oxoglutaramato en los tejidos foliares dificultando, regulando por disminución o desactivando la actividad foliar de la amidasa ω.

FAVORECIENDO LA DEGRADACIÓN DEL 2-OXOGLUTARAMATO MEDIANTE LA REGULACIÓN POR

AUMENTO DE LA ACTIVIDAD DE LA AMIDASA Ω EN LOS TEJIDOS RADICULARES:

Algunos aspectos de la presente divulgación se refieren a plantas transgénicas que contienen un transgén de la amidasa ω, en las que el transgén de la amidasa ω está unido operativamente a un promotor de preferencia radicular.

Previamente se ha demostrado una ruta similar a la de la amidasa ω en plantas que posiblemente esté implicada en la degradación del 2-oxoglutaramato (Von Gusgtav Schwab 1936, Planta Archiv fur wissenschaftliche botanik. 25.

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Band, 4. Heft. págs. 579-606 [publicación alemana]; Olenicheva, LS 1955, Biokhimiia 20 (2): 165-172 [publicación rusa]; y Yamamoto, Y. 1955, Journal of Biochemistry 42: 763-774). Sin embargo, ninguno de estos estudios identificó una proteína amidasa ω.

5 Consecuentemente, se cree que hay una ruta de la amidasa ω implicada en la degradación del 2-oxoglutaramato y de sus análogos en las plantas (FIG. 1). Adicionalmente, se ha demostrado que una enzima amidasa ω es capaz de catalizar la degradación del 2-oxoglutaramato en células animales mediante la apertura del anillo del 2oxoglutaramato y la eliminación del nitrógeno para producir un cetoácido (Cooper y Meister, 1977, CRC Critical Reviews in Biochemistry, páginas 281-303; Meister, 1952, J. Biochem. 197: 304).

10 Los solicitantes han identificado un presunto gen y proteína vegetales de la amidasa ω (el gen de Arabidopsis thaliana AT5 g12040, F14F18_210 ARNm). La identificación de la presunta amidasa ω vegetal se basaba en el análisis de la homología en la secuencia de las secuencias génicas de la amidasa ω de otros organismos, incluyendo el ser humano y la rata. El nucleótido codificante y las secuencias de aminoácidos traducidas de los

15 mismos se muestran a continuación.

Secuencia codificante del nucleótido de la amidasa ω de Arabidopsis (nº de registro del Genbank AY075592.1 correspondiendo GI 19715573 a proteína NP445766) [SEQ ID NO: 2]:

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Secuencia de aminoácidos de la amidasa ω de Arabidopsis madura; y derivada del producto de la traducción de la SEQ ID NO: 2, más arriba (nº de registro del Genbank AAL91613.1) [SEQ ID NO: 3]:

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Tomando como base el análisis inicial de BLAST en el Genbank, la amidasa ω de Arabidopsis tiene homólogos en otras especies vegetales, así como en bacterias, hongos, ranas, peces y mamíferos. Ninguno de los homólogos

30 identificados fue indicado como amidasa ω. Sin embargo, sin desear estar ligados a una teoría, se cree que estas secuencias también codifican amidasas ω. Las secuencias de aminoácidos de las presuntas amidasas ω identificadas se muestran a continuación.

Secuencia de aminoácidos de Vitis vinifera (nº de registro del Genbank XP_002279687.1) [SEQ ID NO: 4]: 35

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Secuencia de aminoácidos de Zea mays (nº de registro del Genbank ACN30911.1) [SEQ ID NO: 5]:

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Secuencia de aminoácidos de Populus trichocarpa (nº de registro del Genbank XP_002309478.1) [SEQ ID NO: 10 6]:

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Secuencia de aminoácidos de Picea sitchensis (nº de registro del Genbank ABK22312.1) [SEQ ID NO: 7]:

imagen15

Secuencia de aminoácidos de Oryza sativa (nº de registro del Genbank NP_001049134.1) [SEQ ID NO: 8]:

imagen16

Secuencia de aminoácidos de Sorghum bicolor (nº de registro del Genbank XP_002468410,1) [SEQ ID NO: 9]:

imagen17

Secuencia de aminoácidos de Ricinus communis (nº de registro del Genbank XP_002516116.1) [SEQ ID NO: 10]:

imagen18

Secuencia de aminoácidos de Physcomitrellapatens subsp. patens (nº de registro del Genbank XP_001766085.1) [SEQ ID NO: 11]:

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Secuencia de aminoácidos de Selaginella moellendorffii (nº de registro del Genbank XP_002969787.1) [SEQ ID NO: 12]:

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Secuencia de aminoácidos de Medicago truncatula (nº de registro del Genbank ACJ85250.1) [SEQ ID NO: 13]:

imagen21

Secuencia de aminoácidos de Chlorella variabilis (nº de registro del Genbank EFN54567.1) [SEQ ID NO: 14]:

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Secuencia de aminoácidos de Volvox carteri f. nagariensis (nº de registro del Genbank XP_002948137.1) [SEQ ID NO: 15]:

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Secuencia de aminoácidos de Chlamydomonas reinhardtii (nº de registro del Genbank XP_001690839.1) [SEQ ID NO: 19]:

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Secuencia de aminoácidos de Micromonas pusilla CCMP1545 (nº de registro del Genbank XP_003064056.1) [SEQ ID NO: 20]:

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Secuencia de aminoácidos de Ectocarpus siliculosus (nº de registro del Genbank CBJ25483.1) [SEQ ID NO: 21]:

imagen26

Secuencia de aminoácidos de Phaeodactylum tricornutum CCAP 1 055/1 (nº de registro del Genbank XP_002183613.1) [SEQ ID NO: 22]:

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Secuencia de aminoácidos de Schizosaccharomyces pombe 972h (nº de registro del Genbank NP_594154.1) [SEQ ID NO: 23]:

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Secuencia de aminoácidos de Aspergillus oryzae RIB40 (nº de registro del Genbank XP_001819629.1) [SEQ ID NO: 24]:

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Secuencia de aminoácidos de Neurospora crassa OR74A (nº de registro del Genbank XP_960906.1) [SEQ ID NO: 25]:

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Secuencia de aminoácidos de Rhizobium leguminosarum bv. viciae 3841 (nº de registro del Genbank YP_769862.1) [SEQ ID NO: 26]:

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Secuencia de aminoácidos de Rhizobium etli CFN 42 (nº de registro del Genbank YP_471237.1) [SEQ ID NO: 27]:

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Secuencia de aminoácidos de Rhizobium leguminosarum bv. trifolii WSM1325 (nº de registro del Genbank YP_002977603.1) [SEQ ID NO: 28]:

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Secuencia de aminoácidos de Bradyrhizobium sp. ORS278 (nº de registro del Genbank YP_001202760.1) [SEQ ID NO: 29]:

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Secuencia de aminoácidos de Sinorhizobium meliloti BL225C (nº de registro del Genbank ZP_07592670.1) [SEQ ID NO: 30]:

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Secuencia de aminoácidos de Sinorhizobium meliloti 1021 (nº de registro del Genbank NP_386723.1) [SEQ ID NO: 31]:

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Secuencia de aminoácidos de Phytophthora infestans T30-4 (nº de registro del Genbank XP_002999170,1) [SEQ ID NO: 32]:

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Secuencia de aminoácidos de Homo sapiens (nº de registro del Genbank NP_064587.1) [SEQ ID NO: 33]:

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Secuencia de aminoácidos de Equus caballus (nº de registro del Genbank XP_001502234.1) [SEQ ID NO: 34]:

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Secuencia de aminoácidos de Xenopus (Silurana) tropicalis (nº de registro del Genbank NP_001016633.1) [SEQ ID NO: 35]:

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Danio rerio Secuencia de aminoácidos de (nº de registro del Genbank AAQ97821.1) [SEQ ID NO: 36]:

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Nematostella vectensis Secuencia de aminoácidos de (nº de registro del Genbank XP_001622809.1) [SEQ ID NO: 37]:

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Mus musculus Secuencia de aminoácidos de (nº de registro del Genbank NP_075664.1) [SEQ ID NO: 38]:

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La secuencia de aminoácidos de la amidasa ω de Arabidopsis thaliana se alineó con la secuencia de aminoácidos de otras presuntas amidasas ω vegetales y con otras presuntas amidasas ω animales para la identificación de las regiones conservadas. Los resultados de las alineaciones de las secuencias se muestran en la FIG. 2 y en la FIG. 3. Las regiones de homología están representadas en color sombreado y en las secuencias consenso (la SEQ ID NO:

25 44 para la Fig. 2, y la SEQ ID NO: 45 para la Fig. 3).

En la siguiente Tabla 1 se recogen algunos homólogos adicionales de la amidasa ω de Arabidopsis thaliana.

TABLA 1

nº de registro del Genbank

Organismo de origen

AAL91613.1

Arabidopsis thaliana

NP_196765.2

Arabidopsis thaliana

XP_002871509.1

Arabidopsis lyrata subsp. lyrata

NP_974769.1

Arabidopsis thaliana

XP_002309478.1

Populus trichocarpa

XP_002279687.1

Vitis vinifera

NP_001146676.1

Zea mays

NP_001146295.1

Zea mays

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NP_001049134.1

Oryza sativa Japonica Group

XP_002516116.1

Ricinus communis

XP_001766085.1

Physcomitrella patens subsp. patens

XP_001756522.1

Physcomitrella patens subsp. patens

XP_002969787.1

Selaginella moellendorffii

XP_002985119.1

Selaginella moellendorffii

XP_002948137.1

Volvox carteri f. nagariensis

XP_001690839.1

Chlamydomonas reinhardtii

NP_001057093.1

Oryza sativa Japonica Group

XP_002468410.1

Sorghum bicolor

NP_064587.1

Homo sapiens

XP_001089575.2

Macaca mulatta

XP_001502234.1

Equus caballus

XP_002502298.1

Micromonas sp. RCC299

XP_526254.2

Pan troglodytes

XP_535718.2

Canis familiaris

XP_002716659.1

Oryctolagus cuniculus

NP_001033222.1

Bos taurus

NP_001029298.1

Rattus norvegicus

NP_001016633.1

Xenopus (Silurana) tropicalis

NP_001085409.1

Xenopus laevis

XP_002758928.1

Callithrix jacchus

XP_003064056.1

Micromonas pusilla CCMP1545

NP_001135127.1

Salmo salar

XP_001622809.1

Nematostella vectensis

NP_991174.2

Danio rerio

XP_002594716.1

Branchiostoma floridae

NP_075664.1

Mus musculus

XP_001370849.1

Monodelphis domestica

NP_001090454.1

Xenopus laevis

XP_002999170.1

Phytophthora infestans T30-4

XP_002917137.1

Ailuropoda melanoleuca

XP_002741281.1

Saccoglossus kowalevskii

XP_002131764.1

Ciona intestinalis

NP 594154.1

Schizosaccharomyces pombe 972h

XP_001742101.1

Monosiga brevicollis MX1

XP_416604.2

Gallus gallus

XP_002194275.1

Taeniopygia guttata

XP_001599587.1

Nasonia vitripennis

XP_002410555.1

Ixodes scapularis

XP_003035898.1

Schizophyllum commune H4-8

XP_002183613.1

Phaeodactylum tricornutum CCAP 1055/1

XP_001875493.1

Laccaria bicolor S238N-H82

XP_002112209.1

Trichoplax adhaerens

XP_636983.1

Dictyostelium discoideum AX4

XP_002158547.1

Hidra magnipapillata

XP_002839272.1

Tuber melanosporum Mel28

XP_307722.3

Anopheles gambiae str. PEST

XP_001819629.1

Aspergillus oryzae RIB40Aspergillus flavus NRRL3357

XP_001268376.1

Aspergillus clavatus NRRL 1

ZP_08115581.1

Desulfotomaculum nigrificans DSM 574

YP_001320997.1

Alkaliphilus metalliredigens QYMF

XP_369268.1

Magnaporthe oryzae 70-15

XP_002626458.1

Ajellomyces dermatitidis SLH14081

XP_751200.1

Aspergillus fumigatus Af293

XP_001657673.1

Aedes aegypti

XP_002173486.1

Schizosaccharomyces japonicus yFS275

XP_001212538.1

Aspergillus terreus NIH2624

XP_001258462.1

Neosartorya fischeri NRRL 181

XP_002434512.1

Ixodes scapularis

XP_960906.1

Neurospora crassa OR74A

XP_002847679.1

Arthroderma otae CBS 113480

XP_967861.1

Tribolium castaneum

XP_002426154.1

Pediculus humanus corporis

XP_003176259.1

Arthroderma gypseum CBS 118893

XP_500602.1

Yarrowia lipolitica

XP_001428419.1

Paramecium tetraurelia cepa d4-2

XP_003014235.1

Arthroderma benhamiae CBS 112371

XP_001393123.1

Aspergillus niger CBS 513.88

ZP_03608460.1

Metanobrevibacter smithii DSM 2375

XP_002147261.1

Penicillium marneffei ATCC 18224

ZP_03293831.1

Clostridium hiranonis DSM 13275

XP_002290043.1

Thalassiosira pseudonana CCMP 1335

XP_003065597.1

Coccidioides posadasii C735 delta SOWgp

XP_001588734.1

Sclerotinia sclerotiorum 1980

YP_001273073.1

Metanobrevibacter smithii ATCC 35061 > Metanobrevibacter smithii DSM 2374

XP_001552800.1

Botryotinia fuckeliana B05.10

XP_446414.1

Candida glabrata CBS 138

imagen46

XP_002792830.1

Paracoccidioides brasiliensis Pb01

XP_001998501.1

Drosophila mojavensis

YP_003780301.1

Clostridium Ijungdahlii DSM 13528

NP_013455.1

Saccharomyces cerevisiae S288c

XP_002404736.1

Ixodes scapularis

YP_001086961.1

Clostridium difficile 630

ZP 05328587.1

Clostridium difficile QCD-63q42

ZP_05399936.1

Clostridium difficile QCD-23m63 Clostridium difficile NAP08 Clostridium difficile NAP07

YP_001113615.1

Desulfotomaculum reducens MI-1

XP_001247884.1

Coccidioides immitis RS

XP_390426.1

Gibberella zeae PH-1

XP_003025334.1

Trichophyton verrucosum HKI 0517

XP_002052999.1

Drosophila virilis

ZP_07325748.1

Acetivibrio cellulolyticus CD2

ZP_05349666.1

Clostridium difficile ATCC 43255

Consecuentemente, en ciertas realizaciones, el transgén de la amidasa ω codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos un 75 %, en al menos un 80 %, en al menos un 85 %, como mínimo en un 90 %, como mínimo en un 91 %, como mínimo en un 92 %, como mínimo en un 93 %, como mínimo 5 en un 94 %, como mínimo en un 95 %, como mínimo en un 96 %, como mínimo en un 97 %, como mínimo en un 98 %, como mínimo en un 99 % o en un 100 % a una secuencia de aminoácidos codificada por un polipéptido seleccionado entre AAL91613.1, ACN30911.1, ABK22312.1, ACJ85250,1, AAQ97821.1, CBJ25483.1, EFN54567.1, NP_196765.2, XP_002871509.1, NP_974769.1, XP_002309478.1, XP_002279687.1, NP_001146676.1, NP_001146295.1, NP_001049134.1, XP_002516116.1, XP_001766085.1, XP_001756522.1, XP_002969787.1, 10 XP_002985119.1, XP_002948137.1, XP_001690839.1, NP_001057093.1, XP_002468410,1, NP_064587.1, XP_001089575.2, XP_001502234.1, XP_002502298.1, XP_526254.2, XP_535718.2, XP_002716659.1, NP_001033222.1, NP_001029298.1, NP_001016633.1, NP_001085409.1, XP_002758928.1, XP_003064056.1, NP_001135127.1, XP_001622809.1, NP_991174.2, XP_002594716.1, NP_075664.1, XP_001370849.1, NP_001090454.1, XP_002999170,1, XP_002917137.1, XP_002741281.1, XP_002131764.1, NP_594154.1, 15 XP_001742101.1, XP_416604.2, XP_002194275.1, XP_001599587.1, XP_002410555.1, XP_003035898.1, XP_002183613.1, XP_001875493.1, XP_002112209.1, XP_636983.1, XP_002158547.1, XP_002839272.1, XP_307722.3, XP_001819629.1, XP_001268376.1, ZP_08115581.1, YP_001320997.1, XP_369268.1, XP_002626458.1, XP_751200,1, XP_001657673.1, XP_002173486.1, XP_001212538.1, XP_001258462.1, XP_002434512.1, XP_960906.1, XP_002847679.1, XP_967861.1, XP_002426154.1, XP_003176259.1, 20 XP_500602.1, XP_001428419.1, XP_003014235.1, XP_001393123.1, ZP_03608460,1, XP_002147261.1, ZP_03293831.1, XP_002290043.1, XP_003065597.1, XP_001588734.1, YP_001273073.1, XP_001552800,1, XP_446414.1, XP_002792830,1, XP_001998501.1, YP_003780301.1, NP_013455.1, XP_002404736.1, YP_001086961.1, ZP_05328587.1, ZP_05399936.1, YP_001113615.1, XP_001247884.1, XP_390426.1, XP_003025334.1, XP_002052999.1, YP_769862.1, ZP_07325748.1, ZP_05349666.1, YP_471237.1, 25 YP_002977603.1, YP_001202760,1, ZP_07592670,1, y NP_386723.1. En otras realizaciones, el transgén de la

amidasa ω está incorporado en el genoma de las plantas transgénicas.

Algunos aspectos de la presente divulgación se refieren a un transgén de una amidasa ω que está unido

operativamente a un promotor de preferencia radicular. Según se usa en el presente documento, un "promotor de 30 preferencia radicular" se refiere a la expresión guiada por un promotor que está selectivamente mejorada en las

células o en los tejidos radiculares, en comparación con una o más células o tejidos no radiculares. Por ejemplo, un

promotor de preferencia radicular puede guiar preferentemente unos elevados niveles de expresión de un gen en las

células o los tejidos radiculares, pero todavía puede guiar unos bajos niveles de expresión del gen en otras células o

tejidos no radiculares, tales como las hojas. Algunos tejidos radiculares incluyen, pero no se limitan a, al menos uno 35 del capuchón radicular, el meristemo apical, el protodermo, el meristemo de tierra, el procámbium, la endodermis, la

corteza, la corteza vascular, la epidermis, y similares.

En algunas otras realizaciones, los niveles del 2-oxoglutaramato en los tejidos radiculares están disminuidos con

objeto de aumentar la proporción entre las hojas y las raíces del mismo mediante el aumento de la degradación 40 natural del 2-oxoglutaramato en el tejido radicular. Por ejemplo, la degradación del 2-oxoglutaramato en el tejido radicular puede aumentarse mediante una regulación por aumento de la actividad de la amidasa en las raíces. Por lo tanto, en una realización, se introduce un transgén de una amidasa ω, incluyendo, sin limitación, cualquiera de los genes de la amidasa ω y las secuencias codificantes divulgadas en el presente documento, en la planta bajo el control de un promotor de preferencia radicular, tal como el promotor rolD de Agrobacterium rhizogenes (Kamo y

imagen47

5 Bowers, 1999, Plant Cell Reports 18: 809-815, y las referencias citadas en el mismo). El promotor rolD controla la expresión del rolD, que funciona favoreciendo el alargamiento de la raíz. Se ha demostrado la expresión de la proteína GUS bajo el control del promotor rolD para producir principalmente una expresión de preferencia radicular de GUS (Leach y Aoyagi, 1991, Plant Sci. 79, 69-76). Los promotores de preferencia radicular pueden ser constitutivos o inducibles.

10 Algunos promotores constitutivos y/o inducibles de preferencia radicular adicionales incluyen, sin limitación: el promotor RolD-2; los promotores ricos en glicina (GRP); los promotores ADH, incluyendo el promotor ADH1 del maíz (Kyozuka, J et al., 1994, The Plant Cell 6: 799-810); los promotores PHT, incluyendo los promotores de la familia del gen Pht1 (Schunmannet al., 2004, J. Experimental Botany 55: 855-865); los promotores de la proteína de captación

15 de metales, incluyendo el promotor de la metalotioneína del maíz (Diehn, S, 2006 Maize, Publicación de Solicitud de Patente de EE.UU. US 2006/0005275); el promotor del dominio A 35S CaMV (Elmayan, T y M. Tepfer. 1995, Transgenic Research 4: 388-396); los promotores pDJ3S, SIREO y pMe1 (Arango et al., Plant Cell Rep., 29 de junio de 2010; (6): 651-9. Publicación electrónica del 6 de abril de 2010); los promotores Sad1 y Sad2 (Publicación de Solicitud de Patente de EE.UU. US 2008/0244791); el promotor TobRB7 (Yamamoto et al., 1991, Plant Cell 3: 371

20 3); el promotor RCc3 (Xu et al., 1995, Plant Mol. Biol. 27: 237-248); el promotor FaRB7 (Vaugn et al., Exp. Bot. (2006) 57 (14): 3901-3910); el promotor SPmads (Noh et al., American Society of Plant Biologists, Plant Biology 2005 Conference, Resumen # 1097); el promotor IDS2 (Kobayashi et al., The Plant Journal, Vol. 36 (6): 780-793, diciembre de 2003); el promotor pyk10 (Nitz et al., Plant Sci., julio de 2001;161 (2): 337-346); el promotor Pt2L4 (De Souza et al., Genet. Mol. Res. 8 (1): 334-344 (2009)); el promotor de la leghemoglobina Lbc3 (Bak, K, et al., 1993,

25 The Plant Journal 4 (3) 577-580); el promotor PEPC (Kawamura et al. 1990, J. Biochem 107: 165-168); el promotor de la glucanasa radicular Gns1 (Simmons, C et al., 1992, Plant Molecular Biology 18: 33-45), el promotor 35S2 (Elmayan, T Y M. Tepfer. 1995, Transgenic Research 4: 388-396); los promotores GI4 y GI5 (Patente Europea EP 1 862 473 B1; y el promotor GRP. Adicionalmente, cualquiera de los promotores de preferencia radicular divulgados puede estar en una forma truncada que contiene únicamente el dominio del núcleo o el dominio funcional del

30 promotor, suficiente para guiar la expresión en el tejido radicular. Además, los promotores de preferencia radicular también incluyen isoformas de cualquiera de los promotores de preferencia radicular divulgados en el presente documento. Por ejemplo, el promotor RolD-2 es una de las diversas isoformas truncadas del promotor RolD descritas en Leach y Aoyagi, 1991, Plant Sci. 79, 69-76. Además, Leach y Aoyagi describen el promotor RolD2 como un promotor de elevada preferencia radicular. Consecuentemente, un promotor de preferencia radicular también

35 incluye cualquiera de los isómeros del RolD descritos por Leach y Aoyagi.

Por lo tanto, en ciertas realizaciones, el promotor de preferencia radicular se selecciona entre el promotor RolD, el promotor RolD-2, el promotor de la proteína rica en glicina, el promotor GRP, el promotor ADH, el promotor del maíz ADH1, el promotor PHT, el promotor de la familia del gen Pht1, el promotor de la proteína de captación de metales,

40 el promotor de la proteína metalotioneína del maíz, el promotor del dominio A 35S CaMV, el promotor pDJ3S, el promotor SIREO, el promotor pMe1, el promotor Sad1, el promotor Sad2, el promotor TobRB7, el promotor RCc3, el promotor FaRB7, el promotor SPmads, el promotor IDS2, el promotor pyk10, el promotor de la leghemoglobina Lbc3, el promotor PEPC, el promotor de la glucanasa radicular Gns1, el promotor 35S2, el promotor GI4, el promotor GI5 y el promotor GRP.

45 En las realizaciones de transformación estable quedan integradas una o más copias del transgén de la amidasa ω en el genoma de la planta transgénica, proporcionando así un aumento en la capacidad enzimática de amidasa ω en el tejido radicular de la planta, que sirve para mediar en la síntesis del 2-oxoglutaramato, lo que a su vez señaliza la expresión del gen metabólico, dando como resultado un aumento en la eficacia de uso del nitrógeno, lo que a su vez

50 da como resultado un aumento en el crecimiento de la planta y una mejora en otras características agronómicas.

En otras realizaciones, la expresión de preferencia radicular del transgén de la amidasa ω da como resultado un aumento en la proporción entre las hojas y las raíces del 2-oxoglutaramto con respecto a una planta de la misma especie que no contiene un transgén de la amidasa ω. En algunas realizaciones preferidas, la proporción entre las

55 hojas y las raíces del 2-oxoglutaramato es al menos dos veces, al menos tres veces, al menos cuatro veces, al menos cinco veces, al menos seis veces, al menos siete veces, al menos ocho veces, al menos nueve veces, al menos diez veces o más superior a la de una planta de la misma especie que no contiene un transgén de la amidasa ω.

60 En algunas formas de realización adicionales, la planta transgénica tiene un aumento en la eficacia de uso del nitrógeno. Las plantas transgénicas divulgadas con un aumento en la eficacia de uso del nitrógeno pueden contener adicionalmente otros transgenes conocidos por aumentar la eficacia de utilización del nitrógeno, incluyendo, sin limitación, los descritos en la Patente de EE.UU. nº 7.560.626.

imagen48

DIFICULTANDO LA DEGRADACIÓN DEL 2-OXOGLUTARAMATO EN LOS TEJIDOS FOLIARES MEDIANTE LA

INHIBICIÓN DE LA ACTIVIDAD DE LA AMIDASA Ω:

Otros aspectos de la presente divulgación se refieren a plantas transgénicas que tienen inhibida la expresión de la 5 amidasa ω endógena en el tejido foliar.

Consecuentemente, en ciertas realizaciones, la degradación del 2-oxoglutaramato o de sus análogos puede verse dificultada por la disminución en la actividad de la amidasa ω con objeto de permitir la acumulación del 2oxoglutaramato en las hojas, aumentando así la proporción entre las hojas y las raíces. Más específicamente,

10 pueden usarse las siguientes metodologías para dificultar la ruta de degradación del 2-oxoglutaramato.

En una realización específica se inhibe la degradación metabólica normal del 2-oxogluataramato catalizada por una enzima amidasa ω, incluyendo, pero no se limita a, cualquiera de las enzimas amidasa ω divulgadas en el presente documento, en el tejido foliar de cualquiera de las plantas transgénicas divulgadas, mediante la aplicación de un 15 inhibidor químico que incluye, sin limitación, 6-diazo-5-oxo-norleucina, benzoato de p-hidroximercurio, fluorofosfatos de diisopropilo, cianuro de sodio, acetato de fenilmercurio, acetato de yodo, nitrato de plata, ácido cloromercuricofenilsulfónico y sulfato de cobre. Consecuentemente, en ciertas realizaciones, la expresión endógena de la amidasa ω en el tejido foliar de cualquiera de las plantas transgénicas dadas es inhibida por un inhibidor químico seleccionado entre 6-diazo-5-oxo-nor-leucina, benzoato de p-hidroximercurio, fluorofosfatos de diisopropilo,

20 cianuro de sodio, acetato de fenilmercurio, acetato de yodo, nitrato de plata, ácido cloromercuricofenilsulfónico y sulfato de cobre.

En otra realización, la función de la amidasa ω puede ser inhibida en el tejido foliar de cualquiera de las plantas transgénicas divulgadas dificultando genéticamente la transcripción y/o la traducción de un gen de la amidasa ω,

25 incluyendo, pero no se limita a, los genes de la amidasa ω y las secuencias codificantes divulgadas en el presente documento. Algunos métodos para dificultar la expresión y la función de la amidasa ω incluyen, sin limitación, una disrupción del gen recesivo y un silenciamiento del gen dominante.

Según se usa en el presente documento, "disrupción del gen recesivo" se refiere a la mutación de una secuencia

30 objetivo de una amidasa ω para eliminar bien su expresión, o bien su función. Los métodos para la mutación de una secuencia objetivo son conocidos en la materia, e incluyen, sin limitación, la generación de mutaciones a través de un daño químico o por radiación, seguida por el aislamiento del mutante. Además, pueden usarse las metodologías conocidas de biología molecular para reducir la expresión de un fenotipo funcional, e incluyen sin limitación, varios métodos de inactivación o de reducción conocidos. Estos métodos aprovechan al máximo el conocimiento de la

35 secuencia tanto del gen de interés como de la secuencia de ADN flanqueante del gen. Después dichas secuencias son analizadas para encontrar las secuencias adecuadas que puedan ser el objetivo para conseguir la escisión del gen objetivo o de fragmentos del gen. Por lo tanto, en ciertas realizaciones, la expresión endógena de la amidasa ω en el tejido foliar de cualquiera de las plantas transgénicas divulgadas es inhibida mediante una disrupción del gen recesivo seleccionada entre un gen mutante de la amidasa ω que elimina la expresión endógena de la amidasa ω,

40 un mutante inactivado de la amidasa ω endógena y un mutante de reducido de la amidasa ω endógena.

Según se usa en el presente documento, "silenciamiento del gen dominante" se refiere a la inducción o la destrucción/inhibición del transcrito de ARNm del gen, un medio que proporciona el beneficio de que se realiza de una forma espacial o temporal mediante la selección de los promotores específicos. De entre las metodologías de 45 silenciamiento del gen dominante, el desencadenado por ARNi ARNbc es una de las más potentes y la más eficaz en el silenciamiento génico, y permite mejorar o aprovechar al máximo el mecanismo regulador natural que destruye el ARNm intacto proporcionando un oligonucleótido antisentido que es específico para un gen de la amidasa ω endógena (para una revisión, véase, Behlke, 2006, Molecular Therapy 13 (4): 644-670; véase también, Tang y Galili, 2004, Trends Biotechnology 22: 463-469; Rajewsky y Socci, 2004, Developmental Biology 267: 529-535; Hamilton et 50 al., 2002, EMBO J. 21: 4671-4679J). En una realización, se introduce una construcción que comprende la secuencia de un ARNi adecuado bajo el control de un promotor específico foliar tal como el promotor de la subunidad menor RuBisCo en la planta con objeto de silenciar la expresión de la proteína amidasa ω. Consecuentemente, en ciertas realizaciones, la expresión de la amidasa ω endógena en el tejido foliar de cualquiera de las plantas transgénicas divulgadas es inhibida por un oligonucleótido de ARNi antisentido que es específico para el gen de una amidasa ω

55 endógena.

En ciertas realizaciones, la inhibición de la expresión de la amidasa ω endógena en el tejido foliar da como resultado un aumento en la proporción entre las hojas y las raíces del 2-oxoglutaramto con respecto a una planta de la misma especie que no comprende una inhibición en la expresión de la amidasa ω endógena en el tejido foliar. En algunas

60 realizaciones preferidas, la proporción entre las hojas y las raíces del 2-oxoglutaramato es al menos dos veces, al menos tres veces, al menos cuatro veces, al menos cinco veces, al menos seis veces, al menos siete veces, al menos ocho veces, al menos nueve veces, al menos diez veces, o más, mayor que la de una planta de la misma especie que no comprende una expresión inhibida de la amidasa ω endógena en el tejido foliar. En algunas formas de realización adicionales, la planta transgénica tiene un aumento en la eficacia de uso del nitrógeno.

5

15

25

35

45

55

65

De forma análoga, la expresión del sustrato GS y/o de la proteína catalítica GPT puede verse dificultada en el tejido radicular mediante el uso de cualquiera de las metodologías divulgadas en el presente documento.

REALIZACIONES QUE SE REFIEREN A PLANTAS TRANSGÉNICAS CON UN AUMENTO EN LA ACTIVIDAD DE LA AMIDASA Ω EN LOS TEJIDOS RADICULARES Y UNA ACTIVIDAD INHIBIDA DE LA AMIDASA Ω EN LOS TEJIDOS FOLIARES:

Algunos aspectos de la presente divulgación se refieren a plantas transgénicas con un aumento en la expresión de la amidasa ω en el tejido radicular y una inhibición de la amidasa ω endógena en el tejido foliar, que da como resultado un aumento en la proporción entre las hojas y las raíces del 2-oxoglutaramto.

Consecuentemente, en ciertas realizaciones, las plantas transgénicas que contienen un transgén de la amidasa ω que está unido operativamente a un promotor de preferencia radicular, tienen adicionalmente inhibida la expresión de la amidasa ω endógena en el tejido foliar. Algunos ejemplos de plantas transgénicas para los transgenes de la amidasa ω, y de promotores de preferencia radicular, son según se han descrito en las secciones anteriores. En otras realizaciones, la expresión de la amidasa ω endógena en el tejido foliar es inhibida por la disrupción del gen recesivo, el silenciamiento del gen dominante o un inhibidor químico. En otras realizaciones más, la expresión de la amidasa ω endógena en el tejido foliar es inhibida mediante una disrupción del gen recesivo que selecciona un gen mutante de la amidasa ω que elimina la expresión de la amidasa ω endógena, un mutante inactivado de la amidasa ω endógena y un mutante reducido de la amidasa ω endógena. En otras realizaciones más, la expresión de la amidasa ω endógena en el tejido foliar es inhibida por un oligonucleótido de ARNi antisentido que es específico para el gen de una amidasa ω endógena. En algunas formas de realización adicionales, la expresión de la amidasa endógena en el tejido foliar es inhibida por un inhibidor químico seleccionado entre 6-diazo-5-oxo-nor-leucina, benzoato de p-hidroximercurio, fluorofosfatos de diisopropilo, cianuro de sodio, acetato de fenilmercurio, acetato de yodo, nitrato de plata, ácido cloromercuricofenilsulfónico y sulfato de cobre. En algunas formas de realización adicionales, la planta transgénica tiene un aumento en la proporción entre las hojas y las raíces del 2-oxoglutaramto. En algunas realizaciones preferidas, la proporción entre las hojas y las raíces del 2-oxoglutaramato es al menos dos veces, al menos tres veces, al menos cuatro veces, al menos cinco veces, al menos seis veces, al menos siete veces, al menos ocho veces, al menos nueve veces, al menos diez veces, o más mayor que la de una planta de la misma especie. En algunas realizaciones adicionales más, la planta transgénica tiene un aumento en la eficacia de uso del nitrógeno.

En ciertas realizaciones, las plantas transgénicas tienen una inhibición en la expresión de la amidasa ω endógena en el tejido foliar con respecto a una planta de la misma especie que no comprende una inhibición en la expresión de la amidasa ω endógena en el tejido foliar, en la que la expresión de la amidasa ω endógena en el tejido foliar es inhibida mediante una disrupción del gen recesivo o un silenciamiento del gen dominante de al menos un gen de la amidasa ω endógena, que contiene adicionalmente un transgén de la amidasa ω, en la que el transgén de la amidasa ω está unido operativamente a un promotor de preferencia radicular. Algunos ejemplos de plantas transgénicas, de disrupción del gen recesivo, de silenciamiento del gen dominante, de transgenes de la amidasa ω y de promotores de preferencia radicular son según se describen en las secciones anteriores. En formas de realización adicionales, la planta transgénica tiene un aumento en la proporción entre las hojas y las raíces del 2oxoglutaramto. En algunas realizaciones preferidas, la proporción entre las hojas y las raíces del 2-oxoglutaramato es al menos dos veces, al menos tres veces, al menos cuatro veces, al menos cinco veces, al menos seis veces, al menos siete veces, al menos ocho veces, al menos nueve veces, al menos diez veces, o más mayor que la de una planta de la misma especie. En algunas realizaciones adicionales más, la planta transgénica tiene un aumento en la eficacia de uso del nitrógeno.

EXPRESIÓN DE LA TRANSAMINASA DE FENILPIRUVATO DE GLUTAMINA Y DE LA SINTETASA DE

GLUTAMINA:

Otros aspectos de la presente divulgación se refieren a plantas transgénicas con un aumento en la expresión de la amidasa ω en el tejido radicular o una inhibición en la expresión de la amidasa ω endógena en el tejido foliar que contiene adicionalmente un aumento en la expresión de la transaminasa de fenilpiruvato de glutamina (GPT) y/o de la sintetasa de glutamina (GS).

En una realización en particular, cualquiera de las plantas transgénicas divulgadas en el presente documento sobreexpresa adicionalmente la proteína GPT, que está implicada directamente en la síntesis de 2-oxoglutaramato, lo que da como resultado una mayor proporción entre las hojas y las raíces del compuesto 2-oxoglutaramato. En una realización relacionada, cualquiera de las plantas transgénicas divulgadas en el presente documento sobreexpresan adicionalmente la proteína GPT y la proteína GS. Estas plantas transgénicas que contienen adicionalmente GPT y GS tienen unas proporciones incluso mayores entre las hojas y las raíces de 2-oxoglutaramato, lo que da resultado un aumento adicional de la eficacia de uso del nitrógeno. Este aumento en la eficacia de uso de nitrógeno también da como resultado plantas que crecen más rápido, que producen unos mayores rendimientos de las semillas y de las frutas/vainas, que muestran una floración más temprana y productiva, que muestran un aumento en la tolerancia a unas elevadas condiciones salinas y que producen unos rendimientos de biomasa superiores (véase la solicitud de

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patente de EE.UU. compartida pendiente de tramitación nº 12/551.271).

Más particularmente, los solicitantes han determinado que la sobreexpresión de la GPT y de la GS en plantas transgénicas da como resultado un aumento desproporcionado en las concentraciones nativas de 2-oxoglutaramato 5 en los tejidos foliares y los del subsuelo. Además, la proporción de la concentración de 2-oxoglutaramato entre los tejidos aéreos y los tejidos del subsuelo (proporción entre las hojas y las raíces) está correlacionada positivamente con la biomasa vegetal. Las plantas más grandes con un crecimiento más rápido modificadas genéticamente tienen una mayor proporción de las concentraciones de 2-oxoglutaramato en el tejido foliar con respecto al tejido radicular cuando se comparan con las plantas silvestres. En una realización en particular, las plantas de tabaco transgénicas portadoras de los transgenes GPT y GS1 bajo el control de robustos promotores constitutivos mostraron una proporción sustancialmente mayor entre las hojas y las raíces de 2-oxoglutaramato y mostraron unos fenotipos de elevado crecimiento cuando se comparaban con las plantas de tabaco silvestres. En particular, se encontró que dos líneas de tabaco transgénicas que sobreexpresan los transgenes GPT y GS1 tenían: (1) bastante más de dos veces el peso en fresco de las plantas silvestres, (2) dos veces la concentración foliar de 2-oxoglutaramato en comparación

15 con las plantas silvestres, y (3) entre dos y tres veces la proporción entre las hojas y las raíces observada en las plantas silvestres.

En una planta de tipo silvestre o modificada, puede esperarse que la proporción refleje las concentraciones nativas del 2-oxoglutaramato, así como de la glutamina, el sustrato a partir del cual se elabora, en las hojas con respecto a las raíces de la planta. Se esperaría que las proporciones reales difieran de una especie a otra. Esto es debido al hecho de que las hojas y las raíces alojan diferentes fracciones de la maquinaria y la actividad de asimilación de nitrógeno, en función de la especie vegetal (Pate, 1980, Ann. Rev. Plant Physiol. 31: 313-340). De hecho, algunas especies vegetales asimilan la mayor parte de su nitrógeno en sus raíces, y por lo tanto tienen unas elevadas concentraciones de aminoácidos en sus raíces y en la savia del xilema, y unas concentraciones menores en sus

25 hojas. Otras plantas asimilan la mayor parte de su nitrógeno en sus hojas, y por lo tanto tienen unas elevadas concentraciones de aminoácidos en sus hojas, y unas menores concentraciones en sus raíces. Las propias especies vegetales se distribuyen a lo largo de un continuo de esta distribución de tareas y concentraciones de aminoácidos entre las hojas y las raíces.

Además de la sobreexpresión de las proteínas GPT naturales en los sistemas de plantas transgénicas, pueden desarrollarse enzimas GPT mejoradas modificadas genéticamente y usarse para mejorar la cinética de la síntesis del 2-oxoglutaramato, aumentando así la tasa de acumulación del 2-oxoglutaramato en las hojas. La enzima GPT puede clasificarse ampliamente como un miembro de las enzimas de tipo transferasa de amino aspartato, basándose en la homología de la secuencia con enzimas transferasas de amino aspartato conocidas y 35 caracterizadas. Las principales bases de datos de secuencias génicas incluyen esta clasificación de las enzimas transferasas como parte de su análisis de la secuencia (Gen Bank, por ejemplo). Es característico que estas enzimas sean dependientes de la vitamina B6 que cataliza reacciones de transaminación entre un aminoácido y un cetoácido. Las propiedades cinéticas de estas muchas (~ 1000) transaminasas difieren en propiedades tales como las especificidades de sustrato, las constantes de unión, la velocidad máxima (Vmáx) y las tasas de recambio unimolecular (Kcat). Los residuos específicos de arginina implicados directamente en los puentes de hidrógeno del sustrato de los sustratos del ácido dicarboxílico están muy conservados (Fotheringham et al., 1986, Biochem J. 234: 593-604; Seville et al., 1988, Biochemistry 27: 8344-8349: Jager et al., 1992, FEBS Lett. 306: 234-238) y por lo tanto, los cambios en las especificidades y en las propiedades cinéticas a menudo son por cambios en otros residuos de aminoácidos. Se ha demostrado que el comportamiento de la enzima es muy sensible a sutiles cambios en la

45 estructura del residuo, por ejemplo, la adición de un único grupo CH2 en un residuo que no está en contacto directo ni con el sustrato ni con un cofactor (Jansonius y Vincent, 1987; Seville et al., 1988, supra). Varios estudios han demostrado que es posible cambiar las propiedades de una enzima de transferasa de amino aspartato con una mutación dirigida de la proteína natural (Kohler et al., 1994, Biochemistry 33: 90-97; Jager et al., 1994, Protein Engineering. 7: 605-612).

En las secuencias de la GPT vegetal, la región NLGQGFP (SEQ ID NO: 18) está muy conservada (y completamente conservada en las secuencias de la soja, la uva, el arroz hordeum y Arabidopsis (véase la Solicitud de Patente de EE.UU. nº 12/551.271 y la Solicitud de Patente de EE.UU. nº 12/551.193). Los solicitantes han usado dicha metodología de mutación dirigida para generar una GPT mutante a partir de la GPT natural de Arabidopsis,

55 mediante la sustitución del resido de V (valina) por el de F (fenilalanina) en la secuencia natural. El mutante GPT/F:V resultante fue expresado en E. coli, mediante el uso del habitual sistema de vector PET, y mostró una velocidad máxima y un recambio unimolecular mejorados. La velocidad máxima se determinó mediante el uso de la fórmula: Vmáx = Kcat[E]tot La constante kcat de tasa unimolecular aparente también se denomina número de recambio y representa el número máximo de reacciones enzimáticas catalizadas por segundo.

La Vmáx del mutante aumentó hasta 6,04, un aumento del 20 % con respecto al valor de la Vmáx natural de 5,07. Se tuvo cuidado de asegurar que se usara la misma cantidad de proteína en estos experimentos, y por lo tanto pudiera aplicarse la relación de Vmáx = Kcat[E]tot para demostrar que la tasa de recambio unimolecular del mutante ha aumentado. La Km de la glutamina para el mutante es 0,75 milimolar, un ligero aumento con respecto a la Km de 65 0,30 mM medida para la enzima natural. Puede esperarse que esta enzima GPT mutante produzca más producto, el 2-oxoglutaramato, por unidad de tiempo que la GPT natural cuando la concentración del sustrato glutamina está

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presente en unas cantidades milimolares o mayores, asegurando así que el mutante está en saturación. Un sondeo de la bibliografía vegetal y agrícola muestra que las plantas bien alimentadas contienen unas concentraciones milimolares de glutamina (Dzuibany et al., 1998, Plants 206: 515-522; Knight y Weissman, 1982, Plant Physiol 70: 1683-1688; Sivasankar y Oaks, 1995, Plant Physiol. 107: 1225-1231; Yanagisawa et al., 2004, Proc. Natl Acad Sci. EE.UU. 101: 7833-7838; Udy y Dennison, 1997, Australia J Experimental Marine Biology and Ecology 217: 253-277).

La secuencia de aminoácidos de la proteína GPT/F:V mutante es como sigue (la sustitución V se muestra en negrita) [SEQ ID NO: 1]:

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Se elaboraron otros dos mutantes de sustitución en este residuo, y uno también fue expresado en E. coli y analizado cinéticamente (mutación F:L), pero mostró un valor mayor (menos deseable) de la Km de 1,98 mM y una Vmáx disminuida de 4,0,

15 En otra metodología de este aspecto de la presente divulgación, pueden diseñarse transgenes de la GPT y/o de la GS para utilizar el uso de codones preferido por la especie vegetal objetivo. En las plantas está bien establecido que el uso de codones varía particularmente entre monocotiledóneas y dicotiledóneas; en general, parece que las monocotiledóneas tienen un mayor uso global de GC, con una preferencia muy pronunciada por GC en la tercera

20 posición de base (Kawabe y Miyashita, 2003, Genes & Genetic Systems 78 (5): 343-52). Se ha correlacionado el sesgo en el uso de los codones con los niveles de expresión de las proteínas (Hiroaka et al., 2009). Por lo tanto, el experto en la materia puede referirse dichas fuentes como Bases de Datos de Uso de Codones o al trabajo de Kawabe y Miyashita, que compara numerosas monocotiledóneas y dicotiledóneas u otra información de la secuencia genómica y usan o deducen el uso preferido de codones de la planta objetivo, y simplemente diseñan y sintetizan la

25 secuencia génica optimizada.

En otra metodología adicional más de este aspecto de la presente divulgación, se usa la modificación del consenso de las estructuras de GPT y/o de GS para generar variantes de consenso que muestran un aumento significativo en la estabilidad de las proteínas con objeto de mejorar la cantidad de actividad de la GPT en la planta. En esta

30 metodología, se modifica la secuencia nativa para que se parezca más a la secuencia consenso derivada de la alineación de numerosas proteínas de una familia en particular (Schiller et al., 1994, J Mol. Biol. 240: 188-192).

Consecuentemente, en ciertas realizaciones, cualquiera de las plantas transgénicas con una expresión modulada de la amidasa ω divulgadas en el presente documento contienen adicionalmente un transgén GPT. En ciertas 35 realizaciones, el transgén GPT es un mutante GPT/F:V codificado por la SEQ ID NO: 1. En otras realizaciones, cualquiera de las plantas transgénicas divulgadas en el presente documento contienen adicionalmente un transgén GPT y un transgén GS. En otras realizaciones más, el transgén GPT y el transgén GS están, cada uno, unidos operativamente a un promotor de preferencia foliar. Según se usa en el presente documento, un "promotor de preferencia foliar" se refiere a la expresión guiada por un promotor que está selectivamente potenciada en las

40 células o los tejidos foliares, en comparación con una o más células o tejidos no foliares. Por ejemplo, un promotor de preferencia foliar puede guiar preferentemente unos elevados niveles de expresión de un gen en las células o los tejidos foliares, pero también puede guiar unos bajos niveles de expresión del gen en otras células o tejidos no foliares, tales como en las raíces.

45 En otras realizaciones, cualquiera de los transgenes divulgados tiene los codones optimizados para su expresión en la planta. En algunas formas de realización adicionales, la planta transgénica tiene un aumento en la proporción entre las hojas y las raíces del 2-oxoglutaramto. En algunas realizaciones preferidas, la proporción entre las hojas y las raíces del 2-oxoglutaramato es al menos dos veces, al menos tres veces, al menos cuatro veces, al menos cinco veces, al menos seis veces, al menos siete veces, al menos ocho veces, al menos nueve veces, al menos diez

50 veces, o más, mayor que la de una planta de la misma especie. En algunas realizaciones adicionales más, la planta transgénica tiene un aumento en la eficacia de uso del nitrógeno.

AUMENTO DE LA BIOSÍNTESIS DEL 2-OXOGLUTARAMATO EN LOS TEJIDOS FOLIARES MEDIANTE UNA

ACTIVACIÓN GÉNICA:

Como otra metodología más, los genes que codifican las proteínas implicadas en la ruta metabólica que produce el 2-oxoglutaramato, genes que pueden estar "silenciados" y no ser expresados en un tipo celular en particular de una planta, pueden ser activados o encendidos a través de metodologías de activación génica, tales como los métodos de recombinación homóloga desarrollados por Transkaryotic Therapies, Inc. (véase, por ejemplo, la Patente de

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5 proteínas reguladoras o combinaciones de estas secuencias. Como resultado, se activa y se expresa una copia endógena de un gen que codifica un producto génico deseado, y no es necesaria la introducción de una copia exógena.

En una realización relacionada puede usarse una regulación por aumento o una sobreexpresión del factor de transcripción para aumentar la transcripción de los genes que favorecen una mayor proporción entre las hojas y las raíces del 2-oxoglutaramato y/o de sus análogos. En una realización, se introduce el factor de transcripción Dof-1 en forma de un transgén con objeto de inducir la regulación por aumento de los genes que codifican las enzimas para la producción del esqueleto carbonado, un notable aumento en el contenido de aminoácidos y una reducción en el nivel de glucosa, como se ha notificado anteriormente en la Arabidopsis transgénica. Se ha demostrado que la

15 sobreexpresión del factor de transcripción Dof-1 mejoraba la asimilación del nitrógeno y el crecimiento en unas condiciones con poco nitrógeno (Yanagisawa et al., 2004, PNAS 101: 7833-7838). En este informe, el factor de transcripción era expresado constitutivamente en la planta. Puede esperarse que la sobreexpresión del factor de transcripción Dof-1, solo o junto con otras medidas tales como la sobreexpresión de la GS y de la GPT (o de mutantes funcionalmente mejorados de las mismas) en los tejidos vegetales aéreos, aumente la proporción entre las hojas y las raíces del 2-oxoglutaramato.

Consecuentemente, en ciertas realizaciones, cualquiera de las plantas transgénicas con una expresión modulada de la amidasa ω divulgadas en el presente documento también contiene un aumento en la expresión de la GPT endógena, en las que la expresión de la GPT endógena está aumentada mediante una activación génica. En

25 algunas realizaciones adicionales más, cualquiera de las plantas transgénicas divulgadas en el presente documento contienen un aumento en la expresión de la GS endógena, en las que la expresión de la GS endógena está aumentada mediante una activación génica. En formas de realización adicionales, la planta transgénica tiene un aumento en la proporción entre las hojas y las raíces del 2-oxoglutaramto. En algunas realizaciones preferidas, la proporción entre las hojas y las raíces del 2-oxoglutaramato es al menos dos veces, al menos tres veces, al menos cuatro veces, al menos cinco veces, al menos seis veces, al menos siete veces, al menos ocho veces, al menos nueve veces, al menos diez veces, o más mayor que la de una planta de la misma especie. En algunas realizaciones adicionales más, la planta transgénica tiene un aumento en la eficacia de uso del nitrógeno.

ALGUNAS PLANTAS TRANSGÉNICAS ADECUADAS:

35 Algunos aspectos de la presente divulgación se refieren a plantas transgénicas. Las plantas transgénicas divulgadas en el presente documento pueden ser cualquier planta vascular de la división Tracheophyta, incluyendo angiospermas y gimnospermas. Las angiospermas pueden ser una planta monocotiledónea (monocot) o dicotiledónea (dicot). Algunas monocotiledóneas importantes incluyen las de las familias de pastos, tales como la familia Poaceae y Graminae, incluyendo plantas del género Avena (Avena sativa, avena), del género Hordeum (es decir, Hordeum vulgare, cebada), del género Oryza (es decir, Oryza sativa, arroz, variedades de cultivo de arroz), del género Panicum (Panicum spp., Panicum virgatum, césped de pradera), del género Phleum (Phleum pratense, césped de jardín), del género Saccharum (es decir, Saccharum officinarum, Saccharum spontaneum, híbridos de los mismos, caña de azúcar), del género Secale (es decir, Secale cereale, centeno), del género Sorghum (Sorghum

45 vulgare, sorgo), del género Triticum (trigo, varias clases, incluyendo T. aestivum y T. durum), del género Fagopyrum (alforfón, incluyendo F. esculentum), del género Triticosecale (Triticale, varios híbridos del trigo y el centeno), del género Chenopodium (quinoa, incluyendo C. quinoa), del género Zea (es decir, Zea mays, numerosas variedades) así como el mijo (es decir, Pennisetum glaucum) incluyendo el género Digitaria (D. exilis).

Algunas importantes dicotiledóneas incluyen las de la familia Solanaceae, tales como plantas del género Lycopersicon (Lycopersicon esculentum, tomate), del género Capiscum (Capsicum annuum, pimiento), del género Solanum (Solanum tuberosum, patata, S. lycopersicum, tomate); del género Manihot (mandioca, M. esculenta), del género Ipomoea (batata, I. batatas), del género Olea (olivo, incluyendo O. europaea); plantas de la familia Gossypium (es decir, Gossypium spp., G. hirsutum, G. herbaceum, algodón); las leguminosas (familia Fabaceae), 55 tales como guisante (Pisum spp., P. sativum), judía (Glycine spp., Glycine max (soja); Phaseolus vulgaris, habichuelas, Vigna radiata, poroto chino), garbanzo (Cicer arietinum)), lenteja (Lens culinaris), cacahuete (Arachis hypogaea); coco (Cocos nucifera) así como otros diversos cultivos importantes tales como camelina (Camelina sativa, familia Brassicaceae), cítricos (Citrus spp., familia Rutaceae), café (Coffea spp., familia Rubiaceae), melón (Cucumis spp., familia Cucurbitaceae), calabaza (Cucurbita spp., familia Cucurbitaceae), rosas (Rosa spp., familia Rosaceae), girasol (Helianthus annuus, familia Asteraceae), remolacha azucarera (Beta spp., familia Amaranthaceae), incluyendo la acelga, B. vulgaris), del género Daucus (zanahoria, incluyendo D. carota), del género Pastinaca (chirivía, incluyendo P. sativa), del género Raphanus (rábano, incluyendo R. sativus), del género Dioscorea (ñame, incluyendo D. rotundata y D. cayenensis), del género Armoracia (rábano picante, incluyendo A. rusticana), del género Elaeis (palma de aceite, incluyendo E. guineensis), del género Linum (lino, incluyendo L. 65 usitatissimum), del género Carthamus (cártamo, incluyendo C. tinctorius L.), del género Sesamum (sésamo, incluyendo S. indicum), del género Vitis (uva, incluyendo Vitis vinifera), y plantas del género Brassica (familia

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Brassicaceae, es decir, brócoli, coles de Bruselas, repollo, nabo sueco, nabo, colza B. napus y coliflor).

Otras plantas específicas que pueden ser transformadas para generar las plantas transgénicas de la presente divulgación incluyen otras diversas frutas y hortalizas, tales como manzanas, espárragos, aguacate, plátano, mora, arándano, coles de Bruselas, repollo, algodón, colza, zanahorias, rábano, pepinos, cerezas, arándanos rojos, melones, berenjenas, pomelos, limones, limas, nectarinas, naranjas, melocotones, piñas, peras, ciruelas, tangelos, tangerinas, papaya, mango, fresa, frambuesa, lechuga, cebolla, uva, kiwi, ocra, chirivías, calabazas y espinacas. Además pueden usarse diversas plantas con flor, árboles y plantas ornamentales para generar variedades transgénicas, incluyendo sin limitación lirio, clavel, crisantemo, petunia, geranio, violeta, gladiolo, lupineo, orquídea y lila.

En ciertas realizaciones, la planta transgénica se selecciona entre trigo, avena, arroz, maíz, judía, soja, tabaco, alfalfa, Arabidopsis, pastos, frutas, legumbres, plantas con flor y árboles.

Otros aspectos de la presente divulgación también se refieren a una descendencia de cualquier generación de cualquiera de las plantas transgénicas divulgadas en el presente documento. Un aspecto adicional se refiere a una semilla de cualquier generación de las plantas transgénicas divulgadas en el presente documento.

PRODUCCIÓN DE PLANTAS TRANSGÉNICAS:

Algunos aspectos de la presente divulgación se refieren a métodos para la generación de plantas transgénicas con un aumento en la eficacia de uso del nitrógeno. A continuación se describen algunos ejemplos de métodos para la producción de plantas transgénicas. Algunos ejemplos adicionales se describen en las Solicitudes de Patente de EE.UU. compartidas pendientes de tramitación nº 12/551.271 y 12/660.501.

CONSTRUCCIONES TRANSGÉNICAS / VECTORES DE EXPRESIÓN:

Con objeto de generar las plantas transgénicas de la presente divulgación, debe incorporarse la secuencia génica codificante del (los) transgén(es) deseado(s) en una construcción de ácido nucleico (denominada también de forma intercambiable en el presente documento vector de expresión (transgén), casete de expresión, construcción de expresión o construcción genética expresable), que pueda dirigir la expresión de la secuencia del transgén en las células vegetales transformadas. Dichas construcciones de ácidos nucleicos portadoras del (los) transgén(es) de interés pueden ser introducidas en una célula o células vegetales mediante el uso de diversos métodos conocidos en la materia, incluyendo, pero no se limitan a, electroporación, bombardeo del ADN o metodologías biolísticas, microinyección y a través del uso de diversos vectores basados en ADN tales como vectores de Agrobacterium tumefaciens y de Agrobacterium rhizogenes. Una vez introducida en la célula vegetal transformada, la construcción de ácido nucleico puede dirigir la expresión del (los) transgén(es) incorporado(s) (es decir, la amidasa ω), tanto de una forma temporal como estable. Se prefiere la expresión estable, y se consigue mediante la utilización de vectores de transformación vegetales que son capaces de dirigir la integración cromosómica de la construcción del transgén. Una vez que una célula vegetal ha sido transformada con éxito, puede ser cultivada para regenerar una planta transgénica.

Se conoce un gran número de vectores de expresión adecuados para dirigir la expresión constitutiva o inducida de los genes insertados en las plantas transformadoras. Además, se conocen varios vectores y sistemas temporales de expresión. En gran medida, los vectores de expresión apropiados se seleccionan para su uso en un método de transformación génica en particular (véase, infra). Hablando ampliamente, un vector de expresión vegetal típico para la generación de plantas transgénicas comprenderá el transgén de interés bajo el control regulador de la expresión de un promotor, un marcador seleccionable para ayudar en la selección de los transformantes, y una secuencia terminadora de la transcripción.

Más específicamente, los elementos básicos de una construcción de ácido nucleico para su uso en la generación de las plantas transgénicas de la presente divulgación son: un promotor adecuado, tal como un promotor de preferencia radicular, capaz de dirigir la expresión funcional del (los) transgén(es) en una célula vegetal transformada, estando el (los) transgén(es) (es decir, la secuencia codificante de la amidasa ω) unido(s) operativamente al promotor, preferentemente una secuencia de terminación de la transcripción adecuada (es decir, un terminador del gen de la enzima sintética nopalina) unido operativamente al transgén, y en algunas ocasiones otros elementos útiles para el control de la expresión del transgén, así como uno o más genes marcadores seleccionables adecuados para la selección del producto transgénico deseado (es decir, genes de resistencia a antibióticos).

Dado que Agrobacterium tumefaciens es el principal sistema de transformación usado para la generación de plantas transgénicas, existen numerosos vectores diseñados para la transformación con Agrobacterium. Para una transformación estable, los sistemas de Agrobacterium utilizan vectores "binarios" que permiten la manipulación del plásmido tanto en E. coli como en Agrobacterium, y normalmente contienen uno o más marcadores seleccionables para la recuperación de las plantas transformadas (Hellens et al., 2000, Technical focus: A guide to Agrobacterium binary Ti vectors. Trends Plant Sci 5: 446-451). Los vectores binarios para su uso en los sistemas de Agrobacterium normalmente comprenden los límites del T-ADN, sitios de clonación múltiple, funciones de replicación para

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Escherichia coli y A. tumefaciens, y genes marcadores seleccionables e indicadores.

Los denominados vectores "super-binarios" proporcionan unas mayores eficacias de transformación, y generalmente comprenden genes de virulencia adicionales de un Ti (Komari et al., 2006, Methods Mol. Biol. 343: 15-41). Los vectores superbinarios se usan normalmente en plantas que muestran unas menores eficacias de transformación, tales como los cereales. Dichos genes de virulencia adicional incluyen, sin limitación, virB, virE y virG (Vain et al., 2004, The effect of additional virulence genes on transformation efficiency, transgene integration and expression in rice plants using the pGreen/pSoup dual binary vector system. Transgenic Res. 13: 593-603; Srivatanakul et al., 2000, Additional virulence genes influence transgene expression: transgene copy number, integration pattern and expression. J. Plant Physiol. 157, 685-690; Park et al., 2000, Shorter T-DNA or additional virulence genes improve Agrobacterium-mediated transformation. Theor. Appl. Genet. 101, 1015-1020; Jin et al., 1987, Genes responsible for the supervirulence phenotype of Agrobacterium tumefaciens A281. J. Bacteriol. 169: 4417-4425).

PROMOTORES VEGETALES:

Con objeto de generar las plantas transgénicas de la presente divulgación, se une operativamente la secuencia codificante del (los) transgén(es) deseado(s) a un promotor con objeto de dirigir la expresión del transgén. En la materia se conocen gran número de promotores que son funcionales en plantas. En la construcción de las construcciones transgénicas de la amidasa ω, la GPT o la GS y de las construcciones de ARNi de la amidasa ω, el (los) promotor(es) seleccionado(s) puede(n) ser constitutivo(s), promotores no específicos, tales como el promotor ribosómico 35S del virus del mosaico de la coliflor (el promotor 35S CaMV), que se emplea ampliamente para la expresión de transgenes en plantas. Algunos ejemplos de otros fuertes promotores constitutivos incluyen, sin limitación, el promotor de la actina del arroz 1, el promotor 19S CaMV, el promotor de la sintetasa de nopalina del plásmido Ti, el promotor de la deshidrogenasa de alcohol y el promotor de la sintetasa de sacarosa.

Alternativamente, en algunas realizaciones puede ser deseable seleccionar un promotor basándose en las células vegetales deseadas que van a ser transformadas por la construcción transgénica, el nivel de expresión deseado del transgén, el tejido o compartimento subcelular deseado para la expresión del transgén, la fase de desarrollo objetivo, y similares. Por ejemplo, un promotor de preferencia radicular puede incluir, sin limitación, un promotor RolD, un promotor RolD-2, un promotor de la proteína rica en glicina, un promotor GRP, un promotor ADH, un promotor del maíz ADH1, un promotor PHT, un promotor de la familia del gen Pht1, un promotor de la proteína de captación de metales, un promotor de la proteína metalotioneína del maíz, un promotor del dominio A 35S CaMV, un promotor pDJ3S, un promotor SIREO, un promotor pMe1, un promotor Sad1, un promotor Sad2, un promotor TobRB7, un promotor RCc3, un promotor FaRB7, un promotor SPmads, un promotor IDS2, un promotor pyk10, un promotor de la leghemoglobina Lbc3, un promotor PEPC, un promotor de la glucanasa radicular Gns1, un promotor 35S2, un promotor GI4, un promotor GI5 y un promotor GRP

Además de los promotores constitutivos, pueden emplearse varias secuencias promotoras inducibles en los casos en los que es deseable regular la expresión del transgén según la planta transgénica se regenera, madura, florece, etc. Algunos ejemplos de dichos promotores inducibles incluyen promotores de los genes de choque térmico, los genes de respuesta a la protección (es decir, liasa de amonio fenilalanina; véase, por ejemplo Bevan et al., 1989, EMBO J. 8 (7): 899-906), los genes de respuesta a las heridas (es decir, los genes de la proteína de la pared celular), los genes inducibles químicamente (es decir, reductasa de nitrato, quitinasa) y los genes inducibles en la oscuridad (es decir, sintetasa de asparragina; véase, por ejemplo la Patente de EE.UU. nº 5.256.558). También, varios genes nucleares vegetales son activados por la luz, incluyendo familias de genes que codifican las principales proteínas de unión a la clorofila a/b (cab), así como la subunidad pequeña de la carboxilasa de ribulosa-1,5bisfosfato (rbcS) (véase, por ejemplo, Tobin y Silverthorne, 1985, Annu. Rev. Plant Physiol. 36: 569-593; Dean et al., 1989, Annu. Rev. Plant Physiol. 40: 415-439).

Otros promotores inducibles incluyen promotores ABA y turgor inducibles, el promotor del gen de la proteína de unión a la auxina (Schwob et al., 1993, Plant J. 4 (3): 423-432), el promotor del gen de la UDP glucosa transferasa de flavonoide glicosilo (Ralston et al., 1988, Genetics 119 (1): 185-197); el promotor inhibidor de la proteinasa MPI (Cordero et al., 1994, Plant J. 6 (2): 141-150), el promotor del gen de la deshidrogenasa de gliceraldehído-3-fosfato (Kohler et al., 1995, Plant Mol. Biol. 29 (6): 1293-1298; Quigley et al., 1989, J. Mol. Evol. 29 (5): 412-421; Martínez et al., 1989, J. Mol. Biol. 208 (4): 551-565) y el gen inducible por la luz de la sintetasa de glutamina plastídica del guisante (Patente de EE.UU. nº 5.391.725; Edwards et al., 1990, supra).

Para una revisión de los promotores vegetales usados en la tecnología vegetal de plantas transgénicas, véase Potenza et al., 2004, In Vitro Cell. Devel. Biol -Plant, 40 (1): 1-22. Para una revisión del diseño de promotores vegetales sintéticos, véase, por ejemplo, Venter, M., 2007, Trends Plant Sci., 12 (3): 118-124.

En ciertas realizaciones también se incorpora una secuencia de terminación de la transcripción en 3’ secuencia abajo del transgén con objeto de dirigir la terminación de la transcripción, y permite una correcta poliadenilación del transcrito de ARNm. Algunos terminadores de la transcripción adecuados son aquellos que son conocidos por funcionar en las plantas, incluyendo sin limitación, los genes de la sintasa de nopalina (NOS) y de la sintasa de octopina (OCS) de Agrobacterium tumefaciens, el transcrito T7 de la sintasa de octopina, el extremo 3’ de los genes del inhibidor de la proteasa I o II de la patata o del tomate, el terminador 35S CaMV, el terminador tml y el terminador E9 rbcS de guisante. Además, puede usarse un terminador de la transcripción natural del gen. En algunas realizaciones específicas, descritas a través de los siguientes Ejemplos, se emplea un terminador de la transcripción de la sintasa de nopalina.

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5 MARCADORES SELECCIONABLES:

Los marcadores seleccionables se incluyen normalmente en los vectores de expresión transgénicos con objeto de proporcionar un medio para seleccionar los transformantes vegetales. Aunque hay disponibles diversos tipos de marcadores, normalmente se utilizan varios marcadores de selección negativa, incluyendo aquellos que confieren resistencia a un agente de selección que inhibe o destruye las células no transformadas, tales como los genes que imparten resistencia a un antibiótico (tal como kanamicina, gentamicina, anamicina, higromicina e higromicina B) o resistencia a un herbicida (tal como sulfonilurea, gulfosinato, fosfinotricina y glifosato). Algunos marcadores cribables incluyen, por ejemplo, genes que codifican la glucuronidasa β (Jefferson, 1987, Plant Mol. Biol. Rep 5: 387-405),

15 genes que codifican la luciferasa (Ow et al., 1986, Science 234: 856-859) y varios genes que codifican las proteínas implicadas en la producción o el control de los pigmentos de antocianina (véase, por ejemplo, la Patente de EE.UU.6.573.432). Él gen de la glucuronidasa de E. coli (gus, gusA o uidA) se ha convertido en un marcador de selección usado ampliamente en plantas transgénicas, especialmente debido a la estabilidad de la enzima glucuronidasa, la elevada sensibilidad y la facilidad de detección (por ejemplo, fluorimétrica, espectrofotométrica, varios métodos histoquímicos). Además, esencialmente no hay glucuronidasa detectable en la mayor parte de las especies vegetales superiores.

METODOLOGÍAS Y SISTEMAS DE TRANSFORMACIÓN:

25 Los expertos en la materia conocen diversos métodos para la introducción de las construcciones del vector de expresión del transgén de la presente divulgación en una planta o en una célula vegetal, y puede utilizarse cualquiera capaz de transformar la planta o la célula vegetal objetivo.

La transformación mediada por Agrobacterium es quizás el método más común utilizado en plantas transgénicas, y los protocolos para la transformación mediada por Agrobacterium de un gran número de plantas están ampliamente descritos en la bibliografía (véase, por ejemplo, Agrobacterium Protocols, Wan, ed., Humana Press, 2ª edición, 2006). Agrobacterium tumefaciens es una bacteria gramnegativa del suelo que provoca tumores, la enfermedad de la agalla en corona) en una gran cantidad de especies de dicotiledóneas, a través de la inserción de un pequeño segmento de ADN inductor del tumor ("T-ADN", ’ADN de transferencia’) en la célula vegetal, que es incorporado en

35 una ubicación semialeatoria en el genoma de la planta, y que finalmente queda incorporado de forma estable allí. Las secuencias de ADN repetidas directamente, denominadas T-ADN limítrofes, definen los extremos izquierdo y derecho del T-ADN. El T-ADN puede ser separado físicamente del resto del plásmido Ti, creando un sistema de ’vector binario’.

La transformación con Agrobacterium puede usarse para transformar de forma estable dicotiledóneas, monocotiledóneas y células de las mismas (Rogers et al., 1986, Methods Enzymol., 118: 627-641; Hernalsteen et al., 1984, EMBO J., 3: 3039-3041; Hoykass-Van Slogteren et al., 1984, Nature, 311: 763-764; Grimsley et al., 1987, Nature 325: 167-1679; Boulton et al., 1989, Plant Mol. Biol. 12: 31-40; Gould et al., 1991, Plant Physiol. 95: 426-434). Se conocen diversos métodos para la introducción del ADN en Agrobacteria, incluyendo electroporación, métodos

45 de congelación, descongelación, y cruce triparental. El método más eficaz para colocar el ADN foráneo en Agrobacterium es a través de una electroporación (Wise et al., 2006, Three Methods for the Introduction of Foreign DNA in Agrobacterium, Methods in Molecular Biology, vol. 343: Agrobacterium Protocols, 2/e, volumen 1; Ed., Wang, Humana Press Inc., Totowa, NJ, páginas 43-53). Además, dado que un gran porcentaje de los T-ADN no se integra, la transformación mediada por Agrobacterium puede usarse para obtener una expresión temporal de un transgén a través de una competencia transcripcional de las moléculas de la construcción del transgén no incorporadas (Helens et al., 2005, Plant Methods 1: 13).

Se ha descrito un gran número de vectores y métodos de transformación con Agrobacterium (Karimi et al., 2002, Trends Plant Sci. 7 (5): 193-5), y muchos de dichos vectores pueden obtenerse comercialmente (por ejemplo,

55 Invitrogen, Carlsbad, CA). Además, hay disponible un creciente número de vectores de transformación de Agrobacterium de "fuente abierta" (por ejemplo, los vectores pCambia; Cambia, Canberra, Australia). Véase, también, la subsección del presente documento TRANSGENE CONSTRUCTS, supra. En una realización específica descrita adicionalmente en los Ejemplos, se usó un vector basado en pMON316 en el sistema de transformación del disco foliar de Horsch et al. (Horsch et al., 1995, Science 227: 1229-1231) para generar plantas de tabaco y de tomate transgénicas con un crecimiento mejorado.

Otros métodos de transformación usados habitualmente que pueden emplearse en la generación de las plantas transgénicas de la presente divulgación incluyen, sin limitación el bombardeo con microproyectiles, o métodos de transformación biolísticos, la transformación en los protoplastos de un ADN desnudo por parte de calcio, 65 polietilenglicol (PEG) o una electroporación (Paszkowski et al., 1984, EMBO J. 3: 2727-2722; Potrykus et al., 1985, Mol. Gen. Genet. 199: 169-177; Fromm et al., 1985, Proc. Nat. Acad. Sci. EE.UU. 82: 5824-5828; Shimamoto et al.,

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1989, Nature, 338: 274-276.

La transformación biolística implica la inyección de millones de partículas metálicas recubiertas con ADN en las células o los tejidos objetivo mediante el uso de un dispositivo biolístico (o "pistola génica"), numerosos tipos de los

5 cuales están disponibles comercialmente. Una vez en el interior de la célula, el ADN eluye fuera de las partículas, y una porción puede ser incorporada de forma estable en uno o más de los cromosomas de la célula (para una revisión, véase Kikkert et al., 2005, Stable Transformation of Plant Cells by Particle Bombardment/Biolistics, en: Methods in Molecular Biology, vol. 286: Transgenic Plants: Methods and Protocols, Ed. L. Peña, Humana Press Inc., Totowa, NJ).

La electroporación es una técnica que utiliza unos cortos campos eléctricos de alta intensidad para permeabilizar de forma reversible las bicapas lipídicas de las membranas celulares (véase, por ejemplo, Fisk y Dandekar, 2005, Introduction and Expression of Transgenes in Plant Protoplasts, en: Methods in Molecular Biology, vol. 286: Transgenic Plants: Methods and Protocols, Ed. L. Peña, Humana Press Inc., Totowa, NJ, páginas 79-90; Fromm et 15 al., 1987, Electroporation of DNA and RNA in plant protoplasts, en Methods in Enzymology, Vol. 153, Wu y Grossman, eds., Academic Press, Londres, Reino Unido, páginas 351-366; Joersbo y Brunstedt, 1991, Electroporation: mechanism and transient expression, stable transformation and biological effects in plant protoplasts. Physiol. Plant. 81, 256-264; Bates, 1994, Genetic transformation of plants by protoplast electroporation. Mol. Biotech. 2: 135-145; Dillen et al., 1998, Electroporation-mediated DNA transfer to plant protoplasts and intact plant tissues for transient gene expression assays, en Cell Biology, Vol. 4, ed., Celis, Academic Press, Londres, Reino Unido, páginas 92-99). La técnica funciona mediante la creación de poros acuosos en la membrana celular, que tienen un tamaño lo suficientemente grande como para permitir que las moléculas de ADN (y otras macromoléculas) entren en la célula, donde la construcción de la expresión del transgén (en forma de un T-ADN) puede ser incorporada de forma estable en el ADN genómico de la planta, dando lugar a la generación de células

25 transformadas que pueden ser posteriormente regeneradas en plantas transgénicas.

Los nuevos métodos de transformación incluyen los denominados métodos de "inmersión floral", que ofrecen la promesa de simplicidad sin la necesidad de cultivar el tejido vegetal, como es el caso con todas los metodologías de trasformación usadas habitualmente (Bent et al., 2006, Arabidopsis thaliana Floral Dip Transformation Method, Methods Mol Biol, vol. 343: Agrobacterium Protocols, 2/e, volumen 1; Ed., Wang, Humana Press Inc., Totowa, NJ, páginas 87-103; Clough y Bent, 1998, Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana, Plant J. 16: 735-743). Sin embargo, con la excepción de Arabidopsis, estos métodos no se han usado ampliamente a lo largo de un amplio espectro de diferentes especies vegetales. En resumen, la transformación por inmersión floral se lleva a cabo sumergiendo pulverizando las plantas en floración con una cepa

35 apropiada de Agrobacterium tumefaciens. Las semillas escogidas a partir de estas plantas T0 son germinadas a continuación bajo selección para identificar los individuos transgénicos en T1. El Ejemplo 16 demostraba la inoculación por inmersión floral de Arabidopsis para generar plantas transgénicas de Arabidopsis.

Otros métodos de transformación incluyen aquellos en los que las semillas en desarrollo o plántulas de las plantas son transformadas mediante el uso de vectores tales como vectores de Agrobacterium. Por ejemplo, dichos vectores pueden usarse para la transformación de las semillas en desarrollo mediante la inyección de una suspensión o de una mezcla del vector (es decir, Agrobacteria) directamente en la cavidad de la semilla de las vainas en desarrollo (es decir, vainas de pimienta, vainas de judías, vainas de guisantes y similares). Otros métodos de transformación adicionales incluyen aquellos en los que la inoculación del vector se dirige a la estructura de la flor.

45 Además, aunque los transgenes son insertados lo más habitualmente en el ADN nuclear de las células vegetales, los transgenes también pueden ser insertados en el ADN plastídico (es decir, en el plastoma del cloroplasto). En la mayoría de las plantas con flor, los plástidos no aparecen en las células del polen, y por lo tanto el ADN transgénico incorporado en un plastoma no pasará a través de una propagación, restringiendo así la migración del rasgo a las plantas silvestres. Sin embargo, la formación del plástido es más compleja que la transformación del núcleo de la célula, debido a la presencia de muchos miles de plastomas por célula (tantos como 10.000). Las líneas transplastómicas son genéticamente estables únicamente si todas las copias del plástido están modificadas de la misma forma, es decir, uniformemente. Esto se consigue normalmente a través de una regeneración repetida en ciertas condiciones de selección para eliminar los plástidos no transformados, mediante la segregación de los plástidos transplastómicos y no transformados, dando como resultado la selección de las células homoplásmicas

55 portadoras de la construcción transgénica y con el marcador seleccionable integrado de forma estable en las mismas. La transformación plastídica se ha llevado a cabo con éxito en diversas especies vegetales, incluyendo tabaco, patata, colza, arroz y Arabidopsis.

Para la generación de las líneas transplastómicas portadoras de un transgén de la amidasa ω, se inserta el casete de expresión del transgén en las secuencias flanqueantes del plastoma. Mediante el uso de una recombinación homóloga, el casete de expresión del transgén queda integrado en el plastoma a través de un proceso de recombinación natural. Las técnicas básicas de administración de ADN para la transformación de plástidos incluyen el bombardeo con partículas de las hojas o la transformación del ADN mediada por polietilenglicol de los protoplastos. Las plantas transplastómicas portadoras de los transgenes en el plastoma pueden ser expresadas a 65 unos niveles muy altos, debido al hecho de que hay muchos plástidos (es decir, cloroplastos) por célula, portador cada uno de muchas copias del plastoma. Este es particularmente el caso en el tejido foliar, en el que una única

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célula foliar madura puede contener más de 10.000 copias del plastoma. Después de una transformación con éxito del plastoma, los acontecimientos transplastómicos llevan el transgén de cada copia del material genético del plástido. Esto puede dar como resultado unos niveles de expresión del transgén que representan tanto como la mitad del total de proteína producido en la célula.

5 Los métodos de transformación de plástidos y los sistemas de vectores se describen, por ejemplo, en las recientes patentes de EE.UU. nº 7.528.292; 7.371.923; 7.235.711; y 7.193.131. Véanse también las patentes de EE.UU. nº

6.680.426 y 6.642.053.

Las anteriores metodologías de transformación vegetales pueden usarse para la introducción de al menos un transgén en varias células y tejidos vegetales diferentes, incluyendo, sin limitación, plantas completas, explantes de tejidos y de órganos, incluyendo cloroplastos, tejidos y células en floración, protoplastos, células del meristemo, callos, embriones inmaduros y células gaméticas tales como células microesporas, polen, células espermáticas y ovocíticas, células tisulares cultivadas de cualquiera de las anteriores, cualquier otra célula a partir de la cual pueda

15 generarse una planta transgénica regenerada fértil. El callo es iniciado a partir de fuentes tisulares que incluyen, pero no se limitan a, embriones inmaduros, meristemos apicales de plántulas, microesporas y similares. Las células capaces de proliferar en forma de callos también son células receptoras para la transformación genética.

Los métodos para la regeneración de plantas individuales a partir de células, tejidos u órganos vegetales transformados son conocidos y están descritos para numerosas especies vegetales.

Como ilustración, se cultivan los plantones transformados (derivados de células o de tejidos transformados) en un medio de crecimiento permisivo con la raíz complementado con el agente selectivo usado en la estrategia de transformación. Una vez enraizados, los plantones transformados se transfieren a continuación al suelo y se dejan

25 crecer hasta la madurez. Después de la floración, las plantas maduras son preferentemente autofecundadas (autofertilizadas), y las semillas resultantes se recogen y se usan para el cultivo de generaciones posteriores.

Las plantas transgénicas T0 pueden usarse para la generación de generaciones posteriores (por ejemplo, T1, T2, etc.) mediante una autofecundación de los transformantes primarios o secundarios, o mediante un cruce sexual de los transformantes primarios o secundarios con otras plantas (transformadas o no transformadas). Durante la etapa de crecimiento de la planta madura, normalmente las plantas son analizadas para evaluar el fenotipo de crecimiento, la eficacia de uso del nitrógeno, la tasa de fijación de CO2, etc. (véase la siguiente subsección).

SELECCIÓN DE LAS PLANTAS TRANSGÉNICAS CON UN AUMENTO EN LA EFICACIA DE USO DEL

35 NITRÓGENO:

Las plantas transgénicas pueden ser seleccionadas, cribadas y caracterizadas mediante el uso de las metodologías habituales. Las plantas transgénicas preferidas de la presente divulgación mostrarán una o más características fenotípicas indicativas del aumento en la eficacia de uso del nitrógeno, incluyendo sin limitación, unas velocidades de crecimiento más rápidas, unos mayores rendimientos de semillas y de frutas/vainas, una floración más temprana y más productiva, un aumento en la tolerancia a unas elevadas condiciones salinas y un aumento en los rendimientos de la biomasa. Las plantas transgénicas normalmente son regeneradas bajo una presión selectiva con objeto de seleccionar los transformantes antes de la creación de las posteriores generaciones de plantas transgénicas. Además, la presión selectiva usada puede emplearse más allá de las generaciones T0 con el fin de

45 garantizar la presencia de la construcción o el casete de expresión transgénico deseado.

Las células, los callos, los tejidos vegetales o las plantas transformadas T0 pueden ser identificados y aislados mediante la selección o el cribado según la composición genética y/o las características fenotípicas codificadas por los genes marcadores contenidos en la construcción de expresión transgénica usada para la transformación. Por ejemplo, la selección puede llevarse a cabo mediante el cultivo de las plantas, los tejidos o las células potencialmente transformados en un medio de crecimiento que contenga una cantidad represora de antibiótico o de herbicida frente a la cual la construcción genética transformante puede impartir resistencia. Además, las células, los tejidos vegetales y las plantas transformadas pueden ser identificados mediante el cribado de la actividad de los genes marcadores (es decir, la glucuronidasa β) que pueden estar presentes en la construcción de expresión

55 transgénica.

Pueden emplearse diversos métodos físicos y bioquímicos para la identificación de las plantas que contienen la construcción de expresión transgénica deseada, como es bien conocido. Algunos ejemplos de dichos métodos incluyen un análisis por inmunotransferencia Southern o varios métodos de amplificación de ácidos nucleicos (es decir, una PCR) para la identificación del transgén, de la construcción de expresión transgénica o de los elementos de los mismos, una inmunotransferencia Northern, una protección con RNasa S1, una amplificación mediante una PCR con transcriptasa inversa (RT-PCR) para la detección y la determinación de los productos de transcripción del ARN, y una electroforesis en gel de la proteína, una inmunotransferencia Western, una inmunoprecipitación, un enzimoinmunoensayo, y similares, pueden usarse para la identificación de la proteína codificada y expresada por el

65 transgén.

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En otra metodología, los niveles de expresión de los genes, de las proteínas y/o de los compuestos metabólicos que se sabe que están modulados por la expresión del transgén en la planta objetivo pueden usarse para la identificación de los transformantes. En una realización de la presente divulgación puede usarse el aumento en los niveles del metabolito de señalización 2-oxoglutaramato en el tejido foliar, o la disminución de los niveles en el tejido radicular, o una mayor proporción entre las hojas y las raíces del 2-oxoglutaramato, para el cribado de los transformantes deseables.

Finalmente, pueden cribarse las plantas transformadas de la presente divulgación según un aumento en la eficacia de uso del nitrógeno. La eficacia de uso del nitrógeno puede ser expresada en forma del crecimiento vegetal para una cantidad dada de nitrógeno. De hecho, generalmente es deseable un cierto grado de cribado fenotípico con objeto de identificar las líneas transformadas con las velocidades de crecimiento más rápidas, los mayores rendimientos de semillas, etc., particularmente cuando se identifican plantas para una autofecundación, un cruce y un retrocruce posteriores. Para este fin pueden usarse diversos parámetros que incluyen, sin limitación, las velocidades de crecimiento, los pesos en fresco totales, los pesos en seco, los rendimientos de semillas y frutos (número, peso), los tamaños de las semillas y/o de las vainas de las semillas, los rendimientos de las vainas de semillas (por ejemplo, número, peso), el tamaño de las hojas, el tamaño de las plantas, el aumento en la floración, el tiempo hasta la floración, el contenido global de proteína (en las semillas, los frutos y los tejidos vegetales), el contenido específico de proteína (es decir, en amidasa ω), el contenido de nitrógeno, los aminoácidos libres y los niveles del compuesto metabólico específico (es decir, de 2-oxoglutaramato). Generalmente, estas mediciones fenotípicas se comparan con las obtenidas a partir de una línea vegetal idéntica o análoga, una planta idéntica o análoga no transformada o una planta de tipo silvestre idéntica o análoga (es decir, una planta normal o parental). Preferiblemente, y al menos inicialmente, la medición de la(s) característica(s) elegida(s) fenotípica(s) en la planta transgénica objetivo se lleva a cabo en paralelo con la medición de la(s) misma(s) característica(s) en una planta normal o parental. Normalmente se usan múltiples plantas para establecer la deseabilidad y/o la superioridad fenotípica de la planta transgénica con respecto a cualquier característica fenotípica en particular.

Preferiblemente, se seleccionan los transformantes iniciales y después se usan para la generación de la T1 y de las generaciones posteriores mediante una autofecundación (autofertilización), hasta que el genotipo transgénico sea verdadero (es decir, la planta es homocigótica para el transgén). En la práctica esto se lleva a cabo mediante el cribado en cada generación de los rasgos deseados y la autofecundación de esos individuos, a menudo de forma repetida (es decir, 3 o 4 generaciones). Como se ejemplifica en el presente documento, las líneas de plantas transgénicas propagadas a través de al menos una generación sexual (tabaco, Arabidopsis, tomate) mostraron unas mayores actividades del producto transgénico en comparación con las líneas que no tenían el beneficio de la reproducción sexual y el concomitante aumento en el número de copias del transgén.

Las líneas transgénicas estables pueden cruzarse y retrocruzarse para crear variedades con cualquier cantidad de rasgos deseados, incluyendo aquellas con transgenes apilados, múltiples copias de un transgén, etc. Los diversos métodos de cruce habituales son bien conocidos por los expertos en la materia (véase, por ejemplo, Breeding Methods for Cultivar Development, Wilcox J. ed., American Society of Agronomy, Madison Wis. (1987)). Adicionalmente, las plantas transgénicas estables pueden ser modificadas adicionalmente genéticamente mediante la transformación de dichas plantas con transgenes o copias adicionales del transgén parental. También se contemplan las plantas transgénicas creadas mediante acontecimientos de transformación individuales que introducen múltiples copias de un transgén dado o múltiples transgenes.

La eficacia de uso del nitrógeno puede ser expresada en forma del rendimiento de la planta por cantidad dada de nitrógeno.

MÉTODOS PARA EL AUMENTO DE LA EFICACIA DE USO DEL NITRÓGENO:

Algunos aspectos de la presente divulgación se refieren a métodos para el aumento de la eficacia de uso del nitrógeno de una planta.

Un aspecto en particular se refiere a un método para el aumento de la eficacia de uso del nitrógeno de una planta con respecto a la planta de tipo silvestre o no trasformada de la misma especie, mediante: (a) la introducción de un transgén de la amidasa ω en la planta, en la que el transgén de la amidasa ω está unido operativamente a un promotor de preferencia radicular; (b) la expresión del transgén de la amidasa ω en el tejido radicular de la planta o de la descendencia de la planta; y (c) la selección de una planta que tiene un aumento en la proporción entre las hojas y las raíces del 2-oxoglutaramato con respecto a una planta de la misma especie que no contiene un transgén de la amidasa ω, en el que el aumento en la proporción entre las hojas y las raíces del 2-oxoglutaramato da como resultado un aumento en la eficacia de uso del nitrógeno.

En ciertas realizaciones, el transgén de la amidasa ω codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos el 90 % a una secuencia de aminoácidos codificada por un polipéptido seleccionado entre AAL91613.1, ACN30911.1, ABK22312.1, ACJ85250,1, AAQ97821.1, CBJ25483.1, EFN54567.1, NP_196765.2, XP_002871509.1, NP_974769.1, XP_002309478.1, XP_002279687.1, NP_001146676.1,

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NP_001146295.1, NP_001049134.1, XP_002516116.1, XP_001766085.1, XP_001756522.1, XP_002969787.1, XP_002985119.1, XP_002948137.1, XP_001690839.1, NP_001057093.1, XP_002468410,1, NP_064587.1, XP_001089575.2, XP_001502234.1, XP_002502298.1, XP_526254.2, XP_535718.2, XP_002716659.1, NP_001033222.1, NP_001029298.1, NP_001016633.1, NP_001085409.1, XP_002758928.1, XP_003064056.1, NP_001135127.1, XP_001622809.1, NP_991174.2, XP_002594716.1, NP_075664.1, XP_001370849.1, NP_001090454.1, XP_002999170,1, XP_002917137.1, XP_002741281.1, XP_002131764.1, NP_594154.1, XP_001742101.1, XP_416604.2, XP_001599587.1, XP_002410555.1, XP_003035898.1, XP_002183613.1, XP_001875493.1, XP_636983.1, XP_002158547.1, ZP_08115581.1, YP_001320997.1 XP_002173486.1, XP_001212538.1 XP_967861.1, XP_002426154.1, XP_001393123.1, ZP_03608460,1, XP_001588734.1, YP_001273073.1 YP_003780301.1, NP_013455.1, YP_001113615.1, XP_001247884.1 XP_002839272.1, XP_369268.1, XP_001258462.1 XP_003176259.1, XP_002147261.1, XP_001552800,1 XP_002404736.1, XP_390426.1, XP_307722.3, XP_001819629.1, XP_002626458.1, XP_751200,1, XP_002434512.1, XP_960906.1, XP_500602.1, XP_001428419.1, ZP_03293831.1, XP_002290043.1, XP_446414.1, XP_002792830,1, YP_001086961.1, ZP_05328587.1, XP_003025334.1, XP_002052999.1 XP_002194275.1, XP_002112209.1, XP_001268376.1, XP_001657673.1, XP_002847679.1, XP_003014235.1, XP_003065597.1, XP_001998501.1, ZP_05399936.1, , YP_769862.1, ZP 07325748.1, ZP 05349666.1, YP 471237.1, YP 002977603.1, YP 001202760,1, ZP 07592670.1 y NP_386723.1. En otras realizaciones, el transgén de la amidasa ω es incorporado en el genoma de la planta. En otras realizaciones más, el promotor de preferencia radicular se selecciona entre el promotor RoID, el promotor RoID-2, el promotor de la proteína rica en glicina, el promotor GRP, el promotor ADH, el promotor del maíz ADH1, el promotor PHT, el promotor de la familia del gen Pht1, el promotor de la proteína de captación de metales, el promotor de la proteína metalotioneína del maíz, el promotor del dominio A 35S CaMV, el promotor pDJ3S, el promotor SIREO, el promotor pMe1, el promotor Sad1, el promotor Sad2, el promotor TobRB7, el promotor RCc3, el promotor FaRB7, el promotor SPmads, el promotor IDS2, el promotor pyk10, el promotor de la leghemoglobina Lbc3, el promotor PEPC, el promotor de la glucanasa radicular Gns1, el promotor 35S2, el promotor GI4, el promotor GI5, el promotor y el promotor GRP.

En otras realizaciones, se inhibe la expresión de la amidasa ω endógena en el tejido foliar. En otras realizaciones más, la expresión de la amidasa ω endógena en el tejido foliar se inhibe mediante una disrupción del gen recesivo, un silenciamiento del gen dominante o un inhibidor químico. En otras realizaciones más, la expresión de la amidasa ω endógena en el tejido foliar se inhibe mediante una disrupción del gen recesivo seleccionada entre un gen de la amidasa ω mutante que elimina la expresión de la amidasa ω endógena, un mutante inactivado de la amidasa ω endógena y un mutante reducido de la amidasa ω endógena. En algunas formas de realización adicionales, la expresión de la amidasa ω endógena en el tejido foliar se inhibe mediante un oligonucleótido de ARNi antisentido que es específico para el gen de una amidasa ω endógena. En algunas realizaciones adicionales más, la expresión de la amidasa ω endógena en el tejido foliar se inhibe mediante un inhibidor químico seleccionado entre 6-diazo-5oxo-nor-leucina, p-hidroximarcuribenzoato, fluorofosfatos de diisopropilo, cianuro de sodio, acetato de fenilmercurio, acetato de yodo, nitrato de plata, ácido cloromercuricofenilsulfónico y sulfato de cobre.

En otras realizaciones, la proporción entre las hojas y las raíces del 2-oxoglutaramato es al menos dos veces mayor que la de una planta progenitora de tipo silvestre de la misma especie. En otras realizaciones más, la planta contiene adicionalmente un transgén GPT. En otras realizaciones más, el transgén GPT es un mutante GPT/F:V codificado por la SEQ ID NO: 1. En formas de realización adicionales, la planta comprende adicionalmente un transgén GPT y un transgén GS. En otras realizaciones, el transgén GPT y el transgén GS están unidos cada uno operativamente a un promotor de preferencia foliar. En algunas realizaciones adicionales más, la expresión de la GPT endógena en la planta se aumenta mediante una activación génica. En otras realizaciones más, la expresión de la GS endógena en la planta se aumenta mediante una activación génica. En otras realizaciones, cada transgén tiene optimizados los codones para su expresión en la planta.

Otro aspecto se refiere a un método para aumentar la eficacia de uso del nitrógeno de una planta con respecto a una planta de tipo silvestre con otras formada de la misma especie, mediante: (a) la inhibición de la expresión de la amidasa ω endógena en el tejido foliar de la planta; y (b) la selección de una planta que tiene un aumento en la proporción entre las hojas y las raíces del 2-oxoglutaramato con respecto a una planta de la misma especie que no tiene inhibida la expresión de la amidasa ω endógena en el tejido foliar, en el que el aumento en la proporción entre las hojas y las raíces del 2-oxoglutaramato da como resultado en aumento en la eficacia de uso del nitrógeno.

En ciertas realizaciones, la expresión de la amidasa ω endógena en el tejido foliar se inhibe mediante una disrupción del gen recesivo, un silenciamiento del gen dominante o un inhibidor químico. En otras realizaciones, la expresión de la amidasa ω endógena en el tejido foliar se inhibe mediante una disrupción del gen recesivo seleccionada entre un gen de la amidasa ω mutante que elimina la expresión de la amidasa ω endógena, un mutante inactivado de la amidasa ω endógena y un mutante reducido de la amidasa ω endógena. En otras realizaciones más, la expresión de la amidasa ω endógena en el tejido foliar se inhibe mediante un oligonucleótido de ARNi antisentido que es específico para un gen de la amidasa ω endógena. En otras realizaciones más, el inhibidor químico se selecciona entre 6-diazo-5-oxo-nor-leucina, benzoato de p-hidroximercurio, fluorofosfatos de diisopropilo, cianuro de sodio, acetato de fenilmercurio, acetato de yodo, nitrato de plata, ácido cloromercuricofenilsulfónico y sulfato de cobre.

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En otras realizaciones, la planta contiene adicionalmente un transgén de la amidasa ω, en el que el transgén de la amidasa ω está unido operativamente a un promotor de preferencia radicular. En otras realizaciones más, la proporción entre las hojas y las raíces del 2-oxoglutaramato es al menos dos veces mayor que la de una planta progenitora silvestre de la misma especie. En otras realizaciones más, la planta contiene adicionalmente un transgén 5 GPT. En algunas formas de realización adicionales, el transgén GPT es un mutante GPT/F:V codificado por la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones adicionales más, la planta comprende adicionalmente un transgén GPT y un transgén GS. En otras realizaciones, el transgén GPT y el transgén GS están unidos cada uno operativamente a un promotor de preferencia foliar. En algunas realizaciones adicionales más, la expresión de la GPT endógena en la planta se aumenta mediante una activación génica. En otras realizaciones, la expresión de la GS endógena en la

10 planta se aumenta mediante una activación génica. En otras realizaciones, cada transgén tiene optimizados los codones para su expresión en la planta.

En algunas formas de realización adicionales de los métodos para el aumento de la eficacia de uso del nitrógeno de una planta, la planta puede contener otros transgenes que se sabe que aumentan la eficacia de utilización del

15 nitrógeno, incluyendo, sin limitación, los descritos en la Patente de EE.UU. nº 7.560.626.

En los Ejemplos proporcionados en el presente documento, tanto las plantas con el transgén como las de control recibieron las mismas soluciones de nutrientes en las mismas cantidades. Las plantas transgénicas se caracterizaban coherentemente por unos mayores rendimientos, y por lo tanto tienen una mayor eficacia de uso del

20 nitrógeno.

EJEMPLOS:

EJEMPLO 1: EFECTOS DEL AUMENTO EN LOS NIVELES DE EXPRESIÓN DE LA GS Y DE LA GPT SOBRE LA 25 RUTA DE LA AMIDASA Ω

Materiales y métodos:

Generación de las plantas transgénicas: se modificaron genéticamente plantas para que sobreprodujeran el 2

30 oxoglutaramato mediante la sobreexpresión de los transgenes GS y GPT, según se describe en la Solicitud de Patente de EE.UU. con el número de serie 12/551.271. Se evaluaron los efectos fenotípicos resultantes. Se generaron conjuntos de tres líneas de tabaco transgénicas: un conjunto sobreexpresaba la GPT para aumentar la capacidad catalítica de la GRMT; un segundo conjunto sobreexpresaba la GS para aumentar, únicamente en las hojas, la capacidad catalítica para elaborar el sustrato de glutamina de la GPT; y un tercer conjunto sobreexpresaba

35 la GS y la GPT, producido mediante el cruce sexual de la descendencia de rápido crecimiento de las líneas transgénicas individuales.

Crecimiento del tabaco y de Arabidopsis modificadas: se esterilizó la superficie de las semillas del tabaco silvestre y modificado y se germinó en fitobandejas que contienen medio M&S. El medio de las plantas modificadas contenía 40 kanamicina (10 µg/ml). Las plántulas en vigoroso crecimiento fueron transferidas a los 17 d a un cultivo de arena, cubiertas con una humedad de control durante 4 d para ayudar a su adaptación a las condiciones ambientales; a las plantas se les proporcionó de forma continua una solución nutriente (Knight y Langston-Unkefer, 1988, Science 241: 951) que contiene KNO3 10 mM. Las condiciones de crecimiento eran como se han descrito previamente (Knight y Langston-Unkefer, supra). El tejido fue recogido entre 32-35 d después del transplante, salvo que las plantas

45 estuvieran siendo cultivadas para la producción de semillas. Se estabilizó la superficie de las semillas de Arabidopsis de tipo silvestre y modificada en fitobandejas que contienen medio M&S. El medio de las plantas modificadas contenía kanamicina (10 ug/ml).

Las plántulas fueron transferidas al ArabiSystem mediante el uso del medio de crecimiento Promix (Lehle Seeds) y 50 se cultivaron a 24 ºC con periodos de 16 h de luz y 8 h de oscuridad. Las plantas se cultivaron hasta su madurez.

Resultados:

La sobreexpresión de la GS en el tabaco generó dos clases de descendencia; una que crecía más rápido y

55 sobreexpresaba únicamente la GS en sus hojas, aumentando por lo tanto su proporción con respecto a las hojas de la GS, y una segunda clase que crecía a una velocidad normal y sobreexpresaba la GS tanto en las hojas como en las raíces, manteniendo así una proporción normal entre las hojas y las raíces. La regulación de la expresión de la GS y de la GPT en estas plantas parece ser compleja, y la expresión de cada gen parece influir en el otro (véanse las Tablas 2 y 3); la sobreexpresión únicamente de la GPT en las hojas y las raíces estaba acompañada por un

60 aumento en la actividad de la GS en la hoja y únicamente una actividad normal de la GS en la raíz. El aumento en la expresión de la GS únicamente en la hoja estaba acompañado por un aumento en la actividad de la GPT en la hoja, y una menor actividad de la GPT en la raíz. Estas respuestas eran también evidentes en las plantas transgénicas GS + GPT. La sobreexpresión de una u otra de la GS o la GPT estaba acompañada por una menor actividad de la amidasa ω en las hojas y una mayor actividad de la amidasa ω en las raíces. Las plantas transgénicas GPT y GS +

65 GPT mostraron los mayores aumentos en la actividad radicular de la amidasa ω. Estas plantas respondían a la expresión de los transgenes alterando sus actividades de amidasa ω de tal forma que tendían a aumentar las reservas de hoja raíz de 2-oxoglutaramato, y mantener las reservas radiculares de 2-oxoglutaramato. Estas respuestas se combinaban en las plantas que sobreexpresan GS + GPT para generar las mayores reservas foliares y menores radiculares de 2-oxoglutaramato, y las mayores actividades foliares y menores de la GS y de la GPT.

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5 Las siguientes Tablas 2, 3 y 4 representan los efectos de la modificación para una mayor biosíntesis de 2oxoglutaramato (2-OGM). Las Tablas 2 y 3 representan los resultados de las plantas de tabaco, y la Tabla 4 representa los resultados de las plantas de Arabidopsis thaliana.

10 TABLA 2: efectos de la modificación para una mayor capacidad de biosíntesis de 2-oxoglutaramato

Genotipo del tabaco

2-OGM foliar en nmol/gfwt 2-OGM radicular en nmol/gfwt (hoja//raíz) GS foliar µmol/ gfwt/m GPT foliar nmol/ gfwt/h Amidasa foliar en nmol/ gfwt/h (GPT/amidasa) GS radicular en µmol/ gfwt/m (hoja//raíz) GPT radicular en nmol/ gfwt/h Amidasa radicular en nmol/gfwt/h (GPT/amidasa)

Silvestre

191 116 (1,6) 7,8 100 191 (0,5) 2,1 (3,7) 236 252 (0,9)

+ GPT

384 143 (2,7) 10,5 196 118 (1,7) 1,9 (5,5) 566 440 (1,3)

+ GS

502 131 (3,8) 11,6 288 112 (2,6) 1,7 (6,8) 136 372 (0,4)

+ GS + GPT

701 80 (8,7) 16,3 731 149 (4,9) 1,8 (9,1) 117 292 (0,4)

En la anterior Tabla 2, "gfwt" se refiere a gramos de peso en fresco, y "nmol/gfwt/h" se refiere a nanomoles por gramos de peso en fresco por hora.

TABLA 4: Arabidopsis modificada para sobreproducir 2-oxoglutaramato

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Genotipo de Arabidopsis

Actividad foliar de la GS en µmol/gfwt, m Actividad foliar de la GPT en nmol/gfwt/h 2-OGM foliar en nmol.gfwt/h Proteína foliar en mg/gfwt (% en peso) Peso total de la planta fresca, en g (% en peso)

Silvestre

6,99 184 184 6,06 * 0,246

+ GS + GPT

18,7 1077 395,6 7,46 * (123 %) 1,106 (449 %)

EJEMPLO 2: VECTOR DE EXPRESIÓN VEGETAL QUE MODULA LOS NIVELES DE EXPRESIÓN RADICULAR DE LA AMIDASA Ω

5 Los niveles de expresión de la amidasa ω son aumentados en los tejidos radiculares mediante la generación de plantas transgénicas transformadas con construcciones de expresión que contienen la secuencia codificante de la amidasa ω, incluyendo, pero no se limita a, cualquiera de las secuencias codificantes de la amidasa ω divulgadas en el presente documento, bajo el control de un promotor de preferencia radicular. Se cree que el aumento en los

10 niveles de la amidasa ω en los tejidos radiculares da como resultado un aumento en la degradación del metabolito de señalización 2-oxoglutaramato.

Una construcción para la transformación de las plantas incluye un casete de expresión que codifica un promotor de preferencia radicular adecuado, una secuencia que codifica una amidasa ω vegetal y una secuencia terminadora. En

15 este ejemplo, el casete de expresión contiene el promotor de la proteína rica en glicina (GRP) (Goddemeier et a., 1998, Plant Mol Biol. 36 (5): 799-802), la secuencia codificante de la amidasa ω de Arabidopsis thaliana y el terminador NOS. La secuencia del promotor de la GRP se muestra a continuación [SEQ ID NO: 16]:

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Alternativamente, puede usarse un casete de expresión que contiene el promotor roID y la secuencia codificante de la amidasa ω de Arabidopsis thaliana. La secuencia de esta construcción se muestra a continuación: (el ATG codón de inició del gen de la amidasa ω se muestra en negrita) [SEQ ID NO: 17]:

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Para la transformación de las plantas se clona el anterior casete de expresión en un vector adecuado. Para una transformación mediada por Agrobacterium, se clonó la anterior construcción en el vector TF 101.1, que porta el gen marcador seleccionable de resistencia a la espectinomicina.

El alcance de la presente invención no debe estar limitado por las realizaciones divulgadas en el presente documento, que pretenden ser meras ilustraciones de los aspectos individuales de la invención, y cualesquiera que sean funcionalmente equivalentes están en el ámbito de la invención. Para los expertos en la materia serán evidentes diversas modificaciones de los modelos y los métodos de la invención, además de los descritos en el presente documento, a partir de la anterior descripción y de las enseñanzas, y de forma similar pretenden estar en el ámbito de la invención.

EJEMPLO 3: AUMENTO EN EL CRECIMIENTO DE PLANTAS DE ALFALFA TRANSGÉNICAS PORTADORAS DE UN TRANSGÉN DE LA AMIDASA Ω DE PREFERENCIA RADICULAR

En este ejemplo se aumentó el crecimiento de una planta de alfalfa mediante la introducción de un transgén de la amidasa ω bajo el control de un promotor de alta preferencia radicular. Las plantas transgénicas de alfalfa resultantes mostraron una disminución en la concentración de 2-oxoglutaramato en las raíces, un aumento en la proporción entre las hojas y las raíces del 2-oxoglutaramato y una mejora en el crecimiento con respecto a las plantas de alfalfa silvestres. Las plantas de alfalfa (Medicago sativa, var Ladak) fueron transformadas con la secuencia codificante de la amidasa ω de Arabidopsis truncada para eliminar el péptido de tránsito a los cloroplastos, bajo el control de un promotor truncado RoID de Agrobacterium rhizogenes en el vector de expresión pTF101.1.

Materiales y métodos:

Vectores de Agrobacterium: se modificó el vector de expresión pTF101.1 para que portara el casete de expresión del transgén de la amidasa ω de la SEQ ID NO: 39 (promotor RoID + amidasa ω + terminador NOS) y se transfirió a cultivos de la cepa de Agrobacterium tumefaciens LBA4404 mediante el uso de un método de electroporación estándar (McCormac et al., 1998, Molecular Biotechnology 9: 155-159). El promotor truncado RoID de Agrobacterium rhizogenes utilizado es la isoforma pD-02 (RoID2) descrita en Leach y Aoyagi, 1991, Plant Sci. 79, 69-76. Leach y Aoyagi describen el promotor RoID2 como un promotor de alta preferencia radicular que dirigía unos altos niveles de expresión en el tejido radicular. Los Agrobacterium transformados fueron seleccionados en un medio que contiene 50 µg/ml de cloranfenicol. Las células transformadas de Agrobacterium se cultivaron en medio de cultivo LB que contiene 25 µg/ml de antibiótico durante 36 horas. Al final del periodo de crecimiento de 36 h, las células se recogieron mediante una centrifugación y se resuspendieron las células de cada transformación en 100 ml de caldo LB sin antibiótico.

La secuencia de nucleótidos del vector pTF101.1 + roID-02promotor + amidasa ω de Arabidopsis (con los codones optimizados para Arabidopsis) + terminador nos (SEQ ID NO: 39) se establece a continuación. Los nucleótidos

subrayados son = promotor roID-02, nucleótidos en negrita = región codificante de la amidasa ω, los nucleótidos en cursiva incluyen la región del terminador nos (y parte de la secuencia del vector Cambia), y otros nucleótidos = vector pTF101.1.

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Inoculaciones en las plántulas: se cultivaron plántulas de Alfalfa hasta una altura de menos de aproximadamente 1/2

5 pulgada, y después se pusieron a remojo en una toalla de papel que había sido empapada con Agrobacterias que contienen el vector TF 101.1 portador del casete de expresión del transgén de la amidasa ω. Las plántulas se dejaron en la toalla de papel durante dos o tres días, se retiraron y después se plantaron en tierra para macetas. Las plantas resultantes T0 y de control se cultivaron durante 27 días en una cámara de crecimiento, se recogieron y se analizaron sus características bioquímicas y físicas.

10 Caracterización bioquímica: ensayo de HPLC para el 2-oxoglutaramato: se usó una HPLC para ensayo del 2oxoglutaramato, después de una modificación de Calderon et al., 1985, J Bacteriol 161 (2): 807-809. En resumen, se extrajo el 2-oxoglutaramato del tejido vegetal con agua desionizada destilada acidificada hasta un pH menor de 2,0 con HCl mediante el uso de una proporción entre peso y volumen de 2:1. El 2-oxoglutaramate se detectó y se

15 cuantificó mediante una HPLC, mediante el uso de una columna ION-300 de 7,8 mm de DI X 30 cm de L, con una fase móvil de H2SO4 0,01 N, un caudal de aproximadamente 0,2 ml/min, a 40 ºC. El volumen de inyección es de aproximadamente 20 µl, y el tiempo de retención es de entre aproximadamente 38 y 39 minutos. La detección se llevó a cabo con luz UV a 210 nm. Se usó 2-oxoglutaramato auténtico para el calibrado del ensayo.

20 Ensayos de HPLC para las actividades de la GPT y de la GS: se extrajo la GPT a partir de tejido vegetal reciente después de una molienda en Tris-HCl 100 mM frío, a pH 7,6, que contiene etilendiaminatetraacético 1 mm, fosfato de piridoxal 200 mM y mercaptoetanol 6 mM en una proporción de 3 ml por gramo de tejido. El extracto se clarificó

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mediante una centrifugación y se usó en el ensayo. La actividad de la GS se extrajo a partir de tejido vegetal reciente después de una molienda en imidazol 50 mM frío, a pH 7,5 que contiene MgCl2 10 mM y mercaptoetanol 12,5 mM en una proporción de 3 ml por gramo de tejido. El extracto se clarificó mediante una centrifugación y se usó en el ensayo. La actividad de la GPT se ensayó según se describe en Calderon y Mora, 1985, Journal Bacteriology

161: 807-809. La actividad de la GS se midió según se describe en Shapiro y Stadtmann, 1970, Methods in Enzymology 17A: 910-922. Ambos ensayos implican una incubación con los sustratos y el cofactor a un pH apropiado. La detección fue mediante una HPLC.

Ensayo de HPLC para la actividad de la amidasa ω: la actividad de la amidasa ω se determinó mediante el uso del ensayo en una placa de 96 pocillos según se describe en Krasnikov et al., 2009, Analytical Biochemistry 391: 144150,

Resultados:

Se midieron el peso en fresco de la planta y las concentraciones y las proporciones foliares y radiculares del 2oxoglutaramato en las plantas de alfalfa silvestres y transgénicas, y se muestran en la siguiente Tabla 5. En la Tabla 6A se muestra una comparación de las actividades de la GS y de la GPT en la alfalfa transgénica con el mejor rendimiento con los valores promedio de una planta silvestre de control. Los valores del peso en fresco de la planta están representados frente a las concentraciones de 2-oxoglutaramato en la FIG. 4. En la FIG. 5A se muestra una fotografía que compara las plantas de alfalfa transgénicas y de control.

Las plantas de alfalfa transgénicas portadoras de la expresión de la amidasa ω dirigida a la raíz mostraron una reducción significativa en las concentraciones radiculares del 2-oxoglutaramato, posiblemente como resultado de la actividad añadida de la amidasa ω introducida por el transgén (Tabla 5). Los niveles de actividad tanto de la GS como de la GPT permanecen constantes en los tejidos radiculares, pero están significativamente elevados en la alfalfa transgénica (Tabla 6). Las plantas transgénicas también mostraron un crecimiento más rápido, produciendo una cantidad sustancialmente aumentada de biomasa (Tabla 5), que se correlacionaba de forma lineal con el nivel de reducción del 2-oxoglutaramato en estas plantas (FIG. 4). La línea de alfalfa transgénica de crecimiento más rápido mostró un aumento del 274 % en la biomasa con respecto a la biomasa promedio de los controles. Esta línea también mostró la mayor reducción en la concentración radicular de 2-oxoglutaramato.

TABLA 5

GENOTIPO DE LA ALFALFA

PESO FRESCO (G) 2-OGM RADICULAR (NMOL/G) 2-OGM FOLIAR (NMOL/G) 2-OGM FOLIAR/RADICULAR

Control 1

1,43 259,7 910,7 3,5

Control 2

1,75 286 1538,5 5,4

Control 3

1,16 383,4 1826,6 4,8

Transgén 4

2,31 332 2144,6 6,5

Transgén 6

2,80 189 1479,4 7,8

Transgén 13

3,16 241,2 3038,5 12,8

Transgén 5

5,42 125,14 2729,9 21,8

TG = Transgénico

TABLA 6

GENOTIPO DE LA ALFALFA

Actividad de la GS en micromoles / gfwt / min Actividad de la GPT en nmoles / gfw / h

Foliar

Radicular Foliar Radicular

Control, promedio

4,3 3,3 339,1 66,3

Transgén 5

15,9 3,5 951,6 63,6

EJEMPLO 4: AUMENTO EN EL CRECIMIENTO DE PLANTAS DE ARABIDOPSIS TRANSGÉNICAS PORTADORAS DEL TRANSGÉN DE PREFERENCIA RADICULAR DE LA AMIDASA Ω

En este ejemplo, el crecimiento de la planta de Arabidopsis se aumentó mediante la introducción de un transgén de la amidasa ω bajo el control de un promotor de alta preferencia radicular. Las plantas de Arabidopsis transgénicas resultantes mostraron una notable disminución en la concentración de 2-oxoglutaramato en las raíces, muy significativamente un aumento en la proporción entre las hojas y las raíces del 2-oxoglutaramato, unos niveles muy elevados de la GS y de la GPT en las hojas, una gran reducción en los niveles de la amidasa ω en las hojas y un desbordante aumento en el crecimiento con respecto a las plantas silvestres de Arabidopsis.

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Materiales y métodos:

Vectores de Agrobacterium: el vector de expresión del transgén de la amidasa ω y la preparación de las Agrobacterias se generaron según se describe en el Ejemplo 3, supra.

5 Transformación: la transformación de Arabidopsis se llevó a cabo mediante el uso de una transferencia de "inmersión floral" mediada por Agrobacterium, según se ha descrito (Harrison et al., 2006, Plant Methods 2: 19-23; Clough y Bent, 1998, Plant J. 16: 735-743). Las Agrobacterias transformadas con el vector TF101.1 portador del casete de expresión del transgén de la amidasa ω se cultivaron bajo selección de antibiótico, se recogieron mediante

10 una centrifugación, se resuspendieron en caldo LB con antibiótico y se usaron en la inmersión floral de las inflorescencias de Arabidopsis. Las plantas de Arabidopsis con la inmersión floral se llevaron hasta la madurez y se autofertilizaron, y se recogieron las semillas.

Germinación y selección: las semillas de las plantas transformadas con el vector TF101.1 portadoras del casete de

15 expresión del transgén de la amidasa ω fueron germinadas en un medio que contiene 15 mg/l de BASTA o una cantidad equivalente de fosfinotricina. Para las construcciones y las combinaciones adicionales descritas en los Ejemplos 5-7: las semillas derivadas de las plantas transformadas con la construcción de sintetasa de glutamina, se germinaron en un medio que contiene 20 microgramos de higromicina y se realizaron los procedimientos de selección regulares para obtener las plántulas supervivientes. Las semillas de las plantas transformadas con la

20 transaminasa de fenilpiruvato de glutamina se germinaron en un medio que contiene 20 ug/ml de kanamicina y se realizaron los procedimientos de selección regulares para obtener las plántulas supervivientes. Para las plántulas que contienen más de uno de estos genes, las plántulas fueron transferidas al medio que contiene la siguiente selección química y se obtuvieron las plántulas supervivientes. Se analizaron las plántulas supervivientes.

25 Caracterización bioquímica: los ensayos del 2-oxoglutaramato, de la amidasa ω, de la GS y de la GPT se llevaron a cabo según se describe en el Ejemplo 3, supra.

Resultados:

30 Se midió la actividad de la GPT y de la GS en las plantas de Arabidopsis silvestres y transgénicas, y se muestra en la siguiente Tabla 7. Se midió la actividad de la amidasa ω y las concentraciones del 2-oxoglutaramato en las plantas de Arabidopsis silvestres y transgénicas en los tejidos foliares y radiculares, y se muestran en la siguiente Tabla 8.

TABLA 7

Genotipo de Arabidopsis

mg de FWt Actividad de la GS en µmoles / gfwt / min Actividad de la GPT en nmoles / gfwt / h

Planta completa

Radicular Foliar F / R Radicular Foliar F / R

Silvestre *

77 1,5 3,4 2,3 167 132 0,8

Amidasa TG **

479 1,4 5,8 4,1 192 486 2,5

TG = Transgénico * Valores promedio de 9 plantas ** Valores promedio de 6 plantas

TABLA 8

Genotipo de Arabidopsis

mg de FWt nmoles de amidasa ω / gfwt / h Concentración de 2oxoglutaramato en nmoles / gfwt

Planta completa

Radicular Foliar Proporción L / R Radicular Foliar Proporción F / R

Silvestre *

77 86 1090 12,7 410 163 0,4

Amidasa ω TG **

479 243 127 0,5 98 305 3,1

TG = Transgénico * Valores promedio de 9 plantas ** Valores promedio de 6 plantas

En comparación con las plantas de Arabidopsis silvestres de control, las plantas de Arabidopsis transgénicas

portadoras de la amidasa ω dirigida a la expresión radicular mostraron unos cambios bioquímicos drásticos en la ruta 40 de la amidasa ω, incluyendo un aumento en la actividad de la amidasa (un aumento del 186 %), unos niveles

radiculares reducidos del 2-oxoglutaramato (una reducción del 76 %) y un aumento en las proporciones entre las

hojas y las raíces del 2-oxoglutaramato. Además, estas plantas transgénicas también mostraban unas importantes

reducciones en los niveles de actividad foliar de la amidasa ω (una reducción del 88 %), prácticamente el doble de

los niveles foliares de 2-oxoglutaramato y unas mayores actividades de la GS foliar y de la GPT foliar (del 70 % y del 45 533 %, respectivamente). El impacto resultante sobre el crecimiento fue asombroso, pesando las plantas

transgénicas más de seis veces el peso de las plantas silvestres, de media.

EJEMPLO 5: AUMENTO EN EL CRECIMIENTO DE PLANTAS DE ARABIDOPSIS TRANSGÉNICAS PORTADORAS DEL TRANSGÉN DE LA AMIDASA Ω DE PREFERENCIA RADICULAR Y DE LA GPT DE PREFERENCIA FOLIAR

5 En este ejemplo, el crecimiento de la planta de Arabidopsis se aumentó mediante la introducción de un transgén de la amidasa ω bajo el control de un promotor de alta preferencia radicular y de un transgén de la GPT bajo el control de un promotor de preferencia foliar. Las plantas de Arabidopsis transgénicas resultantes muestran unos aumentos en el crecimiento, así como diversos cambios bioquímicos, con respecto a las plantas de Arabidopsis silvestres.

10 Materiales y métodos:

Vectores de Agrobacterium: el vector de expresión del transgén de la amidasa ω y la preparación de Agrobacterium se generaron como se ha descrito en el Ejemplo 3, supra. Para el transgén de GPT de preferencia foliar, se construyó un casete de expresión que comprende el promotor de la subunidad menor del tomate rubisco y una GPT

15 de Arabidopsis truncada de codones optimizados para delecionar los primeros 45 codones de la GPT de longitud completa (eliminando el péptido de tránsito a los cloroplastos) y se clonó en el vector de expresión Cambia 2201. La construcción del vector de expresión de la GPT transgénica (6c) se muestra a continuación, y se usó para transformar las Agrobacterias según se describe en el Ejemplo 3.

20 A continuación se establece la secuencia de nucleótidos del Cambia 2201 con el promotor + (-45) SSU truncado del tomate rubisco, optimizado para Arabidopsis GPT + terminador nos, en forma de la SEQ ID NO: 40, nucleótidos subrayados = promotor del tomate rubisco, nucleótidos en negrita = región codificante de la GPT (con los codones optimizados para Arabidopsis), nucleótidos en cursiva = región del terminador nos (y parte de la secuencia del vector Cambia), y otros nucleótidos = vector Cambia 2201 y sitios de clonación adicionales.

25

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Transformación y selección: la transformación de Arabidopsis se llevó a cabo mediante el uso de una "inmersión floral" mediada por Agrobacterium según se ha descrito en el Ejemplo 4. Las plantas transformadas se cultivaron 5 bajo selección según se ha descrito en el Ejemplo 4.

Caracterización bioquímica: los ensayos del 2-oxoglutaramate, de la amidasa ω, de la GS y de la GPT se llevaron a cabo según se describe en el Ejemplo 3, supra.

10 Resultados:

Se midió la actividad de la GPT y la actividad de la GS de las plantas de Arabidopsis silvestres y transgénicas, y se muestran en la siguiente Tabla 9. Se midieron las actividades de la amidasa ω y las concentraciones del 2oxoglutaramato en las plantas de Arabidopsis silvestres y transgénicas tanto en los tejidos foliares como radiculares,

15 y se muestran en la siguiente Tabla 10.

TABLA 9 TABLA 10

Genotipo de Arabidopsis

mg de FWt Actividad de la GS en µmoles / gfwt / min Actividad de la GPT en nmoles / gfwt / h

Planta completa

Radicular Foliar L / R Radicular Foliar L / R

Silvestre *

77 1,5 3,4 2,3 167 132 0,8

TG GPT (6c) + -amidasa ω **

513 1,8 8,25 4,6 232 389 1,7

TG = Transgénico GPT (6c) = GPT truncada -45 [SEQ ID NO: 40] * Valores promedio de 9 plantas ** Valores promedio de 5 plantas

imagen75

Genotipo de Arabidopsis

mg de FWt nmoles de amidasa ω / gfwt / h Concentración de 2-oxoglutaramato en nmoles / gfwt

Planta completa

Radicular Foliar Proporción F / R Radicular Foliar Proporción F / R

Silvestre *

77 86 1090 12,7 410 163 0,4

TG GPT (6c) + amidasa ω **

513 308 584 1,9 268 275 1,0

TG = Transgénico GPT (6c) = GPT truncada -45 [SEQ ID NO: 40] * Valores promedio de 9 plantas ** Valores promedio de 5 plantas

En comparación con las plantas de Arabidopsis silvestres de control, las plantas de Arabidopsis transgénicas portadoras de la amidasa ω dirigida para su expresión radicular y de la GPT truncada (para su expresión citosólica) 5 dirigida para su expresión foliar, mostraron unos cambios bioquímicos en la ruta de la amidasa ω similares a los observados en las plantas transgénicas del Ejemplo 5, supra. Más específicamente, las plantas GPT + amidasa ω transgénicas mostraron un aumento en la actividad de la amidasa ω, una reducción en la concentración radicular del 2-oxoglutaramato y un aumento en las proporciones entre las hojas y las raíces del 2-oxoglutaramato. También, de forma similar a los resultados observados en las plantas transgénicas del Ejemplo 5, las plantas GPT + amidasa ω

10 transgénicas mostraron unas reducciones significativas en los niveles de actividad foliar de la amidasa ω, un aumento del 2-oxoglutaramato foliar y unas mayores actividades de la GS foliar y de la GPT foliar. El impacto resultante sobre el crecimiento fue incluso mayor que el observado para las plantas transgénicas del Ejemplo 5, pesando las plantas transgénicas más de 6,7 veces el peso de las plantas silvestres, de media.

15 EJEMPLO 6: AUMENTO EN EL CRECIMIENTO DE PLANTAS DE ARABIDOPSIS TRANSGÉNICAS PORTADORAS DEL TRANSGÉN DE LA AMIDASA Ω DE PREFERENCIA RADICULAR Y DE LA GPT Y LA GS DE PREFERENCIA FOLIAR

En este ejemplo, el crecimiento de la planta de Arabidopsis se aumentó mediante la introducción de un transgén de

20 la amidasa ω bajo el control de un promotor de alta preferencia radicular, y los transgenes de la GPT y de la GS bajo el control de promotores de preferencia foliar. Las plantas de Arabidopsis transgénicas resultantes mostraron unos aumentos asombrosos en el crecimiento, así como varios cambios bioquímicos, con respecto a las plantas de Arabidopsis silvestres.

25 Materiales y métodos:

Vectores de Agrobacterium: el vector de expresión del transgén de la amidasa ω y la preparación de las Agrobacterias se generaron según se describe en el Ejemplo 3, supra. Para el transgén de la GPT de preferencia foliar se construyó un casete de expresión que comprende el promotor de la subunidad menor del tomate rubisco y

30 la secuencia codificante de una GPT truncada con los codones optimizados para Arabidopsis para delecionar los primeros 45 codones de la GPT de longitud completa (eliminación del péptido de tránsito a los cloroplastos), y que contiene una mutación de F a V en el residuo de aminoácido 45, y se clonó en el vector de expresión Cambia 2201. La construcción del vector de expresión de la GPT transgénica resultante (9c) se muestra en la siguiente SEQ ID NO: 41, y se usó para la transformación de las Agrobacterias según se describe en el Ejemplo 5.

35 A continuación se establece la secuencia de nucleótidos del Cambia 2201 con el promotor + (-45) SSU truncado del tomate rubisco, optimizado para la mutación de F a V de la GPT de Arabidopsis + terminador nos, en forma de la SEQ ID NO: 41. Nucleótidos subrayados = promotor del tomate rubisco, nucleótidos en negrita = región codificante de la GPT (con los codones optimizados para Arabidopsis), nucleótidos en cursiva = región del terminador nos (y

40 parte de la secuencia del vector Cambia), y otros nucleótidos = vector Cambia 2201 y sitios de clonación adicionales.

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Para el transgén de la GS de preferencia foliar, se construyó un casete de expresión que comprende el promotor de la subunidad menor del tomate rubisco y una secuencia codificante de la GS1 de Arabidopsis y se clonó en el vector de expresión Cambia 1305.1 con el promotor de la subunidad menor del tomate rubisco (rbcS3C). La construcción del vector de expresión de la GS transgénica resultante (4c) se establece en forma de la SEQ ID NO: 43, y se usó

5 para la transformación de las Agrobacterias según se describe en el Ejemplo 5.

A continuación se establece la secuencia de nucleótidos del Cambia 1305.1 con el promotor de la subunidad menor de rubisco (rbcS3C) + ARGS (Arabidopsis GS1) en forma de la SEQ ID NO: 43. Nucleótidos subrayados = promotor del tomate rubisco, nucleótidos con subrayado doble = intrón catl del vector Cambia 1305.1 los primeros 10

10 aminoácidos son de la enzima GUSplus y los sitios de clonación del vector 1305.1, nucleótidos en negrita = región codificante de la GS1 de Arabidopsis (clonada en los sitios Spel hasta pmll), nucleótidos en cursiva = región del terminador nos (y parte de la secuencia del vector Cambia), y otros nucleótidos = vector Cambia 2201 y sitios de clonación adicionales.

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Transformación y selección: la transformación de Arabidopsis se llevó a cabo mediante el uso de una transferencia de "inmersión floral" mediada por Agrobacterium según se describe en el Ejemplo 4. Las plantas transformadas se cultivaron bajo selección según se describe en el Ejemplo 4.

Caracterización bioquímica: los ensayos para el 2-oxoglutaramato, la amidasa ω, la GS y la GPT se llevaron a cabo según se describe en el Ejemplo 3, supra.

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Resultados:

Se midió la actividad de la GPT y la actividad de la GS de las plantas de Arabidopsis silvestres y transgénicas, y se muestran en la siguiente Tabla 1. Se midieron las actividades de la amidasa ω y las concentraciones de 2oxoglutaramato en las plantas de Arabidopsis silvestres y transgénicas en los tejidos tanto foliares como radiculares, y se muestran en la siguiente Tabla 12.

TABLA 11

Genotipo de Arabidopsis

mg de FWt Actividad de la GS en µmoles / gfwt / min Actividad de la GPT en nmoles / gfwt / h

Planta completa

Radicular Foliar L / R Radicular Foliar L / R

Silvestre *

77 1,5 3,4 2,3 167 132 0,8

TG GPT (9c) + GS (4c) + amidasa ω **

709 1,6 9,4 5,9 182 414 2,3

TG = Transgénico GPT (9c) = variante de la GPT truncada -45 [SEQ ID NO: 41] GS 4c = SEQ ID NO: 43 * Valores promedio de 9 plantas ** Valores promedio de 5 plantas

TABLA 12

Genotipo de Arabidopsis

mg de FWt nmoles de amidasa ω / gfwt / h Concentración de 2oxoglutaramato en nmoles / gfwt

Planta completa

Radicular Foliar Proporción F / R Radicular Foliar Proporción F / R

Silvestre *

77 86 1090 12,7 410 163 0,4

TG GPT (9c) + GS (4c) + amidasa ω **

709 195 344 1,8 113 223 2,0

TG = Transgénico GPT (9c) = variante de la GPT truncada -45 [SEQ ID NO: 41] * Valores promedio de 9 plantas ** Valores promedio de 5 plantas

En comparación con las plantas de Arabidopsis silvestres de control, las plantas de Arabidopsis transgénicas portadoras de la amidasa ω dirigida para su expresión radicular, y de la GPT truncada (para su expresión citosólica) y de la GS1 dirigida para su expresión foliar, mostraron unos cambios bioquímicos en la ruta de la amidasa ω 15 similares a los observados en las plantas transgénicas de los Ejemplos 4 y 5, supra. Más específicamente, las plantas transgénicas GPT + amidasa ω mostraron un aumento en la actividad radicular de la amidasa ω, una reducción en la concentración radicular del 2-oxoglutaramato y un aumento en las proporciones entre las hojas y las raíces del 2-oxoglutaramato. También, de una forma similar a los resultados observados en las plantas transgénicas de los Ejemplos 5 y 6, las plantas transgénicas GPT + GS + amidasa ω mostraron unas reducciones significativas en

20 los niveles de actividad foliar de la amidasa ω, un aumento en el 2-oxoglutaramato foliar y unas mayores actividades de la GS foliar y de la GPT foliar. El impacto resultante sobre el crecimiento fue mayor que el observado para las plantas transgénicas tanto del Ejemplo 4 como del Ejemplo 5, pesando las plantas transgénicas más de nueve veces el peso de las plantas silvestres, de media.

25 EJEMPLO 7: COMPARACIÓN DE LOS GENOTIPOS TRANSGÉNICOS DE ARABIDOPSIS PORTADORES DEL TRANSGÉN DE LA AMIDASA Ω DE PREFERENCIA RADICULAR

Se presentan conjuntamente los datos generados a partir de los estudios de los Ejemplos 4, 5 y 6, que se llevaron a cabo en paralelo, para su comparación en las siguientes Tablas 13 y 14. 30 TABLA13

Genotipo

mg de FWt Actividad de la GS en µmoles / gfwt / min Actividad de la GPT en nmoles / gfwt / h

Planta completa

Radicular Foliar L / R Radicular Foliar L / R

Silvestre *

77 1,5 3,4 2,3 167 132 0,8

WT + amidasa ω **

479 1,4 5,8 4,1 192 486 2,5

GPT (6c) + amidasa ω

513 1,8 8,25 4,6 232 389 1,7

GPT (9c) + GS + amidasa ω ***

709 1,6 9,4 5,9 182 414 2,3

* Valores promedio de 9 plantas

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5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

** Valores promedio de 6 plantas *** Valores promedio de 5 plantas

TABLA 14

Genotipo

mg de FWt nmoles de amidasa ω / gfwt / h Concentración de 2oxoglutaramato en nmoles / gfwt

Planta completa

Radicular Foliar L / R Radicular Foliar L / R

Silvestre *

77 86 1090 12,7 410 163 0,4

WT + amidasa ω **

479 243 127 0,5 98 305 3,1

GPT (6c) + amidasa ω ***

513 308 584 1,9 268 275 1,0

GPT (9c) + GS + amidasa ω ***

709 195 344 1,8 113 223 2,0

* Valores promedio de 9 plantas ** Valores promedio de 6 plantas *** Valores promedio de 5 plantas

EJEMPLO 8: INHIBICIÓN QUÍMICA DE LA ACTIVIDAD DE LA AMIDASA Ω EN LOS TEJIDOS FOLIARES Y RADICULARES Y MODULACIÓN DE LA PROPORCIÓN ENTRE LAS HOJAS Y LAS RAÍCES DEL 2-OXOGLUTARAMATO

Este ejemplo muestra cómo cambia la concentración del 2-oxoglutaramato en respuesta al tratamiento foliar y radicular con 6-diazo-5-oxo-nor-leucina (DON), un inhibidor de la enzima amidasa ω que descompone el 2oxoglutaramato (Duran y Calderon, 1995, Role of the glutamine transaminase-ra-amidase pathway and glutaminase in glutamine degradation in Rhizobium etli. Microbiology 141: 589-595).

Materiales y métodos:

Solución nutriente: se utilizó la solución nutriente Columbia (Knight y Weissman, 1982, Plant Physiol. 70: 1683).

Tratamientos foliares: las plantas se cultivaron en arena a 24 ºC mediante el uso de un fotoperiodo de 16 horas/día de luz y 8 horas/día de oscuridad. Las semillas germinaron en la arena y se dejaron crecer durante 9-14 días tras el nacimiento de la plántula. A las plántulas (maceta de 1 por 3 pulgadas) se les proporcionaron nutrientes diariamente. La parte superior de cada maceta se cubrió con una película plástica Saran, con un corte en ranura para permitir espacio de crecimiento de las plántulas, con objeto de impedir que la solución de tratamiento alcanzara el suelo. Las hojas se trataron mediante la pulverización de una solución de tratamiento/nutriente DON dos veces al día. La solución de tratamiento/nutriente DON contenía 1 microgramo/ml de DON, 50 microlitros/litro de SILWET L77 (un tensioactivo) y un 0,02 % vol/vol de glicerol (un humectante) a pH 6,3, disueltos en la solución nutriente. Las plantas de control fueron pulverizadas diariamente con la misma solución sin DON. Se usó un aerógrafo para la aplicación de las soluciones hasta empapar. Las plantas fueron sacrificadas y analizadas para evaluar su peso en fresco, la actividad de la amidasa ω y las concentraciones del 2-oxoglutaramato en el tejido foliar y radicular 14 días después del inicio del tratamiento.

Tratamientos radiculares: las plantas se cultivaron hidropónicamente a 24 ºC mediante el uso un fotoperiodo de 16 horas/día de luz y 8 horas/día de oscuridad. En primer lugar germinaron las semillas y las plántulas se cultivaron durante 9 días, momento en el cual las plántulas individuales se suspendieron con sus raíces en la solución nutriente (600 ml de nutriente, pH 6,3) en un vaso de precipitados de 800 ml cubierto con una lámina de aluminio, con una ranura para las plántulas, para impedir el crecimiento de algas. Los vasos de precipitados fueron aireados con aire proporcionado por una pequeña bomba y suministrado en la solución a través de una pipeta de Pasteur de vidrio. Para los tratamientos se añadió DON a la solución nutriente a una concentración final de 1 microgramo por ml. Por lo tanto, el DON fue suministrado de forma continua a las plántulas tratadas. Los controles se cultivaron con la misma solución nutriente sin DON. Las soluciones se refrescaron cada tres días. Las plantas fueron sacrificadas y analizadas para evaluar su peso en fresco, la actividad de la amidasa ω y las concentraciones del 2-oxoglutaramato en el tejido foliar y radicular 14 días después del inicio del tratamiento.

Resultados:

Tratamiento de las raíces con un inhibidor de la amidasa ω: se trataron las raíces de plantas de maíz dulce y de alubia con DON como se ha descrito anteriormente. Los resultados de los tratamientos de las raíces se muestran en las siguientes Tablas 15 y 16. Ninguna de las plantas tratadas con DON tenía unos niveles detectables de actividad de la amidasa ω, mientras que las plantas silvestres de control mantenían unos niveles normales de actividad de la amidasa ω. De hecho, todas las plantas de maíz y de judía sometidas a un tratamiento continuo de las raíces con DON mostraron un crecimiento gravemente atrofiado, en contraste con el vigoroso crecimiento de las plantas de control sin tratar. Las plantas de control aumentaron sus pesos en fresco a lo largo de todo el periodo experimental hasta casi ocho veces.

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Se observaron unas reducciones drásticas en la proporción de 2-oxoglutaramato entre las hojas y las raíces en las plantas tanto de maíz como de judías tratadas con el inhibidor de la amidasa ω. Las plantas tratadas acumulaban unas grandes cantidades de 2-oxoglutaramato en sus raíces (un aumento mayor de 30 veces en el maíz; un aumento de 15 veces en las judías) mientras mantenían unos niveles normales en sus hojas.

TABLA 15: INHIBICIÓN DE LA AMIDASA Ω EN LAS RAÍCES DEL MAÍZ

MAÍZ

% DE AUMENTO EN EL FWT (peso inicial) 2-OGM FOLIAR en nmoles/gfwt 2-OGM RADICULAR en nmoles/gfwt PROPORCIÓN ENTRE HOJAS/RAÍZ

CONTROL

370 % (1,26 g) 276 65 4,25

TRATADO

174 % (0,96 g) 300 2288 0,13

2-OGM = 2-OXOGLUTARAMATO

TABLA 16: INHIBICIÓN DE LA AMIDASA Ω EN LAS RAÍCES DE LAS JUDÍAS

JUDÍA

% DE AUMENTO EN EL FWT (peso inicial) 2-OGM FOLIAR en nmoles/gfwt 2-OGM RADICULAR en nmoles/gfwt PROPORCIÓN ENTRE HOJAS/RAÍZ

CONTROL

839 % (1,134 g) 311,2 101,4 3,07

TRATADO

198 % (1,104 g) 279 1586 0,18

2-OGM = 2-OXOGLUTARAMATO

10 Tratamiento de las hojas con un inhibidor de la amidasa ω: se trataron las hojas de una planta de maíz con DON como se ha descrito anteriormente. Los resultados se muestran en las siguientes Tablas 17 y 18. La actividad foliar de la amidasa ω era efectivamente suprimida por el DON, mostrando las plantas tratadas únicamente aproximadamente un 50 % de la actividad de la amidasa ω observada en las plantas sin tratar (Tabla 18). Se observó un aumento drástico en el 2-oxoglutaramato foliar y en la proporción entre las hojas y las raíces del 2

15 oxoglutaramato en las plantas tratadas (Tablas 17 y 18). Específicamente, las plantas tratadas acumularon unas cantidades muy grandes de 2-oxoglutaramato en sus hojas (un aumento de más de siete veces con respecto a las plantas sin tratar). Además, la inhibición de la actividad de la amidasa ω en las hojas también dio como resultado casi una duplicación de los pesos en fresco de las plantas de maíz (Tabla 18).

20 TABLA 17: LA INHIBICIÓN DE LA AMIDASA Ω EN LAS HOJAS DEL MAÍZ DA COMO RESULTADO UN AUMENTO EN LA PROPORCIÓN ENTRE LAS HOJAS Y LAS RAÍCES DEL 2-OXOGLUTARAMATO

MAÍZ

2-OGM FOLIAR en nmoles/gfwt 2-OGM RADICULAR en nmoles/gfwt PROPORCIÓN ENTRE HOJAS/RAÍZ

CONTROL

101,3 344,1 0,29

TRATADO

753,9 126,8 5,0

2-OGM = 2-oxoglutaramato gfwt = gramos de peso en fresco

TABLA 18: LA INHIBICIÓN DE LA AMIDASA Ω EN LAS HOJAS DEL MAÍZ DA COMO RESULTADO UN AUMENTO EN EL CRECIMIENTO

MAÍZ

Peso en fresco total de la planta, g Actividad foliar de la amidasa, µmol/gfw/h Concentración de 2-oxoglutaramato en nmoles/gfwt

Control

Tratada Control Tratada Control Tratada

9,3

20,9

12,4

19,2

11,3

24,3

Media

11,0 21,4 0,261 0,135 101,3 838,8

gfwt = gramos de peso en fresco

25 EJEMPLO 9: COMPARACIÓN DE LAS ISOFORMAS DE LA GPT EN COMBINACIÓN CON LA AMIDASA Ω DE PREFERENCIA RADICULAR

Este Ejemplo compara el comportamiento de mejora del crecimiento de tres isoformas diferentes del transgén de la

30 GPT junto con la expresión de preferencia radicular de un transgén de la amidasa ω en el crecimiento de una planta de Arabidopsis. La construcción de expresión de la amidasa ω usada en las tres combinaciones es según se describe en el Ejemplo 3 [SEQ ID NO: 39]. Las tres isoformas del transgén de la GPT eran: (1) GPT 5c, GPT de Arabidopsis de longitud completa con los codones optimizados [SEQ ID NO: 42]; (2) GPT 6c, GPT truncada -45 (secuencia de direccionamiento a los cloroplastos delecionada), con los codones optimizados [SEQ ID NO: 40]; y,

35 (3) GPT 9c, GPT truncada -45 (secuencia de direccionamiento a los cloroplastos delecionada), con los codones optimizados, mutación de F a V en el residuo de aminoácido 45 [SEQ ID NO: 41].

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A continuación se establece la secuencia de nucleótidos del Cambia 1305.1 con el promotor rbcS3C + el intrón catl con gen de la GPT de Arabidopsis  Arabidopsis.

imagen89

Los resultados se muestran en la siguiente Tabla 19. Ambas isoformas de la GPT en las que se había delecionado el péptido de tránsito a los cloroplastos se comportaban cómo las plantas con la isoforma de la GPT silvestre y de longitud completa.

TABLA 19: LAS ISOFORMAS DE LA GPT TRUNCADAS SE COMPORTAN COMO LA GPT NATURAL

Genotipo

Peso en fresco, mg Peso medio, mg DT +/ % de aumento

Silvestre (promedio de 9 plantas)

77 27 0

5c GPT + amidasa ω

357

456

459

198

371 149 482

6c GPT + amidasa ω

525

438

560

501

552

513 56 666

Claims (19)

1. imagen1

   REIVINDICACIONES

   1.

   Una planta transgénica que comprende un transgén de la amidasa ω, en la que el transgén de la amidasa ω está unido operativamente a un promotor de preferencia radicular.

2. 2.

   Un método para mejorar las características de crecimiento de una planta con respecto a una planta de tipo silvestre o no transformada de la misma especie, que comprende:

   (a)

   la introducción de un transgén de la amidasa ω en una pluralidad de plantas, en donde el transgén de la amidasa ω está unido operativamente a un promotor de preferencia radicular;

   (b)

   la expresión del transgén de la amidasa ω en el tejido radicular de la pluralidad de plantas o de la descendencia de la pluralidad de plantas; y

   (c)

   la selección entre dicha pluralidad de plantas de una planta transgénica que tiene un aumento en la proporción entre las hojas y las raíces del 2-oxoglutaramato a partir de dicha pluralidad de plantas transgénicas con respecto a una planta de la misma especie que no comprende un transgén de la amidasa ω,

   en donde el aumento en la proporción entre las hojas y las raíces del 2-oxoglutaramato da como resultado una mejora en las características de crecimiento.

3. 3.

   La planta transgénica según la reivindicación 1 o el método según la reivindicación 2, en donde el transgén de la amidasa ω (a) codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 90 % en la secuencia con un polipéptido seleccionado entre el grupo que consiste en AAL91613.1, ACN30911.1, ABK22312.1, ACJ85250,1, AAQ97821.1, CBJ25483.1, EFN54567.1, NP_196765.2, XP_002871509.1, NP_974769.1, XP_002309478.1, XP_0022799687.1, NP_001146676.1, NP_001146295.1, NP_001049134.1, XP_002516116.1, XP_001766085.1, XP_001756522.1, XP_002969787.1, X_002985119.1, XP_002948137.1, XP_001690839.1, NP_001057093.1, XP_002468410,1, NP_064587.1, XP_001089575.2, XP_001502234.1, XP_002502298.1, XP_526254.2, XP_535718.2, XP_002716659.1, NP_001033222.1, NP_001029298.1, NP_001016633.1, NP_001085409.1, XP_002758928.1, XP_003064056.1, NP_001135127.1, XP_001622809.1, NP_991174.2, XP_002594716.1, NP_075664.1, XP_001370849.1, NP_001090454.1, XP_002999170,1, XP_002917137.1, XP_002741281.1, XP_002131764.1, NP_594154.1, XP_001742101.1, XP_416604.2, XP_002194275.1, XP_001599587.1, XP_002410555.1, XP_003035898.1, XP_002183613.1, XP_001875493.1, XP_002112209.1, XP_636983.1, XP_002158547.1, XP_002839272.1, XP_307722.3, XP_001819629.1, XP_001268376.1, ZP_08115581.1, YP_001320997.1, XP_369268.1, XP_002626458.1, XP_751200,1, XP_001657673.1, XP_002173486.1, XP_001212538.1, XP_001258462.1, XP_002434512.1, XP_960906.1, XP_002847679.1, XP_967861.1, XP_002426154.1, XP_003176259.1, XP_500602.1, XP_001428419.1, XP_003014235.1, XP_001393123.1, ZP_03608460.1, XP_002147261.1, ZP_03293831.1, XP_002290043.1, XP_003065597.1, XP_001588734.1, YP_001273073.1, XP_001552800-1, XP_446414.1, XP_002792830,1, XP..001998501.1, YP_003780301.1, NP_013455.1, XP_002404736.1, YP_001086961.1, ZP_05328587.1, ZP_05399936.1, YP_001 1 13615.1, XP_001247884.1, XP_390426.1, XP_003025334.1, XP_002052999.1, YP_769862.1, ZP_07325748.1, ZP_05349666.1, YP_471237.1, YP_002977603.1, YP_001202760.1, ZP_07592670.1 y NP_386723.1, o (b) es incorporado en el genoma de la planta.

4. 4.

   La planta transgénica según la reivindicación 1 o el método según la reivindicación 2, en donde el promotor de preferencia radicular se selecciona entre el grupo que consiste en el promotor RoID, el promotor RoID-2, el promotor de la proteína rica en glicina, el promotor GRP, el promotor ADH, el promotor del maíz ADH1, el promotor PHT, el promotor de la familia del gen Pht1, el promotor de la proteína de captación de metales, el promotor de la proteína metalotioneína del maíz, el promotor A del dominio 35S CaMV, el promotor pDJ3S, el promotor SIREO, el promotor pMel, el promotor Sad1, el promotor Sad2, el promotor TobRB7, el promotor RCc3, el promotor FaRB7, el promotor SP-mads, el promotor IDS2, el promotor pyk10, el promotor de la leghemoglobina Lbc3, el promotor PEPC, el promotor de la glucanasa radicular Gns1, el promotor 35S2, el promotor GI4, el promotor GI5 y el promotor GRP.

5. 5.

   La planta transgénica según la reivindicación 1 o el método según la reivindicación 2, en donde la expresión de la amidasa ω endógena en el tejido foliar está inhibida.

6. 6.

   La planta transgénica o el método según la reivindicación 5, en donde la expresión de la amidasa ω endógena en el tejido foliar es inhibida mediante:

   (i)

   la disrupción del gen recesivo, el silenciamiento del gen dominante o un inhibidor químico;

   (ii)

   la disrupción del gen recesivo seleccionada entre el grupo que consiste en un gen mutante de la amidasa ω que elimina la expresión de la amidasa ω endógena, un mutante inactivado de la amidasa ω endógena y un mutante reducido de la amidasa ω endógena;

   (iii) un oligonucleótido de ARNi antisentido que es específico para el gen de la amidasa ω endógena; o

   (iv) un inhibidor químico seleccionado entre el grupo que consiste en 6-diazo-5-oxo-norleucina, benzoato de phidroximercurio, fluorofosfatos de diisopropilo, cianuro de sodio, acetato de fenilmercurio, acetato de yodo, nitrato de plata, ácido cloromercuricofenilsulfónico y sulfato de cobre.

7. 7.

   La planta transgénica según la reivindicación 1, en la que la expresión de preferencia radicular del transgén de la amidasa ω da como resultado un aumento en la proporción entre las hojas y las raíces del 2-oxoglutaramato con respecto a una planta de tipo silvestre o no transformada de la misma especie.

8. 8.

   La planta transgénica según la reivindicación 7 o el método según la reivindicación 2, en donde la proporción entre las hojas y las raíces del 2-oxoglutaramato es al menos dos veces mayor que la de la una planta de tipo silvestre o no transformada de la misma especie.

9. 9.

   La planta transgénica según la reivindicación 1 o el método según la reivindicación 2, en donde la planta comprende adicionalmente (i) un transgén de la GPT, o (ii) un transgén de la GPT y un transgén de la GS.

10. 10.

    La planta transgénica o el método según la reivindicación 9, en donde (i) el transgén de la GPT es un mutante GPT/F:V codificado por la SEQ ID NO: 1, o (ii) el transgén de la GPT y el transgén de la GS están unidos cada uno operativamente a un promotor de preferencia foliar.

11. 11.

    La planta transgénica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 9, o el método según una cualquiera de las reivindicaciones 2 o 9, en donde cada transgén tiene los codones optimizados para su expresión en la planta.

12. 12.

    La planta transgénica según la reivindicación 1 o el método según la reivindicación 2, en donde (i) la expresión de la GPT endógena es aumentada mediante activación génica, o (ii) la expresión de la GS endógena es aumentada mediante activación génica.

13. 13.

    La planta transgénica según la reivindicación 1, en donde la planta transgénica se selecciona entre el grupo que consiste en trigo, avena, arroz, maíz, judías, soja, tabaco, alfalfa, Arabidopsis, pasto, frutas, hortalizas, plantas con flor y árboles.

14. 14.

    Una descendencia de cualquier generación de la planta transgénica (i) según una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 3-13 o (ii) generada mediante el método según una cualquiera de las reivindicaciones 2-6 y 8-12 en donde la descendencia comprende el transgén de la amidasa ω, en donde el transgén de la amidasa ω está unido operativamente a un promotor de preferencia radicular.

15. 15.

    Una semilla de cualquier generación de la planta transgénica (i) de una cualquiera de las reivindicaciones y 3-13

    122

    imagen2

    o (ii) generada mediante el método según una cualquiera de las reivindicaciones 2-6 y 8-12, en donde la semilla comprende el transgén de la amidasa ω, en donde el transgén de la amidasa ω está unido operativamente a un promotor de preferencia radicular.

16. 16.

    La planta transgénica según la reivindicación 1 o el método según la reivindicación 2, en donde la planta o la descendencia de la planta tienen al menos una característica de crecimiento mejorada seleccionada entre un aumento en el rendimiento de la biomasa, un aumento en la captación de NO3, un aumento en la clorofila por unidad de peso, un aumento en la fijación de CO2 y un aumento en el rendimiento de la semilla.

17. 17.

    La planta transgénica según una cualquiera de las reivindicaciones 1, 4-13 y 16 o el método según una cualquiera de las reivindicaciones 2, 4-13 y 16, en donde el transgén de la amidasa ω codifica (i) un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada como la SEQ ID NO: 3, o (ii) una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad en la secuencia de al menos el 90 % con la SEQ ID NO: 3, o (iii) una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad en la secuencia de al menos el 75 % con la SEQ ID NO: 3.

18. 18.

    La semilla según la reivindicación 15, en la que el transgén de la amidasa ω codifica (i) un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada como la SEQ ID NO: 3, o (ii) una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad en la secuencia de al menos el 90 % con la SEQ ID NO: 3, o (iii) una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad en la secuencia de al menos el 75 % con la SEQ ID NO: 3.

19. 19.

    La descendencia según la reivindicación 14, en la que el transgén de la amidasa ω codifica (i) un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada como la SEQ ID NO: 3, o (ii) una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad en la secuencia de al menos el 90 % con la SEQ ID NO: 3, o (iii) una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad en la secuencia de al menos el 75 % con la SEQ ID NO: 3.

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