CN101896608A - 镉积累减少的转基因植物 - Google Patents

镉积累减少的转基因植物 Download PDF

Info

Publication number
CN101896608A
CN101896608A CN2007801018689A CN200780101868A CN101896608A CN 101896608 A CN101896608 A CN 101896608A CN 2007801018689 A CN2007801018689 A CN 2007801018689A CN 200780101868 A CN200780101868 A CN 200780101868A CN 101896608 A CN101896608 A CN 101896608A
Authority
CN
China
Prior art keywords
lys
val
ser
glu
leu
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN2007801018689A
Other languages
English (en)
Inventor
皮埃尔·里绍
安托万·格拉沃
帕斯卡利娜·奥鲁瓦
阿拉因·瓦瓦瑟尔
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Commissariat a lEnergie Atomique et aux Energies Alternatives CEA
Original Assignee
Commissariat a lEnergie Atomique et aux Energies Alternatives CEA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Commissariat a lEnergie Atomique et aux Energies Alternatives CEA filed Critical Commissariat a lEnergie Atomique et aux Energies Alternatives CEA
Publication of CN101896608A publication Critical patent/CN101896608A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
    • Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P60/00—Technologies relating to agriculture, livestock or agroalimentary industries
    • Y02P60/20—Reduction of greenhouse gas [GHG] emissions in agriculture, e.g. CO2

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及用于减少植物中镉积累的方法和工具例如多核苷酸、重复表达盒和重组载体以及表达Zn2+/Co2+/Cd2+/Pb2+亚类的植物P1B-型ATP酶的变体的转基因植物，所述转基因植物显示在地上部分中的镉积累减少。

Description

镉积累减少的转基因植物
本发明涉及用于减少植物，特别是烟草中镉积累的工具(means)和方法。
大量耕地中存在浓度逐渐升高的镉。这一方面是由于某些土壤中天然的高金属水平，而另一方面是由于肥料(由于用于制造肥料其的磷盐岩中存在镉)的应用，污水处理站淤泥的扩散，使用城市污水灌溉田地，以及浮质(aerosol)的沉降造成的。由于作为肥料使用的无镉磷酸盐矿被耗尽，在不远的将来，农田中的镉浓度还会持续显著地提高。结果，在植物，主要是供食用的那些植物中存在的镉含量越来越频繁地超过由不同国家规定的标准，或联合国粮农组织推荐的标准。举例而言，绿色沙拉、土豆、胡椒、小麦，特别是烟草的情况正是如此。关于烟草，已知这种植物在叶中积累高水平的镉，文献中报道烟草中的镉浓度为0.5-5ppm。
镉是属于元素周期表中IIB族的金属元素。由于其化学毒性，吸入或摄取高水平的镉将造成人和动物的严重健康风险(包括对呼吸系统、肾脏或肝脏的损伤，以及癌症)。
因此，需要能够在包含高镉浓度的土壤中生长，并且能够具有低的这一有害金属含量的植物。尽管可以依照不同的策略降低植物中的镉浓度，生产转基因植物也可有助于获得此类植物。
Lee等人提出了生产抗性增强且镉吸收减少的植物的方法(2003，PlantPhysiol.133：589-96；和国际申请WO 02/081707)。该作者获得了表达大肠杆菌(Escherichia coli)重金属ZntA蛋白的转基因拟南芥(Arabidopsis thaliana)。此转基因植物具有显示改进的Pb和Cd抗性，并且与野生型相比，其芽(shoot)具有降低的Pb和Cd含量。
ZntA是P1B-型ATP酶(P1B-type ATPase)，其通过使例如Zn2+、Cd2+和Pb2+的二价阳离子主动流出细胞质外，而赋予大肠杆菌对毒性浓度的这些金属离子的抗性(Rensing et al.，1997，PNAS，94：14326-14331；Rensing et al.，1998，J Biol Chem.，273：32614-32617；Dutta et al.，2007，Biochemistry，46：3692-3703)。
P1B-ATP酶是利用ATP水解放能反应释放的能量，使例如Zn2+、Cd2+、Pb2+、Co2+、Cu+和Ag+的软金属阳离子跨膜转移的转运蛋白(Inesi，1985，Annu RevPhysiol.，47：573-601；Axelsen and Palmgren，2001，Plant Physiol.，126：696-706；及综述Argüello et al.，2007，BioMetals，20：233-248)。有时也将它们称作HMA(重金属ATP酶)，或者称作CPx-型ATP酶。P1B-ATP酶发现于原核生物和真核生物，包括古细菌、细菌、酵母、昆虫、植物和哺乳动物中。它们都包含标志性的DKTGT氨基酸序列。基于对底物阳离子的选择性和系统发育分析，将P1B-ATP酶分成两个主要的不同亚类(族)(Rensing et al.，1999，J Bacteriol.，181：5891-5897)Cu+族P1B-ATP酶参与Cu+和Ag+的转运，而Zn2+族P1B-ATP酶转运Zn2+和其他重金属，例如Co2+、Cd2+和Pb2+(Axelsen and Palmgren，2001，如上)。不同亚类的P1B-ATP酶在其跨膜域中具有不同的保守氨基酸基序。举例而言，基于选择转运的阳离子，它们的第六跨膜域包含(C，S，T)P(C，H)基序(Solioz and Vulpe，1996，Trends Biochem Sci.，21：237-241；Rensing et al.，1998，如上；Williams et al.，2000，Biochim Biophys Acta.，1465：104-126；Dutta et al.，2007，如上)。
在拟南芥中，HMA2和HMA4蛋白(分别为AtHMA2和AtHMA4)是与Zn2+/Co2+/Cd2+/Pb2+亚类聚类在一起的P1B-型ATP酶。AtHMA2和AtHMA4在植物(in planta)中位于质膜，并参与这些二价阳离子向植物地上部分的转运(Hussain et al.，2004，Plant Cell.，16：1327-39；Verret et al.，2004，FEBS Lett.，576：306-312)。锌是植物需要的必要微量元素，而钴、镉和铅则具有毒性作用。可分别通过GenBank数据库的登录号GI|12229675和GI|12229637获得AtHMA2和AtHMA4的氨基酸序列；本文中复制AtHMA4氨基酸序列，称为SEQ ID No.1。这些蛋白在其第六跨膜域中包含保守的CPC基序(下文中也称作C1PC2)，并且在其第六和第七跨膜域之间的可溶性环中包含DKTGT基序(Argüello et al.，2007，如上)。在AtHMA4中，第一个半胱氨酸残基(C1)位于氨基酸序列的第357位(Mills et al.，2003，Plant J.，35：164-76)。Mills等人的文章(2003，如上)显示AtHMA4在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中的表达降低了酵母对Cd的敏感性，并且赋予酵母对此金属离子的抗性。在Mills等人2005年公开的第二篇文章(FEBS Letters，579：783-791)中显示在酿酒酵母中表达CPC基序的第一个半胱氨酸(C1)(357C)被甘氨酸取代的AtHMA4突变体(AtHMA4-C357G)没有赋予酵母对Cd和Zn的抗性，即与表达野生型AtHMA4的那些酵母相比，表达AtHMA4-C357G的酵母对高水平的Cd和Zn更为敏感。
现已获得过表达AtHMA4的转基因拟南芥(Verret et al.，如上和国际申请WO 2005/090583)。与Lee等人(如上)获得的表达ZntA(与Zn2+亚类聚类的大肠杆菌P1B-型ATP酶)转基因拟南芥相反，Verret等人获得的转基因拟南芥显示其芽的Zn和Cd含量比野生型提高。
由以上描述可见，依照P1B-型ATP酶的原核生物或植物起源，在转基因植物中表达或过表达与Zn2+亚类聚类的P1B-型ATP酶能导致不同的表型。
在导致获得本发明的研究框架内，本发明的发明人意想不到地发现表达AtHMA4变体(AtHMA4-C357S)(其中第六跨膜域中保守C1PC2基序的第一个半胱氨酸(C1)残基被丝氨酸取代)的酿酒酵母表现降低的Cd转运能力，但Zn外流几乎与野生型酵母相同。随后，本发明的发明人证明了表达AtHMA4-C357S变体的转基因拟南芥对镉的摄取低于野生型，并且有利的是其生理Zn2+微量元素的稳态并没有改变。
因此，在第一方面，本发明提供了减少镉在植物地上部分中积累的方法，其特征在于所述方法包括在所述植物中表达在第六跨膜域具有C1PC2基序且在植物中位于质膜的Zn2+/Co2+/Cd2+/Pb2+亚类植物P1B-型ATP酶的变体，所述变体具有突变，该突变由选自丝氨酸、丙氨酸、组氨酸和苏氨酸组成的组的任何氨基酸取代C1残基组成，其中优选该突变由丝氨酸取代C1残基组成。
术语“地上部分”包括，但不限于芽、叶、茎、花、果实和种子，优选叶和种子。
可通过本领域熟知的方法测定所述P1B-型ATP酶在植物中质膜的定位。举例而言，可引用Hussain et al.，2004和/或Verret et al.，2004(如上)中描述的方法。简要而言，通过水两相分配使植物的总质膜分成部分(fraction)，并通过以P1B-型ATP酶特异性抗体为探针的蛋白质凝胶斑点分析表征所述部分。为了验证所述P1B-型ATP酶在质膜的定位，可将其编码序列与例如绿色荧光蛋白(GFP)的标记酶融合在一个读码框中，并在转基因植物或原生质体内的组成型启动子的控制下表达(瞬时表达)。可通过共焦显微镜观察P1B-型ATP酶-标记酶在细胞中的亚细胞定位。
根据本发明优选的实施方式，所述P1B-型ATP酶来自高等植物，例如拟南芥、烟草(nicotiana)、水稻(Oryza)和杨树(Populus)，且更优选来自与需要进行所述表达的植物相同的植物物种。
在另一个优选的实施方式中，所述P1B-型ATP酶选自拟南芥的HMA4和HMA2、天蓝遏蓝菜(Thlaspi caerulescens)的HMA4(可由GenBank数据库登录号GI|46361-990获得)、叶芽鼠耳芥(Arabidopsis halleri subsp.Gemmifera)的HMA4(可由GenBank数据库登录号GI|63056225获得)、水稻的HMA2和HMA3(可分别由GenBank数据库登录号GI|125598398和GI|125557764获得)和葡萄(Vitis vinifera)的HMA(可由GenBank数据库登录号GI|157357491获得)组成的组。
根据本发明的另一个具体实施方式，所述P1B-型ATP酶与SEQ ID NO：1的AtHMA4蛋白质具有至少50％，优选至少54％的序列同一性，并且按照优选度递增的顺序，具有至少56％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％和99％序列同一性，或者至少70％，优选73％的序列相似性，且按照优选度递增的顺序，具有至少79％、80％、85％、90％、95％、97％、98％和99％的序列相似性，条件是所述P1B-型ATP酶在第六跨膜域中包含保守的C1PC2基序。
除非另有说明，本文提供的蛋白序列同一性和相似性是在包括蛋白完整序列的比较窗口上使用默认参数的BLASTP程序计算的。使用计分矩阵BLOSUM62进行相似度计算。
任选地，上述定义的取代可与旨在改进这些突变体活性的一种或多种其他突变组合。
根据本发明的另一个具体实施方式，所述变体具有氨基酸序列SEQ IDNO：2。此氨基酸序列对应于野生型AtHMA4蛋白(SEQ ID NO：1)，其中此蛋白第六跨膜域中保守C1PC2基序中的第一半胱氨酸(C1)残基被上述氨基酸(即丝氨酸、丙氨酸、组氨酸或苏氨酸)取代。
根据本发明的另一个实施方式，降低镉在植物中积累的方法还进一步包括抑制所述植物中在第六跨膜域具有C1PC2基序且在植物中位于质膜的Zn2+/Co2+/Cd2+/Pb2+亚类的至少一种，优选所有内源性(野生型)P1B-型ATP酶。
本发明的这一实施方式的方法仅涉及表达所述内源性P1B-型ATP酶的植物。实际上，植物可能表达一种或多种上以上定义的内源性P1B-型ATP酶。举例而言，拟南芥表达P1B-型ATP酶的HMA2和HMA4。因此，当此实施方式的方法应用于拟南芥时，此方法包括抑制HMA2和/或HMA4。
可通过消除、阻断或降低其功能，或者通过有利地抑制或下调其基因的表达来获得对内源性P1B-型ATP酶的抑制。
举例而言，可通过诱变相应基因或其启动子，并选择具有部分或完全丧失P1B-型ATP酶活性的突变体来获得对内源性P1B-型ATP酶的抑制。例如，根据突变的性质，在编码序列内的突变能够诱导表达无活性的蛋白；与此相同，在启动子序列内的突变能够诱导所述内源性P1B-型ATP酶的表达缺失，或使其表达下降。
可以通过，例如对内源性P1B-型ATP酶编码序列或启动子或其部分的靶向删除，或在所述编码序列或所述启动子内靶向插入外源序列来进行诱变。还可以通过随机的化学或物理诱变，随后筛选在编码所述内源性P1B-型ATP酶基因内的突变体来进行。用于高通量诱变和筛选的方法在本领域内是已知的。例如，可以引用Hussain et al.，2004(如上)中描述的方法，其中将T-DNA插入到来自拟南芥的hma2和hma4等位基因中，并使突变体在含高浓度Zn的培养基上生长(这些突变体是Zn缺陷型的)。
有利地，可通过沉默相应的基因获得所述内源性P1B-型ATP酶的抑制。用于在植物中沉默基因的方法在本领域中是已知的。例如，可通过反义抑制或共抑制进行。还可使用靶向所述内源性P1B-型ATP酶mRNA的核酶。
在优选的方法中，通过靶向待沉默的所述内源性P1B-型ATP酶编码基因的RNA干扰(RNAi)的方式诱导转录后基因沉默。在本领域中可获得用于递送RNAi的各种方法和DNA构建体(综述参见：Watson et al.，2005，FEBSLetters，579：5982-5987)。
本发明还提供了如上文定义的P1B-型ATP酶蛋白变体。
本发明还提供了用于实施所述表达的工具(means)。
本发明还提供了编码如上文定义的P1B-型ATP酶蛋白变体的多核苷酸。可通过DNA重组技术和/或化学DNA合成的已知方法获得本发明的多核苷酸。这些方法还可以在天然存在的编码如上文定义的P1B-型ATP酶蛋白变体的核苷酸序列中引入所需的取代。
本发明还提供了重组表达盒，其包含在转录启动子控制下编码如上文定义的P1B-型ATP酶变体的多核苷酸，由转录启动子控制以允许在宿主细胞中调控所述多核苷酸。
在优选的实施方式中，所述转录启动子是在植物细胞中发挥功能的任何启动子，即能够在植物细胞中指导编码如上文定义的P1B-型ATP酶的多核苷酸的转录。特别地，可根据希望进行表达的器官或组织，或表达的类型(即组成型或诱导型)来选择更为适合的启动子。本领域中可获得大量适合在植物，特别是在烟草中进行基因表达的启动子。例如，可从植物(例如拟南芥和烟草)、植物病毒或细菌，例如土壤杆菌(Agrobacterium)获得。其包括组成型启动子，即在大多数组织和细胞中以及大多数环境条件下都具有活性的启动子，或仅在或主要在某些组织(例如叶)或某些细胞类型中具有活性的组织或细胞特异性启动子，以及通过物理或化学刺激激活的诱导型启动子。还包括所述内源性P1B-型ATP酶的启动子，其来自与需要进行所述表达的植物相同的植物物种。启动子序列也可重复两次或更多次(例如串联重复)。
常用的组成型启动子的非限制性实例为公知的花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子和胭脂碱合酶(Nos)启动子，木薯叶脉花叶病毒(CsVMV)启动子(Verdaguer et al.，1996，Plant Mol.Biol.，31：1129-39)，用于转基因单子叶植物的质粒pAct1-F4中包含的后接水稻肌动蛋白内含子的水稻肌动蛋白(1或2)启动子(RAP-RAI)(McElroy et al.，1991，Mol.Gen.Genet.，231(1)：150-160)。
表达盒通常还包括转录终止子，例如35S转录终止子或Nos终止子(Depicker et al.，1982，J.Mol.Appl.Genet.，1：561-73)。还可包括其他调控序列，例如转录增强序列。
可将本发明的重组表达盒插入到允许对宿主细胞基因组进行遗传转化的适合的载体中。
因此，本发明还涉及包含上述定义的表达盒的重组载体，其中所述表达盒的启动子优选为在植物细胞中发挥功能的启动子。
本发明还提供了包含上文定义的重组表达盒或重组载体的宿主细胞。
本发明的宿主细胞为原核细胞或真核细胞，优选植物细胞，且更优选烟草细胞。
在另一方面，本发明提供了生产镉积累减少的转基因植物的方法。所述方法包括以下步骤：
a)提供包含上文定义的重组表达盒或重组载体的植物细胞，并且任选地抑制所述植物细胞中如上文定义的内源性P1B-型ATP酶，和
b)由步骤a)中获得的植物细胞再生表达如上述定义的P1B-型ATP酶变体的转基因植物。
由于使用来自植物源的P1B-型ATP酶的变体，本发明方法的优点在于所生产的转基因植物包含最小含量的外源元件或外源序列，从而使所述变体的表达更加稳定且更加有效。
本发明还包括通过本发明的重组表达盒遗传转化并表达如上文定义的P1B-型ATP酶变体的植物。优选所述转基因植物可通过本发明的方法获得。在所述转基因植物中，本发明的重组表达盒包含在整合(即稳定整合)到植物基因组中一个或多个转基因中，从而能够被传递至后续的植物世代。因此，本发明的转基因植物不仅包括从最初转基因获得的植物，而且还包括其后代，只要其包含本发明的重组表达盒。
有利地，与没有所述转基因的相同品种的植物相比，表达如上文定义的P1B-型ATP酶变体的本发明转基因植物表现镉吸收减少，特别是在地上部分中。
因此，本发明提供了转基因植物或其分离的器官(例如种子、叶、花、根、茎、穗，优选叶)或其组织，转基因植物或其分离的器官或其组织在其基因组中稳定整合了包含编码上文定义的P1B-型ATP酶的变体的多核苷酸的重组表达盒。
本发明应用于农业经济目标的单子叶或双子叶植物，例如小麦、大麦、玉米、油菜、水稻、甜菜、菠菜、莴苣、西红柿、烟草，优选烟草。
烟草叶天然地积累并浓缩相对高水平的镉，这些镉在燃烧期间挥发，并对接触镉的吸烟者造成显著的影响。有利地，与野生型烟草或没有上述转基因的烟草相比，来自本发明转基因植物的烟草叶具有较低的镉含量。
因此，另一方面，本发明涉及来自本发明转基因植物的烟草叶在制造烟草产品中的应用，所述烟草产品包括冒烟产品(smoking product)例如卷烟、雪茄和粗烟丝，以及无烟产品例如鼻烟、嚼烟(chewing tobacco)或吮烟(suckingtobacco)等。所述产品也包含在本发明的范围之内。
本发明的上述和其他目标和优点更清楚地体现于下文的详述和附图中。然而，应理解上述详细说明仅为例证，而不是对本发明的限制。
附图说明
图1：a)在液体培养基中培养仅pYES-酵母转化体、AtHMA4-酵母转化体和AtHMA4SPC-酵母转化体，随后测量600nm的光密度(OD)。酵母细胞在存在80μM Cd的条件下于30℃生长48小时。b-d)在与a)相同的条件下进行液体培养。收集细胞，使用10mM EDTA清洗一次，随后使用去矿物质水清洗两次，以除去吸附在酵母细胞壁上的镉。将沉淀物干燥、称重并用HNO3矿化，随后通过ICP-AES测定金属含量；在b)和d)中，在存在80μMCd的条件下进行酵母培养；在c)中，在受控的营养溶液(1.5μM Zn)中进行酵母培养。
图2显示了Wassilewskija生态型拟南芥(Ws)和过表达AtHMA4(CPC)或AtHMA4SPC(SPC)的转基因拟南芥的体外根生长测量。幼苗垂直地生长在不含(对照)或含有以下金属的细菌培养琼脂(bactoagar)营养溶液中：20μM Cd、50μM Zn或200μM Zn。在发芽14天后进行根长度测量。图中表明了100-150个测量的平均值+/-SD。
实施例：表达AtHMA4变体形式的转基因酵母和拟南芥的表征
1)材料和方法
通过定点突变修饰克隆到诱导型酵母载体pYES-GFP(Gravot et al.，2004，FEBS Lett.，561：22-28.)中的拟南芥HMA4cDNA(可由2005年3月10日版的GenBank数据库登录号AF412407获得)。使用丝氨酸取代序列中第357位的半胱氨酸残基(克隆pVF472)，从而获得其中Xaa为氨基酸丝氨酸的氨基酸序列SEQ ID NO：2(命名为AtHMA4SPC)。
将此构建体分别转化入对Cd和Pb高度敏感的酵母突变株(ycfl)(Li et al.，1996，J Biol Chem.，271：6509-6517)和对Zn高度敏感的酵母突变株(zrcl)(MacDiarmid et al.，2003，J Biol Chem.，278：15065-15072)中(分别为克隆pVF4121和pVF4136)，以进行异源试验(heterologous experiments)。
通过PCR进行pVF472的插入，以使其用于克隆到带有强异位启动子CaMV35S的植物载体中(克隆pAP4152和pAP4154)。将载体pAP4154引入到根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)株AglI中。
通过蘸花转染拟南芥植物(Wassilewskija生态型)(Clough and Bent，1998，Plant J.，16：735-743)。在潮霉素上筛选转化体。通过表型表征带有一个构建体插入的纯合植物的多个独立株系。在对照土壤或包含由AtHMA4转运的各种阳离子的培养基中培养野生型(Ws)和过表达AtHMA4变体形式(AtHMA4SPC)的植物。种子在受控环境(8h光周期，在300μmol m-2s-1、21℃和70％相对湿度下)中发芽。在发芽14天后测量根长度。使用T3植物(携带独特T-DNA的纯合植物)进行表型表征。
按照Verret et al.2004，FEBS Lett.，576：306-312中的描述获得过表达AtHMA4的拟南芥。
2)结果
2-1)转染的酵母的表征
2-1-1)使用空载体(pYES)、编码拟南芥野生型HMA4的cDNA(AtHMA4，SEQ ID NO：1)，或者编码第357位的半胱氨酸被取代为丝氨酸的AtHMA4变体的cDNA(AtHMA4SPC，SEQ ID NO：2)转化野生型酿酒酵母。在存在80μM Cd的条件下于30℃进行液体培养，并在48小时期间监测600nm的O.D.。与Verret等人获得结果(2005，FEBS Lett.，579：1515-1522)一致，观察到用野生型AtHMA4转化的酵母在存在80μM Cd的条件下的生长较好。AtHMA4诱导镉耐受性提高。在由变体形式(AtHMA4SPC)转化时，酵母没有表现出这种提高的耐受性，并且生长与对照株相同。结果显示于图1a中。
2-1-2)通过Gravot等人(2004，如上)描述的ICP-AES测定酵母中的金属含量。结果显示于图1b-d中。
如此前Verret等人(如上)的描述，发现表达AtHMA4的酵母中的Cd浓度远低于(60％)对照株中的Cd浓度(图1b)。AtHMA4表达于酵母质膜，并在依赖ATP的Cd/Zn外流中发挥作用。
表达AtHMA4SPC的酵母中的Cd浓度介于其它两个菌株之间(比对照低27.5％)。此观察结果可解释为转运和外流Cd的能力较低。
在以下两种生长条件下测量Zn浓度：在包含1.5μM Zn的营养溶液中，和在存在80μM Cd的条件下。在这两种条件下，AtHMA4-和AtHMA4SPC-转化酵母中的Zn浓度相同，且都低于对照酵母(图1c和图1d)。
这些实验显示即使在存在毒性浓度的Cd的条件下，AtHMA4的Zn转运功能也没有因C357S取代而改变，而Cd转运能力下降。
2-2)转染的拟南芥的表征
通过测量细菌培养琼脂固体培养基上的根长度来测定植物对AtHMA4或AtHMA4SPC转运的各种金属的耐受性。在对照条件下，两种表型的根长度相同。结果显示于图2中。
在存在不同浓度的Zn、Co和Pb的条件下，过表达AtHMA4SPC的幼苗的根长度大于野生型。这些结果与在酵母中获得的结果相符，并且与Verret等人(如上)在过表达天然形式AtHMA4的植物中的观察结果相符。与过表达天然形式AtHMA4的植物相似，过表达AtHMA4变体形式(AtHMA4SPC)的植物表现出对这三种金属的耐受性提高。这是由于更重要的向其芽转运和转移金属的能力。
在存在20μM Cd的条件下，两种株系(野生型和变体)的根长度相同。镉耐受性的提高消失，该镉耐受性的提高在过表达AtHMA4的植物中也观察到。此结果与在酵母中获得的那些结果相符。
综上所述，在第六跨膜域中具有C1PC2基序的源自真核生物的Zn2+/Co2+/Cd2+/Pb2+亚类的P1B-型ATP酶的变体可能由于对镉的亲和力下降而表现出改变的金属转运特异性，其中所述变体具有由丝氨酸取代C1残基的突变。然而，对于其他三种转运金属Co、Pb、Zn，特别是生理性的Zn的转运性质则没有改变。
序列表
<110>原子能与替代能源署
     皮埃尔·里绍
     安托万·格拉沃
     帕斯卡利娜·奥鲁瓦
     阿拉因·瓦瓦瑟尔
 
<120>镉积累减少的转基因植物
 
<130>MJP/XRN/mad-F263/237-WO
 
<160>2
 
<170>PatentIn version 3.3
 
<210>1
<211>1172
<212>PRT
<213>拟南芥(Arabidopsis thaliana)
 
<400>1
 
Met Ala Leu Gln Asn Lys Glu Glu Glu Lys Lys Lys Val Lys Lys Leu
1               5                   10                  15
Gln Lys Ser Tyr Phe Asp Val Leu Gly Ile Cys Cys Thr Ser Glu Val
            20                  25                  30
Pro Ile Ile Glu Asn Ile Leu Lys Ser Leu Asp Gly Val Lys Glu Tyr
        35                  40                  45
Ser Val Ile Val Pro Ser Arg Thr Val Ile Val Val His Asp Ser Leu
    50                  55                  60
Leu Ile Ser Pro Phe Gln Ile Ala Lys Ala Leu Asn Glu Ala Arg Leu
65                  70                  75                  80
Glu Ala Asn Val Arg Val Asn Gly Glu Thr Ser Phe Lys Asn Lys Trp
                85                  90                  95
Pro Ser Pro Phe Ala Val Val Ser Gly Leu Leu Leu Leu Leu Ser Phe
            100                 105                 110
Leu Lys Phe Val Tyr Ser Pro Leu Arg Trp Leu Ala Val Ala Ala Val
        115                 120                 125
Ala Ala Gly Ile Tyr Pro Ile Leu Ala Lys Ala Phe Ala Ser Ile Lys
    130                 135                 140
Arg Pro Arg Ile Asp Ile Asn Ile Leu Val Ile Ile Thr Val Ile Ala
145                 150                 155                 160
Thr Leu Ala Met Gln Asp Phe Met Glu Ala Ala Ala Val Val Phe Leu
                165                 170                 175
Phe Thr Ile Ser Asp Trp Leu Glu Thr Arg Ala Ser Tyr Lys Ala Thr
            180                 185                 190
Ser Val Met Gln Ser Leu Met Ser Leu Ala Pro Gln Lys Ala Ile Ile
        195                 200                 205
Ala Glu Thr Gly Glu Glu Val Glu Val Asp Glu Val Lys Val Asp Thr
    210                 215                 220
Val Val Ala Val Lys Ala Gly Glu Thr Ile Pro Ile Asp Gly Ile Val
225                 230                 235                 240
Val Asp Gly Asn Cys Glu Val Asp Glu Lys Thr Leu Thr Gly Glu Ala
                245                 250                 255
Phe Pro Val Pro Lys Gln Arg Asp Ser Thr Val Trp Ala Gly Thr Ile
            260                 265                 270
Asn Leu Asn Gly Tyr Ile Cys Val Lys Thr Thr Ser Leu Ala Gly Asp
        275                 280                 285
Cys Val Val Ala Lys Met Ala Lys Leu Val Glu Glu Ala Gln Ser Ser
    290                 295                 300
Lys Thr Lys Ser Gln Arg Leu Ile Asp Lys Cys Ser Gln Tyr Tyr Thr
305                 310                 315                 320
Pro Ala Ile Ile Leu Val Ser Ala Cys Val Ala Ile Val Pro Val Ile
                325                 330                 335
Met Lys Val His Asn Leu Lys His Trp Phe His Leu Ala Leu Val Val
            340                 345                 350
Leu Val Ser Gly Cys Pro Cys Gly Leu Ile Leu Ser Thr Pro Val Ala
        355                 360                 365
Thr Phe Cys Ala Leu Thr Lys Ala Ala Thr Ser Gly Leu Leu Ile Lys
    370                 375                 380
Ser Ala Asp Tyr Leu Asp Thr Leu Ser Lys Ile Lys Ile Val Ala Phe
385                 390                 395                 400
Asp Lys Thr Gly Thr Ile Thr Arg Gly Glu Phe Ile Val Ile Asp Phe
                405                 410                 415
Lys Ser Leu Ser Arg Asp Ile Asn Leu Arg Ser Leu Leu Tyr Trp Val
            420                 425                 430
Ser Ser Val Glu Ser Lys Ser Ser His Pro Met Ala Ala Thr Ile Val
        435                 440                 445
Asp Tyr Ala Lys Ser Val Ser Val Glu Pro Arg Pro Glu Glu Val Glu
    450                 455                 460
Asp Tyr Gln Asn Phe Pro Gly Glu Gly Ile Tyr Gly Lys Ile Asp Gly
465                 470                 475                 480
Asn Asp Ile Phe Ile Gly Asn Lys Lys Ile Ala Ser Arg Ala Gly Cys
                485                 490                 495
Ser Thr Val Pro Glu Ile Glu Val Asp Thr Lys Gly Gly Lys Thr Val
            500                 505                 510
Gly Tyr Val Tyr Val Gly Glu Arg Leu Ala Gly Phe Phe Asn Leu Ser
        515                 520                 525
Asp Ala Cys Arg Ser Gly Val Ser Gln Ala Met Ala Glu Leu Lys Ser
    530                 535                 540
Leu Gly Ile Lys Thr Ala Met Leu Thr Gly Asp Asn Gln Ala Ala Ala
545                 550                 555                 560
Met His Ala Gln Glu Gln Leu Gly Asn Val Leu Asp Val Val His Gly
                565                 570                 575
Asp Leu Leu Pro Glu Asp Lys Ser Arg Ile Ile Gln Glu Phe Lys Lys
            580                 585                 590
Glu Gly Pro Thr Ala Met Val Gly Asp Gly Val Asn Asp Ala Pro Ala
        595                 600                 605
Leu Ala Thr Ala Asp Ile Gly Ile Ser Met Gly Ile Ser Gly Ser Ala
    610                 615                 620
Leu Ala Thr Gln Thr Gly Asn Ile Ile Leu Met Ser Asn Asp Ile Arg
625                 630                 635                 640
Arg Ile Pro Gln Ala Val Lys Leu Ala Arg Arg Ala Arg Arg Lys Val
                645                 650                 655
Val Glu Asn Val Cys Leu Ser Ile Ile Leu Lys Ala Gly Ile Leu Ala
            660                 665                 670
Leu Ala Phe Ala Gly His Pro Leu Ile Trp Ala Ala Val Leu Val Asp
        675                 680                 685
Val Gly Thr Cys Leu Leu Val Ile Phe Asn Ser Met Leu Leu Leu Arg
    690                 695                 700
Glu Lys Lys Lys Ile Gly Asn Lys Lys Cys Tyr Arg Ala Ser Thr Ser
705                 710                 715                 720
Lys Leu Asn Gly Arg Lys Leu Glu Gly Asp Asp Asp Tyr Val Val Asp
                725                 730                 735
Leu Glu Ala Gly Leu Leu Thr Lys Ser Gly Asn Gly Gln Cys Lys Ser
            740                 745                 750
Ser Cys Cys Gly Asp Lys Lys Asn Gln Glu Asn Val Val Met Met Lys
        755                 760                 765
Pro Ser Ser Lys Thr Ser Ser Asp His Ser His Pro Gly Cys Cys Gly
    770                 775                 780
Asp Lys Lys Glu Glu Lys Val Lys Pro Leu Val Lys Asp Gly Cys Cys
785                 790                 795                 800
Ser Glu Lys Thr Arg Lys Ser Glu Gly Asp Met Val Ser Leu Ser Ser
                805                 810                 815
Cys Lys Lys Ser Ser His Val Lys His Asp Leu Lys Met Lys Gly Gly
            820                 825                 830
Ser Gly Cys Cys Ala Ser Lys Asn Glu Lys Gly Lys Glu Val Val Ala
        835                 840                 845
Lys Ser Cys Cys Glu Lys Pro Lys Gln Gln Val Glu Ser Val Gly Asp
    850                 855                 860
Cys Lys Ser Gly His Cys Glu Lys Lys Lys Gln Ala Glu Asp Ile Val
865                 870                 875                 880
Val Pro Val Gln Ile Ile Gly His Ala Leu Thr His Val Glu Ile Glu
                885                 890                 895
Leu Gln Thr Lys Glu Thr Cys Lys Thr Ser Cys Cys Asp Ser Lys Glu
            900                 905                 910
Lys Val Lys Glu Thr Gly Leu Leu Leu Ser Ser Glu Asn Thr Pro Tyr
        915                 920                 925
Leu Glu Lys Gly Val Leu Ile Lys Asp Glu Gly Asn Cys Lys Ser Gly
    930                 935                 940
Ser Glu Asn Met Gly Thr Val Lys Gln Ser Cys His Glu Lys Gly Cys
945                 950                 955                 960
Ser Asp Glu Lys Gln Thr Gly Glu Ile Thr Leu Ala Ser Glu Glu Glu
                965                 970                 975
Thr Asp Asp Gln Asp Cys Ser Ser Gly Cys Cys Val Asn Glu Gly Thr
            980                 985                 990
Val Lys Gln Ser Phe Asp Glu Lys Lys His Ser Val Leu Val Glu Lys
        995                 1000                 1005
Glu Gly Leu Asp Met Glu Thr Gly Phe Cys Cys Asp Ala Lys Leu
    1010                1015                1020
Val Cys Cys Gly Asn Thr Glu Gly Glu Val Lys Glu Gln Cys Arg
    1025                1030                1035
Leu Glu Ile Lys Lys Glu Glu His Cys Lys Ser Gly Cys Cys Gly
    1040                1045                1050
Glu Glu Ile Gln Thr Gly Glu Ile Thr Leu Val Ser Glu Glu Glu
    1055                1060                1065
Thr Glu Ser Thr Asn Cys Ser Thr Gly Cys Cys Val Asp Lys Glu
    1070                1075                1080
Glu Val Thr Gln Thr Cys His Glu Lys Pro Ala Ser Leu Val Val
    1085                1090                1095
Ser Gly Leu Glu Val Lys Lys Asp Glu His Cys Glu Ser Ser His
    1100                1105                1110
Arg Ala Val Lys Val Glu Thr Cys Cys Lys Val Lys Ile Pro Glu
    1115                1120                1125
Ala Cys  Ala Ser Lys Cys Arg  Asp Arg Ala Lys Arg His Ser Gly
    1130                1135                1140
Lys Ser  Cys Cys Arg Ser Tyr  Ala Lys Glu Leu Cys Ser His Arg
    1145                1150                1155
His His His His His His His His His His His Val Ser Ala
    1160                1165                1170
 
<210>2
<211>1172
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>AtHMA4变体
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(357)..(357)
<223>Xaa选自由Ser、Ala、His和Thr组成的组
 
<400>2
 
Met Ala Leu Gln Asn Lys Glu Glu Glu Lys Lys Lys Val Lys Lys Leu
1               5                   10                  15
Gln Lys Ser Tyr Phe Asp Val Leu Gly Ile Cys Cys Thr Ser Glu Val
            20                  25                  30
Pro Ile Ile Glu Asn Ile Leu Lys Ser Leu Asp Gly Val Lys Glu Tyr
        35                  40                  45
Ser Val Ile Val Pro Ser Arg Thr Val Ile Val Val His Asp Ser Leu
    50                  55                  60
Leu Ile Ser Pro Phe Gln Ile Ala Lys Ala Leu Asn Glu Ala Arg Leu
65                  70                  75                  80
Glu Ala Asn Val Arg Val Asn Gly Glu Thr Ser Phe Lys Asn Lys Trp
                85                  90                  95
Pro Ser Pro Phe Ala Val Val Ser Gly Leu Leu Leu Leu Leu Ser Phe
            100                 105                 110
Leu Lys Phe Val Tyr Ser Pro Leu Arg Trp Leu Ala Val Ala Ala Val
        115                 120                 125
Ala Ala Gly Ile Tyr Pro Ile Leu Ala Lys Ala Phe Ala Ser Ile Lys
    130                 135                 140
Arg Pro Arg Ile Asp Ile Asn Ile Leu Val Ile Ile Thr Val Ile Ala
145                 150                 155                 160
Thr Leu Ala Met Gln Asp Phe Met Glu Ala Ala Ala Val Val Phe Leu
                165                 170                 175
Phe Thr Ile Ser Asp Trp Leu Glu Thr Arg Ala Ser Tyr Lys Ala Thr
            180                 185                 190
Ser Val Met Gln Ser Leu Met Ser Leu Ala Pro Gln Lys Ala Ile Ile
        195                 200                 205
Ala Glu Thr Gly Glu Glu Val Glu Val Asp Glu Val Lys Val Asp Thr
    210                 215                 220
Val Val Ala Val Lys Ala Gly Glu Thr Ile Pro Ile Asp Gly Ile Val
225                 230                 235                 240
Val Asp Gly Asn Cys Glu Val Asp Glu Lys Thr Leu Thr Gly Glu Ala
                245                 250                 255
Phe Pro Val Pro Lys Gln Arg Asp Ser Thr Val Trp Ala Gly Thr Ile
            260                 265                 270
Asn Leu Asn Gly Tyr Ile Cys Val Lys Thr Thr Ser Leu Ala Gly Asp
        275                 280                 285
Cys Val Val Ala Lys Met Ala Lys Leu Val Glu Glu Ala Gln Ser Ser
    290                 295                 300
Lys Thr Lys Ser Gln Arg Leu Ile Asp Lys Cys Ser Gln Tyr Tyr Thr
305                 310                 315                 320
Pro Ala Ile Ile Leu Val Ser Ala Cys Val Ala Ile Val Pro Val Ile
                325                 330                 335
Met Lys Val His Asn Leu Lys His Trp Phe His Leu Ala Leu Val Val
            340                 345                 350
Leu Val Ser Gly Xaa Pro Cys Gly Leu Ile Leu Ser Thr Pro Val Ala
        355                 360                 365
Thr Phe Cys Ala Leu Thr Lys Ala Ala Thr Ser Gly Leu Leu Ile Lys
    370                 375                 380
Ser Ala Asp Tyr Leu Asp Thr Leu Ser Lys Ile Lys Ile Val Ala Phe
385                 390                 395                 400
Asp Lys Thr Gly Thr Ile Thr Arg Gly Glu Phe Ile Val Ile Asp Phe
                405                 410                 415
Lys Ser Leu Ser Arg Asp Ile Asn Leu Arg Ser Leu Leu Tyr Trp Val
            420                 425                 430
Ser Ser Val Glu Ser Lys Ser Ser His Pro Met Ala Ala Thr Ile Val
        435                 440                 445
Asp Tyr Ala Lys Ser Val Ser Val Glu Pro Arg Pro Glu Glu Val Glu
    450                 455                 460
Asp Tyr Gln Asn Phe Pro Gly Glu Gly Ile Tyr Gly Lys Ile Asp Gly
465                 470                 475                 480
Asn Asp Ile Phe Ile Gly Asn Lys Lys Ile Ala Ser Arg Ala Gly Cys
                485                 490                 495
Ser Thr Val Pro Glu Ile Glu Val Asp Thr Lys Gly Gly Lys Thr Val
            500                 505                 510
Gly Tyr Val Tyr Val Gly Glu Arg Leu Ala Gly Phe Phe Asn Leu Ser
        515                 520                 525
Asp Ala Cys Arg Ser Gly Val Ser Gln Ala Met Ala Glu Leu Lys Ser
    530                 535                 540
Leu Gly Ile Lys Thr Ala Met Leu Thr Gly Asp Asn Gln Ala Ala Ala
545                 550                 555                 560
Met His Ala Gln Glu Gln Leu Gly Asn Val Leu Asp Val Val His Gly
                565                 570                 575
Asp Leu Leu Pro Glu Asp Lys Ser Arg Ile Ile Gln Glu Phe Lys Lys
            580                 585                 590
Glu Gly Pro Thr Ala Met Val Gly Asp Gly Val Asn Asp Ala Pro Ala
        595                 600                 605
Leu Ala Thr Ala Asp Ile Gly Ile Ser Met Gly Ile Ser Gly Ser Ala
    610                 615                 620
Leu Ala Thr Gln Thr Gly Asn Ile Ile Leu Met Ser Asn Asp Ile Arg
625                 630                 635                 640
Arg Ile Pro Gln Ala Val Lys Leu Ala Arg Arg Ala Arg Arg Lys Val
                645                 650                 655
Val Glu Asn Val Cys Leu Ser Ile Ile Leu Lys Ala Gly Ile Leu Ala
            660                 665                 670
Leu Ala Phe Ala Gly His Pro Leu Ile Trp Ala Ala Val Leu Val Asp
        675                 680                 685
Val Gly Thr Cys Leu Leu Val Ile Phe Asn Ser Met Leu Leu Leu Arg
    690                 695                 700
Glu Lys Lys Lys Ile Gly Asn Lys Lys Cys Tyr Arg Ala Ser Thr Ser
705                 710                 715                 720
Lys Leu Asn Gly Arg Lys Leu Glu Gly Asp Asp Asp Tyr Val Val Asp
                725                 730                 735
Leu Glu Ala Gly Leu Leu Thr Lys Ser Gly Asn Gly Gln Cys Lys Ser
            740                 745                 750
Ser Cys Cys Gly Asp Lys Lys Asn Gln Glu Asn Val Val Met Met Lys
        755                 760                 765
Pro Ser Ser Lys Thr Ser Ser Asp His Ser His Pro Gly Cys Cys Gly
    770                 775                 780
Asp Lys Lys Glu Glu Lys Val Lys Pro Leu Val Lys Asp Gly Cys Cys
785                 790                 795                 800
Ser Glu Lys Thr Arg Lys Ser Glu Gly Asp Met Val Ser Leu Ser Ser
                805                 810                 815
Cys Lys Lys Ser Ser His Val Lys His Asp Leu Lys Met Lys Gly Gly
            820                 825                 830
Ser Gly Cys Cys Ala Ser Lys Asn Glu Lys Gly Lys Glu Val Val Ala
        835                 840                 845
Lys Ser Cys Cys Glu Lys Pro Lys Gln Gln Val Glu Ser Val Gly Asp
    850                 855                 860
Cys Lys Ser Gly His Cys Glu Lys Lys Lys Gln Ala Glu Asp Ile Val
865                 870                 875                 880
Val Pro Val Gln Ile Ile Gly His Ala Leu Thr His Val Glu Ile Glu
                885                 890                 895
Leu Gln Thr Lys Glu Thr Cys Lys Thr Ser Cys Cys Asp Ser Lys Glu
            900                 905                 910
Lys Val Lys Glu Thr Gly Leu Leu Leu Ser Ser Glu Asn Thr Pro Tyr
        915                 920                 925
Leu Glu Lys Gly Val Leu Ile Lys Asp Glu Gly Asn Cys Lys Ser Gly
    930                 935                 940
Ser Glu Asn Met Gly Thr Val Lys Gln Ser Cys His Glu Lys Gly Cys
945                 950                 955                 960
Ser Asp Glu Lys Gln Thr Gly Glu Ile Thr Leu Ala Ser Glu Glu Glu
                965                 970                 975
Thr Asp Asp Gln Asp Cys Ser Ser Gly Cys Cys Val Asn Glu Gly Thr
            980                 985                 990
Val Lys Gln Ser Phe Asp Glu Lys Lys His Ser Val Leu Val Glu Lys
        995                 1000                1005
Glu Gly Leu Asp Met Glu Thr Gly Phe Cys Cys Asp Ala Lys Leu
    1010                1015                1020
Val Cys Cys Gly Asn Thr Glu Gly Glu Val Lys Glu Gln Cys Arg
    1025                1030                1035
Leu Glu Ile Lys Lys Glu Glu His Cys Lys Ser Gly Cys Cys Gly
    1040                1045                1050
Glu Glu Ile Gln Thr Gly Glu Ile Thr Leu Val Ser Glu Glu Glu
    1055                1060                1065
Thr Glu Ser Thr Asn Cys Ser Thr Gly Cys Cys Val Asp Lys Glu
    1070                1075                1080
Glu Val Thr Gln Thr Cys His Glu Lys Pro Ala Ser Leu Val Val
    1085                1090                1095
Ser Gly Leu Glu Val Lys Lys Asp Glu His Cys Glu Ser Ser His
    1100                1105                1110
Arg Ala Val Lys Val Glu Thr Cys Cys Lys Val Lys Ile Pro Glu
    1115                1120                1125
Ala Cys Ala Ser Lys Cys Arg Asp Arg Ala Lys Arg His Ser Gly
    1130                1135                1140
Lys Ser Cys Cys Arg Ser Tyr Ala Lys Glu Leu Cys Ser His Arg
    1145                1150                1155
His His His His His His His His His His His Val Ser Ala
    1160                1165                1170

Claims (18)

1.用于减少镉在植物地上部分中积累的方法，其特征在于所述方法包括在所述植物中表达在第六跨膜域具有C1PC2基序且在植物中位于质膜的Zn2+/Co2+/Cd2+/Pb2+亚类的植物P1B-型ATP酶的变体，所述变体具有突变，该突变由选自丝氨酸、丙氨酸、组氨酸和苏氨酸组成的组中的任何氨基酸取代C1残基所组成。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述P1B-型ATP酶来自高等植物。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述P1B-型ATP酶来自与需要进行所述表达的植物相同的植物物种。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于所述P1B-型ATP酶选自由来自拟南芥的HMA4和HMA2、来自天蓝遏蓝菜的HMA4、来自叶芽鼠耳芥的HMA4、来自水稻的HMA2和HMA3以及来自葡萄的HMA组成的组。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于所述P1B-型ATP酶的变体具有氨基酸序列SEQ ID NO：2。
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于所述方法还包括抑制在第六跨膜域具有C1PC2基序且在植物中位于质膜的Zn2+/Co2+/Cd2+/Pb2+亚类的至少一种内源性P1B-型ATP酶。
7.权利要求1-5中任一项定义的P1B-型ATP酶的变体。
8.一种多核苷酸，其特征在于其编码权利要求7所述的P1B-型ATP酶的变体。
9.一种重组表达盒，其特征在于其包含在转录启动子控制下的权利要求8所述的多核苷酸。
10.一种重组载体，其特征在于其包含权利要求9所述的重组表达盒，其中所述表达盒的启动子优选为在植物细胞中发挥功能的启动子。
11.一种宿主细胞，其特征在于其包含权利要求9所述的重组表达盒或权利要求10所述的重组载体。
12.如权利要求11所述的宿主细胞，其特征在于其为植物细胞，优选为烟草细胞。
13.用于生产镉积累减少的转基因植物的方法，其特征在于其包括以下步骤：
a)提供权利要求12所述的植物细胞，并且任选地该植物细胞内的如权利要求6所定义的内源性P1B-型ATP酶被抑制，和
b)由步骤a)中获得的植物细胞再生表达权利要求1-5中任一项所定义的P1B-型ATP酶的变体的转基因植物。
14.一种转基因植物，其可由权利要求13的方法获得。
15.一种转基因植物或分离的其器官或其组织，其特征在于其包含稳定地整合到其基因组中的权利要求9所述的重组表达盒。
16.如权利要求14或15所述的转基因植物，其特征在于其为转基因烟草植物。
17.如权利要求15所述的分离的器官，其特征在于其为烟草叶。
18.权利要求17所述的烟草叶在制备烟草产品中的应用。
CN2007801018689A 2007-12-12 2007-12-12 镉积累减少的转基因植物 Pending CN101896608A (zh)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/IB2007/004420 WO2009074843A1 (en) 2007-12-12 2007-12-12 Genetically modified plants displaying reduced accumulation of cadmium

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN101896608A true CN101896608A (zh) 2010-11-24

Family

ID=39731138

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2007801018689A Pending CN101896608A (zh) 2007-12-12 2007-12-12 镉积累减少的转基因植物

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20110023177A1 (zh)
EP (1) EP2231862B1 (zh)
CN (1) CN101896608A (zh)
BR (1) BRPI0722297A2 (zh)
WO (1) WO2009074843A1 (zh)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102775484A (zh) * 2012-08-13 2012-11-14 合肥工业大学 一种提高植物耐镉的基因及其应用
CN105543397A (zh) * 2016-02-26 2016-05-04 中国科学院植物研究所 水稻籽粒镉含量相关基因LCd-38的SNP分子标记的应用
CN105624319A (zh) * 2016-03-24 2016-06-01 中国科学院植物研究所 水稻籽粒镉含量相关基因LCd-31的SNP分子标记的应用
CN105671164A (zh) * 2016-02-29 2016-06-15 中国科学院植物研究所 水稻籽粒镉含量相关基因LCd-41的SNP分子标记的应用
CN106636137A (zh) * 2017-01-18 2017-05-10 云南省烟草农业科学研究院 一种NtHMA4基因突变体的制备方法与应用

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2431471A1 (en) * 2010-09-17 2012-03-21 Université Catholique De Louvain Methods for increasing the size of plants or plant organs
EP2622081B9 (en) 2010-09-30 2016-07-06 Société Nationale d'Exploitation Industrielle des Tabacs et Allumettes S.E.I.T.A. Tobacco with reduced cadmium content
EP3407704B1 (en) 2016-01-29 2024-08-14 Philip Morris Products S.A. Reducing cadmium accumulation in field grown tobacco plants
CN111733167B (zh) * 2020-06-22 2023-05-23 中国水稻研究所 水稻铜高积累突变体hc1的突变基因OsHMA4及其应用
WO2024136756A1 (en) * 2022-12-20 2024-06-27 Temasek Life Sciences Laboratory Limited Generation of low-arsenic and low-cadmium rice by overexpressing ospcs1, osabcc1 and oshma3 genes under the control of rice actin1 promoter

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1551921A (zh) * 2001-04-04 2004-12-01 Posco 增强抗性并减少重金属吸收的植物遗传改良

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102775484A (zh) * 2012-08-13 2012-11-14 合肥工业大学 一种提高植物耐镉的基因及其应用
CN102775484B (zh) * 2012-08-13 2013-11-06 合肥工业大学 一种提高植物耐镉的基因及其应用
CN105543397A (zh) * 2016-02-26 2016-05-04 中国科学院植物研究所 水稻籽粒镉含量相关基因LCd-38的SNP分子标记的应用
CN105543397B (zh) * 2016-02-26 2018-12-25 中国科学院植物研究所 水稻籽粒镉含量相关基因LCd-38的SNP分子标记的应用
CN105671164A (zh) * 2016-02-29 2016-06-15 中国科学院植物研究所 水稻籽粒镉含量相关基因LCd-41的SNP分子标记的应用
CN105624319A (zh) * 2016-03-24 2016-06-01 中国科学院植物研究所 水稻籽粒镉含量相关基因LCd-31的SNP分子标记的应用
CN105624319B (zh) * 2016-03-24 2018-12-25 中国科学院植物研究所 水稻籽粒镉含量相关基因LCd-31的SNP分子标记的应用
CN106636137A (zh) * 2017-01-18 2017-05-10 云南省烟草农业科学研究院 一种NtHMA4基因突变体的制备方法与应用
CN106636137B (zh) * 2017-01-18 2019-11-12 云南省烟草农业科学研究院 一种NtHMA4基因突变体的制备方法与应用

Also Published As

Publication number Publication date
EP2231862A1 (en) 2010-09-29
EP2231862B1 (en) 2013-02-13
US20110023177A1 (en) 2011-01-27
BRPI0722297A2 (pt) 2014-06-03
WO2009074843A1 (en) 2009-06-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101896608A (zh) 镉积累减少的转基因植物
US11066677B2 (en) Plants with enhanced tolerance to multiple abiotic stresses
EP2123753B1 (en) Plant having increased yield of seeds
CN101775381A (zh) 植物抗逆相关的蛋白激酶及其编码基因与应用
US20150218578A1 (en) Methods of increasing tolerance to heat stress and amino acid content of plants
EP2539456B1 (en) Increasing plant growth by modulating omega-amidase expression in plants
US10370675B2 (en) Transgenic plants exhibiting enhanced phytochelatin-based heavy metal tolerance and methods of use thereof
US12012608B2 (en) Transgenic maize plant exhibiting increased yield and drought tolerance
Gong et al. Tobacco PIC1 mediates iron transport and regulates chloroplast development
US10738318B2 (en) HaHB11 provides improved plant yield and tolerance to abiotic stress
BRPI0713698A2 (pt) gene e proteìna para capacidade de adaptação à limitação de nitrogênio e modulação dos mesmos
US20150203864A1 (en) Myb55 promoter and use thereof
CN102154318B (zh) 饭豆柠檬酸转运子基因VuMATE及其应用
CN104093840A (zh) 调控植物生长基因的克隆及其在提高作物产量中的应用
CA2474939A1 (en) Methods for modifying plant responses to stress and correspondingly derived plants
JP6121942B2 (ja) 植物のバイオマス量を増産させる遺伝子及びその利用方法
CN107827963B (zh) 拟南芥idd14基因在提升植物干旱胁迫耐性中的应用
Saad et al. Development of a marker-free engineered durum wheat overexpressing Lobularia maritima GASA1 with improved drought tolerance
CN114807191B (zh) 大麦HvChit34基因及其用途
KR101985321B1 (ko) 벼 유래 OsAIR2 유전자를 이용한 중금속 스트레스 내성이 증가된 형질전환 식물체의 제조방법 및 그에 따른 식물체
WO2012034865A1 (en) Methods for increasing the size of plants or plant organs
KR101296619B1 (ko) 벼 유래 ＯｓＩＤＤ10 유전자의 발현을 조절함으로써 식물의 뿌리 형태를 조절하는 방법
CN101133159A (zh) 使用AtBG1基因产生对多种胁迫具有增加的抗性的转基因植物

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20101124

WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication