CN102775484A - 一种提高植物耐镉的基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种具有耐镉及增加植物镉吸收的植物耐镉蛋白及其编码基因，其特征在于：该蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID No：2所示；核苷酸序列如SEQ ID No：1所示，本发明通过诱导或转入植物中上述耐镉蛋白编码基因的表达以增强植物对镉的耐受性，因此可以利用转基因技术克隆重组有上述基因的植株种植在镉污染的环境中以修复土壤环境。

Description

一种提高植物耐镉的基因及其应用

一、技术领域

本发明涉及生物工程领域，具体地说是一种提高植物耐镉相关蛋白及其编码基因与应用，特别涉及利用该基因增加植物对镉毒害耐受的方法。 

二、背景技术

近些年来，由于工业化的空前扩张，大量的矿物能源和资源被被开发，使得这些原本固定在岩石中的重金属得以大量释放到生命活动可以触及的空间。这些重金属造成的污染不仅会对土壤、水源造成严重危害；一旦进入生物体，更会极大损坏机体的正常功能。重金属造成的水源和土壤污染已对全球的生态环境、食品安全、人类身体健康和农业可持续发展构成严重威胁。因此，重金属污染一直是人类最关心的问题之一，而重金属对于生物体的毒害也一直是科学研究的热点。 

镉（Cd）是一种最具毒性的重金属元素之一，具有很强的生物迁移性，极易被植物吸收并积累。土壤中Cd超过一定浓度时，就会影响植物的生理生化过程和生长发育，如对叶绿素有破坏作用，促进抗坏血酸分解，并能抑制植物各种功能酶活性，从而影响作物产量和品质；更为严重的是，Cd²⁺被作物富集吸收进入食物链，进而引起骨质疏松、贫血、高血压抑及肾损伤等疾病。所以，培育在污染土壤上生长的耐镉作物新品种成为人们关注的重点。 

拟南芥作为一种模式植物，广泛用于植物遗传学、发育生物学和分子生物学等研究领域。拟南芥的大多数基因在其它植物中都能找到，有关拟南芥的任何发现都能应用于其它植物研究。因此，对拟南芥抗重金属毒害分子生物学机制的研究对特定区域提高作物的产量和增加食品安全性具有重要的理论与经济意义。拟南芥基因组已完全测序，根据拟南芥测序数据库（www.arabidopsis.org）寻找和发现新的具有自主知识产权的功能基因是国际植物学研究领域的热点之一，也是不同国家之间科技竞争的焦点。拟南芥共有约1.3亿个碱基对，2.9万个基因，其中大部分基因的功能还不清楚，而利用T-DNA插入技术研究基因功能已成为一种有效的方法。 

面对日益严重的重金属污染尤其是土壤污染问题，寻找耐受重金属的植物修复基因并阐明其功能具有重要的理论及实践意义。 

发明内容

本发明的目的是提供一种具有耐镉及增加植物镉吸收的植物耐镉蛋白及其编码基因，通过该基因的过量表达可明显增强转基因植物对镉的耐受性。 

本发明所提供的植物耐镉及增加植物镉吸收相关蛋白的编码基因，命名为XCD1（AT3G10890），来源于哥伦比亚野生型的拟南芥，其蛋白是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质： 

（1）序列表中的SEQ ID No：2； 

（2）将序列表中SEQ ID No：2的氨基酸残基序列经取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基后衍生的与SEQ ID No：2限定的蛋白质具有相同活性的序列。 

所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。 

XCD1的编码基因也属于本发明的保护范围。 

XCD1基因，选自下述核甘酸序列之一； 

（1）序列表中SEQ ID No：1的DNA序列； 

（2）编码序列表中SEQ ID No：2蛋白质序列的多核苷酸； 

（3）在严谨条件下可与序列表中SEQ ID No：1限定的DNA序列杂交的核甘酸序列； 

（4）与序列表中SEQ ID No：l限定的DNA序列具有90%以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。 

序列表中的序列1由1546个碱基组成，其开放阅读框架(ORF)为自5’端第1位至1546位碱基，编码序列SEQ ID No：2的蛋白质。 

含有本发明XCD1的表达载体、细胞系和宿主菌均属于本发明的保护范围。扩增XCD1中任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。 

本发明的第二个目的是提供一种利用该基因提高植物耐镉及增加植物中镉含量的方法。 

本发明所提供的提高植物耐镉及增加植物中镉含量的方法，是诱导或转入植物中的上述植物耐镉蛋白编码基因的表达。 

诱导植物中的上述植物耐镉蛋白编码基因XCD1的表达可通过植物转基因技术的过量表达实现。本发明激活基因表达的方法并不限于此种方法,只要能激活XCD1基因表达均可。 

利用任何一种可引导外源基因的在植物中表达带有强启动子的载体，将本发明所提供的XCD1转入植物中，植物表现为耐镉。 

本发明利用正向遗传学手段从化学诱导型激活标签子系统构建的XVE突变体库中筛选并通过表型鉴定得到功能获得型耐镉突变体xcd1，通过Tail-PCR技术获得其基因序列，经华 大基因测序并在NCBI数据库中Blast比对，最后进行基因定位，获得一个新的耐镉基因XCD1。通过转基因技术，构建XCD1基因的过量表达载体，导入根癌农杆菌GV3101菌株中，用花絮浸渍法进行拟南芥植株的遗传转化，并用抗生素筛选出3株转化株，该转基因植株在镉胁迫下表现出明显的耐镉性状。 

本发明的XCD1基因或其反义核酸在构建到植物表达载体中时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强启动子或诱导型启动子。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，如加入植物可选择性标记(GUS基因、萤光素酶基因等)或具有抗性的抗生素标记物（庆大霉素，卡那霉素等）。被转化的植物宿主既可以是单子叶植物或双子叶植物，如水稻、小麦、油菜、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草或苜宿等。携带有本发明XCD1基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导，农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物经组织培育成植株。 

本发明根据拟南芥数据库公布的基因组序列，XCD1编码一个(1,4)-β-甘露聚糖内水解酶。发明人发现在外加激素β-estradiol（β-雌二醇）诱导下，用镉处理突变体xcd1，植株表现为对镉耐受，这表明XCD1基因涉及镉耐受性的调控。我们研究该基因的表达，分析显示外加激素诱导下镉处理可诱导GSH1基因转录水平显著提高，这说明诱导基因XCD1表达可以激活在拟南芥中螯合解毒机制中扮演重要角色的GSH1编码基因的表达，将镉螯合到不活跃的细胞器中，从而表现为对镉耐受。同时，对XCD1基因构建过量表达转基因植株，发现其亦表现为明显的镉耐受。因此，利用转基因技术克隆重组有XCD1基因的植株不但可提高农作物类耐镉生长，而且是土壤修复的良好材料。 

下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步的说明。 

三、附图说明

图1是在含有100μMCdCl₂的1/2MS培养基中水平培养1周筛选到耐镉突变体株xcd1。 

图2是突变体xcd1和野生型（WT，下同）植株对镉耐受性比较（图2A1-A4分别表示在1/2MS，1/2MS+10μM β-estradio，1/2MS+75μM CdCl₂，1/2MS+10μM-estradiol+75μMCdCl₂四种培养条件下表型；图2B是根长比较；图2C是鲜重比较；图2D镉含量比较）。 

图3是VEX载体插入位点分析。 

图4是XCD1基因的35S过量表达（图4A是分子水平鉴定；图4B1-B3分别表示在1/2MS，1/2MS+50μM CdCl₂，1/2MS+75μM CdCl₂培养条件下的表型分析；图4C是根长根长比较；图 4D是鲜重比较；图4E是镉含量比较）。 

图5A-C是xcd1和WT在1/2MS和10μM β-estradiol+75μM CdCl₂条件下相关基因的表达水平。 

五、具体实施方式

下述实施例中的实验方法如无特别说明，均为常规方法。 

实施例1、XCD1及其编码基因的获得 

利用化学诱导激活XVE（LexA-VP16-ER）突变体系统（由中国科学院遗传与发育生物学研究所提供），从含有100μMCdCl₂的1/2MS培养基中筛选到的拟南芥幼苗为材料（图1），用经典的CTAB法提取的突变体基因组DNA为模板，进行如下Tail-PCR反应（Yao-Guang Liu et al.,1995）： 

Tail-PCR反应程序（共包括三轮反应，表1）： 

表1 Tail-PCR的反应程序 

其中，巢式引物：LexA2、LexA3、LexA4、LexA5，LexA6，以及随机引物：AD1、AD2、AD3、AD4见表2。 

表2 Tail-PCR所用的引物序列 

将获得的Tail-PCR第三轮产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，得到的DNA片段纯化后经TA克隆，测序结果在NCBI数据库Blast后结果显示，vex载体插入在At3g10890基因的起始密码子ATG上游112bp处（图3）。在外加激素β-estradiol的诱导作用下，该载体的35S启动子起始转录,致使下游基因At3g10890激活表达。VEX载体插入的下游基因片段具有序列表中序列SEQ ID No：1的DNA序列，为XCD1基因，由1546个碱基组成，其cDNA序列长度为1245bp，编码具有序列表中序列SEQ ID No：2的氨基酸残基序列的蛋白质。 

实施例2、培育耐镉的拟南芥 

1、耐镉突变体xcd1的获得及表型特征分析 

利用化学诱导激活XVE（LexA-VP16-ER）突变体系统构建的独立转化株系的拟南芥突变体库，在100μM CdCl2的胁迫条件和10μM外加激素β-estradiol的诱导作用下，在1/2MS培养基中分别播种WT和突变体水平培养1w，筛选到多株镉耐受的突变株（图1），选择其中较大幼苗做后续研究，并通过表型鉴定得到功能获得型耐镉突变体xcd1（图2A-C）。 

2、xcd1与野生型植株的镉积累比较 

由于XCD1的诱导激活会显著增强植株对重金属Cd的耐受性，那么突变体中的Cd含量是否也发生了变化，为此，我们以WT为对照，分析了突变体植株xcd1中Cd含量的变化。实验结果表明，用100μM CdCl₂和10μM β-estradiol短期处理后，无论野生型还是突变体，根部的Cd含量均比地上部要高得多，且在根部，突变体xcd1相对于WT对镉的积累尤为明显（图2D）。 

3、镉胁迫下xcd1与野生型植株相关基因表达比较 

我们应用RT-PCR与qPCR检测了与镉胁迫耐受相关基因的表达水平，在1/2MS,1/2MS+10μM β-estradiol,1/2MS+75μM CdCl₂,1/2MS+10μM-estradiol+75μMCdCl₂的培养条件下培养3w的拟南芥抽提RNA，RT后电泳检测并用定量PCR验证（图4A-B）。结果显示，在 镉胁迫和激素诱导的环境下，GSH1基因在xcd1突变体中表达量较高，说明XCD1的激活表达所调控的对重金属镉胁迫的耐受途径是依赖GSH途径。AtPCR8在镉胁迫及外加激素作用下也有一定程度的上调，但是野生型与突变体并无太大差异。 

4、XCD1基因的35S过量表达 

4.1重组质粒构建及转化 

根据XCD1的cDNA序列分别设计引物： 

XCD1-NcoI:5′CTCGAAGACACCATGGATGAAGTGTTTGTGTTTTGTCGTGCT3′（NcoI）； 

XCD1-BstEII:5′GTGATGGTCACCAATTTTAGTTTTTGATAACTTTCCTTTTCCACGAATC3′（BstEII）； 

按以下程序扩增：95℃3min；94℃30sec，55℃30sec，72℃30sec，22cycle;72℃6min。高保真PCR产物经电泳回收后，用NcoI/BstEII双酶切。取1.5μg的植物表达pCAMBIA2301质粒，用NcoI/BstEII双酶切后，将XCD1以正向插入到PCAMBIA2301载体的相应位置构成含有CaMV35S启动子的pCAMBIA2301-XCD1重组表达载体。该载体经测序并对阅读框进行验证后，通过农杆菌浸染拟南芥野生型植株高效表达。 

4.2过量表达植株的鉴定 

将转化植株的T1代二次抗性筛选后，收获T2代认为可能转化成功的植株进行分子水平上的鉴定。随机挑取T2代幼苗多株，分别移栽到外加100μMCdCl₂的液体1/2MS培养基中培养48小时，抽提RNA并反转录，用RT-PCR验证XCD1基因表达量，结果获得了3株基因表达量较WT高的多的过量表达植株（图4A）。对该转基因株系进行表型分析，发现XCD1过表达的植株35S:XCD1对镉的耐受性显著增强（图4B），其根长和鲜重都要显著高于WT（图4C-D）。进一步对镉处理的WT和转基因植株体内的镉含量进行测定，发现过量表达植株体内镉积累明显高于WT，尤其根部极为显著（图4E），对比突变体xcd1，其含量的增长幅度也是非常明显。 

Claims (5)

1.一种植物耐镉蛋白，其特征在于：蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID No：2所示或者由SEQ ID No：2经取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基后与SEQ ID No：2限定的蛋白质具有相同活性的序列。

2.如权利要求1所述的植物耐镉蛋白的编码基因，其特征在于：选自下列核苷酸下列之一：

（1）序列表中SEQ ID No：1的DNA序列；

（2）编码序列表中SEQ ID No：2蛋白质序列的多核苷酸；

（3）在严谨条件下可与序列表中SEQ ID No：1限定的DNA序列杂交的核甘酸序列；

（4）与SEQ ID No：1限定的DNA序列具有90%以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。

3.根据权利要求2所述的植物耐镉蛋白的编码基因，其特征在于：所述基因序列的ORF为SEQ ID No：1自5’端第1位至1546位碱基。

4.含有权利要求2所述的植物耐镉蛋白的编码基因序列的载体、转基因细胞系及宿主菌。

5.权利要求2所述的编码基因在提高植物耐镉及增加植物中镉积累的应用，其特征在于：是通过诱导或转入植物中权利要求2所述的植物耐镉蛋白编码基因的表达。

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