CN101555276A

CN101555276A - 一种植物耐镉蛋白及其编码基因与应用

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Publication number: CN101555276A
Application number: CNA2009101168456A
Authority: CN
Inventors: 曹树青; 边小会; 汪洋; 陈正义; 江力; 袁怀波; 简红勇; 孙泽华; 文辰
Original assignee: Hefei University of Technology
Current assignee: Hefei University of Technology
Priority date: 2009-05-25
Filing date: 2009-05-25
Publication date: 2009-10-14

Abstract

本发明公开了一种植物耐镉蛋白及其编码基因与应用。植物耐镉蛋白是序列表中SEQ ID No：2，其编码基因是序列表中SEQ ID No：1DNA序列。本发明利用该耐镉蛋白的编码基因增强植物对镉的耐受性，为农作物耐镉育种和降低农作物的镉积累提供基因与技术支持。

Description

一种植物耐镉蛋白及其编码基因与应用

一、技术领域

本发明涉及生物工程领域中一个植物耐镉相关蛋白及其编码基因与应用，特别涉及利用该基因增强植物对镉毒害耐受的方法。

二、背景技术

重金属污染问题是当今世界所面临的重要难题之一。由于人类对重金属的开采、冶炼、加工及商业制造活动日益增多，造成不少重金属如镉、铅、汞、钴等进入大气、水、土壤中，引起严重的环境污染。重金属，特别是镉、铅、汞、铬等具有显著的生物毒性。它们在水体中不能被微生物降解，而只能发生各种形态相互转化和分散、富集过程(即迁移)，并经过食物链为人体摄取和积累。进入人体的重金属，尤其是有害的重金属，有的会在人体内积累和浓缩，如果超过人体所能耐受的限度，可造成人体急性中毒、亚急性中毒、慢性中毒等危害。所以提高作物对重金属的耐受和降低对重金属的吸收已经成为关系民生的大事，已成为农业生产和食品安全进一步研究的重点，倍受世界各国政治界和学术界的关注，也是当前生命科学研究的热点。

拟南芥是一种模式植物，广泛用于植物遗传学、发育生物学和分子生物学等研究领域。拟南芥的大多数基因在其它植物中都能找到，有关拟南芥的任何发现都能应用于其它植物研究。因此，对拟南芥抗重金属毒害分子生物学机制的研究对特定区域提高作物的产量和增加食品安全性具有重要的理论与经济意义。拟南芥基因组已完全测序，根据拟南芥测序数据库(www.arabidopsis.org)寻找和发现新的具有自主知识产权的功能基因是国际植物学研究领域的热点之一，也是不同国家之间科技竞争的焦点。拟南芥共有约1.3亿个碱基对，2.9万个基因。目前大部分基因的功能还不清楚，利用突变技术研究基因功能已成为一种有效的方法。通过对突变体的研究，发现了一些与植物相关的耐受重金属基因的功能，如AtATM3，ACBP，AtPDR1，AtPDR12等。

面对日益严重的环境污染问题，寻找耐受重金属并且能降低作物中重金属含量的功能基因并阐明其功能具有重要的理论及实践意义。根据拟南芥数据库公布的基因组序列，ADS2(16:0Delta9Arabidopsis desaturase 2；At2g31360)是一个低温诱导表达增加的基因，与蓝细菌中的δ-9酰基类脂去饱和酶和酵母和哺乳动物中的酰基辅酶A去饱和酶同源。申请人发现镉处理ADS2基因敲除植株表现为对镉耐受，这表明该ADS2基因涉及镉耐受性的调控。为此，我们研究了该基因功能，基因表达分析显示，镉处理可诱导镉离子转运蛋白AtPDR8基因转录水平显著提高，这说明基因ADS2缺失可以激活拟南芥中镉离子转运蛋白AtPDR8编码基因的表达从而使拟南芥体内的镉含量下降，进而表现为对镉耐受。

三、发明内容

本发明的目的是提供一种新的植物耐镉及降低植物镉吸收相关蛋白及其编码基因。本发明所提供的植物耐镉及降低植物镉吸收相关蛋白的编码基因，名为ADS2(AT2G31360)，来源于哥伦比亚野生型的拟南芥，其蛋白是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：

(1)序列表中的SEQ ID No：2；

(2)将序列表中SEQ ID No：2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐镉相关的蛋白质。

序列表中的序列2由307氨基酸残基组成。

所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

ADS2的编码基因也属于本发明的保护范围。

ADS2的cDNA基因，选自下述核甘酸序列之一；

(1)序列表中SEQ ID No：1的DNA序列；

(2)编码序列表中SEQ ID No：2蛋白质序列的多核苷酸；

(3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID No：1限定的DNA序列杂交的核甘酸序列；

(4)与序列表中SEQ ID No：1限定的DNA序列具有90％以上同源性、且编码相同功能蛋白质的DNA序列。

序列表中的序列1由1440个碱基组成，其开放阅读框架(ORF)为自5’端第58位至978位碱基，编码序列SEQ ID No：2的蛋白质。

含有本发明ADS2的表达载体，细胞系和宿主菌均属于本发明的保护范围。扩增ADS2中任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。

本发明的第二个目的是提供一种利用该基因增强植物耐镉及降低植物中镉含量的方法。

本发明所提供的增强植物耐镉及降低植物中镉含量的方法，是抑制植物中的上述植物耐镉及降低植物中镉含量相关蛋白编码基因的表达。

抑制植物中的上述植物耐镉相关蛋白编码基因ADS2的表达可通过多种方法实现，如植物病毒载体介导基因沉默的方法，反义核酸技术沉默基因的方法，siRNA介导的基因沉默方法等。本发明抑制基因表达的方法并不限于上述几种方法，只要能抑制ADS2表达均可。

利用任何一种植物基因敲除技术，将此基因敲除(或沉默)后，植物表现为耐镉。

本发明的ADS2基因或其反义核酸在构建到植物表达载体中时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强启动子或诱导型启动子。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，如加入植物可选择性标记(GUS基因、萤光素酶基因等)或具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素，卡那霉素等)。被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物，如：水稻、小麦、油菜、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草或苜宿等。携带有本发明ADS2基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物经组织培育成植株。

本发明的植物耐镉相关蛋白及其编码基可为农作物耐镉育种和降低农作物中的镉积累提供基因与技术的支持(保障)。

四、附图说明

图1为ads2-1、野生型植株竖立培养，直接点种于含有或不含有镉的培养基上在正常光照培养条件下竖直20天的比较照片(A 1/2MS；B 50μM CdCl₂；C 75μM CdCl₂；D根长；E鲜重)。

图2为ads2-1、野生型植株竖立培养，直接点种于含有或不含有镉的培养基上在正常光照培养条件下竖直30天的比较照片(A 1/2MS；B 50μMCdCl₂)。

图3为ads2-1、野生型植株在50μM镉处理条件下镉含量的比较。

图4为ads2-1、野生型植株在MS和50μM镉处理条件下相关基因的表达水平。

五、具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步的说明。

下述实施例中的实验方法如无特别说明，均为常规方法。

实施例1、ADS2及其编码基因的获得

以野生型哥伦比亚生态型拟南芥的幼苗约50-100mg为材料，用Trizol提取其总RNA，用紫外分光光度计检测RNA浓度。按RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas公司)试剂盒说明书，以提取的总RNA为模板，合成cDNA第一条链。以提取出来的第一条链cDNA为模板，进行如下PCR反应：20μl反应体系，内含10×PCR缓冲液2μl，dNTPs(10mM)混合物0.4μl，引物1和引物2各2μl，Tag酶(5U/μl)0.2μl，其余加双蒸水至20μl。其中，引物1：F 5’AACAAAAAAGAGAGAGAGAACCTA 3’；引物2：5’TCTTTTGTAATTTTCTTTTTCATC 3’。在Life Express基因扩增仪上扩增：先94℃预变性3min，再94℃30sec，54℃30sec，72℃60sec，共计30个循环，最后72℃延伸10min，将获得的PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳。将PCR得到的cDNA片段连接于pGEM-T载体，得到含有目的片段的载体pT-ADS2，进行测序鉴定，结果表明PCR得到的cDNA片段具有序列表中序列SEQ ID No：1的DNA序列，为ADS2的cDNA基因，由1440个碱基组成，其编码序列为自5’端第58位碱基到第978位碱基，编码具有序列表中序列SEQ ID No：2的氨基酸残基序列的蛋白质。

实施例2、培育耐镉的拟南芥

1、ADS2基因被敲除的纯合突变体ADS2的获得

从美国拟南芥种质资源中心获得了T-DNA插入突变体种子(SALK_079963；http://www.arabidopsis.org/servlets/TairObject？type＝germplasm&id＝4626493)。为鉴定ADS2基因被敲除的纯合突变体，播种SALK_079963种子并提取单株植株DNA，以此为模板，用3对引物对其进行PCR扩增。其中，引物1LBb1：5’-GCGTGGACCGCTTGCTGCAACT-3，引物2：ADS2-LP 5’-TCATTCTCTTGCTCTCTTGGC-3’，引物3：ADS2-RP5’-GAGCTGTCTCCAATTCATGTG-3’。根据PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果，获得ADS2基因被敲除的纯合突变体ads2-1。从表型来看，该突变体与野生型(WT)植株在正常生长条件下没有显著差异(图1A)，用该基因的cDNA序列构建35S强动子的过表达载体并转化突变体，该转基因植株形态上恢复了野生型表型，在镉胁迫条件下也恢复了野生型植株症状，证实了该基因确实控制镉耐受性。

2、ads2-1与野生型植株的耐镉性比较

将野生型(WT)与ads2-1同时播种于直径为90mm的培养皿中，培养基为加镉和不加镉的固体培养基，竖立培养或者水平培养置于22℃恒温光照(光周期为16小时光照，8小时黑暗)培养。培养30天后，可以观察到：在正常培养基上生长的WT和ads2-1在表型、鲜重、根长方面均无显著差异。在植株直接点种或者移栽后在含有镉的培养基上培养，ads2-1都表现出明显的镉耐受的性状。在50μMCdCl₂，75μMCdCl₂胁迫下，ads2-1的鲜重和根长明显比WT高。上述结果表明，ads2-1较WT明显耐受镉毒害。

3、ads2-1与野生型植株的镉积累比较

对镉处理的WT和ads2-1植株体内的镉含量进行测定，发现ads2-1植株体内镉积累明显低于WT，表明ads2-1植株对镉积累明显低于WT植株。

4、镉胁迫下ads2-1与野生型植株相关基因表达比较

对镉处理的WT和ads2-1植株体内的相关基因表达水平进行测定，发现ads2-1植株体内AtPDR8基因明显高于WT，而其他基因ATM3和AtPCR1表达没有明显差异，表明ads2-1植株对镉积累可能与AtPDR8基因的激活有关。

序列表

序列表1 SEQ ID No：1

(Nucleotide Sequence，Sequence Length(bp)：1440)

1 ATTAACAAAA AAGAGAGAGA GAACCTAAAA AGAAGAGAAG AGAAAGAGAG

51 ATCCGAAATG TCGGTGACAT CAACGGTGGA GGAGAACCAC CAGAAAAATC

101 CATCAACGCC GGCGGCGGTG GAGGAGAAGA AGAAGAGGAG ATGGGTGTTT

151 TGGGATAGAA GGTGGAGGAG ATTAGATTAT GTGAAATTCT CAGCTTCTTT

201 CACTGTTCAT TCTCTTGCTC TCTTGGCTCC GTTTTATTTC ACTTGGTCGG

251 CTCTTTGGGT TACGTTTTTG TTTTACACCA TCGGTGGTCT TGGTATCACC

301 GTCTCTTATC ATCGCAACTT GGCTCACCGG AGTTTCAAAG TCCCTAAATG

351 GCTTGAGTAT CTCTTAGCCT ATTGTGCCCT TCTCGCTATT CAGGGAGATC

401 CGATTGATTG GGTGAGTACA CATCGTTACC ATCACCAGTT CACGGATTCA

451 GAACGTGATC CACATAGTCC TAAGGAAGGT TTTTGGTTTA GTCATCTTCT

501 TTGGATCTAT GACTCTGCCT ATCTTGTTTC AAAGTGTGGA AGAAGAGCAA

551 ACGTGGAGGA TTTGAAGAGG CAATGGTTTT ATAGGTTTCT TCAGAAAACA

601 GTGCTATTTC ACATTTTAGG ATTGGGTTTC TTTCTCTTCT ACCTTGGTGG

651 CATGTCCTTC GTTACTTGGG GAATGGGGGT AGGAGCAGCA TTGGAAGTGC

701 ACGTGACTTG CCTCATAAAT TCACTCTGCC ATATTTGGGG CACTCGAACT

751 TGGAAGACCA ATGACACTTC TCGTAATGTT TGGTGGTTAT CGGTATTTTC

801 ATTTGGAGAG AGTTGGCACA ACAATCATCA TGCGTTCGAG TCATCGGCTA

851 GACAAGGACT TGAATGGTGG CAAATAGACA TTTCGTGGTA CATTGTTCGG

901 TTTTTCGAAA TTATCGGTTT AGCGACCGAT GTGAAAGTGC CAACGGAGGC

951 TCAACGACGT CGTATGGCTA TAGTTCGTTG ATGGAAATTG CGGGAAGAGC

1001 ATAGAAAAAG GGATCTATTC TATGTAATTA GAATAATTTC TAATCCTAAA

1051 AGAGAGTTAT TGTTTTATTT TCTTTATTAC TACTTTTGAA GTTTTGGGTT

1101 AACGCAAAGG ACGTTTCCGA TGTGTTTTGG TGTTGGACCA AGTTGATTAA

1151 GATATTTGTC GTAATTGGTA CTTATATATA AAATCTTAGT GGGGACAATT

1201 AATACGTTAA TTACGGTCTC TATGTGAGAC TTATTTTAAT ATATAGACTT

1251 CTCTAAAATA TCTAATCGTC GTTTACGATA AAAGAAGAAA AGCAAAAAGA

1301 CATAAGACTT GTTCAAAAGG AGATGATATT GGTTGGTTGT TGGAGTTTAT

1351 AGCCACATAT AAAATTACCT TTTTTATGTG ATTTTTTGTG ATCATTTCAA

1401 TAGATATATA TAAAGATGAA AAAGAAAATT ACAAAAGAAG

序列表2SEQ ID No：2

Met Ser Val Thr Ser Thr Val Glu Glu Asn His Gln Lys Asn Pro 15

Ser Thr Pro Ala Ala Val Glu Glu Lys Lys Lys Arg Arg Trp Val 30

Phe Trp Asp Arg Arg Trp Arg Arg Leu Asp Tyr Val Lys Phe Ser 45

Ala Ser Phe Thr Val His Ser Leu Ala Leu Leu Ala Pro Phe Tyr 60

Phe Thr Trp Ser Ala Leu Trp Val Thr Phe Leu Phe Tyr Thr Ile 75

Gly Gly Leu Gly Ile Thr Val Ser Tyr His Arg Asn Leu Ala His 90

Arg Ser Phe Lys Val Pro Lys Trp Leu Glu Tyr Leu Leu Ala Tyr 105

Cys Ala Leu Leu Ala Ile Gln Gly Asp Pro Ile Asp Trp Val Ser 120

Thr His Arg Tyr His His Gln Phe Thr Asp Ser Glu Arg Asp Pro 135

His Ser Pro Lys Glu Gly Phe Trp Phe Ser His Leu Leu Trp Ile 150

Tyr Asp Ser Ala Tyr Leu Val Ser Lys Cys Gly Arg Arg Ala Asn 165

Val Glu Asp Leu Lys Arg Gln Trp Phe Tyr Arg Phe Leu Gln Lys 180

Thr Val Leu Phe His Ile Leu Gly Leu Gly Phe Phe Leu Phe Tyr 195

Leu Gly Gly Met Ser Phe Val Thr Trp Gly Met Gly Val Gly Ala 210

Ala Leu Glu Val His Val Thr Cys Leu Ile Asn Ser Leu Cys His 225

Ile Trp Gly Thr Arg Thr Trp Lys Thr Asn Asp Thr Ser Arg Asn 240

Val Trp Trp Leu Ser Val Phe Ser Phe Gly Glu Ser Trp His Asn 255

Asn His His Ala Phe Glu Ser Ser Ala Arg Gln Gly Leu Glu Trp 270

Trp Gln Ile Asp Ile Ser Trp Tyr Ile Val Arg Phe Phe Glu Ile 285

Ile Gly Leu Ala Thr Asp Val Lys Val Pro Thr Glu Ala Gln Arg 300

Arg Arg Met Ala Ile Val Arg

Claims

1、一种植物耐镉蛋白，其特征在于：氨基酸残基序列如序列表中SEQ ID No：2所示。

2、根据权利要求1所述的蛋白，其特征在于：SEQ ID No：2的氨基酸残基序列包括不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺少和/或添加。

3、由权利要求1所述的植物耐寒与抗旱蛋白的编码基因，其特征在于：选自下列核苷酸下列之一：

(1)序列表中SEQ ID No：1的DNA序列；

(2)编码序列表中SEQ ID No：2蛋白质序列的多核苷酸。

4、根据权利要求3所述的编码基因，其特征在于：在高严谨条件下与SEQ ID No：1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

5、根据权利要求3所述的编码基因，其特征在于：与SEQ ID No：1限定的DNA序列具有90％以上同源性、且编码相同功能蛋白质的DNA序列。

6、由权利要求3所述的编码基因增强植物耐镉与降低镉积累的方法，其特征在于：是抑制植物中耐镉与降低镉积累相关蛋白编码基因的表达。

7、根据权利要求6所述的方法，其特征在于：抑制植物中耐镉与降低镉积累相关蛋白编码基因表达的方法包括植物病毒载体介导基因沉默的方法，或者反义核酸技术沉默基因的方法，或者siRNA介导的基因沉默方法。