CN110205332A

CN110205332A - 一种增强植物对镉毒害的耐受性并降低植物镉含量的编码基因及应用

Info

Publication number: CN110205332A
Application number: CN201910562709.3A
Authority: CN
Inventors: 曹树青; 吴席; 陶曼芝; 孟云; 朱香豫; 盛义保; 樊婷婷
Original assignee: Hefei University of Technology
Current assignee: Hefei University of Technology
Priority date: 2019-06-26
Filing date: 2019-06-26
Publication date: 2019-09-06
Anticipated expiration: 2039-06-26
Also published as: CN110205332B

Abstract

本发明涉及一种增强植物对镉毒害的耐受性并降低植物镉含量的编码基因及应用。降低植物镉含量的编码基因序列如序列表SEQ ID No：l所示。本发明将降低植物镉含量的编码基因转入植物中，使植物中的上述植物耐镉及降低植物中镉含量相关蛋白编码基因过量表达，从而使植物体内的镉含量下降，进而表现为对镉耐受。本发明的植物耐镉相关蛋白及其编码基因可为农作物耐镉育种和降低农作物中的镉积累提供基因资源和技术支持。

Description

一种增强植物对镉毒害的耐受性并降低植物镉含量的编码基因及应用

技术领域

本发明涉及生物工程领域中一个植物耐镉相关蛋白及其编码基因与应用, 特别涉及利用该基因增强植物对镉毒害耐受及降低其体内镉含量的方法。

背景技术

镉（Cd）是稀有元素，单元素镉毒性微小，但是以化合物状态(其中为硫镉矿最常见）存在于自然界的化合物镉毒性巨大。随着社会的进步科学技术的发展，镉特有的物理和化学性质被广泛应用在工业制造中。21世纪初科学家就已经发现土壤中镉重金属污染严重，近几年在河水和植物里也检测到镉含量严重超标。镉的毒性很大，可在人体内积蓄，主要积蓄在肾脏，引起泌尿系统的功能变化；镉能够取代骨中钙，使骨骼严重软化，骨头寸断，会引起胃脏功能失调，干扰人体和生物体内锌的酶系统，导致高血压症上升。易受害的人群是矿业工作者、免疫力低下人群。所以提高作物对镉的耐受和降低对镉的吸收已经成为关系民生的大事，已经成为农业生产和食品安全进一步研究的重点，倍受世界各国政治界和学术界的关注，也是当前生命科学研究的热点。

土壤镉污染治理难度巨大，目前治理方法分为物理法、化学法和生物法。

物理法可分为物理分离修复、蒸汽浸提修复技术、固化/稳定化土壤修复技术和玻璃化修复技术，治理效果很好，适用于小面积低污染的土壤，大面积重污染可采取深埋或者换土方式。

化学法通过重金属镉经化学反应来降低含量，例如化学溶液淋洗土壤溶解镉、特定的化学络合剂沉淀镉减少植物吸收。有报道通过纳米材料螯合土壤中重金属离子，细菌-铁(hydr)氧化物缔合物利用组分可加性(CA)方法可固定土壤中的镉，但是化学法在应用的同时会生成其他污染物。

生物法主要通过种植吸附镉能力强的植物吸附镉元素后对植物进行集中处理以及微生物-植物联合修复技术进行去除镉。有报道显示植物(皂素，SAP)和鼠李糖脂（RAM）微生物生成的生物表面活性剂可去除Cd、澳大利亚植物-微生物共生体(如根瘤菌、菌根)的植物生产系统可维持营养成分减缓镉危害。生物法是绿色环保可持续发展的治理镉污染有效的方式之一。

WRKY蛋白是植物信号转导中的关键因子，在植物面临胁迫时这些蛋白质很多都会被诱导响应。WRKY蛋白是植物主要的转录因子，有正调控转录因子也有负调控转录因子，特定的WRKY因子可引起一组应激基因的表达。WRKY47是位于WRKY转录因子家族第Ⅱb组，至今关于它的研究寥寥无几。有论文（Raineri J, Wang S, Peleg Z, et al. The ricetranscription factor OsWRKY47 is a positive regulator of the response towater deficit stress[J]. Plant Molecular Biology, 2015, 88(4-5): 401-413.）曾报道出水稻WRKY47参与了抗旱反应，Oswrky47突变体对干旱表现出更高的敏感性，产量下降，而过表达Oswrky47的植株表现出更强的耐受性，但对于WRKY47响应重金属胁迫却没有被研究。

面对日益严重的环境污染问题, 寻找耐受重金属并且能降低作物中重金属含量的功能基因并阐明其功能具有重要的理论及实践意义。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种增强植物对镉毒害的耐受性并降低植物镉含量的编码基因；本发明的第二个目的是提供所述编码基因在增强植物耐镉及降低植物中镉含量的方面的应用。

所述增强植物对镉毒害的耐受性并降低植物镉含量的编码基因，名为WRKY47(AT4G01720)，所述编码基因的名称与基因编号来源于拟南芥数据库（www.arabidopsis.org），来源于哥伦比亚野生型的拟南芥；所述编码基因的DNA序列如序列表SEQ ID No：l所示。

所述编码基因的氨基酸残基序列如序列表SEQ ID No：2所示。

所述编码基因的DNA序列包括与序列表中SEQ ID No：l 限定的DNA序列具有90%以上同源性、且编码相同功能蛋白质的DNA序列。

本发明所述编码基因在增强植物耐镉及降低植物中镉含量的方面的应用，是使植物中的上述植物耐镉及降低植物中镉含量相关蛋白编码基因过量表达。

本发明利用基因工程技术构建35S:WRKY47过量表达载体，通过浸花法转入野生型植株，使其在野生型中过量表达，植物表现为耐镉。将WRKY47基因构建到植物表达载体中时,在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强启动子或诱导型启动子。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选, 可对所使用的载体进行加工，使其具有抗性的抗生素标记物（卡那霉素）。被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物，如:水稻、小麦、油菜、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草或苜宿等。携带有本发明WRKY47基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri 质粒、植物病毒载体、直接 DNA 转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织, 并将转化的植物经组织培育成植株。

本发明增强植物对镉毒害的耐受性并降低植物镉含量的编码基因可为农作物耐镉育种和降低农作物中的镉积累提供基因资源和技术支持。

根据拟南芥数据库公布的基因组序列，WRKY47(AT4G01720 )是拟南芥WRKY转录因子家族中的成员，WRKY是近年来在植物体内新发现的特有转录调控因子，属于WRKY家族转录调控因子。申请人发现镉处理WRKY47基因功能缺失突变体植株表现为对镉耐受，同时对WRKY47基因过表达植株进行镉表型分析，发现WRKY47过表达植株对镉高度耐受。这表明该WRKY47基因涉及镉耐受性的调控。此外，该基因可被镉胁迫诱导。为此，我们研究了该基因功能，研究结果表明，将GSH合酶抑制剂丁硫氨酸-亚枫亚胺（L-Buthionine-sulfoximine,BSO）添加到含镉的培养基中，突变体耐镉表型消失，表明WRKY47基因介导的镉耐受依赖GSH途径。

附图说明

图1为T-DNA插入位点示意图。

图2为wrky47突变体qRT-PCR分析图。

图3为WRKY47突变体对Cd胁迫的耐受性图。

图4为WRKY47基因在不同时间镉胁迫下表达水平检测图。

图5为WRKY47基因克隆及转化鉴定图。

图6为35S:WRKY47过表达转基因株系的qRT-PCR分析图。

图7 为野生型与转基因植株OE3、OE6的镉胁迫表型分析图。

图8为BSO表型图。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明作进一步地描述。

下述实施例中的实验方法如无特别说明，均为常规方法。

实施例 1、WRKY47及其编码基因的获得

我们利用从美国拟南芥种质资源库获得的拟南芥突变体种子筛选重金属镉耐受突变体。使用含有200μM CdCl₂的½MS培养基对拟南芥种子突变体库进行筛选，获得了一株对镉胁迫耐受的突变体，筛选鉴定发现该突变体为WRKY47基因功能缺失突变体，命名为wrky47- 1。为了进一步研究WRKY47基因在植物响应镉胁迫中作用，我们从美国拟南芥种质资源库获取了另外一个WRKY47基因功能缺失突变体，命名为wrky47-2. 测序结果在NCBI数据库Blast比对，综合分析得出T-DNA插入位点信息，参见图1。利用qRT-PCR，对wrky47-1和wrky47-2进行转录水平鉴定，发现这两个突变体中WRKY47基因的表达水平均显著低于野生型参见图2。

见图3中A，为wrky47表型图，将野生型(WT)与wrky47-1、wrky47-2同时播种于直径为90mm的培养皿中，培养基为加镉和不加镉的固体培养基，置于22℃恒温光照培养箱中（光周期为16小时光照，8小时黑暗）垂直培养。两周后，可以观察到：在½MS培养基上生长的WT和wrky47-1、wrky47-2在生长方面均无显著差异。在植株直接点种在含有不同浓度镉的培养基上培养，wrky47-1和wrky47-2都表现出明显的镉耐受的性状。见图3中B，根长的量化数据显示在50 μM CdCl₂和75 μMCdCl₂胁迫下，wrky47-1和wrky47-2的根长明显比WT长，见图3中C，鲜重的量化数据显示在50 μM CdCl2和75 μMCdCl2胁迫下，wrky47-1和wrky47-2的鲜重要明显重于WT。上述结果表明，wrky47-1和wrky47-2较WT对镉毒害表现出明显耐受。参见图4，WRKY47基因在镉胁迫下被显著诱导表达。

实施例2、培育耐镉拟南芥

1、WRKY47基因过量表达转基因株系WRKY47-OE3、OE6的获得

为进一步验证该基因在植物重金属镉胁迫调控中的功能，我们构建了WRKY47基因过量表达载体（35S:WRKY47）。首先进行目的片段扩增。将野生型拟南芥在½MS培养基上正常培养两周，提取植株总RNA，反转录合成cDNA，以合成的cDNA为模板，进行PCR，扩增出足够量的目的产物。再以PCR产物为模板，进行第二次扩增，目的是引入酶切位点。将PCR产物与载体pCAMBIA1301进行酶切回收。再将回收纯化好的目的DNA片段和载体用T4 DNA连接酶连接过夜。将上述连接液转入大肠杆菌感受态DH5a中，检测筛选出阳性克隆进行测序。测序结果确定无误后，利用电击转化法转入农杆菌感受态GV3101。电击转化后的农杆菌GV3101，经活化后涂布于含双抗（卡那霉素，庆大霉素）的LB培养基平板。随机挑取单菌落，在含双抗（卡那霉素，庆大霉素）的LB培养液中扩培并抽提质粒。用NcoI和BstEⅡ双酶切鉴定重组载体无误，采用浸花法转化拟南芥野生型植株，从而获得WRKY47基因过表达转基因株系；见图5，图5中A为WRKY47基因克隆，图5中B为35S:WRKY47重组质粒转化的阳性菌落鉴定；图5中C为转基因阳性植株筛选图5中A、B中的Marker分子量为2000bp。

2、WRKY47过表达转基因植株转录水平鉴定及与野生型植株的耐镉性比较

参见图6，我们对WRKY47过表达转基因植株进行了转录水平的鉴定，并选择表达量较高的OE3和OE6进行下一步实验。参见图7，将野生型(WT)与WRKY47- OE3和OE6同时播种于直径为90 mm的培养皿中，培养基为加镉和不加镉的固体培养基，置于22℃恒温光照培养箱中（光周期为16小时光照，8小时黑暗）垂直培养。两周后，可以观察到：在½MS培养基上生长的WT和WRKY47-OE3、OE6在生长方面无显著差异。在植株直接点种在含有不同浓度镉的培养基上培养，WRKY47-OE3、OE6都表现出明显的镉耐受的性状。在50 μM CdCl₂和75 μMCdCl₂胁迫下，WRKY47-OE3、OE6的生长状态明显比WT好。上述结果表明，WRKY47-OE3、OE6较WT对镉毒害表现出明显耐受。

3. wrky47 突变体BSO恢复表型

在重金属镉的培养基 wrky47 突变体表现为耐受，谷胱甘肽 GSH 依赖性植，

物螯合镉耐受途径是植物应激镉胁迫主要途径之一，用谷胱甘肽合成酶抑制剂；

BSO 验证 wrky47 突变体耐镉是否与与 GSH 途径有关。首先配制对照组的 1/2MS、100μM BSO、50μM CdCl₂和 100μM BSO + 50μM CdCl₂四种固体培养基，将消毒后无菌种子WT、wrky47-1 和 wrky47-2 均匀点种在四种培养基中，封板、春化后放入培养室垂直培养。2 周后观察表型并测量 WT、wrky47-1 和 wrky47-2 在 4 种培养基的根长和鲜重，在空白对照 1/2MS 培养基中，WT、wrky47-1 和 wrky47-2 拟南芥叶片翠绿无侧根长势很好且无差异性；在只含有 100μM BSO 培养基中，WT、wrky47-1 和 wrky47-2 叶片黄绿无侧根且无差异性，但是根长比 1/2MS 培养基生长拟南芥的根长略短；在只含有 50μM CdCl₂培养基中 WT、wrky47-1 和 wrky47-2 叶片微黄有侧根生长且 wrky47-1 和 wrky47-2 的根叶都比 WT 根叶壮实差异性显著；在 100μM BSO + 50μM CdCl₂ 的培养基中，WT、wrky47-1 和wrky47-2 叶片微黄有侧根且根长鲜重均无差异性。上述结果表明：WRKY47 基因突变后耐重金属镉，在重金属镉培养基中添加BSO 可恢复 wrky47-1 和 wrky47-2 突变体对镉的耐受性使其与 WT 无差异性生长，wrky47 突变体介导的镉耐受依赖 GSH 途径。参见图8，图8中A为不同条件下，野生型和wrky47突变体表型；图8中B为根长；图8中C为鲜重。

SEQUENCE LISTING

<110> 合肥工业大学

<120> 一种增强植物对镉毒害的耐受性并降低植物镉含量的编码基因及应用

<130> 2

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1470

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 1

atggaagaac atattcaaga tcgccgtgaa attgcgttct tacactcagg agaatttctc 60

cacggagatt ctgactcaaa ggatcatcaa ccgaacgagt ctccggtgga acgtcatcac 120

gagtcgtcta tcaaagaagt tgatttcttc gctgctaaaa gtcagccgtt tgatcttggt 180

catgtgagaa caacgacgat cgttggatca tctggtttta atgatggatt aggtttggta 240

aattcatgtc atggaacatc aagcaatgat ggcgatgaca aaaccaaaac tcaaattagt 300

agactgaagt tggagctaga gaggcttcac gaggagaatc acaaactgaa gcatttatta 360

gatgaggtca gtgagagtta caacgacctc caaagaagag ttttgttagc aagacaaaca 420

caagtggaag gtcttcatca taaacaacat gaggatgtac ctcaagctgg ttcctcacaa 480

gctctagaga acagaagacc aaaggatatg aaccatgaaa ctccggccac caccttgaaa 540

cgacggtctc cagacgacgt ggatggtcgt gatatgcacc gaggatcacc aaaaactcct 600

cgaatagacc aaaacaagag tactaatcat gaagaacaac aaaaccctca tgatcaatta 660

ccctatagaa aagctagggt ttccgttaga gctagatctg atgccactac ggtaaatgac 720

ggatgtcaat ggagaaaata cggtcagaaa atggcgaaag ggaatccatg tcctcgcgct 780

tattatcgtt gcaccatggc cgttggatgt cctgtccgta aacaggtcca acgatgcgcg 840

gaggatacaa ctatcttgac aacaacgtac gaaggaaacc ataaccatcc tcttcccccg 900

tcagccacag ccatggctgc aaccacctcc gccgcagcag ccatgctctt atcaggctcc 960

tcctccagca acctccacca aacactctct agcccctccg ccacgtcatc atcatccttc 1020

taccataact tcccatacac ctccacaatc gcaacactct ctgcctcagc tcctttcccc 1080

accataacct tagacctcac caacccacct cgaccgctac aaccgccacc gcagtttcta 1140

agccagtatg gtcccgccgc gtttttacca aacgctaatc aaattaggtc tatgaataat 1200

aataaccagc agttattaat acctaatttg tttggcccac aagccccacc acgtgaaatg 1260

gtcgattcag ttagggctgc gattgcgatg gatccgaact tcacggcggc acttgcggcc 1320

gcgatctcaa acattatcgg aggaggtaat aacgacaaca ataataatac tgatattaat 1380

gataacaagg ttgatgcaaa aagtggaggg agtagtaacg gagattcgcc acagcttcct 1440

cagtcttgca ccactttctc tacaaactaa 1470

<210> 2

<211> 489

<212> PRT

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 2

Met Glu Glu His Ile Gln Asp Arg Arg Glu Ile Ala Phe Leu His Ser

1 5 10 15

Gly Glu Phe Leu His Gly Asp Ser Asp Ser Lys Asp His Gln Pro Asn

20 25 30

Glu Ser Pro Val Glu Arg His His Glu Ser Ser Ile Lys Glu Val Asp

35 40 45

Phe Phe Ala Ala Lys Ser Gln Pro Phe Asp Leu Gly His Val Arg Thr

50 55 60

Thr Thr Ile Val Gly Ser Ser Gly Phe Asn Asp Gly Leu Gly Leu Val

65 70 75 80

Asn Ser Cys His Gly Thr Ser Ser Asn Asp Gly Asp Asp Lys Thr Lys

85 90 95

Thr Gln Ile Ser Arg Leu Lys Leu Glu Leu Glu Arg Leu His Glu Glu

100 105 110

Asn His Lys Leu Lys His Leu Leu Asp Glu Val Ser Glu Ser Tyr Asn

115 120 125

Asp Leu Gln Arg Arg Val Leu Leu Ala Arg Gln Thr Gln Val Glu Gly

130 135 140

Leu His His Lys Gln His Glu Asp Val Pro Gln Ala Gly Ser Ser Gln

145 150 155 160

Ala Leu Glu Asn Arg Arg Pro Lys Asp Met Asn His Glu Thr Pro Ala

165 170 175

Thr Thr Leu Lys Arg Arg Ser Pro Asp Asp Val Asp Gly Arg Asp Met

180 185 190

His Arg Gly Ser Pro Lys Thr Pro Arg Ile Asp Gln Asn Lys Ser Thr

195 200 205

Asn His Glu Glu Gln Gln Asn Pro His Asp Gln Leu Pro Tyr Arg Lys

210 215 220

Ala Arg Val Ser Val Arg Ala Arg Ser Asp Ala Thr Thr Val Asn Asp

225 230 235 240

Gly Cys Gln Trp Arg Lys Tyr Gly Gln Lys Met Ala Lys Gly Asn Pro

245 250 255

Cys Pro Arg Ala Tyr Tyr Arg Cys Thr Met Ala Val Gly Cys Pro Val

260 265 270

Arg Lys Gln Val Gln Arg Cys Ala Glu Asp Thr Thr Ile Leu Thr Thr

275 280 285

Thr Tyr Glu Gly Asn His Asn His Pro Leu Pro Pro Ser Ala Thr Ala

290 295 300

Met Ala Ala Thr Thr Ser Ala Ala Ala Ala Met Leu Leu Ser Gly Ser

305 310 315 320

Ser Ser Ser Asn Leu His Gln Thr Leu Ser Ser Pro Ser Ala Thr Ser

325 330 335

Ser Ser Ser Phe Tyr His Asn Phe Pro Tyr Thr Ser Thr Ile Ala Thr

340 345 350

Leu Ser Ala Ser Ala Pro Phe Pro Thr Ile Thr Leu Asp Leu Thr Asn

355 360 365

Pro Pro Arg Pro Leu Gln Pro Pro Pro Gln Phe Leu Ser Gln Tyr Gly

370 375 380

Pro Ala Ala Phe Leu Pro Asn Ala Asn Gln Ile Arg Ser Met Asn Asn

385 390 395 400

Asn Asn Gln Gln Leu Leu Ile Pro Asn Leu Phe Gly Pro Gln Ala Pro

405 410 415

Pro Arg Glu Met Val Asp Ser Val Arg Ala Ala Ile Ala Met Asp Pro

420 425 430

Asn Phe Thr Ala Ala Leu Ala Ala Ala Ile Ser Asn Ile Ile Gly Gly

435 440 445

Gly Asn Asn Asp Asn Asn Asn Asn Thr Asp Ile Asn Asp Asn Lys Val

450 455 460

Asp Ala Lys Ser Gly Gly Ser Ser Asn Gly Asp Ser Pro Gln Leu Pro

465 470 475 480

Gln Ser Cys Thr Thr Phe Ser Thr Asn

485

Claims

1.一种增强植物对镉毒害的耐受性并降低植物镉含量的编码基因，其特征在于：所述编码基因的DNA序列如序列表SEQ ID No：l所示。

2.根据权利要求1所述的增强植物对镉毒害的耐受性并降低植物镉含量的编码基因，其特征在于：所述编码基因的DNA序列包括与序列表SEQ ID No：l所示的DNA序列具有90%以上同源性、且编码相同功能蛋白质的DNA序列。

3.根据权利要求1所述的增强植物对镉毒害的耐受性并降低植物镉含量的编码基因的应用，其特征在于：将所述序列表SEQ ID No：l所示的编码基因转入植物中，所述植物为拟南芥。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：将所述序列表SEQ ID No：l所示的编码基因通过浸花法转入野生型植株，使其在野生型中过量表达，植物表现为耐镉。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述植物为单子叶植物或双子叶植物。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述单子叶植物为水稻、小麦、玉米或牧草。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述双子叶植物为黄瓜、番茄、油菜、杨树或苜宿。