JP6121942B2 - 植物のバイオマス量を増産させる遺伝子及びその利用方法 - Google Patents
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Description
なお、シロイヌナズナにおけるAt3g09800を過剰発現し、或いは欠損させた植物体は知られていない。ただし、特許文献1〜5には、At3g09800がコードするタンパク質に対して例えば70%程度以上の配列類似性を有するタンパク質をコードする遺伝子を過剰発現することでバイオマスを増産することが開示されている。
(1) コートマー・アダプタのゼータサブユニットをコードする遺伝子の発現を抑制する又はコートマー・アダプタのゼータサブユニットを阻害した、若しくはクラスリン・アダプタの小(シグマ)サブユニットをコードする遺伝子の発現を抑制する又はクラスリン・アダプタの小(シグマ)サブユニットを阻害した植物体。
(2) 上記遺伝子は、以下の(a)〜(c)のいずれかのタンパク質をコードすることを特徴とする(1)記載の植物体。
(a)配列番号2又は4に示すアミノ酸配列を含むタンパク質
(b)配列番号2又は4に示すアミノ酸配列に対して60%以上の配列類似性を有するアミノ酸配列を含み、コートマー・アダプタのゼータサブユニット又はクラスリン・アダプタの小(シグマ)サブユニットとして機能するタンパク質
(c)配列番号1又は3に示す塩基配列の相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下においてハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされ、コートマー・アダプタのゼータサブユニット又はクラスリン・アダプタの小(シグマ)サブユニットとして機能するタンパク質
(3) 上記遺伝子は、配列番号1〜62のうち偶数で示すアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする、又は配列番号1〜62のうち奇数で示す塩基配列を有することを特徴とする(1)記載の植物体。
(4) 上記遺伝子の発現をRNA干渉法により抑制したことを特徴とする(1)記載の植物体。
(5) 植物における、コートマー・アダプタのゼータサブユニットをコードする遺伝子の発現を抑制する又はコートマー・アダプタのゼータサブユニットを阻害する、若しくはクラスリン・アダプタの小(シグマ)サブユニットをコードする遺伝子の発現を抑制する又はクラスリン・アダプタの小(シグマ)サブユニットを阻害する、植物体のバイオマスを増産する方法。
(6) 上記遺伝子は、以下の(a)〜(c)のいずれかのタンパク質をコードすることを特徴とする(5)記載の方法。
(a)配列番号2又は4に示すアミノ酸配列を含むタンパク質
(b)配列番号2又は4に示すアミノ酸配列に対して60%以上の配列類似性を有するアミノ酸配列を含み、コートマー・アダプタのゼータサブユニット又はクラスリン・アダプタの小(シグマ)サブユニットとして機能するタンパク質
(c)配列番号1又は3に示す塩基配列の相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下においてハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされ、コートマー・アダプタのゼータサブユニット又はクラスリン・アダプタの小(シグマ)サブユニットとして機能するタンパク質
(7) 上記遺伝子は、配列番号1〜62のうち偶数で示すアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする、又は配列番号1〜62のうち奇数で示す塩基配列を有することを特徴とする(5)記載の方法。
(8) 上記遺伝子の発現をRNA干渉法により抑制したことを特徴とする(5)記載の方法。
(9) 植物における、コートマー・アダプタのゼータサブユニットをコードする遺伝子の発現を抑制する又はコートマー・アダプタのゼータサブユニットを阻害する、若しくはクラスリン・アダプタの小(シグマ)サブユニットをコードする遺伝子の発現を抑制する又はクラスリン・アダプタの小(シグマ)サブユニットを阻害する工程と、
前記工程後の後代植物のバイオマス量を測定し、当該バイオマス量が有意に向上した系統を選抜する工程とを含む植物体の製造方法。
(10) 上記遺伝子は、以下の(a)〜(c)のいずれかのタンパク質をコードすることを特徴とする(9)記載の製造方法。
(a)配列番号2又は4に示すアミノ酸配列を含むタンパク質
(b)配列番号2又は4に示すアミノ酸配列に対して60%以上の配列類似性を有するアミノ酸配列を含み、コートマー・アダプタのゼータサブユニット又はクラスリン・アダプタの小(シグマ)サブユニットとして機能するタンパク質
(c)配列番号1又は3に示す塩基配列の相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下においてハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされ、コートマー・アダプタのゼータサブユニット又はクラスリン・アダプタの小(シグマ)サブユニットとして機能するタンパク質
(11) 上記遺伝子は、配列番号1〜62のうち偶数で示すアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする、又は配列番号1〜62のうち奇数で示す塩基配列を有することを特徴とする(9)記載の製造方法。
(12) 上記遺伝子の発現をRNA干渉法により抑制したことを特徴とする(9)記載の製造方法。
アブラナ科:シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)、アブラナ(Brassica rapa、Brassica napus)、キャベツ(Brassica oleracea var. capitata)、ナタネ(Brassica rapa、Brassica napus)、チンゲンサイ(Brassica rapa var. chinensis)、カブ(Brassica rapa var. rapa)、ノザワナ(Brassica rapa var. hakabura)、ミズナ(Brassica rapa var. lancinifolia)、コマツナ(Brassica rapa var. peruviridis)、パクチョイ(Brassica rapa var. chinensis)、ダイコン(Brassica Raphanus sativus)、ワサビ(Wasabia japonica)など。
ナス科:タバコ(Nicotiana tabacum)、ナス(Solanum melongena)、ジャガイモ(Solaneum tuberosum)、トマト(Lycopersicon lycopersicum)、トウガラシ(Capsicum annuum)、ペチュニア(Petunia)など。
マメ科:ダイズ(Glycine max)、エンドウ(Pisum sativum)、ソラマメ(Vicia faba)、フジ(Wisteria floribunda)、ラッカセイ(Arachis. hypogaea)、ミヤコグサ(Lotus corniculatus var. japonicus)、インゲンマメ(Phaseolus vulgaris)、アズキ(Vigna angularis)、アカシア(Acacia)など。
キク科:キク(Chrysanthemum morifolium)、ヒマワリ(Helianthus annuus)など。
ヤシ科:アブラヤシ(Elaeis guineensis、Elaeis oleifera)、ココヤシ(Cocos nucifera)、ナツメヤシ(Phoenix dactylifera)、ロウヤシ(Copernicia)など。
ウルシ科:ハゼノキ(Rhus succedanea)、カシューナットノキ(Anacardium occidentale)、ウルシ(Toxicodendron vernicifluum)、マンゴー(Mangifera indica)、ピスタチオ(Pistacia vera)など。
ウリ科:カボチャ(Cucurbita maxima、Cucurbita moschata、Cucurbita pepo)、キュウリ(Cucumis sativus)、カラスウリ(Trichosanthes cucumeroides)、ヒョウタン(Lagenaria siceraria var. gourda)など。
バラ科:アーモンド(Amygdalus communis)、バラ(Rosa)、イチゴ(Fragaria)、サクラ(Prunus)、リンゴ(Malus pumila var. domestica)など。
ナデシコ科:カーネーション(Dianthus caryophyllus)など。
ヤナギ科:ポプラ(Populus trichocarpa、Populus nigra、Populus tremula) など。
フトモモ科:ユーカリ(Eucalyptus camaldulensis、Eucalyptus grandis) など。
イネ科:トウモロコシ(Zea mays)、イネ(Oryza sativa)、オオムギ(Hordeum vulgare)、コムギ(Triticum aestivum)、タケ(Phyllostachys)、サトウキビ(Saccharum officinarum)、ネピアグラス(Pennisetum pupureum)、エリアンサス(Erianthus ravenae)、ミスキャンタス(ススキ)(Miscanthus virgatum)、ソルガム(Sorghum)スイッチグラス(Panicum)など。
ユリ科:チューリップ(Tulipa)、ユリ(Lilium)など。
上述した遺伝子の発現を抑制する又は当該遺伝子がコードするタンパク質の機能を阻害する工程の後、植物体のなかから適切な表現型を示す個体を選抜する選抜工程を、従来公知の方法で行うことができる。選抜の方法は特に限定されるものではなく、植物体そのもの、または任意の器官や組織の重量を測定して野生型と比較して有意に増産しているものを選抜すればよい。
本実施例では、シロイヌナズナにおけるAt3g09800遺伝子或いはAt4g08520を過剰発現する形質転換体、及びAt3g09800遺伝子或いはAt4g08520の発現を抑制した形質転換体を作製し、バイオマス増産効果を検証した。
At3g09800遺伝子或いはAt4g08520を過剰発現させるためpBI 35S:At3g09800及びpBI 35S:At4g08520を作製した。具体的には、先ず、Arabidopsis thaliana (Col-0) のcDNAをテンプレートにして、プライマー (At3g09800: 5’-tccccgggtggtcagtcccttatgtctcctgattcttgtcct-3’(配列番号71)、5’-ttgaacgatcggggaaattcgagctctcatgtaagcagacttcttgc-3’(配列番号72)と5’-ttggagagaacacgggggactctagaggatcccgggtggtcagtc-3’(配列番号73); At4g08520: 5’-tccccgggtggtcagtcccttatggcagggactaatgattct-3’ (配列番号74)、5’-ttgaacgatcggggaaattcgagctcttatgtaagaagacttctcgc-3’ (配列番号75)と5’-ttggagagaacacgggggactctagaggatcccgggtggtcagtc-3’(配列番号76))でPCR増幅しAt3g09800及びAt4g08520のORFをそれぞれ単離した。これらのDNA断片をBamHIとSacIで切断したpBI121ベクターへIn-Fusion Dry-Down PCR Cloning Kit w/Cloning Enhancer (Clontech社製)を使用して(In-Fusion反応)クローニングし、pBI 35S:At3g09800及びpBI 35S:At4g08520を得た。
上記の4種類のベクターを野生型のシロイヌナズナ (Col-0)へfloral-dip 法 (Clough and Bent, 1998)を用いて形質転換した。T1植物の選抜はカナマイシン(終濃度30 mg/mL)とカルベニシリン(終濃度100 mg/mL)を含むMS培地で行った。その後、スーパーミックスA(サカタのタネ社製)を使用して鉢上げした。
上記で得られた形質転換体及びベクターコントロール株について、At3g09800遺伝子又はAt4g08520遺伝子の発現量をリアルタイムPCRにより解析した。なお、これら形質転換体及びベクターコントロール株についてはT3種子を使用した。
先ず、pBI 35SS:At3g09800RNAi或いはpBI 35SS:At4g08520RNAiを導入した形質転換体及びベクターコントロール株について、At3g09800遺伝子又はAt4g08520遺伝子の発現量をリアルタイムPCRにより解析した結果を、それぞれ図1及び2に示した。なお、図1及び2に示した、At3g09800遺伝子及びAt4g08520遺伝子の発現量は、At4g27960の発現量で標準化した値である。図1及び2に示したように、得られた形質転換体では、それぞれAt3g09800遺伝子及びAt4g08520遺伝子の発現量がベクターコントロール株よりも有意に抑制されていることが明らかとなった。
Claims (9)
- 以下の(a)〜(c)のいずれかのタンパク質であるコートマー・アダプタのゼータサブユニットをコードする遺伝子の発現を抑制する又は当該コートマー・アダプタのゼータサブユニットを阻害した、若しくは以下の(d)〜(f)のいずれかのタンパク質であるクラスリン・アダプタの小(シグマ)サブユニットをコードする遺伝子の発現を抑制する又は当該クラスリン・アダプタの小(シグマ)サブユニットを阻害した植物体。
(a)配列番号2に示すアミノ酸配列を含むタンパク質
(b)配列番号2に示すアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、コートマー・アダプタのゼータサブユニットとして機能するタンパク質
(c)配列番号1に示す塩基配列の相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下においてハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされ、コートマー・アダプタのゼータサブユニットとして機能するタンパク質
(d)配列番号4に示すアミノ酸配列を含むタンパク質
(e)配列番号4に示すアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、クラスリン・アダプタの小(シグマ)サブユニットとして機能するタンパク質
(f)配列番号3に示す塩基配列の相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下においてハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされ、クラスリン・アダプタの小(シグマ)サブユニットとして機能するタンパク質 - 上記遺伝子は、配列番号30又は54で示すアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする、又は配列番号29又は53で示す塩基配列を有することを特徴とする請求項1記載の植物体。
- 上記遺伝子の発現をRNA干渉法により抑制したことを特徴とする請求項1記載の植物体。
- 植物における、以下の(a)〜(c)のいずれかのタンパク質であるコートマー・アダプタのゼータサブユニットをコードする遺伝子の発現を抑制する又は当該コートマー・アダプタのゼータサブユニットを阻害する、若しくは以下の(d)〜(f)のいずれかのタンパク質であるクラスリン・アダプタの小(シグマ)サブユニットをコードする遺伝子の発現を抑制する又は当該クラスリン・アダプタの小(シグマ)サブユニットを阻害する、植物体のバイオマスを増産する方法。
(a)配列番号2に示すアミノ酸配列を含むタンパク質
(b)配列番号2に示すアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、コートマー・アダプタのゼータサブユニットとして機能するタンパク質
(c)配列番号1に示す塩基配列の相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下においてハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされ、コートマー・アダプタのゼータサブユニットとして機能するタンパク質
(d)配列番号4に示すアミノ酸配列を含むタンパク質
(e)配列番号4に示すアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、クラスリン・アダプタの小(シグマ)サブユニットとして機能するタンパク質
(f)配列番号3に示す塩基配列の相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下においてハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされ、クラスリン・アダプタの小(シグマ)サブユニットとして機能するタンパク質 - 上記遺伝子は、配列番号30又は54で示すアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする、又は配列番号29又は53で示す塩基配列を有することを特徴とする請求項4記載の方法。
- 上記遺伝子の発現をRNA干渉法により抑制したことを特徴とする請求項4記載の方法。
- 植物における、以下の(a)〜(c)のいずれかのタンパク質であるコートマー・アダプタのゼータサブユニットをコードする遺伝子の発現を抑制する又は当該コートマー・アダプタのゼータサブユニットを阻害する、若しくは以下の(d)〜(f)のいずれかのタンパク質であるクラスリン・アダプタの小(シグマ)サブユニットをコードする遺伝子の発現を抑制する又は当該クラスリン・アダプタの小(シグマ)サブユニットを阻害する工程と、
前記工程後の後代植物のバイオマス量を測定し、当該バイオマス量が有意に向上した系統を選抜する工程とを含む植物体の製造方法。
(a)配列番号2に示すアミノ酸配列を含むタンパク質
(b)配列番号2に示すアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、コートマー・アダプタのゼータサブユニットとして機能するタンパク質
(c)配列番号1に示す塩基配列の相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下においてハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされ、コートマー・アダプタのゼータサブユニットとして機能するタンパク質
(d)配列番号4に示すアミノ酸配列を含むタンパク質
(e)配列番号4に示すアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、クラスリン・アダプタの小(シグマ)サブユニットとして機能するタンパク質
(f)配列番号3に示す塩基配列の相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下においてハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされ、クラスリン・アダプタの小(シグマ)サブユニットとして機能するタンパク質 - 上記遺伝子は、配列番号30又は54で示すアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする、又は配列番号29又は53で示す塩基配列を有することを特徴とする請求項7記載の製造方法。
- 上記遺伝子の発現をRNA干渉法により抑制したことを特徴とする請求項7記載の製造方法。
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