CN112481274B - 引起水稻矮化的转录因子基因loc_os04g54330及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了引起水稻矮化的转录因子基因LOC_OS04G54330及其应用，属于植物生物技术领域。本发明提供了一种转录因子基因LOC_OS04G54330，其转入水稻后能够使水稻茎秆短小粗壮，具有良好的抗倒伏能力，降低生物量。并且转基因植株的光合速率、蒸腾速率、气孔导度和胞间CO2浓度均显著高于野生型，表明该基因具有提高水稻的光合速率的潜能。通过分析转基因植株赤霉素合成代谢途径中的关键酶基因的表达量，发现转基因植株中CPS1的表达量大幅降低，证明所述的转录因子基因具有调控水稻中赤霉素含量的潜力。本发明提供的转录因子基因为进一步培育新的水稻品种提供了工具。

Description

引起水稻矮化的转录因子基因LOC_OS04G54330及其应用
技术领域
本发明涉及植物生物技术领域，特别是涉及引起水稻矮化的转录因子基因LOC_OS04G54330及其应用。
背景技术
我国是世界上最大的水稻生产国之一，水稻作为主要的粮食作物在我国粮食体系中有着不可或缺的地位。为确保粮食安全以及产量需求，对水稻株型及其光合效率进行研究具有重要的现实意义。
在水稻培育生产过程中，水稻高度对于作物株型来说是一项重要的性状指标，其与作物抗逆性及产量密切相关。在水稻品种中，矮化表型的株系茎秆短小粗壮，具有良好的抗倒伏和耐肥的能力；同时短小的茎秆可以降低茎秆的同化作用，让更多的光合产物转移到穗部，从而提高水稻产量。
对于水稻矮化的分子机制，前人的研究表明，赤霉素、油菜素内酯、独脚金内酯等植物激素均与矮化相关，可以通过调节它们的生物合成及信号转导进而调节植株的高度，其中赤霉素在生长发育过程中发挥重要的调控功能。例如水稻sd-1半矮杆基因广泛应用于水稻矮化育种，大大提高了水稻产量。其引起水稻矮化的分子机制是由于编码GA20氧化酶(OsGA20ox2)的基因sd-1突变，而sd-1编码GA20氧化酶在赤霉素合成中起关键作用。
随着植物基因工程技术的快速发展，人们已经逐渐开始采用引入外源基因的方式来对水稻的性状进行调控。因此，寻找一种能够调控水稻株高的外源转录因子，为水稻株型的改良、光合速率和产量的提高提供新的技术，对进一步提升水稻产量具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种引起水稻矮化的转录因子基因LOC_OS04G54330及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，为培育矮化和高光合速率水稻提供工具。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种引起水稻矮化、提高水稻光合速率的转录因子基因LOC_OS04G54330，所述的转录因子核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供一种重组构建体，所述的重组构建体包含所述的转录因子核苷酸序列；所述重组构建体选自克隆载体或者用于表达所述核苷酸序列的表达载体。
本发明还提供一种重组宿主细胞，包含所述的转录因子核苷酸序列或所述的重组构建体，或基因组中整合有所述的转录因子核苷酸序列。
优选的，所述的重组宿主细胞为农杆菌细胞。
优选的，所述重组的宿主细胞为大肠杆菌细胞。
本发明还提供一种培育矮化水稻的方法，将所述的转录因子基因转入作物细胞中获得转基因水稻植株，使得所述转基因水稻植株表达所述的转录因子基因。
本发明还提供一种培育高光合速率水稻的方法，将所述的转录因子基因转入作物细胞中获得转基因水稻植株，使得所述转基因水稻植株表达所述的转录因子基因。
本发明还提供所述的转录因子基因在水稻育种中的应用，所述的应用为所述的转录因子基因在降低水稻中赤霉素含量中的应用。
本发明还提供所述的转录因子基因在水稻育种中的应用，所述的应用为所述的转录因子基因在降低水稻株高中的应用。
本发明还提供所述的转录因子基因在水稻育种中的应用，所述的应用为所述的转录因子基因在提高水稻光合速率中的应用。
本发明公开了以下技术效果：
本发明提供了一种转录因子基因LOC_OS04G54330，其转入水稻后能够使水稻茎秆短小粗壮，具有良好的抗倒伏能力，降低生物量。并且转LOC_OS04G54330植株的光合速率、蒸腾速率、气孔导度和胞间CO2浓度均显著高于野生型，表明LOC_OS04G54330基因具有提高水稻的光合速率的潜能。通过分析转基因植株赤霉素合成代谢途径中的关键酶基因的表达量，发现转基因植株中CPS1的表达量大幅降低，证明所述的转录因子基因具有调控水稻中赤霉素含量的潜力。本发明提供的转录因子基因为进一步培育新的水稻品种提供了工具。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为含目的基因LOC_OS04G54330的载体1391Z示意图；
图2中A为大肠杆菌DH5α潮霉素抗性筛选结果；B为大肠杆菌转化潮霉素抗性基因的PCR产物电泳结果，其中，M为DL2000 DNA Marker，1-11为阳性菌株；12为阳性对照；13为阴性对照；
图3中A为质粒载体电泳检测结果，其中，M为DL15000 DNA Marker，1-8为质粒；B为目的基因PCR电泳结果，其中，M为DL2000 DNA Marker，1-9为目的基因条带，10为阴性对照；
图4为转LOC_OS04G54330基因水稻PCR电泳结果；其中，M为DL2000 DNA Marker，1-11为LOC_OS04G54330基因特异性条带，12为阳性对照，13为阴性对照；
图5中A为LOC_OS04G54330转基因植株和野生型水稻的表型，左为转LOC_OS04G54330植株，右为野生型；B为转LOC_OS04G54330基因水稻T0代大田表型，左边第1排为野生型(对照)，第2和3排为转LOC_OS04G54330基因水稻；
图6为野生型与转LOC_OS04G54330基因水稻光合作用相关参数测定；图中A为野生型和转LOC_OS04G54330基因水稻光合速率的统计结果；B为野生型和转LOC_OS04G54330基因水稻气孔导度的统计结果；C为野生型和转LOC_OS04G54330基因水稻胞间CO2浓度的统计结果；D为野生型和转LOC_OS04G54330基因水稻蒸腾速率的统计结果；**为p<0.01差异极显著；
图7为转LOC_OS04G54330基因水稻与野生型水稻对应的节间特点图；图中A为日本晴与转LOC_OS04G54330基因水稻对应的节间表型，从上至下分别为倒一节间、倒二节间、倒三节间、倒四节间；B为日本晴与转LOC_OS04G54330基因水稻对应的节间长度比较；C为日本晴与转LOC_OS04G54330基因水稻各节间长度；
图8为定量PCR检测赤霉素合成代谢途径中4个关键酶基因表达量结果；a、b、c、d分别是野生型和转LOC_OS04G54330水稻KAO、CPS1、KS1、GA20ox1四个基因表达量的差异。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
本发明中所采用的材料与试剂，如无特殊说明，均可由商业途径获得。
以下实施例中的植物材料为日本晴，转录因子基因LOC_OS04G54330来源于玉米。
实施例1
含目的基因LOC_OS04G54330的载体构建
转录因子基因LOC_OS04G54330的基因序列如SEQ ID NO.1所示，用限制性内切酶HindIII和EcoRI双酶切pCAMBIA1391Z载体和转录因子基因LOC_OS04G54330，得到pCAMBIA1391Z载体骨架片段和基因的双酶切片段；将目的基因LOC_OS04G54330的双酶切片段与pCAMBIA1391Z载体骨架片段进行连接，获得重组质粒(图1)。使用热激法将重组质粒转入大肠杆菌，将大肠杆菌涂在含潮霉素的LB培养基上，对大肠杆菌进行抗性筛选，结果见如图2A所示。挑选大肠杆菌的单菌落，利用菌落PCR技术(目的基因通用引物序列和潮霉素引物序列详情见表1)进一步验证是否转化成功，图2B是菌落PCR的电泳结果，结果表明大肠杆菌内均能扩增出潮霉素基因特异条带，潮霉素基因特异条带大小在750bp左右，扩增的条带清晰，因此判断转化大肠杆菌成功。
表1目的基因和潮霉素引物序列(SEQ ID NO.2-SEQ ID NO.5)
Figure GDA0003250299930000061
使用质粒小提试剂盒从已转化的大肠杆菌中提取质粒并进行凝胶电泳，载体大小约为13.5kb左右，电泳结果(图3A)显示，载体条带大小一致，为单条带且条带清晰，表明成功提取出了大肠杆菌内的过表达载体。用目的基因通用引物对质粒进行PCR以进一步检测过表达载体是否构建成功，所转入的目的基因大小在1000bp左右，结果均能扩增出目的基因特异条带(图3B)，条带清晰大小正确，表明过表达载体构建成功。
实施例2
转基因植株的获得
1)转化
将上一步中构建成功的载体导入农杆菌AGL1，将此农杆菌重悬于液体共培养基(AAM液体培养基+50mg/L乙酰丁香酮，pH5.2)中培养，经调整得到OD600＝0.15的菌液。用菌液浸泡水稻胚性愈伤组织30min，然后经共培养、筛选、生根、壮苗，待水稻成苗后即得到T0代转基因植株。
2)转LOC_OS04G54330水稻的PCR检测
采用CTAB法提取T0代转基因组培苗叶片DNA，提取DNA后对载体上的目的基因进行PCR特异性扩增，验证目的基因LOC_OS04G54330是否转入水稻内，电泳结果如图4所示，转基因水稻全部表现为阳性，且条带大小在1000bp左右，条带清晰正确，表明水稻转化成功。
实施例3
转基因植株表型分析
LOC_OS04G54330转基因植株和野生型水稻的表型如图5所示，可见相比于野生型植株，转基因植株呈现出矮小性状。
1)遗传分析
经过统计，T0代转LOC_OS04G54330基因水稻均表现为矮化表型。收获T0代种子后每个株系分别种植30株，对T1代水稻株高表型进行统计。由于载体上带有强启动子，所以由转录因子引起矮化表型的现象应为显性遗传。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10-300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。对30株转LOC_OS04G54330水稻进行卡方检验(表2)，df(自由度)＝2-1＝1，当p＝0.05时，查χ2表得χ2＝3.84，与实验所得卡方值对比，0.04＜3.84，统计学认为在5％显著水平上差异不显著，遗传学上认为转LOC_OS04G54330水稻后代株高表型符合孟德尔第二定律，表明转LOC_OS04G54330水稻的矮化表型为显性。
表2转LOC_OS04G54330水稻株高χ2检验表
Figure GDA0003250299930000081
2)转基因矮化表型水稻的光合效率测定
在水稻生长至抽穗期1周后，挑选晴朗的天气，在上午9:00～11:00或下午2：00～5:00进行试验。为了保证测量数据的稳定和准确，需要连续3天对转基因矮化表型水稻的光合效率测定进行重复实验。挑选长势一致的野生型和转基因矮化表型的水稻共30株，使用Li-6800对剑叶的光合效率、胞间CO2浓度等生理指标进行测量，结果表明转LOC_OS04G54330水稻的光合速率、蒸腾速率、气孔导度、胞间CO2浓度均显著高于野生型(图6)。
光合仪的参数设置为：光照强度为800μmol·m-2·s-1，CO2浓度为400ppi，相对湿度为75％。操作步骤如下：测量水稻剑叶的叶宽，将数据输入光合仪中自动得到相应的叶面积。将剑叶的叶片中部夹在叶室中央并进行测量。同一单株测量时间设置间隔30s记录一次数据，每株共测20min。在测量前需要对光合仪进行校准和检测，确保各项参数指标为正常值。
3)转基因水稻矮化表型农艺性状相关参数
在成熟期，统计了野生型日本晴和转LOC_OS04G54330水稻的节间长度(图7)。结果发现转LOC_OS04G54330水稻的4个节间与日本晴相比都有所缩短，其中倒一节间和倒二节间缩短更为明显，倒一节间相比野生型缩短了47.86％，倒二节间相比野生型缩短了49.12％，结果表明LOC_OS04G54330基因能缩短水稻茎部节间长度。
选取野生型和T1代转LOC_OS04G54330基因水稻共30株进行株高、千粒重、结实率、生物量和有效分蘖数的统计(表3)，结果表明转LOC_OS04G54330基因水稻的株高和生物量较野生型降低，但分蘖数、结实率和千粒重同野生型的差异并不显著。
表3转LOC_OS04G54330基因水稻农艺性状统计结果
Figure GDA0003250299930000091
实施例4
转录因子基因LOC_OS04G54330引起水稻矮化的分子机理初探
赤霉素在水稻生长发育过程中起着重要的作用，对水稻节间和茎的生长起着重要的调控作用。为了分析转LOC_OS04G54330水稻是否影响激素GA的合成或信号转导途径，本发明利用了定量PCR方法对水稻赤霉素合成代谢途径中的关键酶基因KAO、KS1、CPS1、GA20ox1的表达量进行分析。用primer5软件设计目的基因的引物，由北京擎科新业生物技术有限公司合成，引物序列见表4。采用RNA提取试剂盒，提取筛选出的生长至三叶期的转LOC_OS04G54330水稻和对照日本晴的第3片叶片RNA，用RUEscript RT Kit反转录试剂盒将其反转录成cDNA。利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法，分析各基因在野生型和转基因水稻中的表达量，反应体系如表5，试验结果见图8，结果表明KAO、KS1、GA20ox1三个基因表达量差异并不显著，CPS1表达量与野生型相比明显下降。由此说明，LOC_OS04G54330转录因子基因导致水稻赤霉素合成通路中的关键酶基因CPS1表达量下降，对赤霉素生物合成起到负调控的作用。
表4实时荧光定量PCR的引物序列(SEQ ID NO.6-SEQ ID NO.15)
Figure GDA0003250299930000101
表5定量PCR反应体系
Figure GDA0003250299930000102
Figure GDA0003250299930000111
实施例5
LOC_OS04G54330基因在水稻育种中的应用
LOC_OS04G54330基因作为水稻矮化的重要基因，使水稻茎秆短小粗壮，具有良好的抗倒伏能力，降低生物量。转LOC_OS04G54330植株的光合速率、蒸腾速率、气孔导度和胞间CO2浓度均显著高于野生型，表明LOC_OS04G54330基因具有提高水稻的光合速率的潜能。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
序列表
<110> 河北科技大学
中国农业科学院生物技术研究所
<120> 引起水稻矮化的转录因子基因LOC_OS04G54330及其应用
<160> 15
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 749
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
caaaaagcca ggcaggcggc cgccttgttt aactttaaga aggagccctt caccatggtg 60
tgcatccggc aggcgactat cgacgacctg ctggcgatgc aggcgtgcaa cttgatgtgc 120
ctgccggaga actaccagat gaagtactac ctctaccaca tgctgtcttg gccgcagctc 180
ctcttcgtcg ccgaggacta cggcggccgc atcgtcggct acgtgctcgc caagatggag 240
gaggacccct ccgagccctg ccacggccac atcacctccc tcgcggtgct ccgctcccac 300
cgcaagctcg ggctcgccac caagctcatg tccgccgcgc aggcagccat ggaccaggtc 360
ttcggcgccg agtacgtctc cctccacgtc cgccgatcca accgcgccgc cttcaacctc 420
tacacctcca ctctcgggta ccagatccac gacatcgagg ccaagtacta cgccgatgga 480
gaggacgcgt tcgacatgcg caagcctctc cggcagccgc aacctaagaa gcaccaccat 540
caccaccacc acggccccgg tgggtgctgc tcccacgacg cacctacggc gacgactggt 600
tcttctcctc agtcttttag ttcgccggat aagaaggcta acactaaggg tgggcgcgcc 660
gacccagctt tcttgtacaa agtggttgat aacagcgggt taattaacat cttttaccca 720
tacgatgtct tggaaaaatt gaaaatttt 749
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gggatcctct agagtcgacc tg 22
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gcatagtcag gaacatcgta tgg 23
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gtgctttcag cttcgatg 18
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aaccaagctc tgatagag 18
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tgctatgtac gtcgccatcc ag 22
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
aatgagtaac cacgctccgt ca 22
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ccggagcgtc cctcgtcatc a 21
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tccaagttgt ccattggatt gagc 24
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
aagctcgatc agctgccatt t 21
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
caatgcgggc ttcagacaat 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tgagaatggc ctggaagctt 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ctcagaggca cggtttggtt 20
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
acccgagggt gtacccggac t 21
<210> 15
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ggttgcaggt gacgatgatg attaa 25

Claims (10)

1.一种引起水稻矮化、提高水稻光合速率的转录因子基因LOC_OS04G54330，其特征在于，所述的转录因子核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种重组构建体，其特征在于，所述的重组构建体包含权利要求1所述的转录因子核苷酸序列；所述重组构建体选自克隆载体或者用于表达权利要求1所述核苷酸序列的表达载体。
3.一种重组宿主细胞，其特征在于，包含权利要求1所述的转录因子核苷酸序列或权利要求2所述的重组构建体，或基因组中整合有权利要求1所述的转录因子核苷酸序列。
4.根据权利要求3所述的重组宿主细胞，其特征在于，所述的重组宿主细胞为农杆菌细胞。
5.根据权利要求3所述的重组宿主细胞，其特征在于，所述重组的宿主细胞为大肠杆菌细胞。
6.一种培育矮化水稻的方法，其特征在于，将权利要求1所述的转录因子基因转入作物细胞中获得转基因水稻植株，使得所述转基因水稻植株表达权利要求1所述的转录因子基因。
7.一种培育高光合速率水稻的方法，其特征在于，将权利要求1所述的转录因子基因转入作物细胞中获得转基因水稻植株，使得所述转基因水稻植株表达权利要求1所述的转录因子基因。
8.一种权利要求1所述的转录因子基因在水稻育种中的应用，其特征在于，所述的应用为权利要求1所述的转录因子基因在降低水稻中赤霉素含量中的应用。
9.一种权利要求1所述的转录因子基因在水稻育种中的应用，其特征在于，所述的应用为权利要求1所述的转录因子基因在降低水稻株高中的应用。
10.一种权利要求1所述的转录因子基因在水稻育种中的应用，其特征在于，所述的应用为权利要求1所述的转录因子基因在提高水稻光合速率中的应用。
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