CN111254142B - 玉米籽粒镉低积累控制基因ZmCd1的分子标记和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了玉米籽粒镉低积累控制基因ZmCd1的分子标记和应用。本发明以含有436份玉米自交系构成的关联群体为基础材料，对玉米籽粒镉含量性状进行遗传分析，在显著SNP位点侧翼序列100kb范围内筛选调控玉米籽粒镉含量的候选基因，锁定到一个候选基因命名为ZmCd1，序列比对分析发现镉高积累玉米自交系较低积累玉米自交系在ZmCd1基因的启动子位置存在7520bp缺失和604bp的Gypsy类LTR反转座子插入突变，根据该启动子位置的差异序列开发基于PCR的功能分子标记PCR‑ZmCd1。该分子标记可用于镉低积累玉米的早期预测、筛选，以及选育。

Description

玉米籽粒镉低积累控制基因ZmCd1的分子标记和应用

技术领域

本发明涉及作物分子标记辅助育种技术领域，特别是涉及玉米籽粒镉低积累控制基因ZmCd1的分子标记和应用。

背景技术

镉是一种生物毒性显著的重金属，其会随着食物链进入人体，严重危害人们的身体健康。镉被世界卫生组织(WHO)列为重点研究的食品污染物，被我国列为实施排放总量控制的重点监控指标。玉米是我国重要的粮食和饲料作物，其种植面积和产量列居各农作物之首。土壤中的镉经玉米根系吸收最终在可食部位中积累，严重影响玉米的品质安全，对人和动物的健康造成威胁。因此，提升玉米对镉毒害的耐受性，降低玉米中镉积累量，对保障社会和经济的持续健康发展具有重要意义。

植物对镉的耐性是一个复杂的性状，受到一系列基因的调控。部分镉积累调控基因在拟南芥、水稻中已经被克隆，但是植物中对镉耐受的分子机制仍不清晰，而且玉米中控制籽粒镉积累性状的关键基因还未被克隆。因此，鉴定玉米籽粒镉含量关键调控基因，开发其功能分子标记应用于镉低积累玉米种质的筛选和鉴定，是保障玉米安全生产的迫切需要。由于玉米镉低积累关键调控基因的功能分子标记尚未被开发，限制了其在分子标记辅助选育镉低积累玉米品种中的应用。有必要开发与玉米镉低积累相关的调控基因及其分子标记，以推动镉低积累玉米品种的选育和推广工作。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一种玉米籽粒镉低积累控制基因及其应用。

本发明的第二个目的在于提供与玉米籽粒镉低积累控制基因相关的分子标记，及扩增该分子标记的特异性引物组合。

本发明的第三个目的是提供上述分子标记的应用。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

以含有436份玉米自交系构成的关联群体为基础材料，对玉米籽粒镉含量性状进行遗传分析，发现有1006个显著的SNP位点集中分布在2号染色体。根据基因功能注释在显著SNP位点侧翼序列100kb范围内筛选调控玉米籽粒镉含量的候选基因。锁定到一个候选基因，命名为ZmCd1。对ZmCd1基因进行测序，序列比对分析发现镉高积累玉米自交系较低积累玉米自交系在ZmCd1基因的启动子位置存在7520bp缺失和604bp的Gypsy类LTR反转座子插入突变，基因显隐性分析发现该插入突变为隐性突变。ZmCd1突变体等位测验进一步证实ZmCd1的突变导致玉米籽粒镉高积累性状。根据该启动子位置的差异序列开发基于PCR的功能分子标记PCR-ZmCd1。

本发明提供的玉米籽粒镉低积累控制基因ZmCd1位于玉米基因组第2染色体，其具有SEQ ID NO.9所示的核苷酸序列。

上述玉米镉低积累控制基因ZmCd1编码的蛋白属于本发明的保护范围。

本发明提供了上述玉米镉低积累控制基因ZmCd1或其编码的蛋白在作物分子辅助育种中的应用。

本发明提供了上述玉米籽粒镉低积累控制基因ZmCd1、或其编码的蛋白、或含有所述ZmCd1基因的生物材料在调控玉米籽粒镉积累中的应用，所述的生物材料为表达盒、表达载体、工程菌或宿主细胞。

本发明提供了上述玉米籽粒镉低积累控制基因ZmCd1或其编码的蛋白在制备镉低积累玉米品种中的应用。

本发明提供了上述玉米籽粒镉低积累控制基因ZmCd1或其编码的蛋白在预测玉米籽粒镉积累能力中的应用。

本发明进一步提供了玉米籽粒镉低积累控制基因ZmCd1的启动子，其具有SEQ IDNO.1所示的核苷酸序列，或与其有80％、85％、90％、95％、98％或99％以上同源性的具有相同功能的特异性序列。

本发明还提供了玉米籽粒镉低积累控制基因ZmCd1的另一种启动子，其具有SEQID NO.8所示的核苷酸序列，或与其有80％、85％、90％、95％、98％或99％以上同源性的具有相同功能的特异性序列。该启动子序列能够使玉米籽粒镉低积累控制基因ZmCd1表达沉默。

本发明提供了上述两种启动子在调控玉米籽粒镉积累、或制备镉低积累玉米品种、或预测玉米籽粒镉积累能力中的应用。其中SEQ ID NO.1所示的启动子序列能够调控下游基因ZmCd1，使其表达，从而降低玉米籽粒镉积累，而SEQ ID NO.8所示启动子序列调控下游基因ZmCd1沉默，从而增加了玉米籽粒镉积累。

本发明提供了玉米籽粒镉低积累控制基因ZmCd1的功能分子标记，命名为PCR-ZmCd1，该分子标记与ZmCd1基因共分离，其为SEQ ID NO.1所示启动子序列第56bp位置起缺失一段SEQ ID NO.2所示的序列，即在ZmCd1基因起始密码子上游300bp位置缺失一段SEQID NO.2所示的序列、同时在该位置插入一段SEQ ID NO.3所示的序列。反转录PCR检测结果显示启动子区域的这段改变导致ZmCd1基因不表达。

优选地，本发明所述分子标记含有SEQ ID NO.8所示的序列。

优选地，本发明所述的分子标记可通过SEQ ID NO.4-6所示的引物序列PCR扩增得到。

本发明还提供了一种引物组合，含有三条引物，其核苷酸序列分别如SEQ IDNO.4-6所示。

本发明提供了上述的分子标记或上述的引物组合在镉低积累玉米品种鉴定或选育中的应用。

本发明提供了上述的分子标记或上述的引物组合在玉米分子辅助育种中的应用。

上述的应用中，具体而言是用SEQ ID NO.4-6所示的引物对待测玉米品种DNA进行PCR扩增，若扩增产物电泳检测仅出现大小为574bp的片段，则待测玉米为籽粒镉高积累玉米品种；

若扩增产物电泳检测仅出现大小为776bp的片段，或同时出现574bp和776bp两个片段，则待测玉米为籽粒镉低积累玉米品种。

本发明还提供了一种制备镉低积累转基因玉米的方法，通过基因工程的方法使玉米籽粒镉低积累控制基因ZmCd1过表达，从而获得镉低积累转基因玉米。

本发明的有益效果在于：本发明以含有436份玉米自交系构成的关联群体为基础材料，对玉米籽粒镉含量性状进行遗传分析，在显著SNP位点侧翼序列100kb范围内筛选调控玉米籽粒镉含量的候选基因，锁定到一个候选基因命名为ZmCd1，序列比对分析发现镉高积累玉米自交系较低积累玉米自交系在ZmCd1基因的启动子位置存在7520bp缺失和604bp的Gypsy类LTR反转座子插入突变，根据该启动子位置的差异序列开发基于PCR的功能分子标记PCR-ZmCd1。该分子标记可用于镉低积累玉米的早期预测、筛选，以及选育，可用于高通量、快速、准确鉴定及筛选镉低积累能力的玉米种质资源，可通过分子标记辅助育种手段加速玉米品种的遗传改良。

附图说明

图1为玉米籽粒中镉积累量关联分析结果图。A:曼哈顿图；B:QQ Plot图。箭头指的是最显著的SNP位点。

图2与镉低积累玉米自交系B73(籽粒镉含量为0.008mg/kg)相比，镉高积累玉米自交系Mo17(籽粒镉含量为0.14mg/kg)在ZmCd1基因的启动子区域存在Gypsy类LTR反转座子插入突变(灰色)。

图3功能分子标记PCR-ZmCd1对镉高积累(Mo17)，镉低积累(B73)玉米自交系和B73×Mo17玉米杂交种的基因分型检测结果。PCR产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。B×M：B73×Mo17。M：DNA marker 2000。

图4功能分子标记PCR-ZmCd1对3个镉高积累玉米自交系(郑58，Ye478，P178)和3个镉低积累玉米自交系(黄早四，京92和京724)的基因分型检测结果。PCR产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。泳道1-7分别为郑58，Ye478，P178，黄早四，京92，京724和对照组(拟南芥DNA为模板)。M:DNA marker 2000。

图5功能分子标记PCR-ZmCd1对自然群体中12个玉米自交系的基因分型检测结果。PCR产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。33，35，36，37，39，4，40，41，42，43，44和45分别为玉米自交系GEMS33，GEMS35，GEMS36，GEMS37，GEMS39，GEMS4，GEMS40，GEMS41，GEMS42，GEMS43，GEMS44和GEMS45。M：DNA marker 2000。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

本发明实施例中所用的玉米种质资源均来自北京市农林科学院玉米研究中心玉米种质资源库。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1利用全基因组关联分析定位籽粒镉低积累关键调控基因

由436份玉米自交系构成的关联群体，在镉污染农田(镉含量为1.8±0.3mg/kg)种植，试验采用随机区组设计，进行两次独立性重复。对于每个重复，每个玉米自交系种植一排，每排种植10株。每排长3m，排间距为60cm。玉米收获后测定籽粒镉含量。以两个重复对应自交系籽粒镉含量的平均值作为该自交系表型值。关联群体的基因型是结合简化基因组测序(GBS)、高密度阵列技术，和来自368个不同玉米自交系的深度RNA测序数据，鉴别出等位基因频率(MAF)大于0.05的1.25M SNPs(Liu等,2017,Molecular Plant,10:414-426)。结合基因型和表型，利用Tassel3.0软件的混合线性模型(MLM)，把群体结构和亲缘关系(Q+K)作为协变量进行全基因组关联分析。关联分析结果设定阈值为P<7.97e-7。在该阈值下，发现有1006个显著的SNP位点集中分布在2号染色体，最显著的SNP位点(chr2.S_158408660)的显著性P值达到2.6961e-21，能够解释24.2％的表型变异，见图1。

土壤镉含量测定方法为：采用5点取样法，用取土器采集0-20cm深度土样，参考GB/T 17141-1997标准检测土壤镉含量。

玉米籽粒镉含量测定方法为：玉米果穗成熟后晒干脱粒，对于每个自交系的每个独立性重复，取1kg籽粒烘干粉碎，过100目筛，用硝酸-高氯酸消解样品后，利用ZEEnit700P原子吸收光谱仪石墨炉法测定消化液中镉含量(mg/kg)(吴家梅，2019，Journal of Agro-Environment Science，38：502-509)。

实施例2候选基因筛选

根据实施例1群体的LD衰减距离(Liu等,2017,Molecular Plant,10:414-426)，在显著SNP位点侧翼序列100kb范围内筛选调控玉米籽粒镉含量的候选基因。根据基因功能注释，锁定到一个候选基因，命名为ZmCd1。该基因位于最显著SNP位点(chr2.S_158408660)侧翼序列100kb范围内。

对4个镉高积累玉米自交系郑58(0.26mg/kg)，Ye478(0.21mg/kg)，P178(0.44mg/kg)和Mo17(0.14mg/kg)和4个镉低积累玉米自交系B73(0.008mg/kg)，黄早四(0.009mg/kg)，京92(0.014mg/kg)和京724(0.008mg/kg)的ZmCd1基因进行测序，序列进行比对分析后发现，4个镉高积累玉米自交系郑58，Ye478，P178和Mo17均在ZmCd1基因的启动子区域，即翻译起始密码子(5′-ATGGGCAGTGTCGAGGAGAGGCTGCTGCCA-3′)上游300bp位置存在7520bp缺失(SEQ ID NO.2)和604bp(SEQ ID NO.3)的插入突变(以玉米B73为参考基因组)，CENSOR软件(https://www.girinst.org/censor/index.php)分析发现该604bp插入序列为Gypsy类LTR反转座子(图2)。表1为扩增ZmCd1的cDNA的引物信息。

表1ZmCd1 cDNA扩增引物信息

引物	5′-3′序列
		472F	GATGGGCAGTGTCGAGGAG(SEQ ID NO.10)
3618R	AGCTTTTGGTCTTGTTGCATGA(SEQ ID NO.11)

初步表明ZmCd1启动子区域的插入突变与玉米籽粒中镉高积累性状相关。

镉高积累玉米自交系Mo17、Qi319与镉低积累玉米自交系B73、HZS杂交，所获得的B73×Mo17，Mo17×B73，HZS×Qi319,Qi319×HZS杂交种在镉污染农田种植后，其籽粒镉含量均较低，分别为0.02±0.00，0.02±0.007，0.01±0.00，0.02±0.01(mg/kg)。表明在ZmCd1基因启动子位置的Gypsy类LTR反转座子插入突变为隐性突变。

实施例3候选基因ZmCd1功能验证

从玉米突变体库MEMD(http://www.elabcaas.cn/memd/)中索取在ZmCd1(Zm00001d005190)基因编码区发生终止突变(EMS4-038f45)和错误剪接(EMS4-038f36)的EMS突变体，在镉污染农田各种植5排，每排种植10株。玉米成熟后，混合脱粒测定籽粒镉含量，测定3个生物学重复。测量结果显示，同一突变体籽粒间镉含量差异不显著，突变体籽粒镉含量分别为0.26±0.16mg/kg和0.24±0.07mg/kg，显著高于野生型材料B73(籽粒镉含量为0.008mg/kg)。

用EMS4-038f45、EMS4-038f36分别与镉高积累玉米自交系Mo17(启动子位置存在LTR反转座子插入)杂交进行等位测验。EMS4-038f45、EMS4-038f36两个突变体各种植5排，每排种植10株。分别与Mo17杂交，F1玉米种子在镉污染农田种植收获后，混合脱粒测定玉米籽粒镉含量，测定3个生物学重复。测定结果显示，每种F1玉米种子之间镉含量差异不显著，其籽粒镉含量均高(分别为0.24±0.05mg/kg和0.22±0.06mg/kg)，显著高于野生型材料B73(籽粒镉含量为0.008mg/kg)。突变体等位测验实验结果进一步证实ZmCd1基因为玉米籽粒镉积累关键调控基因，ZmCd1的突变导致玉米籽粒镉高积累。

实施例4ZmCd1基因功能分子标记开发及其应用

基于镉高积累玉米自交系Mo17和镉低积累玉米自交系B73在ZmCd1基因启动子区域的序列差异(另外3个高镉积累玉米自交系郑58、Ye478、P178与另外3个低镉积累玉米自交系黄早四、京92、京724均存在类似的前述这种差异)，本实施例开发PCR功能分子标记PCR-ZmCd1，其引物信息见表2。

表2功能分子标记PCR-ZmCd1引物信息

引物	5′-3′序列
		BHJ-3F	TGGCAAGCTCAACACTGGTA(SEQ ID NO.4)
774R	GGCCAGAATCAAGGACTGCA(SEQ ID NO.5)
		MZ-201F	TCCGCGACATGGATTTGGAA(SEQ ID NO.6)

PCR扩增条件为：94℃5min，然后94℃30s,59℃30s,72℃1min进行34个循环，最后72℃延伸10min。PCR扩增产物用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测。

利用该标记的BHJ-3F，MZ-201F和774R引物，在镉高积累玉米自交系Mo17中的扩增片段大小为574bp，镉低积累玉米自交系B73中扩增片段大小为776bp，在B73×Mo17杂交种中同时扩增出574bp和776bp(图3)。

利用上述BHJ-3F，MZ-201F和774R引物对另外3个镉高积累玉米自交系(郑58，Ye478，P178)和3个镉低积累玉米自交系(黄早四，京92和京724)分别进行PCR扩增，扩增结果显示：3个镉高积累玉米自交系(郑58，Ye478，P178)均仅扩增出574bp的片段；另外3个镉低积累玉米自交系(黄早四，京92和京724)均仅扩增出776bp的片段(图4)，以拟南芥作为对照。

用所开发的PCR-ZmCd1功能标记对关联群体中12个玉米自交系做基因分型检测(图5)，发现5个镉高积累玉米自交系(GEMS33，GEMS35，GEMS36，GEMS37，GEMS43)(表3)中扩增片段大小均为574bp，而7个低积累玉米自交系(GEMS39，GEMS4，GEMS40，GEMS41，GEMS42，GEMS44，GEMS45)(表3)中扩增片段大小均为776bp，表明该PCR功能分子标记可以将镉高积累和镉低积累玉米自交系区分开。

表3自然群体中12个玉米自交系籽粒镉含量测定结果

材料名称	籽粒镉含量(mg/kg)
		GEMS33	1.064
GEMS35	0.732
		GEMS36	0.713333
GEMS37	0.423333
		GEMS39	0.045367
GEMS4	0.040767
		GEMS40	0.046233
GEMS41	0.0847
		GEMS42	0.0602
GEMS43	1.183
		GEMS44	0.028833
GEMS45	0.0205

虽然，上文已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做出一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 北京市农林科学院，湖南省作物研究所

<120> 玉米籽粒镉低积累控制基因ZmCd1的分子标记和应用

<130> KHP191117004.4

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 7874

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

caattcaacc accaaaatca tttaggaaaa aggtttgacc ctatttccct ttcaacgcag 60

ccgcttccct aagctagcga cagtcaatcc gaagactaga tcaccaccca tgcacccagg 120

aaaaaaagac tgtggtcgtt cgcaccaaga gtcgcgaacc ctccacaacc aacggccgca 180

actcctcttg ttgaaggatg gcccaacttg agagcttcta tgacgccaaa tggataacct 240

gcaaaggaga acacaagagt tttttctcaa aaactaagtc atttctacag atccagagcg 300

cccaacacaa caccgccgct ccaagtagaa gcattggttt tagcacacta ttaaaacctt 360

aaagccaatc cccaaacata tggtccacat tttgtgattg gttgattcca gtggccacca 420

gaaacacggt ccagactgac cgggtaagcc ggcattcgaa gaagaggtgt tgaatggtct 480

cttccttgtg acaagaggtg catgttaaac taccttgcca gttttgttta gccaaattat 540

attttgtgag gattacaccc tttcgcaaat accataggaa aatgttaaat ttgagggagg 600

cctttagctt cgaaagctct ttattaacat tagagatatt attgagcatc aaggcagcgt 660

agtgcgattt aaccaagaat ctaccagtcg tggaaaggtt ccagaagaag gtatcctgat 720

catgggacag ctccacacct tgtatacgtg acaatatgga aagccaatcg accaaattgg 780

ctccaaataa ctgtctccgt caggaaaagg ttggaggcga atcgctcaag gcttctgata 840

ttaaaatgaa tttgtccctc gcaatgttat acagggctgg atattggtct gttaaagagg 900

acccatccaa ccaggcatcc tcccagaacc tcacttgaga gccatccttt atgaggaatg 960

agccaaaacg gaggaaggtt gggtttactt tcattaagcc tgaccagaaa tgggagtcac 1020

caagtttcca ctacacatga gccaaaggtt ttgagccaac atatttatta cagagtaatt 1080

gttggcacaa tccatctgag gtgagtagct tgtacagcca tttgctaaga agggcaatat 1140

tcatcatatt tagatctaag ataccaagtc cccttgatac ttattcttaa taatcacttg 1200

attaacagat atgtaatcta tacatctcta ctacttatta agtaagcaat agtagtctgc 1260

ctttgactgt tctgcctctg acccgttctg ccatctacgt gcccccacag ccgtacacat 1320

aggtctccag caaaaattat catgcctgcg caagagttga atctaaccaa ttcagccacc 1380

aacggagttc ttactgttaa gtccgcgcca acgcttataa gccgctccat gtctccttta 1440

gtagccagta tggtactaag tttttgcaag acagcaggag agcggttctt cctcggccca 1500

tcatcccttg gacccgcgcg gcccatttgc ttagtgtcgt gcggacggcc catttggtgc 1560

ggcgtcacgc gaccctcagg agagcggtct tcttcctcgg ccgtccgcac gacggagcgc 1620

ccaaccgctc ggtcagccac tcagccccac tctcgcatcc tccctcccca cgacctccac 1680

ttccttgact tcaatgcgtg cgctggatga tgtcgctata tggtgccgcg tccgagtcag 1740

ttcctctctc gctcacttcc tgcaatttgc cgaggtctgc aagctcccct tcctgcttcg 1800

tccttcctgc atcgggagcc ggaggacctc gcctactccc tccctccatc ggcgcgatag 1860

cttcctcggc gcccggaaca gcgctgccgc cacgccggtg ctgctcaacg tgtacggcgc 1920

gctgctctgc ttcgacctcc tctccgagct ttcctctgcc attgacgagg cccccaaggt 1980

ccaccccact gcctcctgac ctcattccct gaagcgcaga tctctcccat tagggcaatg 2040

tgcgcgcctg catcgctgca cgtctgctgt tgtttgttcc tgtgcgggtt ccctccccat 2100

ggttgccttt cctgtaattg aattatacaa catggattta aataaactag gtggagcaaa 2160

ggcttccttt tcattggatt taatccatgt tctcagtgat aatcttgata tcaccgttct 2220

gcaacccttc cttttttgta gttctcaagt gggtatcacc aagactgcgc gcgtgccgga 2280

gaacgaggac gactgaaatc acatagaggt aatactcttt gtagttttat ttttatgttg 2340

agaactaatt agatagcctt gtagtaccgg agagcccatg atagctatgt gtcgaatgtt 2400

atgcacaagt ttaaataagt tttgtagcaa tatgtttcta tcatgtgatt taggactaca 2460

gtcatagact catagttaac atctttgtcc tgttgttcag tttaaacata tcctatacga 2520

tctcgaagat gatgagtagt ttggcttgct gttgacacca attcagagta ccatgtagtg 2580

tttggcttgc tgttgacacc aattcagagt accaaataac atttgacttg ctgttcacat 2640

caatcgaaat atactgtttg ggttcctgtt cgcattagtt cagattgttt aaaagctcaa 2700

gggacagacg acacagtttt tgttgttctg ctttttgttc attgcactga cctaacgcta 2760

tgctgaattt tgcttcccat caatcccact aatagctagg ctattgttct ccttgctgtt 2820

tattgcattg tgctcccatc aatcccatta gttggattag cataagctgc tttgattttc 2880

agcagtccaa actcatacat atgtatgctc ccatcaatcc catcaattgg attagcataa 2940

gctgctttga ttttcaagag tgcaagaaca cataagaaga acctttgatt tatcttatgt 3000

aatgcttttt atcatagtgc ttctgtatct caaggttatc cttcgtagtt agtatgacca 3060

gagggtcctg tccattatgt ttttcctgct agcaagtatc catcttgcaa acaaactcat 3120

caaagttatc tatgttaaac cgacacctca ttattatccc tggaataagg tgtcggttta 3180

atggtttatt tccttggtta tgccaaagaa agggaacaac tggatccctt ttgagttttg 3240

ggatatagtg ggaggaggtt tttggtgcag aattgtaata ttaacttcag gttattagca 3300

tagaactaaa ggcaggaaca atattatccc cccgtgtatt atgtttgtac tatttgtgtc 3360

aattttgctt gtgtttcagt gatcttttgc ctgcaactgg gtcatgttgt ttgtatttat 3420

gtgttcgaat ccctcacctt gtttgggttc actggacatg cctgcttgct gcgcttcgta 3480

tcggagatct gcgtgccatc ctcgctcttc accagctgct tctacatcta ctccgagagc 3540

aactaccagg acctgctgcg caacacggat gccaaccaga cggcactcga caggaacatg 3600

ttcggtggcc agcggctgca tgtctgtggc gaggtattgg taacccagat gtcctgctcc 3660

cagcctattg aggtcaatgg aactgggagc ggagcacact gttcactcat cgcttgggtt 3720

ggaacctaat ctgtcacttg cagggccatg aactttttgt tttgtacgag ggccttgagc 3780

agctgcaccg gtttctcttc atccttagta tcactcatgt gttgtacagt tttgtaacag 3840

tggttctatc catgatcaag gttcgtgctc actgcctgat tgcggctctg acatttttcc 3900

ctcttatttt cttctgagtt tattatggta tatatctttc tgctattggt gcagatctat 3960

agctagagga agtgggaaac cttagcaggt ccaattgatt acttaataag tagtacagat 4020

tatggtatat atctttctgc tattggtgca gatctatagc tggaggaagc tcatgaacac 4080

ggtcatcaag aagaagctcg acatcatccc aaaggatctc aagtaggccg gccgccatgc 4140

ttggctttcc acaaatttat attgctgaga ctgagagagg gagcgaacca ttatcgtcga 4200

cggaatacca tgcacaagaa aggtcaagct ggttaggaat gactagaatg tatgtgtgcc 4260

tgcaggtggg gcgagcagtc agacgacgtg ttcaatgctc tggctggaga cttcatgaag 4320

cccaggatac aggaggtgga ccagctcctc aagctcggcg tcaatgtcac cgtctacagc 4380

ggacaggtat tctgactgat tgaaccaaac aaactcactg aacgagtgac tgacgaaact 4440

gatccatggt tggcattacc accacaagct tgcctgtttg atctgctctg ctttttcttg 4500

gacatatgga tctccttatt gtttgcaaat aaaataactt gtccattaga tagtactaac 4560

aagtctttct ttctctctct ctctctctct ctctcttgta gctcgacctc atctgcgcga 4620

ccaaaggcac catggactgg gttcagaagc tcaagtaagt gtagtctctc tgatctcaca 4680

cgcacaatgt gcactctgtc tagcagctag ctctggtcac aattcacaac acaagtggcc 4740

tagcctccta gcttactgat ccgatgcctc ctgctgctgc tgcttttgtc atccatcagg 4800

tgggacggcc tcaacagttt cctgagctct cccagaacgc ccatctactg caacaagtag 4860

gggcagtccg gcacccaggc cttcgtcaag tcctacaaga acctcaactt ctactggata 4920

ctcgaagccg aacacatggt aattaacgaa tggtaaccca cgcacccctt tgttttggtt 4980

gttgcattag cactcacata tatatcgccg tgaccaagct gagaaggtga cgcgccatcc 5040

accctgatgc atactcgctc gtccagtgag tgcataagct ggaaagagcg tgcattcatg 5100

cagttggtga gatatagctt cttcgtgccc acgtgcacca gaaacgctcc atgcatctgc 5160

ctgttgctcc attcatgatt ccctctcctc tctcaatgaa gagagacaag actccggcca 5220

caggccagcc gggcacacac atgcaccaac agtgatatgt agacagacag attcctagat 5280

tgtaggcagc tagctaggac agcatcaggc agggaactgc ttcgctgtct tcttgaatgt 5340

ctttatatag actggactta ttaggactaa tttggtgaac aggggaatgg aggagcttat 5400

gggaaaggaa tctcctcgct cttcaatttt gattccttct tcatagatct ccctaatgga 5460

cgcccatttc ctccactatt caactttaag caggaagtaa gtgattccag gacagaaatg 5520

tttcccattg tgtccctaat tattagtcct ttttgaaagc ttgattacat atgaaaaatg 5580

atgtcaattg gccacaggaa aatagtgtta atacattcac tgtatacttc attttggtgg 5640

cattttactg acacgcgaat acatgatatg cattagtggt aaaatcacat gcaccgaaca 5700

tgtcttgcaa tgttatatgt tgcttgtact ctctgtgtat aatcaaactc tttgatgcca 5760

atgtcatgca gattgacgat gatgaaaaaa ttacagtgat tgactttccg cagatggtgt 5820

ctgtttctca ccgtaatgcc caaatgtatg aagcttctca gataactaat gtgaaagtgt 5880

cttgcattta aaaaaaagga atttcacttt tgcaggtttt ttgaccgaga cattgaatgc 5940

atctacaagt tctttaacaa aaggttataa gatatacaag aaagcttcaa atgagcctaa 6000

tttggtaggc ttgttttctt attgtgattt cttttctttc tgttagattc aatctgaggt 6060

cagtgaaaaa tgaagaacaa gctggatttg aaaatgatga tgaaggaaac agcagacctt 6120

cctttttgtc cgtggaaaag ggtgctggtt ccttggacaa ggaactagct gccagtggat 6180

ttaccaggaa agagcaagtg gatatggaga aggtaggtca gatgttcctg caaatttgtt 6240

actcatgtat acatttatag attgttttcc ggcttagttc tcaggtaccc ttttttggca 6300

aactttctta cagtacaccg aggaagttgt tgaagggcat gattccagtt cagatgatga 6360

ggttggtgat gttgtgcctt tggtttcctt gaagatagac caagtacgtc tgcctagcaa 6420

gttagtttga acatgtgcag actgtaccag tgatcaggtc gtcgggccag tctctggtta 6480

ggggtcactg ttattgaagt gtatttttgt tgtctctcag gacagttccg atgagcctga 6540

ttgtgatctt acccaagtga ttcagaggcg cctggaactt tttctgaaga ggttagttgt 6600

cttcccatca gaatgaacga acaacttctg attgcatttt cttacatctg ttttcaccac 6660

acagcatgga acaagttgta gcggcgagaa cagattggaa attcctccct cgggtggcaa 6720

tggagtggtt atggcaccgc tcgaatctag gatcaagacg ttttccatgg aagttttaca 6780

tgtagagtaa aaaaaaaggt cctgctctcg tgttctcgtg taaaactgga ttctgttcag 6840

ttcttactgt ggagctatgc ttcctaggta aaacttatcg atttgtataa cttcttgatt 6900

tgtataaaaa cttctccatt tacatattgg gaagtctata tgtaaaactt ctcgatttgt 6960

atatcagcta tgcttcctgt ggagcaagga agcgaacgca agccagcctt ttgtattagt 7020

gcattctgtt cagttcttac ttgatcatcc cgtgttctcg tgtgtgccat ggccgagtgg 7080

caagctcaac actggtattg ttgtcttgtc tcaaatgaag tccggttcca caagttaacc 7140

ggaaatcttc atgggtgata gctgtgtcag attctttcgc gcatagggca agtaacgcaa 7200

gtgatagttg tgtcagttta cccccatttt cttgggcatc acttgtctca aataaagtcc 7260

attggaggtt cgcaatttat gtttcgtggc atcgcacggg cacctaccta gtatattatt 7320

gtgtgtcatc tttctattaa caaacaatag tggtattctc gaggtgatga accagcttac 7380

cagcaaatgg atgatccaca ttgattcgat actaaaagtc tgattctaat atctatggta 7440

ccatccacat cttttcaaaa accatcgtcg aatattttgc attcctacca ctcatgagcg 7500

aagggttgat tattcatttt gaactgagcg taaaatggtt tcaaagaagg aagtgggcaa 7560

agtggaggtg accagcaagt caagtctgaa tgaaaagtcg aaagtatgga atgggtgcct 7620

cgatgatgtc agcgtgtcca cctcagattg gcacaagcct atcccgaatg cagaagtggc 7680

tcacagaacc tccaatcttg tcgctgatca gtggacgccg tcgttgtcgg ttgttgtcgt 7740

tgccgtgccg cgagaatttt tgcgtgctcc gcgcaccaac tgccatctat gttctcctgt 7800

tgactttccc tccgcctctc gcgttcctgc agctgcagtc cttgattctg gccaggacag 7860

gagcagcggc ggcg 7874

<210> 2

<211> 7520

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cgcagccgct tccctaagct agcgacagtc aatccgaaga ctagatcacc acccatgcac 60

ccaggaaaaa aagactgtgg tcgttcgcac caagagtcgc gaaccctcca caaccaacgg 120

ccgcaactcc tcttgttgaa ggatggccca acttgagagc ttctatgacg ccaaatggat 180

aacctgcaaa ggagaacaca agagtttttt ctcaaaaact aagtcatttc tacagatcca 240

gagcgcccaa cacaacaccg ccgctccaag tagaagcatt ggttttagca cactattaaa 300

accttaaagc caatccccaa acatatggtc cacattttgt gattggttga ttccagtggc 360

caccagaaac acggtccaga ctgaccgggt aagccggcat tcgaagaaga ggtgttgaat 420

ggtctcttcc ttgtgacaag aggtgcatgt taaactacct tgccagtttt gtttagccaa 480

attatatttt gtgaggatta caccctttcg caaataccat aggaaaatgt taaatttgag 540

ggaggccttt agcttcgaaa gctctttatt aacattagag atattattga gcatcaaggc 600

agcgtagtgc gatttaacca agaatctacc agtcgtggaa aggttccaga agaaggtatc 660

ctgatcatgg gacagctcca caccttgtat acgtgacaat atggaaagcc aatcgaccaa 720

attggctcca aataactgtc tccgtcagga aaaggttgga ggcgaatcgc tcaaggcttc 780

tgatattaaa atgaatttgt ccctcgcaat gttatacagg gctggatatt ggtctgttaa 840

agaggaccca tccaaccagg catcctccca gaacctcact tgagagccat cctttatgag 900

gaatgagcca aaacggagga aggttgggtt tactttcatt aagcctgacc agaaatggga 960

gtcaccaagt ttccactaca catgagccaa aggttttgag ccaacatatt tattacagag 1020

taattgttgg cacaatccat ctgaggtgag tagcttgtac agccatttgc taagaagggc 1080

aatattcatc atatttagat ctaagatacc aagtcccctt gatacttatt cttaataatc 1140

acttgattaa cagatatgta atctatacat ctctactact tattaagtaa gcaatagtag 1200

tctgcctttg actgttctgc ctctgacccg ttctgccatc tacgtgcccc cacagccgta 1260

cacataggtc tccagcaaaa attatcatgc ctgcgcaaga gttgaatcta accaattcag 1320

ccaccaacgg agttcttact gttaagtccg cgccaacgct tataagccgc tccatgtctc 1380

ctttagtagc cagtatggta ctaagttttt gcaagacagc aggagagcgg ttcttcctcg 1440

gcccatcatc ccttggaccc gcgcggccca tttgcttagt gtcgtgcgga cggcccattt 1500

ggtgcggcgt cacgcgaccc tcaggagagc ggtcttcttc ctcggccgtc cgcacgacgg 1560

agcgcccaac cgctcggtca gccactcagc cccactctcg catcctccct ccccacgacc 1620

tccacttcct tgacttcaat gcgtgcgctg gatgatgtcg ctatatggtg ccgcgtccga 1680

gtcagttcct ctctcgctca cttcctgcaa tttgccgagg tctgcaagct ccccttcctg 1740

cttcgtcctt cctgcatcgg gagccggagg acctcgccta ctccctccct ccatcggcgc 1800

gatagcttcc tcggcgcccg gaacagcgct gccgccacgc cggtgctgct caacgtgtac 1860

ggcgcgctgc tctgcttcga cctcctctcc gagctttcct ctgccattga cgaggccccc 1920

aaggtccacc ccactgcctc ctgacctcat tccctgaagc gcagatctct cccattaggg 1980

caatgtgcgc gcctgcatcg ctgcacgtct gctgttgttt gttcctgtgc gggttccctc 2040

cccatggttg cctttcctgt aattgaatta tacaacatgg atttaaataa actaggtgga 2100

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ccggagaacg aggacgactg aaatcacata gaggtaatac tctttgtagt tttattttta 2280

tgttgagaac taattagata gccttgtagt accggagagc ccatgatagc tatgtgtcga 2340

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ctacagtcat agactcatag ttaacatctt tgtcctgttg ttcagtttaa acatatccta 2460

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tagtgtttgg cttgctgttg acaccaattc agagtaccaa ataacatttg acttgctgtt 2580

cacatcaatc gaaatatact gtttgggttc ctgttcgcat tagttcagat tgtttaaaag 2640

ctcaagggac agacgacaca gtttttgttg ttctgctttt tgttcattgc actgacctaa 2700

cgctatgctg aattttgctt cccatcaatc ccactaatag ctaggctatt gttctccttg 2760

ctgtttattg cattgtgctc ccatcaatcc cattagttgg attagcataa gctgctttga 2820

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gtttaatggt ttatttcctt ggttatgcca aagaaaggga acaactggat cccttttgag 3180

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tcgtatcgga gatctgcgtg ccatcctcgc tcttcaccag ctgcttctac atctactccg 3480

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acatgttcgg tggccagcgg ctgcatgtct gtggcgaggt attggtaacc cagatgtcct 3600

gctcccagcc tattgaggtc aatggaactg ggagcggagc acactgttca ctcatcgctt 3660

gggttggaac ctaatctgtc acttgcaggg ccatgaactt tttgttttgt acgagggcct 3720

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aacagtggtt ctatccatga tcaaggttcg tgctcactgc ctgattgcgg ctctgacatt 3840

tttccctctt attttcttct gagtttatta tggtatatat ctttctgcta ttggtgcaga 3900

tctatagcta gaggaagtgg gaaaccttag caggtccaat tgattactta ataagtagta 3960

cagattatgg tatatatctt tctgctattg gtgcagatct atagctggag gaagctcatg 4020

aacacggtca tcaagaagaa gctcgacatc atcccaaagg atctcaagta ggccggccgc 4080

catgcttggc tttccacaaa tttatattgc tgagactgag agagggagcg aaccattatc 4140

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ctaacaagtc tttctttctc tctctctctc tctctctctc ttgtagctcg acctcatctg 4560

cgcgaccaaa ggcaccatgg actgggttca gaagctcaag taagtgtagt ctctctgatc 4620

tcacacgcac aatgtgcact ctgtctagca gctagctctg gtcacaattc acaacacaag 4680

tggcctagcc tcctagctta ctgatccgat gcctcctgct gctgctgctt ttgtcatcca 4740

tcaggtggga cggcctcaac agtttcctga gctctcccag aacgcccatc tactgcaaca 4800

agtaggggca gtccggcacc caggccttcg tcaagtccta caagaacctc aacttctact 4860

ggatactcga agccgaacac atggtaatta acgaatggta acccacgcac ccctttgttt 4920

tggttgttgc attagcactc acatatatat cgccgtgacc aagctgagaa ggtgacgcgc 4980

catccaccct gatgcatact cgctcgtcca gtgagtgcat aagctggaaa gagcgtgcat 5040

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tctgcctgtt gctccattca tgattccctc tcctctctca atgaagagag acaagactcc 5160

ggccacaggc cagccgggca cacacatgca ccaacagtga tatgtagaca gacagattcc 5220

tagattgtag gcagctagct aggacagcat caggcaggga actgcttcgc tgtcttcttg 5280

aatgtcttta tatagactgg acttattagg actaatttgg tgaacagggg aatggaggag 5340

cttatgggaa aggaatctcc tcgctcttca attttgattc cttcttcata gatctcccta 5400

atggacgccc atttcctcca ctattcaact ttaagcagga agtaagtgat tccaggacag 5460

aaatgtttcc cattgtgtcc ctaattatta gtcctttttg aaagcttgat tacatatgaa 5520

aaatgatgtc aattggccac aggaaaatag tgttaataca ttcactgtat acttcatttt 5580

ggtggcattt tactgacacg cgaatacatg atatgcatta gtggtaaaat cacatgcacc 5640

gaacatgtct tgcaatgtta tatgttgctt gtactctctg tgtataatca aactctttga 5700

tgccaatgtc atgcagattg acgatgatga aaaaattaca gtgattgact ttccgcagat 5760

ggtgtctgtt tctcaccgta atgcccaaat gtatgaagct tctcagataa ctaatgtgaa 5820

agtgtcttgc atttaaaaaa aaggaatttc acttttgcag gttttttgac cgagacattg 5880

aatgcatcta caagttcttt aacaaaaggt tataagatat acaagaaagc ttcaaatgag 5940

cctaatttgg taggcttgtt ttcttattgt gatttctttt ctttctgtta gattcaatct 6000

gaggtcagtg aaaaatgaag aacaagctgg atttgaaaat gatgatgaag gaaacagcag 6060

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ttgttactca tgtatacatt tatagattgt tttccggctt agttctcagg tacccttttt 6240

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gatgaggttg gtgatgttgt gcctttggtt tccttgaaga tagaccaagt acgtctgcct 6360

agcaagttag tttgaacatg tgcagactgt accagtgatc aggtcgtcgg gccagtctct 6420

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accacacagc atggaacaag ttgtagcggc gagaacagat tggaaattcc tccctcgggt 6660

ggcaatggag tggttatggc accgctcgaa tctaggatca agacgttttc catggaagtt 6720

ttacatgtag agtaaaaaaa aaggtcctgc tctcgtgttc tcgtgtaaaa ctggattctg 6780

ttcagttctt actgtggagc tatgcttcct aggtaaaact tatcgatttg tataacttct 6840

tgatttgtat aaaaacttct ccatttacat attgggaagt ctatatgtaa aacttctcga 6900

tttgtatatc agctatgctt cctgtggagc aaggaagcga acgcaagcca gccttttgta 6960

ttagtgcatt ctgttcagtt cttacttgat catcccgtgt tctcgtgtgt gccatggccg 7020

agtggcaagc tcaacactgg tattgttgtc ttgtctcaaa tgaagtccgg ttccacaagt 7080

taaccggaaa tcttcatggg tgatagctgt gtcagattct ttcgcgcata gggcaagtaa 7140

cgcaagtgat agttgtgtca gtttaccccc attttcttgg gcatcacttg tctcaaataa 7200

agtccattgg aggttcgcaa tttatgtttc gtggcatcgc acgggcacct acctagtata 7260

ttattgtgtg tcatctttct attaacaaac aatagtggta ttctcgaggt gatgaaccag 7320

cttaccagca aatggatgat ccacattgat tcgatactaa aagtctgatt ctaatatcta 7380

tggtaccatc cacatctttt caaaaaccat cgtcgaatat tttgcattcc taccactcat 7440

gagcgaaggg ttgattattc attttgaact gagcgtaaaa tggtttcaaa gaaggaagtg 7500

ggcaaagtgg aggtgaccag 7520

<210> 3

<211> 604

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aaaagtaact ttattttctt cttgctgatt cttttgaact agttgtaaag aagaacaagg 60

tgaagatttg gccaatgctg gccaaacaaa ttcagcggta catatatctg cggattcgtc 120

ttccgaatta tcgcgctcca ctagatgtat agtacgatcg gtcgattttg atgtttctct 180

acatcggctt tcacaggcca aagtccgctg atgtacttga gctaatgtat agaactgagt 240

accatccaat ttgtctttta agtaggatag caacgcatta aaaaccagcc ctgctaggtg 300

tttgtccgcg acatggattt ggaagcatcg atttctagtg tcccgaatcc tcatgatata 360

gttattaact gattccccgt tcccttgtcg gactgaagcc aaatcagcta gttctaactc 420

atgctcttcc gagaaagagt gttcatagac tttctgtact aattattcat aggagttgat 480

agagttaggt gacagaactg cttaccatgc gaatacagta tcactaatgg acaataagaa 540

taaacaaaca cagtagtctt ccctttatcc ttgcggatat aatatgttgt ccaatcgtta 600

atta 604

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tggcaagctc aacactggta 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ggccagaatc aaggactgca 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tccgcgacat ggatttggaa 20

<210> 7

<211> 982

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

caattcaacc accaaaatca tttaggaaaa ggtgtaagcc tatttccctt tcaaaaagta 60

actttatttt cttcttgctg attcttttga actagttgta aagaagaaca aggtgaagat 120

ttggccaatg ctggccaaac aaattcagcg gtacatatat ctgcggattc gtcttccgaa 180

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tccgagaaag agtgttcata gactttctgt actaattatt cataggagtt gatagagtta 540

ggtgacagaa ctgcttacca tgcgaataca gtatcactaa tggacaataa gaataaacaa 600

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tttttgcgtg ctcctcgcac caactgccat ctatgttctc ctgttgactt cccctccgcc 900

tctcgcgttc ctgcagtcct tgattctggc caggacagga gcagcggcgg cgatgggcag 960

tgtcgaggag aggctgctgc ca 982

<210> 8

<211> 952

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

caattcaacc accaaaatca tttaggaaaa ggtgtaagcc tatttccctt tcaaaaagta 60

actttatttt cttcttgctg attcttttga actagttgta aagaagaaca aggtgaagat 120

ttggccaatg ctggccaaac aaattcagcg gtacatatat ctgcggattc gtcttccgaa 180

ttatcgcgct ccactagatg tatagtacga tcggtcgatt ttgatgtttc tctacatcgg 240

ctttcacagg ccaaagtccg ctgatgtact tgagctaatg tatagaactg agtaccatcc 300

aatttgtctt ttaagtagga tagcaacgca ttaaaaacca gccctgctag gtgtttgtcc 360

gcgacatgga tttggaagca tcgatttcta gtgtcccgaa tcctcatgat atagttatta 420

actgattccc cgttcccttg tcggactgaa gccaaatcag ctagttctaa ctcatgctct 480

tccgagaaag agtgttcata gactttctgt actaattatt cataggagtt gatagagtta 540

ggtgacagaa ctgcttacca tgcgaataca gtatcactaa tggacaataa gaataaacaa 600

acacagtagt cttcccttta tccttgcgga tataatatgt tgtccaatcg ttaattacaa 660

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<210> 9

<211> 3495

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

atgggcagtg tcgaggagag gctgctgcca ccgccgccgg ccaggagcgc agatgctggc 60

gccggcggcg cgaagagtgg caagtgggag aagacgtacc tggacgtgct gggcgtgtgc 120

tgctccgcgg aggtcgcgct cgtggagcgg ctcctgaagc cgatcgacgg cgtgagggcg 180

gtcaccgtcg tcgtcccctc ccggaccgtg atcgtcgagc acgacctcgc cgccgtctcc 240

cagtcccaca tcggtaagca accggcctct cgtcggaagt caccacgaca ccaccaaaca 300

cctccgcgca agattctcgg ctcacccttt ccctgcccct gcctcgctcg tattcgtatc 360

catcccatca gtgaaggctc tcaacaaggc ggggctggag gcgtccgtcc gcgcgtacgg 420

cagcagcggg gtcgtcgctc gctggccgag cccgtacacc gtcgccagcg gagccctgct 480

gctggcgtcc ctgttcgcgc cgctgctacc ttccctgcgc tggctggccc tggcggcggc 540

ctgcgccggc gcgccgccga tggtgctcag ggcgctggcc gcggggctcg ccctggacat 600

caacgcgctg atgctcgtgg ccgtggccgg cgccgcggcg ctcggcgact acgcggaggc 660

cggcgccatc gtgttcctct tcaccaccgc ggagtggctg gagacgctgg cgtgcaccaa 720

ggccagcgcc gggatgtcgt cgctcatgag catggtcccg cccaccgtcg tgctcgcgca 780

gacaggggag gtcgtcggcg tgcgcgacgt cggggtgggc gccgtcgtcg ctgtccgggc 840

cggggaggtc gtgcccgtgg acggcgtggt cgtcgacggg cagagcgagg tcgacgagag 900

cagcctcacc ggcgagtcct tccccgtgcc caaacagccg caggcggagg tctgggccgg 960

caccatgaac ctggacggta aaagctgcgg gggttttttt gttttgtgtt acattttttc 1020

aaatgtccgc gcggttactt tgttgtagtg accaggatcc taaacaaaac tgtggcgttc 1080

atgtggtagg ctacatagcc gtgaggacga cagctctggc cgacaactcg acagtggcca 1140

ggatgcagcg gcttgtggag gcggcgcaga acagcaggtc caagacacag cggctggtcg 1200

attcatgcgc caagtactac accccaggta tgtacgtgtg cgacgaaaca aacctccatg 1260

catggtctct attgatggca ctatgcaatt gaattgacag cacgaagtgt ctgttgttgc 1320

agccgtggtt gctgttgcag ctggcgtggc tcttgtcccg ctgctgctgg ggccacgggg 1380

agcgcaggac ccgaaacggt ggttccagct agcgctggta ctgctggtga gcgcgtgccc 1440

gtgcgcgctg gtgctgtcga cgccggtggc tacgttctgc gcgctgctgc gggcggcgag 1500

gatgggggtt ctcatcaagg gcggggacgt tctggagtcg ctgggcgaga tcagggtcgc 1560

ggcgttcgac aagacgggaa ccatcactaa gggcgagttc agcgtccatg ggttccatgt 1620

ggttggggac aaggttggaa tgagccagct tctttattgg tacgtatcca tccatccctt 1680

cagccttttt atttagtgtt tgaactaact aaattccatg gatgacaact ttcttctgtt 1740

gcagggtgtc gagcattgag agcaagtcaa gccacccaat ggcaaccgca ctcgtcgagt 1800

acgctcagtc caaatccatc caacccgagc cgacaagcgt cactgacttc cgtatctacc 1860

ctggagaggg catatccgga gcgataaacg gaaggcaaat cttcattggg aacacaagga 1920

tcatggcaag gtcctcctgc tacgcagcag gagcaggtcc ggagatggaa ggccagcaag 1980

gtgcgtcgat cgggcatgtg atcgtcgacg gcgaccacgt ggcggcgttt tcgctctcgg 2040

acgactgtag gaccggcgcg gcagaggcga tccgtgagct gagatcgatg ggcatcaggt 2100

cggtcatgct gacaggggac agcaaagcgg cggcgtcgcg ggcgcagcgg cagctcggcg 2160

gcgccctgga ggaggtccac tcggagctcc tcccggcgga caaggtcgcg ctggtcgggg 2220

acctcaaggc gagggccggg ccgacgctga tggtcgggga cggcatgaac gacgcgccgg 2280

cgctggccac ggcggacgtg ggcgtcgcca tgggcctgtc gggctcggcg gccgccatgg 2340

agacgagcca cgccacgctc atgtccagcg acctcctccg ggtgcccgcg gccgtccggc 2400

tcgggcggcg cgcccgcgca accgtcgccg ccaacgtgat cgcctccgtg ggcgccaagg 2460

ccgccgtcct cgctctggcc gccgcgtggc gccccgcgct gtgggtggcc gtgctcgccg 2520

acgtcggcac gtgcctgctc gtcgtgctgc acagcatgct gctgctctgg gacccagctg 2580

gcgcgggctg gcggaggagg ggtgggggtg gggaccccga ggcgtgccgc gcgacggcgc 2640

ggtcgctggc catgaggtct cagctcgccg aagcgtccaa cggcgcggcc ggaaccgctc 2700

agggacgacg accaggcggt gggaccaaag caggctgcca ttgctgtcgg gagacaagcg 2760

agccgtctga gcaggaccac acggcggtgg tggtcgacat accggcacca tccgctgagc 2820

gtcctggtgt tgtggcgccg accgccgcca ccggatgttg cagcagctcc gcccgcgaag 2880

cttgtgctac tccaaccacc gtgactactg tgaactctgc gccacgaggt tgctgtggcg 2940

gcattggcga aggagacacc cgcgagaatg caaggacaag ctgctgcacc gatgcccgtg 3000

actctcctaa gaaggcaggg caacaatgca acgcaaggtg ttgttcttgg ggcaaacaaa 3060

atactctcaa gtgtcaagcg caggatacaa tctcaaatct caagtgaaat actgactgtt 3120

ctgttcatgc aacaagacca aaagctttcc gagtgttcag atcgactggg ttgctcgtga 3180

agttttcaac attgagagtg atcaaatcct tagctgcttg cttttgtctc tctattttct 3240

ccttgtgtat ttttaagcgt ttatccatga acaaagtatc ggtactaggg tactactaaa 3300

ccaaggtatt taggctgttt ggctcaggtt taaaaatgct tccactgtca aaaggtagaa 3360

cgtcaattaa ttgcgtgttt ggtagaaata agctagtcca tcatatttct actcctcact 3420

ttcatgtttg gtttgtggaa tagaatagag tactatcccg tctaatttat aattcgtttg 3480

acttttttac tcaaa 3495

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gatgggcagt gtcgaggag 19

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

agcttttggt cttgttgcat ga 22

Claims (3)

1.一种启动子在调控玉米籽粒镉积累、或制备镉低积累玉米品种、或预测玉米籽粒镉积累能力中的应用，所述启动子为玉米籽粒镉低积累控制基因ZmCd1的启动子，其具有SEQID NO.1所示的核苷酸序列。

2.玉米籽粒镉低积累控制基因ZmCd1的分子标记在镉低积累玉米品种鉴定、选育或玉米分子辅助育种中的应用，其特征在于，所述分子标记为SEQ ID NO.1所示启动子序列第56bp位置起缺失一段SEQ ID NO.2所示的序列、同时插入一段SEQ ID NO.3所示的序列。

3.权利要求2所述的应用，其特征在于，用SEQ ID NO.4-6所示的引物对待测玉米品种DNA进行PCR扩增，若扩增产物电泳检测仅出现大小为574 bp的片段，则待测玉米为籽粒镉高积累玉米品种；

若扩增产物电泳检测仅出现大小为776 bp的片段，或同时出现574bp和776bp两个片段，则待测玉米为籽粒镉低积累玉米品种。

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