CN117025668A - 水稻OsMGD1基因在光能高效利用方面的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于水稻基因工程应用技术领域，公开了一个来源于水稻的OsMGD1基因在光能高效利用方面的应用。所述OsMGD1基因与水稻生长发育和作物产量相关。在低光照、中等光照及高光照条件下，OsMGD1基因过表达后，转基因植株的光能利用效率和光保护能力显著增强，OsMGD1基因过表达后水稻的产量得到明显的提高。上述结果在降低目的植物中OsMGD1基因的表达量得到进一步的证实，充分说明OsMGD1基因与光能高效利用和作物高产具有直接关联性。本发明在类囊体膜脂调控、光能高效利用和作物产量之间建立了新的调控方法，对培育高光效水稻新材料和品种具有重要的理论支撑和实践意义。
Description
技术领域
本发明属于水稻基因工程应用技术领域，涉及一种利用转基因实验鉴定水稻OsMGD1基因功能的方法，具体涉及在不同光强环境下水稻OsMGD1基因在光能高效利用方面的应用。
背景技术
当前全球面临的最大挑战之一是不断增长的粮食需求。到2050年，农业产量必须增加超过70％才能满足预计增长到97亿的世界人口。然而，全球作物产量目前的增长速度以及气候环境带来的影响给粮食安全造成严峻的挑战。水稻(Oryza sativa L)作为全球最重要的粮食作物之一，被广泛用作植物基因组研究的模式作物之一。评估作物的实际产量(Yieldactual)可以通过最大潜在产量(Yieldmax)与由生物或非生物胁迫引起的产量损失(Yieldloss)之间的差值来估算。其中，Yieldmax可以被入射太阳辐射(st)、光拦截效率(εi)、光合效率(εc)和收获指数(εp)的乘积量化。在绿色革命期间，三个效率参数中仅有εc没有有效提高，这是导致当前水稻产量放缓甚至停滞的主要原因。光作为驱动光合作用的能源，过低或过高的光照条件都会引起植物氧化应激并导致光合作用被抑制。因此，应用能够在不同光照条件下高效利用光能的作物被认为是满足未来粮食需求的主要机会，以实现潜在产量的跃升。
高等植物的光合反应由叶绿体内发育良好的类囊体膜系统决定。叶绿体类囊体膜中单半乳糖甘油二脂MGDG和双半乳糖甘油二脂DGDG约占总脂质的70％以上，对维持光合膜的稳定性和光合蛋白的功能活性至关重要。MGDG合酶(MGD)是半乳糖脂MGDG和DGDG生物合成的关键酶基因。在高等植物中，MGD一般被分为Type A和Type B两种亚组。Type A型MGD通常在绿色组织广泛分布，与植物光合作用密切相关。Type B型MGD主要在非光合组织(如花序和根)中表达。目前已有研究报道类囊体膜脂对保护光合装置和适应不同的光照条件至关重要。因此，推测MGD1在调节植物生长和光合作用中扮演关键角色。
现有技术中，针对水稻OsMGD1的克隆和功能已在烟草中进行了初步研究，在张梅娟的《水稻MGD同源基因的克隆及功能研究》(西北农林科技大学，2017博士学位论文)中，即对水稻OsMGD1基因进行了克隆，并在烟草进行了初步的功能研究。然而，目前尚无关于本发明中水稻OsMGD1基因在水稻中的功能以及通过调控OsMGD1基因表达来提高植物在不同光强条件下的高光效利用，及利用该基因提高对作物产量的研究报道。因此，开展水稻OsMGD1基因在光能高效利用方面的应用，建立类囊体膜脂、光能高效利用和作物产量之间的新方法，对培育高光效水稻新材料具有重要的理论和实践意义。
发明内容
针对上述现有技术中存在的问题与缺陷，本发明目的在于提供一种水稻OsMGD1基因在植物光能高效利用方面的应用。本发明通过利用过表达和RNAi干扰技术获得OsMGD1基因的转基因水稻植物，可响应低光照、正常光照和高光照环境，为利用基因工程手段培育高光效利用水稻新品种提供了基因资源，具有重要的应用前景。
本发明要求保护所述水稻OsMGD1基因或其相关生物材料在下述水稻光能高效利用方面中的任一种应用：
(1)提高水稻光能高效利用中的应用；
(2)制备水稻光能高效利用的产品中的应用；
(3)培育光能高效利用水稻中的应用；
(4)制备光能高效利用水稻产品中的应用；
所述相关生物材料为能够表达所述OsMGD1蛋白的核酸分子或含有所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组菌、重组微生物或转基因细胞系。
所述水稻OsMGD1基因与光能高效利用能力相关，所述OsMGD1基因与水稻苗期在低光或高光照条件下的生长发育相关；具体而言：在低光或高光照条件下，OsMGD1基因的过表达水稻幼苗相比所述目的植株表现出明显的适应性生长，叶面积和植物株高显着增强，植株生长相对健壮。
进一步而言，所述水稻OsMGD1基因与水稻苗期在不同光照条件下的光合利用效率相关；具体而言：在低光照、中等光照或高光照条件下，过表达OsMGD1基因的水稻光合色素和净光合速率明显增加。
上述方法中，所述植物为目的植株水稻或其过表达植株。OsMGD1基因的干扰水稻植株光能高效利用低于所述目的水稻。
本发明目的之二是提供水稻OsMGD1基因提高水稻产量的应用，为水稻高光效育种方面的应用提供重要的理论和实际意义。
本发明要求保护所述水稻OsMGD1基因或其相关生物材料在下述提高水稻产量方面中的任何一种应用：
(1)提高水稻产量中的应用；
(2)制备提高水稻产量的产品中的应用；
(3)培育高产量水稻中的应用；
(4)制备水稻高产量产品中的应用；
所述相关生物材料为能够表达所述OsMGD1蛋白的核酸分子或含有所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组菌、重组微生物或转基因细胞系。
所述水稻OsMGD1基因与作物产量相关，所述OsMGD1基因与水稻灌浆期在正常光或灌浆初期遮光条件下的植物生长相关；具体而言：相比所述目的植株，在正常光照条件下，OsMGD1基因的过表达水稻表现出地上部生物量和株高明显增加；在灌浆初期遮光条件下，过表达OsMGD1基因地上部生物量显着增强，植株生长相对健壮。
另一方面，所述水稻OsMGD1基因与水稻灌浆期在正常光或灌浆初期遮光条件下的产量相关；具体而言：相比所述目的植株，在正常光照条件下，OsMGD1基因的过表达水稻的单株产量明显增加；在灌浆初期遮光条件下，过表达OsMGD1基因结实率和单株产量显著提高。
上述方法中，所述植物为目的植株水稻或其过表达植株。OsMGD1基因的干扰水稻植株光能高效利用低于所述目的水稻。
为实现上述目的，一种培育光能高效利用和/或高产量的方法，包括如下步骤：调控目的水稻中所述的蛋白OsMGD1的含量，得到光能高效利用和/或高产量转基因水稻，所述过表达转基因水稻的光能高利用效率和/或产量高于所述目的水稻，干扰水稻植株的光能利用效率和/或产量低于所述目的水稻。
所述提高目的水稻中OsMGD1蛋白质或其编码基因的表达量是通过将OsMGD1基因导入所述目的水稻实现的。
在模式植株拟南芥的研究中，已有研究认为AtMGD1基因在调控植物生长发育的多个方面发挥关键作用，包括与植株的膜脂合成、叶绿体结构、光合作用和高光胁迫等方面具有一定关联性，但是其是否能够提高植物的光合利用效率并不明确，且是否可以通过该基因实现作物增产也没有研究。在本发明中，水稻OsMGD1基因的功能在水稻中至今没有相关的研究报告。利用转基因实验获得该基因的过表达和RNAi干扰株系，通过对OsMGD1基因在低光、中等光和高光照条件下的功能解读，进一步解析该基因在植物光能高效利用中的应用，建立类囊体膜脂、光能高效利用和作物产量之间的新方法，为培育高光效水稻新材料提供了重要的理论支撑和实践价值。
附图说明
图1为对过表达转基因株系和干扰株系进行琼脂糖凝胶电泳图。
图2为定量PCR检测OsMGD1基因的相对表达水平数据图。
图3为苗期水稻OsMGD1转基因水稻株系在不同光照条件下的植株表型图。
图4为苗期水稻OsMGD1转基因水稻株系在不同光照条件下的生长参数图。
图5为苗期水稻OsMGD1转基因水稻株系在不同光照条件下的光合色素含量图。
图6为苗期水稻OsMGD1转基因水稻株系在不同光照条件下的光合参数图。
图7为灌浆期水稻OsMGD1转基因水稻株系在不同光照条件下的植株表型图。
图8为灌浆期水稻OsMGD1转基因水稻株系在不同光照条件下的生长和产量参数图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例采用SPSS20.0统计软件对数据进行单因素方差分析，采用LSD检验以比较样品之间的显着差异(P<0.05)。
实施例1、水稻OsMGD1转基因水稻植株的获得及其鉴定
一、水稻OsMGD1基因植株表达载体的构建
1、过表达植物重组载体pBWA(V)HS-OsMGD1-HA的构建
据水稻OsMGD1蛋白核苷酸的编码序列，设计扩增出完整编码序列的引物序列，引物序列如下：
OsMGD1-OEF:5’-cagtGAAGACaacaacatgccggcgccgaccgcctc-3’Seq_1
OsMGD1-OER:5’-cagtGAAGACaatacatcaagcgtaatctggaacat-3’Seq_2
将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳后切下回收所需的目的条带，用限制性内切酶BbsI(BpiI)酶切回收纯化的PCR产物，回收酶切产物；用限制性内切酶Eco31I酶切pBWA(V)HS载体回收载体骨架；将酶切产物和载体骨架连接，得到连接产物。
将获得的连接产物热击转化至大肠杆菌感受态细胞，37℃倒置培养过夜。挑取阳性克隆进行摇菌，提取质粒验证正确后进行测序。将测序结果正确的菌株命名为pBWA(V)HS-OsMGD1-HA，并进行保菌于-80℃保存。
2、RNAi干扰植物重组载体pBWA(V)HS-OsMGD1-RNAi的构建
据水稻OsMGD1蛋白核苷酸的编码序列，设计扩增出完整编码序列的引物序列，引物序列如下：
OsMGD1-RNAiF:5’-cagtCACCTGCaaaacaacgatcctgatgagcgacacgg-3’Seq_3
OsMGD1-RNAiR:5’-cagtCACCTGCaaaacagggacaactgttgtgaacggaa-3’Seq_4
loopR:5’-cagtGGTCTCacctgcaggtctagtttttct-3’Seq_5
loopF:5’-cagtGGTCTCagcccgggctctgtaactatc-3’Seq_6
OsMGD1-RNAicR:5’-cagtCACCTGCaaaagggcgacaactgttgtgaacggaa-3’Seq_7
OsMGD1-RNAicF:5’-cagtCACCTGCaaaatacagatcctgatgagcgacacgg-3’Seq_8
将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳后切下回收所需的目的条带，用限制性内切酶Eco31I酶切回收纯化的PCR产物，回收酶切产物；用限制性内切酶Eco31I酶切pBWA(V)HS载体回收载体骨架；将酶切产物和载体骨架连接，得到连接产物。
将获得的连接产物热击转化至大肠杆菌感受态细胞，37℃倒置培养过夜。挑取阳性克隆进行摇菌，提取质粒验证正确后进行测序。将测序结果正确的菌株命名为pBWA(V)HS-OsMGD1-RNAi，并进行保菌于-80℃保存。
二、水稻OsMGD1转基因水稻植株的获得
1、水稻愈伤组织的诱导
选取成熟的水稻种子脱壳后，挑选饱满无菌斑优质种子进行消毒后将种子接种到培养基上诱导水稻愈伤组织的形成。
2、农杆菌培养
将步骤一中构建的pBWA(V)HS-OsMGD1-HA和pBWA(V)HS-OsMGD1-RNAi植物重组载体的质粒分别通过热激法转化到感受态农杆菌EHA105菌株中，菌落PCR鉴定出阳性克隆。
3、抗性愈伤和纯合体筛选
利用阳性菌液制取农杆菌悬浮液，28℃振荡培养过夜。第二天重新悬浮至OD600在0.8-1.0之间。将长势良好的水稻愈伤组织置于农杆菌悬浮液中侵染后置于共培养基上培养。将共培养的愈伤组织转入筛选培养基上进行第一次筛选，将长有抗性愈伤的初始愈伤转入新培养基中，进行第二次筛选，诱导抗性愈伤的分化及生根。挑取抗性愈伤，移入分化培养基，待苗生长至1cm左右，移至生根培养基壮苗。
将T0代不同转OsMGD1过表达和干涉转基因水稻分别进行潮霉素筛选、播种，直到得到T2代纯合体水稻转基因株系进行验证、扩繁。T3代纯合体水稻转基因株系用于后续实验。
三、水稻OsMGD1转基因水稻植株的鉴定
1、DNA水平的鉴定
用CTAB法提取水稻野生型和转基因株系叶片的基因组DNA，以提取的基因组DNA为模板，水和对照水稻植株为阴性对照，质粒pBWA(V)HS为阳性对照。
(1)过表达株系分别以(OE-35SF和OE-OsMGD1R)和(OEFL-OsMGD1F和OEHA-OsMGD1R)为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；如果PCR扩增产物中含有约626bp和1634bp的条带，则相应的水稻待鉴定转基因植株即为水稻过表达转基因阳性植株。引物序列如下所示：
OE-35SF:5’-GGAGAGAACACGGGGGAC-3’Seq_9
OE-OsMGD1R:5’-ACTGTAGCTCCTGGGTAG-3’Seq_10
OEFL-OsMGD1F:5’-ATGCCGGCGCCGACCGCCTCGTCGCT-3’Seq_11
OEHA-OsMGD1R:5’-AGCGTAATCAGGAACATCGTAAGGGTA-3’Seq_12
(2)RNAi干扰株系以(Ri35S-OsMGD1F和RiLoop-OsMGD1R)和(RiLoop-OsMGD1F和RiNoseq-OsMGD1)R为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；如果PCR扩增产物中含有约621bp和642bp的条带，则相应的水稻待鉴定转基因植株即为水稻RNAi干扰转基因阳性植株。引物序列如下所示：
Ri35S-OsMGD1F:5’-GGAGAGAACACGGGGGAC-3’Seq_13
RiLoop-OsMGD1R:5’-CCGGGCTCTGTAACTATC-3’Seq_14
RiLoop-OsMGD1F:5’-CTGCAGGTCTAGTTTTTC-3’Seq_15
RiNoseq-OsMGD1R:5’-AGCTGGTCAGTCTTCGGG-3’Seq_16
将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，过表达转基因株系结果如图1A所示,干扰转基因株系结果如图1B所示。从图中可以看出：野生型水稻植株的RT-PCR无扩增产物，而OsMGD1过表达转基因株系OE13、OE21和OE22，干扰转基因株系Ri23、Ri27和Ri29均可以扩增出目的条带，表明OsMGD1已经整合到水稻的基因组中，并且能够在转基因水稻中正常转录表达。
2、RNA水平的鉴定
提取水稻野生型和转基因水稻叶片的RNA，并反转录生成cDNA。定量PCR检测OsMGD1基因的相对表达水平。采用引物(OsUbq-F和OsUbq-R)和(OsMGD1-qRTF和OsMGD1-qRTR)为引物进行定量PCR，以OsUbiquitin作为内参基因。引物序列如下：
OsUbq-F:5’-CACCCTGGCTGACTACAACA-3’Seq_17
OsUbq-R:5’-TTCTTCTTGCGGCAGTTGAC-3’Seq_18
OsMGD1-qRTF:5’-TAACGAAACCCTTAACCTGA-3’Seq_19
OsMGD1-qRTR:5’-TGTGGCCGTAATAAGAAGC-3’Seq_20
定量PCR检测结果如图2所示，表明OsMGD1过表达转基因水稻OE13、OE21和OE22中OsMGD1基因表达量分别为野生型植株的15.76倍、46.31倍和19.61倍，远高于对照野生型水稻。干涉OsMGD1转基因水稻Ri23、Ri27和Ri29中OsMGD1基因表达量为野生型植株的42％、63％和44％，远低于对照野生型水稻。
实施例2、水稻OsMGD1转基因水稻幼苗在不同光照条件下的光能高效利用
将水稻野生型和OsMGD1转基因水稻幼苗在光照培养室(温度25±1℃、光照400μmol m-2s-1[PAR]、光周期14h)土培至四叶一心期，然后选择长势一致的水稻幼苗分别进行为期5天的低光照(LL,100μmol m-2s-1)、中等光照(ML,400μmol m-2s-1)和高光照(HL,1500μmol m-2s-1)处理，如图3所示。
一、水稻OsMGD1转基因水稻幼苗在不同光照条件下的生长参数和光合色素含量
1、生长参数的测定
苗期株高的测定：单株植株从基部到最高叶叶尖的高度。
苗期叶面积的测定＝叶片的叶长×最大叶宽×0.75(校正系数)。
图4表明低光和高光照条件下，过表达株系株高和叶面积显著高于对照野生型水稻，干涉转基因株系株高和叶面积低于对照野生型水稻，中等光照条件下各株系的株高和叶面积无明显变化。表明OsMGD1基因可以减缓光胁迫对水稻生长发育的伤害。
2、光合色素的含量测定
本发明测定的光合色素含量分别包括叶绿素和类胡萝卜素含量，其测定采用80％丙酮浸提法。具体如下：将不同光照处理的相同部位的新鲜水稻叶片剪碎、混匀后准确称重0.1g。在样品中加入10mL浓度为80％的丙酮溶液，28℃浸泡24小时至叶片发白。以9000g/min的转速在室温下离心10min后取上层清液，以80％丙酮提取液为空白对照。测定叶绿素a与b含量的波长分别为663nm和645nm，测定类胡萝卜素含量的波长为470nm。光合色素的提取和测定均在低温黑暗条件下进行。
叶绿素Chl总含量的计算公式如下：
Chl(mg g-1FW)＝(20.2×A645nm+8.02×A663nm)×V/(FW×1000)；
注释FW代表鲜重(g)；V代表提取液总体积(mL)。
结果如图5所示：在低光、中等光和高光照下过表达水稻植株的叶绿素和类胡萝卜素含量明显高于野生型植株，干涉转基因株系的叶绿素和类胡萝卜素含量显著低于对照野生型水稻。叶绿素a与b含量的比值代表植物的光适应能力和光能利用效率的强弱。以上结果表明，OsMGD1基因可以提高水稻的光能利用效率，并在提高水稻光保护和光适应能力方面有着重要作用。
二、水稻OsMGD1转基因水稻幼苗在不同光照条件下的光合速率
光合速率是指光合作用固定二氧化碳(或产生氧)的速度，是光合效率高低的重要指标。植物光合作用能力的高低一般通过光合速率来进行衡量，在其他条件都相同的情况下，高光合速率能够促进高产量、高光能利用效率。
本发明利用Li-6400便携式光合仪器对水稻光合速率进行测定，测定部位选择处理叶片上的相同位置。在测量期间，光合光子通量密度、环境CO2浓度和叶片温度分别稳定在500m-2s-1、400μmol CO2 mol-1和25.0±0.5℃。
图6结果表明在不同光照条件下，过表达水稻植株的净光合速率均高于对照植株，干涉转基因株系的净光合速显著低于对照植株。证实OsMGD1具有提高植物光能高效利用的作用。
实施例3、水稻OsMGD1转基因植株提高水稻的产量
将水稻野生型和OsMGD1转基因水稻幼苗在温室大棚土培至灌浆初期，分别进行正常光照和遮光70％的处理，直至收获期进行生长和产量性状的统计分析。
结果如图7和图8所示：在不同光照生长条件下，OsMGD1过表达植株的地上部生物量和产量都显著增加，干涉转基因株系的地上部生物量和产量显著低于对照植株。表明OsMGD1基因可以提高水稻的产量。
综上所述，水稻OsMGD1基因在水稻光能高效利用和作物高产方面具有重要作用。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，以上内容仅为说明本发明的若干个具体实施例，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明权利要求书的保护范围之内。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
Claims (10)
1.水稻OsMGD1基因在光能高效利用的转基因水稻选育中的应用。
2.水稻OsMGD1蛋白或能够表达所述OsMGD1蛋白的核酸分子或含有所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组菌、重组微生物或转基因细胞系在提高水稻光能高效利用中的应用。
3.水稻OsMGD1蛋白或能够表达所述OsMGD1蛋白的核酸分子或含有所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组菌、重组微生物或转基因细胞系在制备水稻光能高效利用的产品中的应用。
4.水稻OsMGD1蛋白或能够表达所述OsMGD1蛋白的核酸分子或含有所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组菌、重组微生物或转基因细胞系在培育光能高效利用水稻中的应用。
5.水稻OsMGD1蛋白或能够表达所述OsMGD1蛋白的核酸分子或含有所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组菌、重组微生物或转基因细胞系在制备光能高效利用水稻产品中的应用。
6.水稻OsMGD1蛋白或能够表达所述OsMGD1蛋白的核酸分子或含有所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组菌、重组微生物或转基因细胞系在提高水稻产量中的应用。
7.水稻OsMGD1蛋白或能够表达所述OsMGD1蛋白的核酸分子或含有所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组菌、重组微生物或转基因细胞系在制备提高水稻产量的产品中的应用。
8.水稻OsMGD1蛋白或能够表达所述OsMGD1蛋白的核酸分子或含有所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组菌、重组微生物或转基因细胞系在培育高产量水稻中的应用。
9.水稻OsMGD1蛋白或能够表达所述OsMGD1蛋白的核酸分子或含有所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组菌、重组微生物或转基因细胞系在制备水稻高产量产品中的应用。
10.一种培育光能高效利用和/或高产量水稻的方法，其特征在于，包括如下步骤：调控目的水稻中蛋白OsMGD1的含量，得到光能高效利用和/或高产量转基因水稻，过表达转基因水稻的产量和光能利用效率高于所述目的水稻，干扰水稻植株的产量和光能利用效率低于所述目的水稻；所述调控目的水稻中编码蛋白OsMGD1的含量是通过将所述蛋白OsMGD1编码基因的过表达和RNAi干扰载体导入所述目的水稻植株实现的。
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