KR100813150B1

KR100813150B1 - Ｍｄｈ 유전자의 색소체 형질전환을 통한 식물체의광합성량 또는 바이오매스 증대 방법

Info

Publication number: KR100813150B1
Application number: KR1020060109550A
Authority: KR
Inventors: 유장렬; 정화지; 민성란; 정원중; 김현태; 박주영; 허정혜
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2006-11-07
Filing date: 2006-11-07
Publication date: 2008-03-17
Also published as: WO2008056915A1; US20100043096A1

Abstract

본 발명은 MDH 유전자의 색소체 형질전환을 통한 식물체의 광합성량 또는 바이오매스 증대 방법에 관한 것으로, 구체적으로 MDH 유전자를 색소체 형질전환 시스템을 통하여 C3 식물을 형질전환하여 광합성량 또는 바이오매스를 증대시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 증대 방법을 통해 제조된 MDH 색소체 형질전환 식물체는 광합성 효율의 증가함과 함께, 식물체의 생장률, 잎의 면적, 줄기 직경 및 바이오매스가 대조구 식물체와 비교하였을 때 유의하게 증가함으로, C4 타입의 유전자가 도입된 색소체 형질전환 C3 식물체를 제조하여 식물체의 광합성량 또는 바이오매스를 증대시키는데 유용하게 이용될 수 있다.

색소체 형질전환 방법, MDH, Corynebacterium glutamicum, C3 식물.

Description

ＭＤＨ 유전자의 색소체 형질전환을 통한 식물체의 광합성량 또는 바이오매스 증대 방법{The method for enhancement of photosynthesis and biomass of plant by plastid transformation of malate dehydrogenase}

도 1은 벼 clp 프로모터와 대장균의 rrnB1 /B2 터미네이터를 포함하는 색소체 형질전환용 재조합 발현벡터의 모식도이다:

(a) : 담배 색소체 게놈에서 외래 유전자가 도입되는 부위인 trnI - trnA 부위;

(b) : 담배의 rrn 프로모터 및 psbA 터미네이터를 이용한 색소체 형질전환용 재조합 발현벡터인 CtVG04;

(c) : 담배의 trnI - trnA를 포함하는 색소체 형질전환벡터 제작의 기본적인 벡터인 pTIA;

(d) : 벼 clp 프로모터와 aadA 유전자, gfp 유전자 및 rrnB1 /B2 터미네이터를 포함하는 재조합 벡터인 pRclPADGHT 벡터; 및

(e): 벼 clp 프로모터와 gfp 유전자 사이에 MCS(multicloning site)가 삽입되고 aadA 유전자와 rrnB1 /B2 터미네이터가 순차적으로 연결된 재조합 벡터인 pRclPGAH 벡터.

도 2는 MDH 색소체 형질전환용 발현 벡터들의 지도이다.

도 3은 색소체 형질전환 식물체에서 MDH가 존재함을 나타내는 PCR 결과이다.

도 4는 T₀ 및 T₁ 세대의 색소체 형질전환 식물체의 색소체 내의 MDH가 호모플라스미 상태로 존재함을 증명하는 서던 블롯 결과이다.

도 5는 T₀ 및 T₁ 세대의 색소체 형질전환 식물체의 색소체 내의 MDH의 발현 수준을 나타내는 노던 블롯 결과이다.

도 6은 T₁ 세대의 색소체 형질전환 식물체의 색소체 내의 MDH 효소 활성도를 나타내는 그래프이다.

도 7은 T₁ 세대의 색소체 형질전환 식물체의 광도에 따른 이산화탄소 흡수율을 조사한 그래프이다:

도 8은 T₁ 세대의 색소체 형질전환 식물체를 고, 중, 저광도 조건의 온실에서 재배했을 때 각각의 Fv/Fm 값을 나타내는 그래프이다.

도 9은 T₁ 세대의 색소체 형질전환 식물체를 온실에서 재배하여 꽃대가 생길 시기의 표현형 그림이다.

도 10은 T₁ 세대의 색소체 형질전환 식물체를 온실에서 재배하여 꽃대가 생길 시기까지의 생장률 그래프이다.

도 11는 T₁ 세대의 색소체 형질전환 식물체를 온실에서 재배하여 꽃대가 생길 시기의 잎 면적을 측정한 그래프이다.

도 12은 T₁ 세대의 색소체 형질전환 식물체를 온실에서 재배하여 꽃대가 생길 시기의 줄기 직경을 측정한 그래프이다.

도 13는 T₁ 세대의 색소체 형질전환 식물체를 온실에서 재배하여 꽃대가 생길 시기의 식물체의 바이오매스(잎과 줄기 부분)를 생중량과 건중량으로 측정한 그래프이다.

본 발명은 MDH 유전자의 색소체 형질전환을 통한 식물체의 광합성량 또는 바이오매스 증대 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 MDH 유전자를 색소체 형질전환 시스템을 통하여 C3 식물을 형질전환하여 광합성량 또는 바이오매스를 증대시키는 방법에 관한 것이다.

환경악화와 인구증가로 인하여 식물 생산력을 개선시키는 문제는 가장 중요한 문제로 대두되고 있다. 따라서 전통적인 육종교배를 통한 작물의 생산량을 증가시킴과 동시에 최근에는 분자육종 기술을 이용하여 작물의 산출량과 바이오매스를 증가시키기 위한 노력을 오랫동안 시도하여 왔다. 즉 농업 및 임업분야에서 식물의 광합성과 관련된 유전자를 조작한 재조합 핵산분자를 식물 내로 도입하여 발 현함으로써 부분적으로 진보되어 왔는데 이러한 접근방식은 한 식물 종에 국한되는 것이 아니라 다른 식물 종에도 적용이 가능하다.

벼, 밀, 보리, 대두와 감자와 같은 주요 작물을 포함한 대다수의 육상 고등식물들은 C3 광합성 경로 즉 칼빈회로를 통해 대기 중의 CO₂를 동화한다. CO₂ 고정단계의 최초 효소인 Rubisco(ribulose 1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase)는 CO₂ 뿐만 아니라 O₂와도 반응을 하여 궁극적으로는 동화된 탄소를 소비하는 광호흡이 진행된다(Matsuoka et al ., Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 52, 297-314, 2001). 반면 옥수수, 수수, 사탕수수와 같은 C4 식물들은 C3 광합성 경로 외에도 Rubsico 근처에 CO₂ 농도를 높여줄 수 있는 부가적인 C4 광합성회로를 지니고 있어 광호흡을 저해하므로서 광합성 효율이 C3 식물보다 월등히 높다(von Caemmerer and Furbank, Photosynth Res 77, 191-207, 2003; Sage, New Phytologist 161, 341-370, 2004).

C4 광합성회로에 기여하는 주 효소들은 PEP carboxylase, NADP-의존성 말산 탈수소효소(NADP-dependent malate dehydrogenase), NADP-의존성 말산효소(NADP-dependent malic enzyme), 피루브산 인산 디키나제(pyruvate phosphate dikinase)이다. 식물의 경우, NADP-의존성 말산 탈수소효소( malate dehydrogenase: NADP-MDH; EC 1.1.1.82)는 엽록체 내에만 존재하며 광합성에 매우 중요한 효소이다(Sheen, Auun Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 50, 187-217, 1999). NADP-의존성 MDH는 엽록체 내에서 옥살로아세트산(oxaloacetate)을 말산으로 전환하므로써 NADP-의존성 말산 효소와 포르소페놀피루브산 카복시키나제(phosphoenolpyuvate carboxykinase: PCK)와 함께 광합성 탄소동화 작용에 관여함과 동시에 엽록체로부터 세포질로 말산을 내보내는 과정도 조절한다(von Caemmerer and Furbank, Photosynth Res 77, 191-207, 2003).

최근 C4 식물의 광합성의 관련된 주요 효소들의 유전자를 조작함으로써 C4 식물에서 혹은 C3 식물의 광합성효율을 높이는 연구가 진행되고 있다(Bailey et al., J Exp Bot 51 Spec No, 339-346, 2000; Matsuoka et al ., Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 52, 297-314, 2001; Hausler et al., J Exp Bot 53, 591-607, 2002; Jeanneau et al ., J Exp Bot 53, 1837-1845, 2002; Leegood, J Exp Bot, 53, 581-590, 2002; Rademacher et al ., Plant J 32, 25-39, 2002; Miyao, J Exp Bot 54, 179-189, 2003; Chen et al ., Planta 219, 440-449. 2004; Izui et al ., Annu Rev Plant Biol 55, 69-84, 2004).

색소체 형질전환은 핵 형질전환에 비하여 외래유전자의 발현 수준을 획기적으로 높일 수 있고, 화분 내에 외래유전자 부재로 인한 환경친화성 등의 이유로 식물 생명공학의 핵심적 주제가 되고 있다. 색소체는 광합성을 담당하는 엽록체(chloroplast), 전분저장을 하는 전분체(amyloplast), 색소를 포함하지 않는 백색체(luekoplast), 꽃 및 과일의 색에 관여하는 유색체(chromoplast) 등으로 분류되는데, 식물세포 하나에는 200여개의 색소체가 존재하고 한 개의 색소체는 100여 개의 게놈을 가지고 있어서 10,000∼50,000 카피(copy)의 유전자가 존재하는 반면, 식물의 핵은 보통 1∼2 카피의 게놈(genome)을 가지고 있다. 이처럼 색소체에서는 게놈의 카피수가 핵의 카피 수와 독립적으로 유지된다. 따라서 색소체에서 외래유전자를 에피솜(episome) 형태로 도입하여 유지할 수 있다면 색소체 형질전환에 의한 외래유전자의 도입은 핵을 형질전환 시켰을 때와 비교하여 목적 단백질을 비교할 수 없을 정도로 많은 양을 효율적으로 생산할 수 있는 것이다.

색소체 형질전환에 관한 대부분의 연구가 담배에서 이루어져 있고 그 외에 애기장대, 감자, 토마토 등에서 성공한 사례가 있다. 그러나 담배 이외의 식물체에서는 형질전환 효율이 매우 낮은 것으로 알려져 있으며, 기존의 담배엽록체 형질전환의 경우에도 형질전환벡터에 사용하는 프로모터/터미네이터 시스템은 담배 유래의 프로모터와 터미네이터를 사용하였기에 형질전환체가 만들어지는 과정에서 처음 상동 재조합(homologous recombination)이 일어난 후 이후 터미네이터 부위와 기존 담배엽록체 게놈내의 동일한 염기서열 사이에서 다시 한번 재조합이 일어나서 비정상적인 엽록체 게놈을 가지는 식물체가 생산된다(Staub JM, Maliga P, Proc . Natl . Acad . Sci . 91, 7468-7472, 1994 ;Svab Z, Maliga P, Proc . Natl . Acad . Sci . 90, 913-917, 1993). 따라서 기존의 전형적인 색소체 형질전환 벡터를 이용할 경우 약 50%의 확률로 상기와 같은 이차 재조합이 발생하여 비정상적인 색소체 형질전환 식물체가 생산되었으며 이러한 경우에는 도입 유전자의 안정적 유지 및 발현이 보장되지 않는다(대한민국 특허출원 제 2006-12477 호).

이에 본 발명자들은 Corynebacterium glutamicum의 MDH 유전자를 색소체 형질전환 시스템을 이용하여 C3 식물에 형질전환하고, 상기 색소체 형질전환 식물체 의 광합성량 및 바이오매스가 증가됨을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 광합성량 또는 바이오매스가 증대된 형질전환 식물체, 상기 형질전환 식물체 제조 방법 및 식물의 광합성량 또는 바이오매스 증대 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 MDH(malate dehydrogenase) 유전자를 C3 식물의 색소체 게놈에 삽입시킨 형질전환 식물체를 제공한다.

또한, 본 발명은 1) 색소체에서 활성을 나타내는 MDH(malate dehydrogenase) 유전자 서열을 색소체 형질전환용 벡터에 삽입하여 MDH 색소체 형질전환용 벡터를 제조하는 단계; 2) 단계 1)의 MDH 색소체 형질전환용 벡터를 C3 식물체 또는 C3 식물의 배양세포에 도입하여 형질전환체를 제조하는 단계; 3) 단계 2)의 형질전환체를 배양하는 단계; 및 4) 단계 3)의 배양된 형질전환체를 조직배양으로 재분화시키는 단계를 포함하는 MDH 유전자가 색소체 게놈에 삽입된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.

아울러, 본 발명은 상기 형질전환 식물체를 노지 또는 고광도 조건의 실내에서 재배하는 단계를 포함하는 식물의 광합성량 또는 바이오매스 증대 방법을 제공한다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명자들은 색소체 형질전환용 발현벡터에 Corynebacterium glytamicum에서 유래된 MDH 유전자를 삽입하여 MDH 발현벡터를 제작하였다(도 2 참조). 이후 야생형 담배(Nicotiana tabacum , Samsun) 식물체의 종자를 발아시킨 후 유식물체의 잎을 분리하고 MS 배지에서 치상하여 색소체 형질전환에 이용하였다. 이후 선발 배지에서 재분화를 반복하면서 저항성 어린 싹(shoot)을 유도하여 형질전환 식물체를 재배하였다. 이렇게 재배된 식물체에서 DNA를 분리한 후 PCR을 수행하여 MDH 유전자가 도입되었는지 확인하였다(도 3 참조). 이후 재배된 T₀ 및 T₁ 형질전환 식물체를 대상으로 서던 블롯을 수행하여 MDH 유전자가 호모플라스미(homoplasmy) 상태로 다음 세대까지 전달되었음을 확인하였다(도 4 참조). 또한 재배된 T₀ 및 T₁ 형질전환 식물체를 대상으로 노던 블롯을 수행하여, T₀ 및 T₁ 형질전환 식물체의 색소체 게놈에서 목표 유전자가 도입되어 정상적으로 전사 과정이 진행됨을 확인하였다(도 5 참조). 상기와 같이 식물체에 MDH 유전자가 성공적으로 형질전환됨을 확인한 발명자들은 MDH 효소 활성도를 조사하였다. 그 결과, MDH 형질전환체의 MDH 효소 활성은 벡터 대조구 식물체에 비하여 월등히 증가됨을 확인하였다(도 6 참조). 또한 상기 형질전환 식물체의 광합성에 따른 이산화탄소 흡수율 조사 결과, 대조구 식물체에 비해 약 1.41배 증가하였다(도 7 참조). 엽록소 형광은 주로 광계 2(PSⅡ)에서 방출되기 때문에 암적응된 잎에서 최대 엽록소 형광에 대한 변이 비(Fv/Fm)는 광화학 반응에 대한 양자수율의 최대치를 의미한다. 이에 본 발명자들은 색소체 형질전환 식물체에서의 광도 증가에 따른 광계 Ⅱ의 효율을 측정하였다. 그 결과, 중광도와 저광도 조건에서 자라는 형질전환 식물체와 벡터 대조구 식물체 모두 Fv/Fm 값이 0.8을 유지하였다. 그러나 고광도에서 자란 MDH 형질전환 식물체들은 Fv/Fm 값이 0.8을 유지하는 반면, 벡터 대조구 식물체의 Fv/Fm 값이 0.42로 감소하였다. 이를 통해 MDH 형질전환 식물체들이 강한 빛에서도 광계 2에 의한 광저해(photoinhibition)가 일어나지 않았음을 알 수 있었다(도 8 참조). 본 발명자들은 상기 색소체 형질전환 식물체의 생장률 및 바이오매스를 측정하였다. 그 결과, 상기 색소체 형질전환 식물체의 생장률은 벡터 대조구 식물체보다 40-55% 신장이 증가하였다(도 9 및 도 10 참조). 또한 MDH 형질전환 식물체는 벡터 대조구 식물체와 비교하여 잎면적은 86%, 줄기 직경은 35%, 생중량은 63%, 건중량은 14% 증가함을 확인하였다(도 11 내지 13 참조).

상기와 같이 MDH를 C3 식물의 색소체 내로 도입함으로써 식물체의 광합성 량을 증대시키는 동시에 식물체의 바이오매스가 증대되었다.

이에 본 발명은 MDH 유전자를 대상 식물의 색소체 게놈 내에 삽입시킨 형질전환 식물체를 제공한다.

상기 MDH 유전자는 C4 식물 타입의 NADP-의존성 MDH 유전자인 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다. 또한 상기 MDH 유전자는 원핵생물에서 유래하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 MDH 유전자는 Corynebacterium glutamicum , Rhodococcus , Oceanobacillus, Aspergillus , Methanothermus , Chaetomium , Methanopyrus , Bacillus , Methanocaldococcus , Magnaporthe , Phaeosphaeria, Gibberella , Desulfitobacterium , coccidioides , Thermus , Candidatus , Pyrococcus, Solibacter , Aurantimonas , Syntrophus , Enterococcus , Methanosphaera , Anopheles , Entamoeba, Yersinia , Mesorhizobium , Tribolium , Salmonella , Aurantimonas , Amycolatopsis , Escherichia coli , Apis , Burkhoderia , Bordetella , Pseudomonas , Aedes로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나에서 유래하는 것이 바람직하며, Corynebacterium glutamicum에서 유래하는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, Corynebacterium glutamicum의 MDH 아미노산 서열과 비교했을 때, 30% 이상 유사성을 갖는 다른 세균의 MDH 유전자를 사용하여도 무방하다.

상기 형질전환 식물체의 대상 식물은 C3 식물체인 것이 바람직하며, C3 식물체로는 담배, 벼를 포함하는 곡류, 녹두, 강낭콩, 완두를 포함하는 두류, 감자, 카사바, 고구마를 포함하는 전분저장식물, 대두, 유채, 해바라기, 목화를 포함하는 오일저장식물, 토마토, 가지, 당근, 고추, 배추, 무, 수박, 오이, 멜론, 쑥갓, 시금치, 양배추, 딸기를 포함하는 채소용 식물, 국화, 장미, 카네이션, 페튜니아를 포함하는 원예용 식물, 애기장대인 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 당해업계의 당업자에게 알려진 모든 C3 식물체는 사용하여도 무방하다.

또한, 본 발명은 상기 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다. 본 발명의 제조 방법은 하기와 같다: 1) 색소체에서 활성을 나타내는 C4 식물 타입의 MDH(malate dehydrogenase) 유전자 서열을 색소체 형질전환용 벡터에 삽입하여 MDH 색소체 형질전환용 벡터를 제조하는 단계; 2) 단계 1)의 MDH 색소체 형질전환용 벡터를 C3 식물체 또는 C3 식물의 배양세포에 도입하여 형질전환체를 제조하는 단계; 3) 단계 2)의 형질전환체를 배양하는 단계; 및 4) 단계 3)의 배양된 형질전환체를 조직배양으로 재분화시키는 단계.

상기 제조 방법에 있어서, 단계 1)의 MDH 유전자는 Corynebacterium glutamicum , Rhodococcus , Oceanobacillus, Aspergillus , Methanothermus , Chaetomium , Methanopyrus , Bacillus , Methanocaldococcus, Magnaporthe , Phaeosphaeria , Gibberella , Desulfitobacterium , coccidioides, Thermus , Candidatus , Pyrococcus , Solibacter , Aurantimonas , Syntrophus , Enterococcus, Methanosphaera , Anopheles , Entamoeba , Yersinia , Mesorhizobium , Tribolium , Salmonella, Aurantimonas , Amycolatopsis , Escherichia coli , Apis , Burkhoderia , Bordetella, Pseudomonas , Aedes로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나에서 유래된 것이 바람직하며, Corynebacterium glutamicum에서 유래되는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, Corynebacterium glutamicum의 MDH 아미노산 서열과 비교했을 때, 30% 이상 유사성을 갖는 다른 세균의 MDH 유전자를 사용하여도 무방하다.

상기 제조 방법에 있어서, 단계 1)의 색소체 형질전환용 발현벡터는 대상 식 물 색소체 게놈 내의 폴리뉴클레오티드와 상동성이 낮은 식물체의 색소체 유래 프로모터, rbs 서열, 대상 식물의 색소체 게놈 내의 폴리뉴클레오티드와 상동성이 낮은 터미네이터를 순차적으로 포함하는 컨스트럭트를 포함하는 재조합 발현벡터이다(도 2 참조). 상기 대상 식물은 C3 식물체인 것이 바람직하며, C3 식물체로는 담배, 벼를 포함하는 곡류, 녹두, 강낭콩, 완두를 포함하는 두류, 감자, 카사바, 고구마를 포함하는 전분저장식물, 대두, 유채, 해바라기, 목화를 포함하는 오일저장식물, 토마토, 가지, 당근, 고추, 배추, 무, 수박, 오이, 멜론, 쑥갓, 시금치, 양배추, 딸기를 포함하는 채소용 식물, 국화, 장미, 카네이션, 페튜니아를 포함하는 원예용 식물, 애기장대인 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 당해업계의 당업자에게 알려진 모든 C3 식물체는 사용하여도 무방하다.

상기 색소체 유래 프로모터는 벼(Oryza sativa)의 clp 프로모터인 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 터미네이터는 대장균(Escherichia coli) pHCE19 벡터로부터 유래한 rrnB1 /B2 터미네이터인 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 색소체 형질전환용 벡터는 추가적으로 선별 유전자를 포함하는 것이 바람직하며, 선별 유전자로는 aadA , gfp 유전자인 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다. trnl 유전자 서열, trnA 유전자 서열, aadA 유전자 서열, gfp 유전자 서열, rbs 서열을 포함하는 재조합 발현벡터이다(도 1 참조).

아울러 본 발명은 상기 형질전환 식물체를 노지 또는 고광도 조건의 온실에서 재배하는 단계를 포함하는 식물의 광합성량 또는 바이오매스 증대 방법을 제공 한다.

이하 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 색소체 형질전환 기본 벡터 제작

미국의 Daniell 교수 연구실부터 분양받은 엽록체 형질전환 벡터 CtV2(Guda G, et al ., Plant Cell Rep 19:257-26, 2000)를 변형하여 pTIG vector(Jeong SW, et al ., Plant Cell Rep , 22:747-751, 2004)와 동일한 방법으로 GFP를 가지는 전형적인 엽록체 형질전환 벡터 CtVG04를 제작(도 1b)하였다. 벼( Oryza sativa )의 염색체 DNA를 주형으로 rclpP5 프라이머(서열번호 1)와 rclpP3 프라이머(서열번호 2)를 사용하여 하기의 방법으로 PCR 증폭을 한 후 pCR2.1-TOPO 벡터(Invitrogen, USA)로 클로닝(cloning)하였다. PCR은 일본 TaKaRa 회사의 exTaq 효소를 이용하고, 10-100 ng의 벼 지놈 DNA(genomic DNA)를 주형으로 하고, 94℃에서 5분간 변성 과정(denatureation) 후, 94℃에서 1분간 변성 반응(denaturation), 55℃에서 1분간 프라이머 결합 반응(annealing), 72℃에서 1분간 길이 연장 반응(polymerization)을 30회 반복한 후, 72℃에서 10분간 길이 연장 반응을 수행하였다. rrnB1 /B2 터미네이터(terminator)는 일본 TaKaRa 회사의 상용 대장균(Escherichia coli ) 발현벡터 pHCE19로부터 800 bp의 rrnB1 /B2 터미네이터를 PstI/HincII로 분리하여 사용하였다(서열번호 3). 벼의 clp 프로모터는 염기서열을 서열결정(sequencing)하여 확인하였다(서열번호 4).

pTIA 벡터 제작은 10-100 ng 의 담배 지놈 DNA를 I-L1프라이머(서열번호 5)와 I-R2 프라이머(서열번호 6)를 이용하여 PCR을 수행하여 1.95 kb의 trnI-trnA boarder DNA 단편을 증폭하였다. PCR 조건은 하기와 같다. 일본 TaKaRa 회사의 exTaq 효소를 이용하고, 94℃에서 5분간 변성 반응 후, 94℃에서 1분간 변성 반응, 55℃에서 1분간 프라이머 결합 반응, 72℃에서 2분간 길이 연장 반응을 30회 반복한 후, 72℃에서 10분간 길이 연장 반응을 수행하였다. 이후 이를 XbaI/KpnI으로 자르고 Klenow 효소로 말단부위를 평활화하여 pUC18 벡터(Fermentase, USA)의 PvuII 자리에 도입하여 pTIA 기본벡터(도 5c)를 완성하였다.

pRclPADGHT 벡터(도 5d) 제작을 위해 pTIG 벡터로부터 분리한 aadA-GFP DNA 단편을 pBluescript KSII 벡터(Stratagene, USA)에 SalI/PstI으로 도입하고 이후 이를 BamHI/SmaI으로 절단하여 Klenow 효소로 말단 부위를 평활화한 후 이곳에 상기한 rrnB1 /B2 터미네이터 DNA 단편을 도입하였다. 이후 XhoI/SalI 자리에 rclp 프로모터를 도입하여 pRclPADGHT 벡터를 제작하였다.

pRclPGAH 벡터(도 5e) 제작을 위해 aadA-PstI 5' 프라이머(서열번호 7)와 aadA-HindIII 3' 프라이머(서열번호 8)를 사용하여 pRclPADGHT 벡터를 주형으로 PCR 증폭을 한 후 pCR2.1 TOPO TA 벡터(Invitrogen, USA)로 클로닝하여 pCR2.1 aadA(H/P) 벡터를 제조하였다. PCR 증폭은 일본 TaKaRa 회사의 exTaq 효소를 이용하고, 94℃에서 5분간 변성 반응 후, 94℃에서 30초간 변성 반응, 50℃에서 30초간 프라이머 결합 반응, 72℃에서 30초간 길이 연장 반응을 27회 반복한 후, 72℃에서 5분간 길이 연장 반응을 수행하였다. pCR2.1 aadA(H/P) 벡터를 PstI/HindIII로 절단하여 얻은 DNA 절편을 PstI/HindIII로 절단한 pRclPADGHT 벡터로 도입하여 이중(double) aadA 벡터를 제조하였다. 동시에 rclp-XhoI 프라이머(서열번호 9)와 SalI, XbaI, EcoRV, SacI 순서로 제한효소 자리를 포함한 rclp-MCS 3'프라이머(서열번호 10)를 사용하여 pRclPADGHT 벡터를 주형으로 rclp 프로모터를 PCR로 증폭하고, pCR2.1 TOPO TA 벡터(Invitrogen, USA)로 클로닝하여 pCR2.1 Rclp-MCS 벡터를 제조하였다. PCR 조건은 pCR2.1 aadA(H/P) 벡터를 제조한 조건과 같다. 이중 aadA 벡터를 XhoI/SacI으로 절단하여 원래 있던 rclp 프로모터와 aadA 유전자를 잘라내고 그 자리에 Rclp-MCS 벡터를 XhoI/SacI으로 잘라서 얻은 rclp-MSC DNA 절편을 도입하여 pRclPGAH 벡터를 제작하였다.

< 실시예 2> MDH 를 포함하는 색소체 형질전환 벡터 제작

MDH를 포함하는 색소체 형질전환벡터는 도 1에서 제작한 기본벡터를 사용하였다. 우선 Corynebacterium glutamicum 염색체 DNA를 주형으로 MDH 5' 프라이머(서열번호 11)와 MDH 3'프라이머(서열번호 12)를 사용하여 PCR 증폭을 한 후 pGEM T-easy 벡터(Promega, USA)로 클로닝하여 제조하였고, “TvecMDH 벡터”라 명명하였다. PCR 조건은 하기와 같다. 일본 TaKaRa 회사의 exTaq 효소를 이용하고, 94℃에서 5분간 변성 과정 후, 94℃에서 30초간 변성 과정, 55℃에서 30초간 프라이머 결합 반응, 72℃에서 1분간 길이 연장 반응을 27회 반복한 후, 72℃에서 5분간 길 이 연장 반응을 수행하였다. 이후 TvecMDH 벡터를 SalI/HindⅢ 제한효소로 처리하여 MDH DNA를 절단하였고, 이를 상기에서 제조한 pRclPADGHT 벡터를 SalI/HindIII로 절단한 자리로 도입하여 RclpMDH 벡터를 제조하였다. RclpMDH 벡터를 XhoI/EcoRI 제한효소로 절단한 후 Klenow 효소를 처리하여 말단 부위를 평활하게 제조하여 PstI 제한효소 처리 후 평활 말단부위로 된 CtVG04 벡터(도 1b) 내로 삽입하여 색소체 형질전환벡터를 완성하였다(도 2A). Corynebacterium glutamicum MDH 유전자는 목적에 따라 선발마커 유전자들 앞에 위치할 수도록 상기의 방법으로 벡터를 제조하였다(도 2B). 도 2A와 도 2B에 제시한 벡터는 MDH 유전자가 단독의 프로모터에 의해 전사되는 모노시스트론(monocistron) 구조이다. 또한 Corynebacterium glutamicum MDH 유전자를 aadA , gfp 선발 유전자와 함께 clp 프로모터에서 전사하도록 폴리시스트론(polycistron) 구조 형태로 벡터를 제조하였다(도 2C, D, E, F). P1는 서던블럿을 할 때 사용한 염기표지인자(probe)이며, P2는 노던블럿을 할 때 사용한 염기표지인자이다. 서던블럿 시 염색체를 BglⅡ와 BamHI 제한효소로 자른 후 P1 연기표지인자를 사용하였을 때 나타나는 밴드의 크기를 각 벡터모식도에 표시하였다.

< 실시예 3> MDH 를 가지는 색소체 형질전환 벡터를 이용한 색소체 형질전환 담배 식물체 제작

실시예 2에서 제작한 벡터로 색소체 형질전환을 하기와 같이 수행하였다. 색소체 형질전환 실험을 수행할 때는 실시예 1에서 제작한 CtVG04 벡터를 대조구로 사용하였다.

야생형 담배(Nicotiana tabacum , Samsun) 식물체의 종자를 기내에서 8주간 발아시킨 후 유식물체의 잎을 분리하여 1 mg/ℓ BAP, 0.1 mg/ℓ NAA이 첨가된 MS 배지에서 치상하여 색소체 형질전환에 사용하였다.

실시예 1과 2에서 제작한 색소체 형질전환용 벡터를 CaCl₂와 스퍼미딘(spermidine)을 사용하여 0.6 ㎛ 지름의 금 입자(gold particle)에 코팅(coating)한 후 PDH-1000/He gene delivery system 기기(BioRad, USA)를 사용하여 100 psi의 Acceleration Power, 9 cm의 Target distance, 28 in/Hg의 Vacuum 조건으로 색소체 형질전환을 수행하였다.

처리된 담배 잎은 이후 25℃, 2,000 lux의 암 조건으로 2일간 배양하고 담배 잎을 2-5 mm 크기의 절편으로 나누어 1 mg/ℓ BAP, 0.1 mg/ℓ NAA, 500mg/ℓ 스펙티노마이신(Spectinomycin)이 첨가된 MS 배지에서 6-7주 배양하여 저항성 어린싹(shoot)을 유도하였다. 스펙티노마이신 저항성 배지에서 유도된 어린 싹는 3 mm × 3 mm 크기로 절단하여 동일한 선발배지에서 재분화를 통하여 저항성 어린 싹을 재유도하였다. 이와 같이 선발 배지에서 재분화를 반복하여 도입된 유전자의 호모플라스미(homoplasmy)를 높여 주었다.

항생제 첨가 배지에서 재분화된 식물체(T₀)가 목표의 유전자가 도입된 형질전환체인지 확인하기 위하여 각 식물체로부터 DNA를 추출하여 벡터 특이적인 trnI F3 프라이머(서열번호 13)와 trnA R1 프라이머(서열번호 14)를 이용하여 PCR 분석 을 수행한 결과 형질전환 식물체에서 도입된 유전자를 확인할 수 있었다. PCR 분석 조건은 95℃에서 5분간 변성 반응 후, 95℃에서 45초간 변성 반응, 55℃에서 45초간 프라이머 결합 반응, 72℃에서 5분간 길이 연장 반응을 30회 반복한 후, 72℃에서 15분간 길이 연장 반응을 수행하였다. PCR 생성물의 크기는 야생형에서는 trnI와 trnA 일부가 증폭된 약 800 bp 밴드만 검출되었고, MDH 형질전환 식물체의 경우는 trnI와 trnA 일부가 증폭된 약 800 bp 밴드와 trnI와 trnA 사이에 외래유전자가 삽입되어 약 5,1 kb 밴드가 동시에 검출되었다(도 3).

< 실시예 4> 색소체 형질전환 담배 식물의 서던 블럿 분석

실시예 3에서 획득한 T₀ 및 T₁ 형질전환 식물체에서 엽록체의 호모플라스미 상태를 확인하기 위하여 trnA 유전자를 표지인자로 이용하여 서던 분석을 수행하였다. 서던 분석을 위한 모든 염색체 DNA는 DNA 분리 키트(DNeasy Plant Mini Kit, QIAGENE, Germany)를 사용하여 추출하였다. 추출한 DNA 4 ㎍을 BamHI 및 BglⅡ 제한효소로 처리하여 1% 아가로스 겔(agarose gel)에 전기영동하여 분리한 후 블롯팅 막(Zeta-Probe GT blotting membrane: Bio-Rad, USA)에 블럿팅하였다. 표지인자의 준비는 trnA를 포함하는 0.6kb의 BamHI/BglII DNA 단편을 [α-³²P]dCTP로 표식하여 준비하였다. 예비 혼성화(Prehybridization)과 혼성화 과정은 7%(w/v) SDS를 포함하는 0.25 M 소디움 포스페이트 버퍼(sodium phosphate buffer: pH 7.2)를 사용하여 65℃에서 하룻밤 수행했다. 반응이 끝난 막(membrane)은 5%(w/v) SDS를 포함한 20 mM 소디움 포스페이트 버퍼(sodium phosphate buffer: pH 7.2)로 65℃에서 30분간 세척하였고 3시간 동안 노출시켰다.

서던 블럿 분석 결과, 야생형에서는 0.8 kb에서 DNA 밴드가 검출이 되었으며, 실시예 3의 CtVG04로 형질전환된 벡터 대조구 식물체에서는 약 3.0kb, MDH 형질전환체에서는 1.5 kb 크기의 DNA 밴드가 검출이 되었다. 이들 결과는 재분화된 형질전환 식물체의 엽록체 게놈 전체는 목표의 유전자가 도입된 상태로 전환이 되었다는 호모플라스미 상태를 의미하며 도입된 유전자는 호모플라스미 상태로 다음세대까지 전달되는 것을 의미한다(도 4).

< 실시예 5> 색소체 형질전환 담배 식물체에서의 MDH 발현의 관찰

실시예 3에서 획득한 T₀ 및 T₁ 형질전환 식물체에서 도입된 MDH 유전자가 전사되는지 노던블럿 분석을 하여 확인하였다. 노던 분석을 위한 모든 RNA는 TRIzol 시약(Invitrogen, USA)을 사용하여 추출하였다. 추출한 RNA 2 ㎍을 5.1%(v/v) formaldehyde를 첨가한 1.2% 아가로오즈 겔에서 전기영동하여 분리한 후 블롯팅 막(Zeta-Probe GT blotting membrane: Bio-Rad, USA)에 전사시켰다. 프루브(Probe)의 준비는 1,044 bp MDH를 PCR로 증폭한 후[α-³²P]dCTP로 표식하여 준비하였다. 예비 혼성화와 혼성화는 7%(w/v) SDS를 포함하는 0.25 M 소디움 포스페이트 버퍼(pH 7.2)를 사용하여 65℃에서 하룻밤 수행했다. 반응이 끝난 막은 5%(w/v) SDS를 포함한 20 mM 소디움 포스페이트 버퍼(pH 7.2)로 65℃에서 30분간 씻어낸 후 30분간 노출시켰다

노던 블럿 분석 결과, 야생형과 상기 벡터 대조구 식물체에서는 RNA 밴드가 검출이 되지 않았으며, 재분화된 MDH 형질전환 T₀ 식물체와 T₁ 형질전환체에서는 MDH와 rrnB1 /B2 터미네이터를 포함하는 약 1.8 kb 크기의 RNA 밴드가 가장 많이 검출이 되었으며 그 외 오페론으로 연결된 다양한 크기의 mRNA도 검출되었다. 또한 재분화된 형질전환 T₀ 식물체와 T₁ 형질전환체의 색소체 게놈에서 목표의 유전자가 도입되어 정상적으로 전사과정이 진행되었음을 의미하며 동시에 효소기능을 지닌 단백질로 번역될 수 있음을 암시한다(도 5)

< 실시예 6> 색소체 형질전환 담배 식물체의 MDH 효소 활성도 측정

실시예 3에서 획득한 T₀ 및 T₁ 형질전환 식물체에서 NADP-의존 MDH 효소활성도는 분광측정기(shimadzu UV-VIS Spectorophotometer, Japan)를 이용하여 측정하였다. 해가 뜨고 난 후 6시간 후에 식물체의 위에서 4-5번째 신선한 잎을 직경 1.5 cm 되도록 준비하였다. 잎 조직을 추출용액[100 mM HEPES-KOH(pH7.3), 10 mM MgCl₂, 2 mM K₂HPO₄, 1 mM EDTA, 10% glycerol, 10 mM β-mercaptoethanol, 10 mM NaF, 2 mM PMSF]을 사용하여 추출물을 분리하였다. 이때 준비한 잎은 저온 상태를 유지하면서 막자를 사용하여 재빨리 분쇄한 후, 12000 rpm(4°C)에서 15분간 원심분리하여 상등액을 새 튜브로 옮겼다. 부유물질이 보이면 한번 더 원심분리를 수행하였다. 4°C에서 30분 이상 정치시킨 잎 추출물을 Sephadex G-25(1*3 cm) 컬 럼(GE healthcare Bio-Science AB, 스웨덴)을 이용하여 염분을 제거하여 효소반응에 사용하였다. 반응하기 전에 효소 반응액[50 mM HEPES-KOH(pH7.3), 5 mM MgCl₂, 0.2 mM NADPH, 2 U MDH, 5 mM EDTA, 2 mM OAA, 0.2 mM NADPH]을 제조하여 적정량의 잎 추출물을 함유하는 1 ㎖의 NADP-의존 MDH 효소 반응액을 30℃에서 처리하여 340 nm NADPH의 흡수 감속속도를 구하였다. 잎 추출물의 단백질의 정량은 프로틴 assay kit(BioRad, USA)을 사용하여 행하였다. MDH 형질전환 식물체의 NADP-의존 MDH 효소 활성도는 벡터 대조구 식물체에 비해 월등히 증가됨을 알 수 있었다(도 6).

< 실시예 7> 색소체 형질전환 담배 식물체에서의 광합성에 따른 이산화탄소 흡수율 측정

실시예 3에서 획득한 T₀와 T₁ 형질전환 식물체들을 온실에서 재배하였으며 손상되지 않은 상태의 잎에서의 이산화탄소 흡수율은 LI-6400 광합성 시스템(Li-Cor, Inc., Lincoln, NE, USA)을 이용하여 측정하였다. 광원은 적색과 푸른색 광 LED 광원이며 이산화탄소는 6400 CO₂ 혼합체를 사용하였다. 광도에 따른 이산화탄소 흡수율은 건강한 잎을 이용하여 온도는 25℃, CO₂는 400 μmol photons CO₂ mol^-1air CO₂ 농도로 고정한 후 챔버의 광을 0, 100, 300, 500, 700, 1000 및 1500 μ mol photons CO₂ mol^-1s^-1까지 변화시키면서 측정하였다.

실험 결과, 이산화탄소 흡수율을 1500 μmol photons에서 MDH 형질전환 식물의 이산화탄소 흡수율이 벡터 대조구 식물체에 비해 약 1.41배 증가하였다(도 7).

< 실시예 8> 색소체 형질전환 담배 식물체에서의 광도 증가에 따른 광계 II 효율 측정

엽록소 형광은 주로 광계 2(PSⅡ)에서 방출되기 때문에 암적응된 잎에서 최대 엽록소 형광에 대한 변이의 비(Fv/Fm)는 광화학반응에 대한 양자수율의 최대치를 의미한다. 즉, 상기 값은 식물 잎의 광합성을 수행할 수 있는 최대값 즉 잠재력을 의미하며 광계 2의 광 손상을 확인하는데 사용한다. 건강한 식물의 잎은 Fv/Fm 값이 항상 0.8 정도에서 유지된다. 실시예 3에서 획득한 T₀ 및 T₁ 형질전환 식물체들을 광도가 고광도(800 ~ 1600 μmol photons/m²/sec), 중광도(300 ~ 800 μmol photons/m²/sec), 저광도(30 ~ 300 μmol photons/m²/sec)로 조절된 온실에서 재배하였으며 식물체의 위에서 다섯 번째 잎을 휴대용 엽록소 형광 반응측정기(Hansatech, King's Lynn, UK)의 클립을 끼운 다음 30분 동안 암 처리한 후 포화광도에서 Fv/Fm 값을 측정하였다. 중광도와 저광도 조건에서 자라는 식물체들은 형질전환 식물체와 벡터 대조구 식물체 모두 Fv/Fm 값이 0.8을 유지하였다. 그러나 고광도에서 자란 MDH 형질전환 식물체들은 Fv/Fm 값이 0.8을 유지한 반면, 벡터 대조구 식물체의 Fv/Fm 값이 0.42로 감소하였다. 이들 결과는 MDH 형질전환 식물체들이 강한 빛에서도 광계 2에 의한 광저해(photoinhibition)가 일어나지 않았음을 알 수 있었다(도 8).

< 실시예 9> 색소체 형질전환 담배 식물체의 생장률 및 바이오매스 측정

실시예 3에서 획득한 T₀ 및 T₁ 형질전환 식물체들을 온실에서 재배하여 꽃대가 형성되는 시기까지 바이오매스 증가율을 매 2-3일 간격으로 측정하였다. 바이오매스 증가율은 식물체의 생장률, 잎면적, 줄기의 직경과 생중량, 건중량을 포함한다. 잎 면적은 모든 식물체에서 아래에서 13 번째 잎을 선택하여 잎 면적을 측정하는 소프트웨어를 사용하여 측정하였다. 줄기 직경은 식물체 아래에서 3 ㎝ 되는 지점을 직경을 측정하는 자(Manostat, 15-100-500)를 이용하여 측정하였다. 식물체의 뿌리, 줄기, 잎을 분리하여 각각을 저울로 생중량을 측정하고, 80℃ 오븐 에서 6 일 동안 건조시켜서 건중량을 측정하였다. MDH 형질전환 식물체의 생장률은 흙으로 옮긴 지 38일부터 급격히 증가하여 꽃대가 형성될 시기(약 65일째)에는 벡터 대조구 식물체보다 40-55% 신장이 증가하였다(도 9 및 10). 또한 벡터 대조구 식물체와 비교하여 MDH 형질전환 식물체의 잎 면적은 88%, 줄기 직경은 35%, 생중량은 63%, 건중량은 14%가 증가하였다(도 11 내지 13).

본 발명의 NADP-의존성 MDH 유전자의 색소체 형질전환을 통한 식물체의 광합성량 또는 바이오매스 증대 방법을 통해 제조된 MDH 색소체 형질전환 식물체는 산소 발생률과 이산화탄소 흡수율이 증가하며, 식물체의 생장률, 잎의 면적, 줄기 직경 및 바이오매스가 대조구 식물체와 비교하였을 때 유의하게 증가함으로, 색소체 형질전환 C3 식물체를 제조하여 식물체의 광합성량 또는 바이오매스를 증대시키는데 유용하게 이용될 수 있다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

원핵생물에서 유래한 MDH(malate dehydrogenase) 유전자를 C3 식물의 색소체 게놈에 삽입시킨 형질전환 C3 식물체.
제 1항에 있어서, 상기 원핵생물은 Corynebacterium glutamicum, Rhodococcus, Oceanobacillus, Aspergillus, Methanothermus, Chaetomium, Methanopyrus, Bacillus, Methanocaldococcus, Magnaporthe, Phaeosphaeria, Gibberella, Desulfitobacterium, coccidioides, Thermus, Candidatus, Pyrococcus, Solibacter, Aurantimonas, Syntrophus, Enterococcus, Methanosphaera, Anopheles, Entamoeba, Yersinia, Mesorhizobium, Tribolium, Salmonella, Aurantimonas, Amycolatopsis, Escherichia coli, Apis, Burkhoderia, Bordetella, Pseudomonas 또는 Aedes로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 형질전환 C3 식물체.
제 1항에 있어서, 상기 원핵생물은 Corynebacterium glutamicum에서 유래하는 것을 특징으로 하는 형질전환 C3 식물체.
삭제
제 4항에 있어서, C3 식물은 담배, 벼, 녹두, 강낭콩, 완두, 감자, 카사바, 고구마, 대두, 유채, 해바라기, 목화, 토마토, 가지, 당근, 고추, 배추, 무, 수박, 오이, 멜론, 쑥갓, 시금치, 양배추, 딸기, 국화, 장미, 카네이션, 페튜니아 또는 애기장대로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 형질전환 C3 식물체.
1) 색소체에서 활성을 나타내는 원핵생물에서 유래한 MDH(malate dehydrogenase) 유전자 서열을 색소체 형질전환용 벡터에 삽입하여 MDH 색소체 형질전환용 벡터를 제조하는 단계;

2) 상기 제조된 MDH 색소체 형질전환용 벡터를 C3 식물체 또는 C3 식물의 배양세포에 도입하여 형질전환체를 제조하는 단계;

3) 단계 2)의 형질전환체를 배양하는 단계; 및

4) 단계 3)의 배양된 형질전환체를 조직배양으로 재분화시키는 단계를 포함하는 MDH 유전자가 색소체 게놈에 삽입된 형질전환 식물체의 제조 방법.
제 6항에 있어서, 단계 1)의 원핵생물은 Corynebacterium glutamicum, Rhodococcus, Oceanobacillus, Aspergillus, Methanothermus, Chaetomium, Methanopyrus, Bacillus, Methanocaldococcus, Magnaporthe, Phaeosphaeria, Gibberella, Desulfitobacterium, coccidioides, Thermus, Candidatus, Pyrococcus, Solibacter, Aurantimonas, Syntrophus, Enterococcus, Methanosphaera, Anopheles, Entamoeba, Yersinia, Mesorhizobium, Tribolium, Salmonella, Aurantimonas, Amycolatopsis, Escherichia coli, Apis, Burkhoderia, Bordetella, Pseudomonas 또는 Aedes로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
제 6항에 있어서, 단계 1)의 상기 원핵생물은 Corynebacterium glutamicum로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
제 8항에 있어서, MDH 유전자 서열은 서열번호 16인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
제 6항에 있어서, 단계 1)의 색소체 형질전환용 발현벡터는 대상 식물 색소체 게놈 내의 폴리뉴클레오티드와 상동성이 낮은 식물체의 색소체 유래 프로모터, rbs 서열, 대상 식물의 색소체 게놈 내의 폴리뉴클레오티드와 상동성이 낮은 터미네이터를 순차적으로 포함하는 유전자 컨스트럭트를 포함하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
제 10항에 있어서, 대상 식물은 C3 식물인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
제 11항에 있어서, C3 식물은 담배, 벼, 녹두, 강낭콩, 완두, 감자, 카사바, 고구, 대두, 유채, 해바라기, 목화, 토마토, 가지, 당근, 고추, 배추, 무, 수박, 오이, 멜론, 쑥갓, 시금치, 양배추, 딸기, 국화, 장미, 카네이션, 페튜니아, 또는 애기장대로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
제 10항에 있어서, 색소체 유래 프로모터는 벼(Oryza sativa)에서 유래한 clp 프로모터인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
제 10항에 있어서, 터미네이터는 대장균(Escherichia coli) pHCE19 벡터로부터 유래한 rrnB1/B2 터미네이터인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
제 10항에 있어서, 추가적으로 선별 유전자를 포함하는 색소체 형질전환용 벡터인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
제 15항에 있어서, 상기 선별 유전자는 aadA 또는 gfp 유전자인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
삭제