KR102540389B1

KR102540389B1 - 광합성 효율 및 성장이 증가된 형질전환 식물

Info

Publication number: KR102540389B1
Application number: KR1020187037434A
Authority: KR
Inventors: 스티븐 피. 롱; 요하네스 크롬디크; 카타르지나 글로와츠카; 크리슈나 케이. 니요기; 로리 레오넬리; 스테판 티. 가빌리
Original assignee: 더 보드 오브 트러스티즈 오브 더 유니버시티 오브 일리노이; 더 리전츠 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아
Priority date: 2016-05-27
Filing date: 2017-05-26
Publication date: 2023-06-02
Also published as: US20190161765A1; KR20230080515A; EP3464601B1; JP2022110043A; US11572569B2; EP4421178A2; BR112018074094A2; JP7078207B2; US20230183731A1; ZA201807592B; WO2017205834A1; KR20190010647A; CN109477118A; AU2017270579B2; JP2019527034A; EP3464601A1; AU2017270579A1; JP7515123B2

Abstract

본 명세서는 적어도 하나의 발현 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 광계(photosystem) II 서브유닛 S(PsbS), 제아크산틴 에폭시다제(zeaxanthin epoxidase, ZEP), 및 비올라크산틴 디-에폭시다제(violaxanthin de-epoxidase, VDE)로 부터 선택된 폴리펩타이드를 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 형질전환 식물을 제공한다. 또한 형질전환 식물들을 제조하기 위한 발현 벡터들 및 PsbS, ZEP, 및 VDE 폴리펩타이드의 적어도 하나의 발현 증가를 포함하고 있는 식물에서 바이오매스 생산 증가 및/또는 탄소 고정 증가 및/또는 성장을 증가시키는 방법들을 제공한다. 반면에 WT 종자에서 NPQ 는 좀더 느리게 증가 되며, 4 번째 사이클에서 3분 째에 최대 수준에 도달한다. 흥미롭게도, 낮은 빛 상태의 사이클에서는 NPQ 는 반대 패턴을 보여준다. 첫 번째 사이클에서, 낮은 빛 상태의 사이클 동안 NPQ 수준은 VPZ 라인에서 더 높으며, 그러나 두 번째 사이클에서 NPQ 수준은 VPZ 및 WT에서 똑같으며, 마지막 3 사이클에서는 VPZ 라인에서 상당히 더 낮다.

Description

광합성 효율 및 성장이 증가된 형질전환 식물

관련된 출원과의 교차 참고

본 출원은 그 전문이 참고 문헌으로 포함된 2016년 5월 27일에 출원된 U.S. Prov. App. No. 62/342,248호의 이익을 청구하는 것이다.

ASCII 텍스트 파일(ASCII TEXT FILE)로 리스트 된 서열의 제출

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기술분야

본 발명은 식물의 광합성 효율 및 성장을 증가시키는 방법에 관한 것이다.

식물 캐노피(plant canopies)에서의 햇빛의 강도는 매우 다이나믹하고 식물의 잎들은 흡수되는 조사량(광선량, irradiance)의 수준이 매우 급격하게 변동하는 것을 일상적으로 경험한다. 흡수되는 에너지를 사용하기 위한 광화학을 위해 빛의 강도가 너무 높거나 또는 너무 빨리 증가하면 광합성 안테나 복합체(photosynthetic antenna complex)가 과도하게 흥분되는 것을 막기 위해 몇 가지 광-보호 기전들이 유도된다. 광계 II 안테나 복합체(photosystem II (PSII)antenna complex)에서의 과도한 흥분 에너지 (excitation energy)는 유도가능한 보호적인 과정을 통해 아무 해가 없이 열로서 분산이 되며, 이는 관찰가능하고 때로는 클로로필 플루오레센스의 비-광화학 소멸로도 불린다(non-photochemical quenching of chlorophyll fluorescence (NPQ; Muller et al. Plant Physiol. Vol 125, 1558-1566, 2000). NPQ에서의 변화는 빠를 수 있으나 즉시는 아니며, 따라서 흡수된 광선에서는 변동 후에 뒤따를 수 있다. NPQ의 이완(relaxation)의 비율은 유도 비율보다 상당히 느리며, 이 비대칭성은 과도한 빛 컨디션에 오랫동안 또는 반복적인 노출에 의해 악화된다. 이러한 PSII 안테나의 소멸(quenched)로부터 비소멸(unquenched) 상태로의 상대적으로 느린 회복율은 광합성적인 양자 수율(quantum yield) 및 관련되는 CO₂ 고정이 높은 강도에서 낮은 강도의 빛으로 변화함에 따라 NPO에 의해 일시적으로 제한될 수 있음을 암시한다. 이 가정을 시뮬레이션 모델과 작물 캐노피(canopy)에 통합시켜 테스트했을 때, 해당하는 CO₂ 고정의 손실이 7.5%-30% 사이임으로 예측되었다(Zhu et al. J. Exp. Bot. Vol 55, 1167-1175, 2004). 이러한 계산에 근거하여, NPO의 이완율 증가는 광합성 효율을 개선시킬 수 있는 가능한 전략을 제안하나, 실험적으로는 아직 증명이 되지 못하고 있다.

정확한 NPO 소멸 부위 및 관련되는 소멸기전의 성격이 아직도 밝혀지고 있는 반면, NPQ가 일어나기 위해, PSII-연관된 안테나가 대비적 시간 항수(contrasting time constant)로 많은 다른 기전을 통해 유도될 수 있는 소멸 상태로의 구조적 변화를 거칠 필요가 있는 것이 분명하다. 고등 식물에서 지배적이고 만국적으로 알려진 NPQ의 기전은 소위 에너지-의존적 소멸(quenching)(qE) 이다. 에너지-의존적 소멸(qE) 유도는 낮은 틸라코이드(thylakoid) 내강(lumen)의 pH를 요구하며, 광계(photosystem) II 서브유닛 S(PsbS)의 존재 및 가역적인 엽황소(크산토필) 색소 사이클(xanthophyll pigment cycle)을 통한 비올라크산틴(violaxanthin)의 안테락크산틴(antheraxanthin) 및 제아크산틴(zeaxanthin)으로의 디-에폭시화(de-epoxidation)에 의해 큰 도움이 된다.

PsbS의 과발현은 qE 형성의 증폭에 큰 영향을 미치며, qE의 유도 및 이완율의 증가의 결과를 가져오나, 비교적 스트레스가 적은 조건 하에서는 광합성 양자 수율(photosynthetic quantum yield)과 경쟁할 수 있다. 그러므로, PsbS 과발현을 통한 qE의 증강은 고량의 빛 또는 빨리 변동하는 조건 하에서는 증가된 광-보호 효과를 제공할 수 있는 반면에, CO₂ 고정 및 식물 성장에서의 PsbS 과발현만의 양성적 효과는 지배적인 빛의 환경에 많이 의존한다. NPQ를 조절하는 다른 루트는 가역적인 엽황소(크산토필) 색소 사이클을 수정하는 것이다. 리코펜(lycopene)으로부터 카로테노이드(carotenoid, (카로틴 및 엽황소(carotenes & xanthophyll))의 생합성 경로의 도식적인 그림이 도 17에 나타나있다. 제아크산틴(zeaxanthin)의 축적은 몇몇의 NPQ 성분(qE, qZ, 및 qI)과 관계가 있다. 과도한 빛이 있을 때 비올라크산틴이 제아크산틴으로 전환되는 것은 비올라크산틴 효소(VDE)에 의해 촉진된다. 제아크산틴이 비올라크산틴으로 전환되는 것은 에폭시다제 효소(ZEP)에 의해 촉진된다. 엽황소(크산토필) 색소 풀(xanthophyll pigment pool) 크기가 증가된 애기장대(Arabidopsis) 돌연변이는 NPQ의 증폭에는 영향이 없었던 반면에 NPQ 형성 및 이완율은 느린 것으로 나타났다. 흥미롭게도, 이 돌연변이 및 야생형 대조군 식물에서 NPQ 형성 및 이완 율은 엽황소(크산토필) 색소 풀의 디-에폭시화(de-epoxidation) 상태에 따라 주로 조절되는 것으로 나타났다. 닐켄 등(Nilkens et al. Biochimica et Biophysica Acta 1797; 466-475 (2010))은 특히 제아크산틴 에폭시화(epoxidation) 키네틱스(kinetics)는 NPQ의 이완율과 강한 연관관계가 있는 것을 보여주었다. 그러므로, 엽황소(크산토필) 사이클 평형 조절 비율은 NPQ 생성 및 이완율에 대한 조절도 가지며, 비올라크산틴 디-에폭시다제(VDE) 및 제아크산틴 에폭시다제(ZEP)에 의한 턴오버(turn-over) 속도에 대한 상대적인 엽황소(크산토필) 색소 풀의 크기에 의해 영향을 받는 것 같다.

NPQ가 높은 빛 강도에서 광-보호를 유지하면서, 낮은 빛의 강도에서 광합성 양자 수율과의 순간적인 경쟁을 감소시키도록 조절될 수 있는지 여부는 아직 결정되지 않았다. 변동하는 빛 조건 하에서 향상된 양자 수율 및 CO₂ 고정을 가진 식물들은 식물 성장 및 작물 수율의 개선을 제공할 수 있다.

발명의 요약

본 발명의 일 측면은 PsbS, ZEP 및 VDE 를 암호화하는 하나 이상의 이종 뉴클레오티드 서열을 가진 형질전환된 식물에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 뉴클레오티드 서열은 쌍떡잎 식물로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 뉴클레오티드 서열은 애기장대(Arabidopsis thaliana)에서 유래된다. 일부 실시양태에서, 형질전환 식물은 PsbS, ZEP 및 VDE를 암호화하는 하나 이상의 이종의 뉴클레오티드 서열을 가진다. 일부 실시양태에서, PsbS는 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된다. 일부 실시양태에서, ZEP는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된다. 일부 실시양태에서, VDE는 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된다. 일부 실시양태에서, PsbS는 서열번호 1과 적어도 90%의 상동성을 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된다. 일부 실시양태에서, ZEP는 서열번호 2와 적어도 90%의 상동성을 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된다. 일부 실시양태에서, VDE는 서열번호 3과 적어도 90%의 상동성을 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된다. 일부 실시양태에서, PsbS는 서열번호 1과 적어도 70%의 상동성을 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된다. 일부 실시양태에서, ZEP는 서열번호 2와 적어도 70%의 상동성을 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된다. 일부 실시양태에서, VDE는 서열번호 3과 적어도 70%의 상동성을 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된다. 일부 실시양태에서, PsbS는 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, ZEP는 서열번호 5의 아미노산 서열을 가진다. 일부 실시양태에서, VDE는 서열번호 6의 아미노산 서열을 가진다. 일부 실시양태에서, PsbS는 서열번호 4와 적어도 90%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, ZEP는 서열번호 5와 적어도 90%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, VDE는 서열번호 6과 적어도 90%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, PsbS는 서열번호 4와 적어도 70%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, ZEP는 서열번호 5와 적어도 70%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, VDE는 서열번호 6과 적어도 70%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, PsbS는 서열번호 7의 보존된 도메인(conserved domain)을 더 포함한다. 일부 실시양태에서, ZEP는 서열번호 8의 보존된 도메인을 더 포함한다. 일부 실시양태에서, VDE는 서열번호 9의 보존된 도메인을 더 포함한다. 상기 서술된 일부 실시양태에서, 상기 식물은 작물 식물(crop plant), 모델 식물(model plant), 외떡잎 식물(monocotyledonous plant), 쌍떡잎 식물(dicotyledonous plant), 크레슐산(CAM) 대사 광합성 식물(plant with Crassulacean acid metabolism photosynthesis), C3 광합성 식물(plant with C3 photosynthesis), C4 광합성 식물(plant with C4 photosynthesis), 일년생 식물(annual plant), 온실 식물(greenhouse plant), 원예 꽃 식물(horticultural flowering plant), 다년생 식물(perennial plant), 스위치그라스 식물(switchgrass plant), 옥수수 식물(maize plant), 바이오매스 식물(biomass plant), 또는 사탕수수 식물(sugarcane plant)이다. 상기 서술된 일부 실시양태에서, 상기 식물은 스위치그라스, 억새속(Miscanthus), 개자리속(Medicago), 단수수(sweet sorghum), 곡용 수수(grain sorghum), 사탕수수(sugarcane), 에너지 수수(energy cane), 코끼리 풀(elephant grass), 옥수수(maize), 카사바(cassava), 동부(cowpea), 밀(wheat), 보리(barley), 귀리(oats), 쌀(rice), 대두(soybean), 팜유(oil palm), 잇꽃(safflower), 참깨(sesame), 담배(tobacco), 아마(flax), 목화(cotton), 해바라기(sunflower), 양구슬냉이속(Camelina), 유채(Brassica napus), 브라시카 카리나타(Brassica carinata), 갓(Brassica juncea), 펄 밀렛(pearl millet), 조(foxtail millet), 다른 곡물(other grain), 쌀(rice), 오일시드(oilseed), 채소 작물(vegetable crop), 사료 작물(forage crop), 공예 작물(industrial crop), 목본 작물(woody crop) 또는 바이오매스 작물(biomass crop)이다. 일부 실시양태에서, 상기 식물은 담배(Nicotiana tabacum) 이다. 일부 실시양태에서, 상기 식물은 옥수수(Zea mays)이다. 일부 실시양태에서, 상기 식물은 쌀(Oryza sativa)이다. 일부 실시양태에서, 상기 식물은 수수(Sorghum bicolor)이다. 일부 실시양태에서, 상기 식물은 대두(Glycine max) 이다. 일부 실시양태에서, 상기 식물은 동부(Vigna unguiculata)이다. 일부 실시양태에서, 상기 식물은 포플러(Populus spp .)이다. 일부 실시양태에서, 상기 식물은 유칼립투스(Eucalyptus spp.)이다. 일부 실시양태에서, 상기 식물은 카사바(Manihot esculenta)이다. 일부 실시양태에서, 상기 식물은 보리(Hordeum vulgare)이다. 일부 실시양태에서, 상기 식물은 감자(Solanum tuberosum)이다. 일부 실시양태에서, 상기 식물은 사탕수수(Saccharum spp.)이다. 일부 실시양태에서, 상기 식물은 알팔파(Medicago sativa)이다. 상기 서술된 일부 실시양태에서, 상기 식물은 변동하는 광 조건 하에 있는 대조군 식물과 비교하여 변동하는 광 조건 하에서 성장이 증가된다. 상기 서술된 일부 실시양태에서, 상기 식물은 변동하는 광 조건 하에 있는 대조군 식물과 비교하여 변동하는 광 조건 하에서 광합성 효율이 증가된다. 상기 서술된 일부 실시양태에서, 상기 식물은 변동하는 광 조건 하에 있는 대조군 식물과 비교하여 변동하는 광 조건 하에서 광보호(photoprotection) 효율이 향상된다. 상기 서술된 일부 실시양태에서, 상기 식물은 변동하는 광 조건 하에 있는 대조군 식물과 비교하여 변동하는 광 조건 하에서 양자 수율(quantum yield) 및 CO₂ 고정(fixation)이 향상된다. 상기 서술된 일부 실시양태에서, 상기 식물은 엘리트 라인(elite line) 또는 엘리트 계통(elite strain)이다. 상기 서술된 일부 실시양태에서, 상기 식물은 제초제(herbicide) 저항성, 곤충 또는 해충 저항성, 질병 저항성, 변형된 지방산 대사, 및/또는 변형된 탄수화물 대사를 제공하는 적어도 하나 이상의 추가적인 폴리펩타이드의 발현을 더 포함한다.

본 발명의 또 다른 측면은 PsbS, ZEP, 및/또는 VDE를 암호화하는 하나 이상의 이종의 뉴클레오티드 서열을 갖는 발현 벡터에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 상기 벡터는 Rbcs1A, GAPA-1 또는 FBA2 의 프로모터를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 Rbcs1A 프로모터는 ZEP의 발현을 유도하고, GAPA-1 프로모터는 PsbS 의 발현을 유도하고, FBA2 프로모터는 VDE의 발현을 유도한다. 일부 실시양태에서, 상기 벡터는 T-DNA 이다. 일부 실시양태에서, 상기 벡터는 항생제 내성을 제공하는 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 벡터는 발현 조절 서열, 및 PsbS, ZEP 및 VDE 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 플랭킹하는 좌측 경계(left border, LB) 및 우측 경계(right border, RB) 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, PsbS는 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된다. 일부 실시양태에서, ZEP는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된다. 일부 실시양태에서, VDE는 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된다. 일부 실시양태에서, PsbS는 서열번호 1과 적어도 90%의 상동성을 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된다. 일부 실시양태에서, ZEP는 서열번호 2와 적어도 90%의 상동성을 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된다. 일부 실시양태에서, VDE는 서열번호 3과 적어도 90%의 상동성을 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된다. 일부 실시양태에서, PsbS는 서열번호 1과 적어도 70%의 상동성을 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된다. 일부 실시양태에서, ZEP는 서열번호 2와 적어도 70%의 상동성을 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된다. 일부 실시양태에서, VDE는 서열번호 3과 적어도 70%의 상동성을 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된다. 일부 실시양태에서, PsbS는 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, ZEP는 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, VDE는 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, PsbS는 서열번호 4와 적어도 90%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, ZEP는 서열번호 5와 적어도 90%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, VDE는 서열번호 6과 적어도 90%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, PsbS는 서열번호 4와 적어도 70%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, ZEP는 서열번호 5와 적어도 70%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, VDE는 서열번호 6과 적어도 70%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, PsbS는 서열번호 7의 보존된 도메인을 더 포함한다. 일부 실시양태에서, ZEP는 서열번호 8의 보존된 도메인을 더 포함한다. 일부 실시양태에서, VDE는 서열번호 9의 보존된 도메인을 더 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 발현 벡터는 박테리아 세포 내에 존재한다. 상기 서술된 일부 실시양태에서, 상기 발현 벡터는 아그로박테리움(Agrobacterium) 세포 내에 존재한다. 상기 서술된 일부 실시양태에서, 상기 발현 벡터는 형질전환 식물을 생산하는데 사용된다. 상기 서술된 일부 실시양태에서, 상기 형질전환 식물은 종자를 생산한다. 상기 서술된 일부 실시양태에서, 상기 종자는 자손 식물(progeny plant)을 더 생산한다.

본 발명의 다른 측면은 식물에서 광합성 및 성장을 증가시키는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 본원에 서술된 2개 이상의 폴리펩타이드의 식물 내 발현을 증가시키는 단계를 포함한다. 일 측면에서, 본 발명은 변동하는 광 조건 하에서 식물의 성장을 증가시키는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 PsbS, ZEP, 및 VDE로부터 적어도 2개 이상의 폴리펩타이드의 식물 내 발현을 증가시켜, 대조군 식물과 비교하여 2개 이상의 폴리펩타이드의 발현이 증가된 식물을 생산하는 단계를 포함한다. 일 측면에서, 본 발명은 변동하는 광 조건 하에서 식물에서 광합성 효율을 증가시키는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 PsbS, ZEP, 및 VDE로부터 적어도 2개 이상의 폴리펩타이드의 식물 내 발현을 증가시켜, 대조군 식물과 비교하여 2개 이상의 폴리펩타이드의 발현이 증가된 식물을 생산하는 단계를 포함한다. 일 측면에서, 본 발명은 변동하는 광 조건 하에서 식물에서 광 보호 효율을 증가시키는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 PsbS, ZEP, 및 VDE로부터 적어도 2개 이상의 폴리펩타이드의 식물 내 발현을 증가시켜, 대조군 식물과 비교하여 상기 2개 이상의 폴리펩타이드의 발현이 증가된 식물을 생산하는 단계를 포함한다. 일 측면에서, 본 발명은 변동하는 광 조건 하에서 식물에서 양자 수율 및 CO₂고정을 증가시키는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 PsbS, ZEP, 및 VDE로부터 적어도 2개 이상의 폴리펩타이드의 식물 내 발현을 증가시켜, 대조군 식물과 비교하여 상기 2개 이상의 폴리펩타이드의 발현이 증가된 식물을 생산하는 단계를 포함한다. 일 측면에서, 본 발명은 변동하는 광 조건 하에서 식물 내 비-광화학적 소멸(non-photochemical quenching, NPQ)의 이완율을 증가시키는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 PsbS, ZEP, 및 VDE로부터 적어도 2개 이상의 폴리펩타이드의 식물 내 발현을 증가시켜, 대조군 식물과 비교하여 상기 2개 이상의 폴리펩타이드의 발현이 증가된 식물을 생산하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, PsbS 및 ZEP의 발현이 증가된다. 일부 실시양태에서, PsbS 및 VDE의 발현이 증가된다. 일부 실시양태에서, VDE 및 ZEP의 발현이 증가된다. 일부 실시양태에서, PsbS, ZEP, 및 VDE의 발현이 증가된다. 일부 실시양태에서, PsbS, ZEP, 및/또는 VDE의 발현은 PsbS, ZEP 및/또는 VDE를 암호화하는 하나 이상의 이종의 뉴클레오티드 서열을 발현시킴으로써 증가된다. 일부 실시양태에서, PsbS, ZEP, 및/또는 VDE의 발현은 PsbS, ZEP 및/또는 VDE의 프로모터 부위를 변형시켜 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 프로모터 변형은 유전체(genome) 편집 시스템에 의해 달성된다. 일부 실시양태에서, 상기 유전체 편집 시스템은 크리스퍼 (CRISPER)이다.

본 발명의 또 다른 측면은 변동하는 광 조건 하에서 성장 특성이 향상된 식물을 선별하는 방법에 관한 것으로, 하기의 단계를 포함한다; 식물 집단을 제공하는 단계; PsbS, ZEP 및 VDE 중 임의의 것의 활성을 증가시키도록 상기 식물들의 집단을 변형시키는 단계; 상기 식물 내 변동하는 광 조건 하에서 비-광화학적 소멸(NPQ)의 수준을 검출하는 단계; 변동하는 광 조건 하에 있는 NPQ의 대조군 수준과 상기 식물 내 변동하는 광 조건 하에서 상기 NPQ의 수준을 비교하는 단계; 상기 식물이 높은 빛의 세기에서 낮은 빛의 세기로 전이될 때 NPQ 이완율이 증가된 식물을 선별하는 단계. 일부 실시양태에서, 상기 NPQ의 대조군 수준은 상기 집단 내 NPQ의 최저 수준이다. 일부 실시양태에서, 상기 NPQ의 대조군 수준은 상기 집단 내 NPQ의 중간 수준이다. 일부 실시양태에서, 상기 NPQ의 대조군 수준은 상기 집단 내 NPQ의 평균 수준이다. 일부 실시양태에서, 상기 NPQ의 대조군 수준은 대조군 식물체 내 NPQ의 수준이다. 일부 실시양태에서, 상기 식물은 돌연변이원(mutagen)으로 PsbS, ZEP 및/또는 VDE 내 하나 이상의 돌연변이를 유도함으로써 변형된다. 일부 실시양태에서, 상기 돌연변이원은 에탄 메틸 설포네이트(ethane methyl sulfonate, EMS)이다. 일부 실시양태에서, 상기 식물은 형질전환 기술을 이용하여 이종의 PsbS, ZEP 및/또는 VDE를 도입함으로써 변형된다. 일부 실시양태에서, 상기 식물은 유전체 편집 시스템을 이용하여 PsbS, ZEP 및/또는 VDE의 프로모터를 변형시킴으로써 변형된다. 일부 실시양태에서, 상기 유전체 편집 시스템은 CRISPR이다. 본 발명의 또 다른 측면은 하기의 단계를 포함하는, 변동하는 광 조건 하에서 성장 특성의 향상과 연관된 뉴클레오티드 서열 다형성(nucleotide sequence polymorphism)을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다: 식물 집단을 제공하는 단계; 상기 식물 집단 내에서 PsbS, ZEP 및 VDE 중 임의의 것을 조절 및/또는 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 얻는 단계; 상기 식물 집단 내에서 PsbS, ZEP 및 VDE 중 임의의 것을 조절 및/또는 암호화하는 뉴클레오티드 서열에서 하나 이상의 다형성을 얻는 단계; 상기 식물 집단 내에서 높은 빛의 세기에서 낮은 빛의 세기로 전이될 때 비-광화학적 소멸(NPQ) 이완율을 검출하는 단계; 식물 집단 내에서 NPQ 이완율과 연관성을 결정하기 위한 통계 분석을 수행하는 단계; 및 NPQ 이완율과 통계적으로 유의한 연관성을 갖는 다형성을 선별하는 단계. 일부 실시양태에서, 상기 다형성은 단일염기 다형성(single nucleotide polymorphism, SNP)이다. 일부 실시양태에서, 상기 다형성은 PsbS, ZEP 및 VDE의 프로모터 내 위치한다. 일부 실시양태에서, 상기 다형성은 서열 결정(sequence determination)으로 검출된다. 일부 실시양태에서, 상기 다형성은 겔 전기영동(gel electrophoresis)에 의해 검출된다. 일부 실시양태에서, 상기 다형성은 변동이 있는 광 조건에서 성장 특성이 향상된 식물을 선별하기 위해 식물의 집단을 스크리닝하는 데 추가로 사용된다. 일부 실시양태에서, 상기 다형성은 변동이 있는 광 조건에서 식물의 성장 특성을 향상시키기 위해 PsbS, ZEP 및 VDE 내 유전체 편집을 위한 표적으로서 추가로 사용된다. 상기 서술된 일부 실시양태에서, 상기 향상된 성장 특성은 성장 향상, 광합성 효율의 향상, 광보호 효율의 향상, 양자 수율의 향상, 및/또는 CO₂ 고정의 향상이다. 상기 서술된 일부 실시양태에서, 식물 내 NPQ는 엽록소(chlorophyll) 형광을 측정함으로써 검출된다.

상기 서술된 일부 실시양태에서, 상기 향상된 성장 특성은 성장 향상이다. 상기 서술된 일부 실시양태에서, 상기 향상된 성장 특성은 광합성 효율의 향상이다. 상기 서술된 일부 실시양태에서, 상기 향상된 성장 특성은 광보호 효율의 향상이다. 상기 서술된 일부 실시양태에서, 상기 향상된 성장 특성은 양자 수율의 향상 및 CO₂ 고정의 향상이다. 상기 서술된 일부 실시양태에서, 상기 향상된 성장 특성은 비-광화학적 소멸 (NPQ)의 이완율의 증가이다. 어떤 일부 실시양태에서, NPQ는 엽록소(chlorophyll) 형광 이미지를 사용하여 검출된다.

상기 실시양태 중 임의의 것과도 결합될 수 있는 일부 실시양태에서, PsbS는 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된다. 상기 실시양태 중 임의의 것과도 결합될 수 있는 일부 실시양태에서, ZEP는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된다. 상기 실시양태 중 임의의 것과도 결합될 수 있는 일부 실시양태에서, VDE는 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된다. 상기 실시양태 중 임의의 것과도 결합될 수 있는 일부 실시양태에서, PsbS는 서열번호 1과 적어도 90%의 상동성을 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된다. 상기 실시양태 중 임의의 것과도 결합될 수 있는 일부 실시양태에서, ZEP는 서열번호 2와 적어도 90%의 상동성을 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된다. 상기 실시양태 중 임의의 것과도 결합될 수 있는 일부 실시양태에서, VDE는 서열번호 3과 적어도 90%의 상동성을 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된다. 상기 실시양태 중 임의의 것과도 결합될 수 있는 일부 실시양태에서, PsbS는 서열번호 1과 적어도 70%의 상동성을 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된다. 상기 실시양태 중 임의의 것과도 결합될 수 있는 일부 실시양태에서, ZEP는 서열번호 2와 적어도 70%의 상동성을 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된다. 상기 실시양태 중 임의의 것과도 결합될 수 있는 일부 실시양태에서, VDE는 서열번호 3과 적어도 70%의 상동성을 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된다. 상기 실시양태 중 임의의 것과도 결합될 수 있는 일부 실시양태에서, PsbS는 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는다. 상기 실시양태 중 임의의 것과도 결합될 수 있는 일부 실시양태에서, ZEP는 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는다. 상기 실시양태 중 임의의 것과도 결합될 수 있는 일부 실시양태에서, VDE는 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는다. 상기 실시양태 중 임의의 것과도 결합될 수 있는 일부 실시양태에서, PsbS는 서열번호 4와 적어도 90%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다. 상기 실시양태 중 임의의 것과도 결합될 수 있는 일부 실시양태에서, ZEP는 서열번호 5와 적어도 90%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다. 상기 실시양태 중 임의의 것과도 결합될 수 있는 일부 실시양태에서, VDE는 서열번호 6과 적어도 90%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다. 상기 실시양태 중 임의의 것과도 결합될 수 있는 일부 실시양태에서, PsbS는 서열번호 4와 적어도 70%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다. 상기 실시양태 중 임의의 것과도 결합될 수 있는 일부 실시양태에서, ZEP는 서열번호 5와 적어도 70%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다. 상기 실시양태 중 임의의 것과도 결합될 수 있는 일부 실시양태에서, VDE는 서열번호 6과 적어도 70%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다. 상기 실시양태 중 임의의 것과도 결합될 수 있는 일부 실시양태에서, PsbS는 서열번호 7의 보존된 도메인을 더 포함한다. 상기 실시양태 중 임의의 것과도 결합될 수 있는 일부 실시양태에서, ZEP는 서열번호 8의 보존된 도메인을 더 포함한다. 상기 실시양태 중 임의의 것과도 결합될 수 있는 일부 실시양태에서, VDE는 서열번호 9의 보존된 도메인을 더 포함한다. 상기 실시양태 중 임의의 것과도 결합될 수 있는 일부 실시양태에서, 상기 식물은 작물 식물(crop plant), 모델 식물(model plant), 외떡잎 식물(monocotyledonous plant), 쌍떡잎 식물(dicotyledonous plant), 크레슐산(CAM) 대사 광합성 식물(plant with Crassulacean acid metabolism photosynthesis), C3 광합성 식물(plant with C3 photosynthesis), C4 광합성 식물(plant with C4 photosynthesis), 일년생 식물(annual plant), 온실 식물(greenhouse plant), 원예 꽃 식물(horticultural flowering plant), 다년생 식물(perennial plant), 스위치그라스 식물(switchgrass plant), 옥수수 식물(maize plant), 바이오매스 식물(biomass plant), 또는 사탕수수 식물(sugarcane plant)이다. 상기 실시양태 중 임의의 것과도 결합될 수 있는 일부 실시양태에서, 상기 식물은 스위치그라스, 억새속(Miscanthus), 개자리속(Medicago), 단수수(sweet sorghum), 곡용 수수(grain sorghum), 사탕수수(sugarcane), 에너지 수수(energy cane), 코끼리 풀(elephant grass), 옥수수(maize), 카사바(cassava), 동부(cowpea), 밀(wheat), 보리(barley), 귀리(oats), 쌀(rice), 대두(soybean), 팜유(oil palm), 잇꽃(safflower), 참깨(sesame), 담배(tobacco), 아마(flax), 목화(cotton), 해바라기(sunflower), 양구슬냉이속(Camelina), 유채(Brassica napus), 브라시카 카리나타(Brassica carinata), 갓(Brassica juncea), 펄 밀렛(pearl millet), 조(foxtail millet), 다른 곡물(other grain), 쌀(rice), 오일시드(oilseed), 채소 작물( vegetable crop), 사료 작물(forage crop), 공예 작물(industrial crop), 목본 작물(woody crop) 또는 바이오매스 작물(biomass crop)이다. 상기 실시양태 중 임의의 것과도 결합될 수 있는 일부 실시양태에서, 상기 식물은 담배(Nicotiana tabacum)다. 상기 실시양태 중 임의의 것과도 결합될 수 있는 일부 실시양태에서, 상기 식물은 옥수수(Zea mays)다. 상기 실시양태 중 임의의 것과도 결합될 수 있는 일부 실시양태에서, 상기 식물은 쌀(Oryza sativa)이다. 상기 실시양태 중 임의의 것과도 결합될 수 있는 일부 실시양태에서, 상기 식물은 수수(Sorghum bicolor)이다. 상기 실시양태 중 임의의 것과도 결합될 수 있는 일부 실시양태에서, 상기 식물은 대두(Glycine max)다. 상기 실시양태 중 임의의 것과도 결합될 수 있는 일부 실시양태에서, 상기 식물은 상기 동부(Vigna unguiculata)이다. 상기 실시양태 중 임의의 것과도 결합될 수 있는 일부 실시양태에서, 상기 식물은 포플러(Populus spp .)이다. 상기 실시양태 중 임의의 것과도 결합될 수 있는 일부 실시양태에서, 상기 식물은 유칼립투스(Eucalyptus spp.)이다. 상기 실시양태 중 임의의 것과도 결합될 수 있는 일부 실시양태에서, 상기 식물은 카사바(Manihot esculenta)이다. 상기 실시양태 중 임의의 것과도 결합될 수 있는 일부 실시양태에서, 상기 식물은 보리(Hordeum vulgare)다. 상기 실시양태 중 임의의 것과도 결합될 수 있는 일부 실시양태에서, 상기 식물은 감자(Solanum tuberosum)다. 상기 실시양태 중 임의의 것과도 결합될 수 있는 일부 실시양태에서, 상기 식물은 사탕수수(Saccharum spp.)이다. 상기 실시양태 중 임의의 것과도 결합될 수 있는 일부 실시양태에서, 상기 식물은 알팔파(Medicago sativa)이다..

상기 실시양태 중 임의의 것과도 결합될 수 있는 일부 실시양태에서, 상기 식물에서 VDE의 전사 수준이 대조군 식물과 비교하여 3배 증가된다. 상기 실시양태 중 임의의 것과도 결합될 수 있는 일부 실시양태에서, 상기 식물에서 PsbS의 전사 수준이 대조군 식물과 비교하여 3배 증가된다. 상기 실시양태 중 임의의 것과도 결합될 수 있는 일부 실시양태에서, 상기 식물에서 ZEP의 전사 수준이 대조군 식물과 비교하여 8배 증가된다. 상기 실시양태 중 임의의 것과도 결합될 수 있는 일부 실시양태에서, 상기 식물에서 VDE의 전사 수준이 대조군 식물과 비교하여 10배 증가된다. 상기 실시양태 중 임의의 것과도 결합될 수 있는 일부 실시양태에서, 상기 식물에서 PsbS의 전사 수준이 대조군 식물과 비교하여 3배 증가된다. 상기 실시양태 중 임의의 것과도 결합될 수 있는 일부 실시양태에서, 상기 식물에서 ZEP의 전사 수준이 대조군 식물과 비교하여 6배 증가된다. 상기 실시양태 중 임의의 것과도 결합될 수 있는 일부 실시양태에서, 상기 식물에서 VDE의 전사 수준이 대조군 식물과 비교하여 4배 증가된다. 상기 실시양태 중 임의의 것과도 결합될 수 있는 일부 실시양태에서, 상기 식물에서 PsbS의 전사 수준이 대조군 식물과 비교하여 1.2배 증가된다. 상기 실시양태 중 임의의 것과도 결합될 수 있는 일부 실시양태에서, 상기 식물에서 ZEP의 전사 수준이 대조군 식물과 비교하여 7배 증가된다. 상기 실시양태 중 임의의 것과도 결합될 수 있는 일부 실시양태에서, 상기 식물에서 VDE의 단백질 수준이 대조군 식물과 비교하여 16배 증가된다. 상기 실시양태 중 임의의 것과도 결합될 수 있는 일부 실시양태에서, 상기 식물에서 PsbS의 단백질 수준이 대조군 식물과 비교하여 2배 증가된다. 상기 실시양태 중 임의의 것과도 결합될 수 있는 일부 실시양태에서, 상기 식물에서 ZEP의 단백질 수준이 대조군 식물과 비교하여 80배 증가된다. 상기 실시양태 중 임의의 것과도 결합될 수 있는 일부 실시양태에서, 상기 식물에서 VDE의 단백질 수준이 대조군 식물과 비교하여 30배 증가된다. 상기 실시양태 중 임의의 것과도 결합될 수 있는 일부 실시양태에서, 상기 식물에서 PsbS의 단백질 수준이 대조군 식물과 비교하여 4배 증가된다. 상기 실시양태 중 임의의 것과도 결합될 수 있는 일부 실시양태에서, 상기 식물에서 ZEP의 단백질 수준이 대조군 식물과 비교하여 74배 증가된다. 상기 실시양태 중 임의의 것과도 결합될 수 있는 일부 실시양태에서, 상기 식물에서 VDE의 단백질 수준이 대조군 식물과 비교하여 47배 증가된다. 상기 실시양태 중 임의의 것과도 결합될 수 있는 일부 실시양태에서, 상기 식물에서 PsbS의 단백질 수준이 대조군 식물과 비교하여 3배 증가된다. 상기 실시양태 중 임의의 것과도 결합될 수 있는 일부 실시양태에서, 상기 식물에서 ZEP의 단백질 수준이 대조군 식물과 비교하여 75배 증가된다. 상기 실시양태 중 임의의 것과도 결합될 수 있는 일부 실시양태에서, 상기 식물에서 VDE, PsbS 및 ZEP 간의 전사 수준의 증가는 대조군 식물과 비교하여 3:3:8, 10:3:6 또는 4:1:2.7이다. 상기 실시양태 중 임의의 것과도 결합될 수 있는 일부 실시양태에서, 상기 식물에서 VDE, PsbS 및 ZEP 간의 단백질 수준의 증가는 대조군 식물과 비교하여 16:2:80, 30:4:74 또는 47:3:75이다. 상기 실시양태 중 임의의 것과도 결합될 수 있는 일부 실시양태에서, 상기 식물에서 VDE의 전사 수준의 증가는 대조군 식물과 비교하여 3배 내지 10배 범위이다. 상기 실시양태 중 임의의 것과도 결합될 수 있는 일부 실시양태에서, 상기 식물에서 PsbS의 전사 수준의 증가는 대조군 식물과 비교하여 약 1.2배 내지 약 3배이다. 상기 실시양태 중 임의의 것과도 결합될 수 있는 일부 실시양태에서, 상기 식물에서 ZEP의 전사 수준의 증가는 대조군 식물과 비교하여 약 6배 내지 약 8배이다. 상기 실시양태 중 임의의 것과도 결합될 수 있는 일부 실시양태에서, 상기 식물에서 VDE의 단백질 수준의 증가는 대조군 식물과 비교하여 16배 내지 약 47배 범위이다. 상기 실시양태 중 임의의 것과도 결합될 수 있는 일부 실시양태에서, 상기 식물에서 PsbS의 단백질 수준의 증가는 대조군 식물과 비교하여 약 2배 내지 약 4배이다. 상기 실시양태 중 임의의 것과도 결합될 수 있는 일부 실시양태에서, 상기 식물에서 ZEP의 단백질 수준의 증가는 대조군 식물과 비교하여 약 74배 내지 약 80배이다.

상기 제시한 것 이외의 특성, 목표 및 장점들은 하기의 상세한 서술을 고려할 때 좀더 명백해 질 것이다. 그러한 상세한 서술은 하기의 그림들을 참조로 하며, 상기:
도 1. (A) 1000 μmol m^-2 s^-1 PFD 로 10 분간 조명(illumination)하고 이어서 10분간 암 이완(dark relaxation) 하는 동안의 야생형 및 3개(VDE-PsbS-ZEP) VPZ 과발현 라인(line)들의 어린 묘목들에서 비-광화학적 소멸. (B) 2000 μmol m^-2 s^-1 PFD 로 3 분간, 이어서 200 μmol m^-2 s^-1 PFD 로 2 분간 조명(illumination)하는 반복 사이클 하는 동안의 어린 묘목에서의 비-광화학적 소멸 및 (C) PSII 효율. 에러 바(error bar) 는 ± se (n=18) 를 나타내고, 별표(asterisk)는 VPZ 라인과 야생형 라인 사이의 유의한 차이 (α= 0.05)를 표시한다.
도 2. 자연(native(Nt)) 및 형질전환된(transgenic (At)) 비올라크산틴 디-에폭시다제 (VDE), 광계 II 서브유닛 S(PsbS) 및 제아크산틴 에폭시다제의 mRNA 및 단백질 발현. (A-C) 액틴(actin) 및 튜부린(tubuln) 대비한 mRNA 수준, (D-F) 웨스턴 브럿을 덴시토메터(densotimetry)로 측정한 야생 대비한 단백질 수준, 에러 바는 ± se (n=5) 를 나타내고, 별표(asterisk)는 VPZ 라인과 야생형 라인 사이의 유의한 차이 (α= 0.05)를 표시 한다, (G) VDE, PsbS 및 ZEP의 웨스턴 브럿.
도 3. 가스 교환하는 동안 야생형 및 VPZ-과발현 라인의 완전히 펼쳐진 잎에서 흡수되는 빛의 강도로서의 비-광화학적 소멸. 빛의 강도는, 각 단계마다 일정한 상황(steady stat)이 되도록 기다리면서, 낮은 데서 높은 PFD 로 증가시키거나 (A), 각 빛의 강도를 바꾸기 전에, 2000 μmol m^-2 s^- ¹ 로 4 분간, 높은 PFD 에서 낮은 PFD로 다양하게 변화시켰다(B). 에러 바는 ± se (n=6) 를 나타내고, 별표 (asterisk)는 VPZ 라인과 야생형 라인 사이의 유의한 차이 (α= 0.05)를 표시한다.
도 4. (A-B) 빛의 강도 대비 선상 전자 수송(linear electron transport)(J) 및 총 동화율(net assimilation rate) (An) 및 초기 기울기에 대한 해당 매개변수 적합 (C-D). 빛의 강도는 각 빛의 강도를 바꾸기 전에, 2000 μmol m^-2 s^-1 로 4 분 동안, 높은 PFD 에서 낮은 PFD으로 다양하게 변화시켰다. 각 에러 바는 ± se (n=6) 를 나타내고, 별표(asterisk)는 VPZ 라인과 야생형 라인 사이의 유의한 차이 (α= 0.05)를 표시한다.
도 5. VPZ 과발현 라인 및 야생형 묘목에서 2000 μmol m^-2 s^-1 PFD (λ_max = 470nm)에 한 시간 (A) 또는 두 시간(B) 노출 후의 광-보호 계수. 계수 값 1 미만은 광-저해가 나타남을 표시한다. (C) 어린 묘목에서 2000 μmol m^-2 s^-1 에 1 시간(상향 삼각형-VPZ, 원-WT) 또는 두 시간(하향삼각형-VPZ, 사각형-WT)동안 노출 시키고, 이어서 10 분 동안 암 이완(dark relaxtion) 시킨 후의 잔여 NPQ 에 대한 PSII 효율 플럿. 에러 바는 ± se (n=18) 를 나타내고, 별표(asterisk)는 VPZ 라인과 야생형 라인 사이의 유의한 차이 (α= 0.05)를 표시한다.
도 6. WT 대비한 그린하우스 실험에서 최종 식물의 크기 및 무게. (A) 각 식물 당 총 건조-무게, (B) 식물 당 잎 면적, (C) 식물 길이, (D) 식물 당 잎 건조-무게, (E) 각 식물 당 줄기 건조-무게, (F) 각 식물 당 뿌리건조-무게. 에러 바는 ± se (n=20 및 n=19, 실험 1 및 2에서)를 나타내고, 별표 (asterisk) 는 VPZ 라인과 야생형 라인 사이의 유의한 차이 (α= 0.05)를 표시한다.
도 7. 빛의 강도 대비 선상 전자 수송 (linear electron transport) 및 총 동화 율 (net assimilation rate). 빛의 강도는 각 빛의 강도를 바꾸기 전에, 2000 μmol m^-2 s^- ¹ 로 4 분간, 높은 PFD 에서 낮은 PFD으로 다양하게 변화시켰다. (A-B) 선상 전자 수송 (linear electron transport) (J) 및 총 동화율 (net assimilation rate) (An) 및 초기 기울기 (C-D), 볼록면 (convexity)(E-F), 점근선 (G-H) 에 대한 해당 매개변수 적합. 에러 바는 ± se (n=6)를 표시한다.
도 8. 빛의 강도 대비 선상 전자 수송 (linear electron transport) 및 총 동화 율 (net assimilation rate)에 대한 볼록면 (A-B) 및 점근선 (C-D) 매개변수 적합. 빛의 강도는 각 빛의 강도를 바꾸기 전에, 2000 μmol m^-2 s^-1 PFD 4 분으로, 높은 PFD 에서 낮은 PFD으로 다양하게 변화시켰다. 에러 바는 ± se (n=6) 를 표시한다.
도 9. VDE-PsbS-ZEP의 플라즈미드 지도.
도 10. 빛 강도 변화에 반응하는 광보호 스피드를 증가시키기 위한 의도적인 목표 및 이 과정에서 VDE, PsbS, 및 ZEP가 하는 역할. 오렌지 선 (야생형)에 비교해 푸른 선은 형질전환 식물 이다
도 11. 표현형의 최고속 스크리닝 (fast high throughput screening). 잎 디스크 (leaf disk)의 엽록소 형광 (chlorophyll fluorescence) (왼쪽) 및 어린 묘목의 엽록소 형광 (오른쪽).
도 12. 야생형 대비한 VPZ-23 및 VPZ-34 형질전환 식물의 성장 실험.
도 13. 모든 라인에서 의미 있게 성장이 증가한 온실 (greenhouse) 실험.
도 14. 2000 μmol m^-2 s^-1 PFD 에 잎을 먼저 노출시킨 후 다양한 빛의 강도에서의 양자 수율 및 CO₂고정의 결과들.
도 15. 변동하는 빛 하에서 NPQ 키네틱스 (kinetics).
도 16. 첫 번째 유도/이완에서 NPQ의 시간 항수.
도 17. 비올라크산틴에서 제아크산틴으로의 전환과 연관된 NPQ 성분들 (qE, qZ 및 qI).
도 18. Nicotiana benthamiana 에서의 NPQ-연관된 유전자들의 일시적인 과발현. 위 왼쪽 패널은 600 μmol 광자 (photons) m-2 s-1 에서 13 분 동안 조명(흰색 바) 하고 이어서 10 분 동안 암 (흑색 바) 사이클 두는 동안, FLAG-태그 된 (FLAG-tagged) PsbS, VDE, ZEP, 및 음성 대조군으로 GUS가 과발현된 잎의 점에서의 NPQ의 측정 값을 보여준다. 에러 바는 표준편차(n=6)를 표시한다. 위 오른쪽 패널은 높은 빛에 노출 된 후 10분 후에 PsbS, VDE, ZEP, 및 GUS를 발현하는 잎의 NPQ의 위양성-칼라 이미지를 보여준다. 무지개 바는 상대적인 NPQ의 양을 표시한다. 아래 패널은 위 오른쪽 패널에 있는 잎으로부터 모은 조직을 항-FLAG으로 프로브(probed)한 면역블럿 (immune blot) 분석을 보여준다.
도 19. Nicotiana benthamiana 에서 VDE 및 ZEP의 일시적인 동시 발현은 NPQ 유도 및 이완을 가속화 시킨다. 에러 바는 표준오차(n=4)를 표시한다.
도 20. 형질전환 T₁ 자손의 NPQ 키네틱스(kinetics). DUAL PAM 으로 NPQ의 측정은 600 μmol 광자 (photons) m-2 s-1 (흰색 바)로 10분 조명하고 이어서 10 분 암 사이클 (흑색 바)로 3 종류의 서로 다른 라인: 야생형 분리개체(segregant) (Null) 라인, ZEP 과발현 (ZEP)하는 라인, 및 ZEP 및 VDE (ZEP-VDE) 과발현 하는 라인의 성장된 T₁ 식물의 가장 어린 완전히 발달된 잎에서 얻어졌다. 각 커브는 3개의 다른 식물에서 평균 NPQ 측정값에 해당한다; 에러 바는 표준 오차를 (n=3) 표시한다.
도 21. 안정된 형질전환 T₁ 식물 담배(Nicotiana tabacum cv. Petite Havana) 의 광계 II 양자 수율 (photosystem II quantum yield) (YII).
도 22. 온실에서의 성장 실험. 그림에서는 4셋트의 식물이 보여 준다, 형질 전환 라인 당 하나. 각 셋트는 36 식물이다.
도 23. N . benthamiana 에서 NbPsbS 및 Rbcs1aAtZEP +Gapa1AtPsbS +Fba2AtVDE 구조들의 일시적 과발현.
도 24. (a-c) PsbS, (d-i) ZEP 및 (j-n)VDE의 대표적인 식물 종 에서 NPQ 유전자의 아미노산 정렬 (alignment).
도 25. 온실 조건 하에서 자란 형질전환 된 담배의 잎에서 VDE, PsbS 및 ZEP의 mRNA 및 단백질 수준. (A, C, 및 E) 액틴(actin) 및 튜브린(tublin) 대비한 mRNA 수준. (B, D, 및 F) 면역블럿을 덴시도미터(densitometer)로 측정한 야생형 대비한 단백질 수준(WT). 에러 바 (error bar)는 측정의 표준오차 (standard error measurement, SEM) ((n=5 개 생물학적 복제 (biological replicate))를 의미하며, 별표는 VPZ 라인과 WT 사이의 유의성 있는 차이 (α= 0.05)를 의미한다. (G) VDE, PsbS 및 ZEP의 대표적인 면역블럿.
도 26. 야외 (field) 조건에서 자란 형질전환 된 담배의 잎에서 VDE, PsbS 및 ZEP의 mRNA 및 단백질 수준. (A, C, 및 E) 액틴(actin) 및 튜브린(tublin) 대비한 mRNA 수준. (B, D, 및 F) 면역블럿을 덴시도미터(densitometer)로 측정한 야생형 대비한 단백질 수준(WT). 에러 바는 측정의 표준오차 (standard error measurement, SEM) (n=4)를 의미하며, 별표는 VPZ 라인과 WT 사이의 유의성 있는 차이 (α= 0.05)를 의미한다.
도 27. 형질전환 된 동부 (cowpea) 1643B1 에서 NPQ 이완 키네틱스 (kinetics). X-축은 초단위 시간 이다. Y-축은 정상화한(normalized) NPQ 이다.
도 28. 형질전환 된 동부 (cowpea) 1643B1 에서 NPQ 유도 및 이완 키네틱스. X-축은 시간. Y-축은 4 로 나눈 NPQ.
도 29. 형질전환 된 동부 (cowpea) 1643B1 에서 변동하는 빛 하에서의 NPQ 유도 및 이완 키네틱스. X-축은 시간. Y-축은 4 로 나눈 NPQ. 데이터는 각 세트 내에서 가장 높은 NPQ로 정상화되었다.
도 30. 형질전환 된 동부 (cowpea) CP472A 에서 NPQ 유도 및 이완 키네틱스. X-축은 시간. Y-축은 4 로 나눈 NPQ.
도 31. 형질전환 된 9개 쌀 라인(rice lines)에서 NPQ 유도 및 이완 키네틱스
도 32. 형질전환 된 쌀 라인(rice lines)에서 NPQ 유도 및 이완 키네틱스.
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식물들, 벡터들, 및 방법들이 본 발명의 모두는 아니지만 일부 실시양태에서 보여주는 수반되는 도면들을 참조하여 좀 더 완전하게 이후부터 서술될 것이다. 실제로, 본 발명은 많은 여러 다른 형태로 예를 들 수 있으며 본원에서 제시한 실시양태들에 한정되는 것으로 생각해서는 안된다; 오히려, 이들 실시양태들은 본 발명이 청구하는 법적인 요구사항을 만족하도록 제공된다.

마찬가지로, 많은 변경 및 여기서 서술된 식물들, 벡터들 및 방법들의 다른 실시양태들은은 본 발명과 관련된 이 분야의 당업자가 전술한 설명 및 관련 도면에 제시된 교시의 이점을 염두에 둘 것이다. 그러므로 본 발명은 개시된 특정 실시양태들에만 제한되지 않으며 변형 및 다른 실시양태들은 첨부된 청구항들의 범위 내에 포함되도록 의도됨을 이해해야 할 것이다. 특별한 용어들이 본원에서 사용되더라도, 이들은 포괄적이고 서술적인 의미에서만 사용되며 제한적인 목적으로 사용되는 것은 아니다.

특별히 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 기술적이고 과학적인 용어들은 본 발명이 관련된 이 분야의 당업자에게 공통으로 이해되는 것과 같은 의미를 가진다. 본원에 서술된 것과 비슷하거나 또는 같은 방법들이나 재료들은 실제로 사용될 수 있거나 또는 본 발명을 테스트하는 데 사용될 수 있다 하더라도, 선호하는 방법들 및 재료들이 여기 서술된다.

정의

달리 기록되지 않는 한, 기술적인 용어들은 전통적인 사용법에 따라 사용된다. 분자 생물학에서의 일반용어의 정의들은 Lewin, Genes VII, 2001 (옥스포드 대학 출판사, Oxford University Press), The Encyclopedia of Molecular Biology, Kendrew et al, eds., 1999 (윌리-인터사이언스, Wiley-Interscience) 및 Molecular Biology and Biotechnology, a Comprehensive Desk Reference, Robert A. Meyers, ed., 1995 (VCH 출판사, VCH Publishers. Inc), Current Protocols In Molecular Biology, F. M. Ausubel et al., eds., 1987 (그린 출판사, Green Publishing), Sambrook and Russell, Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 3^rd edition, 2001 에서 찾아 볼 수 있다.

“폴리뉴클레오티드 (polynucleotide)”“뉴클레오티드 (nucleotide)” “핵산(nucleic acid)”'유전자(gene)”및 올리고뉴클레오티드 (oligonucleotide) 라는 용어는 서로호환적으로 사용된다. 이들은 임의의 길이의 뉴클레오티드의 폴리머 형태, 디옥시라이보뉴클레오티드 (deoxyribonucleotide) 또는 라이보뉴클레오티드(ribonucleotide) 또는 이들의 유사체를, 의미 한다. 폴리뉴클레오티드는 임의의 3차원 구조를 가질 수 있으며, 알려지거나 또는 알려지지 않은 어떤 기능도 가질 수 있다. 다음은 폴리뉴클레오티드의 무제한적인 예시들이다: 유전자 또는 유전자 조각의 암호화 또는 비-암호화 부위, 연관성 분석 (linkage analysis) 으로 정의된 부위들 (loci) (부위, locus), 엑손 (exons), 인트론(introns), 메센져 RNA (messenger RNA) (mRNA), 트랜스퍼 RNA(transfer RNA)(tRNA), 리보조말 RNA(ribosomal RNA)(rRNA), 짧은 방해 RNA(short interfering RNA)(siRNA), 짧은-헤어핀 RNA (short-hairpin RNA) (shRNA), 마이크로-RNA(micro-RNA) (miRNA), 리보좀 (ribozymes), cDNA, 재조합 폴리뉴클레오티드 recombinant polynucleotide), 가지형 폴리뉴클레오티드 (branched polynucleotides), 플라즈미드, 벡터, 임의의 서열을 지닌 분리된 DNA, 임의의 서열을 지닌 분리된 RNA, 핵산 프로브 (nucleic acid probes) 및 프라이머 (primers). 폴리뉴클레오티드는 메틸화된 뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체 (nucleotide analogs) 와 같은 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수도 있다. 만약 변형이 있다면, 뉴클레오티드 구조에의 변형은 폴리머가 조립되기 전 또는 후에 주어질 수 있다. 뉴클레오티드의 서열은 비-뉴클레오티드 성분으로 차단 될 수도 있다. 폴리뉴클레오티드는 라벨링 성분과의 접합과 같이 중합된 후 더 변형될 수 있다.

본원에서 사용된 것과 같이, “벡터”는 플라즈미드, 파지(phage), 또는 코스미드(cosmid)와 같은 복제단위체(replicom)로서 여기에 삽입된 다른 DNA 조각들을 복제 시키기 위해 다른 DNA 조각이 삽입 될 수 있다. 본원에서 서술된 벡터들은 발현 벡터일 수 있다.

본원에서 사용된 것과 같이, “발현 벡터”는 하나 이상의 발현 조절 서열을 포함한다.

본원에서 사용된 것과 같이, “발현 조절 서열 (expression control sequence)” 또는 “발현 카세트 (expression cassette) 는 다른 DNA 서열의 전사 및/또는 번역을 조절 및 조절하는 DNA 서열이다. 발현 조절 서열은 이종 (heterologous) 또는 비-이종 (non-heterologous) 프로모터를 포함할 수 있다.

본원에서 사용된 것과 같이, “작동적으로 연결된 (operably linked)”이란 유전적 구조에 통합되어 발현 조절 서열이 관심 있는 암호화 서열 (coding sequence)의 발현을 효과적으로 조절함을 의미한다.

본원에서 사용된 것과 같이, “형질전환된(transformed)”또는 “감염된 (transfected)”이란 핵산을 (예, 벡터) 이 분야에서 알려진 여러 기술로 세포에 도입시키는 것을 포함한다.

“플라즈미드(plasmid)”는 소문자 “p”로 앞에 붙이고 및/또는 이어서 대문자 및/또는 숫자로 지정한다.

본원에서 사용된 것과 같이, “발현 수준 (level of expression)” 이란 용어는 주어진 핵산 또는 폴리펩타이드의 측정 될만한 발현 수준을 의미한다. 주어진 핵산 또는 폴리펩타이드의 측정 될만한 발현 수준은 이 분야에서 잘 알려진 방법으로 측정한다. “상이하게 발현된 (differentially expressed)”또는 “상이한 발현(differential expression)”이란 용어는 주어진 핵산 또는 폴리펩타이드의 측정 될만한 발현의 증가 또는 감소를 의미한다. “상이하게 발현된 (differentially expressed)”또는 “상이한 발현(differential expression)”이란 비교에 사용된 핵산 또는 폴리펩타이드의 두 샘플의 발현 수준의 차이가 1-배 또는 그 이상, 및 2-배, 5-배, 20-배, 50-배 또는 더 이상 까지를 포함하는 것을 의미한다. 두 샘플에서 만약 두 개 중에 하나의 주어진 핵산 또는 폴리펩타이드가 검출될 만한 발현을 함유하고 있지 않으면 또한 주어진 핵산 또는 폴리펩타이드는 “상이하게 발현된다” 라고도 말한다.

다형성 (polymorphism)은 유전체내에 기능적인 결과가 있거나 또는 없을 수도 있는 핵산 서열의 변화를 의미한다. 이러한 변이체는 유전적 마커로 개발될 수 있으며 관심 있는 특성의 변화와 유전적 차이와의 연관성 분석을 포함하는 유전적 조사의 모든 관점에서 사용될 수 있다. 본원에서 사용된 것과 같이, “다형성 (polymorphism)”이란 용어는 이것에만 국한되지는 않지만, 단일염기 다양성 (single nucleotide polymorphism)(SNP), 삽입/삭제 (insertion/deletion) (InDel), 단순서열반복 (simple sequence repeats)(SSR), 변이의 존재/비존재 (presence/absence of variation)(PAV) 및 카피 수 변이 (copy number variation)(CNV)를 포함한다. 다형성은 자연적으로 일어날수 있거나 또는 인위적으로 유도될 수 있다. 다형성을 유도하거나 검출할 수 있는 방법들은 이 분야에서는 잘 알려져있다.

본원에서 사용된 것과 같이, “프로모터(promoter)”라는 용어는 암호화하는 서열 또는 기능성 RNA의 발현을 조절할 수 있는 DNA 서열을 의미한다. 프로모터 서열은 근접 및 원거리 상위 요소 (proximal and distal upstream element)로 구성 되며, 후자요소는 자주 증강제(enhancer)라고도 불린다. “증강제(enhancer)”는 프로모터 활성을 촉진시킬 수 있는 DNA 서열이며, 프로모터의 내재적 요소일 수 있거나 또는 프로모터의 수준 또는 조직-특이성을 강화시키기 위해 삽입되는 이종 요소 (heterologous element) 일 수 있다. 프로모터는 원래의 유전자로부터 전부 유래될 수 있거나, 또는 자연에서 발견되는 다른 프로모터로부터 유래된 다른 요소들로 구성되거나, 및/또는 합성된 DNA 조각을 포함할 수 있다. 이 분야에 통상의 전문가들은 다른 프로모터들은 다른 조직 또는 세포 타입에서, 또는 발달의 다른 단계에서, 또는 다른 환경조건의 반응에 따라, 유전자의 발현을 지시할 수 있다는 것을 이해한다. 대부분의 경우에 조절 서열의 정확한 경계는 완전히 정의되지 않았으므로, 몇몇의 변화가 있는 DNA 조각들은 동일한 프로모터 활성을 가질 수 있다는 것을 더 인식하고 있다. 이 분야에서 잘 알려진 대로, 프로모터들은 이들의 강도 및/또는 이들이 활성화 되는 조건, 예로 상시적 프로모터 (constitutive promoter), 강한 프로모터 (strong promoter), 약한 프로모터 (weak promoter), 유도적인/억제적인 프로모터 (inducible/repressible), 조직-특이적으로/발생학적으로 조절되는 프로모터, 세포주기-의존적인 프로모터 등, 에 따라 분류될 수 있다.

본원에서 사용된 것과 같이, “유전체 편집(genome editing)”이란 용어는 인위적으로 조작한 핵산 분해효소 뉴클레아제(nucleases), 또는 “분자 가위(molecular scissors)”를 사용하여 유전체로부터 DNA가 삽입, 치환, 또는 제거 되는 유전 공학 (genetic engineering)이다. 이것은 서열 특이적으로 유전자의 기능 및 효과를 보여주는 도구로, 및 유전체 내에 변화를 일으켜 바람직한 표현형으로 바뀌게 하는 결과를 가져오게 하는 도구로 유용하다. 유전자 편집 시스템에는, 이것에만 국한되지 않지만, 메가뉴클레아제 (meganuclease), 아연 손 뉴클레아제 (zinc finger nuclease)(ZEN), 및 전사활성화-유사 효능제 근거한 뉴클레아제 (transcription activator-like effector-based nucleases) (TALEN), 및 모여서 규칙적으로 떨어져 있는 짧은 앞뒤역순상동서열의 반복서열 (clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)이 포함된다.

“식물”이란 용어는 특징적으로 배아를 생산하고, 엽록소를 포함하고, 셀루로즈 세포 벽을 가지며, 이동력이 없는 식물계 (Kingdom Plantae)의 임이의 여러가지 광합성, 진핵 다세포 개체를 의미한다. 본원에서 사용된 대로, “식물”은 임의의 식물 또는, 종자, 현탁 배양, 식물 세포, 배아, 분열조직 부위 (meristemic region), 켈러스조직 (callus tissue), 잎, 뿌리, 새싹 (shoots), 배우체(gamatophytes), 포자체 (sporophytes), 꽃가루 (pollen), 소포자 (microspores), 및 이들의 자손들을 포함하는 발생의 어느 단계에 있는 식물의 일부를 포함한다. 또한 자른나무가지(cutting), 및 세포 (cell) 또는 조직 배양 (tissue cultures) 도 포함된다. 본 명세서와 연관되어 사용된 대로, 식물 조직에는, 예를 들어, 전체 식물, 식물 세포, 식물 기관, 즉, 잎, 줄기, 뿌리, 분열조직 (meristem), 식물종자, 원형질체 (protoplast), 켈러스 (callus), 세포 배양 (cell cultures), 및 구조적 및/또는 기능적 단위로 조직된 식물 세포의 임의의 그룹이 포함한다.

“식물”이란 용어는 이의 가장 넓은 의미로 사용된다. 여기에는, 이것에만 국한 되지는 않지만, 나무같은, 관상용 또는 장식용, 작물 또는 곡식, 과일 또는 야채 식물, 및 조류 (algae) (예, Chlamydomonas reinhardtii) 의 임의의 종을 포함한다. 이는 또한 식물 발달의 어느 단계에 존재하는 구조로 크게 분화된 식물 세포의 군집을 의미한다. 그러한 구조에는, 이것에만 국한 되지는 않지만, 과일, 새싹, 줄기, 잎, 꽃잎 등이 포함된다.

본원에서 사용된 대로 “대조군 식물 (control plant)”또는 “야생형 (wild type)”이란 용어는 형질 전환되거나 또는 유전적으로 변경된 식물에서 증강된 표현형 또는 바람직한 특징을 동정할 목적으로 형질 전환되거나 또는 유전적으로 변화된 식물과 비교하기 위해 사용되는 식물 세포, 조직배양 (explant), 종자, 식물 성분 (plant component), 식물 조직, 식물 기관, 또는 전체 식물을 의미한다. “대조군 식물”은 어떤 경우에는, 평가 하고자 하는 형질 전환되거나 또는 유전적으로 변화된 식물에 존재하는 관심 있는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하지 않는, 빈 벡터 또는 마커 유전자를 포함하는 형질 전환된 식물 라인 일 수도 있다. 대조군 식물은 평가하고자 하는 형질 전환된 또는 유전적으로 변화된 식물과 같은 라인 또는 다양한 식물일 수도 있거나, 또는 특이한 표현형, 성질, 또는 알려진 유전형질을 가진 것으로 알려진 식물과 같은 다른 라인 또는 다양한 식물 일 수 있다. 적합한 대조군 식물에는 본원에서 형질전환된 식물을 생성하기 위해 사용한 모 라인 (parent line)의 유전적으로 변하지 않거나 또는 비-형질전환된 식물을 포함하기도 한다.

“식물 조직 (plant tissue)” 이란 용어에는 뿌리, 새싹, 잎, 꽃차례 (inflorescence), 꽃밥 (anthers), 꽃가루 (pollen), 씨방 (ovary), 종자, 종양은 물론 배양내의 세포 (예, 단일 세포, 원형질 세포, 배아, 켈러스, 등)를 포함하는 분화된 또는 미분화된 식물의 조직을 포함한다. 식물 조직은 식물계, 기관 배양, 조직 배양, 또는 세포 배양에 있을 수 있다.

본원에서 사용된 대로 “식물부분 (plant part)”은 식물 구조, 식물 기관, 또는 식물 조직을 의미한다.

"비-자연적으로 나타나는 식물 (non-naturally occurring plant)" 은 사람의 중재 없이는 자연에서는 나타나지 않는 식물을 의미한다. 비-자연적으로 나타나는 식물에는 형질전환된 식물, 유전공학을 통해 만들어진 식물 및 전통적인 또는 시장 도움의 식물 교배와 같은 비-형질전환 방법으로 생산된 식물을 포함한다.

“식물 세포 (plant cell)”이란 용어는 원형질 및 세포 벽을 포함하는 식물의 구조적 및 생리적인 단위를 의미한다. 식물 세포는 분리된 단일 세포 또는 배양세포의 형태일 수도 있고, 또는 예를 들어, 식물 조직, 식물 기관, 또는 전체 식물과 같은, 좀 더 높이 조직화된 단위의 일부분으로서의 형태일 수도 있다. “식물 세포 배양 (plant cell culture)”이란 용어는 액체 또는 고체 배지에서, 예를 들어, 원형질, 세포 및 세포 군집 (cell cluster) 과 같은 식물 단위 (plant unit)의 배양, 식물의 조직 및 기관의 세포, 소포자 및 꽃가루, 꽃가루 주머니, 꽃밥, 배중 (ovules), 배아 낭 (embryo sac), 접합체 (zygoate) 및 여러 발생 단계 있는 배아를 배양함을 의미한다.

“식물 재료(plant material)”란 잎, 줄기, 뿌리, 꽃차례 (inflorescence) 및 꽃, 또는 꽃 부분 (flower parts), 열매, 꽃가루 (pollen), 꽃밥 (anthers), 난자 세포 (egg cell), 접합체, 종자, 자른나무가지(cuttings), 세포 또는 조직 배양, 또는 식물의 다른 임의의 부분 또는 생산물의 의미한다.

“식물 기관 (plant organ)” 이란 뿌리, 줄기, 잎, 꽃봉우리, 꽃차례, 작은 수상화 (spikelet), 꽃부분 (floret), 종자 및 배아와 같은 식물의 뚜렷하고 눈에 보이는 구조 및 분화된 부분을 의미한다.

“작물 식물(crop plant)”이란 특히 곡물 (cereal)((밀(wheat), 기장 (millet), sorghum (수수), 호밀(rye), 라이밀(triticale), 귀리(oats), 보리 (barley), 테프(teff), 스펠트밀 (spelt), 메밀 (buckwheat), 포니오 (fonio) 및 퀴노아 (quinoa)), 쌀, 옥수수 (maize)(corn), 및/또는 사탕수수와 같은 외떡잎식물 (monocotyledons); 또는 사탕무우 (beet) ((사탕무우(sugar beet) 또는 사료용 사탕수수 (fodder beet)와 같은))와 같은 쌍떡잎 작물; 과일 (fruits) ((예를 들어 배(pears), 자두 (plums), 복숭아, 아몬드 (almonds), 체리 (cherries), 딸기, 라즈베리 (raspberries) 또는 불랙베리(blackberries))와 같은 이과 (pomes), 핵과 (stone fruits), 또는 씨없는 작은 과일 (soft fruits));콩과 식물 (콩, 렌틸콩, 완두콩 또는 대두와 같은);오일 식물 (oil plant) ((유채 (rape), 겨자(mustard),양귀비(poppy), 올리브(olives), 해바라기 (sunflowers), 코코넛 (coconut), 피마자 오일 식물 (castor oil plants), 코코넛 콩 (cocoa beans) 또는 땅콩 (roundnuts)과 같은)); 오이 식물 ((호박 (marrows), 오이 또는 멜론 (melons)과 같은)); 섬유 식물 (fiber plant) (목화, 아마 (flax), 삼 (hemp) 또는 황마 (jute)와 같은));감귤류 과일 (citrus fruit) (오렌지, 레몬, 자몽 (grapefruit), 또는 귤 (mandarins)과 같은)); 야채 ((시금치, 양상추 (lettuce), 양배추, 당근, 토마토, 감자, 박 (cucurbit), 또는 파프리카(paprika) 와 같은)); 녹나무과 (lauraceae) ((아보카도 (avocados), 계피(cinnamon) 또는 장뇌 (camphor)와 같은)); 담배 (tobacco); 견과류 (nuts);커피; 차(tea); 덩굴식물 (vines) ;홉(hops); 두리안 (durian); 바나나; 천연고무식물 (natural rubber plants); 및 관상용식물 (ornamentals) (꽃, 관목 (shrubs), 넓은-잎 나무 (broad-leaved tree) 또는 예를 들어 침엽수 (conifers)와 같은 상록수 (evergreens)) 을 의미한다. 이 리스트는 어떤 제한을 표시하는 것은 아니다.

“목본 작물 (woody plant)” 또는 “목본 식물 (woody plant)”이란 용어는

이의 구조적 조직으로 나무를 생산하는 식물을 의미한다. 목본 작물에는 나무 (trees), 관목 (shrubs), 또는 리아나(lianas)를 포함한다. 목본 작물의 예들에는, 이것에만 국한되지는 않으나, 가시가 없는 로우커스 (thornless locust), 교배된 밤나무 (hybrid chestnut), 검은 호두나무 (black walnut), 일본 단풍 (Japanese maple), 유칼립투스 (eucalyptus), 목마황속관목 (casuarina), 가문비나무(spruce), 전나무 (fir), 소나무 (pine) (예, Pinus radiata 및 Pinus caribaea), 및 꽃피는 층층나무(flowering dogwood)기 포함된다.

“향상된 성장(improved growth)”또는 “증가된 성장 (increased growth)” 이란 용어는 이의 가장 넓은 의미로 사용된다. 여기에는 식물의 성장 및 발달의 과정에서 개선되거나 또는 증강된 어느 것도 다 의미한다. 향상된 성장의 예들에는, 이것에만 국한되지는 않으며, 증가된 광합성 효율, 증가된 바이오메스 (increased biomass), 증가된 수율 (increased yield), 증가된 종자의 수, 증가된 종자의 무게, 증가된 줄기의 무게, 증가된 잎 면적 (increased leaf area), 및 증가된 식물의 건조 무게(increased plant dry weight) 를 포함한다.

"양자효율(quantum yield)"이라는 것은 흡수된 양자 (광자) 한 몰 (mole) 당 고정된 CO₂의 몰수를 의미하거나, 또는 빛이 탄소 고정으로 전환되는 효율을 의미한다. 광합성의 양자 수율은 빛의 강도 및 광합성 비율의 측정으로부터 유래된다. 그러하므로, 양자 수율은 흡수된 빛이 특정한 효과를 생산하는 효율의 측정치이다. 식물 세포 또는 식물에서 수행되는 광합성의 양은 형질전환된 식물 또는 식물 세포에 의해 생산되는 전분의 양을 측정함으로써 간접적으로 검출될 수 있다. 식물 세포 배양 또는 식물에서의 광합성의 양은 CO₂ 검출기 (예를 들어, CO₂의 감소 또는 소비는 증가된 광합성 수준을 나타낸다) 또는 O₂ 검출기 (예를 들어, O₂ 수준의 증가는 증가된 광합성 수준을 나타낸다) (예를 들어, Silva et al., Aquatic Biology 7:127-141, 2009; 및 Bai et al., Biotechnol. Lett. 33:1675-1681, 2011 에 서술된 방법들 참조)로 검출될 수 있다. 광합성은 또한 방사성활성으로 라벨된 CO₂를 사용하여 측정될 수 있다 (예를 들어, 14CO₂ 및 H₁₄CO₃-) (예를 들어, Silva et al., Aquatic Biology 7:127-141, 2009 에 서술된 방법들 및 이곳에서 인용된 참고 문헌을 참조). 광합성은 또한 엽록소 형광 (chlorophyll fluorescence) (예를 들어, Silva et al., Aquatic Biology 7:127-141, 2009 및 이곳에서 인용된 참고 문헌을 참조) 을 검출하여 측정될 수도 있다. 식물에서 광합성을 검출하는 추가적인 방법들은 장 등 (Zhang et al.), Mol. Biol. Rep. 38:4369-4379, 2011 에 서술되어 있다.

물리과학에서는, “이완(relaxation)”이란 용어는 교란된 시스템 (pertubed system)에서 평형 (equilibrium)의 상태, 보통 고 에너지 수준에서 저 에너지 수준으로 돌아오는 것을 의미한다. 본원에서 사용된 대로, “비-광화학적 소멸 이완 (non-photochemical quenching relaxation)” 또는 “NPQ 이완 (NPQ relaxation)”은 높은 수준의 빛에서 낮은 수준의 빛으로 전환될 때 NPQ 수준이 감소하는 과정을 의미한다.

“약(about)”의 값 또는 계수에 참조하여 라는 것은 본원에서는 이 기술 분야에 통상 전문가들에게 잘 알려진 해당 하는 값의 일상의 오차 범위를 의미한다. 약(about)”의 값 또는 계수에 참조하여 라는 것은 본원에서는 그 값 또는 계수 그 자체에 직접 해당하는 관점을 포함(및 서술)한다. 예를 들어, “약 X (about X)”라고 언급하는 서술은 “X”의 서술을 포함한다.

개요 (Overview)

빠르게 성장하는 세계인구에 직면하여, 세계적인 정치 및 사회 안정성을 위해 식량 생산의 더 증가가 긴급하게 필요하며, 그러므로 이런 요구를 충족하기 위해 2050년까지 2-배의 작물 생산 증가가 필요하다고 예측하고 있다. 그러므로 광합성과 같은 중요한 작물의 특징에 기반하는 생리적 과정을 더 잘 이해 하는 것은 전세계의 식량 안정성 위기를 경감시키는 주요한 열쇠이다. 광합성은 식물 및 녹색 조류(green algae)에 의해서 빛 에너지를 추후에 개체의 활동에 연료를 공급하기 위해 방출될 수 있는 화학적 에너지로 전환하기 위해 사용되는 과정이며, 이 과정 동안 대기의 이산화 탄소는 (CO₂)는 동화되고 산소는 방출된다. 고정 또는 동화된 CO₂ 양 대비 흡수된 광자 (양자) 양의 비율, 양자 수율이라고도 알려진, 은 보통은 식물 광합성 효율의 측정으로 사용된다.

빛이 광합성에 필요하더라도, 잎들이 높은 빛의 강도에 노출되었을 때는 손상을 입을 수 있다. 이를 피하기 위하여 잎들은 몇가지 광보호 기전을 개발하였다. 비-광화학 이완 (non-photochemical quenching) (NPQ)이 이들 중 한 기전이며, 이는 과도하게 흡수된 조사된 빛을 열로 소멸되게 한다. 그러나, 식물이 높은 빛 강도에서 낮은 빛 강도로 전이될 때는, NPQ가 CO₂고정을 억제하기 때문에, 광합성의 양자 수율은 일시적으로 감소된다. 추가로, NPQ는 높은 빛 강도에서는 빠르게 켜지나 (유도되나), 제한적으로 조사되는 빛으로 돌아왔을 때는 좀 더 천천히 꺼진다 (이완된다). 그 결과, 자연적인 현장(field) 조건에서는 흔히 일어나는, 변동하는 빛 하에서는 식물의 광합성 효율 및 성장은 절충된다.

본 명세서는 식물이 높은 빛 강도에서 낮은 빛 강도로 전이된 후, NPQ의 이완을 가속화시키고, 그럼으로써 CO₂고정의 광합성 양자 수율의 회복을 더 빠르게 하는 방법을 제공 한다. 이 방법에는 하나 이상의 광계 II 서브유닛 S (photosystem II subunit S)(PsbS), 제아크산틴 에폭시다제 (zeaxanthin epoxidase)(ZEP), 및 비올라크산틴 디-에폭시다제 (violaxanthin de-epoxidase) (VDE) 를 암호화하는 뉴틀레오티드 서열의 발현 증가를 포함한다. 이는 NPQ의 진폭을 감소시키지 않고 달성될 수 있으므로, 높은 빛 강도 하에서 정상적인 광보호는 영향을 받지 않는다. 식물이 자주 높은 빛 강도에서 낮은 빛 강도로 전이되는, 변동하는 빛 조건 하에서는, 이 방법은 향상된 광보호 효율의 결과를 가져오며, 결국 식물의 광합성 효율 및 성장을 증가시킨다.

본 명세서는 향상된 광합성 및 성장을 위하여 식물을 유전적으로 제작하는 방법을 더 제공한다. PsbS, ZEP 및 VDE를 암호화하는 뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터는, 이것만 국한하지는 않지만, 원형질 형질전환, 아그로박테리움-중개하는 (Agrobacterium-mediated) 형질전환, 전기천공법 (electroporation), 미세 투사물 충격 (microprojectile bombardment)을 포함하는 현재 가능한 방법들로 식물에 도입 될 수 있다. 이 방법은 향상된 광합성 및 성장을 지닌 형질전환된 식 물, 이것만 국한하지는 않지만, 담배 (tobacco), 밀, 옥수수(maize), 쌀, 대두 (soybean), 수수 (sorghum), 카사바 (cassava), 동부 (cowpea), 포플라 (poplar), 및 유칼립투스 (eucalyptus)를 포함하는 식물 종을 생산하는데 사용될 수 있다.

이 분야에서 NPQ 반응 근거하는 기전 및 관련되는 엽황소 (크산토필) 사이클 (xanthophyll cycle)은 식물 및 녹조류 전반에 걸쳐 매우 보존되어 있음은 잘 알려졌다. 예를 들어, Niyogi KK, Truong TB (2013). Evolution of flexible non-photochemical quenching mechanisms that regulate light harvesting in oxygenic photosynthesis (산소적 광합성에서 빛 수확을 조절하는 유연한 비-광화학적 소멸 기전의 진화)를 참조. Curr Op Plant Biol 16: 307-314, Koziol AG, Borza T, Ishida K-I, Keeling P, Lee RW, Durnford DG (2007). Tracing the evolution of the light-harvesting antennae in chlorophyll a/b-containing organisms (클로로필 II a/b-포함하는 개체들에서 빛-수확하는 안테나 진화의 추적) 참조. Plant Physiol 143: 1802-1816, Engelken J, Brinkmann H, Adamska I (2010). Taxonomic distribution and origins of the extended LHC (light-harvesting complex) antenna protein superfamily (확장된 LHC(빛-수확 복합체) 안테나 단백질 수퍼훼밀리의 분류상 분포 및 기원) 참조. BMC Evol Biol 10: 233, Brooks MD, Jansson S, Niyogi KK (2014). PsbS-dependent non-photochemical quenching (PsbS-의존 비-광화학적 소멸) 참조. 다음에 있는 것 참조: Non-photochemical quenching and energy dissipation in plants, algae and cyanobacteria (식물, 조류 및 시아노박테리아에서의 비- 광화학적 소멸 및 에너지 분산). Demmig-Adams B, Garab G, Adams WW III, Govindjee eds. (Dordrecht: Springer), pp. 297-314, Kasajima I, Ebana K, Yamamoto T, Takahara K, Yano M, Kawai-Yamada M, Uchimiya H (2011). ). Molecular distinction in genetic regulation of nonphotochemical quenching in rice (쌀에서의 비광화학적 소멸의 유전적 조절의 분자적 구별). Proc Natl Acad Sci USA 108:13835-13840, Alboresi A, Gerotto C, Giacometti GM, Bassi R, Morosinotto T (2010). Physcomitrella patens mutants affected on heat dissipation clarify the evolution of photoprotection mechanisms upon land colonization. (Proc Natl Acad Sci USA 107:11128-11133, and Goss R, Lepetit B (2015). Biodiversity of NPQ (NPQ의 생물다양성). Journal of Plant Physiology, 172, 13-32. 그러므로, 본 발명에서 공개되는 방법들은 모든 식물들 및 녹조류에 다 적용된다.

달리 제시되지 않은 한, 본 공개는 이 분야의 기술 내에 있는 식물 형질전환, 식물 번식, 미생물학, 세포생물학, 및 재조합 DNA 의 전통적인 기술들을 다 포함한다. 예를 들어 다음을 참조; Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition, 2001; Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel et al. eds., 1987; Plant Breeding: Principles and Prospects , M. D. Hayward et al., 1993; Current Protocols in Protein Science, Coligan et al, eds., 1995, (John Wiley & Sons, Inc.); the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.): PCR 2: A Practical Approach, M. J. MacPherson, B. D. Hames and G. R. Taylor eds., 1995.

일 측면에서, 발현 조절 서열에 작동적으로 연결된 PsbS, ZEP 및 VDE로부터 선택되는 폴리펩타이드를 암호화하는 하나 이상이 이종 뉴클레오티드 서열을 포함하는 형질전환식물, 또는 식물의 일부분, 또는 식물 재료, 또는 식물 종자, 또는 식물 세포가 제공된다. 일 실시양태에서 PsbS 폴리펩타이드는 서열번호 1 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되고, ZEP 폴리펩타이드는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되며, 및 VDE 폴리펩타이드는 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된다.

다른 실시양태에서는, 형질전환 식물은 PsbS, ZEP 및 VDE를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 형질전환 식물은 PsbS, ZEP 및 VDE 중 적어도 2개의 임의의 조합을 포함할 수 있거나, 또는 PsbS, ZEP 및 VDE 중 오직 하나만 포함할 수 있다. 뉴클레오티드 서열들은 적어도 서열 번호 1, 서열 번호 2 및/또는 서열 번호 3과 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99% 서열 상동성 (sequence identity)을 가질 수 있다. 다른 실시양태에서, PsbS 폴리펩타이드는 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖고, ZEP 폴리펩타이드는 서열번호 5의 아미노산 서열을 가지며, VDE 폴리펩타이드는 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는다. 폴리펩타이드들은 적어도 서열 번호 4, 서열 번호 5 및/또는 서열 번호 6과 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99% 아미노산 서열 상동성을 가질 수 있다. 애기장대 (Arabidopsis) PsbS, Zep 및 VDE 뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 폴리펩타이드 서열의 상동체가 대부분의 식물 종 및 하기의 식물 리스트에 존재하며, 이 상동체들은 애기장대 유전자 대신 사용될 수 있다.

PsbS, ZEP 및 VDE 와 비슷한 활성을 가진 효소들, 또는 하기 식물들에 있는, 그러나 이것에만 국한하지 않은, 상동체를 포함하는 보존적인 도메인을 가진 효소들도 대신하여 사용될 수 있다; 스위치그라스, 억새속(Miscanthus), 개자리속(Medicago), 단수수(sweet sorghum), 곡용 수수(grain sorghum), 사탕수수(sugarcane), 에너지 수수(energy cane), 코끼리 풀(elephant grass), 옥수수(maize), 밀(wheat), 보리(barley), 귀리(oats), 쌀(rice), 대두(soybean), 팜유(oil palm), 잇꽃(safflower), 참깨(sesame), 담배(tobacco), 아마(flax), 목화(cotton), 해바라기(sunflower), 양구슬냉이속(Camelina), 유채(Brassica napus), 브라시카 카리나타(Brassica carinata), 갓(Brassica juncea), 펄 밀렛(pearl millet), 조(foxtail millet), 다른 곡물(other grain), 쌀(rice), 오일시드(oilseed), 채소 작물( vegetable crop), 사료 작물(forage crop), 공예 작물(industrial crop), 목본 작물(woody crop) 및 바이오매스 작물 (biomass crops). PsbS 는 보존적인 클로로아_b-결합 도메인 (Chloroa_b -binding domain) (서열번호 7)을 가지고 있으며, ZEP는 NADB_로스만 (NADB_Rossman) 및 FHA 수퍼훼밀리 도메인(서열 번호 8)을 포함하며, VDE는 리포칼린 도메인 (Lipocalin dom ain) (서열 번호 8) 을 가지고 있다. 이러한 도메인들을 갖는 상동체들도 사용될 수 있다.

다른 실시양태에서, 형질전환식물, 또는 식물의 일부분, 또는 식물 재료, 또는 식물 종자, 또는 식물 세포는 작물 식물(crop plant), 모델 식물(model plant), 외떡잎 식물(monocotyledonous plant), 쌍떡잎 식물(dicotyledonous plant), 크레슐산(CAM) 대사 광합성 식물(plant with Crassulacean acid metabolism photosynthesis), C3 광합성 식물(plant with C3 photosynthesis), C4 광합성 식물(plant with C4 photosynthesis), 일년생 식물(annual plant), 온실 식물(greenhouse plant), 원예 꽃 식물(horticultural flowering plant), 다년생 식물(perennial plant), 스위치그라스 식물(switchgrass plant), 옥수수 식물(maize plant), 바이오매스 식물(biomass plant), 또는 사탕수수 식물(sugarcane plant)이다. 다른 실시양태에서는, 식물은 하기로부터 선택 된다; 스위치그라스, 억새속(Miscanthus), 개자리속(Medicago), 단수수(sweet sorghum), 곡용 수수(grain sorghum), 사탕수수(sugarcane), 에너지 수수(energy cane), 코끼리 풀(elephant grass), 옥수수(maize), 밀(wheat), 보리(barley), 귀리(oats), 쌀(rice), 대두(soybean), 팜유(oil palm), 잇꽃(safflower), 참깨(sesame), 담배(tobacco), 아마(flax), 목화(cotton), 해바라기(sunflower), 양구슬냉이속(Camelina), 유채(Brassica napus), 브라시카 카리나타(Brassica carinata), 갓(Brassica juncea), 펄 밀렛(pearl millet), 조(foxtail millet), 다른 곡물(other grain), 쌀(rice), 오일시드(oilseed), 채소 작물( vegetable crop), 사료 작물(forage crop), 공예 작물(industrial crop), 목본 작물(woody crop) 및 바이오매스 작물 (biomass crops). 더 다른 실시양태에서, 형질 전환 식물은 담배 (Nicotiana tabacum)이다. 다른 실시양태에서, 식물은 변동하는 빛 조건하에서 향상된 양자 수율 및/또는 CO₂ 고정을 가지며, 및/또는 향상된 성장을 가진다. 유전자 발현 수준의 균형은 식물 개선에 한 역할을 할 수 있다. 일 실시양태에서, VDE 및 ZEP 폴리펩타이드는 상대적으로 비슷한 수준으로 발현된다.

다른 실시양태에서, 형질전환식물, 또는 식물의 일부분, 또는 식물 재료, 또는 식물 종자, 또는 식물 세포는 추가적인 특성, 예를 들어, 제초제(herbicide) 저항성, 곤충 또는 해충 저항성, 질병 저항성, 변형된 지방산 대사, 및/또는 변형된 탄수화물 대사를 가진다.

다른 측면에서, 한 발현 벡터가 제공되며, 이 발현 벡터는 PsbS, Zep 및 VDE 로부터 선택된 하나 이상의 폴리팹타이드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결된 적어도 하나의 발현조절 서열을 포함한다. 일 실시양태에서, 벡터는 형질전환식물, 또는 식물의 일부분, 또는 식물 재료, 또는 식물 종자, 또는 식물 세포에서 PsbS, Zep 및 VDE 로부터 선택된 하나 이상의 폴리팹타이드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 발현을 유도할 수 있는 능력이 있는 프로모터를 포함하는 적어도 하나의 발현 조절 서열을 포함한다. 다른 실시양태에서, 프로모터는 Rbcs1A, GAPA-1 및 FBA2 로 부터 선택 된다. 더 실시양태에서, Rbcs1A 프로모터를 포함하는 벡터는 ZEP의 발현을 유도하고, GAPA-1 프로모터는 PsbS의 발현을 유도하며, FBA2 프로모터는 VDE의 발현을 유도한다. 다른 실시양태에서, 벡터는 T-DNA이다. 다른 실시양태에서, 벡터는 도 9에 보여진 것과 같은 벡터를 포함한다. 다른 실시양태에서, 벡터는 하기의 식물, 식물의 일부분, 또는 식물 재료, 또는 식물 종자, 또는 식물 세포에서 PsbS, Zep 및 VDE 폴리팹타이드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 발현할 수 있다:작물 식물(crop plant), 모델 식물(model plant), 외떡잎 식물(monocotyledonous plant), 쌍떡잎 식물(dicotyledonous plant), 크레슐산(CAM) 대사 광합성 식물(plant with Crassulacean acid metabolism photosynthesis), C3 광합성 식물(plant with C3 photosynthesis), C4 광합성 식물(plant with C4 photosynthesis), 일년생 식물(annual plant), 온실 식물(greenhouse plant), 원예 꽃 식물(horticultural flowering plant), 다년생 식물(perennial plant), 스위치그라스 식물(switchgrass plant), 옥수수 식물(maize plant), 바이오매스 식물(biomass plant), 또는 사탕수수 식물(sugarcane plant). 다른 실시양태에서는, 식물은 하기로부터 선택 된다: 스위치그라스, 억새속(Miscanthus), 개자리속(Medicago), 단수수(sweet sorghum), 곡용 수수(grain sorghum), 사탕수수(sugarcane), 에너지 수수(energy cane), 코끼리 풀(elephant grass), 옥수수(maize), 밀(wheat), 보리(barley), 귀리(oats), 쌀(rice), 대두(soybean), 팜유(oil palm), 잇꽃(safflower), 참깨(sesame), 담배(tobacco), 아마(flax), 목화(cotton), 해바라기(sunflower), 양구슬냉이속(Camelina), 유채(Brassica napus), 브라시카 카리나타(Brassica carinata), 갓(Brassica juncea), 펄 밀렛(pearl millet), 조(foxtail millet), 다른 곡물(other grain), 쌀(rice), 오일시드(oilseed), 채소 작물( vegetable crop), 사료 작물(forage crop), 공예 작물(industrial crop), 목본 작물(woody crop) 및 바이오매스 작물 (biomass crops).

다른 측면에서, 여기서 서술된 재조합 벡터를 포함하는, 형질전환식물, 또는 식물의 일부분, 또는 식물 재료, 또는 식물 종자가 제공된다.

다른 측면에서, 식물, 식물의 일부분, 또는 식물 재료, 또는 식물 종자, 또는 식물 세포에서 바이오매스 생산 및/또는 탄소 고정 및/또는 식물성장을 증가시키는 방법들ㅇ이 제공되며, 그 방법들에는 식물, 식물의 일부분, 또는 식물 재료, 또는 식물 종자, 또는 식물 세포의 유전체에 하나 이상의 발현 조절 서열에 작동가능 하게 연결된 PsbS, Zep 및 VDE 로부터 선택된 폴리팹타이드를 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 도입하는 것을 포함한다. 뉴클레오티드 서열 번호 1, 서열 번호 2, 및 서열 번호 3로 암호화 되는 폴리펩타이드의 병합은 양자 수율, 변동하는 빛 조건 하에서 CO₂ 고정을 증가시키고 및 식물 성장을 개선 시키는 것을 발견 했다. 일 실시양태에서, 그 방법은 여기 서술된 것과 같이 재조합 벡터를 포함한다.

본 발명의 형질전환 식물

일 측면에서, 하나 이상의 폴리펩타이드 PsbS, ZEP 또는 VDE를 암호화 하는 하나이상의 이종 뉴클레오티드 서열을 갖는 형질전환 된 식물이 하기에 제공된다. 일부 실시양태들에서, 형질전환식물은 PsbS 를 암호화하는 하나 이상의 이종 뉴클레오티드 서열을 가진다. 일부 실시양태들에서, 형질전환식물은 ZEP를 암호화하는 하나 이상의 이종 뉴클레오티드 서열을 가진다. 일부 실시양태들에서, 형질전환식물은 ZEP를 암호화하는 하나 이상의 이종 뉴클레오티드 서열을 가진다. 한 일부 실시양태들에서, 형질전환식물은 PsbS 및 ZEP를 암호화하는 하나 이상의 이종 뉴클레오티드 서열을 가진다. 한 일부 실시양태들에서, 형질전환식물은 PsbS 및 VDE를 암호화하는 하나 이상의 이종 뉴클레오티드 서열을 가진다. 일부 실시양태들에서, 형질전환식물은 ZEP 및 VDE를 암호화하는 하나 이상의 이종 뉴클레오티드 서열을 가진다. 일부 실시양태들에서, 형질전환식물은 PsbS, ZEP 및 VDE를 암호화하는 하나 이상의 이종 뉴클레오티드 서열을 가진다.

상기 서술된 실시양태의 어떤 것에서, 하나 이상의 이종 뉴클레오티드 서열은 쌍떡잎 식물로부터 유래한다. 일부 실시양태들에서 하나 이상의 이종 뉴클레오티드 서열은 외떡잎 식물로부터 유래한다. 일부 실시양태들에서 하나 이상의 이종 뉴클레오티드 서열은 애기장대(Arabidopsis thaliana)로부터 유래된다. 일부 실시양태들에서 하나 이상의 이종 뉴클레오티드 서열은 옥수수(Zea mays)로부터 유래된다. 일부 실시양태들에서 하나 이상의 이종 뉴클레오티드 서열은 쌀(Oryza sativa)로부터 유래된다. 일부 실시양태들에서 하나 이상의 이종 뉴클레오티드 서열은 수수(Sorghum bicolor) 로부터 유래된다. 일부 실시양태들에서 하나 이상의 이종 뉴클레오티드 서열은 대두(Glycine max)로부터 유래된다. 일부 실시양태들에서 하나 이상의 이종 뉴클레오티드 서열은 동부(Vigna unguiculata)로부터 유래된다. 일부 실시양태들에서 하나 이상의 이종 뉴클레오티드 서열은 포플러(Populus spp .)로부터 유래된다. 일부 실시양태들에서 하나 이상의 이종 뉴클레오티드 서열은 식물은 유칼립투스(Eucalyptus spp.)로부터 유래된다 일부 실시양태들에서 하나 이상의 이종 뉴클레오티드 서열은 카사바(Manihot esculenta)로부터 유래된다. 일부 실시양태들에서 하나 이상의 이종 뉴클레오티드 서열은 보리(Hordeum vulgare)로부터 유래된다. 일부 실시양태들에서 하나 이상의 이종 뉴클레오티드 서열은 감자(Solanum tuberosum)로부터 유래된다. 일부 실시양태들에서 하나 이상의 이종 뉴클레오티드 서열은 사탕수수(Saccharum spp.)로부터 유래된다. 일부 실시양태들에서 하나 이상의 이종 뉴클레오티드 서열은 알팔파(Medicago sativa)로부터 유래된다. 일부 실시양태들에서 하나 이상의 이종 뉴클레오티드 서열은 하기의 식물로부터 유래된다: 스위치그라스, 억새속(Miscanthus), 개자리속(Medicago), 단수수(sweet sorghum), 곡용 수수(grain sorghum), 사탕수수(sugarcane), 에너지 수수(energy cane), 코끼리 풀(elephant grass), 옥수수(maize), 카사바(cassava), 동부(cowpea), 밀(wheat), 보리(barley), 귀리(oats), 쌀(rice), 대두(soybean), 팜유(oil palm), 잇꽃(safflower), 참깨(sesame), 담배(tobacco), 아마(flax), 목화(cotton), 해바라기(sunflower), 양구슬냉이속(Camelina), 유채(Brassica napus), 브라시카 카리나타(Brassica carinata), 갓(Brassica juncea), 펄 밀렛(pearl millet), 조(foxtail millet), 다른 곡물(other grain), 쌀(rice), 오일시드(oilseed), 채소 작물( vegetable crop), 사료 작물(forage crop), 공예 작물(industrial crop), 목본 작물(woody crop) 또는 바이오매스 작물(biomass crop).

상기 서술된 실시양태 중 어떤 것에서는, VDE, PsbS 또는 ZEP 중 어느 것의 전사 수준은 대조군 식물과 비교하여 적어도 약 1배, 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 적어도 약 6배, 적어도 약 7배, 적어도 약 8배, 적어도 약 9배, 적어도 약 10배, 적어도 약 15배, 적어도 약 20배, 또는 적어도 약 30배로 증가된다. 어떤 구쳬예에서는, VDE, PsbS 또는 ZEP 중 어느 것의 단백질 수준은 대조군 식물과 비교하여 적어도 약 1배, 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 적어도 약 6배, 적어도 약 7배, 적어도 약 8배, 적어도 약 9배, 적어도 약 10배, 적어도 약 20배, 적어도 약 30배, 적어도 약 40배, 적어도 약 50배, 적어도 약 60배, 적어도 약 70배, 적어도 약 80배, 적어도 약 90배, 또는 적어도 약 100배 증가된다.

광보호 기전은 고등 식물들 사이에서는 높은 정도로 보존되고 있다. 보존 또는 상동성의 정도는 관심 있는 유전자의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열의 비교를 통해 분석될 수 있다. 여기서 사용된 대로, “서열 동일성 (sequence identity)”은 분석되는 서열내에서 같은 위치에 동일한 잔기가 있을 퍼센트를 의미한다. 비교를 위한 서열 정렬 방법은 이분야 통상 전문가에게는 잘 알려져있으며, 이것에만 국한하지 않지만, 수작업 정렬과 컴퓨터-도움에 의한 서열 정렬 및 분석이 포함된다. 후자의 접근 방법은 컴퓨터-도움의 방법으로 제공되는 처리량이 증가되기 때문에 본 명세서에서 선호하는 방법이다. 어느 두 서열 사이의 동일성 퍼센트의 결정은 수학적 알고리즘은 사용하여 달성될 수 있다. 그러한 수학적 알고리즘의 예들에는 마이어 및 밀러 알고리즘 (algorithm of Myers and Miller, CABIOS 4:11-17 (1988); 스미 등의 지역적인 상동성 알고리즘 (the local homology algorithm of Smith et al.), Adv. Appl. Math. 2:482 (1981); 니들만 및 운쉬의 상동성 알고리즘(the homology alignment algorithm of Needleman and Wunsch), J. Mol. Biol. 48:443-453 (1970); 피어슨 및 리프만의 유사성 탐색 방법 (the search-for-similarity-method of Pearson and Lipman), Proc. Natl. Acad. Sci. 85:2444-2448 (1988);카린 및 알트슐의 알고리즘 (the algorithm of Karlin and Altschul), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268 (1990),수정된 카린 및 알트슐 알고리즘 (modified as in Karlin and Altschul), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877 (1993) 이 있다. 이들 수학적 알고리즘의 컴퓨터에서의 실행은 서열을 비교하여 서열의 동일성 및/또는 유사성을 결정하는데 사용될 수 있다. 그러한 실행에는 예를 들어 다음을 포함한다: PC/유전자 프로그램에 있는 CLUSTAL (CLUSTAL in the PC/Gene program) (Intelligenetics, Mountain View, Calif.로부터 구할 수 있음); AlignX 프로그램(the AlignX program, version10.3.0 (Invitrogen, Carlsbad, CA) 및 위스콘신 유적학 소프트웨어 패키지 ((the Wisconsin Genetics Software Package, Version 8 (Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Drive, Madison, Wis., USA로부터 구할 수 있음)) 의 GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA, 및 TFASTA. 이들 프로그램을 사용하여 정렬하는 것은 디폴트 계수 (default parameter)를 사용하여 수행될 수 있다. CLUSTAL 프로그램은 Higgins et al. Gene 73:237-244 (1988); Higgins et al. CABIOS 5:151-153 (1989); Corpet et al., Nucleic Acids Res. 16:10881-90 (1988); Huang et al. CABIOS 8:155-65 (1992); 및 Pearson et al., Meth. Mol. Biol. 24:307-331 (1994) 에 의해 잘 서술되어 있다. 알트슐의 BSAST 프로그램 ((Altschul et al. J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)) 은 앞의 카린 및 알트슐의 ((Karlin and Altschul (1990)) 알고리즘에 근거 한다.

상기 서술된 실시양태들의 어떤 것에서는, PsbS는 서열 번호 1 과 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화 된다. 일부 실시양태들에서, ZEP는 서열 번호 2와 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화 된다. 일부 실시양태들에서, VDE는 서열 번호 3과 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화 된다. 일부 실시양태들에서, PsbS는 서열 번호 4와 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 100%의 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시양태들에서, ZEP는 서열 번호 5와 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 100%의 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시양태들에서, VDE는 서열 번호 6과 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 100%의 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시양태들에서, PsbS는 서열 번호 7의 보존 도메인을 더 포함한다. 일부 실시양태들에서, ZEP는 서열 번호 8의 보존 도메인을 더 포함한다. 일부 실시양태들에서, VDE는 서열 번호 9의 보존 도메인을 더 포함한다.

상기 서술된 실시양태들의 어떤 것에서는, 형질전환된 식물은 발현 벡터를 포함하며, 상기 발현 벡터는 여기 서술된 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태들에서는, 형질전환된 식물은 PsbS, ZEP, 또는 VED중 어느 것은 암호화하는 하나 이상의 이종 뉴클레오티드 서열을 가진 발현 벡터를 함유하고 있는 종자를 생산한다. 일부 실시양태들에서는, 형질전환된 식물로부터 유래된 종자는 더 나아가 자손 식물을 생산 한다.

상기 서술된 실시양태 들의 어떤 것에서는, 형질전환된 식물은 변동하는 빛 조건 하에 있는 대조군 식물에 비교하여 변동하는 빛 조건 하에서 성장이 증가 된다. 일부 실시양태들에서, 형질전환된 식물은 변동하는 빛 조건 하에 있는 대조군 식물에 비교하여 변동하는 빛 조건 하에서 광합성 효율이 증가 된다. 일부 실시양태들에서, 형질전환된 식물은 변동하는 빛 조건 하에 있는 대조군 식물에 비교하여 변동하는 빛 조건 하에서 광보호 효율이 향상 된다. 일부 실시양태들에서, 형질전환된 식물은 변동하는 빛 조건 하에 있는 대조군 식물에 비교하여 변동하는 빛 조건 하에서 양자 수율 및 CO₂ 고정이 향상 된다. 일부 실시양태들에서, 형질전환된 식물은 엘리트 라인 (elite line) 또는 엘리트 스트레인 (elite strain)이다. 일부 실시양태들에서, 형질전환된 식물은 제초제(herbicide) 저항성, 곤충 또는 해충 저항성, 질병 저항성, 변형된 지방산 대사, 및/또는 변형된 탄수화물 대사를 제공하는 하나 이상의 추가적인 폴리펩타이드의 발현을 더 포함한다.

상기 서술된 실시양태들의 어떤 것에서는, 식물에서 VDE의 전사 수준은 대조군 식물에 비교하여 3배 증가 된다. 상기 서술된 실시양태들의 어떤 것에서는, 식물에서 PsbS의 전사 수준은 대조군 식물에 비교하여 3배 증가 된다. 상기 서술된 실시양태들의 어떤 것에서는, 식물에서 ZEP의 전사 수준은 대조군 식물에 비교하여 8배 증가 된다. 상기 서술된 실시양태들의 어떤 것에서는, 식물에서 VDE의 전사 수준은 대조군 식물에 비교하여 10배 증가 된다. 상기 서술된 실시양태들의 어떤 것에서는, 식물에서 PsbS의 전사 수준은 대조군 식물에 비교하여 3배 증가 된다. 상기 서술된 실시양태들의 어떤 것에서는, 식물에서 ZEP의 전사 수준은 대조군 식물에 비교하여 6배 증가 된다. 상기 서술된 실시양태들의 어떤 것에서는, 식물에서 VDE의 전사 수준은 대조군 식물에 비교하여 4배 증가 된다. 상기 서술된 실시양태들의 어떤 것에서는, 식물에서 PsbS의 전사 수준은 대조군 식물에 비교하여 1.2배 증가 된다. 상기 서술된 실시양태들의 어떤 것에서는, 식물에서 ZEP의 전사 수준은 대조군 식물에 비교하여 7배 증가 된다. 상기 서술된 실시양태들의 어떤 것에서는, 식물에서 VDE의 단백질 수준은 대조군 식물에 비교하여 16배 증가 된다. 상기 서술된 실시양태들의 어떤 것에서는, 식물에서 PsbS의 단백질 수준은 대조군 식물에 비교하여 2배 증가 된다. 상기 서술된 실시양태들의 어떤 것에서는, 식물에서 ZEP의 단백질 수준은 대조군 식물에 비교하여 80배 증가 된다. 상기 서술된 실시양태들의 어떤 것에서는, 식물에서 VDE의 단백질 수준은 대조군 식물에 비교하여 30배 증가 된다. 상기 서술된 실시양태들의 어떤 것에서는, 식물에서 PsbS의 단백질 수준은 대조군 식물에 비교하여 4배 증가 된다. 상기 서술된 실시양태들의 어떤 것에서는, 식물에서 ZEP의 단백질 수준은 대조군 식물에 비교하여 74배 증가 된다.

상기 서술된 실시양태들의 어떤 것에서는, 식물에서 VDE의 단백질 수준은 대조군 식물에 비교하여 47배 증가 된다. 상기 서술된 실시양태들의 어떤 것에서는, 식물에서 PsbS의 단백질 수준은 대조군 식물에 비교하여 3배 증가 된다. 상기 서술된 실시양태들의 어떤 것에서는, 식물에서 ZEP의 단백질 수준은 대조군 식물에 비교하여 75배 증가 된다. 상기 서술된 실시양태들의 어떤 것에서는, 식물에서 VDE, PsbS, 및 ZEP의 전사 수준의 증가 대조군 식물에 비교하여 3:3:8, 10:3:6 또는 4:1.2:7 비율이다. 상기 서술된 실시양태들의 어떤 것에서는, 식물에서 VDE, PsbS, 및 ZEP의 단백질 수준의 증가 비율은 대조군 식물에 비교하여 16:2:80, 30:4:74, 또는 47:3:75이다. 상기 서술된 실시양태들의 어떤 것에서는, 식물에서 VDE의 전사 수준의 증가는 대조군 식물에 비교하여 3배 내지 10배 범위에 있다. 상기 서술된 실시양태들의 어떤 것에서는, 식물에서 PsbS의 전사 수준의 증가는 대조군 식물에 비교하여 약 1.2배 내지 약 3배 이다. 상기 서술된 실시양태들의 어떤 것에서는, 식물에서 ZEP의 전사 수준의 증가는 대조군 식물에 비교하여 약 6배 내지 약 8배 이다. 상기 서술된 실시양태들의 어떤 것에서는, 식물에서 VDE의 단백질 수준의 증가는 대조군 식물에 비교하여 16배 내지 47배 이다. 상기 서술된 실시양태들의 어떤 것에서는, 식물에서 PsbS의 단백질 수준의 증가는 대조군 식물에 비교하여 약 2배 내지 약 4배 이다. 상기 서술된 실시양태들의 어떤 것에서는, 식물에서 ZEP의 단백질 수준의 증가는 대조군 식물에 비교하여 약 74배 내지 약 80배 이다.

본 발명의 발현 벡터

다른 측면에서, 본 공개서는 VDE, PsbS, 및 ZEP 의 어느 것을 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 갖고 있는 발현 벡터와 관계된다. 일부 실시양태들에서, 발현 벡터는 PsbS를 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 일부 실시양태들에서, 발현 벡터는 ZEP를 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 일부 실시양태들에서, 발현 벡터는 VDE를 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 일부 실시양태들에서발현 벡터는 PsbS 및 ZEP를 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 일부 실시양태들에서, 발현 벡터는 PsbS 및 VDE를 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 일부 실시양태들에서, 발현 벡터는 ZEP 및 VDE를 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 일부 실시양태들에서, 발현 벡터는 PsbS, ZEP 및 VDE를 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 갖는다.

상기 서술된 실시양태들의 어떤 것에서는, PsbS 는 적어도 서열 번호 1 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화 된다. 일부 실시양태들에서, ZEP는 서열 번호 2와 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화 된다. 일부 실시양태들에서, VDE는 서열 번호 3과 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화 된다. 일부 실시양태들에서는, PsbS는 서열 번호 4와 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 100%의 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시양태들에서, ZEP는 서열 번호 5와 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 100%의 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시양태들에서, VDE는 서열 번호 6과 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 100%의 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시양태들에서, PsbS는 서열 번호 7의 보존 도메인을 더 포함한다. 일부 실시양태들에서, ZEP는 서열 번호 8의 보존 도메인을 더 포함한다. 일부 실시양태들에서, VDE는 서열 번호 9의 보존 도메인을 더 포함한다.

상기 서술된 실시양태들의 어떤 것에서는, 벡터는 식물에서 VDE, PsbS, 또는 ZEP 뉴클레오타이드 서열의 발현을 유도할 수 있는 프로모터를 가진 하나 이상의 발현 조절 서열을 포함한다. 일부 실시양태들에서는, 프로모터는 유도성 프로모터 (inducible promoter)이다. 일부 실시양태들에서는 프로모터는, 상시적 프로모터 (constitutive promoter)이다. 일부 실시양태들에서는, 프로모터는 약한 프로모터이다. 일부 실시양태들에서는, 프로모터는 조직-특이 프로모터이다. 일부 실시양태들에서는, 프로모터는 종자-및/또는 배아-특이 프로모터이다. 일부 실시양태들에서, 프로모터는 종자-및/또는 배아-특이 프로모터이다 일부 실시양태들에서, 프로모터는 잎-특이 프로모터이다. 일부 실시양태들에서, 프로모터는 측두-특이 (temporal-specific) 프로모터이다. 일부 실시양태들에서, 프로모터는 꽃밥-및/또는 꽃가루-특이 (anther- and/or pollen-specific) 프로모터이다. 일부 실시양태들에서, 프로모터는 꽃-특이 (floral-specific) 프로모터이다. 일부 실시양태들에서, 프로모터의 조합이 발현 벡터로 사용 된다.

상기 서술된 실시양태들의 어떤 것에서는, 프로모터는 Rbcs1A, GAPA-1, 또는 FBA2 이다. 일부 실시양태들에서, Rbcs1A 프로모터는 ZEP 발현을 유도하고, GAPA-1 프로모터는 PsbS의 발현을 유도 하고, 및 FBA2 프로모터는 VDE의 발현을 유도한다. 일부 실시양태들에서, 벡터는 T-DNA 이다. 일부 실시양태들에서, 발현 벡터는 항생제 저항성을 제공하는 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 더 포함한다. 일부 실시양태들에서, 발현 벡터는 발현 조절 서열 및 PsbS, ZEP 및 VDE 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 플랭킹하는 (flanking) 좌측 경계(left border, LB) 및 우측 경계(right border, RB) 도메인을 더 포함한다. 일부 실시양태들에서, 발현 벡터는 박테리아 세포에 있다. 일부 실시양태들에서, 발현 벡터는 아그로박테리움 (Agrobacterium cell) 세포에 있다.

본 발명의 방법

어떤 다른 측면에서는, 본 발명은 상기 서술된 하나 이상의 폴리펩타이드의 식물에서의 발현 증가를 포함하여 식물에서 광합성 및 성장을 증가시키는 방법들에 관한 것이다.

일부 실시양태들에서는, 증가된 발현은 식물에 PsbS, ZEP, 및 VDE를 암호화하는 하나 이상의 이종 뉴클레오티드 서열을 도입 시킴으로써 달성 될 수 있다. 일부 실시양태들에서는, 증가된 발현은 PsbS, ZEP, 및 VDE 중 어느 것을 암호화하는 내부 뉴클레오티드 서열의 발현을 변경 시킴으로써 달성 될 수 있다. 일부 실시양태들에서는, 증가된 발현은 PsbS, ZEP, 및 VDE 중 어느 것을 암호화하는 내부 뉴클레오티드 서열의 프로모터를 변경 시킴으로써 달성 될 수 있다. 일부 실시양태들에서는, 증가된 발현은 PsbS, ZEP, 및 VDE 중 어느 것의 전사효율은 조절하는 전사인자를 변경 시킴으로써 달성 될 수 있다. 일부 실시양태들에서는, 증가된 발현은 PsbS, ZEP, 및 VDE 중 어느 것의 mRNA의 안정성을 증가 시킴으로써 달성 될 수 있다. 일부 실시양태들에서는, 증가된 발현은 PsbS, ZEP, 및 VDE 중 어느 것의 코돈 사용도 (codon usage)를 최적화 시킴으로써 달성 될 수 있다. 일부 실시양태들에서는, 증가된 발현은 식물에서 후생유전(epigenetics)을 변경함으로써 달성 될 수 있다. 일부 실시양태들에서는, 증가된 발현은 식물에서 DNA 메틸화를 변경 시킴으로써 달성 될 수 있다. 일부 실시양태들에서는, 증가된 발현은 식물에서 히스톤 수정 (histon modification)을 변경 시킴으로써 달성 될 수 있다. 일부 실시양태들에서는, 증가된 발현은 식물에서 스몰 RNA(sRNA)를 변경 시킴으로써 달성 될 수 있다. 일부 실시양태들에서는, 증가된 발현은 식물에서 PsbS, ZEP, 및 VDE 중 어느 것의 번역 효율 (translation efficiency)를 증가 시킴으로써 달성 될 수 있다. 일부 실시양태들에서는, 이것에만 국한하지는 않으나 ZFN, TALEN 및 CRISPR를 포함하는 유전체-편집 (genome-editing) 기술이 PsbS, ZEP, 및 VDE의 발현을 조절하는 뉴클레오티드 서열을 변경시키는데 사용된다.

일부 실시양태들에서는, 식물에서의 VDE의 전사 수준은 대조군 식물에 비교하여 3배 증가한다. 일부 실시양태들에서는, 식물에서의 PsbS의 전사 수준은 대조군 식물에 비교하여 3배 증가한다. 일부 실시양태들에서는, 식물에서의 ZEP의 전사 수준은 대조군 식물에 비교하여 8배 증가한다. 일부 실시양태들에서는, 식물에서의 VDE의 전사 수준은 대조군 식물에 비교하여 10배 증가한다. 일부 실시양태들에서는, 식물에서의 PsbS의 전사 수준은 대조군 식물에 비교하여 3배 증가한다. 일부 실시양태들에서는, 식물에서의 ZEP의 전사 수준은 대조군 식물에 비교하여 6배 증가한다. 일부 실시양태들에서는, 식물에서의 VDE의 전사 수준은 대조군 식물에 비교하여 4배 증가한다. 일부 실시양태들에서는, 식물에서의 PsbS의 전사 수준은 대조군 식물에 비교하여 1.2배 증가한다. 일부 실시양태들에서는, 식물에서의 ZEP의 전사 수준은 대조군 식물에 비교하여 7배 증가한다. 일부 실시양태들에서는, 식물에서의 VDE의 단백질 수준은 대조군 식물에 비교하여 16배 증가한다. 일부 실시양태들에서는, 식물에서의 PsbS의 단백질 수준은 대조군 식물에 비교하여 2배 증가한다. 일부 실시양태들에서는, 식물에서의 ZEP의 단백질 수준은 대조군 식물에 비교하여 80배 증가한다. 일부 실시양태들에서는, 식물에서의 VDE의 단백질 수준은 대조군 식물에 비교하여 30배 증가한다. 일부 실시양태들에서는, 식물에서의 PsbS의 단백질 수준은 대조군 식물에 비교하여 4배 증가한다. 일부 실시양태들에서는, 식물에서의 ZEP의 단백질 수준은 대조군 식물에 비교하여 74배 증가한다. 일부 실시양태들에서는, 식물에서의 VDE의 단백질 수준은 대조군 식물에 비교하여 47배 증가한다. 일부 실시양태들에서는, 식물에서의 PsbS의 단백질 수준은 대조군 식물에 비교하여 3배 증가한다. 일부 실시양태들에서는, 식물에서의 ZEP의 단백질 수준은 대조군 식물에 비교하여 75배 증가한다. 일부 실시양태들에서는, 식물에서 VDE, PsbS, 및 ZEP 사이의 전사 수준의 증가는 대조군 식물에 비교하여 3:3:8, 10:3:6 또는 4:1.2:7의 비율 이다. 일부 실시양태들에서는, 식물에서 VDE, PsbS, 및 ZEP의 단백질 수준의 증가는 대조군 식물에 비교하여 16:2:80, 30:4:74, 또는 47:3:75 의 비율이다. 일부 실시양태들에서는, 식물에서 VDE의 전사 수준의 증가는 대조군 식물에 비교하여 3배 내지 10배 범위에 있다. 일부 실시양태들에서는, 식물에서 PsbS의 전사 수준의 증가는 대조군 식물에 비교하여 약 1.2배 내지 약 3배 이다. 일부 실시양태들에서는, 식물에서 ZEP의 전사 수준의 증가는 대조군 식물에 비교하여 약 6배 내지 약 8배 이다. 일부 실시양태들에서는, 식물에서 VDE의 단백질 수준의 증가는 대조군 식물에 비교하여 16배 내지 47배 이다. 일부 실시양태들에서는, 식물에서 PsbS의 단백질 수준의 증가는 대조군 식물에 비교하여 약 2배 내지 약 4배 이다. 일부 실시양태들에서는, 식물에서 ZEP의 단백질 수준의 증가는 대조군 식물에 비교하여 약 74배 내지 약 80배 이다.

변동하는 빛 조건 하에서 성장을 증가시키는 방법

일 측면에서, 하기는 PsbS, ZEP, 및/또는 VDE 의 식물에서 발현을 증가시켜 이로 인해 대조군 식물에 비해 하나 이상의 폴리펩타이드의 발현이 증가된 식물을 생산하는 것을 포함하는, 변동하는 빛 조건 하에서 식물의 성장을 증가 시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서는, 증가된 발현은 전사 수준의 증가 형태이다. 일부 실시양태에서는, PsbS, ZEP, 또는 VDE 중 어느 것의 전사 수준은 대조군 식물에 비교하여 적어도 약 1배, 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 적어도 약 6배, 적어도 약 7배, 적어도 약 8배, 적어도 약 9배, 적어도 약 10배, 적어도 약 15배, 적어도 약 20배, 또는 적어도 약 30배로 증가된다. 일부 실시양태에서는, 증가된 발현은 단백질 수준의 증가형태이다. 일부 실시양태에서는, VDE, PsbS 또는 ZEP 중 어느 것의 단백질 수준은 대조군 식물과 비교하여 적어도 약 1배, 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 적어도 약 6배, 적어도 약 7배, 적어도 약 8배, 적어도 약 9배, 적어도 약 10배, 적어도 약 20배, 적어도 약 30배, 적어도 약 40배, 적어도 약 50배, 적어도 약 60배, 적어도 약 70배, 적어도 약 80배, 적어도 약 90배, 또는 적어도 약 100배 증가된다. 일부 실시양태에서는, 방법에는 PsbS의 발현을 증가시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서는, 방법에는 ZEP의 발현을 증가시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서는, 방법에는 VDE의 발현을 증가시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서는, 방법에는 PsbS 및 ZEP의 발현을 증가시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서는, 방법에는 PsbS 및 VDE의 발현을 증가시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서는, 방법에는 ZEP 및 VDE의 발현을 증가시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서는, 방법에는 PsbS, ZEP 및 VDE의 발현을 증가시키는 것을 포함한다.

상기 서술된 실시양태들의 어떤 것에서는, PsbS 는 서열 번호 1 과 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화 된다. 일부 실시양태들에서는, ZEP는 서열 번호 2와 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화 된다. 일부 실시양태들에서는, VDE는 서열 번호 3과 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화 된다.

상기 서술된 실시양태들의 어떤 것에서는, PsbS 는 서열 번호 4와 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시양태들에서는, ZEP는 서열 번호 5와 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시양태들에서는, VDE는 서열 번호 6과 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시양태들에서는, PsbS는 서열 번호 7의 보존 도메인을 더 포함한다. 일부 실시양태들에서는, ZEP는 서열 번호 8의 보존 도메인을 더 포함한다. 일부 실시양태들에서는, VDE는 서열 번호 9의 보존 도메인을 더 포함한다.

상기 서술된 실시양태들의 어떤 것에서는, 식물은 옥수수(Zea mays)이다. 일부 실시양태들에서 식물은 쌀(Oryza sativa)이다. 일부 실시양태들에서, 식물은 수수(Sorghum bicolor) 다. 일부 실시양태들에서, 식물은 대두(Glycine max)이다. 일부 실시양태들에서, 식물은 동부(Vigna unguiculata)다. 일부 실시양태들에서, 식물은 포플러(Populus spp .)이다. 일부 실시양태들에서, 식물은 유칼립투스(Eucalyptus spp.)이다. 일부 실시양태들에서, 식물은 카사바(Manihot esculenta)다. 일부 실시양태들에서, 식물은 보리(Hordeum vulgare)다. 일부 실시양태들에서, 식물은 감자(Solanum tuberosum)다. 일부 실시양태들에서, 식물은 사탕수수(Saccharum spp.)다. 일부 실시양태들에서, 식물은 알팔파(Medicago sativa)다. 일부 실시양태들에서, 식물은 스위치그라스, 억새속(Miscanthus), 개자리속(Medicago), 단수수(sweet sorghum), 곡용 수수(grain sorghum), 사탕수수(sugarcane), 에너지 수수(energy cane), 코끼리 풀(elephant grass), 옥수수(maize), 카사바(cassava), 동부(cowpea), 밀(wheat), 보리(barley), 귀리(oats), 쌀(rice), 대두(soybean), 팜유(oil palm), 잇꽃(safflower), 참깨(sesame), 담배(tobacco), 아마(flax), 목화(cotton), 해바라기(sunflower), 양구슬냉이속(Camelina), 유채(Brassica napus), 브라시카 카리나타(Brassica carinata), 갓(Brassica juncea), 펄 밀렛(pearl millet), 조(foxtail millet), 다른 곡물(other grain), 쌀(rice), 오일시드(oilseed), 채소 작물( vegetable crop), 사료 작물(forage crop), 공예 작물(industrial crop), 목본 작물(woody crop) 또는 바이오매스 작물(biomass crop) 이다.

변동하는 빛 조건 하에서 광합성 효율을 증가시키는 방법

다른 측면에서, 하기는 PsbS, ZEP, 및/또는 VDE 의 식물에서 발현을 증가시켜 이로 인해 대조군 식물에 비해 하나 이상의 폴리펩타이드의 발현이 증가된 식물을 생산하는 것을 포함하는, 변동하는 빛 조건 하에서 식물의 광합성 효율 증가 시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서는, 증가된 발현은 전사 수준의 증가 형태이다. 일부 실시양태에서는, PsbS, ZEP, 또는 VDE 중 어느 것의 전사 수준은 대조군 식물에 비교하여 적어도 약 1배, 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 적어도 약 6배, 적어도 약 7배, 적어도 약 8배, 적어도 약 9배, 적어도 약 10배, 적어도 약 15배, 적어도 약 20배, 또는 적어도 약 30배로 증가된다. 일부 실시양태에서는, 증가된 발현은 단백질 수준의 증가 형태이다. 일부 실시양태에서는, VDE, PsbS 또는 ZEP 중 어느 것의 단백질 수준은 대조군 식물과 비교하여 적어도 약 1배, 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 적어도 약 6배, 적어도 약 7배, 적어도 약 8배, 적어도 약 9배, 적어도 약 10배, 적어도 약 20배, 적어도 약 30배, 적어도 약 40배, 적어도 약 50배, 적어도 약 60배, 적어도 약 70배, 적어도 약 80배, 적어도 약 90배, 또는 적어도 약 100배 증가된다. 일부 실시양태에서는, 방법에는 PsbS의 발현을 증가시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서는, 방법에는 ZEP의 발현을 증가시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서는, 방법에는 VDE의 발현을 증가시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서는, 방법에는 PsbS 및 ZEP의 발현을 증가시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서는, 방법에는 PsbS 및 VDE의 발현을 증가시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서는, 방법에는 ZEP 및 VDE의 발현을 증가시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서는, 방법에는 PsbS, ZEP 및 VDE의 발현을 증가시키는 것을 포함한다.

변동하는 빛 조건 하에서 광보호 효율을 증가시키는 방법

다른 측면에서, 하기는 PsbS, ZEP, 및/또는 VDE 의 식물에서 발현을 증가시켜 이로 인해 대조군 식물에 비해 하나 이상의 폴리펩타이드의 발현이 증가된 식물을 생산하는 것을 포함하는, 변동하는 빛 조건 하에서 식물의 광보호 효율 증가 시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서는, 증가된 발현은 전사 수준의 증가 형태이다. 일부 실시양태에서는, PsbS, ZEP, 또는 VDE 중 어느 것의 전사 수준은 대조군 식물에 비교하여 적어도 약 1배, 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 적어도 약 6배, 적어도 약 7배, 적어도 약 8배, 적어도 약 9배, 적어도 약 10배, 적어도 약 15배, 적어도 약 20배, 또는 적어도 약 30배로 증가된다. 일부 실시양태에서는, 증가된 발현은 단백질 수준의 증가 형태이다. 일부 실시양태에서는, VDE, PsbS 또는 ZEP 중 어느 것의 단백질 수준은 대조군 식물과 비교하여 적어도 약 1배, 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 적어도 약 6배, 적어도 약 7배, 적어도 약 8배, 적어도 약 9배, 적어도 약 10배, 적어도 약 20배, 적어도 약 30배, 적어도 약 40배, 적어도 약 50배, 적어도 약 60배, 적어도 약 70배, 적어도 약 80배, 적어도 약 90배, 또는 적어도 약 100배 증가된다. 일부 실시양태에서는, 방법에는 PsbS의 발현을 증가시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서는, 방법에는 ZEP의 발현을 증가시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서는, 방법에는 VDE의 발현을 증가시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서는, 방법에는 PsbS 및 ZEP의 발현을 증가시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서는, 방법에는 PsbS 및 VDE의 발현을 증가시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서는, 방법에는 ZEP 및 VDE의 발현을 증가시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서는, 방법에는 PsbS, ZEP 및 VDE의 발현을 증가시키는 것을 포함한다.

상기 서술된 실시양태들의 어떤 것에서는, PsbS 는 서열 번호 1 과 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된다. 일부 실시양태들에서는, ZEP는 서열 번호 2와 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된다. 일부 실시양태들에서는, VDE는 서열 번호 3과 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된다.

변동하는 빛 조건 하에서 양자 효율 및 CO ₂ 고정을 증가시키는 방법

다른 측면에서, 하기는 PsbS, ZEP, 및/또는 VDE 의 식물에서 발현을 증가시켜 이로 인해 대조군 식물에 비해 하나 이상의 폴리펩타이드의 발현이 증가된 식물을 생산하는 것을 포함하는, 변동하는 빛 조건 하에서 식물의 양자 수율 및 CO₂ 고정을 증가 시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서는, 증가된 발현은 전사 수준의 증가 형태이다. 일부 실시양태에서는, PsbS, ZEP, 또는 VDE 중 어느 것의 전사 수준은 대조군 식물에 비교하여 적어도 약 1배, 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 적어도 약 6배, 적어도 약 7배, 적어도 약 8배, 적어도 약 9배, 적어도 약 10배, 적어도 약 15배, 적어도 약 20배, 또는 적어도 약 30배로 증가된다. 일부 실시양태에서는, 증가된 발현은 단백질 수준의 증가 형태이다. 일부 실시양태에서는, VDE, PsbS 또는 ZEP 중 어느 것의 단백질 수준은 대조군 식물과 비교하여 적어도 약 1배, 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 적어도 약 6배, 적어도 약 7배, 적어도 약 8배, 적어도 약 9배, 적어도 약 10배, 적어도 약 20배, 적어도 약 30배, 적어도 약 40배, 적어도 약 50배, 적어도 약 60배, 적어도 약 70배, 적어도 약 80배, 적어도 약 90배, 또는 적어도 약 100배 증가된다. 일부 실시양태에서는, 방법에는 PsbS의 발현을 증가시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서는, 방법에는 ZEP의 발현을 증가시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서는, 방법에는 VDE의 발현을 증가시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서는, 방법에는 PsbS 및 ZEP의 발현을 증가시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서는, 방법에는 PsbS 및 VDE의 발현을 증가시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서는, 방법에는 ZEP 및 VDE의 발현을 증가시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서는, 방법에는 PsbS, ZEP 및 VDE의 발현을 증가시키는 것을 포함한다.

상기 서술된 실시양태들의 어떤 것에서는, PsbS 는 서열번호 1과 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화 된다. 일부 실시양태들에서는, ZEP는 서열 번호 2와 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화 된다. 일부 실시양태들에서는, VDE는 서열 번호 3과 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된다.

변동하는 빛 조건 하에서 비-광화학적 소멸 (non-photochemical quenching) (NPQ)의 이완 율을 증가시키는 방법

다른 측면에서, 하기는 PsbS, ZEP, 및/또는 VDE 의 식물에서 발현을 증가시켜 이로 인해 대조군 식물에 비해 하나 이상의 폴리펩타이드의 발현이 증가된 식물을 생산하는 것을 포함하는, 변동하는 빛 조건 하에서 식물의 비-광화학적 소멸 (NPQ)의 이완 율을 증가 시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서는, 증가된 발현은 전사 수준의 증가 형태이다. 일부 실시양태에서는, PsbS, ZEP, 또는 VDE 중 어느 것의 전사 수준은 대조군 식물에 비교하여 적어도 약 1배, 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 적어도 약 6배, 적어도 약 7배, 적어도 약 8배, 적어도 약 9배, 적어도 약 10배, 적어도 약 15배, 적어도 약 20배, 또는 적어도 약 30배로 증가된다. 일부 실시양태에서는, 증가된 발현은 단백질 수준의 증가 형태이다. 일부 실시양태에서는, VDE, PsbS 또는 ZEP 중 어느 것의 단백질 수준은 대조군 식물과 비교하여 적어도 약 1배, 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 적어도 약 6배, 적어도 약 7배, 적어도 약 8배, 적어도 약 9배, 적어도 약 10배, 적어도 약 20배, 적어도 약 30배, 적어도 약 40배, 적어도 약 50배, 적어도 약 60배, 적어도 약 70배, 적어도 약 80배, 적어도 약 90배, 또는 적어도 약 100배 증가된다. 일부 실시양태에서는, 방법에는 PsbS의 발현을 증가시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서는, 방법에는 ZEP의 발현을 증가시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서는, 방법에는 VDE의 발현을 증가시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서는, 방법에는 PsbS 및 ZEP의 발현을 증가시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서는, 방법에는 PsbS 및 VDE의 발현을 증가시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서는, 방법에는 ZEP 및 VDE의 발현을 증가시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서는, 방법에는 PsbS, ZEP 및 VDE의 발현을 증가시키는 것을 포함한다.

변동하는 빛 조건 하에서 향상된 성장 특성을 갖는 식물을 선택하는 방법

다른 측면에서, 하기는 변동하는 빛 조건하에서 향상된 성장 특성을 갖는 식물을 선택하는 방법을 제공하며 그 방법에는 다음을 포함한다: 식물 집단을 제공하는 단계; PsbS, ZEP 및 VDE의 활성을 증가 시키기 위해 식물 집단을 변경하는 단계; 식물에서 변동하는 빛 조건 하에서 비-광화학적 소멸 (NPQ)의 수준을 탐색하는 단계; 식물에서 변동하는 빛 조건 하에서 비-광화학적 소멸 (NPQ)의 수준을 변동하는 빛 조건 하에서의 대조군의 비-광화학적 소멸 (NPQ)의 수준과 비교하는 단계; 및 식물이 높은 빛 강도에서 낮은 빛 강도로 전이 될 때 비-광화학적 소멸 (NPQ)의 이완 비율이 증가된 식물은 선택하는 단계. 일부 실시양태에서, NPQ 대조군 수준은 그 식물 집단에서 가장 낮은 NPQ 수준이다. 일부 실시양태에서, NPQ 대조군 수준은 그 식물 집단에서의 평균중앙값의 NPQ 수준이다. 일부 실시양태에서, NPQ 대조군 수준은 그 식물 집단에서의 평균 값 수준의 NPQ 이다. 일부 실시양태에서, NPQ 대조군 수준은 대조군 식물에서의 NPQ 수준이다. 일부 실시양태에서, 집단에는 PsbS, ZEP 및/또는 VDE의 이종 서열을 발현하는 식물, 또는 PsbS, ZEP 및/또는 VDE 발현을 증가시키기 위하여 유전체가 편집된 식물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 유전체 편집 기술은 ZFN 이다. 일부 실시양태에서, 유전체 편집 기술은 탈렌 (TALEN) 이다. 일부 실시양태에서, 유전체 편집 기술은 크리스퍼 (CRISPER) 이다. 일부 실시양태에서 PsbS의 프로모터가 변경되었다. 일부 실시양태에서 ZEP의 프로모터가 변경되었다. 일부 실시양태에서, VDE의 프로모터가 변경되었다. 일부 실시양태에서, 그 집단에는 PsbS, ZEP 및/또는 VDE에 돌연변이를 유도하기 위해 처치된 식물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이원(mutagen)은 EMS 이다.

상기 서술된 실시양태들의 어떤 것에서는, 식물은 옥수수(Zea mays)이다. 일부 실시양태들에서 식물은 쌀(Oryza sativa)이다. 일부 실시양태들에서, 식물은 수수(Sorghum bicolor) 다. 일부 실시양태들에서, 식물은 대 (Glycine max)이다. 일부 실시양태들에서, 식물은 동부(Vigna unguiculata)다. 일부 실시양태들에서, 식물은 포플러(Populus spp .)이다. 일부 실시양태들에서, 식물은 유칼립투스(Eucalyptus spp.)이다. 일부 실시양태들에서, 식물은 카사바(Manihot esculenta)다. 일부 실시양태들에서, 식물은 보리(Hordeum vulgare)다. 일부 실시양태들에서, 식물은 감자 (Solanum tuberosum)다. 일부 실시양태들에서, 식물은 사탕수수(Saccharum spp.)다. 일부 실시양태들에서, 식물은 알팔파(Medicago sativa)다. 일부 실시양태들에서, 식물은 스위치그라스, 억새속(Miscanthus), 개자리속(Medicago), 단수수(sweet sorghum), 곡용 수수(grain sorghum), 사탕수수(sugarcane), 에너지 수수(energy cane), 코끼리 풀(elephant grass), 옥수수 (maize), 카사바 (cassava), 동부(cowpea), 밀(wheat), 보리(barley), 귀리(oats), 쌀(rice), 대두(soybean), 팜유(oil palm), 잇꽃(safflower), 참깨(sesame), 담배(tobacco), 아마(flax), 목화(cotton), 해바라기(sunflower), 양구슬냉이속(Camelina), 유채(Brassica napus), 브라시카 카리나타(Brassica carinata), 갓(Brassica juncea), 펄 밀렛(pearl millet), 조(foxtail millet), 다른 곡물(other grain), 쌀(rice), 오일시드(oilseed), 채소 작물( vegetable crop), 사료 작물(forage crop), 공예 작물(industrial crop), 목본 작물(woody crop) 또는 바이오매스 작물(biomass crop) 이다.

변동하는 빛 조건 하에서 향상된 성장 특성과 연관된 다형성 (polymorphism)을 스크리닝하는 방법

다른 측면에서, 하기는 변동하는 빛 조건하에서 향상된 성장 특성과 연관된 뉴클레오티드 서열 다형성 (polymorphism)을 스크리닝 하는 방법을 제공하며 그 방법에는 다음을 포함한다: 식물 집단을 제공하는 단계; 그 식물 집단에서 PsbS, ZEP 및 VDE 를 조절하고 및/또는 암호화하는 임의의 뉴클레오티드 서열을 얻는 단계; 그 식물 집단에서 PsbS, ZEP 및 VDE 를 조절하고 및/또는 암호화하는 임의의 뉴클레오티드 서열에서 하나 이상의 다형성을 얻는 단계; 그 식물 집단에서 높은 빛의 강도에서 낮은 빛의 강도로 전이될 때 비-광화학적 소멸(NPQ) 이완 율을 검출하는 단계; 그 식물 집단에서 NPQ 이완 율과 다형성과의 연관성을 결정하기 위한 통계적 분석 수행에 단계; 및 그 식물 집단에서 NPQ 이완 율과 통계적으로 유의한 다형성을 가진 식물을 선택하는 단계. 일부 실시양태에서 그 집단은 생식소(germplasm) 의 모음이다. 일부 실시양태에서, 그 집단은 PsbS, ZEP 및/또는 VDE의 이종 서열을 발현하거나 또는 PsbS, ZEP 및/또는 VDE 의 발현을 증가 시키기 위해 유전체가 편집 된 식물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 그 집단은 돌연변이를 유도하기 위해 처치되지 않은 식물을 포함한다. 일부 실시양태에서, PsbS, ZEP 및/또는 VDE에 돌연변이가 유도되도록 처치된 식물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 다형성(polymorphism)은 단일염기 다형성 (single nucleotide polymorphism)(SNP)이다. 일부 실시양태에서, 다형성 은 삽입/삭제(insertion/deletiom)(Indel)이다. 일부 실시양태에서, 다형성 은 단순 서열 반복 (simple sequence repeat)(SSR)이다. 일부 실시양태에서, 다형성은 변화(variation)의 유/무(presence/absence) (PAV)이다. 일부 실시양태에서, 다형성은 카피 수의 변화 (copy number variation)(CNV)이다. 일부 실시양태에서, 다형성은 PbsS의 프로모터에 위치하고 있다. 일부 실시양태에서, 다형성은 ZEP의 프로모터에 위치하고 있다. 일부 실시양태에서, 다형성은 VDE의 프로모터에 위치하고 있다. 일부 실시양태에서, 다형성은 생거 염기 서열 분석(Sanger sequencing)으로 검출 된다. 일부 실시양태에서, 다형성은 다음세대 염기 서열 분석(next-generation-sequencing) 으로 검출 된다. 일부 실시양태에서, 다형성은 아가로즈 겔(agarose gel) 전기영동으로 검출 된다. 일부 실시양태에서, 다형성은 폴리아크리아마이드 겔 (polyacryl amide gel) 전기영동으로 검출 된다. 일부 실시양태에서, 다형성은 그 다형성이 동정된 집단과는 다른 집단을 스크리닝하는데 더 사용된다. 일부 실시양태에서, 다형성은 식물의 성장 특성을 향상시키기 위해 유전체를 편집하는 타겟으로 더 사용될 수 있다.

상기 서술된 실시양태들의 어떤 것에서는, 향상된 성장 특성은 향상된 성장이다. 일부 실시양태들에서, 향상된 성장 특성은 향상된 광합성 효율이다. 일부 실시양태들에서, 향상된 성장 특성은 향상된 광보호 효율이다. 일부 실시양태들에서, 향상된 성장 특성은 향상된 광보호 효율이다 일부 실시양태들에서, 향상된 성장 특성은 향상된 양자 수율 및 CO₂ 고정이다. 일부 실시양태들에서, 향상된 성장 특성은 향상된 비-광화학적 소멸(NPQ)의 이완 율이다. 일부 실시양태들에서, NPQ는 엽록소 형광 이미징 (chlorophyll fluorescence imaging)을 사용하여 검출된다.

본원에 서술된 실시양태들의 실행을 위한 일반적인 방법들

관심있는 뉴클레오티드 서열로 식물내의 형질전환

형질전환 식물은 관심있는 어느 뉴클레오티드 서열을 식물 또는 식물 세포에 발현시키기 위해 기존 전통적인 방법을 사용하여 생산될 수 있다. (Methods in Molecular Biology, 2005, vol. 286, Transgenic Plants: Methods and Protocols, Pena L., ed., Humana Press, Inc. Totowa, NT). 일반적으로, 유전자 전달, 또는 형질전환은 완전하고 생식력이 있는 식물을 생산하는 재생 능력이 있는 외식 (explant)을 사용하여 수행될 수 있다. 일반적으로, 개체에 도입 되는 DNA 또는 RNA 분자는 형질전환 벡터의 일부분이다. 플라즈미드와 같은 이 분야에서 알려진 많은 여러 그러한 벡터 시스템들을 사용할 수 있다. 예를 들어, 도입되는 핵산의 발현을 증가시키기 위해 발현 시스템의 성분들은 변경 될 수 있다. 예를 들어, 짤린 서열 (truncated sequence), 대체된 되거나 또는 다르게 수정된 핵산 서열이 사용될 수 있다. 이 분야에서 알려진 발현 시스템은 적절한 조건하에서 사실상 거의 어느 식물 세포의 형질전환을 위해 사용될 수 있다. 관심 있는 유전자를 암호화 하고 있는 DNA 분자를 포함하고 있는 형질전환 유전자는 바람직하게는 안정적으로 형질 전환되며 숙주의 유전체내에 안정하게 통합(integration)된다. 형질 전환된 세포는 바람직하게는 완전한 식물로 재생된다. 형질전환 기술에 대한 상세한 서술은 이 분야 통상 전문가들의 지식 내에 있다.

형질전환을 위한 유전자 구조 (genetic construct)

상기 서술된 방법에 유용한 DNA 구조에는 식물에 형질전환 유전자를 도입시킬 수 있는 능력이 있는 형질전환 벡터가 포함 된다. 여기서 사용된 대로, “형질전환 된 (transgenic)”이란 용어는 이종 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 절편이 도입된 개체를 의미한다. 형질전환 된 개체의 형질전환 유전자는 바람직하게는 안정적이고 유전 가능하다. 이종의 핵산 절편은 숙주 유전체에 통합되거나 또는 되지 않을 수 있다.

하기에 서술된 것에 있는 것을 포함하는, 여러 식물 형질전환 벡터들의 선택이 가능하다; Gene Transfer to Plants, 1995, Potrykus et al, eds., Springer- Verlag Berlin Heidelberg New York, Transgenic Plants: A Production System for Industrial and Pharmaceutical Proteins, 1996, Owen et al, eds., John Wiley & Sons Ltd. England, 및 Methods in Plant Molecular Biology: A Laboratory Course Manual, 1995, Maliga et al., eds., Cold Spring Laboratory Press, New York. 이 접근 방법은 다 수의 형질전환 유전자를 한 부위 (single locus)에 위치 시킬 수 있는 장점이 있으며, 이는 이어지는 다음 세대 식물 번식 노력에 유리하다. 일부 실시양태에서, 벡터는 식물, 식물의 한 부분, 식물 재료, 식물종자 또는 식물세포에서 PsbS, ZEP 및 VDE로부터 선택된 하나 이상의 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 발현을 유도 할 수 있는 능력을 가진 적어도 하나의 발현조절 서열을 포함한다. 다른 실시양태에서, 프로모터는 Rbcs1A, GAPA-1 및 FBA2로부터 선택된다. 다른 실시양태에서는, Rbcs1A 프로모터는 ZEP 발현을 유도하며, GAPA-1 프로모터는 ZEP 발현을 유도하고 및 FBA2는 VDE 발현을 유도한다. 다른 실시양태에서는, 벡터는 T-DNA 이다. 다른 실시양태에서는, 벡터는 도 9에 보여진다. 이분야 통상 전문가에게 알려진 대로, 한 타입의 식물에서 작용하는 특정한 프로모터 및 벡터는 다른 식물 타입에서 작용을 하지 않을 수 있다. 상기 서술된 대로, 형질전환된 식물을 만드는 방법은 이 분야에서는 잘 알려져 있다.

T-DNA

아그로박테리움-중개 하는(Agrobacterium -mediated) 형질전환방법으로 식물에 형질전환유전자를 도입하는 방법에는 일반적으로 적어도 한 형질전환유전자의 유전적 요소를 통합하고 그 유전적 요소를 식물의 유전체에 전달하는 T-DNA (transfer DNA)가 관여 된다. 그 형질전환 유전자(들)는 전형적으로 DNA 플라즈미드 (plasmid) 벡터에 만들어지고 보통 아그로박테리움 Ti 플라즈미드의 오른쪽 경계 DNA 부위 (RB) 및 왼쪽 경계 DNA 부위 (LB)와 인접 (flanking) 해 있다. 아그로박테리움-중개 하는 (Agrobacterium -mediated) 형질전환 과정 동안에, DNA 플라즈미드는 오른쪽 경계 (RB) 및 왼쪽 경계 부위에 내부핵산분해 효소(endonuclease), VirD2, 에 의해 구멍 (nick)이 생긴다. T-가닥 (T-strand)으로 불리는, 구멍 사이의 한 가닥 DNA (single strand DNA)는, 아그로박테리움 세포로부터 식물 세포로 전달 된다. T-DNA 부위에 해당하는 서열이 식물 유전체로 삽입된다.

T-DNA의 식물 유전체에의 삽입은 보통 오른쪽 경계에서 시작되고 T-DNA 끝, 왼쪽 경계로 계속 된다. 그러나 내부핵산분해 효소는 가끔 구멍을 양쪽 경계에 동일하게 만들지는 않는다. 이런 일이 일어날 때는, 식물 유전체에 삽입된 T-DNA는 자주 플라즈미드 벡터 DNA의 일부 또는 전부의 서열을 포함한다. 이 현상을 자주 “리드-스루 (read-through)”라고 불린다. 바람직한 접근 방법은 인접한 어느 플라즈미드 벡터 DNA도 (벡터 뼈대, vector backbone)) 없이 자주 오른 쪽 경계 (RB) 와 왼쪽 경계 (LB) 사이의 형질전환 유전자 DNA (T-DNA) 만을 식물 유전체에 전달하는 것이다. 벡터 뼈대 DNA는 예를 들어, 복제 시작점, 박테리아 선택 마커 유전자들, 및 식물에서 바람직한 특징(들)을 발현하는 데는 필요하지 않은 다른 DNA 조각을 포함하는, 여러가지 플라즈미드 유지 요소들을 함유한다.

식물 세포에서 하나 이상의 유전자를 발현시키기 위하여 만들어진 미니크로모좀 (engineered minichromosome)이 또한 사용될 수 있다. 세포에 도입된 클론된 텔로미어 반복서열 (cloned telomeric repeats)은 통합 부위에 새로운 텔로미어를 형성하게 함으로써 크로모좀의 먼 부분이 잘라지게 할 수 있다. 이 방법을 사용하여, 자연 식물의 크로모좀 팔 (chromosomr arm)을 잘라내고 큰 삽입을 위한 삽입부위를 추가함으로서 유전자 전달을 위한 벡터가 제조 될 수 있다 (Yu et al., 2006, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103: 17331-17336; Yu et al., 2007, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104: 8924-8929).

식물에서 크로모좀 공학기술의 다른 접근 방법에는 식물 자동 미니크로모좀들을 생체 내에서 조립하는 것이 관련된다 (Carlson et al., 2007, PLoS Genet. 3: 1965- 74). 식물 세포는 중심체 서열로 형질전환 될 수 있으며, 신규로 자동 크로모좀을 조립한 식물을 스크리닝 할 수 있다. 유용한 구조 (construct)는 선택 마커 유전자와 중심체 세타라이트 (centromeric satellite) 및 레트로요소 (retroelement) 서열 및/또는 다른 반복서열을 포함하는 유전체 DNA 조각과 병합하는 것이다.

서술된 발명에서 유용한 다른 접근 방법은 만들어진 특성 부위(Engineered Trait Loci)("ETL") 기술 (U.S. Patent No. 6,077,697; US 2006/0143732) 이다. 이 시스템은 DNA를 차단동원체 염색체 (acrocentric chromosome)의 짧은 팔에 있는 함동원체 헤테로크로마틴 (pericentric heterochromatin)과 같은 식물 크로모좀의 헤테로크로마틴 부위 (heterochromatin region)에 타겟 하는 것이다. 타겟팅 하는 서열은 라이보좀 DNA(rDNA) 또는 람다 파지 DNA(lamda phage DNA)를 포함할 수 있다. 함동원체 (pericentric) rDNA 부위는 안정적인 삽입, 낮은 재조합, 및 높은 수준의 발현을 지원한다. 이 기술은 또한 식물에 여러 특징을 겹쳐 쌓아 두는데 유용하다 (USA 2006/0246586).

아연-손가락-핵산분해효소 (Zinc-finger nucleases) (ZFN), TALEN 및 CRISPR-Cas9 는 식물 크로모좀의 특정한 부위에 이중 선 DNA (double strand DNA)가 쪼개지게 하여 타겟한 유전자의 도입 또는 삭제를 수행 할 수 있게 함으로서 또한 본 발명을 실용화하는데 유용하다 (Shukla et al., 2009, Nature 459: 437- 441 ; Townsend et al, 2009, Nature 459: 442-445, WO 2015089427 A1).

핵 형질전환을 위한 조직-배양에 기반한 방법

뉴클레오티드 서열을 식물에 도입하는 프로토콜은 물론, 형질전환 프로토콜 (protocol)들은 식물 또는 식물 세포 타입 즉, 외떡잎 또는 쌍떡잎, 형질전환을 위한 타겟에 따라 변화될 수 있다.

식물 세포에 뉴클레오티드 서열을 도입시키고 이어서 식물의 유전체에 삽입시키는 적절한 방법들이 US 2010/0229256 Al to Somleva & Ali 및 US 2012/0060413 to Somleva et al. 에 서술되어 있다.

형질전환된 세포들은 전통적인 기술에 따라 식물로 자라게 된다. 예를 들어McCormick et al., 1986, Plant Cell Rep. 5: 81-84 참조. 이 식물들은 그 후 성장시켜, 같은 형질전환 품종 또는 다른 품종들로 수분(pollinate)시켜, 원하는 표현형 성질을 상시적으로 발현하는 결과적으로 얻어지는 잡종(hybrid)을 동정한다. 원하는 표현형 성질의 상시적 발현이 안정적으로 유지되고 유전 되도록 확실히 하기 위하여 2 세대 이상 성장시키고, 그 후 원하는 표현형 성질의 상시적 발현이 성취된 것을 확신하기 위하여 종자를 수확한다.

식물계 내 (In Plana ) 형질전환 방법

식물계 내 형질전환 과정은 복잡하지는 않다. 조직 배양 조작 및 가능한 체세포영양계 변이 (somaclonal variations)는 피하며 형질전환 식물을 얻기 위하여 단지 짧은 시간 만 요구된다. 그러나, 접종된 식물의 자손에서 그러한 형질전환체 가 나오는 횟수는 상대적으로 낮으며 변화가 있다. 현재로는, 조직 배양에-근거한 재생 시스템 없이는 일상적으로 형질전환 될 수 있는 종은 거의 없다. 안정적인 애기장대 (Arabidopsis) 형질전환체는 진공 침윤법 (vacume infiltration) (Clough & Bent, 1998, The Plant J. 16: 735-743), 발아하는 종자의 형질전환 (Feldmann & Marks, 1987, Mol. Gen. Genet. 208: 1 -9), 꽃잎 담그기 (floral dip) (Clough and Bent, 1998, Plant J. 16: 735-743), 및 꽃잎 스프레이 (floral spray) (Chung et al., 2000, Transgenic Res. 9: 471-476)를 포함하는 몇 가지 식물계 내 (in Planta) 방법으로 얻어질 수 있다. 식물계 내 (in Planta) 방법으로 성공적으로 형질전환 된 다른 식물에는 유채씨 및 무 (진공 침윤법, Ian and Hong, 2001, Transgenic Res., 10: 363-371 ; Desfeux et al., 2000, Plant Physiol. 123: 895-904), 개자리속 (Medicago truncatula) (진공 침윤법, Trieu et al., 2000, Plant J. 22: 531-541), 양구슬냉이속 camelina (꽃입담그기 (floral dip), WO/2009/1 17555 to Nguyen et al.) 및 밀 (wheat) (꽃입담그기 (floral dip), Zale et al., 2009, Plant Cell Rep. 28: 903-913)이 포함된다. 식물계 내 (in Planta) 방법들은 또한 옥수수(maize) (pollen, Wang et al. 2001, Acta Botanica Sin., 43, 275-279; Zhang et al, 2005, Euphytica, 144, 11-22; pistils, Chumakov et al. 2006, Russian J. Genetics, 42, 893-897; Mamontova et al. 2010, Russian J. Genetics, 46, 501-504) 및 수수(Sorghum) (pollen, Wang et al. 2007, Biotechnol. Appl. Biochem., 48, 79-83)의 생식세포의 형질전환에도 사용 되었다.

리포터 유전자 (reporter genes) 및 선택 마커 유전자 (selection marker genes)

여기 참고 문헌으로 병합된 미국 특허 출원 US Patent Applications 20100229256 및 20120060413에 서술된 대로 리포터 유전자 및 선택 마커 유전자들이 발현 조절 서열 (발현 카셋트, expression cassette)에 포함 될 수도 있다. 관심 있는 이종 뉴클레오티드 서열에 작동적으로 연결된 프로모터 서열을 포함하는 발현 카셋트는 상기 서술된 어느 방법으로 어느 식물이나 형질전환 하는데 사용될 수 있다. 유용한 선택 마커 유전자들 및 여러 다른 작물 종 범위의 형질전환 라인을 선택하는 방법들이 하기 실시예들에서 서술된다.

식물에서의 뉴클레오티드 서열의 발현

이 분야 통상 전문가들에게 알려진 모든 방법으로 다른 식물 조직 또는 기관들에 뉴클레오티드 서열의 발현을 조절하기 위하여 식물 프로모터들이 선택될 수 있다 (Gasser & Fraley, 1989, Science 244: 1293-1299).

사용될 프로모터(들)의 선택은, 이것들에만 국한된 것은 아니나, 효율, 선택성, 유도능력, 바람직한 발현 수준, 및/또는 선호적인 세포 또는 조직 발현을 포함하는 여러 요소들에 의존된다. 이 분야 전문가에게는 그 서열에 대비하여 상대적으로 프로모터 및 다른 조절 부위를 적절히 선택하고 위치를 정하여 뉴클레오티드 서열의 발현을 조정하는 것은 일상적인 일이다. 사용될 수 있는 프로모터의 예시들이 이 분야에서 잘 알려져있다. 사용될 수 있는 프로모터들에는 식물 유전체에 있는 것은 물론 및 다른 소스로부터의 프로모터도 포함된다. 어떤 적절한 프로모터들은 특정한 세포 타입에서만 또는 주로 전사를 시작한다. 식물 유전체 DNA 에서 프로모터 부위를 동정하고 성질 규명하는 방법들은, 예를 들어, 조르다노 등 (Jordano, et al., Plant Cell 1:855-866, 1989); 버스토스 등 (Bustos, et al., Plant Cell 1:839-854, 1989; Green, et al., EMBO J. 7:4035-4044, 1988); 마이어 등 (Meier et al., Plant Cell 3:309-316, 1991); 및 장 등 (Zhang et al., Plant Physiology 110: 1069-1079, 1996) 에서 서술된 것을 포함한다.

사용될 수 있는 추가의 프로모터 예시들에는 다음이 포함되어 있다: 동부 낙엽송 ((Eastern larch (Larix laricina))의 RbcS 프로모터와 같은 리브로즈-1,5-비스포스페이트 카복실레이즈 (ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase) (RbcS) 프로모터, 소나무(pine) cab6 프로모터 (Yamamoto et al., Plant Cell Physiol . 35:773-778, 1994), 밀(wheat)의 Cab-1 유전자 프로모터 (Fejes et al., Plant Mol . Biol . 15:921-932, 1990), 시금치(spinach) 의 CAB-1 프로모터 (Lubberstedt et al., Plant Physiol . 104:997-1006, 1994), 쌀 (rice)의 cab1R 프로모터 (Luan et al., Plant Cell 4:971-981, 1992), 옥수수(maize)의 GAPA-1 프로모터, 이스트(Saccharomyces cerevisiae)의 FBA2 프로모터, 옥수수(maize)의 피루베이트 오르토포스페이트 디키네이즈 (pyruvate orthophosphate dikinase) (PPDK) 프로모터 (Matsuoka et al., Proc . Natl . Acad . Sci. U.S.A . 90:9586-9590, 1993), 담배(tobacco)의 Lhcb1*2 프로모터 (Cerdan et al., Plant Mol . Biol . 33:245-255, 1997), 애기장대(Arabidopsis thaliana) SUC2 슈크로즈- H⁺ 동시수송체 (sucrose-H⁺ symporter) 프로모터 (Truernit et al., Planta 196:564-570, 1995), 및 시금치(spinach)의 틸라코이드 세포막 단백질 프로모터(thylakoid membrane protein) (psaD, psaF, psaE, PC, FNR, atpC, atpD, cab, 및 rbcS. 줄기, 잎, 및 녹색 조직에서 유전자의 전사를 유도하는데 사용될 수 있는 추가의 프로모터 예시들이 그 전문이 참고 문헌으로 하기에 병합 되어 있는 미국 특허 출원서 U.S. Patent Application Publication No. 2007/0006346에 서술 되어 있다. 식물의 녹색 조직에서 선호적으로 발현되는 결과를 가져오게 하는 추가적인 프로모터들에는 애기장대(Arabidopsis thaliana) 리브로즈-1,5-비스포스페이트 카복실레이즈 (Rubisco) 작은 서브유닛트 (ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase (Rubisco) small subunit) (Fischhoff et al., Plant Mol . Biol . 20:81-93, 1992), 알도레이즈 (aldolase) 및 피루베이트 오르토포스페이트 디키네이즈 (pyruvate orthophosphate dikinase) (PPDK) (Taniguchi et al., Plant Cell Physiol . 41(1):42-48, 2000) 와 같은 유전자들로부터 온 프로모터들이 포함된다.

유도성 프로모터 (inducible promoters)

화학적으로 조절 가능한 프로모터는 외부적인 화학적 조절제 적용을 통하여 식물에서 뉴클레오티드 서열의 발현을 조절하기 위해 사용할 수 있다. 목적에 따라, 프로모터는 화학 약품을 적용하면 유전자 발현이 유도되는, 화학적으로-유도 가능한 프로모터 이거나, 화학 약품을 적용하면 유전자 발현이 억제되는, 화학적으로-억제 가능한 프로모터 일수 있다. 화학적으로-유도 가능한 프로모터들이 이분야 기술에서 알려져 있고, 이것에만 국한되지는 않으나, 벤젠설폰아마이드 (benzenesulfonamide) 제초제 사페너(safeners)로 활성화되는 옥수수 In2-2 프로모터, 나오기 전 제초제 (pre-emergent herbicide)로 사용되는 소수성 전자친화성 화합물 (hydrophobic electrophilic compound)로 활성화 되는 옥수수 GST 프로모터, 및 살리실 산(salicylic acid)에 의해 활성화 되는 담배 PR-1 프로모터가 포함된다. 다른 화학적으로-조절되는 프로모터들에는 스테로이드-반응 프로모터 ((예를 들어, 글루코코티코이드-유도성 프로모터(Schena et al, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 10421-10425; McNellis et al., 1998, Plant 14:247-257) 참조)) 및 테트라사이클린-유도성 및 테트라사이클린-억제성 프로모터가 (예를 들어, Gatz et al., 1991, Mol. Gen. Genet. 227: 229-237; 전문이 참고문헌으로 하기에 병합된 U.S. Patent Nos. 5,814,618 및 5,789,156, 참조) 포함 된다. 식물 대사 공학에 적절한 세-성분 삼투적으로 유도 가능한 (three-component osmotically inducible) 발현 시스템이 최근 보고되었다 (Feng et al, 2011, PLoS ONE 6: 1-9).

상시적 프로모터 (constitutive promoters)

상시적 프로모터들에는, 예를 들어, Rsyn7 프로모터의 코아프로모터 및 WO 99/43838 및 U.S. Patent No 6,072,050, 에 공개 된 다른 상시적 프로모터, 코아 CaMV 35S 프로모터 (Odell et al., 1985, Nature 313: 810-812), 쌀 액틴 (rice actin) (McElroy et al., 1990, Plant Cell 2: 163-171), 유비퀴틴(ubiquitin)((Christensen et al., 1989, Plant Mol. Biol. 12: 619-632; Christensen et al, 1992, Plant Mol. Biol. 18: 675-689)), pEMU (Last et al, 1991, Theor. Appl. Genet. 81: 581-588), MAS (Velten et al., 1984, EMBO J. 3: 2723-2730), 및 ALS 프로모터 (U.S. Patent No 5,659,026) 가 포함된다. 다른 상시적 프로모터가 U.S. Patent Nos 5,608,149; 5,608, 144; 5,604, 121; 5,569,597; 5,466,785; 5,399,680; 5,268,463; and 5,608,142 에 서술되어 있다.

약한 프로모터 (weak promoters)

낮은 수준의 발현이 바람직한 곳에서는 약한 프로모터가 사용될 수 있다. 일반적으로, “약한 프로모터 (weak promoter)”라는 용어는 뉴클레오티드 서열의 발현을 낮은 수준으로 유도하는 프로모터를 서술 하려고 할 때를 의미한다. 프로모터가 허용하지 못할 만큼 높은 수준으로 발현 되는 곳에서는, 발현 수준을 감소시키기 위해 프로모터 서열의 일부가 삭제되거나 변경될 수 있다. 그러한 약하고 상시적인 (weak & constitutive) 프로모터들에는, 예를 들어, Rsyn7 프로모터의 코아 프로모터 (WO 99/43838 및 U.S. Patent No 6,072,050) 가 포함된다.

조직-특이 프로모터 (Tissue-specific promoters)

“조직-선호(tissue-preferred)”프로모터들은 특별한 조직 내에서 유전자 발현을 타겟으로 하기 위해 사용될 수 있다. 화학적으로 유도 가능한 시스템과 비교하여, 발생학적으로 및 공간적으로 조절되는 자극들은 외부 인자들의 식물세포 내로의 침투에 덜 의존한다. 조직-선호 프로모터들에는 다음에 서술된 것들을 포함한다: Van Ex et al., 2009, Plant Cell Rep. 28: 1509- 1520; Yamamoto et al, 1997, Plant J. 12: 255-265; ; Kawamata et al., 1997, Plant Cell Physiol. 38: 792-803; Hansen et al., 1997, Mol. Gen. Genet. 254: 337-343; Russell et al., 199), Transgenic Res. 6: 157-168; Rinehart et al., 1996, Plant Physiol. 1 12: 1331-1341 ; Van Camp et al., 1996, Plant Physiol. 112: 525-535; Canevascini et al., 1996, Plant Physiol. 1 12: 513-524; Yamamoto et al., 1994, Plant Cell Physiol. 35: 773-778; Lam, 1994, Results Probl. Cell Differ. 20: 181-196, Orozco et al., 1993, Plant Mol. Biol. 23: 1 129-1 138; Matsuoka et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 9586-9590, 및 Guevara-Garcia et al, 1993, Plant J. 4: 495-505. 이러한 프로모터들은, 필요하면, 약한 발현을 위해 변경될 수 있다.

종자/배아 특이 프로모터 (Seed/Embryo Specific Promoters)

“종자-선호(seed-preferred)”프로모터들에는 “종자-특이(seed-specific)”프로모터 (종자 저장 단백질의 프로모터들과 같은 종자발달 하는 동안에 활성이 있는 프로모터)는 물론 “종자-발아(seed-germinating)”프로모터 (종자 발아하는 동안 활성이 있는 프로모터) 두 개 다 포함된다. 하기 참고문헌으로 병합된 Thompson et al., 1989, BioEssays 10: 108-1 13 참조. 그런 종자-선호 프로모터 (seed- preferred promoters) 에는, 이것에만 국한하지 않으나, Ciml (사이토키닌-유도 메시지) (cytokinin- induced message), cZ19B l (옥수수 19 kDa 제인)(maize 19 kDa zein), milps (마이오-이노시톨-1-포스페이트-신테제)(myo-inositol-1 -phosphate synthase), 및 celA 셀루로즈 신테제(cellulose synthase)를 포함한다. 감마-제인(Gamma-zein)은 선호적인 배젓-특이(endosperm-specific) 프로모터이다. Glob-1은 선호적인 배아-특이 프로모터이다. 쌍떡잎 식물에 대하여, 종자-특이 프로모터들에는, 이것에만 국한되지는 않으나, 콩 베타-페세올린 (bean β), 납신(napin), 베타-콘글리시닌(β-conglycinin), 대두 레시틴(soybean lectin), 크루시페린(cruciferin), 및 이와 비슷한 것이 포함된다. 외떡잎 식물에 대하여, 종자-특이 프로모터들에는, 이것에만 국한되지는 않으나, 옥수수(maize) 15kDa 제인 (zein), 15 kDa 제인(zein), 22 kDa 제인 (zein), 27 kDa 제인 (zein), g-제인(g-zein), 왁시(waxy), 슈런캔 1(shrunken 1), 슈런캔 2 (shrunken 2), 및 글로빈 1 (globulin 1)이 포함된다. 후기 배아 발생에 풍부한 단백질 유전자 LEA의 단계 특이적 발생 프로모터는 종자 종결 기술(seed terminator technology)에서 후기 배아발생 단계에서 치사 유전자 (lethal gene)의 적출-매개한 발현 (exision-mediated expression)을 위한 재조합 시스템을 유도하는데 성공적으로 사용되었다(U.S. Patent No. 5,723,765 to Oliver et al).

잎 특이 프로모터 (Leaf Specific Promoters)

잎-특이프로모터들이 이 분야 기술에서 알려져 있다. 예를 들어, WO/2011/041499 및 U. S. Patent No 201 1/0179511 Al to Thilmony et al.; Yamamoto et al., 1997, Plant J. 12: 255-265; Kwon et al., 1994, Plant Physiol. 105: 357-367; Yamamoto et al, 1994, Plant Cell Physiol. 35: 773-778; Gotor et al, 1993, Plant J. 3: 509-518; Orozco et al., 1993, Plant Mol. Biol. 23: 1 129-1 138, 및 Matsuoka et al, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 9586- 9590 참조.

템포랄 -특이 프로모터 (temporal specific promoters)

또한 고려되는 것은 발생 시간 테두리 (time frame) 동안, 예를 들어, 식물이 잎이 성숙된 후에 탄소의 흐름을 강화시키기 위해 스위치가 켜지는 것, 사용될 수 있는 템포랄 프로모터 (temporal promoter)이다.

꽃밥/ 꽃가루 특이 프로모터 (Anther/pollen specific promoters)

꽃밥 및/또는 꽃가루에서 특별히 발현하는 여러 많은 유전자들이 동정되었으며 이들의 꽃가루 발생 및 생식에서의 기능들이 규명 되었다. 이들 유전자들의 특이성은 주로 이들의 프로모터에 의해 전사 수준에서 조절되는 것이 발견되었다 (Ariizumi et al., 2002, Plant Cell Rep. 21 : 90-96 및 거기에 있는 참고문헌). 많은 수의 꽃밥- 및/또는 꽃가루-특이 프로모터 및 다른 식물 종으로부터의 이들의 주요 ds-요소들 (ds-elements)이 분리되었으며 기능적으로 분석되었다.

꽃-특이 프로모터 (Floral specific promoter)

꽃-선호적인 프로모터에는, 이것에만 국한되지 않으나, 다음이 포함된다: CHS (Liu et al., 201 1, Plant Cell Rep. 30: 2187-2194), OsMADS45 (Bai et al., 2008, Transgenic Res. 17: 1035- 1043), PSC (Liu et al, 2008, Plant Cell Rep. 27: 995-1004), LEAFY, AGAMOUS, 및 API (Van Ex et al., 2009, Plant Cell Rep. 28: 1509-1520), API (Verweire et al, 2007, Plant Physiol. 145: 1220-1231), ), PtAGIP (Yang et al, 201 1, Plant Mol. Biol. Rep. 29: 162-170), Leml (Somleva & Blechl, 2005, Cereal Res. Comm. 33: 665-671 ; Skadsen et al, 2002, Plant Mol. Biol. 45: 545-555), Lem2 (Abebe et al., 2005, Plant Biotechnol. J. 4: 35-44), AGL6 및 AGL13 (Schauer et al., 2009, Plant J. 59: 987-1000).

프로모터의 조합 (Combination of promoter)

일부 실시양태에서는 하나 이상의 프로모터를 가지고 있는 다수-유전자 발현 구조를 가지고 있는 형질전환 식물들 또는 식물 세포를 사용한다. 프로모터는 같을 수도 있고 다를 수도 있다.

하나 이상의 본 발명의 뉴클레오티드 서열, 이들의 동족체 (호모로그, homologue) 및/또는 상동체 (오토로그, orthologue) 뿐만아니라 관심 있는 어느 다른 유전자의 발현을 지정된 시공간적인 방식으로 조절하기 위해 서술된 어느 프로모터들이 사용될 수 있다

옥수수 프로모터 (Maize promoter)

식물 세포를 형질전환 시키는데 사용되는 형질전환 유전자 DNA 구조(transgenic DNA construct)는 숙주 옥수수 세포에 도입시키고자 하는 이종의 뉴클레오티드 및 숙주 옥수수세포에서 이 이종 뉴클레오티드를 발현시키기 위한 프로모터로 구성된다. 이 분야에서 잘 알려진 대로, 이러한 구조들은 조절 요소들 (regulatory elements), 3'-비번역 부분 (3'-untranslated regions) ((폴리아데닐화 부위 (polyadenylation site)와 같은)), 수송 또는 신호 펩타이드 및 마커유전자 요소등을 원하는 대로 더 포함할 수 있다. 1. 조절 요소. 식물 세포에서 활성이 있는 여러 프로모터들, 상시적 및 조직 특이적 프로모터 및 유도성 프로모터 둘다 문헌에 서술되었다, 식물에서 기능을 갖고 있는 여러 다양한 프로모터들에 대한 서술은 미국 특허 U.S. patent 6,437,217 의 배경 부분을 참조. 그런 프로모터들에는 아그로박테리움 (Agrobacterium tumefaciens)의 종양-유도 플라즈미드에 붙어 있는 노팔린 신테제 (nopaline synthase) (NOS) 및 옥토핀 신테제(octopine synthase) (OCS) 프로모터, 콜리플라워 모자익 바이러스 (cauliflower mosaic virus (CaMV)) 19S 및 35S 프로모터 및 피그워트 모자익 바이러스 ((figwort mosaic virus) (FMV)) 35S 프로모터와 같은 콜리모바이러스 프로모터(caulimovirus promoters), 강화된 CaMV35S 프로모터 (e35S), 리브로즈 비스포스페이트 카복실레이즈(ribulose bisphosphate carboxylase)의 작은 서브유닛 (ssRUBISCO, 매우 흔한 식물 폴리펩타이드)으로 부터의 빛-유도성 프로모터를 포함한다. 예를 들어, 옥수수 RS81 프로모터를 공개하는 미국 특허(U.S. Patents) 6,437,217, 쌀 액틴 (rice actin) 프로모터를 공개하는 5,641,876, 옥수수 RS324 프로모터를 공개하는, 6,426,446, 옥수수 PR-1 프로모터를 공개하는, 6,429,362, 옥수수 A3 프로모터를 공개하는 6,232,526, 및 상시적 옥수수 프로모터를 공개하는 6,177,611 를 참조, 이 모두는 참고문헌으로 하기에 병합되어 있다.

식물 발현 카셋트 구조의 필요조건 (Requirement for construction of plant expression cassette)

형질전환 식물에 발현시킬 의도가 있는 뉴클레오티드 서열은 먼저 식물에서 활성이 있는 적절한 프로모터 뒤에 발현 카셋트 (expression cassettes)으로 조립된다. 발현 카셋트는 형질전환 유전자의 발현에 요구되거나 또는 선택되는 어느 다른 서열을 더 포함할 수 있다. 그러한 서열에는, 이것에만 국한하지는 않으나, 전사 종결인자, 인트론과 같은 발현을 증강시키기 위한 외부 서열, 필수 서열 (vital sequence), 및 유전자 산물을 특정한 세포소기관(organell) 및 세포 구획 (cell compartment)에 타겟 시키려는 (targeting) 의도가 있는 서열 등을 포함한다. 이들 발현 카셋트는 그후 하기 서술된 대로 식물 형질전환 벡터에 옮겨질 수 있다. 다음은 전형적인 발현 카셋트의 여러가지 구성요소들에 대한 서술이다.

전사 종결인자 (Transcriptional Terminators)

발현 카셋트에 사용하기 위하여 여러 종류의 전사 종결인자들을 이용 할 수 있다. 이들은 형질전환유전자 끝을 지나서 전사를 종결시키고 전사체 (transcripts)에 올바른 폴리아데닐화 (polyadenylation)가 되게 하는 책임이 있다. 적절한 전사 종결인자들은 식물에서 작용하는 것으로 알려진 것이며, CaMV 35S 종결인자, tml 종결인자, 노팔린 신테이즈 (nopaline synthase) 종결인자, 완두콩(pea) rbcS E9 종결인자이 포함된다. 이들은 외떡잎 식물이나 쌍떡잎 식물 모두에 사용된다.

발현을 증강시키거나 또는 조절시키기 위한 서열 (Sequences for the Enhancement or Regulation of Expression)

전사 유닛트 (transcript unit)내 로부터 발현을 증강시키기 위해 수많은 서열들이 발견되었으며, 이런 서열들은 형질전환 식물에서 이들의 발현을 증가시키기 위해 유전자와 함께 사용된다. 예를 들어, 옥수수의 Adh1 유전자의 인트론과 같은 여러가지 인트론 서열들이, 특히 외떡잎 식물 세포에서, 발현을 증가시키는 것으로 나타났다. 추가로, 바이러스로부터 유도된 여러 비-번역 리더 서열 (non-translated leader sequence)이 또한 발현을 증강시킨다고 알려지고 있으며, 이들은 특히 쌍떡잎 식물 세포에서 효과적이다.

암호화 서열 최적화 (Coding Sequence Optimization)

선택된 유전자의 암호화 서열 (coding sequence)은 관심있는 작물 종에서 최적화된 발현을 위해 암호화 서열을 바꾸어 유전공학적으로 만들어 질 수 있다. 특정한 작물 종에서 최적화 발현을 성취하기 위해 암호화 서열을 수정하는 방법들은 잘 알려져 있다 (Perlak et al, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 3324 및 Koziel et al., 1993, Biotechnology 11: 194-200).

식물 형질전환 벡터의 제조 (Construction of Plant Transformation Vectors)

식물 형질전환에 이용 가능한 수많은 벡터들은 식물 형질전환 분야 기술에 통상 전문가들에게는 잘 알려 있다. 이 공개서에 속한 유전자들은 그러한 어떤 벡터들과 함께 사용될 수 있다. 벡터의 선택은 선택한 형질전환 기술 및 타겟 종 (target species)에 의존한다.

아그로박테리움 (Agrobacterium tumefaciens)을 사용하여 형질전환 하는데 많은 벡터들이 이용 가능하다. 이들은 전형적으로 적어도 하나의 T-DNA 서열 가지며 pBIN19 와 같은 벡터가 포함된다. 아그로박테리움 (Agrobacterium tumefaciens)의 형질전환에 적합한 전형적인 벡터들은 두 부분으로 이루어진 벡터(binary vector) pCIB200 및 pCIB2001은 물론 두 부분으로 이루어진 벡터 pCIB10 및 이의 하이그로마이신 (hygromycin) 선택 유도체가 포함된다 (예를 들어, 미국 특허 U.S. Patent No 5,639,949 참조).

아그로박테리움 (Agrobacterium tumefaciens)을 사용하지 않은 형질전환은 선택된 형질전환 벡터에 T-DNA 서열을 요구하지 않으며 따라서 이러한 서열이 없는 벡터들은 상기 서술된 T-DNA 서열을 포함하는 것과 같은 벡터들에 추가하여 사용된다. 아그로박테리움에 의존하지 않는 형질전환 기술을 위한 벡터의 선택은 형질전환될 종의 선호적인 선택에 주로 의존한다. 비-아그로박테리움 형질전환을 위한 적합한 전형적인 벡터들에는 pCIB3064, pSOG 19, 및 pSOG35 가 포함된다 (예를 들어, U.S. Patent No 5,639,949 참조).

형질전환 및 배양과 식물의 선택 (Transformation and Selection of Cultures and Plants)

식물 배양은 형질전환 될 수 있으며, 이 분야 통상 전문가들에게는 잘 알려진 상기 서술된 하나 이상의 방법들을 사용하여 선택될 수 있다.

내재하는 프로모터의 조작 (Manipulation of endogenous promoters)

아연-손가락-핵산분해효소 (Zinc-finger nucleases) (ZFN), TALEN, 및 CRISPR-Cas9 는 식물 크로모좀의 특정한 부위에 이중 선 DNA가 쪼개지게 하여 타겟 유전자 삽입 또는 삭제를 수행할 수 있게 한다는 점에서 본 발명을 실용화하는데 또한 유용하다 (Shukla et al., 2009, Nature 459: 437- 441; Townsend et al, 2009, Nature 459: 442-445). 이 접근 방법은 관심 있는 식물의 유전체에 존재하는 PsbS, ZEP 및 VDE와 상동성이 있는 유전자의 발현을 변경하기 위하여 내재하는 유전자의 프로모터를 변경하는 본 발명에서 특히 유용할 것이다. 이 경우 ZFN, TALEN, 및 CRISPR-Cas9은 비-조작된 (non-engineered) 식물 또는 야생형 (wild type) 식물에서 발견된 것을 능가하는 발현을 증가시키거나 또는 발현 시간을 바꾸기 위해 관심 있는 형질전환체(TF)의 발현을 조절하는 서열을 변경하는데 사용될 수 있다.

실시예 (EXAMPLES)

본 공개서는 다음의 실시예들을 참고함으로서 좀더 완전히 이해될 것이다. 그러나 본 공개서의 범위를 제한한다고 생각해서는 안 된다. 하기 서술되는 예시들이나 실시양태들은 실례가 되는 목적일 뿐이며 이를 고려하여 여러 가지 변경과 수정들이 이 분야 전문가들에게 제안될 것이며 본 청구서의 정신과 권한의 범위 내 및 수반되는 청구 범위 내에 포함될 것이다.

실시예 1. 형질전환 담배 ( Transgenic Nicotiana tabacum )

담배 ( Nicotiana tabacum ) 식물은 애기장대(아라비돕시스) (Arabidpsis taliana) 유전자 3개를 포함하고 있는T-DNA 카셋트로 형질전환 시켰다. 아라비돕시스 ZEP는 엽황소(크산토필) 에폭시화 (xanthophyll epoxidation) 속도를 증가시키고 해당하는 NPQ 이완을 증가시키기 위해 과발현 시켰으며, 동시에 아라비돕시스 PsbS 과발현은 qE 형성의 증폭을 자극 하기 위함이었고 및 아리비돕시스 VDE는 ROS 청소를 위한 제아크산틴 (zeaxanthin)의 임계 수준 (critical level)을 유지하기 위하여 과발현 시켰다. 결과적으로 얻어진 형질전환 식물들은 변경된 NPQ 키네텍스를 보이며 변동하는 빛 강도 하에서 광-보호 효율의 손실 없이 더 높은 양자 수율 및 CO₂ 고정을 초래하고 각기 독립된 두 온실 실험에서 증가된 성장을 보여주었다. 이 결과들은 변동하는 빛 강도 하에서 광합성 효율은 NPQ 에 의해 일시적으로 제한 된다는 사실을 확인시켜주며 NPQ 키네틱스를 변경함으로서 광합성 효율 및 작물의 수확량을 향상시키는 원리를 처음으로 증명함을 제공한다.

실시예 2. 어린 묘?趾【? NPQ 및 PSII 의 작동 효율 ( NPQ and PSII operating efficiency in young seedlings)

일시적인 NPQ 는 vde-psbs-zep (VPZ) 구조물 (construct)로 수행한 20번의 독립적인 형질전환에서 얻은 T₁ 자손에 대한 10분 동안 1000 μmol quanta m^-2 s^-1, 로 조명하고 (illuminate) 이어서 10 분 동안 암-이완 (dark relaxation) 시키는 동안의 클로로필 형광 이미징(chlorophyll fluorescence imaging) 으로 결정하였다. 목표는 비슷한 비-광화학적 소멸 역량을 유지하는 것이므로, 야생형 (WT)과 비슷한 최대 NPQ 수준을 지닌 라인을 조사하기 위해 더 선택하였다. 이로부터 8개 라인을 얻었으며 이중 단일 T-DNA 카피 (VPZ-34 및 56) 를 지닌 2개의 라인들과 두 개의 T-DNA 삽입 (VPZ-23)을 지닌 하나의 라인이 현 작업에 포함되었다. 동종 T2 자손 (homologous T₂ progeny)에 대한 모든 결과들은 보고되었다. NPQ 키네틱(kinetic) 양상은 3개의 VPZ 라인 및 WT 라인에서 상당한 차이가 있음을 보여준다 (도 1A). VPZ 라인 에서의 NPQ는 빨리 증가했으며, 최대 NPQ 수준은 2 분에서 4 분 사이에 도달하며, 이 이후 NPQ 수준은 안정화되거나 (VPZ-23) 또는 약간 감소 되기까지 했다 (VPZ-34 및 VPZ-56). 반면에, WT 대조군에서 NPQ은 7분 동안 계속 증가하고, 이후 최대 수준은 나머지 3 분 동안 유지되었다. 이러한 대조되는 유도 패턴의 결과 때문에, NPQ는 유도되는 처음 5 분 동안에는 이 3 라인 모두에서 꽤 높았으나, 마지막 5 분 동안은 아니었다 (도 1A). 빛을 끈 후에는, NPQ 이완은 매우 빨랐으며 WT 및 VPZ 라인들에서 모두 비슷하였다.

2000 (3 min) 및 200 (2 min) μmol m^-2 s^-1사이의 빛 강도의 반복적인 사이클에서는 VPZ 및 WT 라인 사이의 NPQ 수준의 차이가 좀 더 심각하게 나는 결과를 가져 왔다 (도 1B). VPZ 라인에서 NPQ는 첫 번째 두 사이클의 높은 빛 상태 동안에는 빠르게 증가되며, 두 번째 사이클 2 분 동안 최대 수준에 도달했다. 반면에, 야생 묘목 (WT seedlings)에서는 NPQ는 좀더 천천히 증가했으며, 단지 4 번째 사이클 3 분째에 최대 수준에 도달 했다. 흥미롭게도, 사이클의 낮은 빛 상태 동안에는 반대의 패턴을 보였다. 첫 번째 사이클에서는, NPQ 수준은 VPZ 라인에서 더 높았다, 그러나, 두 번째 사이클에서 NPQ의 수준은 VPZ 라인들과 WT 라인 다 동등했으며, 마지막 세 번째 사이클에서는 VPZ 라인에서 의미 있게 낮았다.

NPQ 와 연관되어 추정한 광계 II (PSII) (photosystem II) 작동 효율은 VPZ 라인들과 WT 사이에서 첫 번째 사이클에서는 별 차이를 보이지 않았다 (도 1C). 그러나 5 사이클 동안, 낮은 빛 상태 동안에 VPZ 라인들은 (PSII) 더 우수한 작동 효율을 보였으며, 반면에 높은 빛 상태 동안에는 별 차이를 보이지 않았다. 이 패턴은 두 번째 사이클에서 확립 되었으며, 나머지 실험 동안에 반복되었다.

실시예 3. 전사 및 단백질 발현 (Transcription & protein expression)

세 VPZ-라인 모두에서 VDE (3-배), PsbS (3-배) 및 ZEP (8-배)의 혼합된 형질전환유전자 (At) 및 자연유전자 (Nt ) 전사 수준이 야생형 (WT)에 비해 상당히 증가함을 보여 주었다 (도 2A, B 및 C). 자연 및 형질전환 단백질을 대표하는, 거의 비슷한 밀도의 22kDa 벤드 (도 2G, VPZ 라인들)에서 보이는 것과 같이, Psb에서 전사 수준의 증가는 약 2배 정도의 더 높은 단백질 수준으로 번역 된다(도 2E). 그러나, VDE 및 ZEP 에서는 전사 수준의 증가는 단백질 수준의 증폭이며 (도 2G, 약 73kDa의 라벨된 벤드 ZEP 및 45kDa 의 VDE), 이는 WT 에 비해 VDE (도 2D) 및 ZEP (도 2F) 단백질이 상당히 증가되었음을 보여준다. 자연 단백질의 전사체와 단백질 수준은 VPZ 라인 및 WT에서 비슷하므로, 형질전환 유전자 및 자연 전사체와 단백질 수준의 상호작용의 차이는 무시할 만하다.

실시예 4. 빛 강도의 반복적인 변경 후 어린 묘목에서의 NPQ 키네틱스 (Kinetics of NPQ in young seedlings following repeated changes in light intensity)

다이나믹한 NPQ 적응의 키네틱스를 비교 하기 위하여, 어린 묘목에서 이중 지수 모델 (double exponential model)의 시간 항수를 반복적인 2000 및 200 μmol m^-2 s^-1 사이 빛 변경의 기능으로서 NPQ의 시간-시리즈에 맞추었다 (표 1). 첫 번째 2000/200 사이클에서는 WT 및 VPZ 과발현 라인들 사이에서는 일관된 차이는 보이지 않았다. NPQ 유도의 시간 항수는, 49.3 ± 1.9 (VPZ-34) 에서 91.8 ± 6.2 (VPZ-56), 사이로 변화하였으며, 시간 항수의 2000 에서 200 μmol m^-2 s^-1으로의 재적응은 평균 τ₁ 에서 10.2 s 및 τ₂ 에서 669.9 s 로서 WT 및 3개의 VPZ 라인들에서 또한 다 비슷하였다. 두 번째 2000/200 사이클 동안에는, NPQ 키네틱스에 대한 VPZ 발현의 효과는 좀더 분명해졌다. WT에서 NPQ 증가의 빠른 상태는, VPZ 라인들에서 평균 τ₁이 12.6 s 에 비해 WT에서 τ₁ 이 5.5 τ₁ 로서 VPZ 라인들에서보다 약 2.3 배 빨랐다 (표 1). 200 μmol m^-2 s^-1로의 NPQ 두 번째 적응에서는 NPQ 감소의 느린 성분에서 현저한 차이를 보여주었다. VPZ 라인들에서 τ₂ 는 WT에 비해 1.9 배 빠른 것으로 나타났다 (464.3 대비 886.4 s). 그러므로, 반복적인 빛 강도 변경은 WT에서 빠른 NPQ 축적 (build-up) 및 느린 이완 (relaxation)의 결과를 가져오게 하나, VPZ 라인들에서 시간 항수는 상대적으로 영향을 받지 않았다. 이와 똑 같은 경향은 마지막 3 분 동안 2000 μmol m^-2 s^-1에서 및 이어지는 10분 동안의 어둠 (darkeness)에서도 계속되었다. WT 묘목에서 NPQ 증가의 빠른 상태는 VPZ 라인들에서 보다 약 2.4배 빨랐으나 (τ₁ 4.3 대비 10.3 s), 10분 동안의 어둠(darkness) 에서 NPQ의 최종 이완은 WT 비해 VPZ 라인들에서1.4 (τ₁) 및 3.5 (τ₂) 배 빨랐다. 추가로, PSII 작동 효율의 회복에 대해 측정한 τ₁ 및 τ₂ 은 WT에 비해 VPZ 라인들에서 2.1 및 4.1 배 빨랐다.

표 1. 빛 강도의 반복적인 변경에 대한 NPQ 적응의 시간 항수 (값 ± se). 별표는 VPZ 라인들 및 야생형 사이에서의 의미 있는 차이를 보여준다 (α=0.05).

^a1^st HL 상태에 있는 데이터는 두 개의 시간 항수를 요구하지는 않으며, 그래서 모델은 하나의 지수 기능으로 줄었으며 단지 하나의 시간 항수에만 맞추어졌다.

^b데이터 해석은 빠른 상태를 적절히 만들기에는 충분하지 않았으며, 단지 느린 상태만 적용시켰다.

실시예 5. 안정된 상태에서 NPQ , 선상 전자 운송 및 CO ₂ 흡입 ( NPQ , linear electron transport and CO ₂ uptake in steady state).

완전히 펴진 잎에서 안정된 상태 (steady state)의 가스 교환 및 클로로필 형광을 측정하기 위해, 각 강도마다 가스 교환 및 형광이 완전히 안정되게 하기위해 매우 조심하면서, 빛의 강도를 낮은 강도에서 높은 강도로 변화시켰다. 특히 빛의 강도 400 μmol m^-2 s^-1이하에서는 NPQ는 WT과 VPZ 라인들 사이에서 매우 비슷했다 (도 3A). 흡수된 빛 강도 기능 대비 해당하는 선상 전자 수송 (linear electron transport) 의 반응 곡선 및 총 동화율 (net assimilation rate) 은 WT과 VPZ 라인들 사이에서 의미 있는 차이는 보이지 않았다 (도 7). 추가적으로, CO₂ 반응 곡선으로부터 유도된 적응된 계수 값 V _cmax , J, TPU, 및 Rd 는 WT과 VPZ 라인들 사이에서 비슷했다 (표 2).

표 2. CO₂ 반응 곡선으로부터 유도된 계수 적응. 최대 카복실레이숀 (carboxylation) 능력 (Vcmax), 최대 선상 전자 수송 율 (maximal rate of linear electron transport) (Jmax), 광호흡 (photorespiration)과 연관되지 않은 마이토콘드리아 호흡 율(R _d ) 및 최대 트리오즈 포스페이트 (triose phosphate utilization) 사용 율 (TPU). 값 ± se, n=10, WT과 VPZ 라인들 사이에서 의미 있는 차이는 보이지 않았다.

실시예 6. 변동하는 빛 하에서 NPQ , 전자 운송 및 CO ₂ 고정 ( NPQ , electron transport and CO ₂ fixation under fluctuating light)

빛 반응 곡선의 모양에 대한 VPZ 과발현의 다이나믹한 효과를 평가하기 위하여, 간헐적인 단계로 각 빛의 강도를 바꾸기 전에 2000 μmol m^-2 s^- ¹로 4 분간 처리하면서, 빛의 강도를 높은 데서 낮은 PFD로 4 분 단계로 변화시켰다. 높은 강도의 빛에서는 VPZ 라인들에서의 NPQ는 WT에서와 비슷하였으나, 낮은 강도의 빛에서는 WT 보다 상당히 낮았다 (도 3B). 결과로 얻어진 선상 전자 수송율 및 총 동화율 반응 곡선은 WT와 VPZ 라인 들에서 상당히 달랐다 (도 4A 및 B). 적응시킨 볼록면 (fitted convexity) 및 점근선 계수(asymptote parameter)는 WT와 VPZ 라인들에서 비슷했으나 (도 8A-D), 초기의 기울기 (initial slop)는 뚜렷하게 달랐다 (도 4C 및 D). 변동하는 빛 강도는 WT 식물에서는 ΦPSIImax를 0.541 ± 0.012 로 감소 시켰으나, VPZ 라인들에서는 ΦPSII_max가 0.612 ± 0.021 (VPZ-23), 0.599 ± 0.023 (VPZ-34) 및 0.595 ± 0.023 (VPZ-56) 로 덜 감소되게 유지 했다. 비슷하게, WT 식물에서 ΦCO₂-max 는 0.058 ± 0.001 (도 4D)로 감소 되었으며, 반면에 VPZ 라인들에서는 Φ₂-max 값은 간헐적인 높은 빛 강도에 의해 훨씬 덜 영향을 받아, VPZ-23에서는 0.069 ± 0.003, VPZ-34 에서는 0.066 ± 0.003 및 VPZ-56 에서는 0.064 ± 0.003 를 나타내었다. 그러므로, 이러한 변동하는 조건하에서는, VPZ 라인들의 평균 ΦPSII-max 및 Φ₂-max 는 WT 보다 11.3% 및 14.0% 높았다.

실시예 7. 다른 빛 처치 기능에 따른 크산토필 ( 엽황소 ) 사이클 디-에폭시화(Xanthophyll cycle de- epoxidation as a function of different light treatments)

크산토필 사이클에 대한 VPZ 과발현의 효과를 평가하기 위하여, 잎들은 4가지 서로 다른 빛 처치를 받게 하였다 (표 3). 비올라크산틴 (violaxanthin), 안테락크산틴 (antheraxanthin), 및 제아크산틴 (zeaxanthin)의 혼합된 풀 크기 (combined pool size)는 WT 및 VPZ 라인에서 비슷하였다. 크산토필 (엽황소) 색소 (xanthophyll pigment)의 풀은 암-적응된 (dark-adjusted) 잎에서 완전히 에폭시화 (epoxidation)되었으며 WT과 VPZ 라인들 사이에서 차이는 관찰되지 않았다. 400 μmol m^-2 s^- ¹ 의 PFD 에의 노출은 크산토필 (엽황소) 구성성분 (xanthophyll composition)에 거의 변화를 가져오지 않았으며 DES는 0 에 가깝게 남아 있었으나, 2000 μmol m^-2 s^-1의 PFD로 빛을 쪼이면 안테락크산틴 (antheraxanthin) 및 주로 제아크산틴(zeaxanthin)이 상당히 축적되게 하였다. VPZ 라인들은 WT에 비해 비올라크산틴 (violaxanthin)을 상당히 더 함유하고 있었으며 제아크산틴 (zeaxanthin) 및 안테락크산틴(antheraxanthin)은 적게 축적하고 있었으며, 이는 VPZ 라인들에서 크산토필 DES (xanthophyll DES) 이 WT 보다 거의 2배 낮도록 하였다 (25.5% 대비 46.2%). WT 에 비해 상대적으로 VPZ 라인들에서 크산토필 디-에폭시화가 덜 일어나는 것으로 보이기도 하면서 (17.8% 대비 52.5%) 변동하는 빛 처치는 높은 빛에 노출시키는 것과 같은 경향을 보였다.

표 3. 완전히 확장된 잎에서 암-적응된 상태 (dark-adapted state)이거나 또는 일정한 400 또는 2000 μmol m^-2 s^-1 PFD 또는 3 분 2000 / 3 분 200 μmol m^-2 s^-1 PFD 의 3 사이클에 노출 시킨 후 크산토필(엽황소) 사이클 색소 (Xanthophyll cycle pigment) 농도 및 디-에폭시화 상태(de-epoxidation state) (DES). 색소 농도 (값 ± se, n = 3-5)는 단위 잎 면적당 (g m^-2)으로 정상화 시켰다. DES (%) = (Zea + 0.5Ant)/ (Zea+Ant+Viola), n.d. = 검출되지 않음. 별표는 VPZ 라인들과 야생형 (wild-type) 사이에서의 의미 있는 차이를 가리킨다 (α = 0.05).

실시예 8. 비-광화학적 소멸에 의한 광-보호의 효율 (Efficiency of photo-protection by non-photochemical quenching)

WT 대비하여 VPZ 라인에서 광-보호 효율을 평가하기 위해, 묘목을 2000 μmol m^-2 s^- ¹ 의 청색 빛(blue light)에 1 내지 2 시간 동안 노출 시켰다. 높은 빛 처치 후 Fo' 에 대한 광억제 및 NPQ의 대조되는 효과가 광-보호 수치를 계산하기 위해 사용되었으며 (도 5), 여기서 값 1은 광-억제 손상으로부터 완전한 보호와 동등하다. 높은 빛에서 1 시간 노출은 상당한 광-억제 유도의 결과를 가져오며, 이는 VPZ 라인들에서보다 WT 묘?趾【? 약간 더 높다 (도 5A). 두 시간 후 광-보호 효율은 (도 5B) 한 시간 후보다 상당히 덜하나, VPZ 묘목은 WT보다 역시 덜 광-억제 되는 것이 발견 되었다. 어두움에서 회복 10 분 후에 잔여 NPQ는 VPZ 묘목에서 더 낮은 경향이 있었다 (도 5C). 더 낮은 잔여 NPQ 및 더 높은 강-보호 수치의 결과로, VPZ 묘목에서 PSII 효율은 어두움에서 회복 10 분 후에 또한 더 높은 경향이 있었다 (도 5C).

실시예 9. 온실조건에서 식물 성장

위에 언급된 광합성 효율에서의 차이가 성장에 영향을 주는지 조사하기 위해, 두 번의 온실 실험에서 바이오매스 (biomass) 축적을 평가했다. 온도는 두 실험 모두 비슷했으며 21 에서 25℃ 사이로 변화시켰다. 피크 빛 강도는 처음실험에서는 2000μmol m^-2 s^-1을 넘었으며 두 번째 실험에서는 1600 μmol m^-2 s^-1넘었으며 매일 필요한 빛은 첫 번째 및 두 번째 실험에서 각각 평균 21.3 및 19.3 mol m^-2 d^- ¹이었다. 그러나, 두 번째 실험에서 마지막 주에 피크 빛 강도 및 매일 필요한 빛은 계절적인 빛 강도의 감소 때문에 1037μmol m^-2 s^-1 및 8.9 mol m^-2 d^-1로 상당히 감소되었다. 그 결과, 식물의 평균 무게는 첫 번째 실험에서는 훨씬 더 높아, 각각 35.6 g 대비 22.5 g 이었다. 두 시험을 통해, VPZ 라인들로부터의 식물들은 WT에 비해 줄기 높이 (도 5B) 및 잎 면적 (도 5C)이 증가함을 보여 주었다. 추가로, 식물 당 총 건조 무게는 VPZ 라인들에서는 10 내지 21 %가 더 높았으며(도 5A), 이는 주로 줄기 건조 무게가 상당히 증가하였기 때문 일뿐만 아니라 (14 내지 26%, 도 5D), 잎 (7.5 내지 16%, 도 5E) 및 뿌리 (12.5 내지 38.3%)의 건조 무게도 증가하였기 때문이다.

실시예 10. 추가 데이터 (Additional data)

도 12 및 도 13 잎, 줄기 및 뿌리 크기 및 성장, 야생형에 비교하여 형질전환 식물 N2-23 및 N2-34 에서 증가. 도 14 는 VPZ-56, VPZ-23 및 VPZ-34 형질전환 라인에서 증가된 NPQ 키네틱스, 양자 효율 및 CO₂ 고정을 보여준다. 이 결과들은 미리 잎에 2000 μmol m^-2 s^-1 PFD 로 노출시킨 후, 다양한 빛 강도에서 양자효율 및 CO₂ 고정의 증가를 보여 준다. 1, 2, 및 3은 노출 후 시간에서 이 증가의 진전을 보여준다.

도 16은 첫 번째 유도/이완 (induction/relaxation) 에서 NPQ의 시간 항수가 비슷하나, 후속 빛 사이클은 더 느린 축적 (증폭과 독립적으로, 이들은 시간 항수) 및 형질전환 식물에서 빠른 NPQ 이완을 초래하며, 암-이완에서 양자 효율의 빠른 회복을 초래한다는 것을 보여준다. 이 비교 결과들은 형질전환 라인에서 제아크산틴의 축적이 감소하는 것과 전적으로 일치한다. 높은 빛에서 VPZ 라인들의 NPQ의 수준은 WT과 비슷하거나 높다. dA532nm로 예측한 VPZ 라인들에서의 qE의 수준은 WT보다 더 높으며, Psbs 과발현과 관련이 매우 있는 것 같다. 반복적인 높은 빛에의 노출은 VPZ 라인들에서 NPQ 증가의 더 높은 시간 항수를 보여주며, NPQ 이완의 낮은 시간 항수를 보여준다. 더 빠른 NPQ 이완 율 때문에, PFD에서 빠른 스위치 동안에 VPZ 라인들은 낮은 PFD 에서 5-10% 향상된 양자 수율을 보여준다.

VDE, ZEP 및 PsbS의 연합된 과발현은 묘목 및 완전히 자란 식물에서 변경된 NPQ의 축적 및 이완의 키네틱스를 초래하고, 묘목 및 완전히 자란 식물에서 변동하는 빛 조건하에서 좀더 높은 양자 수율을 초래하고, 완전히 자란 식물에서 안정적인 상태 (stedy state)에서 가스교환에는 별 차이가 없게 하고, 완전히 자란 식물에서는 변동하는 빛 조건하에서 좀 더 높은 총체적인 동화 율을 보이게 하며, 및 온실에서 약10% 의 성장 증가를 초래한다.

실시예 11. 재료 및 방법들

형질전환

담배(N. tabacum)의 cv. 'Petite Havana' 을 클레멘테의, 아그로박테리움 프로토콜 ((Clemente, Agrobacterium Protocols (ed Wang K.), pp. 143-154. Humana Press Inc., Totowa)) 에 따라 아그로박테리움-매개한 (Agrobacterium-mediated) 잎 디스크 프로토콜에 따라 형질전환 시켰다. 두 부분으로 이루어진 플라즈미드는 A. thaliana로부터 의 3개의 유전자: 비올라크산틴 디-에폭시데이즈 (violaxanthin de-epoxidase)(AtVDE), AtPsbS 및 제아크산틴 에폭시데이즈 (zeaxanthin epoxidase) (AtZEP) 는 물론 비아라포스 (bialaphos) 에 저항성을 암호화하는 바 유전자 (bar gene)를 포함한다 (Thompson et. al. Journal of Agricultural and Food Chemistry 35, 361-365, 1987). 20개의 독립적인 T₀형질전환체가 만들어졌으며 글로왁카 등 (Glowacka et al Plant Cell and Environment doi: 10.1111/ pce. 12693, 2015)에 따라 디지털 드롭렛 PCR (digital droplet PCR) (ddPCR) 을 사용하여 유전체 DNA 분석으로 T-DNA 카피 수를 결정하였다. T-DNA 단일 카피를 가진 두 라인 (VPZ-34 및 56) 및 두 카피를 가진 한 라인 (VPZ-23)을 T₁ 자손 (T₁ progeny)을 생성하는데 사용하였으며, 이를 글로왁카(Glowacka)등에 따라 ddPCR 로 동종접합체 식물을 (homozygous plant) 동정하였으며 더 분석을 위한 동종접합체 T₂ 자손을 얻기 위해 자가-수정시켰다.

식물 재료의 번식 (Propagation of plant material )

같은 수확 날짜로부터 얻은 VPZ 라인들의 T₂ 종자 및 WT 종자를 조정되는 환경의 워크-인 성장 챔버(controlled environment walk-in growing chamber) (Environmental Growth Chambers, Chagrin Falls, Ohio, USA) 에서 12시간 낮 (23 º시간 밤 (18 º사이클로 150 μmol quanta m^-2 s^-1하에 성장 배지 (LC1 Sunshine mix, Sun Gro Horticulture, Agawam, MA, USA)에서 발아 시켰다. 발아 5 일 후, 묘목은 클로로필 형광 이미징을 위하여 8 x 12 포팅 트레이(potting tray) (812 series, Hummert International, Earth City, MO, USA) 또는 9 x 4 포팅 트레이 (3600 series, Hummert International) 에 이식시키고 제대로 된 잎이 2 개 나올 때까지 키웠다. 가스 교환 및 바이오매스에 사용 될 묘목은 첫 번째 이식 후 온실로 옮겨졌다.

전사 및 단백질 발현

라인 당 5개의 식물로부터 완전히 확장된 가장 어린 잎에서, 가스 교환이 또한 수행된 위치의 잎으로부터 5개의 잎 디스크 (모두 2.9cm2) 샘플을 얻었다. 같은 잎 샘플로부터 단백질 및 mRNA가 추출 되었다 (NucleoSpin RNA/Protein kit, REF740933, Macherey-Nagel). 추출된 mRNA는 DNase (Turbo DNA-free kit; AM1907, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)로 처치하였으며 RT-PCR을 위해 Superscript III First-Strand Synthesis System (18080-051; Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 cDNA 로 전사 시켰다. NtActin 및 NtTubulin 대비한 형질전환 유전자들 AtZEP, AtPsbS 및 AtVDE, 및 자연 유전자들 NtZEP, NtPsbS 및 NtVDE의 발현 수준을 정량화 하기 위하여 RT-qPCR 이 사용되었다 (프라이머 서열들이 보조 자료에 제공된다).

총 단백질 농도를 정량 한 후 (protein quantification assay ref740967.50, Macherey-Nagel), 4 μg의 단백질을 SDS-PAGE 전기영동으로 분리하고, 반-건조 블럿팅 ((semi-dry blotting (Trans-Blot SD, Bio-Rad))을 사용하여 멤브레인에 블럿하고(blot) (Immobilon-P, IPVH00010, Millipore, USA), 및 AtPsbS (AS09533, Agrisera, Vannas, Sweden), AtZEP (AS08289, Agrisera) 및 AtVDE (AS153091, Agrisera)에 대해 얻어진 일차 항체(primary antibody)로 면역-레블 하였고 이어서 2차 항체 (secondary antibody) (Promega W401B)로 배양시켰다. 스캐너(ImageQuant LAS-4010, Fuji,) 를 사용하여 화학발광 (Chemiluminescence)을 검출하였으며 단백질 농도를 측정하기 위해 ImageJ (version 1.47v, National Institute of Health, USA)를 사용하여 덴시토메트리 (densitometry)를 하였다. 야생형 단백질농도는 정상화 (normalization)를 위해 사용되었다.

어린 묘목에서 NPQ 및 PSII의 작동 효율 ( NPQ and PSII operating efficiency in young seedlings)

클로로필 형광 이메져 (chlorophyll fluorescence imager) (CF Imager, Technologica, Colchester, UK)를 이용하여 18개의 묘목에서 동시에 비-광화학적 소멸 (non-photochemical quenching) (NPQ)을 측정하였다. 묘목은 먼저 20분 동안 어둠에서 적응하도록 하였고 이후 암-적응된 최소 형광 (dark-adapted minimal fluorescence) (Fo) 및 최대 형광 (maximal fluorescence) (Fm)은 포화 빛 강도 (saturating light intensity) (6000 μmol quanta m^-2 s^-1, λ의 800 ms 펄스를 사용하여 이미지 되었다. 이어서, 묘목들은 1000 μmol quanta m^-2 s^-1에서 10분 동안 및 이어서 10 분 동안 어둠에 있게 하거나 또는 2000 μmol quanta m^-2 s^-1에서 3 분씩 6 사이클에 이이서 200 μmol quanta m^-2 s^-1 에 2 분 동안 있게 하였다. 변화하는 형광(F') 및 조명이 비취는 조건하에서의 최대 형광 (Fm')을 이미지 하기 위해 정규적인 간격으로 포화된 플래쉬가 제공되었다. 그리고 스턴-몰모 소멸 모델 (Stern-Volmer quenching model)을 가정하여 식 Eq. 1 에 따라 이런 측정치들로부터 묘목당 평균 NPQ가 계산되었다:

NPQ = Fm/Fm' -1 Eq.1

최대 또는 작동 PSII 효율은 겐티등 (Genty et al. Biochimica et Biophysica Acta 990, 87-921989, 1989)을 따라 식 2 및 3로 형광 측정치로부터 예측되었다.

최대 PSII 효율 (Maximal PSII efficienc )= (Fm - Fo)/Fm Eq.2

PSII 작동 효율 (PSII operating efficiency) = (Fm' - F')/Fm' Eq.3

빛 강도 변경에 따른 NPQ 적응의 시간 상수 (Time constants of NPQ adjustment to changes in light intensity)

묘목들은 암-적응시켰으며 클로로필 형광은 위에서 서술된 대로 클로로필 형광 이메져로 (chlorophyll fluorescence imager)로 측정하였다. 최대 형광은 빛 강도를 3 분마다 2000 에서 200, 2000, 200, 2000 및 마지막에 0 μmol quanta m^-2 s^- ¹ 로 변경시키면서 매 30초마다 측정되었다. 어둠에서의 최종 이완은 10 분 동안 지속되었다. 3 개의 VPZ 형질전환 된 라인에서의 18개 묘목 6 셋트 및 야생형이 이에 따라 측정되었으며, 여기서 형광 측정 및 각 셋트 사이에서 빛 강도 변경 사이에 5초의 프레임변화 (framedhift)를 주었다. NPQ 는 식 1에 따라 계산 되었으며, 각 셋트 내의 최고 값을 대상으로 정상화 시켰으며, 이후 6 셋트는 5초의 해상도를 가진 정상화된 NPQ의 시간-시리즈를 만들기 위해 모두 시간 기능으로 편집 되었다. NPQ의 유도 및 이완을 위한 이중 지수 함수(double exponential function) 에서 시간 상수는 빛 강도의 각 변경 후 편집된 시간-시리즈에 적응시켰다. 어둠에서의 최종 회복을 위해, 시간상수들은 또한 PSII 작동 효율을 위해 적응시켰다 (식 3을 이용하여 예측함).

광-보호 효율 (Photo-protection efficiency)

묘목들은 20 분 동안 암-적응시켰으며, 그후 암-적응된 최대 PSII 효율 (Fv/Fm) 이 위에서 서술된 대로 클로로필 형광 이메져로 측정되었다. 이어서, 묘목은 2000 μmol quanta m^-2 s^-1에 60 분 또는 120 분 동안 노출 시켰다. 노출 후, 묘목은 qE의 이완을 주기 위해 어둠에서 10분 동안 회복되게 하였고, 이후 완전한 암-적응 없이 최소 형광 (minimal fluorescence) (Fo') 및 최대 형광 (maximal fluorescence) (Fm')을 측정하였다. Fo' 측정치는 Fo' 에 대한 NPQ의 효과라고 전적으로 고려되는 유도된 값과 비교 되었다 (Oxborough and Baker, Photosynthesis Research 54: 135-142, 1997). 측정된 또는 유도된 Fo' 를 사용한 PSII 효율 사이의 차이는 그 후 광-보호 효율을 결정하는데 사용 되었다.

완전히 확장된 잎에서의 가스 교환 및 선상 전자 수송 (Gas exchange and linear electron transport in fully expanded leaves)

가스 교환 분석을 위해, 묘목들은 트레이로부터 성장 배지 (포트 당 10 g 과립 비료로 보충된 LC1 Sunshine mix) (Osmocote Plus 15/9/12, The Scotts Company LLC, Marysville, Ohio, USA)로 채워진 3.8 L 포트(pots) (400C, Hummert International) 에 이식시켰다. 포트는 무작위로 30cm 간격으로 온실 테이블에 놓았다. 식물에 물을 주었으며 식물 위치는 5 번째 잎이 완전히 확장될 때까지 무작위로 매 2일 마다 변경되었다. 가스 교환 측정은 2 cm2 잎 챔버 훌루오로메터 (leaf chamber fluorometer)로 장착된 열린 가스 교환 시스템 (pen gas exchange system)(LI6400XT, LI-COR, Lincoln, Nebraska, USA)을 사용하여 수행되었다. 모든 가스 교환 측정은, 여러가지 CO₂농도에서 공 등에 (Gong et al. Plant, Cell and Environment 38, 2417-24322015) 따른 암 측정치 (dark measurements)를 사용하여 큐벳 (cuvette)과 주변 대기 사이의 확산적인 누출에 대한 보정을 하였다.

완전히 확장된 잎에서 총 동화 율 및 선상 전자 수송의 빛 용량 반응 곡선을 결정하기 위해, 가스 교환 및 펄스 증폭 조절된 클로로필 형광 (pulse amplitude modulated chlorophyll fluorescence)이 빛 강도 범위에서 측정되었다. 모든 클로로필 형광 측정은 다상 플래쉬 루틴 (multiphase flash routine) (Loriaux et al. 2013)을 사용하여 수행되었다. 가장 어린 완전히 확장된 잎 (n=6)을 블록 온도가 25 °C로 셋팅되고 [CO₂] 는 1500 ppm으로 공기흐름에 있는 큐벳에 고정 시켰다. 암-적응 30 분 후에 최소 형광 (minimal fluorescence) (Fo) 및 최대 형광(maximal fluorescence) (Fm)가 측정 되었다. 이어서, 빛 강도는 두 가지 다른 방식으로 변화 시켰다. 첫 번째 실험은 각 빛 강도에서 NPQ의 유도가 절대 최소가 되도록 유지하기 위하여 빛의 강도를 0 에서 50, 80, 110, 140, 170, 200, 400, 600, 800, 1000, 1200, 1500 및 2000 μmol m^-2 s^- ¹ 로 천천히 증가시키게 구성 되었다. 안정적 상태에 이르렀을 때, 가스 교환 계수들이 기록 되었으며 NPQ (Eq. 1) 및 PSII 작동 효율 (PSII operating efficiency) (Eq. 3)을 추정하기 위해 베이스라인 형광 (baseline fluorescence) (F') 및 빛-적응된 최대 형광 (light-adapted maximal fluorescence) (Fm')이 측정 되었다. 두 번째 실험에서는, 2000 μmol m^-2 s^-1 에서 잎이 안정적 상태 가스 교환에 도달하도록 하였다. 이어서, 빛 강도는 2000 에서 1500, 1000, 800, 600, 400, 200, 170, 140, 110, 80 및 50으로 변경 시켰으며, 각 단계는 4 분 지속되었고 그전에 2000 μmol m^-2 s^-1에 4 분 동안 두었다. 각 빛 강도에서, F' 및 Fm' 및 가스 교환 계수들은 60 s, 140 s 및 220 s 후에 측정 되었다. 이 세 측정치의 평균 값을 간헐적인 높은 PFD로 빛 반응 곡선을 다시 구성하기 위한 후속 분석을 위하여 사용되었다.

방사되는 빛의 잎 흡수율은, 스펙트로메터(USB-2000, Ocean Optics Inc, Dunedin, Florida, USA)에 연결된 통합된 구(integrating sphere) (LI1800, LI-COR, USA)를 사용하여, 가스 교환 분석에 사용된 같은 지점 (spot)에서 측정 되었다. 선상 전자 수송 율 (J)은 두 실험 모두에서 다음에 따라 결정되었다:

J=잎 흡수율(Leaf absorptance) * PSII 작동 효율(PSII operating efficiency) * PED * 0.5 Eq.4

두 실험 모두에서 선상 전자 수송 및 가스 교환 분석을 위한 빛 강도 용량 반응 곡선은 샤키 등에 의한 ((Sharkey et al. (2007)) 식에 따라 일정한 잎 온도에 맞추어 졌으며, 서술적인 비-직사각형 쌍곡선 모델 (non-rectangular hyperbola model) (Von Caemmerer, Biochemical models of leaf photosynthesis. Collingwood, Australia: CSIRO Publishing 2000)에 적응시켜, 초기 기울기(initial slope), 볼록면 (convexity) 및 점근선 (asymptote)에 대한 추정치를 얻었다.

총 동화 율의 CO₂용량 반응 곡선을 분석하기 위해, 잎들은 블록 온도가 25 °C 로 조정되고 빛 강도는 2000 μmol m^-2 s^-1로 셋트 된 큐벳 (cuvette)에 고정시켰다. 공기 흐름에 CO₂농도는 400, 300, 200, 100, 75, 400, 400, 500, 600, 700, 800, 1200 및 1600 ppm 으로 조정 되었으며, 가스 교환 계수는 안정적 상태에 도달 되었을 때 기록 되었다. 샤키등에 따른 (Sharkey et al. Plant Cell Environ. 30,1035-1040, 2007)온도 보정과 함께 무한한 엽육 전도 (mesophyll conductance)를 가정하면서, 최대 카복실레이숀 율 (maximal carboxylation rate) (Vcmax), 2000 μmol m^-2 s^-1 에서 전자 수송 율 (electron transport rate) (J), 트리오즈 포스페이트 이용 율(triose phosphate utilization rate) (TPU) 및 광호흡 (photorespiration)(Rd) 과 연관 되지 않은 마이토콘드리아 호흡 율을 유도 하기 위해 화쿠하르 등에 (Farquhar et al. Planta 149, 78-90. 1980) 의한 잎 광합성 모델을 적응시켰다.

크산토필 ( 엽황소 ) 사이클 색소 농도 ( Xanthophyll cycle pigment concentrations)

잎들은 위에 서술된 대로 열린 가스 교환 시스템 및 암-적응된 잎 큐벳에 고정시켰다. 이어서, CO₂ 및 H₂O 교환이 0, 400 및 2000 μmol m^-2 s^-1 에서 안정적 상태에 이르도록 하거나, 또는 빛 강도가 시리즈로 (3 분 2000/3 분 200 μmol m^-2 s^- ¹의 3 사이클) 변경되도록 하였고, 이후 바로 에워싸인 잎 스팟 (enclosed leaf spot)으로부터 잎 디스크 (0.58 cm2) 샘플을 하였으며, 액체 질소에 바로 얼렸으며(snap-frozen) 추출할 때까지 -80℃에 저장시켰다. 색소 분석은 Horn Point Laboratory (University of Maryland Center for Environmental Science, Cambridge, MD, USA)에서 실시 되었다. 얼린 샘플들은 90% 아세톤에서 초음파 프로브를 사용하여 불렸으며 거친 추출물은 여과 (0.45 μm) 시켰다. 색소는 Zorbax Eclipse XDB-C8 컬럼 (963967-906, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)을 사용하여 HPLC로 분리하였으며 반 호이켈램 및 토마스 ((Van Heukelem and Thomas (2001))의 프로토콜에 따라 정량하였다.

성장 및 최종 매스 축적 (Growth and final biomass accumulation)

VPZ 과발현의 성장에의 효과를 평가하기 위해, 두 번의 독립적인 온실 실험이 2015년 5월25일- 6월29 (WT, VPZ-23 및 VPZ-34를 사용하여) 및 2015 년 10월 9일-11월 13일 (WT, VPZ-23, VPZ-34 및 VPZ-56 를 사용하여)에 수행 되었다. 묘목들은 위에 명시된 대로 (식물 전파 파라그래프) 번식시켰으며 트레이에서 포트당 30 g의 천천히 방출되는 과립 비료 (slow release granulated fertilizer) (Osmocote Plus 15/9/12, The Scotts Company LLC)가 보충된 성장 배지 (LC1 Sunshine mix, Sun Gro Horticulture)로 채운 14.5 L 포트 (pots) (2000C, Hummert International)에 이식시켰다. 포트들은 무작위로 온실 테이블에 30cm 간격으로 놓아 두었다. 식물에 물을 주고 식물 위치는 매 이틀마다 무작위로 변경 시켰다. 잎 수준에서의 빛 강도는 온실 테이블의 중앙에서 양자 센서 (quantum sensor) (LI-190R, LI-COR, USA) 로 기록 하였으며, 이 센서는 삼발이에 붙여 가장 어린 잎으로부터 10cm 위에 위치하게 유지되도록 매일 조정하였다. 공기 온도, 상대적인 습도 및 [CO₂]는 혼합된 온도 및 습도 센서 (combined temperature and humidity sensor) (HMP60-L, Vaisala Oyj, Helsinki, Finland) 및 적외선 가스 분석기 (infrared gas analyzer) (SBA-5, PPsystems, Amesbury, MA, USA)를 사용하여, 식물 덮개 로부터 약 1 m 위에서 측정 되었다. 모든 온도 데이터는 데이터로거 (datalogger) (CR1000, Campbell Scientific Inc, Logan, UT, USA)를 사용하여 매 30 분마다 기록 하였다. 온실 안의 온도는 통풍, 증발 냉각 및 가스 히터를 조합하여 사용하여 28℃ (낮) 및 18℃(밤) 사이로 유지시켰다. 빛 강도는 들어오는 조명에 따라 변화 시켰으며, 첫 번째 실험에서 정오에 피크가 약 1800 μmol m^-2 s^-1에 도달하게 하고, 두 번째 실험에서는 1000 -1500 μmol m^-2 s^-1 되게 하였다. [CO₂]는 조절되지 않았으며 360 ppm (낮) 및430 ppm (밤) 로 변화 시켰다. 첫 번째 꽃이 열린 후, 줄기 길이 및 한 식물 당 잎의 수가 측정 되었으며 식물 당 총 잎 면적은 컨베이어-벨트 스캐너 (conveyor-belt scanner) (LI-3100C Area Meter, LI-COR, USA)로 측정 되었다. 식물은 이어서 잎, 줄기, 뿌리 분획으로 분리 되었으며 일정한 무게가 되도록 70℃에서 건조 시켰다.

통계적 분석 (Statistical analysis)

모든 통계적 분석은 SAS (version 9.3, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA)를 사용하여 수행되었다. 데이터는 브라운-포시테의 테스트 (Brown-Forsythe's test) 를 사용하여 변이의 균질성을 테스트하였으며 사피로-윌크스 테스트 (Shapiro-Wilk's test)를 사용하여 정규성 테스트하였다. 변이의 한가지-방법 분석 (one-way analysis)은 적응시킨 가스 교환 계수 (gas exchange parameters), 전사 수준 및 단백질 발현에 적용되었다. 어린 묘목에서 NPQ의 클로로필 형광 이미지 데이터 셋트는 두가지-방법으로 (two-way)(광-보호) 분석 되거나, 또는 한가지-방법 분석의 반복된 측정 (10분 켜짐/꺼짐), 또는 변이의 두가지-방법 (높은/낮은 빛) 분석으로 분석되었다. 두 번의 반복 온실 시험의 분석은 두개의 완전한 무작위 블록으로 혼합된 모텔을 사용하여 수행 되었다. 모든 경우에서, ANOVA의 의미 있는 효과는 WT 대조군에 대한 라인 민즈 (line means)의 던넷의 복합 비교 테스트 (Dunnett's multiple comparison test) 로 이어졌다(α = 0.05). NPQ 유도 및 이완의 적응 시간 항수는 95% 신뢰 간격에 근거하여 비교 되었다.

실시예 12. 형질 전환 옥수수 (예언적) (( Transgenic maize (prophetic))

본 발명은 언급된 옥수수 라인 (maize line)의 모체 유닛 (parental unit)의 표현 형질에 비교하여 향상된 광합성 및 성장을 지닌 옥수수 라인을 또한 제공한다. 옥수수 라인은 상기 서술된 대로 PsbS, ZEP 및 VDE로부터 선택된 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 뉴클레오티드 서열을 포함하는 형질전환 식물 집단을 생성시켜 만들 수 있다. 각 형질전환 사건은 부모 식물의 유전체에 적어도 상기 서술된 대로 이종 뉴클레오티드에 작동적으로 연결된 프로모터를 포함하는 하나의 뉴클레오티드 구조물을 도입하는 것을 포함한다. 그 뉴클레오티드 구조물은 부모 유전체에 충분한 양이 도입되어 형질전환 세포를 생산하고 이는 언급된 강화된 표현형질을 갖는 형질전환 옥수수의 식물로 배양될 수 있다. 형질전환 세포는 배양되어 형질전환 종자의 자손을 생산하는 형질전환 식물로 된다. 형질전환 식물 집단은 관찰될 만한 표현형질에 대하여 스크리닝한다. 기대하지 않은 증강된 표현형질을 지닌 것으로서 선택된 형질전환 식물로부터 종자를 모은다. 선택적으로, 그 방법에는 형질전환 종자 발아, 상기 형질전환 종자로부터의 그 후 세대 식물 성장, 상기 그 후 세대 식물의 표현 형질관찰 및 증강된 표현형질을 지닌 그 후 세대 식물로부터 종자 수집의 사이클을 반복하는 것을 포함한다. 다른 측면에서, PsbS, ZEP 및 VDE로부터 선택된 폴리펩타이드를 암호화하는 적어도 하나의 이종 뉴클레오티드 서열을 적용하여 큰 집단을 스크리닝 하는 방법. 다른 선호적인 측면에서의 방법은 이종 DNA가 선택된 프로모터에 작동적으로 연결된, 예를 들어, 프로모터의 부위의 5' 끝에, 뉴클레오티드 구조물을 적용하는 것이다. DNA 구조물은 유전체에 무작위적인 위치에 도입시키거나 또는 미리 선택된 유전체 부위에 도입시킬 수 있다.

옥수수 형질전환 프로토콜의 실시예가 하기에 서술된다.

아그로박테리움 배양 시작 (Initiate Agrobacterium culture)

1. 단순한 두 부분으로 된 벡터(binary vector) (예를 들어, pZY102)를 지닌 AGL1을 80℃ 스탁 (stock)으로부터 적절한 항생제를 ((벡터 및 여기서 보여주는 스트레인(strain)을 위해, 100 mg/liter 스펙티노마이신 (spectinomycin) 및 30 mg/liter 리밤피신 (rifampin)) 포함하고 있는 ABC 아가 플레이드 (agar plate)에 스트리크 (streak) 하고, 단일 콜로니를 얻기 위하여 희석 시리즈를 제조한다. 플레이트들은 어둠에서 3 일간 28℃에서 배양한다.

2. 단일 콜로니를 선택하고, 이를 적절한 항생제((벡터 및 여기서 보여주는 스트레인을 위해, 100 mg/liter 스펙티노마이신 (spectinomycin) 및 30 mg/liter 리밤피신 (rifampin))를 포함하고 있는 YEP 아가 플레이트(agar plates) 에 스트리크(streak) 한다.

3. 5 ml 의 멸균 PHI-A (접종 배지)를 15-ml 각뿔형 원심분리 튜브에 첨가한다.

4. 두 루프 가득의 AGL1를 YEP 플레이트에서 상기 3 번에서 제조한 튜브에 옮긴다. 2 내지 3 분 후, 박테리아 세포가 완전히 현탁 되도록 튜브를 흔든다.

5. 현탁액 1 ml을 제거하여 550 nm (OD550)에서 광학 밀도 (optical density)를 조사하기 위하여 스팩트로미터 큐벳에 넣는다. 실온 (24℃)에서 OD550 가 0.35 (0.5 × 109 cfu/ml) 되도록 세포 현탁액에 아그로박테리움 세포를 더 넣거나 또는 PHI-A로 배양액을 희석시킨다.

6. 배양을 쉐이커에서 (shaker) 100 rpm으로 4 내지 5 시간 동안 실온(예, 24℃) 에서 흔들어 준다.

7. 현탁액 1 ml을 2 ml의 멸균 마이크로원심분리(microcentrifuge) 튜브에 분주한다.

배아 분리, 접종, 및 동시-재배

8. 수정된 후 10 내지 13 일에 수확한 옥수수 이삭으로부터 (배아 크기 1.5mm; Support Protocol 참조) 껍질 및 수염을 제거한다. 이삭의 한쪽 끝에 한 쌍의 겸자(forcep)를 넣는다.

9. 신선한 Hi-II 이삭들을 0.5 리터 (liter)의 30% 상업용 표백제 및 몇 방울의 Tween 20을 포함하는 용액 0.5 liters 에 20 분 동안 완전히 잠기게 한다 (멸균된 1-리터 넓은-입 (wide-mouse) 병에).

10. 이삭을 3번 멸균수로 씻고 (매번 이삭이 완전히 물에 잠기도록 확인한다), 이삭이 멸균된 150 × 15-mm 페트리 디쉬 (petri dish)에 똑바로 서도록 세워둔다.

11. 멸균된 #11 면도 칼날(razor blade)로 각 이삭으로부터 위쪽 알맹이를 반을 제거한다.

12. 멸균된 이삭으로부터 1.5 mm 미성숙 배아를 멸균된 마이크로스파툴라 (microspatula)로 분리하고 1.7- 내지 2.0-ml 의 마이크로원심분리 튜브 당 50내지 100 개의 배아를 옮겨 넣는다. 찌꺼기 및 녹말을 제거하기 위해 배아를 1 ml PHI-A 용액으로 3 번 씻는다.

13. 그후 바로, 1 ml의 아그로박테리움 현탁액을 미성숙 배아를 포함하고 있는 튜브에 첨가하고, 튜브를 멸균 후드에 5 분 동안 놓아 두고, 그후 모든 배아를 포함한 전체 내용물을 PHI-B(동시-재배 배지) 아가 플레이트 (agar plate)에 쏟는다.

14. 미세한 끝을 가진 피펫을 사용하여 아그로박테리움 현탁액을 덜어내고, 그후 배아를 플레이트에 골고루 펴놓고 및 배아의 배반 (scutellum)이 배지 위쪽을 보게 하고 평평한 쪽 (flat side)은 배지 아래를 보게 놓는다.

15. 파라필림(parafilm)으로 플레이트를 밀봉하고 어두운 곳 20℃ 에서 3 일 동안 배양한다.

휴식 (Resting)

16. 배아를 스파튤라로 PHI-C 플레이트(휴식 배지)에 옮긴다. 배아 손상을 피하도록 한다.

17. 파라필림 (parafilm) 으로 플레이트를 밀봉하고 어두운 곳 28℃에서 7 일 동안 배양한다.

선택(Selection)

18. 배아를 스파튤라 또는 겸자로 PHI-D1 플레이트(선택 배지 1)에 옮긴다. 플레이트 당 25 배아를 놓고 플레이트를 밀봉한다. 배아를 어두운 곳 28℃에서 처음 2-주 선택 동안 배양한다.

19. 캘리 (calli, 굳은조직)를 겸자로 PHI-D1 플레이트에서 PHI-D2 플레이트로(선택 배지 2) 옮긴다. 18 번의 단계에 따라 총 2 달 동안 매 2주 마다 캘리를 신선한 PHI-D2 플레이트에 후속 배양한다.

20. 18 및 19번 단계와 똑 같은 조건하에서 캘리를 또 다른 2 주 동안 PHI-D2 배지에서 직경이 약 1.0cm 될 때까지 자라게 하여 제초제-저항성인 캘리의 부피를 늘린다.

성숙 및 재생 (Maturation and regeneration)

21. 겸자를 사용하여, 각 불투명한 배아 포함하는 전체 켈러스 (callus)매스를 PHI-E (성숙 배지) 20 × 100 mm 페트리 플레이트(petri plates) (3 M porous 테이프로 감싼다)에 옮기고, 배양 플레이트를 어둠에 28℃에서 두 번의 2 내지 3 주 동안 놓아두어 체세포 배아가 성숙되도록 한다.

22. 아이보이-흰색의 캘리를 PHI-F (재생 배지)에 옮기고 25℃에서 16-시간 광주기 (photoperiod) 하에서 새싹과 뿌리가 발달 될 때까지 배양 한다.

23. 각 작은 식물을 PHI-F(재생 배지)를 함유하고 있는 25 × 150-mm 튜브에 옮기고, 25℃에서 16-시간 광주기 (photoperiod) 하에서 2 내지 3 주 동안 자라게 한다.

24. 각 식물들을 24℃ 18 시간/빛, 6 시간/어둠 사이클에 있는 빛 배양기 또는 배양실에 있는 흙 혼합물 (예, Promix BX soil)이 있는 작은 플리스틱 포트에 옮긴다.

실시예 13. 형질 전환 수수 ( Transgenic sorghum (prophetic)

본 발명은 언급된 수수 라인 (sorghum line)의 모체 유닛 (parental unit)의 표현 형질에 비교하여 향상 된 광합성 및 성장을 지닌 수수 라인을 또한 제공한다. 수수 라인은 상기 서술된 대로 PsbS, ZEP 및 VDE로부터 선택된 폴리펩타이드를 암호화 하는 이종 뉴클레오티드 서열을 포함하는 형질전환 식물 집단을 생성시켜 만들 수 있다. 각 형질전환 사건은 부모 식물의 유전체에 적어도 상기 서술된 대로 이종 뉴클레오티드에 작동적으로 연결된 프로모터를 포함하는 하나의 뉴클레오티드 구조물을 도입하는 것을 포함한다. 그 뉴클레오티드 구조물은 부모 유전체에 충분한 양이 도입되어 형질전환 세포를 생산하고 이는 언급된 강화된 표현형질을 갖는 형질전환 수수의 식물로 배양될 수 있다. 형질전환 세포는 배양되어 형질전환 종자의 자손을 생산하는 형질전환 식물로 된다. 형질전환 식물 집단은 관찰될 만한 표현형질에 대하여 스크리닝 한다. 기대하지 않은 증강된 표현형질을 지닌 것으로서 선택된 형질전환 식물로부터 종자를 모은다. 선택적으로, 그 방법에는 형질전환 종자 발아, 상기 형질전환 종자로부터의 그 후 세대 식물 성장, 상기 그 후 세대 식물의 표현 형질관찰 및 증강된 표현형질을 지닌 그 후 세대 식물로부터 종자 수집의 사이클을 반복하는 것을 포함한다. 다른 측면에서, PsbS, ZEP 및 VDE로부터 선택된 폴리펩타이드를 암호화하는 적어도 하나의 이종 뉴클레오티드 서열을 적용하여 큰 집단을 스크리닝 하는 방법. 다른 선호적인 측면에서의 방법은 이종 DNA가 선택된 프로모터에 작동적으로 연결된, 예를 들어, 프로모터의 부위의 5' 끝에, 뉴클레오티드 구조물을 적용하는 것이다. DNA 구조물은 유전체에 무작위적인 위치에 도입시키거나 또는 미리 선택된 유전체 부위에 도입시킬 수 있다.

수수 형질전환 프로토콜의 한 예시가 구오 등 (Guo et al., Methods Mol Biol 1223, 181-188, 2015)은 물론 호웨 등(Howe et al., Plant Cell Rep 25(8): 784-791, 20060 에 서술된다.

실시예 14. 형질전환 대두 ( Transgenic soybean 0(prophetic)

본 발명은 언급된 대두 라인 (soybean line)의 모체 유닛 (parental unit)의 표현 형질에 비교하여 향상 된 광합성 및 성장을 지닌 대두 라인을 또한 제공한다. 대두 라인은 상기 서술된 대로 PsbS, ZEP 및 VDE로부터 선택된 폴리펩타이드를 암호화 하는 이종 뉴클레오티드 서열을 포함하는 형질전환 식물 집단을 생성시켜 만들 수 있다. 각 형질전환 사건은 부모 식물의 유전체에 적어도 상기 서술된 대로 이종 뉴클레오티드에 작동적으로 연결된 프로모터를 포함하는 하나의 뉴클레오티드 구조물을 도입하는 것을 포함한다. 그 뉴클레오티드 구조물은 부모 유전체에 충분한 양이 도입되어 형질전환 세포를 생산하고 이는 언급된 강화된 표현형질을 갖는 형질전환 대두의 식물로 배양될 수 있다. 형질전환 세포는 배양되어 형질전환 종자의 자손을 생산하는 형질전환 식물로 된다. 형질전환 식물 집단은 관찰될 만한 표현형질에 대하여 스크리닝 한다. 기대하지 않은 증강된 표현형질을 지닌 것으로서 선택된 형질전환 식물로부터 종자를 모은다. 선택적으로, 그 방법에는 형질전환 종자 발아, 상기 형질전환 종자로부터의 그 후 세대 식물 성장, 상기 그 후 세대 식물의 표현 형질관찰 및 증강된 표현형질을 지닌 그 후 세대 식물로부터 종자 수집의 사이클을 반복하는 것을 포함한다. 다른 측면에서, PsbS, ZEP 및 VDE로부터 선택된 폴리펩타이드를 암호화하는 적어도 하나의 이종 뉴클레오티드 서열을 적용하여 큰 집단을 스크리닝 하는 방법. 다른 선호적인 측면에서의 방법은 이종 DNA가 선택된 프로모터에 작동적으로 연결된, 예를 들어, 프로모터의 부위의 5' 끝에, 뉴클레오티드 구조물을 적용하는 것이다. DNA 구조물은 유전체에 무작위적인 위치에 도입시키거나 또는 미리 선택된 유전체 부위에 도입시킬 수 있다.

대두 형질전환 프로토콜의 한 실시예가 하기에 서술된다.

5-일 된 대두 묘목에서 떡잎으로부터 약 3-5 mm 아래의 배축 부위 (hypocotyl region)를 통해 수평 슬리이스를 만들어 떡잎 조직 배양 (coyledonary explant)을 준비 한다. 이어서 떡잎 사이로 수직 슬라이스를 만들고 배축 (embryonic axis)을 제거한다. 이 조작은 2개의 떡잎 마디 조직 배양 (cotyledonary node explants)을 만들어낸다. 약 7-12 수직 슬라이스가 떡잎/배축 연결부위 위에서 3 mm 를 둘러싼 면적의 조직 배양의 향축면 (adaxial surface)에 만들어진다. 조직 배양 (explant) 조작은 No. 15 작은칼 칼날 (scalpel blade)로 수행한다.

조직 배양 (explant)은 아그로박테리움 접종물에 30 분 동안 담그고 그후 0.5% 정제된 아가 (purified agar)(BBL Cat # 11853)로 고체화 시킨 아그로박테리움 현탁액 배지를 포함하는 100 × 15 mm 페트리 플레이트 (Petri plates) 에 공생-배양한다. 공생-배양한 플레이트는 와트만 #1 필터 페이퍼 (Whatman #1 lter paper)(Mullins et al., 1990; Janssen and Gardner, 1993; Zhang et al., 1997) 로 덮는다. 조직 배양들 (expalnts)은 (플레이트당 5개) 공생-배양하는 플레이트 위에 향축 사이드를 아래로 하여 배양하며, 이는 필터 페이퍼로 덮고, 3 일 동안 24℃ 에서 빛의 강도 약 80 μmol s-1 m-2(F17T8/750 cool white bulbs, Litetronics)으로 18/6 시간 빛 체재 하에 둔다. 공생-배양 플레이트는 파라필름으로 싼다.

공생-배양 기간 후에 조직 배양 (외식, explant)은 1.67 mg l1 BAP, 3% 설탕(sucrose), 500 mg l1 티카르실린 (ticarcillin) 및 100 mg l1 세포탁시메 (cefotaxime) 가 보충된 B5 배지에 간단히 씻는다. 배지는 3 mM MES, pH 5.6로 완충시킨다. 성장 조절제, 비타민 및 항생제는 오토클레이브(autoclaving) 후에 필터 멸균한다. 세척 단계 후 조직배양 (외식)들은 (플레이트당 5개) 0.8% 정제 아가 (BBL Cat # 11853) 로 고체화 되고 3.3 또는 5.0 mg l1 글루포시네이트 (glufosinate) (AgrEvo USA)로 수정된 세척 배지를 함유하는 100 × 20 mm 페트리 플레이트에서, 향축 사이드 (adaxial side)가 위로 가고 배축 (hypocotyl)은 배지에 고착되게 배양시킨다. 이 배지는 새싹 시작 배지 (shoot initiation medium) (SI)로 불린다. 플레이트는 3M 압력 민감 테이프 (3M pressure sensitive tape) (ScotchTM, 3M, USA) 로 싸고 종자 발아 단계에 사용된 환경 조건 하에서 배양 시켰다.

2 주 배양 후에, 각 조직 배양 (외식) 으로부터 배축 부위 (hypocotyl region)를 잘라내고, 나머지 조직 배양은, 즉 분화하고 있는 마디를 가진 떡잎 (cotyledon)은, 이어서 신선한 SI 배지에 후속 배양 시킨다. 추가로 2 주 더 SI 배지에 배양 후에, 떡잎 (cotyledon)은 분화하고 있는 마디에서 제거 된다. 분화하고 있는 마디는 무라시게 및 스쿠그 기본 염 ((Murashige and Skoog (MS) (1962) basal salts)), B5 비타민들, 1mg 1-1 제아틴-리보사이드 (l1 zeatin-riboside), 0.5 mg l1 GA3 및 0.1 mg l1 IAA, 50 mg 1-1 글루타민 (l1 glutamine), 50 mg 1-1 아스파라긴 (l1 asparagine), 3% 설탕(sucrose) 및 3 mM MES, pH 5.6로 구성된 새싹 연장 배지 (shoot elongation medium) (SE)에 후속 배양한다. SE 배지는 1.7 또는 2.0 mg l1 글루포시네이트(1-1 glufosinate)로 수정 된다. 조직 배양 (외식)들은 이 주마다 (biweekly) 신선한 SE 배지에 새싹 길이가 3cm 보다 클 때까지 후속-배양한다. 연장된 새싹들은 더 이상의 선택없이 메젠타 박스 (Magenta boxes) 또는 선데이 컵 (Sundae cups) (Industrial Soap Company, St. Louis MO)에서 B5 비타민, 1% 설탕(sucrose), 0.5 mg l1 NAA가 있는 무라시게 및 스쿠그 염(Murashige and Skoog salts)에 뿌리 내리게 한다.

실시예 15. 형질전환 쌀 ( Transgenic rice (prophetic))

본 발명은 언급된 쌀 라인의 모체 유닛 (parental unit)의 표현 형질에 비교하여 향상 된 광합성 및 성장을 지닌 쌀 라인을 또한 제공한다. 쌀 라인은 상기 서술된 대로 PsbS, ZEP 및 VDE로부터 선택된 폴리펩타이드를 암호화 하는 이종 뉴클레오티드 서열을 포함하는 형질전환 식물 집단을 생성시켜 만들 수 있다. 각 형질전환 사건은 부모 식물의 유전체에 적어도 상기 서술된 대로 이종 뉴클레오티드에 작동적으로 연결된 프로모터를 포함하는 하나의 뉴클레오티드 구조물을 도입하는 것을 포함한다. 그 뉴클레오티드 구조물은 부모 유전체에 충분한 양이 도입되어 형질전환 세포를 생산하고 이는 언급된 강화된 표현형질을 갖는 형질전환 쌀의 식물로 배양될 수 있다. 형질전환 세포는 배양되어 형질전환 종자의 자손을 생산하는 형질전환 식물로 된다. 형질전환 식물 집단은 관찰될 만한 표현형질에 대해 스크리닝 한다. 기대하지 않은 증강된 표현형질을 지닌 것으로서 선택된 형질전환 식물로부터 종자를 모은다. 선택적으로, 그 방법에는 형질전환 종자 발아, 상기 형질전환 종자로부터의 그 후 세대 식물 성장, 상기 그 후 세대 식물의 표현형질 관찰 및 증강된 표현형질을 지닌 그 후 세대 식물로부터 종자 수집의 사이클을 반복하는 것을 포함한다. 다른 측면에서, PsbS, ZEP 및 VDE로부터 선택된 폴리펩타이드를 암호화하는 적어도 하나의 이종 뉴클레오티드 서열을 적용하여 큰 집단을 스크리닝 하는 방법. 다른 선호적인 측면에서의 방법은 이종 DNA가 선택된 프로모터에 작동적으로 연결된, 예를들어, 프로모터의 부위의 5' 끝에, 뉴클레오티드 구조물을 적용하는 것이다. DNA 구조물은 유전체에 무작위적인 위치에 도입시키거나 또는 미리 선택된 유전체 부위에 도입시킬 수 있다.

쌀 형질전환 프로토콜의 한 실시예가 하기에 서술된다.

감염 및 공생-재배

켈러스 (callus) 를 멸균된 차 걸름망 (tea strainer)에 옮기고 차 걸름망을 15 분 동안 매우 부드럽게 및 간헐적으로 흔들면서 아그로박테리움 현탁액에서 배양하고, 멸균 페트리 디쉬 (Petri dish)에 쌓아 놓은 와트만 1 (Whatmann 1) 멸균 필터 페이퍼의 꼭대기에 걸름망을 블럿 건조 (blot dry)시켜 과량의 박테리아를 제거한다. 켈러스를 MSG4K 배지 위에 있는 멸균 필터 페이퍼에 옮기고, 어둠에서 25℃ 에 48 시간 동안 배양한다.

휴식 및 Bialaphos 선택 (Resting and Bialaphos (basta) selection)

공생-배양한 켈스를 멸균된 50 ml 튜브에 옮기고, 멸균 수로 5 번 세척하고 한번은 티멘틴 (timentin) 200 mg/l을 포함하는 액체 공생-배양 배지로 세척한다. 켈러스를 멸균된 와트만 1 (Whatmann 1) 필터 페이퍼에 블럿 건조 시키고 MSG2K “휴식(rest)”배지를 함유하는 플레이트에 옮긴다. 켈러스 플레이트를 어둠에서 25℃ 에 7 일 동안 배양한다. 켈러스를 MSG2K bialaphos 선택 배지에 옮긴다. 플레이트를 어둠에서 25℃에 3 주 동안 배양한다. 이 과정을 매 3 주마다 신선한 배지에 후속 배양하면서 추가로 5 주 동안 반복한다.

켈러스 건조, 새싹 재생 및 뿌리 내리기( 발근 ) (Callus desiccation, shoot regeneration and rooting)

3-4 회로 선택 배지에서 8 주 동안 선택 한 후, 켈러스를 멸균 후드 (sterile hood)에서 두 층의 멸균된 와트만 #1 (Whatmann #1) 필터 페이퍼가 있는 멸균 페트리 디쉬에 옮긴다. 이를 3M 수술용 테이프로 감고 후드에서 어두운 상태로 방해 받지 않게 하여 24시간 동안 놓아 둔다. 플레이트는 켈러스가 어둠에 확실하게 있게 하기 위해 알루미늄 포일에 감아 둘 필요가 있다. 이 부분적으로 켈러스를 건조 시키는 단계는 새싹 재생 배지에서 새싹을 유도하는데 절대로 필요다. 48 시간 후, 켈러스를 MSG75K 새싹 재생 배지에 옮기고 어둠에서 3 주 동안 배양 한다. 체세포 배아와 함께 증식하고 있는 켈러스를 같은 배지에 옮기고 낮은 빛, 약 20 내지 30 μE m-2s-1, 에 12 시간 / 8 시간 암-사이클로 배양한다. 빛이 있는 곳에서 새싹은 10일 후에 나타나기 시작하며 대부분의 켈러스는 초록색으로 될 것이다. 배아와 함께 초록색 켈러스를 만족 할 만한 양의 새싹이 얻어 질 때까지MSG75K 새싹 재생 배지에서 같은 빛 체제하에서 계속 배양한다. 한편, 새싹이 길이가 5 cm 이상 도달 했을 때 밑에서 자르고 MSG100K 발근 배지 (rooting medium)가 있는 그레이너 바이오-원 식물 배양기 (Greiner Bio-One plant culture containers) (# 968161 -82051-508-container with lid, 330ml, sterile, 68 Dia. x 110 H mm))에 옮긴다.

실시예 16. 형질전환 밀 ( Transgenic wheat (prophetic))

본 발명은 언급된 밀 라인의 모체 유닛 (parental unit)의 표현 형질에 비교하여 향상 된 광합성 및 성장을 지닌 밀 라인을 또한 제공한다. 밀 라인은 상기 서술된 대로 PsbS, ZEP 및 VDE로부터 선택된 폴리펩타이드를 암호화 하는 이종 뉴클레오티드 서열을 포함하는 형질전환 식물 집단을 생성시켜 만들 수 있다. 각 형질전환 사건은 부모 식물의 유전체에 적어도 상기 서술된 대로 이종 뉴클레오티드에 작동적으로 연결된 프로모터를 포함하는 하나의 뉴클레오티드 구조물을 도입하는 것을 포함한다. 그 뉴클레오티드 구조물은 부모 유전체에 충분한 양이 도입되어 형질전환 세포를 생산하고 이는 언급된 강화된 표현형질을 갖는 형질전환 밀의 식물로 배양될 수 있다. 형질전환 세포는 배양되어 형질전환 종자의 자손을 생산하는 형질전환 식물로 된다. 형질전환 식물 집단은 관찰될 만한 표현형질에 대해 스크리닝 한다. 기대하지 않은 증강된 표현형질을 지닌 것으로서 선택된 형질전환 식물로부터 종자를 모은다. 선택적으로, 그 방법에는 형질전환 종자 발아, 상기 형질전환 종자로부터의 그 후 세대 식물 성장, 상기 그 후 세대 식물의 표현 형질관찰 및 증강된 표현형질을 지닌 그 후 세대 식물로부터 종자 수집의 사이클을 반복하는 것을 포함한다. 다른 측면에서, PsbS, ZEP 및 VDE로부터 선택된 폴리펩타이드를 암호화하는 적어도 하나의 이종 뉴클레오티드 서열을 적용하여 큰 집단을 스크리닝 하는 방법. 다른 선호적인 측면에서의 방법은 이종 DNA가 선택된 프로모터에 작동적으로 연결된, 예를 들어, 프로모터의 부위의 5' 끝에, 뉴클레오티드 구조물을 적용하는 것이다. DNA 구조물은 유전체에 무작위적인 위치에 도입시키거나 또는 미리 선택된 유전체 부위에 도입시킬 수 있다.

밀 형질전환 프로토콜의 한 예시는 메드벡카 하우드 (Medvecka E, Harwood WA. Wheat (Triticum aestivum L.) Transformation Using Mature Embryos. Agrobacterium Protocols: Volume 1. 2015:199-209)에 서술되어 있다.

실시예 17. 형질 전환 동부 ( Transgenic cowpea )

동부 (cowpea) 식물은 히긴스 등 (Higgins et al., Innovative research along the cowpea value chain. Ibadan, Nigeria: International Institute of Tropical Agriculture, pp. 133-139, 2013) 에 서술 된 것에 따라 PsbS, ZEP 및 VDE를 암호화 하는 뉴클레오티드를 포함하고 있는 T-DNA 구조물로 형질전환 시켰다. 다이나믹한 NPQ 적응 키네틱스를 비교하기 위해, 변동하는 빛에 노출 시킨 후 이중 지수 모델을 (double exponential model) T₀형질전환 동부에서 NPQ의 암-이완에 적응시켰다. 표 4 에서 보는 바와 같이, qE 이완(qE relaxation) (τ은 측정치 20.5 s 및 19.7 s 대비 35.9 s 및 29.7 s로 형질전환 라인 164381A에서 대조군에 비해 눈에 띨 만하게 더 빨랐다. NPQ 이완 (NPQ relaxation) (τ의 qZ 상은 대조군에 비해 형질전환 라인1643B1 에서 더 느렸으며, 이는 아마도 측정이 T₀형질전환 식물에서 이루어졌다는 한계 때문일 것이다. 이 분야에서 알려진 대로, 표현형 측정에는 T₁ 또는 T₂ 세대로부터 온 형질 전환 식물을 T₀보다 일반적으로 선호한다. 한가지 이유는, T₀ 형질 전환 식물에서는 형질전환 및 조직 배양 과정에서의 스트레스가 정상적인 식물의 생리를 방해하여 표현형질 측정에 영향을 줄 수 있기 때문이다. 또 다른 이유는 형질전환 유전자의 분자적 특성화는 T₁ 또는 T₂세대 까지는 완전 할 수 없기 때문이며 카피 수 및 유전체 상의 삽입 위치와 같은 형질전환 특징들이 형질전환 유전자들의 발현에 상당한 영향을 줄 수 있기 때문이다. 도 27 , 도 28 및 도 29 에서 보는 바와 같이, NPQ는 형질전환 라인 1643B1에서 대조군 식물에서보다 이완이 더 빠르다. 도 30 에 보여준 대로, NPQ는 형질전환 라인 CP472A (오렌지 점)에서 대조군 (파란 점)에서 보다 더 천천히 이완 되며, 이는 위에서 논의 된 대로 아마도 측정이 T₀형질전환 식물에서 이루어졌다는 한계 때문일 것이다.

표 4. 형질전환 동부에서 NPQ 이완의 시간 항수(Time constants of NPQ relaxation in transgenic cowpea)

실시예 18. 형질전환 카사바 ( Transgenic cassava (prophetic))

본 발명은 언급된 카사바 라인의 모체 유닛 (parental unit)의 표현 형질에 비교하여 향상 된 광합성 및 성장을 지닌 카사바 라인을 또한 제공한다. 카사바 라인은 상기 서술된 대로 PsbS, ZEP 및 VDE로부터 선택된 폴리펩타이드를 암호화 하는 이종 뉴클레오티드 서열을 포함하는 형질전환 식물 집단을 생성시켜 만들 수 있다. 각 형질전환 사건은 부모 식물의 유전체에 적어도 상기 서술된 대로 이종 뉴클레오티드에 작동적으로 연결된 프로모터를 포함하는 하나의 뉴클레오티드 구조물을 도입하는 것을 포함한다. 그 뉴클레오티드 구조물은 부모 유전체에 충분한 양이 도입되어 형질전환 세포를 생산하고 이는 언급된 강화된 표현형질을 갖는 형질전환 카사바 식물로 배양될 수 있다. 형질전환 세포는 배양되어 형질전환 종자의 자손을 생산하는 형질전환 식물로 된다. 형질전환 식물 집단은 관찰될 만한 표현형질에 대해 스크리닝 한다. 기대하지 않은 증강된 표현형질을 지닌 것으로서 선택된 형질전환 식물로부터 종자를 모은다. 선택적으로, 그 방법에는 형질전환 종자 발아, 상기 형질전환 종자로부터의 그 후 세대 식물 성장, 상기 그 후 세대 식물의 표현 형질관찰 및 증강된 표현형질을 지닌 그 후 세대 식물로부터 종자 수집의 사이클을 반복하는 것을 포함한다. 다른 측면에서, PsbS, ZEP 및 VDE로부터 선택된 폴리펩타이드를 암호화하는 적어도 하나의 이종 뉴클레오티드 서열을 적용하여 큰 집단을 스크리닝 하는 방법. 다른 선호적인 측면에서의 방법은 이종 DNA가 선택된 프로모터에 작동적으로 연결된, 예를들어, 프로모터의 부위의 5' 끝에, 뉴클레오티드 구조물을 적용하는 것이다. DNA 구조물은 유전체에 무작위적인 위치에 도입시키거나 또는 미리 선택된 유전체 부위에 도입시킬 수 있다.

카사바 형질전환 프로토콜의 한 예시는 체티 등에 (Chetty et al., New Biotechnology 30.2: 136-143, 2013)에 서술되어 있다.

실시예 19. 형질전환 포플라 (( Transgenic poplar (prophetic))

본 발명은 언급된 포플라 라인의 모체 유닛 (parental unit)의 표현 형질에 비교하여 향상 된 광합성 및 성장을 지닌 포플라 라인을 또한 제공한다. 포플라 라인은 상기 서술된 대로 PsbS, ZEP 및 VDE로부터 선택된 폴리펩타이드를 암호화 하는 이종 뉴클레오티드 서열을 포함하는 형질전환 식물 집단을 생성시켜 만들 수 있다. 각 형질전환 사건은 부모 식물의 유전체에 적어도 상기 서술된 대로 이종 뉴클레오티드에 작동적으로 연결된 프로모터를 포함하는 하나의 뉴클레오티드 구조물을 도입하는 것을 포함한다. 그 뉴클레오티드 구조물은 부모 유전체에 충분한 양이 도입되어 형질전환 세포를 생산하고 이는 언급된 강화된 표현형질을 갖는 형질전환 포플라의 식물로 배양될 수 있다. 형질전환 세포는 배양되어 형질전환 종자의 자손을 생산하는 형질전환 식물로 된다. 형질전환 식물 집단은 관찰될 만한 표현형질에 대해 스크리닝 한다. 기대하지 않은 증강된 표현형질을 지닌 것으로서 선택된 형질전환 식물로부터 종자를 모은다. 선택적으로, 그 방법에는 형질전환 종자 발아, 상기 형질전환 종자로부터의 그 후 세대 식물 성장, 상기 그 후 세대 식물의 표현형질 관찰 및 증강된 표현형질을 지닌 그 후 세대 식물로부터 종자 수집의 사이클을 반복하는 것을 포함한다. 다른 측면에서, PsbS, ZEP 및 VDE로부터 선택된 폴리펩타이드를 암호화하는 적어도 하나의 이종 뉴클레오티드 서열을 적용하여 큰 집단을 스크리닝 하는 방법. 다른 선호적인 측면에서의 방법은 이종 DNA가 선택된 프로모터에 작동적으로 연결된, 예를 들어, 프로모터의 부위의 5' 끝에, 뉴클레오티드 구조물을 적용하는 것이다. DNA 구조물은 유전체에 무작위적인 위치에 도입시키거나 또는 미리 선택된 유전체 부위에 도입시킬 수 있다.

포플라의 형질전환 프로토콜의 한 예시는 모바헤디 등에 (Movahedi et al., International Journal of Molecular Science 15.6: 10780-10793, 2014) 에 서술되어 있다.

실시예 20. 형질전환 유칼립투스 ( Transgenic eucalyptus (prophetic)

본 발명은 언급된 유칼립투스 라인의 모체 유닛 (parental unit)의 표현 형질에 비교하여 향상 된 광합성 및 성장을 지닌 유칼립투스 라인을 또한 제공한다. 유칼립투스 라인은 상기 서술된 대로 PsbS, ZEP 및 VDE로부터 선택된 폴리펩타이드를 암호화 하는 이종 뉴클레오티드 서열을 포함하는 형질전환 식물 집단을 생성시켜 만들 수 있다. 각 형질전환 사건은 부모 식물의 유전체에 적어도 상기 서술된 대로 이종 뉴클레오티드에 작동적으로 연결된 프로모터를 포함하는 하나의 뉴클레오티드 구조물을 도입하는 것을 포함한다. 그 뉴클레오티드 구조물은 부모 유전체에 충분한 양이 도입되어 형질전환 세포를 생산하고 이는 언급된 강화된 표현형질을 갖는 형질전환 유칼립투스의 식물로 배양될 수 있다. 형질전환 세포는 배양되어 형질전환 종자의 자손을 생산하는 형질전환 식물로 된다. 형질전환 식물 집단은 관찰될 만한 표현형질에 대해 스크리닝 한다. 기대하지 않은 증강된 표현형질을 지닌 것으로서 선택된 형질전환 식물로부터 종자를 모은다. 선택적으로, 그 방법에는 형질전환 종자 발아, 상기 형질전환 종자로부터의 그 후 세대 식물 성장, 상기 그 후 세대 식물의 표현형질 관찰 및 증강된 표현형질을 지닌 그 후 세대 식물로부터 종자 수집의 사이클을 반복하는 것을 포함한다. 다른 측면에서, PsbS, ZEP 및 VDE로부터 선택된 폴리펩타이드를 암호화하는 적어도 하나의 이종 뉴클레오티드 서열을 적용하여 큰 집단을 스크리닝 하는 방법. 다른 선호적인 측면에서의 방법은 이종 DNA가 선택된 프로모터에 작동적으로 연결된, 예를 들어, 프로모터의 부위의 5' 끝에, 뉴클레오티드 구조물을 적용하는 것이다. DNA 구조물은 유전체에 무작위적인 위치에 도입시키거나 또는 미리 선택된 유전체 부위에 도입시킬 수 있다.

유칼립투스 형질전환 프로토콜의 한 예시는 디와카 등에 (Diwakar et al., Plant Tissue Culture: Propagation, Conservation and Crop Improvement, 219-244, 2016)에 서술되어 있다.

실시예 21. NPQ 유전자들의 서열 동일성 분석 (Sequence identity analysis of NPQ genes)

아라비돕시스 (Arabidopsis) PsbS, ZEP 및 VDE 와 동일성을 가진 아미노산 서열을 동정하기 위하여, BLAST 단백질 서치를 (BLAST protein searches) BLASTX 프로그램으로 수행 하였다. BLAST에 의한 서열 유사성 퍼센트는 표 4 에는 PsbS, 표 5에는 ZEP, 및 표 6에는 VDE에 대해 표시되며, 아라비돕시스 동족체와 서열 동일성의 % 에 대한 내림차 순으로 상위 100 hit 서열이 목록화 되어 있다.

아라비돕시스 (Arabidopsis) PsbS, ZEP 및 VDE와 동일성을 가진 아미노산 서열과 서열 동일성 및/또는 유사성을 비교하기 위하여, CLUSTAL OMEGA 프로그램으로 서열 정렬 (alignment of sequences)을 수행하였다. 도 24는 CLUSTAL O 를 통해 각각 ( a-c ) PsbS, ( d-i ) ZEP 및 ( j-n) VDE에 대한, 아미노산 서열 유사성을 보여준다.

표 5. PbsS 에 대한 서열 동일성 퍼센트 (Percentage of sequence identity for PsbS)

표 6. ZEP에 대한 서열 동일성 퍼센트 (Percentage of sequence identity for ZEP).

표 7. VDE에 대한 서열 동일성 퍼센트 (Percentage of sequence identity for VED).

실시예 22. 온실 NPQ 발현 실험 (Greenhouse NPQ expression experiment)

잎에서의 발현을 위해 다른 프로모터의 조절하에 있는 아라비돕시스 (Arabidopsis) VDE, ZEP, 및 PsbS의 암호화 서열로 담배 (Nicotiana tabacum ) 를 형질전환시켰다. 묘목 NPQ 스크린에 근거하여 단일 트랜스퍼 DNA (T-DNA) 통합 (single transfer DNA (T-DNA) integration)을 지닌 형질전환체 2 개 ((VPZ-34 및 -56) 및 두개의 T-DNA 삽입을 지닌 형질전환체 1 개 (VPZ-23)를 선택 하였으며, 더 조사하기 위해 동종 접합체 T₂자손을 얻기 위한 자가-수정 시켰다. 이들 식물들은 온실에서 키웠다. VDE, ZEP, 및 PsbS의 mRNA 및 단백질의 수준이 측정되었다 ( 도 25 ).

모든 세 VPZ 라인들은 WT (A, C, 및 E) 전사수준에 비해 VDE (10-배), PsbS (3 배), 및 ZEP (6 배)의 총 (형질전환 + 자연) 전사수준의 증가를 보여준다. PsbS 에서는, 21 kDa (AtPsbS) 및 24 kDa (NtPsbS) 벤드에서 보여 주는것과 같이 (G), 전사 수준의 증가는 약 4 배 더 높은 단백질 수준으로 번역된다. VDE 및 ZEP에서는, 전사 수준의 증가는 WT 단백질 수준에 비해 VDE (45 kDa) 는 30배 (B 및 G) 및 ZEP (73 kDa)는 74-배 (F 및 G) 증가에 해당한다.

실시예 23. 야외 NPQ 발현 실험 (Field NPQ expression experiment)

잎에서의 발현을 위해 다른 프로모터의 조절하에 있는 아라비돕시스 (Arabidopsis) VDE, ZEP, 및 PsbS의 암호화 서열로 담배 (Nicotiana tabacum ) 를 형질전환시켰다. 묘목 NPQ 스크리닝에 근거하여 단일 트랜스퍼 DNA (T-DNA)통합 (single transfer DNA (T-DNA) integration)을 지닌 형질전환체 2 개 ((VPZ-34 및 -56) 및 두개의 T-DNA 삽입을 지닌 형질전환체 1 개 (VPZ-23)를 선택 하였으며, 더 조사하기 위해 동종접합체 T₂자손을 얻기 위한 자가-수정시켰다. 이들 식물들은 야외에서 키웠다. VDE, ZEP, 및 PsbS의 mRNA 및 단백질의 수준이 측정되었다 ( 도 26 ).

모든 세 VPZ 라인들은 WT 전사수준에 비해 VDE (4-배), PsbS (1.2-배), 및 ZEP (7-배)의 총 (형질전환 + 자연) 전사수준의 증가를 보여준다. 모든 세 VPZ 라인들은 또한 WT 단백질 수준에 비해 VDE (47-배), PsbS (3-배), 및 ZEP (75- 배)의 총 (형질전환 + 자연) 단백질 수준의 증가를 보여준다.

실시예 24. 형질전환 쌀 실험 ( Transgenic rice experiment)

쌀 식물은 PsbS, ZEP 및 VDE를 암호화하는 뉴크레오티드 서열을 포함하는 T-DNA 구조물 (T-DNA construct)로 실시예 15에 서술된 형질전환 프로토콜에 따라 형질전환 시켰다. 형질전환 담배 실험에서 사용된 똑같은 발현 구조물 (expression construct)을 이 실험에서도 사용했다. 독립적인 T₀ 형질전환체 9개의 잎 및 두 GUS 대조군을 암-적응시켰다. 이어서 1000 μmol m-2 s-1 빛에 10분 이어서 어둠에서 3 분 있는 동안 NPQ를 측정하였다. 도 31 은 9 개의 쌀 형질전환체 (점) 및 대조군(라인)의 1000 μmol m-2 s-1 빛에 10분 이어서 어둠에서 3 분 있는 코스 동안의 NPQ를 보여준다. 도 32 는 1000 μmol m-2 s-1 빛에 10분 이어서 어둠에서 3 분 있는 코스 동안의 9 개 쌀 형질전환체 (파란 점) 및 대조군 (오렌지 점) 의 평균 NPQ를 보여준다.

도 31 및 도 32 에서 보여준 대로, 9 개의 형질전환체의 NPQ 증폭은 1000 μmol m-2 s-1 빛에 10 분 있는 동안에는 대조군 보다 더 낮다. 이 결과는 이들 형질전환체에서 ZEP 증가된 발현과 일치하며, 이는 제아크산틴 (zeaxanthin) 형성을 억제시키고 이로서 NPQ 증폭을 감소시킨다. 다른 설명은 PsbS 과발현은 자연 PsbS 의 발현을 방해하여 이로서 NPQ 증폭을 감소시킨다. 결과는 또한 어둠에서 3 분 이완하는 동안에는, 이 실험에서는 가능한 제아크산틴 (zeaxanthin) 축적이 없기 때문에, 형질전환체와 대조군 사이에 의미 있는 NPQ의 차이는 없다는 것을 보여준다.

형질전환 쌀식물 실험에서 NPQ 키네틱스의 변화가 없다는 것은 실험 디자인의 한계 때문일 것으로 거의 생각 된다: 이 실험에서는, 쌍 떡잎 식물에 최적의 유전자 발현이 되도록 디자인한 프로모터를 포함하는 담배 형질전환을 위해 만들어진 발현 카셋트로 쌀식물에 형질전환시켰다. 이 분야에서는 쌍떡잎 프로모터는 외떡잎 식물에서는 잘 작동하지 않는 것이 알려졌다. 그러므로, 이러한 형질전환 쌀식물에서 PsbS, ZEP 및 VDE의 발현은 NPQ 이완율을 증가시키도록 하는 수준까지 최적으로 증가되지 않았을 것이다.

실시예 25. 추가적인 실험 (Additional experiments)

NPQ 관련 유전자들의 일시적 발현을 Nicotiana benthamiana에서 수행하였다. FLAG-태그된 PsbS, VDE, ZEP, 및 음성 대조군 GUS을 과발현 하는 잎 스팟에서 600 μmol photons m-2 s-1 에서 10분간 조명 (illumination) 하고, 이어서 3 분간 어둠에 두는 동안 NPQ 측정을 하였다. 도 18 에서 보여 주는 것과 같이, GUS 대조군에 비해 PsbS의 과발현은 NPQ 의 역량을 증가 시키는 결과를 보였다. VDE의 과발현은 NPQ 유도를 가속화 시켰다. ZEP의 과발현은 NPQ 이완을 가속화 시켰으나 NPQ 유도 및 역량에는 부정적 양향을 주었다.

VDE 및 ZEP의 일시적인 공동-과발현을 Nicotiana benthamiana 에서의 수행 하였다. 도 19 에서 보는 바와 같이 결과는 NPQ 유도 및 이완의 증가된 속도를 보여 준다. VDE의 공동-과발현은 ZEP 과발현과 균형을 맞추고 NPQ 유도 및 역량에 ZEP 과발현의 부정적 영향을 막기 위해 필요 한것으로 보여졌다.

도 20은 Nicotiana tabacum cv. Petite Havana의 안정적인 형질전환 T₁식물의 NPQ 키네틱스를 보여준다. DUAL PAM 으로의 NPQ 측정은 3 개 서로 다른 라인: 하나의 야생-타입 분리개체 ((segregant (Null)), 하나의 과발현 ZEP (ZEP) 및 하나의 과발현 ZEP 및 VDE (ZEP-VDE)의 T₁ 어른식물의 완전히 발달된 잎에서 600 μmol photons m-2 s-1 에서 10분 조명하고 이어서 어둠에서 10 분 두는 동안에서 수행 되었다. 결과는 ZEP-VDE 라인이 NPQ 유도 및 이완이 더 빠르다는 것을 보여 준다.

도 21은 Nicotiana tabacum cv. Petite Havana 의 안정적인 형질전환 T₁ 식물의 광계 II 양자 수율 (photosystem II quantum yield) (YII) 을 보여준다. 도 20에 서술된 NPQ 측정과 동시에 수행된 YII 의 측정은 같은 식물에서 같은 조건으로 수행 되었다. 어둠에서 회복 되는 기간 동안, YII 는 ZEP 또는 Null을 과발현하는 라인에 비교하여 ZEP-VDE를 과발현하는 라인에서 더 높았다.

도 22는 온실에서의 성장 실험을 보여준다. 결과는 야생 타입에 비해 (Null), ZEP 및 VDE (ZEP-VDE)를 과발현 하는 Nicotiana tabacum cv. Petite Havana의 안정적인 형질전환 T₁ 식물의 증가된 크기 및 바이오 매스를 보여 준다. PsbS (PsbS) 또는 ZEP 및 PSBS (ZEP-PsbS)를 과발현 하는 라인들은 야생 타입과 비슷한 바이오매스를 보여 준다. 도면에 4 셋트의 식물, 형질전환 라인당 하나를 보여 준다. 각 셋트는 36 식물을 포함한다. 각 셋트의 지상-위의 바이오매스를 19일 간의 성장 후, 수확한 36 식물의 총 wet-무게 및 총 건조 무게로 결정했다. 데이터는 단일 실험의 결과를 대표한다.

<110> The Board of Trustees of the University of Illinois The Regents of the University of California <120> TRANSGENIC PLANTS WITH INCREASED PHOTOSYNTHESIS EFFICIENCY AND GROWTH <130> 2018FPI-11-002US <150> US 62/342248 <151> 2016-05-27 <150> PCT/US 2017/034840 <151> 2017-05-26 <160> 68 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 1059 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 1 atcttttaat ctcttcactt ccacaacaca acacaaaaca catcactgat ccttctctca 60 tcctcagaaa gaatggctca aaccatgctg cttacttcag gcgtcaccgc cggccatttt 120 ttgaggaaca agagcccttt ggctcagccc aaagttcacc atctcttcct ctctggaaac 180 tctccggttg cactaccatc taggagacaa tcattcgttc ctctcgctct cttcaaaccc 240 aaaaccaaag ctgctcctaa aaaggttgag aagccgaaga gcaaggttga ggatggcatc 300 tttggaacgt ctggtgggat tggtttcaca aaggcgaatg agctattcgt tggtcgtgtt 360 gctatgatcg gtttcgctgc atcgttgctt ggtgaggcgt tgacgggaaa agggatatta 420 gctcagctga atctggagac agggataccg atttacgaag cagagccatt gcttctcttc 480 ttcatcttgt tcactctgtt gggagccatt ggagctctcg 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hassleriana <400> 30 Met Gly Ser Thr Leu Phe Cys Ser Pro Val Asn Pro Ser Leu Ser Lys 1 5 10 15 Leu Asp Phe Ser Arg Thr His Leu Leu Ser Pro Ala Asp Lys His Phe 20 25 30 Phe Leu Asp Leu Pro Ser Phe Met Gly Lys Val Arg Gly Lys Ser Ser 35 40 45 Val Met Ser Arg Arg Arg Val Val Gly Val Lys Ala Thr Ala Ala Val 50 55 60 Glu Glu Glu Arg Arg Glu Thr Ala Ala Glu Lys Glu Lys Leu Arg Val 65 70 75 80 Leu Val Ala Gly Gly Gly Ile Gly Gly Leu Val Phe Ala Leu Ala Ala 85 90 95 Lys Arg Lys Gly Phe Asp Val Ala Val Phe Glu Lys Asp Leu Ser Ala 100 105 110 Ile Arg Gly Glu Gly Gln Tyr Arg Gly Pro Ile Gln Ile Gln Ser Asn 115 120 125 Ala Leu Ala Ala Leu Glu Ala Ile Asp Met Gly Val Ala Glu Glu Val 130 135 140 Met Glu Ala Gly Cys Ile Thr Gly Asp Arg Ile Asn Gly Leu Val Asp 145 150 155 160 Gly Val Ser Gly Ser Trp Tyr Val Lys Phe Asp Thr Phe Thr Pro Ala 165 170 175 Ala Glu Arg Gly Leu Pro Val Thr Arg Val Ile Ser Arg Met Thr Leu 180 185 190 Gln Gln Ile Leu Ala Arg Ala Val Gly Glu Asp Val Ile Gln Asn Glu 195 200 205 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70 75 80 Lys Phe Pro Ser Phe Ser Ser Thr Ala Ala Ser Ile Asn Lys Ala Lys 85 90 95 Glu Val Leu Asn Phe Leu Met Leu Ser Val Ser Asn Asn Leu Lys Glu 100 105 110 Lys Gly Gln Leu Gln Phe Leu Lys Val Ala Gly Ile Leu Ala Cys Ala 115 120 125 Leu Leu Val Ile Pro Ser Ala Asp Ala Val Asp Ala Leu Lys Thr Cys 130 135 140 Ala Cys Leu Leu Lys Glu Cys Arg Leu Glu Leu Ala Lys Cys Ile Ala 145 150 155 160 Asn Pro Ala Cys Ala Ala Asn Ile Ala Cys Leu Gln Thr Cys Asn Asn 165 170 175 Arg Pro Asp Glu Thr Glu Cys Gln Ile Lys Cys Gly Asp Leu Phe Glu 180 185 190 Asn Asn Val Val Asp Glu Phe Asn Glu Cys Ala Val Ser Arg Lys Lys 195 200 205 Cys Val Pro Lys Lys Ser Asp Val Gly Glu Phe Pro Val Pro Asp Pro 210 215 220 Ala Val Leu Val Lys Ser Phe Asn Ile Ala Asp Phe Ser Gly Lys Trp 225 230 235 240 Phe Ile Thr Ser Gly Leu Asn Pro Thr Phe Asp Thr Phe Asp Cys Gln 245 250 255 Leu His Asp Phe His Arg Glu Ser Asn Arg Leu Val Gly Asn Leu Ser 260 265 270 Trp Arg Ile Arg Thr Pro Asp Gly Gly Phe Phe Thr Arg Ser Thr Val 275 280 285 Gln Lys Phe Val Gln Asp Pro Leu Gln Pro Gly Ile Leu Tyr Asn His 290 295 300 Asp Asn Glu Tyr Leu His Tyr Gln Asp Asp Trp Tyr Ile Leu Ser Ser 305 310 315 320 Lys Leu Glu Asn Ser Glu Asn Asp Tyr Ile Phe Val Tyr Tyr Arg Gly 325 330 335 Arg Asn Asp Ala Trp Asp Gly Tyr Gly Gly Ala Val Val Tyr Thr Arg 340 345 350 Ser Ala Val Leu Pro Glu Ser Ile Ile Pro Glu Leu Glu Thr Ala Ala 355 360 365 Lys Lys Val Gly Arg Asp Phe Asn Lys Phe Ile Ile Thr Asp Asn Thr 370 375 380 Cys Gly Pro Glu Pro Pro Leu Ala Glu Arg Ile Glu Lys Thr Val Glu 385 390 395 400 Glu Gly Glu Lys Thr Ile Ile Arg Glu Val Glu Glu Ile Glu Gly Asn 405 410 415 Val Glu Lys Val Gly Lys Thr Glu Met Ala Leu Phe Gln Arg Leu Ala 420 425 430 Glu Gly Phe Lys Glu Leu Gln Gln Asp Glu Glu Phe Phe Val Arg Glu 435 440 445 Leu Ser Lys Glu Glu Met Asp Ile Leu Asn Asp Leu Lys Met Glu Ala 450 455 460 Gly Glu Val Glu Lys Leu Phe Gly Glu Ala Leu Pro Leu Arg Lys Leu 465 470 475 480 Arg

Claims

하나 이상의 발현 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 하기를 암호화하는 하나 이상의 감염된(transfected) 뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전적으로 변화된 식물:
광계(photosystem) II 서브유닛 S(PsbS), 제아크산틴 에폭시다제(zeaxanthin epoxidase, ZEP), 및 비올라크산틴 디-에폭시다제(violaxanthin de-epoxidase, VDE); 또는
ZEP 및 VDE,
여기서 적어도 ZEP 및 VDE의 전사 수준이 동일한 조건에서 성장한 감염된 서열이 없는 대조군 식물과 비교하여 모두 증가하고, 상기 식물은 동일한 변동되는 광 조건하에서 성장한 대조군 식물과 비교하여, 변동하는 광 조건하에서 성장이 향상되는,
유전적으로 변화된 식물.
제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 감염된 뉴클레오티드 서열은 쌍떡잎식물(dicot)로부터 유래된, 유전적으로 변화된 식물.
제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 감염된 뉴클레오티드 서열은 애기장대(Arabidopsis thaliana)로부터 유래된, 유전적으로 변화된 식물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, VDE, PsbS 또는 ZEP의 전사(transcript) 수준이 대조군 식물과 비교하여 증가된, 유전적으로 변화된 식물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
a. PsbS는 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되고, ZEP는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되며, VDE는 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는;
b. PsbS는 서열번호 1을 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되고, ZEP는 서열번호 2을 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되며, VDE는 서열번호 3을 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는;
c. PsbS는 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖고, ZEP는 서열번호 5의 아미노산 서열을 가지며, VDE는 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는;
d. PsbS는 서열번호 4 또는 10-29를 갖는 아미노산 서열을 갖고, ZEP는 서열번호 5 또는 30-49를 갖는 아미노산 서열을 가지며, VDE는 서열번호 6 또는 50-68을 갖는 아미노산 서열을 갖거나; 또는
e. PsbS는 서열번호 7의 보존된 도메인을 포함하고, ZEP는 서열번호 8의 보존된 도메인을 포함하며, VDE는 서열번호 9의 보존된 도메인을 포함하는, 유전적으로 변화된 식물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 식물은 작물 식물(crop plant), 모델 식물(model plant), 외떡잎 식물(monocotyledonous plant), 쌍떡잎 식물(dicotyledonous plant), 크레슐산(CAM) 대사 광합성 식물(plant with Crassulacean acid metabolism photosynthesis), C3 광합성 식물(plant with C3 photosynthesis), C4 광합성 식물(plant with C4 photosynthesis), 일년생 식물(annual plant), 온실 식물(greenhouse plant), 원예 꽃 식물(horticultural flowering plant), 다년생 식물(perennial plant), 스위치그라스 식물(switchgrass plant), 옥수수 식물(maize plant), 바이오매스 식물(biomass plant), 또는 사탕수수 식물(sugarcane plant)인, 유전적으로 변화된 식물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 식물은 스위치그라스, 억새속(Miscanthus), 개자리속(Medicago), 단수수(sweet sorghum), 곡용 수수(grain sorghum), 사탕수수(sugarcane; Saccharum spp.), 에너지 수수(energy cane), 코끼리 풀(elephant grass), 수수(sorghum, Sorghum bicolor), 옥수수(maize; Zea mays), 카사바(cassava; Manihot esculenta), 동부(cowpea; Vigna unguiculata), 밀(wheat), 보리(barley; Hordeum vulgare), 귀리(oats), 쌀(rice; Oryza sativa), 대두(soybean; Glycine max), 팜유(oil palm), 잇꽃(safflower), 참깨(sesame), 담배(tobacco; Nicotiana tabacum), 아마(flax), 목화(cotton), 해바라기(sunflower), 양구슬냉이속(Camelina), 유채(Brassica napus), 브라시카 카리나타(Brassica carinata), 갓(Brassica juncea), 펄 밀렛(pearl millet), 조(foxtail millet), 다른 곡물(other grain), 오일시드(oilseed), 알파파(alfalfa; Medicago sativa), 감자(potato; Solanum tuberosum), 포플러(poplar; Populus spp.), 유칼립투스(eucalyptus; Eucalyptus spp.), 채소 작물( vegetable crop), 사료 작물(forage crop), 공예 작물(industrial crop), 목본 작물(woody crop) 및 바이오매스 작물(biomass crop)로 구성된 군으로부터 선택된, 유전적으로 변화된 식물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 식물은 변동하는 광 조건 하에 있는 대조군 식물과 비교하여 변동하는 광 조건 하에서 성장이 증가, 광합성 활성 증가, 광 보호 효율 향상, 양자 수율(quantum yield) 및 CO₂ 고정(fixation)의 향상 중 어느 하나 이상을 갖는, 유전적으로 변화된 식물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 식물은 엘리트 라인(elite line) 또는 엘리트 계통(elite strain)인, 유전적으로 변화된 식물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 식물은 제초제(herbicide) 저항성, 곤충 또는 해충 저항성, 질병 저항성, 변형된 지방산 대사, 또는변형된 탄수화물 대사를 제공하는 하나 이상의 추가적인 폴리펩타이드의 발현을 더 포함하는, 유전적으로 변화된 식물.
하나 이상의 발현 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 하기를 암호화하는 하나 이상의 이종의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터:
PsbS, ZEP, 및 VDE; 또는
ZEP 및 VDE,
여기서 적어도 하나의 발현 조절 서열은, 동일한 조건에서 성장한 감염된 뉴클레오디트 서열이 없는 대조군 식물과 비교하여 발현 벡터가 식물로 감염되어질 때 적어도 ZEP 및 VDE의 전사 수준이 동일한 조건에서 모두 증가하고, 식물은 동일한 변동되는 광 조건하에서 성장한 대조군 식물과 비교하여, 변동하는 광 조건하에서 성장이 향상된다.
제11항에 있어서, 상기 하나 이상의 발현 조절 서열은 Rbcs1A, GAPA-1 및 FBA2로 구성된 군으로부터 선택된 프로모터를 포함하는, 발현 벡터.
제11항에 있어서, Rbcs1A 프로모터는 ZEP의 발현을 유도하고, GAPA-1 프로모터는 PsbS의 발현을 유도하며, FBA2 프로모터는 VDE의 발현을 유도하는, 발현 벡터.
제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발현 벡터는 T-DNA인, 발현 벡터.
제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 항생제 내성을 제공하는 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 더 포함하는, 발현 벡터.
제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발현 조절 서열, 및 PsbS, ZEP 및 VDE 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 플랭킹하는 좌측 경계(left border, LB) 및 우측 경계(right border, RB) 도메인을 더 포함하는, 발현 벡터.
제11항 내지 제13항 중 어느 한 항의 발현 벡터에 있어서,
a. 상기 PsbS는 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되고, ZEP는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되며, VDE는 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는;
b. PsbS는 서열번호 1을 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되고, ZEP는 서열번호 2를 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되며, VDE는 서열번호 3을 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는;
c. PsbS는 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖고, ZEP는 서열번호 5의 아미노산 서열을 가지며, VDE는 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는;
d. PsbS는 서열번호 4 또는 10-29를 갖는 아미노산 서열을 갖고, ZEP는 서열번호 5 또는 30-49를 갖는 아미노산 서열을 가지며, VDE는 서열번호 6 또는 50-69를 갖는 아미노산 서열을 갖는; 또는
e. PsbS는 서열번호 7의 보존된 도메인을 포함하고, ZEP는 서열번호 8의 보존된 도메인을 포함하며, VDE는 서열번호 9의 보존된 도메인을 포함하는, 발현 벡터.
제11항 내지 제13항 중 어느 한 항의 발현 벡터를 포함하는 박테리아 세포.
제11항 내지 제13항 중 어느 한 항의 발현 벡터를 포함하는 아그로박테리움(Agrobacterium) 세포.
제11항 내지 제13항 중 어느 한 항의 발현 벡터를 포함하는 형질전환 식물.
제11항 내지 제13항 중 어느 한 항의 발현 벡터를 포함하는 종자.
제21항의 종자로부터 나온 자손 식물(progeny plant).
삭제
식물 내 하기의 발현을 증가시켜, 대조군 식물과 비교하여 2개 이상의 폴리펩타이드의 발현이 증가된 식물을 생산하는 단계를 포함하는, 식물 내 성장, 광합성 효율, 광 보호 효율, 양자 수율(quantum yield), CO₂ 고정(fixation) 및 비-광화학적 소멸(non-photochemical quenching, NPQ)의 이완 속도 중 어느 하나 또는 그 이상을 증가시키는 방법:
PsbS, ZEP, 및 VDE; 또는
ZEP 및 VDE,
여기서 적어도 ZEP 및 VDE는 동일한 조건하에서 성장된 증가한 발현이 부족한 대조군 식물과 비교하여 동일한 조건 하에서 모두 증가되고, 고등 식물은 동일한 변동되는 광 조건하에서 성장한 대조군 식물과 비교하여, 변동하는 광 조건하에서 성장이 향상된다.
삭제
제24항에 있어서, 상기 PsbS, ZEP 및 VDE의 하나 또는 그 이상의 발현은 PsbS, ZEP 또는 VDE를 암호화하는 하나 이상의 이종의 뉴클레오티드 서열을 발현시킴으로써 증가되는, 방법.
제24항에 있어서, 상기 PsbS, ZEP 및 VDE의 하나 또는 그 이상의 발현은 PsbS, ZEP 또는 VDE의 프로모터를 변형시킴으로써 증가되는, 방법.
제27항에 있어서, 상기 프로모터 변형은 유전체 편집 시스템에 의해 달성되는, 방법.
제28항에 있어서, 상기 유전체 편집 시스템은 CRISPR인, 방법.
하기의 단계를 포함하는, 변동하는 광 조건 하에서 성장 특성이 향상된 식물을 선별하는 방법으로,
여기서 성장 특성의 향상은 성장의 향상, 광합성 활성의 향상, 광 보호 효율의 향상, 양자 수율(quantum yield)의 향상, 및 CO₂ 고정(fixation)의 향상으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 방법:
(a) 식물 집단을 제공하는 단계;
(b) ZEP 및 VDE 둘 모두 또는 PsbS, ZEP 및 VDE 셋 모두의 활성을 증가시키도록 상기 식물들을 변형시키는 단계;
(b) 상기 식물 내 변동하는 광 조건 하에서 비-광화학적 소멸(NPQ)의 수준을 검출하는 단계;
(c) 변동하는 광 조건 하에 있는 NPQ의 대조군 수준과 상기 식물 내 변동하는 광 조건 하에서 상기 NPQ의 수준을 비교하는 단계;
(d) 상기 식물이 높은 빛의 세기에서 낮은 빛의 세기로 전이될 때 NPQ 이완 율이 증가된 식물을 선별하여, 변동하는 광 조건 하에서 성장 특성이 향상된 식물을 선별하는 단계.
제30항에 있어서, 상기 NPQ의 대조군 수준은 상기 집단 내 NPQ의 최저 수준, 상기 집단 내 NPQ의 중간 수준, 상기 집단 내 NPQ의 평균 수준, 및 대조군 식물체 내 NPQ의 수준으로 구성된 군으로부터 선택된, 방법.
제30항 또는 제31항에 있어서, 상기 식물은 돌연변이원(mutagen)으로 PsbS, ZEP 및 VDE의 하나 또는 그 이상 내 하나 이상의 돌연변이를 유도함으로써 변형되는, 방법.
제32항에 있어서, 상기 돌연변이원은 에탄 메틸 설포네이트(ethane methyl sulfonate, EMS)인, 방법.
제30항 또는 제31항에 있어서, 상기 식물은 형질전환 기술 또는 유전체 편집 시스템을 이용하여 PsbS을 암호화하는 감염된 뉴클리오티드 서열, ZEP을 암호화하는 감염된 뉴클리오티드 서열, 및 VDE를 암호화하는 감염된 뉴클리오티드 서열의 하나 또는 그 이상을 도입함으로써 변형되는, 방법.
제34항에 있어서, 상기 유전체 편집 시스템은 CRISPR인, 방법.
변동하는 광 조건 하에서 성장 특성의 향상과 연관된 다형성을 스크리닝하는 방법으로,
여기서 성장 특성의 향상은 성장의 향상, 광합성 효율의 향상, 광 보호 효율의 향상, 양자 수율(quantum yield)의 향상, 및 CO₂ 고정(fixation)의 향상으로 구성된 그룹으로부터 선택되고, 및
하기의 단계를 포함하는, 방법:
(a) 식물 집단을 제공하는 단계;
(b) 상기 식물 내 ZEP 및 VDE 둘 모두 또는 PsbS, ZEP 및 VDE 셋 모두를 조절 또는 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 얻는 단계;
(c) 상기 식물 내 PsbS, ZEP 및 VDE 중 임의의 것을 조절 또는 암호화하는 상기 뉴클레오티드 서열에서 하나 이상의 다형성을 얻는 단계;
(d) 상기 식물 내 높은 빛의 세기에서 낮은 빛의 세기로 전이될 때 비-광화학적 소멸(NPQ) 이완율을 검출하는 단계;
(e) 상기 식물 집단 내 NPQ 이완 율과의 연관성을 결정하기 위한 통계 분석을 수행하는 단계; 및
(f) NPQ 이완 율과 통계적으로 유의한 연관성을 갖는 다형성을 선별하여, 변동하는 광 조건 하에서 성장 특성의 향상과 연관된 다형성을 선별하는 단계,
여기서 성장 특성의 향상은 성장의 향상, 수율의 향상, 광합성 효율의 향상, 광 보호 효율의 향상, 양자 수율의 향상, 및 CO₂ 고정의 향상으로 구성된 그룹으로부터 선택된다.
제36항에 있어서, 상기 다형성은 단일 염기 다형성(single nucleotide polymorphism, SNP)인, 방법.
제36항 또는 제37항에 있어서, 상기 다형성은 PsbS, ZEP 또는 VDE의 프로모터 내 위치하는, 방법.
제36항 또는 제37항에 있어서, 상기 다형성은 서열 결정(sequence determination)또는 겔 전기영동(gel electrophoresis)에 의해 검출되는, 방법.
제36항 또는 제37항에 있어서, 상기 다형성은 성장 특성이 향상된 식물을 선별하기 위해 식물의 집단을 스크리닝하는 데 추가로 사용되는, 방법.
제36항 또는 제37항에 있어서, 상기 다형성은 변동하는 광 조건 하에서 식물 내 성장 특성을 향상시키기 위해 PsbS, ZEP 또는 VDE 내 유전체 편집을 위한 표적으로서 추가로 사용되는, 방법.
삭제
제30항 또는 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 식물 내 상기 NPQ는 엽록소(chlorophyll) 형광을 측정함으로써 검출되는, 방법.
제24항, 제30항, 또는 제36항 중 어느 한 항에 있어서,
a. PsbS는 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되고, ZEP는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되며, VDE는 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는;
b. PsbS는 서열번호 1을 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되고, ZEP는 서열번호 2를 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되며, VDE는 서열번호 3을 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는;
c. PsbS는 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖고, ZEP는 서열번호 5의 아미노산 서열을 가지며, VDE는 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는;
d. PsbS는 서열번호 4 또는 10-29을 갖는 아미노산 서열을 갖고, ZEP는 서열번호 5 또는 30-49를 갖는 아미노산 서열을 가지며, VDE는 서열번호 6 또는 50-68을 갖는 아미노산 서열을 갖는; 또는
e. PsbS는 서열번호 7의 보존된 도메인을 포함하고, ZEP는 서열번호 8의 보존된 도메인을 포함하며, VDE는 서열번호 9의 보존된 도메인을 포함하는, 방법.
제24항, 제30항 또는 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 식물은 작물 식물(crop plant), 모델 식물(model plant), 외떡잎 식물(monocotyledonous plant), 쌍떡잎 식물(dicotyledonous plant), 크레슐산(CAM) 대사 광합성 식물(plant with Crassulacean acid metabolism photosynthesis), C3 광합성 식물(plant with C3 photosynthesis), C4 광합성 식물(plant with C4 photosynthesis), 일년생 식물(annual plant), 온실 식물(greenhouse plant), 원예 꽃 식물(horticultural flowering plant), 다년생 식물(perennial plant), 스위치그라스 식물(switchgrass plant), 옥수수 식물(maize plant), 바이오매스 식물(biomass plant), 또는 사탕수수 식물(sugarcane plant)인, 방법.
제24항, 제30항 또는 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 식물은 스위치그라스, 억새속(Miscanthus), 개자리속(Medicago), 단수수(sweet sorghum), 곡용 수수(grain sorghum), 사탕수수(sugarcane; Saccharum spp.), 에너지 수수(energy cane), 코끼리 풀(elephant grass), 수수(sorghum, Sorghum bicolor), 옥수수(maize; Zea mays), 카사바(cassava; Manihot esculenta), 동부(cowpea; Vigna unguiculata), 밀(wheat), 보리(barley; Hordeum vulgare), 귀리(oats), 쌀(rice; Oryza sativa), 대두(soybean; Glycine max), 팜유(oil palm), 잇꽃(safflower), 참깨(sesame), 담배(tobacco; Nicotiana tabacum), 아마(flax), 목화(cotton), 해바라기(sunflower), 양구슬냉이속(Camelina), 유채(Brassica napus), 브라시카 카리나타(Brassica carinata), 갓(Brassica juncea), 펄 밀렛(pearl millet), 조(foxtail millet), 다른 곡물(other grain), 오일시드(oilseed), 알파파(alfalfa; Medicago sativa), 감자(potato; Solanum tuberosum), 포플러(poplar; Populus spp.), 유칼립투스(eucalyptus; Eucalyptus spp.), 채소 작물( vegetable crop), 사료 작물(forage crop), 공예 작물(industrial crop), 목본 작물(woody crop) 및 바이오매스 작물(biomass crop)로 구성된 군으로부터 선택된, 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 VDE의 전사 수준이 대조군 식물과 비교하여 3배 증가되고, 상기 PsbS의 전사 수준이 대조군 식물과 비교하여 3배 증가되며, 상기 ZEP의 전사 수준이 대조군 식물과 비교하여 8배 증가되거나,
상기 VDE의 전사 수준이 대조군 식물과 비교하여 10배 증가되고, 상기 PsbS의 전사 수준이 대조군 식물과 비교하여 3배 증가되며, 상기 ZEP의 전사 수준이 대조군 식물과 비교하여 6배 증가되거나,
상기 VDE의 전사 수준이 대조군 식물과 비교하여 4배 증가되고, 상기 PsbS의 전사 수준이 대조군 식물과 비교하여 1.2배 증가되며, 상기 ZEP의 전사 수준이 대조군 식물과 비교하여 7배 증가되거나,
상기 VDE의 전사 수준이 대조군 식물과 비교하여 16배 증가되고, 상기 PsbS의 전사 수준이 대조군 식물과 비교하여 2배 증가되며, 상기 ZEP의 전사 수준이 대조군 식물과 비교하여 80배 증가되거나,
상기 VDE의 전사 수준이 대조군 식물과 비교하여 30배 증가되고, 상기 PsbS의 전사 수준이 대조군 식물과 비교하여 4배 증가되며, 상기 ZEP의 전사 수준이 대조군 식물과 비교하여 74배 증가되거나,
상기 VDE의 전사 수준이 대조군 식물과 비교하여 47배 증가되고, 상기 PsbS의 전사 수준이 대조군 식물과 비교하여 3배 증가되며, 상기 ZEP의 전사 수준이 대조군 식물과 비교하여 75배 증가되거나,
VDE, PsbS 및 ZEP 간의 전사 수준의 증가는 대조군 식물과 비교하여 3:3:8, 10:3:6 및 4:1:2.7로 구성된 군으로부터 선택된 비율을 나타내거나,
VDE, PsbS 및 ZEP 간의 단백질 수준의 증가는 대조군 식물과 비교하여 16:2:80, 30:4:74 및 47:3:75로 구성된 군으로부터 선택된 비율을 나타내거나,
VDE의 전사 수준의 증가는 대조군 식물과 비교하여 3배 내지 10배이고, PsbS의 전사 수준의 증가는 대조군 식물과 비교하여 1.2배 내지 3배이며, ZEP의 전사 수준의 증가는 대조군 식물과 비교하여 6배 내지 8배이거나;
VDE의 단백질 수준의 증가는 대조군 식물과 비교하여 16배 내지 47배이고, PsbS의 단백질 수준의 증가는 대조군 식물과 비교하여 2배 내지 4배이며, ZEP의 단백질 수준의 증가는 대조군 식물과 비교하여 74배 내지 80배인, 유전적으로 변화한 식물.
제24항에 있어서,
상기 발현을 증가시키는 것은 대조군 식물과 비교하여 식물 내 VDE의 전사 수준을 3배 증가시키는 단계를 포함하고, 상기 발현을 증가시키는 것은 대조군 식물과 비교하여 식물 내 PsbS의 전사 수준을 3배 증가시키는 단계를 포함하며, 상기 발현을 증가시키는 것은 대조군 식물과 비교하여 식물 내 ZEP의 전사 수준을 증가시키는 단계를 포함하거나;
상기 발현을 증가시키는 것은 대조군 식물과 비교하여 식물 내 VDE의 전사 수준을 10배 증가시키는 단계를 포함하고, 상기 발현을 증가시키는 것은 대조군 식물과 비교하여 식물 내 PsbS의 전사 수준을 3배 증가시키는 단계를 포함하며, 상기 발현을 증가시키는 것은 대조군 식물과 비교하여 식물 내 ZEP의 전사 수준을 6배 증가시키는 단계를 포함하거나;
상기 발현을 증가시키는 것은 대조군 식물과 비교하여 식물 내 VDE의 전사 수준을 4배 증가시키는 단계를 포함하고, 상기 발현을 증가시키는 것은 대조군 식물과 비교하여 식물 내 PsbS의 전사 수준을 1.2배 증가시키는 단계를 포함하며, 상기 발현을 증가시키는 것은 대조군 식물과 비교하여 식물 내 ZEP의 전사 수준을 7배 증가시키는 단계를 포함하거나;
상기 발현을 증가시키는 것은 대조군 식물과 비교하여 식물 내 VDE의 단백질 수준을 16배 증가시키는 단계를 포함하고, 상기 발현을 증가시키는 것은 대조군 식물과 비교하여 식물 내 PsbS의 단백질 수준을 2배 증가시키는 단계를 포함하며, 상기 발현을 증가시키는 것은 대조군 식물과 비교하여 식물 내 ZEP의 단백질 수준을 80배 증가시키는 단계를 포함하거나,
상기 발현을 증가시키는 것은 대조군 식물과 비교하여 식물 내 VDE의 단백질 수준을 30배 증가시키는 단계를 포함하고, 상기 발현을 증가시키는 것은 대조군 식물과 비교하여 식물 내 PsbS의 단백질 수준을 4배 증가시키는 단계를 포함하며, 상기 발현을 증가시키는 것은 대조군 식물과 비교하여 식물 내 ZEP의 단백질 수준을 74배 증가시키는 단계를 포함하거나;
상기 발현을 증가시키는 것은 대조군 식물과 비교하여 식물 내 VDE의 단백질 수준을 47배 증가시키는 단계를 포함하고, 상기 발현을 증가시키는 것은 대조군 식물과 비교하여 식물 내 PsbS의 단백질 수준을 3배 증가시키는 단계를 포함하며, 상기 발현을 증가시키는 것은 대조군 식물과 비교하여 식물 내 ZEP의 단백질 수준을 75배 증가시키는 단계를 포함하거나;
상기 발현을 증가시키는 것은 대조군 식물과 비교하여 3:3:9, 10:3:6 및 4:1:2.7로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 비율로 VDE, PsbS 및 ZEP의 식물 내 전사 수준을 증가시키는 단계를 포함하거나;
상기 발현을 증가시키는 것은 대조군 식물과 비교하여 16:2:80, 30:4:74 및 47:3:75로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 비율로 VDE, PsbS 및 ZEP의 식물 내 단백질 수준을 증가시키는 단계를 포함하거나;
상기 발현을 증가시키는 것은 대조군 식물과 비교하여 식물 내 VDE의 전사 수준을 3배 내지 10배 증가시키는 단계를 포함하고, 상기 발현을 증가시키는 것은 대조군 식물과 비교하여 식물 내 PsbS의 전사 수준을 1.2배 내지 3배 증가시키는 단계를 포함하며, 상기 발현을 증가시키는 것은 대조군 식물과 비교하여 식물 내 ZEP의 전사 수준을 6배 내지 8배 증가시키는 단계를 포함하거나; 또는
상기 발현을 증가시키는 것은 대조군 식물과 비교하여 식물 내 VDE의 단백질 수준을 16배 내지 47배 증가시키는 단계를 포함하고, 상기 발현을 증가시키는 것은 대조군 식물과 비교하여 식물 내 PsbS의 단백질 수준을 2배 내지 4배 증가시키는 단계를 포함하며, 상기 발현을 증가시키는 것은 대조군 식물과 비교하여 식물 내 ZEP의 단백질 수준을 74배 내지 80배 증가시키는 단계를 포함하는, 방법.
제30항 또는 제36항에 있어서,
상기 성장 특성의 향상은 발현의 증가 때문이고,
상기 발현을 증가시키는 것은 대조군 식물과 비교하여 식물 내 VDE의 전사 수준을 3배 증가시키는 단계를 포함하고, 상기 발현을 증가시키는 것은 대조군 식물과 비교하여 식물 내 PsbS의 전사 수준을 3배 증가시키는 단계를 포함하며, 상기 발현을 증가시키는 것은 대조군 식물과 비교하여 식물 내 ZEP의 전사 수준을 증가시키는 단계를 포함하거나;
상기 발현을 증가시키는 것은 대조군 식물과 비교하여 식물 내 VDE의 전사 수준을 10배 증가시키는 단계를 포함하고, 상기 발현을 증가시키는 것은 대조군 식물과 비교하여 식물 내 PsbS의 전사 수준을 3배 증가시키는 단계를 포함하며, 상기 발현을 증가시키는 것은 대조군 식물과 비교하여 식물 내 ZEP의 전사 수준을 6배 증가시키는 단계를 포함하거나;
상기 발현을 증가시키는 것은 대조군 식물과 비교하여 식물 내 VDE의 전사 수준을 4배 증가시키는 단계를 포함하고, 상기 발현을 증가시키는 것은 대조군 식물과 비교하여 식물 내 PsbS의 전사 수준을 1.2배 증가시키는 단계를 포함하며, 상기 발현을 증가시키는 것은 대조군 식물과 비교하여 식물 내 ZEP의 전사 수준을 7배 증가시키는 단계를 포함하거나;
상기 발현을 증가시키는 것은 대조군 식물과 비교하여 식물 내 VDE의 단백질 수준을 16배 증가시키는 단계를 포함하고, 상기 발현을 증가시키는 것은 대조군 식물과 비교하여 식물 내 PsbS의 단백질 수준을 2배 증가시키는 단계를 포함하며, 상기 발현을 증가시키는 것은 대조군 식물과 비교하여 식물 내 ZEP의 단백질 수준을 80배 증가시키는 단계를 포함하거나,
상기 발현을 증가시키는 것은 대조군 식물과 비교하여 식물 내 VDE의 단백질 수준을 30배 증가시키는 단계를 포함하고, 상기 발현을 증가시키는 것은 대조군 식물과 비교하여 식물 내 PsbS의 단백질 수준을 4배 증가시키는 단계를 포함하며, 상기 발현을 증가시키는 것은 대조군 식물과 비교하여 식물 내 ZEP의 단백질 수준을 74배 증가시키는 단계를 포함하거나;
상기 발현을 증가시키는 것은 대조군 식물과 비교하여 식물 내 VDE의 단백질 수준을 47배 증가시키는 단계를 포함하고, 상기 발현을 증가시키는 것은 대조군 식물과 비교하여 식물 내 PsbS의 단백질 수준을 3배 증가시키는 단계를 포함하며, 상기 발현을 증가시키는 것은 대조군 식물과 비교하여 식물 내 ZEP의 단백질 수준을 75배 증가시키는 단계를 포함하거나;
상기 발현을 증가시키는 것은 대조군 식물과 비교하여 3:3:9, 10:3:6 및 4:1:2.7로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 비율로 VDE, PsbS 및 ZEP의 식물 내 전사 수준을 증가시키는 단계를 포함하거나;
상기 발현을 증가시키는 것은 대조군 식물과 비교하여 16:2:80, 30:4:74 및 47:3:75로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 비율로 VDE, PsbS 및 ZEP의 식물 내 단백질 수준을 증가시키는 단계를 포함하거나;
상기 발현을 증가시키는 것은 대조군 식물과 비교하여 식물 내 VDE의 전사 수준을 3배 내지 10배 증가시키는 단계를 포함하고, 상기 발현을 증가시키는 것은 대조군 식물과 비교하여 식물 내 PsbS의 전사 수준을 1.2배 내지 3배 증가시키는 단계를 포함하며, 상기 발현을 증가시키는 것은 대조군 식물과 비교하여 식물 내 ZEP의 전사 수준을 6배 내지 8배 증가시키는 단계를 포함하거나; 또는
상기 발현을 증가시키는 것은 대조군 식물과 비교하여 식물 내 VDE의 단백질 수준을 16배 내지 47배 증가시키는 단계를 포함하고, 상기 발현을 증가시키는 것은 대조군 식물과 비교하여 식물 내 PsbS의 단백질 수준을 2배 내지 4배 증가시키는 단계를 포함하며, 상기 발현을 증가시키는 것은 대조군 식물과 비교하여 식물 내 ZEP의 단백질 수준을 74배 내지 80배 증가시키는 단계를 포함하는, 방법.
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