CN113584073A - 一种埃塞俄比亚芥高效遗传转化系统建立的方法 - Google Patents
一种埃塞俄比亚芥高效遗传转化系统建立的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN113584073A CN113584073A CN202111072359.6A CN202111072359A CN113584073A CN 113584073 A CN113584073 A CN 113584073A CN 202111072359 A CN202111072359 A CN 202111072359A CN 113584073 A CN113584073 A CN 113584073A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- culture
- genetic transformation
- establishing
- transformation system
- efficiency genetic
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 230000009466 transformation Effects 0.000 title claims abstract description 47
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 title claims abstract description 42
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 28
- 241000219195 Arabidopsis thaliana Species 0.000 title claims description 15
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims abstract description 45
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 claims abstract description 29
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 claims abstract description 18
- 244000257790 Brassica carinata Species 0.000 claims abstract description 17
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 claims abstract description 17
- 235000005156 Brassica carinata Nutrition 0.000 claims abstract description 16
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims abstract description 13
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims abstract description 13
- 230000006698 induction Effects 0.000 claims abstract description 12
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 claims abstract description 8
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 claims description 26
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims description 26
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims description 26
- 229960004793 sucrose Drugs 0.000 claims description 26
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 24
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims description 24
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 18
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 claims description 16
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 claims description 16
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 claims description 16
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 claims description 16
- 229940027257 timentin Drugs 0.000 claims description 16
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 claims description 15
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 claims description 15
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 claims description 15
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 claims description 15
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 claims description 14
- OJOBTAOGJIWAGB-UHFFFAOYSA-N acetosyringone Chemical compound COC1=CC(C(C)=O)=CC(OC)=C1O OJOBTAOGJIWAGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- SXGZJKUKBWWHRA-UHFFFAOYSA-N 2-(N-morpholiniumyl)ethanesulfonate Chemical compound [O-]S(=O)(=O)CC[NH+]1CCOCC1 SXGZJKUKBWWHRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 7
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 claims description 7
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 7
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 claims description 3
- 239000012882 rooting medium Substances 0.000 claims description 2
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 abstract description 8
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 abstract description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 15
- 239000005708 Sodium hypochlorite Substances 0.000 description 7
- SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N sodium hypochlorite Chemical compound [Na+].Cl[O-] SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 6
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 6
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 6
- 235000014755 Eruca sativa Nutrition 0.000 description 5
- 244000024675 Eruca sativa Species 0.000 description 5
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 4
- 239000012880 LB liquid culture medium Substances 0.000 description 4
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 4
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- 241000219194 Arabidopsis Species 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 244000060924 Brassica campestris Species 0.000 description 3
- 244000178993 Brassica juncea Species 0.000 description 3
- 240000002791 Brassica napus Species 0.000 description 3
- 240000007124 Brassica oleracea Species 0.000 description 3
- 235000003899 Brassica oleracea var acephala Nutrition 0.000 description 3
- 235000011301 Brassica oleracea var capitata Nutrition 0.000 description 3
- 235000001169 Brassica oleracea var oleracea Nutrition 0.000 description 3
- 241000721671 Ludwigia Species 0.000 description 3
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 3
- 238000007598 dipping method Methods 0.000 description 3
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 3
- LWJROJCJINYWOX-UHFFFAOYSA-L mercury dichloride Chemical compound Cl[Hg]Cl LWJROJCJINYWOX-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 241000219198 Brassica Species 0.000 description 2
- 235000011293 Brassica napus Nutrition 0.000 description 2
- DPUOLQHDNGRHBS-UHFFFAOYSA-N Brassidinsaeure Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCCCCCC(O)=O DPUOLQHDNGRHBS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- URXZXNYJPAJJOQ-UHFFFAOYSA-N Erucic acid Natural products CCCCCCC=CCCCCCCCCCCCC(O)=O URXZXNYJPAJJOQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000005034 decoration Methods 0.000 description 2
- DPUOLQHDNGRHBS-KTKRTIGZSA-N erucic acid Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCCCCCC(O)=O DPUOLQHDNGRHBS-KTKRTIGZSA-N 0.000 description 2
- 230000035784 germination Effects 0.000 description 2
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 2
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 239000012883 rooting culture medium Substances 0.000 description 2
- 230000007226 seed germination Effects 0.000 description 2
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 2
- WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N (E)-8-Octadecenoic acid Natural products CCCCCCCCCC=CCCCCCCC(O)=O WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HNXGGWNCFXZSAI-UHFFFAOYSA-N 2-morpholin-2-ylethanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CCC1CNCCO1 HNXGGWNCFXZSAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 20:1omega9c fatty acid Natural products CCCCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 9-Heptadecensaeure Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 1
- 241000902876 Alticini Species 0.000 description 1
- 241001124076 Aphididae Species 0.000 description 1
- 235000011331 Brassica Nutrition 0.000 description 1
- 235000003351 Brassica cretica Nutrition 0.000 description 1
- 235000011332 Brassica juncea Nutrition 0.000 description 1
- 235000014700 Brassica juncea var napiformis Nutrition 0.000 description 1
- 235000005855 Brassica juncea var. subintegrifolia Nutrition 0.000 description 1
- 235000011292 Brassica rapa Nutrition 0.000 description 1
- 244000221633 Brassica rapa subsp chinensis Species 0.000 description 1
- 235000010149 Brassica rapa subsp chinensis Nutrition 0.000 description 1
- 235000000536 Brassica rapa subsp pekinensis Nutrition 0.000 description 1
- 235000003343 Brassica rupestris Nutrition 0.000 description 1
- 235000004977 Brassica sinapistrum Nutrition 0.000 description 1
- 241001390275 Carinata Species 0.000 description 1
- 239000005642 Oleic acid Substances 0.000 description 1
- ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N Oleic acid Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000233679 Peronosporaceae Species 0.000 description 1
- 241000233647 Phytophthora nicotianae var. parasitica Species 0.000 description 1
- 241001052560 Thallis Species 0.000 description 1
- 238000012271 agricultural production Methods 0.000 description 1
- 230000009418 agronomic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- QKSKPIVNLNLAAV-UHFFFAOYSA-N bis(2-chloroethyl) sulfide Chemical compound ClCCSCCCl QKSKPIVNLNLAAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000249 desinfective effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 125000004383 glucosinolate group Chemical group 0.000 description 1
- 210000003701 histiocyte Anatomy 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-UHFFFAOYSA-N hydron Chemical compound [H+] GPRLSGONYQIRFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N isooleic acid Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCCC(O)=O QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000010460 mustard Nutrition 0.000 description 1
- ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N oleic acid Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 229930195732 phytohormone Natural products 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005728 strengthening Methods 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 230000008467 tissue growth Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
- C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
- C12N15/8205—Agrobacterium mediated transformation
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
- A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
- A01H4/005—Methods for micropropagation; Vegetative plant propagation using cell or tissue culture techniques
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
- A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
- A01H4/008—Methods for regeneration to complete plants
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Botany (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
Abstract
本发明提供了埃塞俄比亚芥高效遗传转化系统建立的方法，涉及植物高效遗传转化技术领域。本发明包括以下步骤：以埃塞俄比亚芥子叶作为外植体，放入预培养基进行预培养，取出进行农杆菌侵染，再次利用预培养基进行共培养，完成后进行愈伤组织诱导、增殖及生根培养，获得再生植株。本发明以子叶为外植体，相较于下胚轴具有更高的转化效率；通过预培养及共培养，进一步提高遗传转化效率及植株的再生。
Description
技术领域
本发明属于植物高效遗传转化技术领域，尤其涉及一种埃塞俄比亚芥高效遗传转化系统建立的方法。
背景技术
栽培油菜主要包括甘蓝型油菜(Brassica napus)、白菜型油菜(B.rapa或B.campestris)、芥菜型油菜(B.juncea)和埃塞俄比亚芥(B.carinata)。其中，埃塞俄比亚芥由于起源于非洲，虽具有一些不良性状，如产量低、生育期长，低油酸、高芥酸、高硫苷，菜籽品质较差，但埃塞俄比亚芥不需要低温春化，耐热、耐干旱，其分枝旺盛，根系深，抗倒伏，还具有很多优良的农艺性状，如抗黑胫病、霜霉病等多种病害，抗蚜虫、跳甲等多种害虫，且种质资源十分丰富。因此，随着埃塞俄比亚芥的利用，围绕其有利性状改良的品种越来越多。
转基因技术作为现代生物技术中改良农作物品质的有效手段之一，其在农业生产中具有广泛的应用前景。有关十字花科作物开展转基因的研究报道较多，大多数研究者主要采用农杆菌导入法，采用此法成功的关键是如何建立一个稳定高效的遗传转化体系。目前，已经在白菜高频再生体系、甘蓝和甘蓝型油菜、芥菜等作物的高效稳定遗传转化体系建立等方面进行了探讨，而对埃塞俄比亚芥高效遗传转化体系的建立研究较为少见。影响植物农杆菌高效遗传转化的因素较多，如外植体的选择、农杆菌浸染过程、再生体系培养基的组成等。如对于外植体，一般认为子叶与下胚轴具有较高的细胞全能性，或者说其全能性能够得到较好的发挥，在遗传转化中，下胚轴外植体能形成高频率的遗传转化再生体系，而子叶外植体则具有较低的遗传转化频率。
目前十字花科芸苔属作物的遗传转化体系主要为甘蓝型油菜遗传转化体系，且以下胚轴为外植体较多，缺少更适合埃塞俄比亚芥的遗传转化体系。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种埃塞俄比亚芥高效遗传转化系统建立的方法，以子叶为外植体，并配合更加适合埃塞俄比亚芥的遗传转化体系，可显著提高其遗传转化效率。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
一种埃塞俄比亚芥高效遗传转化系统建立的方法，包括以下步骤：以埃塞俄比亚芥子叶作为外植体，放入预培养基进行预培养，取出进行农杆菌侵染，再次利用预培养基进行共培养，完成后进行愈伤组织诱导、增殖及生根培养，获得再生植株。
优选的是，所述子叶外植体的获取方法包括：取埃塞俄比亚芥无菌苗，在叶柄与下胚轴结合尖端切下叶柄，不包括茎尖分生组织。
优选的是，所述农杆菌菌液OD600＝1.8-2.0。
优选的是，所述预培养基包括：MS 4.4-4.5g/L+乙酰丁香酮0.08-0.1g/L+蔗糖28-30g/L+琼脂糖5.5-6.0g/L+甘露醇18-20g/L+NAA 0.0005-0.001g/L+GA30.001-0.003g/L。
优选的是，所述预培养为常温培养18-30h。
优选的是，所述农杆菌侵染包括：将所述外植体叶柄切断处浸入农杆菌菌液浸染8-12s。
优选的是，所述共培养为在22-28℃下暗培养36-60h。
优选的是，所述愈伤组织诱导培养基包括：MS 4.4-4.5mg/L+甘露醇18-20mg/L+蔗糖28-30mg/L+NAA 0.0005-0.001mg/L+GA30.001-0.003mg/L+特美汀0.25-0.3mg/L+卡那霉素0.005-0.01mg/L+琼脂糖5.5-6.0mg/L。
优选的是，所述继代增殖培养基包括：MS 4.4-4.5mg/L+葡萄糖9-10mg/L+木糖0.2-0.3mg/L+2-吗啉乙磺酸0.5-0.6mg/L+NAA 0.0005-0.001mg/L+GA30.001-0.003mg/L+特美汀0.1-0.3mg/L+卡那霉素0.005-0.01mg/L+琼脂糖5.5-6.0mg/L。
优选的是，所述生根培养基包括：MS 2.2-3.0mg/L+蔗糖10-12mg/L。
相对于现有技术，本发明具有如下有益效果：
本发明提供了一种埃塞俄比亚芥高效遗传转化系统建立的方法。对埃塞俄比亚芥而言，以下胚轴为外植体的遗传转化成苗率低，下胚轴易褐化；而以子叶为外植体，可显著提高转化效率。相对于传统的遗传转化方法切下的外植体浸泡悬浮液，再转化农杆菌，本发明将外植体切口端插入预培养基预培18-30h，一方面可以缓解传统方法中边切外植体边转农杆菌，工作量大时间紧的问题；另一方面预培养基预培1天后可以起到“壮苗”的作用，提高了遗传转化效率。在外植体感菌之后，本发明再次利用预培养基进行共培养，能够提高植物愈伤组织胚状体的发生和植株的再生。
具体实施方式
本发明提供了一种埃塞俄比亚芥高效遗传转化系统建立的方法，包括以下步骤：以埃塞俄比亚芥子叶作为外植体，放入预培养基进行预培养，取出进行农杆菌侵染，再次利用预培养基进行共培养，完成后进行愈伤组织诱导、增殖及生根培养，获得再生植株。
本发明埃塞俄比亚芥子叶优选来自于埃塞俄比亚无菌幼苗。所述埃塞俄比亚无菌幼苗经过种子消毒及萌发培养获得。
本发明埃塞俄比亚种子消毒优选体积浓度75％酒精消毒20min+质量浓度2％次氯酸钠溶液消毒10min。传统遗传转化方法种子消毒通常采用2％次氯酸钠+0.1％升汞，本发明取消了升汞消毒的步骤，在酒精消毒后仅采用次氯酸钠溶液消毒10min，避免了升汞的毒性，消毒效果较好。作为一种可实施方式，本发明挑选籽粒饱满的埃芥种子放入培养皿，向培养皿中加入15-20ml 75％酒精，旋转20分钟，倒出溶液；再向培养皿中加入15-20ml的2％次氯酸钠溶液，旋转10分钟，倒出溶液；用20-30ml无菌ddH2O冲洗种子4-6次。
本发明埃芥种子萌发培养优选将种子放入萌发培养基，暗培养1天后移至光照培养箱，25℃，16h/8h的光/暗培养5天。进一步优选种子萌发培养基包括：MS 4.4-4.5g/L+蔗糖28-30g/L+琼脂糖5.5-6.0g/L；更优选MS 4.4g/L+蔗糖30g/L+琼脂糖6.0g/L。
本发明所述子叶外植体的获取方法包括：取埃塞俄比亚芥无菌苗，在叶柄与下胚轴结合尖端切下叶柄，不包括茎尖分生组织及其任何部分。
将子叶外植体直接浸入农杆菌菌液进行感染，会导致外植体在分化培养基上褐化死亡。本发明收集子叶后放入预培养基进行预培养，优选常温预培养18-30h，更优选预培养24h。本发明优选预培养基包括：MS 4.4-4.5g/L+乙酰丁香酮0.08-0.1g/L+蔗糖28-30g/L+琼脂糖5.5-6.0g/L+甘露醇18-20g/L+NAA 0.0005-0.001g/L+GA30.001-0.003g/L；进一步优选MS 4.4g/L+乙酰丁香酮0.1g/L+蔗糖30g/L+琼脂糖6.0g/L+甘露醇18g/L+NAA 0.001g/L+GA30.001g/L。
农杆菌菌液浓度过低，侵染时间过短，进行转化的外植体因为不能附着足够的菌体，从而导致转化率较低；农杆菌菌液浓度过高，侵染时间过长，农杆菌侵染过度，不利于外植体成活及后续的组织培养过程。本发明优选农杆菌菌液OD600＝1.8-2.0，进一步优选OD600＝2.0。作为一种可实施方式，本发明将重组载体农杆菌菌液加入到50mL LB液体培养基(含抗生素Kan 100ng/μL、Rif 100ng/μL、Gen100ng/μL)，置于28℃，200rpm振荡培养至OD600＝1.5-2.0，5000rpm离心15min，倒掉上清培养基，用DM缓冲液重悬，调节OD600＝2.0；所述DM缓冲液为MS 2.2g/L+琼脂2.5g/L。
本发明优选侵染方式为将所述外植体叶柄切断处浸入农杆菌菌液浸染8-12s进行接种，进一步优选侵染时间为10s。
浸染完成后，将外植体再次放入预培养基，进行共培养。利用本发明利用预培养基进行共培养，甘露醇可提高培养基的渗透压，使组织细胞不会因为吸水过多而涨破；NAA+GA3对愈伤组织诱导培养，可提高植物愈伤组织胚状体的发生和植株的再生。作为一种可实施方式，共培养前，将接种后的外植体放在无菌滤纸盘上吸取多余的菌液。
共培养的时间长短则直接影响到目的基因的整合及转化细胞的数量，从而影响遗传转化率。本发明优选共培养为在22-28℃下暗培养36-60h；进一步优选温度为25℃，共培养时间为48h。
共培养完成后，将外植体依次置于愈伤组织诱导培养基、增殖培养基和生根培养基培养，以获得埃芥再生植株。本发明优选愈伤组织诱导、增殖、生根环境温度为22-28℃，16h/8h的光/暗培养，其中愈伤组织诱导2-3周，增殖培养3-4周，生根培养至植株长出根系。
本发明优选愈伤组织诱导培养基包括：MS 4.4-4.5mg/L+甘露醇18-20mg/L+蔗糖28-30mg/L+NAA 0.0005-0.001mg/L+GA30.001-0.003mg/L+特美汀0.25-0.3mg/L+卡那霉素0.005-0.01mg/L+琼脂糖5.5-6.0mg/L；进一步优选MS 4.4mg/L+甘露醇18mg/L+蔗糖30mg/L+NAA 0.001mg/L+GA30.001mg/L+特美汀0.3mg/L+卡那霉素0.01mg/L+琼脂糖6.0mg/L。本发明在预培养基的基础上添加特美汀和卡那霉素，特美汀对农杆菌的生长繁殖起到抑制作用，卡那霉素起到筛选作用，避免假阳性苗的产生。
本发明优选增殖培养基包括：MS 4.4-4.5mg/L+葡萄糖9-10mg/L+木糖0.2-0.3mg/L+2-吗啉乙磺酸0.5-0.6mg/L+NAA 0.0005-0.001mg/L+GA30.001-0.003mg/L+特美汀0.1-0.3mg/L+卡那霉素0.005-0.01mg/L+琼脂糖5.5-6.0mg/L；进一步优选MS 4.4mg/L+葡萄糖10mg/L+木糖0.25mg/L+2-吗啉乙磺酸0.6mg/L+NAA 0.001mg/L+GA30.001mg/L+特美汀0.3mg/L+卡那霉素0.01mg/L+琼脂糖6.0mg/L。本发明通过在增殖培养基中添加2-吗啉乙磺酸，调节氢离子浓度，促进愈伤组织生长、增殖。
本发明优选生根培养基包括：MS 2.2-3.0mg/L+蔗糖10-12mg/L；进一步优选MS2.2mg/L+蔗糖10mg/L，以促进生根。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
一种埃塞俄比亚芥高效遗传转化体系：
(1)准备无菌种子：挑选籽粒饱满的埃芥种子300粒放入培养皿，向培养皿中加入18ml的75％酒精，旋转20分钟，倒出溶液；再向培养皿中加入18ml的2％次氯酸钠溶液，旋转10分钟，倒出溶液；用25ml无菌ddH2O冲洗种子5次。
(2)使用无菌镊子将灭菌后的种子转移至M0培养基中，每个播种盒放约50粒种子，暗光培养1天后移至光照培养箱，25℃，16h/8h的光/暗培养5天。M0培养基为：MS 4.4g/L+蔗糖30g/L+琼脂糖6.0g/L。
(3)在叶柄与下胚轴结合的尖端用锋利的手术刀切下叶柄，但不包括茎尖分生组织及其任何部分，收集子叶放入M1培养基预培养24h。M1培养基为：MS 4.4g/L+乙酰丁香酮0.1g/L+蔗糖30g/L+琼脂糖6.0g/L+甘露醇18g/L+NAA0.001g/L+GA30.001g/L。
(4)农杆菌菌液准备：重组载体农杆菌菌液加入到50mL LB液体培养基(含抗生素Kan 100ng/μL、Rif 100ng/μL、Gen100ng/μL)，置于28℃，200rpm振荡培养至OD600＝1.5-2.0，5000rpm离心15min，倒掉上清培养基，用DM缓冲液重悬，调节OD600＝2.0。DM缓冲液为：MS 2.2g/L+琼脂2.5g/L。
(5)通过将叶柄的切端浸入农杆菌悬液10秒钟，接种外植体。将接种后的外植体放在无菌滤纸盘上吸取多余的菌液，之后将外植体摆放到M1培养基，在暗光中于25℃培养48h。
(6)将M1中的外植体移入M2培养基，25℃，16h/8h的光/暗培养2-3周。M2培养基为：MS 4.4mg/L+甘露醇18mg/L+蔗糖30mg/L+NAA0.001mg/L+GA30.001mg/L+特美汀0.3mg/L+卡那霉素0.01mg/L+琼脂糖6.0mg/L。
(7)将M2中的外植体移入M3培养基，25℃，16h/8h的光/暗培养3-4周。M3培养基为：MS 4.4mg/L+葡萄糖10mg/L+木糖0.25mg/L+2-吗啉乙磺酸0.6mg/L+NAA 0.001mg/L+GA30.001mg/L+特美汀0.3mg/L+卡那霉素0.01mg/L+琼脂糖6.0mg/L
(8)用无菌手术刀切去愈伤组织的褐化部分，保留再生苗并移入M4培养基，放入光照培养箱，25℃，16h/8h的光/暗培养至长出根。M4培养基为：MS 2.2mg/L+蔗糖10mg/L。
实施例2
一种埃塞俄比亚芥高效遗传转化体系：
(1)准备无菌种子：挑选籽粒饱满的埃芥种子300粒放入培养皿，向培养皿中加入15ml的75％酒精，旋转20分钟，倒出溶液；再向培养皿中加入15ml的2％次氯酸钠溶液，旋转10分钟，倒出溶液；用20ml无菌ddH2O冲洗种子4次。
(2)使用无菌镊子将灭菌后的种子转移至M0培养基中，每个播种盒放约50粒种子，暗光培养1天后移至光照培养箱，25℃，16h/8h的光/暗培养5天。M0培养基为：MS 4.4g/L+蔗糖29g/L+琼脂糖5.8g/L。
(3)在叶柄与下胚轴结合的尖端用锋利的手术刀切下叶柄，但不包括茎尖分生组织及其任何部分，收集子叶放入M1培养基预培养18h。M1培养基为：MS 4.4g/L+乙酰丁香酮0.09g/L+蔗糖29g/L+琼脂糖5.8g/L+甘露醇19g/L+NAA0.0008g/L+GA30.003g/L。
(4)农杆菌菌液准备：重组载体农杆菌菌液加入到50mL LB液体培养基(含抗生素Kan 100ng/μL、Rif 100ng/μL、Gen100ng/μL)，置于28℃,200rpm振荡培养至OD600＝1.5-2.0，5000rpm离心15min，倒掉上清培养基，用DM缓冲液重悬，调节OD600＝1.9。DM缓冲液为：MS 2.2g/L+琼脂2.5g/L。
(5)通过将叶柄的切端浸入农杆菌悬液8秒钟，接种外植体。将接种后的外植体放在无菌滤纸盘上吸取多余的菌液，之后将外植体摆放到M1培养基，在暗光中于25℃培养36h。
(6)将M1中的外植体移入M2培养基，25℃，16h/8h的光/暗培养2-3周。M2培养基为：MS 4.4mg/L+甘露醇19mg/L+蔗糖29mg/L+NAA 0.0008mg/L+GA30.003mg/L+特美汀0.28mg/L+卡那霉素0.008mg/L+琼脂糖5.8mg/L。
(7)将M2中的外植体移入M3培养基，25℃，16h/8h的光/暗培养3-4周。M3培养基为：MS 4.4mg/L+葡萄糖10mg/L+木糖0.2mg/L+2-吗啉乙磺酸0.6mg/L+NAA 0.0008mg/L+GA30.003mg/L+特美汀0.28mg/L+卡那霉素0.008mg/L+琼脂糖5.8mg/L。
(8)用无菌手术刀切去愈伤组织的褐化部分，保留再生苗并移入M4培养基，放入光照培养箱，25℃，16h/8h的光/暗培养至长出根。M4培养基为：MS 2.6mg/L+蔗糖11mg/L。
实施例3
一种埃塞俄比亚芥高效遗传转化体系：
(1)准备无菌种子：挑选籽粒饱满的埃芥种子300粒放入培养皿，向培养皿中加入20ml的75％酒精，旋转20分钟，倒出溶液；再向培养皿中加入20ml的2％次氯酸钠溶液，旋转10分钟，倒出溶液；用30ml无菌ddH2O冲洗种子6次。
(2)使用无菌镊子将灭菌后的种子转移至M0培养基中，每个播种盒放约50粒种子，暗光培养1天后移至光照培养箱，25℃，16h/8h的光/暗培养5天。M0培养基为：MS 4.5g/L+蔗糖28g/L+琼脂糖5.5g/L。
(3)在叶柄与下胚轴结合的尖端用锋利的手术刀切下叶柄，但不包括茎尖分生组织及其任何部分，收集子叶放入M1培养基预培养30h。M1培养基为：MS 4.5g/L+乙酰丁香酮0.08g/L+蔗糖28g/L+琼脂糖5.5g/L+甘露醇20g/L+NAA0.0005g/L+GA30.0015g/L。
(4)农杆菌菌液准备：重组载体农杆菌菌液加入到50mL LB液体培养基(含抗生素Kan 100ng/μL、Rif 100ng/μL、Gen100ng/μL)，置于28℃,200rpm振荡培养至OD600＝1.5-2.0，5000rpm离心15min，倒掉上清培养基，用DM缓冲液重悬，调节OD600＝1.8。DM缓冲液为：MS 2.2g/L+琼脂2.5g/L。
(5)通过将叶柄的切端浸入农杆菌悬液12秒钟，接种外植体。将接种后的外植体放在无菌滤纸盘上吸取多余的菌液，之后将外植体摆放到M1培养基，在暗光中于25℃培养60h。
(6)将M1中的外植体移入M2培养基，25℃，16h/8h的光/暗培养2-3周。M2培养基为：MS 4.5mg/L+甘露醇20mg/L+蔗糖28mg/L+NAA 0.0005mg/L+GA30.0015mg/L+特美汀0.25mg/L+卡那霉素0.005mg/L+琼脂糖5.5mg/L。
(7)将M2中的外植体移入M3培养基，25℃，16h/8h的光/暗培养3-4周。M3培养基为：MS 4.5mg/L+葡萄糖9mg/L+木糖0.3mg/L+2-吗啉乙磺酸0.5mg/L+NAA 0.0005mg/L+GA30.0015mg/L+特美汀0.25mg/L+卡那霉素0.005mg/L+琼脂糖5.5mg/L。
(8)用无菌手术刀切去愈伤组织的褐化部分，保留再生苗并移入M4培养基，放入光照培养箱，25℃，16h/8h的光/暗培养至长出根。M4培养基为：MS 3.0mg/L+蔗糖12mg/L。
实施例4
不同类型的外植体对外源植物激素做出不同的反应，影响外植体的分化率及不定芽的再生。本发明以100粒种子为1个转化批次，分别以子叶和下胚轴为外植体，利用实施例1所述体系进行埃芥遗传转化，统计各外植体的分化率及转化率(见表1)。发现相对于下胚轴为外植体，埃塞俄比亚芥子叶的分化率及转化率均较高。
分化率＝已分化外植体数/总外植体数
转化率＝转化成苗数/总种子数
表1不同外植体分化率与转化率
实施例5
本发明以子叶为外植体，以NAA 0.001mg/L+GA30.001mg/L作为外源激素，分别添加到埃芥预培养基、愈伤组织诱导培养基及增殖培养基，统计子叶外植体各阶段生长情况(见表2)。发现以NAA 0.001mg/L+GA30.001mg/L作为外源激素，能够保证埃芥的较高的分化率、不定芽再生率，提前生根时间，及较高的生根率。
表2以子叶为外植体的各阶段生长情况
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种埃塞俄比亚芥高效遗传转化系统建立的方法，其特征在于，包括以下步骤：以埃塞俄比亚芥子叶作为外植体，放入预培养基进行预培养，取出进行农杆菌侵染，再次利用预培养基进行共培养，完成后进行愈伤组织诱导、增殖及生根培养，获得再生植株。
2.根据权利要求1所述的高效遗传转化系统建立的方法，其特征在于，所述子叶外植体的获取方法包括：取埃塞俄比亚芥无菌苗，在叶柄与下胚轴结合尖端切下叶柄，不包括茎尖分生组织。
3.根据权利要求1所述的高效遗传转化系统建立的方法，其特征在于，所述农杆菌菌液OD600＝1.8-2.0。
4.根据权利要求1所述的高效遗传转化系统建立的方法，其特征在于，所述预培养基包括：MS 4.4-4.5g/L+乙酰丁香酮0.08-0.1g/L+蔗糖28-30g/L+琼脂糖5.5-6.0g/L+甘露醇18-20g/L+NAA 0.0005-0.001g/L+GA30.001-0.003g/L。
5.根据权利要求1所述的高效遗传转化系统建立的方法，其特征在于，所述预培养为常温培养18-30h。
6.根据权利要求1所述的高效遗传转化系统建立的方法，其特征在于，所述农杆菌侵染包括：将所述外植体叶柄切断处浸入农杆菌菌液浸染8-12s。
7.根据权利要求1所述的高效遗传转化系统建立的方法，其特征在于，所述共培养为在22-28℃下暗培养36-60h。
8.根据权利要求1所述的高效遗传转化系统建立的方法，其特征在于，所述愈伤组织诱导培养基包括：MS 4.4-4.5mg/L+甘露醇18-20mg/L+蔗糖28-30mg/L+NAA 0.0005-0.001mg/L+GA3 0.001-0.003mg/L+特美汀0.25-0.3mg/L+卡那霉素0.005-0.01mg/L+琼脂糖5.5-6.0mg/L。
9.根据权利要求1所述的高效遗传转化系统建立的方法，其特征在于，所述继代增殖培养基包括：MS 4.4-4.5mg/L+葡萄糖9-10mg/L+木糖0.2-0.3mg/L+2-吗啉乙磺酸0.5-0.6mg/L+NAA 0.0005-0.001mg/L+GA30.001-0.003mg/L+特美汀0.1-0.3mg/L+卡那霉素0.005-0.01mg/L+琼脂糖5.5-6.0mg/L。
10.根据权利要求1所述的高效遗传转化系统建立的方法，其特征在于，所述生根培养基包括：MS 2.2-3.0mg/L+蔗糖10-12mg/L。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111072359.6A CN113584073A (zh) | 2021-09-14 | 2021-09-14 | 一种埃塞俄比亚芥高效遗传转化系统建立的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111072359.6A CN113584073A (zh) | 2021-09-14 | 2021-09-14 | 一种埃塞俄比亚芥高效遗传转化系统建立的方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN113584073A true CN113584073A (zh) | 2021-11-02 |
Family
ID=78241882
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202111072359.6A Pending CN113584073A (zh) | 2021-09-14 | 2021-09-14 | 一种埃塞俄比亚芥高效遗传转化系统建立的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN113584073A (zh) |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1826876A (zh) * | 2005-12-30 | 2006-09-06 | 中国科学院西北高原生物研究所 | 水母雪莲毛状根系的诱导与培养方法 |
| CN102634539A (zh) * | 2012-01-18 | 2012-08-15 | 中国农业科学院蔬菜花卉研究所 | 一种将抗根结线虫的rna干扰基因导入黄瓜的方法 |
| WO2014145883A1 (en) * | 2013-03-15 | 2014-09-18 | Spogen Biotech Inc. | Plant growth-promoting bacteria and methods of use |
| CN104087611A (zh) * | 2014-06-19 | 2014-10-08 | 华南农业大学 | 一种农杆菌介导的麻疯树遗传转化方法 |
| CN104140978A (zh) * | 2014-07-23 | 2014-11-12 | 成都大学 | 一种以山葵子叶为外植体的遗传转化方法 |
| WO2017205834A1 (en) * | 2016-05-27 | 2017-11-30 | The Board Of Trustees Of The University Of Illinois | Transgenic plants with increased photosynthesis efficiency and growth |
-
2021
- 2021-09-14 CN CN202111072359.6A patent/CN113584073A/zh active Pending
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1826876A (zh) * | 2005-12-30 | 2006-09-06 | 中国科学院西北高原生物研究所 | 水母雪莲毛状根系的诱导与培养方法 |
| CN102634539A (zh) * | 2012-01-18 | 2012-08-15 | 中国农业科学院蔬菜花卉研究所 | 一种将抗根结线虫的rna干扰基因导入黄瓜的方法 |
| WO2014145883A1 (en) * | 2013-03-15 | 2014-09-18 | Spogen Biotech Inc. | Plant growth-promoting bacteria and methods of use |
| CN104087611A (zh) * | 2014-06-19 | 2014-10-08 | 华南农业大学 | 一种农杆菌介导的麻疯树遗传转化方法 |
| CN104140978A (zh) * | 2014-07-23 | 2014-11-12 | 成都大学 | 一种以山葵子叶为外植体的遗传转化方法 |
| WO2017205834A1 (en) * | 2016-05-27 | 2017-11-30 | The Board Of Trustees Of The University Of Illinois | Transgenic plants with increased photosynthesis efficiency and growth |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| 唐桂香: "油菜高效再生体系的创建及农杆菌介导法基因转化研究", 《中国优秀博硕士学位论文全文数据库（博士） 农业科技辑》 * |
| 杨美珠等: "埃塞俄比亚芥的原生质体培养及植株再生", 《植物学报》 * |
| 欧阳丽莹等: "油菜子叶和下胚轴再生体系研究进展", 《中国农学通报》 * |
| 欧阳丽莹等: "甘蓝型黄籽油菜下胚轴再生体系的初步研究_.pdf", 《西南农业大学学报》 * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Barrueto Cid et al. | Plant regeneration from seedling explants of Eucalyptus grandis× E. urophylla | |
| US7947869B2 (en) | Methods for inducing cotton embryogenic callus | |
| Hwang | Rapid in vitro propagation and enhanced stevioside accumulation in Stevia rebaudiana Bert | |
| Mangena et al. | In vitro multiple shoot induction in soybean | |
| CN108770690B (zh) | 一种利用马来甜龙竹芽尖进行高效稳定再生体系的建立方法 | |
| CN110669783B (zh) | 一种橡胶草遗传转化方法 | |
| CN109392721B (zh) | 一种诱导甘薯植株再生的方法 | |
| CN108064699B (zh) | 一种葛根植物的组织离体培养繁殖方法 | |
| CN116548313B (zh) | 一种欧美山杨杂种组培苗离体根诱导再生植株的方法 | |
| CN116569842B (zh) | 利用胚尖组织快速获得乌菜再生苗的方法 | |
| CN112042537A (zh) | 一种白芨植株再生体系的建立方法 | |
| Zhong et al. | In vitro culture of petioles and intact leaves of sugar beet (Beta vulgaris) | |
| CN115024220B (zh) | 薄层培养获得大花君子兰体细胞胚的方法 | |
| CN114606257B (zh) | 石榴农杆菌遗传转化的方法 | |
| CN113575422B (zh) | 菠萝叶片高效离体再生方法 | |
| CN111149703B (zh) | 一种简便高效高质量的番木瓜组培苗生根方法 | |
| CN112931227B (zh) | 一种杜仲各部位全株诱导植物再生及构建转基因植株再生体系的方法 | |
| CN113584073A (zh) | 一种埃塞俄比亚芥高效遗传转化系统建立的方法 | |
| US5530182A (en) | Methods for production f hybrid rose plantlets from rose somatic embryos | |
| CN109105257B (zh) | 一种烤烟组培快繁育苗的方法 | |
| Ozyigit et al. | Efficient shoot and root formation from cotton shoot apices | |
| CN112931226A (zh) | 一种东方桤木组培快繁方法 | |
| CN115088623B (zh) | 一种诱导蓖麻子叶节丛芽高频发生组培体系的建立方法 | |
| CN115362938B (zh) | 一种基于同化枝诱导的准噶尔无叶豆快速扩繁体系建立的方法 | |
| Blay et al. | Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of Solanum gilo Raddi as influenced by explant type |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20211102 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |